ES2640614T3 - Plasmodium purificado y composiciones de vacuna - Google Patents

Abstract

Una preparación purificada de esporozoítos infecciosos de especies de Plasmodium de glándulas salivales de mosquitos que comprenden menos de 85 nanogramos de SGM (material de glándula salival) de mosquito por cada 25.000 esporozoítos, medido por ELISA utilizando suero anti-SGM de conejo como anticuerpo primario e IgG anti- conejo conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario.

Description

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DESCRIPCION

Plasmodium purificado y composiciones de vacuna Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

Esta solicitud se refiere a la purificacion de parasitos de estadios de esporozoftos de Plasmodium. Mas particularmente, se refiere a parasitos sustancialmente puros y metodos para prepararlos y usarlos. Esta solicitud se refiere tambien a composiciones vacunales y farmaceuticas de parasitos de Plasmodium de estadios esporozoftos purificados, tanto atenuados como no atenuados, y metodos para usar las composiciones en vacunas y otras preparaciones para prevenir la malaria y otras enfermedades, tratar enfermedades y como medio de infectar a voluntarios en las pruebas de las vacunas y medicamentos contra la malaria.

Antecedentes de la tecnica

La malaria es una enfermedad que se estima que afecta a 300-500 millones de personas y que mata a 1-3 millones de personas al ano. Tambien tiene un enorme impacto economico en las personas del mundo en desarrollo, especialmente en Africa subsahariana. El Plasmodium falciparum provoca la mayona de las muertes por malaria en el mundo. La Organizacion Mundial del Turismo informo que de las cerca de 700 millones de llegadas de turistas internacionales registradas en todo el mundo en 2000, aproximadamente 9 millones correspondfan a Africa occidental, central u oriental, 37 millones a Asia sudoriental, 6 millones a Asia meridional y 10 millones a Oceania. Se calcula que mas de 30.000 viajeros de America del Norte, Europa y Japon contraen la malaria por ano. Durante mas de 100 anos durante todas las campanas militares llevadas a cabo donde la malaria era transmitida, las fuerzas estadounidenses han tenido mas vmtimas de la malaria que del fuego hostil. Se calcula que se perdieron 12.000.000 de persona dfas durante la Segunda Guerra Mundial y 1,2 millones durante el conflicto de Vietnam debido a la malaria.

La transmision del parasito de Plasmodium ocurre a traves de la mordedura y de la alimentacion de los mosquitos femeninos infectados de Anopheles que son activos del crepusculo al amanecer. El plasmodio, en el estadio de desarrollo de los esporozoftos, migra del sitio de la picadura al hngado, principalmente a traves del torrente sangumeo, donde se multiplican dentro de los hepatocitos, produciendo, en el caso de P. falciparum, aproximadamente 10.000-40.000 progenies por celula infectada. Estos parasitos de la etapa hepatica expresan algunas protemas que no se expresan en la etapa de los esporozoftos. En esta etapa, los parasitos vuelven a entrar en el torrente sangumeo como merozoftos, expresando algunas protemas que son diferentes de las expresadas durante las etapas de los esporozoftos y hepaticas tempranas, e invaden los eritrocitos, donde la multiplicacion adicional aumenta el numero de parasitos en aproximadamente 10 a 20 veces cada 48 horas. A diferencia de los cinco a diez dfas de desarrollo en el tngado, que no inducen ningun smtoma o signos de malaria, la infeccion no tratada de la fase sangumea provoca hemolisis, escalofnos temblorosos, fiebres altas y postracion. En el caso de P. falciparum, la mas peligrosa de las cuatro especies principales de Plasmodium que causan la enfermedad humana (P. vivax, P. malariae y P. ovale [P. knowlesi tambien puede causar la enfermedad humana]), la enfermedad es complicada por la interrupcion del flujo sangumeo microcirculatorio y los cambios metabolicos en organos vitales tales como el cerebro, los rinones y los pulmones, lo que frecuentemente conduce a la muerte si no se trata urgentemente.

Una vacuna eficaz contra la malaria por P. falciparum sigue siendo uno de los grandes retos de la medicina. A pesar de los mas de cien anos de esfuerzo, cientos de millones de dolares en investigacion, sacrificios de toda la vida de medicos y cientfficos dedicados y muchas vacunas experimentales prometedoras, no hay ninguna vacuna comercializada para aliviar uno de los grandes flagelos infecciosos de la humanidad.

Hace una generacion, las iniciativas de salud publica que empleaban cloroquina, DDT y programas de control de vectores parecieron estar a punto de consignar la malaria por falciparum a la insignificancia como una amenaza mundial. La falta de una vacuna efectiva complico estos esfuerzos, pero un control sostenible parecfa inminente.

