DE2945788C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine zur parenteralen Injektion bei Mensch und Tier geeignete Zusammensetzung und deren Verwendung als Vakzin-Adjuvans.

Schon seit langem besteht Bedarf an einem Adjuvans bei der Verabreichung von Immunsubstanzen, und erhebliche Arbeit ist zur Auffindung von Substanzen investiert worden, die nach Zusatz zu einem Antigen oder einer anderen Immunsubstanz deren Antigenaktivität und dadurch deren Antikörper-Stimuliervermögen potenzieren würden. Bisher sind viele solche Adjuvantien aufgefunden worden, wie die Verwendung von Alaunfällung von Antigenen, wobei bestimmte spezifische Antigene kombiniert werden, von denen einige die Aktivität der anderen in dem Gemisch verstärken, die Verwendung von Calciumphosphat, insbesondere zur Verstärkung der Influenza-Antikörperproduktion, und die ähnliche Verwendung von Staphylococcus- Toxin, was die Antikörper-Reaktion auf bestimmte Antigene verbessert. Mehrere andere Adjuvans-Substanzen, wie Tapioca, Calcium- oder Magnesiumsalze, Tannin und dergleichen, sind auch in Betracht gezogen worden, die nach Zugabe zu bestimmten spezifischen Antigenen den Antikörper-Titer über den hinaus erhöhen würden, der bei Verabreichung des Antigens alleine erzielbar ist.

Immunologische Adjuvantien werden zur Erhöhung der Menge des gebildeten Antikörpers und zur Herabsetzung der Antigenmenge und der Häufigkeit der Injektion verwendet. Aluminium-Adjuvantien werden weithin verwendet, und obgleich sie beim Menschen als sicher angesehen werden, können nach ihrer Verwendung sterile Abszesse und dauerhafte Knötchen die Folge sein. Vollständiges Freundsches Adjuvans, eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die Tuberkel-Bazillen enthält, ist stärker als die Aluminium- Adjuvantien. Doch schließen die schädlichen Nebenwirkungen, einschließlich schwere Granulom-Bildung, allergische Reaktionen und Ölzurückhaltung in den Geweben seine Verwendung beim Menschen aus.

Die US-PS 38 72 171 offenbart Polyamine, die als Antivirusmittel geeignet sind. Die dort eingesetzten Polyamine können als alleiniger Wirkstoff verwendet werden oder in Kombination mit anderen pharmakologisch wirksamen Stoffen wie Analgetica, Anaestetica, Antiseptica, Antibiotica, Vakzinen, Puffersubstanzen etc.

Die US-PS 40 34 040 offenbart Xylol-Diamine, die ebenfalls als Antivirusmittel geeignet sind und als alleiniger Wirkstoff oder in Kombination mit den vorstehend genannten Stoffen eingesetzt werden können.

Erfindungsgemäß ist nunmehr gefunden worden, daß ganz bestimmte Diaminderivate der nachstehend angegebenen Formel in Kombination mit einem ganz bestimmten Träger überraschenderweise eine gegenüber anderen Trägern gesteigerte Adjuvansaktivität erfahren.

