ES2260440T3 - Complejo de vacuna para prevenir y tratar la leishmaniasis. - Google Patents
Complejo de vacuna para prevenir y tratar la leishmaniasis.Info
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Abstract
Complejo vacunal terapéutico destinado a la prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en los mamíferos y en particular en el hombre, los cánidos, los félidos y los équidos, caracterizado por estar compuesto - por una parte, de moléculas de excreción secreción procedentes de amastigotes y/o promastigotes de Leishmania sp. producidas en un medio axénico y asérico perfectamente definido, comprendiendo dicho medio: para los amastigotes (cantidades para 800 ml): - y por otra parte, de muramil dipéptido.
Description
Complejo de vacuna para prevenir y tratar la
Leishmaniasis.
La presente invención se refiere a un complejo
inmunomodulador específico compuesto de antígenos de excreción y
secreción de Leishmania y a su utilización en las infecciones
causadas por microorganismos patógenos intracelulares en el mamífero
y particularmente en el hombre, los cánidos, los félidos y los
équidos.
De manera más concreta, la presente invención se
refiere a un complejo vacunal terapéutico destinado a la prevención
o al tratamiento de las leishmaniosis y de las infecciones causadas
por microorganismos patógenos intracelulares en los mamíferos y en
particular en el hombre, los cánidos, los félidos y los équidos,
destacando dicho complejo vacunal por el hecho de estar compuesto de
moléculas de excreción y secreción procedentes de amastigotes y/o de
promastigotes de Leishmania sp. producidas en un medio axénico y
asérico definido.
Las leishmaniosis constituyen un grupo de
infecciones parasitarias endémicas o incluso epidémicas de las
regiones tropicales y subtropicales del planeta. Las
leishmania, protozoos flagelados de la familia de los
Tripanosomatidae y del género Leishmania, son los agentes
patógenos responsables de dichas enfermedades. Estos parásitos
afectan a múltiples especies de mamíferos, constituyendo el hombre y
el perro los principales reservorios domésticos de dichas
enfermedades. Las leishmanias se transmiten a los diferentes
hospedadores por medio de la picadura infectante de una pequeña
mosca llamada flebótomo. Existen diecinueve especies de leishmanias
potencialmente capaces de infectar al hombre y dependiendo de las
especies de leishmanias de que se trate y de los factores
específicos del hospedador (genético, inmunológico...) pueden dar
lugar a manifestaciones clínicas muy diversas. Dichas
manifestaciones suelen evolucionar hacia tres formas clínicas
diferentes: cutánea, muco-cutánea y visceral,
dependiendo de si los parásitos afectan al sistema fagocítico
mononuclear de la dermis, de las mucosas o de las vísceras. La
lesión cutánea puede permanecer localizada en el punto de
inoculación del parásito y corresponderse con una forma benigna de
curación espontánea. Paralelamente, existen patologías más graves
provocadas por las leishmaniosis cutáneo-difusas y
cutáneo-mucosas que son altamente mutilantes y
deformantes.
La leishmaniosis visceral afecta al sistema
fagocítico mononuclear de numerosos órganos y tejidos, y
principalmente al hígado, al bazo y a la médula ósea (hepatomegalia
y esplenomegalia), siendo letal a falta de tratamien-
to.
to.
Como todas las enfermedades de transmisión
vectorial, las leishmaniosis se caracterizan por un ciclo evolutivo
que es relativamente sencillo, ya que se divide entre dos
hospedadores, mamífero y flebótomo, y comprende dos formas
principales:
- -
- una forma flagelada llamada promastigote, presente en el tubo digestivo del vector flebótomo donde se multiplica antes de adquirir la forma infectante para el hospedador mamífero, también llamada metací- clica;
- -
- una forma no flagelada llamada amastigote, presente en los hospedadores mamíferos, entre los cuales cabe destacar al perro y al hombre.
El flebótomo vive en las regiones cálidas del
globo (clima cálido mediterráneo o tropical). Para desarrollarse,
necesita una temperatura superior a 17ºC (condiciones ideales entre
22 y 25ºC) una atmósfera húmeda y ausencia de viento.
Las zonas suburbanas de los países mediterráneos
que cuentan con un gran número de perros, reúnen las condiciones
medioambientales adecuadas para que los flebótomos se puedan
reproducir (estercoleros, granjas, jardines, refugios arbolados,
paredes, céspedes con sistemas de riego...), lo que favorece una
mayor densidad de insectos a proximidad de los perros domésticos y
del hombre.
Las leishmaniosis representan todavía hoy en día
un importante problema de salud pública, especialmente en los países
en desarrollo, y un extraordinario tema de estudio y de
investigación tanto fundamental como aplicada sobre todo en el
ámbito de la inmunoprofilaxia. Las leishmaniosis afectan a noventa y
siete países repartidos por 4 de los 5 continentes. Estas
parasitosis, que suponen una amenaza para aproximadamente 380
millones de personas a nivel mundial, afectan a unos 18 millones de
personas en el mundo, con aproximadamente 2 millones de nuevos casos
al año, contabilizándose el 90% de dichos casos en India, Sudan y
Brasil. Hace quince años, la frecuencia anual mundial estaba
estimada en 400.000 casos [300.000 casos de leishmaniosis cutánea
(LC) y 100.000 casos de leishmaniosis visceral (LV)], con una
incidencia general de 12 millones de casos clínicos, y una población
de riesgo de aproximadamente 350 millones de individuos.
Actualmente, la frecuencia anual global se estima entre 1,5 y 2
millones de nuevos casos al año, de los cuales entre 1 y 1,5
millones son casos de LC y 500.000 son casos de LV.
Si bien es cierto que las poblaciones tropicales
y subtropicales se encuentran en primera línea frente a estas
enfermedades, los riesgos de contaminación canina y humana en la
cuenca mediterránea se suelen subestimar. La leishmaniosis visceral
causada por Leishmania infantum que se encuentra ampliamente
extendida por los diferentes continentes del antiguo mundo, está
presente en todo el perímetro de la cuenca mediterránea,
constituyendo el sur de Francia uno de los focos. A pesar de que
tanto el vector como el parásito presentes en el sur de Francia
parecen estar mejor adaptados al perro que al hombre, el número de
casos humanos de leishmaniosis, actualmente estimado a un centenar
de casos anuales, está en pleno crecimiento desde hace 10 años y
sigue aumentando debido al número creciente de individuos
inmunodeprimidos.
Las leishmaniosis también se consideran una de
las enfermedades oportunistas del SIDA. Se contabilizan
aproximadamente 1500 casos de co-infección VIH /
Leishmaniosis en el sur de Europa, lo que representa un 90% de los
casos contabilizados en el mundo y el país más afectado es España,
con aproximadamente el 60% de los ca-
sos.
sos.
El perro doméstico es el principal reservorio
del parásito. La leishmaniosis canina, que es una patología común en
los países mediterráneos, se traduce por diversas formas clínicas
que suelen conducir a la muerte del animal. La prevalencia de la
leishmaniosis canina puede alcanzar el 30% de la población canina en
ciertas zonas periurbanas. Según Berrahal y col. (Am. J. Trop. Med.
Hyg, 1996, 55, 273-277) el 85% de los perros
son PCR (Polymerase Chain Reaction) positivos en zona endémica.
Por el momento, no existen medios
inmunoprofilácticos eficaces contra estas enfermedades. La terapia
de las leishmaniosis utiliza ciertas moléculas disponibles:
antimonio pentavalente, pentamidina, pirazolopirimidinas,
anfotericina B y aminosidina. Hoy en día, parece que se ha hallado
consenso para considerar que la asociación de sales de antimonio
pirazolopirimidinas son el mejor tratamiento para la leishmaniosis
canina. Sin embargo, los perros sometidos a tratamiento siguen
siendo contagiosos, a pesar de la aparente curación clínica del
animal.