La promesa del exito inminente fue de corta duracion y las razones del fracaso fueron multifactoriales. Los parasitos se hicieron cada vez mas resistentes a los medicamentos antipaludicos altamente efectivos y asequibles, las medidas de control de vectores decayeron y la transmigracion, la guerra y las perturbaciones economicas se hicieron cada vez mas comunes en las zonas endemicas del mundo en desarrollo. Como resultado, la malaria por P. falciparum resurgio, colocando anualmente a al menos 2.500 millones de seres humanos en riesgo, causando 300900 millones de infecciones y matando a 1-3 millones de personas. De los muchos problemas sociales, economicos, ambientales y politicos que afligen al mundo en desarrollo, la malaria por P. falciparum es cada vez mas vista como una causa fundamental y un resultado cruel de estas desigualdades, y es un impedimento singular para resolver estos problemas complejos. El control de la malaria por P. falciparum en el mundo en desarrollo puede no ser posible sin una vacuna eficaz. En la practica, dadas las realidades sociales, polfticas y economicas, los inventores creen que una vacuna puede ser un componente esencial de un programa de control sostenible y que sera necesaria para una campana mundial de erradicacion.

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Durante los ultimos 25 anos, la mayor parte de los esfuerzos de investigacion se han dedicado a identificar las subunidades antigenicas del parasito que confieren inmunidad - lamentablemente, con resultados poco satisfactorios. Este esfuerzo y las dificultades concomitantes en el desarrollo de una vacuna adecuada se han descrito (Nussenzweig V., F. y R. S. Nussenzweig, Adv. Immunol., (1989) 45: 283 - 334; Hoffman S.L. et al. En: Hoffman S.L., ed. “Malaria Vaccine Development: A Multi-Immune Response Approach” (1996) Washington, D. C: ASM Press, pp. 35-75; Hoffman S.L. y L.H. Miller, En: Hoffman S. L., ed. “Malaria Vaccine Development: A MultiImmune Response Approach”. (1996) Washington, D. C: ASM Press, pp. 1-13; Epstein, J.E. et al., Curr. Opin. Mol. Ther. (2007) 9: 12-24; Richie, T.L. & A. Saul, Nature, (2002) 415: 694 -701).

Hay esfuerzos continuos para producir vacunas de malaria subunitarias. Tfpico de tales intentos se encuentra en Paoletti et al. (documento de EE.UU. 5.766.597, publicado el 16/6/98), que describe un poxvirus recombinante que contiene ADN de Plasmodium que codifica una o mas protemas circumsporozottas, incluyendo una realizacion denominada NYVAC - Pf7, posiblemente util como vacuna potencial contra la malaria. Los ensayos subsecuentes de esta construccion resultaron ser decepcionantes (Ockenhouse, C.F. et al., J. Infect. Dis. (1998)177: 1664 - 73).

De forma similar, se propuso otra vacuna de circumsporozoito subunitaria candidata y se identifico como RTS, S/AS02A (Stoute J.A. et al., J. Infect. Dis. (1998) 178: 1139 - 44). Los resultados del primer ensayo de campo de la Fase 2b de esta vacuna en ninos de un ano a cuatro anos en Mozambique fueron publicados (Alonso, P.L. et al. Lancet (2004) 364:1411-1420; Alonso, P.L. et al., Lancet (2005) 366: 2012-2018, Epstein, JE et al., Supra, Richie, T.L., F. y A. Saul, Supra), asf como los resultados de otros ensayos de campo de fase 2b en infantes (Aponte, J.J. et al. 2007) The Lancet 370: 1543 - 1551; Bejon, P. et al. (2008) NEJM 359: 2521 - 32; Abdullah, S et al (2008) NEJM 359: 2533-44. La vacuna ha demostrado una eficacia protectora modesta.

Por otro lado, la demostracion de la efectividad de todo el parasito, esporozottos atenuados por radiacion (suministrados a huespedes humanos por la exposicion a mosquitos y a animales hospedantes por inoculacion intravenosa (iv)) que confieren altos niveles de inmunidad protectora cuando los receptores son posteriormente desafiados con parasitos patogenos (los mas importantes Plasmodium falciparum atenuados a los huespedes humanos) fue un hito temprano en la busqueda de una vacuna adecuada (Hoffman SL et al, J. Infect. Dis. (2002)185: 1155 - 64). Con el tiempo, esto llevo a esfuerzos para explorar los obstaculos tecnicos que se presentan en la transformacion de estas observaciones anteriores en un enfoque practico de la vacuna que comprende los esporozottos asepticos atenuados (Luke, T.C. y S.L. Hoffman, J. Ex. Biol., (2003) 206: 3803- 3808, Hoffman, S.L., y T.C. Luke, Patente de Estados Unidos N° 7.229.627 y publicacion de Estados Unidos 2005/0208078). Tambien ha conducido a un mayor interes general en la utilidad de vacunas que utilizan esporozottos atenuados (Menard, R., Nature 2005) 433: 113-114; Waters, A.P. et al. Science (2005) 307: 528 - 530; Wykes, M.F. & M.F. Good, Int. J. Parasitol. (2007) 37: 705 - 712; Renia, L. et al, Expert Rev. Vaccines, (2006) 5: 473 - 481; Epstein, J.E. et al., Supra).