Die Erfindung liefert also ein starkes, gut verträgliches Adjuvans zum Einarbeiten in eine Reihe von Vakzinen und Antigen-Zusammensetzungen zur Verwendung bei Mensch und Tier. Das Antigen selbst kann in Form gereinigten oder teilweise gereinigten Antigens vorliegen, das aus Bakterien, Viren oder Rickettsien stammt, oder das Antigen kann ein Allergen sei, wie Pollen, Staub, Schuppen oder deren Extrakte, oder das Antigen kann in Form eines Giftes oder eines aus giftigen Insekten oder Reptilien stammenden tierischen Giftes sein. In allen Fällen ist das Antigen in der Form, die nach Einführen in einen geeigneten Wirt entweder aktive Immunität durch Produktion von Antikörpern gegen das spezifische Antigen induziert oder im Falle eines Allergens dazu beitragen wird, die Symptone der Allergie aufgrund des spezifischen Allergens zu lindern. Die Antigene können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Antigene von besonderer Bedeutung stammen aus Bakterien, wie H. pertussis, Leptospira pomona und icterohaemorrhagiae, S. typhosa, S. paratyphi A und B, C. diphtheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. feseri und andere Gasbrandbakterien, B. anthracis, P. pestis, P. multocida, V. cholerae und dergleichen, aus Viren, wie Poliovirus (multiple Typen), Adenovirus (multiple Typen), Parainfluenza-Virus (multiple Typen), Masern, Mumps, mehrkörnige Viren der Atmungswege, Influenza (multiple Typen), Shipping Fever Virus (SF4), Western und Eastern Pferdeencephalomyelitis, Japanische B. Encephalomyelitis, Russische Frühlings/Sommer-Encephalomyelitis, Schweinecholera-Virus, Geflügelpocken, Newcastle Disease Virus, Rabies, Katzen- und Hundestaupe und dergleichen Viren, aus Rickettsien als epidemische und endemische Typhus- oder andere Vertreter der Fleckfiebergruppe, aus verschiedenen Spinnen- und Schlangengiften oder irgend welchen der bekannten Allergene, wie Kreuzkraut, Hausstaub, Pollenextrakte, Graspollen und dergleichen.

Von einer Reihe von Substanzen, die auch Interferon induzieren, ist berichtet worden, daß sie Adjuvans-Eigenschaften haben. Diese sind in "Immunological Adjuvants", World Health Organization Technical Report Series No. 595 aufgeführt. Außerdem werden die Adjuvans-Aktivität aliphatischer Stickstoffbasen von D. Gall, Immunology 11, 369 (1966) und Lysolecithin-Analoga von O. Shannegard und G. Roupe, Int. Arch. Allergy Appln. Immun. 51, 198 (1976) berichtet.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können als Vakzin- Adjuvantien für die gleichen Zwecke und nach den gleichen Methoden verabreicht werden, wie die derzeit bekannten Adjuvantien, vgl. z. B. "Immunological Adjuvants", World Health Organization Technical Report Series, Nr. 595. Beispielsweise sind sie brauchbar, wenn sie in Verbindung mit Vakzinen verwendet werden, wie solchen für Influenza, Maul- und Klauenseuche und Diphterie, ohne hierauf beschränkt zu sein.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine zur parenteralen Injektion bei Mensch und Tier geeignete Zusammensetzung, enthaltend ein Diaminderivat der Formel

worin R₁ und R₂ jeweils Alkyl mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen sind, oder deren pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz sowie einen Träger, wobei sie erfindungsgemäß als Träger eine wäßrige Emulsion enthaltend 10% Sojabohnenöl und 1,2% Eigelb- Phospholipide enthält.

Der optimale Träger ist eine 10%ige intravenöse Fettemulsion, die unter der Bezeichnung Intralipid 10% zur Verwendung bei Patienten, die über längere Zeit parenterale Ernährung brauchen, im Handel ist. Intralipit 10% (der Cutter Laboratories, Inc., Berkeley, California) besteht aus 10% Sojabohnenöl, 1,2% Eigelb-Phospholipiden, 2,25% Glycerin, Wasser zur Injektion und genügend Natriumhydroxid zum Einstellen des pH zwischen 5,5 und 9,0. Das Vakzin-Adjuvans wird in für das besondere Vakzin herkömmlicher Weise dem Behandlungsobjekt verabreicht, im allgemeinen als Einzeldosis eines Antigens in Salzlösung, kombiniert mit der Verbindung in Lipidemulsion, subkutan oder intramuskulär. Andererseits kann das Adjuvans unabhängig vom Vakzin verabreicht werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Diamine ist in den US-PS 38 72 171 und 40 34 040 beschrieben.