Esto significa que la mejoría sintomática no es
correlativa a la disminución significativa de la carga parasitaria y
que, a pesar de que la curación clínica persista, sigue existiendo
un riesgo epidemiológico. Esta situación se complica todavía más
debido a la emergencia de fenómenos de quimiorresistencia.
En la actualidad, a pesar de que los problemas
de quimiorresistencia complican considerablemente el tratamiento,
todavía es imposible determinar la prevalencia de ésta en las zonas
endémicas, ni diagnosticarla en pacientes. Asimismo, todavía se
desconocen las bases moleculares de esta resistencia inducida en la
fase médicamente importante del parásito (por ej. amastigote).
Por último, los casos de coinfección Sida /
leishmaniosis plantean un serio problema de salud pública en la
medida que los tratamientos disponibles son poco eficaces tanto en
los enfermos de Sida como en cualquier otra persona
inmunodeprimida.
Hoy en día, no se dispone de ninguna vacuna
eficaz para combatir estas enfermedades y su control implica
necesariamente el uso de la quimioterapia. Desgraciadamente, esta
última va perdiendo terreno a favor de otros tratamientos largos,
tóxicos y onerosos, que en muchos casos van acompañados de recaídas,
y ante la emergencia de los fenómenos de quimiorresistencia. Hoy en
día, parece evidente que el tratamiento de estas enfermedades
parasitarias a largo plazo depende del descubrimiento de nuevos
blancos terapéuticos y/o vacunales.
La presente invención propone un complejo
vacunal terapéutico específico de Leishmania que actúa sobre la
respuesta inmunitaria del hospedador mamífero infectado.
Los múltiples estudios referentes a las
respuestas inmunitarias en las leishmaniosis murinas experimentales
han conducido a la demostración de la función preponderante de la
inmunidad de mediación celular y de la existencia de una dualidad de
la respuesta inmunológica. Fundamentalmente, existen dos tipos de
respuestas contra las leishmanias: una de ellas calificada de
"sensibilidad" y la otra de "resistencia". En función de
las linfoquinas secretadas por las leishmanias, las diferentes
subpoblaciones de linfocitos T (CD4+) limitan o exacerban la
infección. De este modo, se demostró que la subpoblación de
linfocitos T auxiliares de tipo Th1 (productor de interferón gamma y
de interleuquina 2) era capaz de eliminar las formas amastigotes
intracelulares mediante la activación de los macrófagos (Reiner S.L
y col., Annu. Rev. Immunol., 1995, 13, 151-177.
Review). Inversamente, la subpoblación de linfocitos T auxiliares de
tipo Th2 (productor de interleuquina 4) es responsable de la
exacerbación de la enferme-
dad.
dad.
En el hombre, existen algunos hechos de
naturaleza comparable. En el perro (hospedador natural
"reservorio" receptivo al ciclo evolutivo de L.
infantum), la dualidad de la respuesta inmunológica es similar.
Sólo un estudio llevado a cabo por Pinelli y col. (Infect. Immun.,
62:229, 1994) con animales experimental y naturalmente infectados
por L. infantum, permitió demostrar que la carencia de
síntomas en el perro (estado clínico frecuentemente encontrado) iba
acompañada de la ausencia de una respuesta humoral y del desarrollo
de una inmunidad de mediación celular de tipo Th1 con una reacción
de hipersensibilidad de tipo retardada positiva y de índices
elevados de interleuquina 2 y de caquectina
(TNF-\alpha) circulando en los líquidos
biológicos.
Por lo tanto, un buen candidato vacunal se debe
corresponder con uno o varios antígenos parasitarios altamente
inmunogénico(s) susceptibles bien de bloquear la
diferenciación de los linfocitos Th2 (Gurunathan S. y col., J. Exp.
Med., 1997 Oct. 6, 186, 1137-1147) (modo de
intervención comparable a los tratamientos de
"desensibilización" habitualmente practicados en los casos de
alergia) o bien de favorecer la emergencia de linfocitos Th1 que
garantizan el establecimiento de una inmunidad protectora.
La presente invención se refiere a un complejo
vacunal terapéutico y preventivo antiLeishmania que posee un poder
inmunizante asociado a la presencia de antígenos de excreción
secreción específicos contra Leishmania por activación de la vía
Th1.
Hoy en día todavía sigue siendo problemático el
hecho de plantearse vacunar contra las leishmanias. Los intentos son
numerosos, pero los resultados son poco concluyentes y/o
contradictorios. Cabe citar la utilización de parásitos vivos, de
parásitos irradiados y de parásitos muertos enteros (Moreau Y. y
col., 1994, Médecine et Armées, 22, 1, 89-93)
que proporcionaron niveles de protección variable en el ratón y en
el hombre.
En los años 80, se utilizaron extractos
purificados de antígenos parasitarios en el perro induciendo una
exacerbación de la enfermedad: fracción LIF2 y vacuna antiidiotípica
del equipo del Dr. Montjour (CHAUVY, J. "Essais d'immunothérapie
sur une population canine en zone d'endémie leishmanienne" tesis
nº 36.1993-OGUNKOLADE B.W. y col. Vet. Parasitol.,
1988, 28, 33-41). Otros antígenos como los antígenos
de membrana GP63 y los lipofosfoglicanos (MOREAU Y. y col., Médecine
et Armées, 1994, 22, 1, 89-93) no dieron resultados
satisfactorios. En la actualidad, se están probando varias
moléculas que están a la espera de resultados finales. Cabe citar la
proteína heat shock HSP83 de Leishmania major que estimula la
vía Th1 y la proteína DP72 (JAFFE. C. y col., J. of Immunol., 1990,
144, 699-706). Sin embargo, ninguno de los
protocolos actuales de inmunización permite obtener un grado de
protección suficiente o, en cualquier caso, no es reproducible.
Hasta el momento, no se ha efectuado ningún
trabajo con antígenos de excreción secreción de Leishmania.
La presente invención consiste en un complejo
inmunomodulador que utiliza dichas proteínas de excreción secreción
junto con un adyuvante que induce, bien una inmunoestimulación del
sistema linfocitario T de tipo Th1 de manera reproducible, o bien
una inmunomodulación de los linfocitos de tipo Th2 hacia un tipo
Th1.
En numerosos parásitos, como Plasmodium,
Babesia, Trypanosoma, Toxoplasma o Shistosoma, se ha demostrado que
los antígenos de excreción secreción (AES) desempeñaban una función
preponderante en el establecimiento de la respuesta inmune del
hospedador. Los AES de leishmanias parecen estar implicados en la
penetración del macrófago por los parásitos, en la inhibición de
enzimas proteolíticas lisosomales del macrófago y en la regulación
negativa de las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad (Alexander y Russel, Adv. Parasitol., 1992, 31,
175-254). Además, los planes de vacunación que
emplean AES llevados a cabo en ratones, ya se han utilizado con
éxito en diferentes parasitosis (Ouaissi y col.,
Parasitology, 1990, 100, 115-24; James y
col., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1989, 83,
67-72; Précigout y col., Infect. Immun.,
1991, 59, 2799-805; Darcy y col., Ann. Biol.
Clin., 1989, 47, 451-7; Capron y col., Mem. Inst.
Oswaldo Cruz, 1995, 90, 235-4).
Sin embargo, la dificultad de obtención y los
múltiples contaminantes séricos y/o celulares contenidos en los
sobrenadantes de cultivo dificultaban su uso en vacunación.
El medio de cultivo descrito en la solicitud de
patente de invención WO 94/26 899 permite resolver parcialmente
dichas dificultades y disponer de una fuente abundante, limpia y
barata de AES de las principales fases parasitarias de las
leishmanias.
A fin de obtener un buen rendimiento de cultivo
de promastigotes y amastigotes de Leishmanias, el medio de la
patente WO 94/26 899 se modificó de la siguiente manera:
- \bullet
- Para el cultivo de amastigotes, se suprimió la adición de compuestos azufrados como la L-cisteína y/o de productos nutritivos como el ácido sulfónico de batocuproína.