Vergleichsuntersuchungen wurden an Meerschweinchen (Camm Laboratories, Wayne, N. J. und Springfield Laboratories, Springfield, N. Y.) an den Primär- und Sekundärantikörperreaktionen durchgeführt, die nach Injektion mit geeigneten Lipidaminen erhalten wurden, die in verschiedene Träger eingearbeitet worden waren, und geeignete Kontrollen jeweils kombiniert mit Zellantigenen, wie roten Blutzellen von Schafen und EL₄- Zellen und einem viralen Antigen, wie Influenza-Virus (Fluogen, Parke-Davis, Detroit, Michigan).

Materialien und Methoden Herstellung von Adjuvans-Zusammensetzungen

Die Lipid-Amine wurden jeweils in 0,3 ml absolutem Äthanol, 0,1 ml Polyoxyäthylenmonooleat (Tween 80 - ICI, Wilmington, Delaware) gelöst und von Hand mit 4,6 ml Intralipid (Cutter Laboratories, Fairfield, N. J.), einer wäßrigen Fettemulsion mit 10% Sojabohnenöl, 1,2% Eigelb-Phospholipiden, 2,25% Glycerin, und genügend Wasser, um das Volumen auf 100% zu bringen, gemischt.

Herstellung von Antigen-Zusammensetzungen

Rote Schafsblutzellen, direkt in Alsever's Lösung eingeblutet, wurden mit 0,85%iger Salzlösung gewaschen und auf eine Zellenkonzentration von 1,8×10/ml Salzlösung eingestellt. 2 ml rote Schafsblutzellen-Suspension wurden zu 5,0 ml eines jeden Adjuvans gegeben.

2 ml Fluogen wurden mit jeweils 5 ml eines jeden Adjuvans gemischt, so daß jeweils 0,5 ml Injektionsvolumen 250 CCA Antigen enthielten.

EL₄-Zellen wurden in Salzlösung, 5×10⁷ Zellen/0,4 ml, vollständigem Frendschem Adjuvans und in einer Lösung von Lipidamin in Mineralöl (50 mg/ml) suspendiert.

Immunisierung

Tierversuchsgruppen wurden intramuskulär wie folgt behandelt:

• 1. 0,5 ml eines jeden Antigens in jedem Adjuvans-Verdünner,
• 2. 0,5 ml eines jeden Antigens ohne Adjuvans-Verdünner und
• 3. 0,5 ml eines jeden Adjuvans-Verdünners.

Antigen-Immunitätstest

Etwa 30 Tage nach der Sensibilisierung wurden Tiere durch intramuskuläre Verabreichung homologen Antigens in Salzlösung in das gegenüberliegende Bein immungetestet.

Serumherstellung

Tieren wurde durch intrakardiale Punktur zu mehreren Zeitpunkten nach der ersten Sensibilisierung Blut entnommen und das abgetrennte Serum bis zur Titration bei -20° gelagert.

Immunreaktion Rote Schafsblutzellen Hämagglutinationstiter

Serum (0,25 ml) wurde in phosphatgepufferter Salzlösung in Mikrotiterplatten serienmäßig verdünnt. Dann wurden 0,5 ml einer 0,5%igen Suspension roter Schafsblutzellen in 100fach verdünntem fetalem Kalbserum, zuvor an gepackten roten Schafsblutzellen absorbiert, jedem Gefäß zugesetzt. Der höchste Titer, der eine sichtbare Agglutination ergab, wurde als Titer des Serums aufgezeichnet.

2. Verzögerte Hypersensitivität

0,1 ml einer 1×10⁸ roten Schafsblutzellensuspension wurde intradermal in den rasierten und enthaarten Rücken des Meerschweinchens injiziert. Nach 24 h wurde die Fläche des Erythems durch Messen zweier senkrecht zueinander stehender Durchmesser aufgezeichnet, deren einer die Langachse war, wenn der Fleck ein Oval war. Die Intensität des Erythems und die Dauer wurden ebenfalls aufgezeichnet und verliefen in etwa parallel zur Fläche der Reaktion.