El medio MA1 de base con los compuestos
azufrados es el siguiente:
\newpage
| Constituyentes | Cantidades para 800 ml |
| Medio de base | |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm Medio 199 H® (x10) (con sales de Hanks)* | 100 ml |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm Triptocaseína de soja® | 5 g |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm NaHCO3 | 0,35 g |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm L-Glutamina | 0,75 g |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm HEPES | 5,95 g |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm D(+)glucosa | 2,50 g |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm H20 | csp 800 ml |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm Medio 199 H modificado® | |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm (x10)** | 4 ml (5%) |
| Aditivos | |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm Hemina bovina | 0,009 mM |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm Glutatión reducido | 0,08 mM |
| \hskip0.5mm - \hskip0.5mm Solución de vitaminas (x100) | 2% |
A 1000 ml del medio MA1, se añade
L-cisteína (3 mM) y ácido disulfónico de
batocuproína (0,01 mM).
El medio MA1m (m de modificado) es el medio MA1
sin L-cisteína y sin ácido disulfónico de
batocuproína. Por otra parte, la hemina bovina se sustituyó por
hemina porcina irradiada a 25 kilogray en una concentración
claramente más baja (0,003 mM).
Los medios MA1 y MA1m se sembraron con una cepa
de Leishmania infantum MON1 y se efectuó una comparación en
el tiempo del crecimiento de los amastigotes (ver Fig. 1).
- \bullet
- Para el cultivo de los promastigotes, la principal modificación del medio de referencia consiste en una reducción de la concentración de 2 componentes (RPMI y hemina) así como en la adición de un antibiótico (gentamicina).
Hay que añadir que la hemina bovina se sustituyó
por hemina porcina irradiada a 25 kilogray como en el caso de la
modificación del medio para amastigotes.
| Medio MP para promastigotes | Medio MPm (modificado) para promastigotes | ||
| RPMI 1640 (1,1x) | 1000 ml | RPMI 1640 (1x) | 1000 ml |
| Con L glutamina y Hepes | Medio 199 H modificado 10x | 2% | |
| Medio 199 H modificado (10x) | 2% | Hemina porcina irradiada | 0,0002% |
| Hemina bovina | 0,0005% | Gentamicina sulfato | 0,04 mg |
Los medios MP y MPm se sembraron con una cepa de
Leishmania infantum MON1 y se efectuó una comparación en el
tiempo del crecimiento de los promastigotes (ver Fig. 2).
El complejo obtenido según la invención
comprende moléculas naturalmente excretadas por los promastigotes
y/o amastigotes de Leishmania sp., así como un adyuvante que
induce preferentemente una respuesta de mediación celular.
Estas moléculas presentan al menos un epítopo
común presente en una o varias proteínas principales. Su peso
molecular varía de 32 Kda a 200 Kda según las especies de
leishmanias y en función de la fase parasitaria considerada (Fig. 3:
detección de un epítopo común en diversas especies de Leishmanias
por el anticuerpo monoclonal F5. A: extractos Tritón x 100 de
promastigotes, 1 y 2: L. amazonensis (45 kDa), 3 y 4: L.
infantum (54 kDa), 5: L. chagasi (36 kDa), B: AES de
promastigotes). Estas moléculas nativas que expresan actividades
proteásicas (Fig. 4a: actividad proteásica (gel de electroforesis
que comprende gelatina), 1 = control complejo vacunal, 2 y 3 =
complejo vacunal estudiado) no catalogadas (ni metalo, ni serina, ni
cisteína proteasa) están exentas de todo tipo de contaminantes
séricos o celulares.
Las formas promastigotes o amastigotes se
cultivan en un medio axénico y asérico completamente definido según
el procedimiento descrito en la solicitud de patente de invención WO
94/26 899 anteriormente citada y la modificación aportada por la
solicitante.
Los cultivos se inoculan a razón de 5.10^{5}
parásitos por mililitro de medio de cultivo. Tras incubación, los
parásitos se eliminan por filtración tangencial contra una membrana
de 0,16 \mu de polietersulfona y el filtrado se concentra 100
veces por filtración tangencial contra un filtro de 3 kDa de
polietersulfona.
Cada dosis liofilizada, establecida tras el
estudio efecto/dosis (Fig. 5, 6 y 7), está formada por un
liofilizado de 100 \mug de proteínas de excreción secreción de
Leishmanias y por un diluyente compuesto de 1 ml de suero
fisiológico estéril.
La composición así obtenida se administra al
mamífero infectado en presencia de un adyuvante, preferentemente el
muramil dipéptido.
De manera preferente, la relación
proteína/adyuvante está comprendida entre 1/0,5 y 1/4.
Los estudios efectuados en el perro permitieron
determinar la dosis vacunal óptima a 200 \mug de muramil dipéptido
con un inicio de respuesta a partir de 100 \mug de proteínas
infectadas.
El mecanismo de acción específica del complejo
vacunal obtenido según la invención se comprueba utilizando
procedimientos clásicos que permiten la dosificación de las
proteínas, su identificación y la medición de su actividad
proteásica (técnicas de inmunotransferencia o inmunoblotting y
SDS-PAGE) y utilizando procedimientos más
específicos que demuestran que el complejo vacunal terapéutico
innovador actúa bien por inmunoestimulación del sistema linfocitario
de tipo Th1, o bien por inmunomodulación de un tipo Th2 hacia un
tipo Th1.
El procedimiento Inmunotransferencia permite la
detección individual de proteínas, principalmente de las proteínas
de excreción y secreción de amastigotes (ESA) y de excreción y
secreción de promastigotes (ESP) mediante la reacción
Antígeno/Anticuerpo con los inmunosueros correspondientes.
Para cada mamífero estudiado (perro por
ejemplo), se efectuó un análisis serológico con las ESA y ESP.
En primer lugar, las proteínas del complejo
vacunal se separaron por electroforesis discontinua en gel de
policrilamida (PAGE) en presencia de sodio dodecil sulfato (SDS).
Esta separación va seguida de una transferencia electroforética de
las proteínas a una membrana de nitrocelulosa según el procedimiento
de Towbin y col. (Proc. Nath. Acad. Sci. 1979, 76,
4350-4354). Estas proteínas son posteriormente
detectadas por reacción inmunoenzimática por medio de un anticuerpo
monoclonal anti-ESP (Fig. 4b: Inmunotransferencia
obtenido con un anticuerpo monoclonal anti-AES de
promastigotes, 4b1: proteínas marcador (kDa), 4b2: Lote ESP a
controlar, 4b3: Lote ESP de referen-
cia).
cia).
Con la muestra extraída directamente del
candidato estudiado, perro por ejemplo, se efectuó un examen
parasitológico.
A partir de una punción de médula ósea, se
efectuó un frotis en portaobjetos. Dicho frotis, una vez fijado con
metanol, se tiñó con May Grümwald Giemsa y se observó al microscopio
con objetivo de inmersión (x1000).
En el medio de cultivo bifásico NNN (Novy and
Mac Neal, 1904, J. Infec. Dis., 1: 1-30) cuya fase
líquida está constituida por RPMI 1640 al que se le añadió un 20% de
suero de ternera fetal descomplementado, se cultivaron muestras de
médula ósea. Entre cada cuatro y seis días se realizaron repicados a
ciegas. Los cultivos se observaron regularmente al microscopio
fotónico (x 400) durante 20 minutos.
Las parasitemias se calificaron del siguiente
modo:
- +/-
- : forma alargada refringente inmóvil;
- +
- : 1 a 5 formas promastigotes móviles/campo;
- ++
- : > 5 formas promastigotes móviles/campo;
- +++
- : confluencia del cultivo.
Se cultivan Leishmanias de formas promastigotes
en medios de cultivo definidos según los procedimientos descritos
anteriormente. Se recogen parásitos de fin de fase exponencial
(6-7 días). El residuo parasitario se lava tres
veces por centrifugación (2500 g, 15 min, 4ºC) en tampón PBS.
Después de haber comprobado la viabilidad de los parásitos
utilizando un colorante vital (el azul Tripán), se procede a la
inactivación de una suspensión que contiene 2 x 10^{8} parásitos
por ml en un tampón PBS que contiene un 0,01% de mertiolato (Pinelli
y col., 1994, Infect. Immun., 62: 229-235). De este
modo se obtienen las leishmaninas para la prueba de
intradermorreacción (IDR).
El estudio de la respuesta inmunitaria de tipo
Th1 que figura a continuación, se efectuó a partir de perros.
Los perros se colocan en posición decúbito
lateral y se les realiza un esquileo cuidadoso y no irritante en la
zona torácica de aproximadamente 5 cm por 10 cm por detrás del
codo. Con un rotulador se delimitan cuatro círculos de 10 mm de
diámetro.
En el centro de los círculos se inyectan 0,1 ml
de solución por medio de una inyección intradérmica. En dos de los
círculos se inyecta la solución de leishmaninas y en los otros dos
se inyecta la solución salina mertiolada en control negativo. La
lectura de la intradermorreacción (IDR) se efectúa 48 horas más
tarde utilizando una regleta de alergólogo.
La prueba se considera positiva si la media de
dos diámetros de induración observada es superior o igual a 5 mm. La
observación de un eritema sin induración se considerará como una
prueba negativa (Pinelli y col., 1994, Infect. Immun., 62:
229-235; Marty y col., 1994, Trans. Roy. Soc. Trop.
Med. Hyg., 88, 658-659).
A continuación se efectúa una prueba de
proliferación linfocitaria.
Las células mononucleadas de la sangre
periférica (PBMC) de los perros se separan en gradiente de Ficoll
(densidad 1,078) por centrifugación a 800 g durante 20 min. a
temperatura ambiente. Dichas células se cultivan en una placa de 96
pocillos a razón de 2.10^{5} células por pocillo en presencia de 2
\mug por ml de Concanavalina A (Sigma), de 5 \mug por ml de ESP
o 20 ml de sobrenadantes de cultivo recogidos en la fase
estacionaria del crecimiento de los promastigotes (SP) por pocillo,
y en ausencia de todo aditivo en un volumen de 200 ml de medio RPMI
1640 que contiene un 5% de suero de ternera fetal descomplementado,
2 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina por ml y
100 mg de estreptomicina por ml. Las concentraciones óptimas de
antígenos y de mitógeno habían sido determinadas en experimentos
previos. Las PBMC se incuban durante 72 horas en una atmósfera
húmeda a 37ºC en presencia de un 5% de CO_{2} y luego durante 20
horas con 0,5 \muCi de ^{3}H timidina. Las células se recogen en
un filtro y la incorporación de la radiactividad se determina por
recuento en líquido de centelleo (contador \beta). Todas las
pruebas se realizan por triplicado.
Para medir la proliferación celular (BrdU, cell
proliferation detection kit III, Boehringer Mannheim, Alemania),
también se utiliza un procedimiento inmunohistoquímico más rápido y
más sensible que emplea BrdU
(5-bromo-2'-desoxiuridina),
un análogo estructural de la timidina. En los experimentos de la
presente invención, el BrdU se añade durante 18 horas, después de 72
horas de incubación. Las células que han incorporado el BrdU a su
ADN son fácilmente detectables en presencia de un anticuerpo
monoclonal dirigido contra el BrdU.
Las respuestas proliferativas se expresan en
índices de estimulación que representan la relación entre la media
de proliferación tras estimulación y la media de proliferación en
ausencia de antígeno.
La proliferación linfocitaria también se estimó
mediante lecturas visuales al microscopio fotónico (-: negativa,
+/-: ligera proliferación, +: pequeña proliferación en menos de 5
puntos por campo microscópico; ++: proliferación moderada en más de
5 puntos; +++: gran proliferación).
La valoración de la actividad leishmanicida de
los monocitos se efectuó según el procedimiento LEMESRE descrito a
continuación.
Para esta prueba, se aislaron los monocitos y
los linfocitos a partir de sangre venosa de perros. Los monocitos se
cultivaron durante 3 días a razón de 10^{5} células por pocillo en
cámaras de cultivo (Labteck) en un medio RPMI 1640 completo (que
contiene 25 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 100 U
de penicilina por ml, 100 mg de estreptomicina por ml y un 10% de
suero de ternera fetal inactivado) a 37ºC en una atmósfera húmeda
que contiene un 5% de CO_{2}. Al cabo de 3 días de cultivo, los
macrófagos se lavan en medio RPMI completo, se les añade medio
fresco y se ponen en contacto con formas promastigotes metacíclicas
de L. infantum en una relación de 5 parásitos por célula, a
37ºC durante una noche o 5 horas según los experimentos. Los
macrófagos se lavan con medio RPMI completo fresco para eliminar
los parásitos no fagocitados. Las células se ponen en incubación
bien solas, bien en presencia de 5 \mug de antígenos ESP, bien en
presencia de linfocitos autólogos, o bien en presencia de
sobrenadantes de co-cultivo de macrófagos
infectados, de linfocitos autólogos y de los controles
correspondientes (recogidos tras 5 horas) a 37ºC en una atmósfera
húmeda al 5% de CO_{2} durante 48 horas. Previamente a su
utilización, los linfocitos cultivados por separado se lavan, se
cuentan y luego se añaden a los macrófagos a razón de 2 linfocitos
por macró-
fago.
fago.
Después de 48 horas de incubación, las células
se lavan tres veces en tampón PBS 0,01 M, pH 7,2, se fijan con
metanol y se tiñen con Giemsa. La actividad leishmanicida de los
macrófagos se estima con el microscopio fotónico (1000X)
determinando el porcentaje de macrófagos infectados y el número de
formas amastigotes intactas para 100 células (se observan por
duplicado 2 veces 200 células). Los resultados se expresan en
porcentaje de inhibición del índice parasitario = 100 - (IP x
100).
IP = Índice parasitario = [(el número medio de
amastigotes por macrófago en la muestra tratada) x (el porcentaje
medio de macrófagos infectados en la muestra tratada)] / [(el número
medio de amastigotes por macrófago en la muestra de control) x (el
porcentaje medio de macrófagos infectados en la muestra de
control)].
También se puede proceder a la dosificación del
monóxido de nitrógeno (NO) para conocer la actividad destructora de
los monocitos con respecto a las Leishmanias. En efecto, la síntesis
de NO por los monocitos es signo de destrucción de las leishmaninas
por parte de los monocitos que han sido activados por las citoquinas
de tipo interferón gamma (IFN\gamma).
El NO posee una alta reactividad química. En
presencia de agua y oxígeno, esta molécula se oxida rápidamente de
manera estequiométrica formando nitritos (NO_{2}^{-}) de acuerdo
con la reacción:
4 NOº + O_{2}
+ 2H_{2}O --- 4 NO_{2}^{-} + 4
H^{+}.
Los nitritos se acumulan en los medios y son
fácilmente detectables químicamente por el procedimiento de
Griess.
Sobre 50 \mul del sobrenadante a probar, se
añaden 60 \mul de Griess A (Sulfanilamida 1% en HCl 1,2N) y 60
\mul de Griess B
(N-(1-Naftil)etil-enediamina
0,3%). La reacción colorimétrica se desarrolla al abrigo de la luz
durante 2 minutos. Las densidades ópticas obtenidas a 540 nm se
corrigen mediante la sustracción de las DO obtenidas en los pocillos
que contienen el medio de cultivo solo.
Los valores obtenidos se trasladan a una curva
patrón (DO = f(NO_{2}) realizada a partir de
concentraciones conocidas de NO_{2}^{-}.