EL₄-Zellen

Die humorale Immunreaktion auf EL₄-Zellen in Ratten (gemessen durch komplementabhängige Antikörper-Lysis von mit ⁵¹Cr markierten EL₄-Zellen) ist von Y. H. Chang in J. Phar. Exp. Ther. 1977 (im Druck) beschrieben.

Influenza-Virus Hämagglutinationshemmungs-Test

Testseren, mit 0,111 m KJO₄ behandelt, um nichtspezifische Serumfaktoren zu entfernen, die die Agglutination hemmen, wurden in serienmäßig zweifachen Verdünnungen in Volumina von 0,025 ml in Mikrotitergefäße gegeben, die 0,025 ml 0,01 m phosphatgepufferte physiologische Salzlösung vom pH 7,2 enthielten. Die Testvirussuspension, die 4 Hämagglutinationseinheiten pro 0,025 ml gepufferter Salzlösung enthielt, wurde jedem Gefäß zugesetzt. Gepufferte Salzlösung und Antigenkontrollen (gepufferte Salzlösung und Virusantigen) wurden verwendet. Nach dem Inkubieren der Platten bei Raumtemperatur für etwa 30 min wurden 0,05 ml Küken-Erythrozyten (Flow Laboratories, Rockville, Md.), mit 0,5%iger Salzlösung gewaschen, jedem Gefäß zugesetzt. Die Inkubation konnte weiterlaufen, bis die Zellenkontrolle (nur phosphatgepufferte physiologische Salzlösung) normales Absetzen zeigte. Perjodatbehandelte Viren normaler Meerschweinchen wurden einbezogen, um den Wert nicht-spezifischer Agglutinationshemmung zu ermitteln, die in den mit KJO₄ behandelten Testseren verblieben ist. Der Hämagglutinationstiter wurde definiert als die höchste Serumverdünnung, die die Hämagglutination vollständig hemmte, korrigiert um nicht-spezifische Hemmung.

Beispiel 1

Antikörperreaktionen von Meerschweinchen, die mit roten Schafsblutzellen in verschiedenen Trägern geimpft worden waren, wurden untersucht. Tieren wurde 15 Tage nach der Impfung Blut entnommen, am 30. Tage Blut entnommen und immungetestet und wieder am 45. und 60. Tag Blut entnommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I

Einfluß von N,N-Dioctadecyl-N′,N′-bis(2-hydroxyäthyl)-propandiamin (Verbindung 20 961) auf den Antikörpertiter zu roten Schafsblutzellen

Rote Schafsblutzellen in Salzlösung oder Intralipid induzierten keine Antikörper-Primär-Reaktion und nur eine vorübergehende Sekundär-Reaktion, aber starke Antikörper-Primär- und -Sekundär- Reaktionen auf rote Schafsblutzellen wurden bei Tieren beobachtet, die mit roten Schafsblutzellen beimpft wurden, die die Verbindung 20 961 enthielten.

Beispiel 2

Eine Untersuchung wurde durchgeführt, um eine optimale Dosis der Verbindung 20 961, gelöst in Äthanol, gemischt in Tween- 80-Interlipid-Adjuvans-Träger, zu bestimmen. Als Antigen wurden rote Schafsblutzellen verwendet, und 8 Meerschweinchen pro Gruppe wurden immunisiert. Rote Schafsblutzellen, gemischt mit Salzlösung, dienten als Vergleichskontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle II

Einfluß der Menge der Verbindung 20 961 in dem Adjuivans auf die Reaktion auf rote Schafsblutzellen

Die Daten zeigen, daß Hämagglutinationsantikörper-Titer mit Dosen der Verbindung 20 961 auf einen Maximaltiter bei 3 mg/Stelle allmählich stiegen. Eine weitere Erhöhung der Menge der Verbindung 20 961 auf 10 mg/Stelle führte zu einem niedrigeren Spitzentiter.