La tabla que figura a continuación muestra las
respuestas serológicas obtenidas a partir de los experimentos y el
seguimiento de la parasitemia (análisis efectuados 2 meses y 8 meses
después de la prueba infecciosa).
| Serología | Parasitemia | ||||||
| (a partir de punción | |||||||
| de médula) | |||||||
| Perros | IF | WB | WB | ELISA | Examen | Cultivo | |
| cuantitativa | (ESA) | (ESP) | (IgG2) | directo | en medio | ||
| ESA/ESP | NNN | ||||||
| Perros | MUMA | - | - | - | - | + | ++ |
| control | LEO | - | - | - | - | + | ++ |
| Perros inmunizados | LOUBARD | 1/200 | + | + | +(0,700) | - | - |
| ESA | MINA | 1/200 | \pm | \pm | +(0,450) | - | - |
| Perros inmunizados | NOUGAT | 1/800 | + | + | +(0,780) | - | - |
| ESP | MINON | 1/100 | \pm | \pm | +(0,520) | - | - |
| Leyenda: |
| IF: Inmunofluorescencia (considerada positiva si la concentración es \geq 1/100). | |
| WB: Inmunotransferencia. | |
| ELISA: Cutt off = 0,300 en DO (densidad óptica). | |
| Parasitemia: cultivo en medio NNN | |
| \; - = ausencia | |
| ++ = más de 5 formas promastigotes móviles/campo. |
La tabla que figura a continuación muestra las
respuestas obtenidas de tipo celular y la función inhibidora de los
sueros sobre la proliferación parasitaria (análisis efectuados 2
meses después de la prueba infecciosa).
\newpage
| Respuestas de mediación | Porcentaje de inhibición | ||||||
| celular | de la proliferación | ||||||
| de las Leishamanias | |||||||
| Perros | IDR | Prueba de | Actividad | Dosificación | Proliferación | Proliferación | |
| proliferación | leishmanicida | del NO | de los | de los | |||
| linfoblástica | de los | (en \muM) | promastigotes | amastigotes | |||
| monocitos | |||||||
| Perros | MUMA | + | + 2,1 (3) | 15,5% | 0,3 | 20% | 15% |
| control | LEO | - | + 1,2 (3,1) | 21,5% | ND | ND | ND |
| Perros inmunizados | LOUBARD | + | ++ 2,9 (3,2) | 58,9% | ND | 50% | 41% |
| ESA | MINA | + | ++ 3,8 (4,2) | 47,8% | ND | 69% | 52% |
| Perros inmunizados | NOUGAT | + | ++ 3,1 (4,2) | 75,6% | 3,9 | 98% | 54% |
| ESP | MINON | + | +++ 3,5 (4,5) | 64,1% | 2,8 | 72% | 56% |
| Leyenda: |
| \bullet | \begin{minipage}[t]{150mm} IDR: La prueba de intradermorreacción se considera positiva (+) si la induración es \geq 5 mm 48 h después de la inyección intradérmica. \end{minipage} |
| \bullet | \begin{minipage}[t]{150mm} Prueba de proliferación linfoblástica: los resultados se expresan por lectura al microscopio fotónico y en índices de estimulación (entre paréntesis, índice de estimulación del control + Concanavalina A). \end{minipage} |
| +: | pequeña proliferación \hskip0.5cm ++: proliferación moderada \hskip0.5cm +++: gran proliferación |
| \bullet | Actividad leishmanicida de los monocitos: expresada en porcentaje de inhibición del índice parasitario. |
| \bullet | Dosificación del NO: |
| \bullet | Función inhibidora de los sueros: resultados expresados en porcentaje de inhibición del crecimiento. |
| ND = No Determinado. |
El objetivo de estas pruebas consiste en
demostrar el posible efecto inhibidor de los anticuerpos
anti-ES sobre la proliferación y la diferenciación
in vitro de los parásitos.
100 \mul de inmunosuero previamente inactivado
(56ºC durante 45 minutos) de diferentes grupos de perros se ponen en
contacto durante 30 minutos a temperatura ambiente con 5 x 10^{6}
formas promastigotes metacíclicas. Se realizan pruebas de viabilidad
pre y post-tratamiento (ver más arriba) para
establecer los porcentajes de mortalidad. Los parásitos así tratados
se cultivan, bien a 25ºC en el medio RPMI 1640 que contiene un 10%
de STF (Suero de Ternera Fetal), o bien a 37ºC en el medio MAA/20
(10^{6} parásitos por ml de medio). Las cinéticas de proliferación
de las formas promastigotes así como las de los amastigotes se
establecen por recuento diario de las células al microscopio
fotónico. Los resultados se expresan en porcentaje de inhibición del
crecimiento.
El carácter innovador del complejo vacunal según
la invención no reside solamente en la inducción de una respuesta
celular específica de tipo Th1, sino también en la producción de
pequeñas tasas de anticuerpos muy eficaces contra los promastigotes
y los amastigotes de Leishmania.
Para el desarrollo de los estudios, se
utilizaron otras técnicas particulares
La prueba infecciosa consiste en inyectar por
vía intravenosa 10^{6} promastigotes en fase metacíclica tratados
con complemento de perro sano y 5.10^{6} macrófagos peritoneales
de perro sano, infectados in vitro por amastigotes.
Los promastigotes y los macrófagos infectados se
diluyen en suero fisiológico estéril para obtener un volumen final
de 1,5 ml. Esta mezcla se realiza justo antes de ser inyectada.
Esta detección se efectúa por el procedimiento
de Inmunotransferencia utilizando un conjugado anti IgG2
(Inmunoglobulinas G2) de perro y por el procedimiento ELISA según la
técnica de micro titulación de Kweider y col. (J. Immunol., 1987,
138, 299).
El complejo vacunal según la invención se puede
administrar de diversas maneras. No obstante, su administración se
realiza preferentemente por 4 vías:
- -
- Por inyección subcutánea
- -
- Por inyección intradérmica
- -
- Por inyección intramuscular
- -
- Por vía oral
Se pueden emplear otros modos de administración,
como la vía parenteral o intravenosa.
De manera general, la vacuna suele adoptar una
forma inyectable constituida por una fracción liofilizada que se
retoma con una fracción líquida o diluyente. Las dosis utilizadas
para la prevención de la inmunoterapia son diferentes y también son
diferentes según el modo de inyección.
- \bullet
- por vía subcutánea e intramuscular
- -
- Inyección de una dosis (100 \mug de proteínas excretadas secretadas y 200 \mug de adyuvante) en perros sea cual fuere su raza, edad y sexo para un efecto preventivo.
- -
- Inyección de medias dosis (50 \mug de proteínas excretadas secretadas y 100 \mug de adyuvante) para la inmunoterapia de perros con leishmaniosis.
- \bullet
- por vía intradérmica
- -
- Inyección de media dosis en perros para un efecto preventivo.
- -
- Inyección de un cuarto de dosis en perros con leishmaniosis para un efecto terapéutico.
Los procedimientos de inyecciones se explican en
los ejemplos de inmunoterapia y de vacunación, así como en los
estudios de inocuidad.
Los estudios de inocuidad sobre el complejo
vacunal se llevaron a cabo a partir de 30 perros.
Todos los perros son beagles adultos de 1 a 6
años, 50% machos y 50% hembras, procedentes de zonas no endémicas.
Estos perros están perfectamente sanos y presentan una serología y
una prueba de intradermorreacción (IDR) negativas con respecto a
Leishmania.
A algunos de esos perros se les administran
placebos. Paralelamente al seguimiento clínico, se efectúa un
seguimiento del estado inmunitario específico con respecto al
complejo vacunal (demostración de la inducción de la inmunidad de
mediación celular y humoral de tipo Th1 únicamente en los perros
vacunados).
Los ensayos se efectuaron bajo los principios de
BPL (Buenas Prácticas de Laboratorio) y BPC (Buenas Prácticas
Clínicas).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
(Primera \+ \rightarrow \+ 4 semanas \+ \rightarrow \+ Dosis \+
\rightarrow \+ 4 semanas \+ \rightarrow \+ Sobredosis \+
\rightarrow \+ 4 semanas\cr vacunación) \+ \+ de \+ \+ reiterada
\+ \+ de \+ \+ (2 dosis \+ \+ de\cr \+ \+ observación \+ \+ \+ \+
observación \+ \+ simultáneas) \+ \+
observación\cr}
Las dosis se inyectaron por vía subcutánea.
Se efectuó un seguimiento de la tolerancia:
Tras la administración, se realizó
cotidianamente un examen visual directo (dolor, tumefacción, calor y
prurito) del punto de inyección durante 14 días.
También se efectuó un seguimiento de la
tolerancia general. Se trata de un examen diario rápido con toma de
temperatura, un examen clínico veterinario semanal que incluye una
palpación de los ganglios (poplítea), una palpación abdominal, el
seguimiento de artritis y de uveítis y una pesada.
Los seguimientos hematológicos y bioquímicos
(creatinina, urea y transaminasas) se efectuaron 3 semanas después
de cada inyección vacunal.
No se observaron trastornos generales en ninguno
de los 30 perros, incluidos los 7 placebos. Sólo cabe señalar
algunas reacciones locales sin importancia: pequeño edema en el
punto de inyección, eritema moderado y ligero prurito. Estos
trastornos son benignos, desaparecen espontáneamente al cabo de 24 h
a 48 h y son totalmente lógicos en el caso de una vacuna de
mediación celular.
Tampoco cabe señalar ninguna anomalía por lo que
respecta a los seguimientos hematológicos y bioquímicos. Los
resultados obtenidos tras inyección intradérmica en 5 perros y tras
inyección intramuscular en 5 perros fueron similares.
El complejo vacunal no presenta, pues, ningún
problema de inocuidad.
Paralelamente al seguimiento serológico por
inmunofluorescencia clásica, en el que se utilizan portaobjetos
tratados con promastigotes (procedimiento de referencia serológico
para la leishmaniosis canina), que resultó ser poco concluyente en
todos los perros, se efectuó el estudio de la respuesta de mediación
celular a través de la prueba de proliferación linfoblástica y del
estudio de la actividad leishmanicida de los monocitos en los 30
perros.
Los 7 placebos no inducen una respuesta celular
específica del antígeno vacunal, en cambio, los 23 perros vacunados
presentan una inducción del sistema Th1 con, principalmente, índices
de proliferación linfocitarios específicos del complejo vacunal
comparables al índice de control (Concanavalina A) acompañados de
porcentajes de inhibición del índice parasitario elevados (> 40%
con una media del 60% en 23 perros vacunados).
Por lo tanto, el complejo vacunal tiene como
efecto la activación de los monocitos contra las leishmania por
medio de los linfocitos sin afectar de modo alguno al sistema
Th2.
La finalidad de este experimento consiste en
determinar la dosis vacunal mínima que induce una respuesta Th1
eficaz.
Para ello, 12 perros beagle adultos de 1 a 6
años procedentes de zonas no endémicas se repartieron en 6 grupos de
2:
1^{er} grupo: placebo.
2º grupo: placebo + 200 \mug de adyuvante.
3^{er} grupo: 25 \mug de proteínas
excretadas secretadas y 50 \mug de adyuvante.
4º grupo: 50 \mug de proteínas excretadas
secretadas y 100 \mug de adyuvante.
5º grupo: 100 \mug de proteínas excretadas
secretadas y 200 \mug de adyuvante.
6º grupo: 200 \mug de proteínas excretadas
secretadas y 400 \mug de adyuvante.
Estos ensayos se efectuaron bajo los principios
de BPL y de BPC.
| Primera vacunación | 4 semanas | 2ºC inyección | 4 semanas | Prueba infecciosa |
La prueba infecciosa consiste en infectar a los
perros por vía intravenosa utilizando promastigotes en fase
metacíclica y monocitos infectados de amastigotes.
Tras la 2ª inyección, el estudio del estado
inmunitario permite afirmar que los perros a los que se les ha
administrado el complejo vacunal se encuentran efectivamente en Th1
con un inicio de respuesta máxima en meseta a partir de 50 \mug de
proteínas secretadas excretadas inyectadas. Este fenómeno de meseta
se observa tanto en el caso de la prueba de proliferación
linfocitaria como para la actividad de los monocitos.
El gráfico de la figura 5 muestra los resultados
ofrecidos por el estudio efecto/dosis: estudio de la proliferación
linfoblástica según la dosis vacunal inyectada.
Por otra parte, se efectuó un estudio
parasitémico a partir de una punción de médula, 2 meses después de
la prueba infecciosa, utilizando el medio de cultivo de referencia
NNN (Novy and Mac Neal, J. Infect., Dis., 1904, 1,
1-30).
Los 4 perros placebos y un perro que había
recibido 50 \mug de proteínas excretadas secretadas, presentan una
parasitemia positiva.
El gráfico de la figura 6 muestra los resultados
ofrecidos por el estudio efecto/dosis: estudio de la parasitemia 6
semanas después de la prueba infecciosa según la dosis vacunal
inyectada.
Como se demostró anteriormente, el sistema Th1
se corresponde con una respuesta de mediación celular que consiste
en una activación de los macrófagos por medio de los linfocitos
productores de citoquinas específicas. Se trata de la función
principal del complejo vacunal según la invención. Esta respuesta
celular va acompañada de una pequeña respuesta humoral fácilmente
demostrable por él procedimiento clásico de inmunofluorescencia
utilizando un conjugado anti IgG total marcado con fluoresceína.
Sin embargo, algunos trabajos preliminares en el
hombre (KAWANO P. y col., Parasite Immunol., 1995, 17,
451-458) y en el perro (NIETO C. G. y col., Vet.
Immunol. and Immunopathology, 1999, 67, 117-130)
demuestran que los isotipos de IgG vendrían a ser marcadores de la
dicotomía inmunitaria Th1/Th2. De manera más concreta, un perro con
leishmaniosis y con signos clínicos evidentes, presenta un índice
elevado de anticuerpos, principalmente de isotipo IgG1, mientras que
un perro asintomático presenta anticuerpos específicos de isotipo
IgG2. Los perros a los que se les administró el complejo vacunal
según la invención, presentan índices bajos de IgG2 específicos de
las proteínas secretadas excretadas, lo cual es conforme a la
expansión preferente de linfocitos T de tipo Th1.
El gráfico de la figura 7 muestra la respuesta
específica de los perros vacunados con IgG2 con respecto al complejo
vacunal objeto de la invención, según la dosis vacunal inyectada
(procedimiento ELISA en pocillos).
Según los especialistas como PINELLI (PINELLI E.
y col., Infect. Immun., 1994, 62, 229-235) los
perros con leishmaniosis correspondientes a la activación del
sistema linfocitario de tipo Th2 presentan una respuesta en
anticuerpos elevada.
Este aumento de la producción de anticuerpos se
corresponde con la hiperproteinemia e induce la aparición de
inmunocomplejos que provocan daños renales (aumento de la creatinina
y de la urea sanguíneas).
Por lo tanto, durante los estudios y ensayos se
intentó modular hacia un estado Th1 administrando dosis del complejo
vacunal por vía intramuscular a perros con leishmaniosis. El
seguimiento del estado inmunitario así como la observación clínica
se efectuaron antes y después del tratamiento.
Ejemplo
1
Un perro macho de raza Epagneul Bretón, LOYD, de
6 años de edad y perteneciente a la Sra. C, presenta numerosas
lesiones cutáneas junto con un estado de cansancio general y aspecto
delgado, lo cual apunta a una leishmaniosis canina. LOYD vive cerca
de Aix-en-Provence, en plena zona
endémica, y pasa la mayor parte del tiempo al aire libre. Se trata,
pues, de un animal predispuesto a ser picado por flebótomos.