Beispiel 3

Die Adjuvans-Verbindung 20 961 wurde auf ihre Fähigkeit geprüft, eine Sekundärreaktion nach Immuntest mit roten Schafsblutzellen- Antigen in Abwesenheit von Adjuvans hervorzubringen. Dies kann als Maß des Induzierens einer Immunspeicherung angesehen werden. Die Meerschweinchen erhielten alle eine Zusatzinjektion am 30. Tag mit roten Schafsblutzellen alleine, ihnen wurde Blut entnommen, und ihre Seren am 45. und 65. Tag getitert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle III

Primär- und Sekundärreaktion mit roten Schafsblutzellen in ausgewählten Adjuvantien

Rote Schafsblutzellen mit Intralipid/Verbindung 20 961 (3 mg/ Stelle) ergaben eine starke Primärreaktion mit roten Blutzellen.

Intralipid-Träger/rote Schafsblutzellen erbrachten keine Primärreaktion, die sich wesentlich von roten Schafsblutzellen in Salzlösung unterschied. Nur rote Schafsblutzellen in Intralipid/Verbindung 20 961-Adjuvans lieferten stark erhöhte Titer bei Sekundärreaktion.

Beispiel 4

Eine Untersuchung wurde durchgeführt, um die Antikörper-Primär- Reaktion gegenüber Influenzavirus, mit verschiedenen Trägern versetzt, zu vergleichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

Einfluß der Verbindung 20 961 auf Influenzavirus-Serum-HI-Titer nach Beimpfung

Beispiel 5

Die immunisierten Tiere des Beispiels 4 erhielten eine zweite Injektion von Influenzavirus-Vakzin. Die Immun-Sekundär- Reaktionen sind in Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V

Serumtiter 2 und 5 Wochen nach Sekundär-Injektion von Influenza-Vakzin

Die Antikörpertiter 2 Wochen nach einer zweiten Injektion von Influenzavirus-Vakzin waren etwa 10fach erhöht (Intralipid + Verbindung 20 961) gegenüber Titern, die in der Vakzin-Kontrollgruppe erhalten wurden. 5 Wochen nach dem Immuntest waren die Titer von mit Intralipid + Verbindung 20 961 beimpften Tieren nicht verschieden von den Kontrollen.

Beispiel 6

Ratten erhielten eine intraperitoneale Injektion einer Suspension von 5×10⁷ EL₄-Zellen in 0,4 ml Salzlösung und EL₄-Zellen in einer Lösung der Verbindung 20 961 in Mineralöl (50 mg/ml). Die humorale Reaktion (reziproke Titer) ist in Tabelle VI wiedergegeben.
EL₄-Zellen + Salzlösung4933 EL₄-Zellen + Verbindung 20 961 + Mineralöl7800

Claims (7)

1. Zur parenteralen Injektion bei Mensch und Tier geeignete Zusammensetzung, enthaltend ein Diaminderivat der Formel worin R₁ und R₂ jeweils Alkyl mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen sind, oder deren pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz sowie einen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Träger eine wäßrige Emulsion enthaltend 10% Sojabohnenöl und 1,2% Eigelb- Phospholipide enthält.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Diaminderivat N,N-Dioctadecyl- N′,N′-bis(2-hydroxyäthyl)-propandiamin ist.

3. Verwendung der Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche als Adjuvans für eine Immunsubstanz.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunsubstanz ein Vakzin ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunsubstanz aus Bakterien oder Rickettsien stammt.

6. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunsubstanz aus Pollen, Staub oder Schuppen besteht.

7. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunsubstanz ein aus einem giftigen Insekt oder einer Schlange stammendes Gift ist.