Las lesiones cutáneas son de varios tipos:
pústulas y pápulas en la región frontal; eritema en el flanco y en
la cara interna de las orejas; y prurito, escamas y costras a la
altura de los codos.
El veterinario, el Dr. DM le diagnostica un
pénfigo foliáceo acompañado de leishmaniosis. Este último
diagnóstico se confirma mediante la observación directa al
microscopio de leishmanias a partir de un raspado cutáneo y un
análisis serológico positivo para Leishmania con una concentración
de 1/1600 en inmunofluorescencia.
LOYD se somete a un tratamiento clásico con
sales de antimonio y con corticoides durante 8 meses que no ofrece
ningún tipo de resultado. Por consiguiente, se instaura una
inmunoterapia que consiste en efectuar por vía intramuscular 4
inyecciones de 50 \mug de complejo vacunal (1/2 dosis) dejando un
lapso de 10 días entre cada inyección.
El análisis del estado inmunitario antes de toda
inyección permite afirmar que el perro se encuentra efectivamente en
un estado inmunitario de tipo Th2 con una concentración de
anticuerpos elevada y que las pruebas de proliferación
linfoblásticas y la activación monocitaria son negativas.
Una semana después de la segunda inyección, el
perro LOYD recupera algo de apetito y cierta vitalidad. El Dr. DM
empieza a observar una ligera mejoría cutánea.
Un mes después de la última inyección, LOYD ha
recuperado un aspecto clínico normal en el que cabe destacar un
aumento de peso de 1 kg y una desaparición del 80% de todas las
lesiones cutáneas. El análisis del estado inmunitario permite
afirmar una reducción de la concentración de anticuerpos
anti-leishmania que desciende a 1/400 en
inmunofluorescencia. Paralelamente, los monocitos recuperan una
actividad leishmanicida (con un porcentaje de inhibición del índice
parasitario igual al 75%) y la prueba de proliferación linfoblástica
es perfectamente positiva.
La búsqueda de parásitos mediante cultivo en
medio NNN resultó negativa. 8 meses después del tratamiento, el
perro LOYD presenta de vez en cuando lesiones en la región frontal
que se corresponden con el pénfigo foliáceo, lesiones que
desaparecen tras un tratamiento con corticoides. Los análisis
biológicos permiten afirmar que LOYD todavía sigue en estado
inmunitario Th1.
Ejemplo
2
Un perro macho de raza rottweiler, JAZZ, de 5
años de edad y perteneciente al Sr. C, presenta signos clínicos
específicos de la leishmaniosis. Según el Dr. GH: presencia de
múltiples escamas brillantes, depilación periocular derecha,
lesiones ulcerosas a la altura de los 2 codos anteriores y un
acusado estado de cansancio. Los análisis biológicos, que incluyen
principalmente una serología positiva para Leishmania de 1/400 en
inmunofluorescencia, corroboran el diagnóstico clínico.
Se instaura una inmunoterapia que consiste en
efectuar por vía intramuscular 3 inyecciones de 50 \mug de
complejo vacunal (1/2 dosis) dejando un lapso de 10 días entre cada
inyección. El análisis del estado inmunitario antes de toda
inyección demuestra que el perro JAZZ desarrolla un sistema
inmunitario de tipo Th2 con una parasitemia altamente positiva a
partir de la médula ósea.
Un mes después de la última inyección, los
signos clínicos de leishmaniosis de JAZZ desaparecen, pudiendo
destacar principalmente una cicatrización de las lesiones ulcerosas,
una desaparición importante de las escamas así como una depilación
periocular casi inexistente. La serología sigue presentando una
concentración en inmunofluorescencia igual a 1/400. En cambio, el
análisis de la respuesta celular permite afirmar que JAZZ presenta
un estado Th1 activo con una prueba de proliferación linfoblástica
positiva y una actividad leishmanicida intramacrofágica elevada.
Paralelamente, la parasitemia resultó negativa
(cultivo de médula ósea en medio NNN).
Por lo tanto, la presente invención consiste
efectivamente en un complejo vacunal y terapéutico que induce el
paso de un estado inmunitario de tipo Th2, con producción importante
de anticuerpos que exacerba las manifestaciones clínicas, hacia un
estado inmunitario de tipo Th1 que causa la curación.
A fin de evaluar la eficacia del complejo
vacunal según la invención, el complejo vacunal se probó en 6 perros
perfectamente sanos. Los 6 perros presentan una serología negativa
para Leishmania, una parasitemia negativa así como pruebas de
respuesta celular específica frente a Leishmania perfectamente
negativas.
Los 6 perros viven en un lugar exento de
flebótomos. Se definieron 3 grupos de perros, presentando cada uno
de ellos un macho y una hembra.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Grupo de control (Placebos)
- -
- Control negativo: Perro LEO de raza Pointer, sexo macho. Edad: 3 años.
- -
- Control adyuvante solo: Perra MUMA de raza Epagneul Bretón, sexo hembra. Edad: 6 años.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Grupo de perros vacunados con proteínas de Excreción Secreción de Promastigotes (ESP)
- -
- Perra MINON de raza Braco de Weimar, sexo hembra. Edad: 2 años y medio.
- -
- Perro NOUGAT de raza Pointer, sexo macho. Edad: 2 años y medio.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Grupo de perros vacunados con proteínas de Excreción Secreción de Amastigotes (ESA)
- -
- Perro LOUBARD de raza Epagneul Bretón, sexo macho. Edad: 4 años.
- -
- Perra MINA de raza Braco de Weimar, sexo hembra. Edad: 3 años.
\newpage
El esquema de inyección vacunal es el
siguiente:
| D0 | D28 | D84 | ||||||
| 1ª inyección | 2ª inyección | |||||||
| 1 dosis por | \rightarrow | 4 semanas | \rightarrow | 1 dosis por | \rightarrow | 8 semanas | \rightarrow | Prueba |
| vía subcutánea | vía subcutánea | infecciosa |
Se efectuó un seguimiento clínico de los 6
perros cada dos semanas. Los análisis biológicos se pueden
esquematizar de la manera siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis biológicos consisten en:
- -
- análisis bioquímicos: urea, creatina y transaminasas.
- -
- análisis hematológicos: numeración y fórmula.
- -
- serología leishmaniosis: inmunofluorescencia cuantitativa anti-Leishmania, a través del procedimiento Inmunotransferencia con respecto a los antígenos de excreción secreción y dosificación por el procedimiento ELISA de los IgG2 específicos.
- -
- pruebas de respuesta celular: prueba de proliferación linfoblástica, estudio de la activación de los macrófagos, prueba IDR (intradermorreactiva) y dosificación del NO.
- -
- estudio de la función neutralizadora de los anticuerpos anti-ES.
A estos análisis hay que añadir la detección de
leishmanias por observación directa al microscopio y cultivo en
medio NNN a partir de médula ósea tras la prueba infecciosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Seguimiento clínico:
Durante todo este estudio no se produjo ninguna
manifestación clínica importante. Cabe señalar una ligera pérdida de
peso y la aparición de algunas escamas en el perro LEO 2 meses
después de la prueba infecciosa.
Seguimiento biológico:
- \bullet
- Los parámetros bioquímicos y hematológicos permanecieron normales a lo largo de todo este estudio.
- \bullet
- Serología leishmaniosis y parasitemia.
Antes de toda inyección, los 6 perros
presentaban serologías y parasitemias negativas. La tabla que figura
a continuación muestra las respuestas serológicas obtenidas a partir
de los experimentos efectuados y el seguimiento de la parasitemia
(análisis efectuados 2 meses y 8 meses después de la prueba
infecciosa).
\newpage
| Serología | Parasitemia | ||||||
| (a partir de punción | |||||||
| de médula) | |||||||
| Perros | IF | WB | WB | ELISA | Examen | Cultivo | |
| cuantitativa | (ESA) | (ESP) | (IgG2) | directo | en medio | ||
| ESA/ESP | NNN | ||||||
| Perros | MUMA | - | - | - | - | + | ++ |
| control | LEO | - | - | - | - | + | ++ |
| Perros inmunizados | LOUBARD | 1/200 | + | + | +(0,700) | - | - |
| ESA | MINA | 1/200 | \pm | \pm | +(0,450) | - | - |
| Perros inmunizados | NOUGAT | 1/800 | + | + | +(0,780) | - | - |
| ESP | MINON | 1/100 | \pm | \pm | +(0,520) | - | - |
| Leyenda: |
| IF: Inmunofluorescencia (considerada positiva si la concentración es \geq 1/100). | |
| WB: Inmunotransferencia. | |
| ELISA: Cutt off = 0,300 en DO (densidad óptica). | |
| Parasitemia: cultivo en medio NNN | |
| \; - = ausencia | |
| ++ = más de 5 formas promastigotes móviles/campo. | |
| - \begin{minipage}[t]{155mm} Sólo los perros inmunizados presentan anticuerpos específicos contra las ESA y ESP (Inmunotransferencia), IgG2 específicos (ELISA) y parasitemias negativas. Cabe señalar una pequeña aparición de anticuerpos totales (1/200 en IF) en todos los perros tras la prueba infecciosa. \end{minipage} | |
| - \begin{minipage}[t]{155mm}Sólo los perros de control (LEO y MUMA) presentan parasitemias positivas, así como una ausencia de anticuerpos específicos IgG2 anti-ES. \end{minipage} |
- \bullet
- Respuesta de mediación celular
Antes de toda inyección, los 6 perros
presentaban una respuesta de mediación celular frente a
Leishmania infantum perfectamente negativa. Según la tabla
II, sólo los perros inmunizados presentan pruebas de proliferación
linfoblástica y actividades leishmanicidas intramacrofágicas
positivas asociadas a la producción de NO por los monocitos.
La tabla que figura a continuación muestra las
respuestas obtenidas de tipo celular y la función inhibidora de los
sueros sobre la proliferación parasitaria (análisis efectuados 2
meses después de la prueba infecciosa).
\newpage
| Respuestas de mediación | Porcentaje de inhibición | ||||||
| celular | de la proliferación | ||||||
| de las Leishamanias | |||||||
| Perros | IDR | Prueba de | Actividad | Dosificación | Proliferación | Proliferación | |
| proliferación | leishmanicida | del NO | de los | de los | |||
| linfoblástica | de los | (en \muM) | promastigotes | amastigotes | |||
| monocitos | |||||||
| Perros | MUMA | + | + 2,1 (3) | 15,5% | 0,3 | 20% | 15% |
| control | LEO | - | + 1,2 (3,1) | 21,5% | ND | ND | ND |
| Perros inmunizados | LOUBARD | + | ++ 2,9 (3,2) | 58,9% | ND | 50% | 41% |
| ESA | MINA | + | ++ 3,8 (4,2) | 47,8% | ND | 69% | 52% |
| Perros inmunizados | NOUGAT | + | ++ 3,1 (4,2) | 75,6% | 3,9 | 98% | 54% |
| ESP | MINON | + | +++ 3,5 (4,5) | 64,1% | 2,8 | 72% | 56% |
| Leyenda: |
| \bullet | \begin{minipage}[t]{150mm} IDR: La prueba de intradermorreacción se considera positiva (+) si la induración es \geq 5 mm 48 h después de la inyección intradérmica. \end{minipage} |
| \bullet | \begin{minipage}[t]{150mm} Prueba de proliferación linfoblástica: los resultados se expresan por lectura al microscopio fotónico y en índices de estimulación (entre paréntesis, índice de estimulación del control + Concanavalina A). \end{minipage} |
| +: | pequeña proliferación \hskip0.5cm ++: proliferación moderada \hskip0.5cm +++: gran proliferación |
| \bullet | Actividad leishmanicida de los monocitos: expresada en porcentaje de inhibición del índice parasitario. |
| \bullet | Dosificación del NO: |
| \bullet | Función inhibidora de los sueros: resultados expresados en porcentaje de inhibición del crecimiento. |
| ND = No Determinado. | |
| \bullet | Estudio de la función neutralizadora de los anticuerpos anti-ES |
Este análisis efectuado en uno de los perros de
cada grupo (tabla II) permite afirmar que los perros inmunizados por
los ES presentan anticuerpos muy eficaces que inhiben tanto la
proliferación de los promastigotes como la de los amastigotes
contrariamente a los perros de control.
Según estos análisis, el complejo vacunal induce
efectivamente una inmunidad de mediación celular de tipo Th1
protector a la que hay que añadir una inducción de anticuerpos
específicos del isotipo IgG2 que inhiben significativamente la
proliferación de las leishmanias.
Claims (11)
1. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos y en particular en el hombre, los cánidos, los félidos
y los équidos, caracterizado por estar compuesto
- por una parte, de moléculas de excreción
secreción procedentes de amastigotes y/o promastigotes de Leishmania
sp. producidas en un medio axénico y asérico perfectamente definido,
comprendiendo dicho medio:
para los amastigotes (cantidades para 800
ml):
para los promastigotes:
- y por otra parte, de muramil dipéptido.
2. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según la reivindicación 1, caracterizado
porque el muramil dipéptido está asociado a las moléculas de
excreción secreción procedentes de promastigotes y/o de amastigotes
de Leishmania sp. en una relación proteína/adyuvante de 1/0,5 a
1/4.
3. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los cánidos, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado
porque el muramil dipéptido está asociado a las moléculas de
excreción secreción procedentes de promastigotes y/o de amastigotes
de Leishmania sp. en una relación de 100 \mug de proteínas por 200
\mug de muramil dipéptido.
4. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque las moléculas de excreción secreción se
obtienen por medio de un procedimiento durante el cual se realiza
una filtración tangencial contra una membrana de 0,16 \mu de
polietersulfona para la separación de los parásitos seguida de una
concentración por un factor 100 del filtrado mediante filtración
tangencial contra un filtro de 3 kDa de polietersulfona.
5. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado por presentar la particularidad de inducir en
los mamíferos una actividad leishmanicida de los monocitos
parasitados mensurable según el procedimiento de LEMESRE de
determinación del índice parasitario tras 48 horas de
incubación.
6. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado por presentar la particularidad de inducir en
los mamíferos una activación de la inmunidad de mediación celular
dependiente de linfocitos T, y preferentemente, de linfocitos T de
tipo Th1.
7. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado por presentar la particularidad de inducir en
los mamíferos el paso de un estado inmunitario de tipo Th2 hacia un
estado inmunitario de tipo Th1.
8. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una de las reivindicaciones 6 ó 7,
caracterizado por presentar la particularidad de inducir en
los mamíferos anticuerpos específicos, y más concretamente,
anticuerpos específicos de isotipo IgG2.
9. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizado porque las moléculas de excreción secreción
procedentes de promastigotes y/o amastigotes de Leishmania sp.
presentan al menos un epitopo en la principal proteína inmunogénica
del perro.
10. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizado porque ciertas moléculas de excreción secreción
procedentes de promastigotes y/o amastigotes de Leishmania sp.
presentan actividades proteásicas no catalogadas (ni metalo, ni
serina, ni cisteína proteasa).
11. Complejo vacunal terapéutico destinado a la
prevención o al tratamiento de las leishmaniosis y de las
infecciones causadas por microorganismos patógenos intracelulares en
los mamíferos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,
acondicionado bajo una forma que le permite ser administrado por
diferentes vías: subcutánea, intradérmica, intramuscular,
intravenosa, parenteral y oral.
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