Tambien se han demostrado otros modos de atenuacion. Por ejemplo, se demostro que los esporozottos atenuados resultantes de la alteracion genica de Plasmodium berghei protegen los ratones contra la malaria de P. berghei (Kappe et al., Patente de los Estados Unidos 7.122.179, Mueller et al., Nature (2005), Mueller et al., PNAS (2005); Van Dijk et al., PNAS (2005) 102: 12194 - 12199); Waters, Patente de Estados Unidos 7.550.138; Labaied et al. Infect. And Immun. (2007). Recientemente se ha descrito la atenuacion genetica de los esporozottos de P. falciparum (van Schaijk et al., PLoS ONE (2008) 3: e3549); VanBuskirk et al. PNAS.

De forma similar, se ha descrito la atenuacion qmmica de Plasmodium (Purcell et al. Infect. Immun. (2008) 76: 1193 - 99; Purcell et al Vaccine (2008) 26: 4880 - 84).

Otros han descrito tambien metodos para cultivar preparaciones no purificadas de esporozottos e inducir la diferenciacion de parasitos a estadios hepaticos axenicos (Kappe et al., Pub. de EE.UU. 2005/ 0233435).

Los estudios discutidos anteriormente establecen ciertas limitaciones. Por ejemplo, mientras que los esporozottos administrados a huespedes humanos por la picadura de un mosquito generan una respuesta inmune eficaz contra la malaria, tal metodo de administracion no es claramente un metodo practico para vacunar a una poblacion que necesita proteccion contra la malaria. Estudios adicionales en ratones, mencionados anteriormente, han sugerido que el suministro de esporozottos atenuados a ratones por via intravenosa tambien es eficaz, mientras que otros medios de administracion (por ejemplo, intramuscular) en comparacion, no lo son. Un metodo de administracion intravenosa, sin embargo, tampoco es practico si se va a administrar una vacuna antipaludica a numerosas personas (incluidos ninos y ancianos). La administracion intravenosa ha aumentado los riesgos, aumentado los costes, y los pacientes son mucho menos propensos a aceptar ser vacunados con este metodo. Por lo tanto, existe la necesidad en la tecnica de proporcionar una vacuna eficaz contra el paludismo que proporcione inmunidad protectora, donde la vacuna puede administrarse mediante una variedad de metodos.

Con respecto a las consideraciones para las vacunas humanas, la pureza del inmunogeno y la presencia o ausencia de material no espedfico auxiliar que puede ser inmunogenico o toxico son cuestiones esenciales adicionales que no han sido resueltas previamente. Las preparaciones de esporozottos atenuados aislados, tal como se usan en los estudios discutidos anteriormente, contienen material contaminante y otros materiales auxiliares. Se necesitaba en la tecnica desarrollar vacunas basadas en esporozottos, particularmente en seres humanos, que empleen preparaciones preparadas asepticamente, esteriles y purificadas de esporozottos para uso en composiciones de

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vacunas. Tales preparaciones de esporozoftos, preparadas y purificadas de forma aseptica pueden ser tambien mas eficaces que las preparaciones no purificadas cuando tales preparaciones se administran por metodos de administracion no intravenosos (por ejemplo, intramuscular, intraperitoneal, intradermica, epidermica, mucosal, submucosa, cutanea o subcutanea).

El documento de EE.UU. 2005/220822 A1 describe composiciones de esporozoftos de Plasmodium preparadas por diseccion manual de glandulas homologas de Anopheles o por centrifugacion con gradiente de densidad.

Wood et al. describen en "The use of membrane screen filters in the isolation of Plasmodium Berghei sporozoites from mosquitos", Bulletin of the World Health Organization, vol. 57, No. 1, 1979, paginas 69-74, composiciones de esporozoftos de Plasmodium preparadas por filtracion de homogenados de Anopheles a traves de una serie de membranas Nuclepore.

Breve resumen de la invencion

Una preparacion purificada de acuerdo con la presente invencion se define en la reivindicacion 1. Las caractensticas preferidas de la preparacion se definen en las reivindicaciones dependientes 2 a 12. Un metodo de purificacion de esporozoftos de Plasmodium metabolicamente activos se define en la reivindicacion 13. Otras caractensticas preferidas del metodo se definen en las reivindicaciones dependientes 14 a 21.

Se describen composiciones de esporozoftos vivos, infecciosos, sustancialmente purificados, particularmente esporozoftos de Plasmodium - esporozoftos atenuados, asf como esporozoftos patogenos. Tambien se describen metodos para producir parasitos vivos, infecciosos, sustancialmente purificados y metodos para usar composiciones de esporozoftos atenuados, sustancialmente purificados, como vacunas para prevenir la malaria. Tambien se describen metodos de utilizacion de parasitos patogenos purificados utiles para evaluar la eficacia de farmacos y vacunas antimalaricos, y en conjuncion con agentes antipaludicos tales como cloroquina, utiles para conferir inmunidad protectora.

En una realizacion util para comprender la invencion, se proporcionan metodos de utilizacion de esporozoftos de Plasmodium atenuados, producidos asepticamente, esterilizados, infecciosos, sustancialmente purificados, para conferir inmunidad protectora frente a la malaria en huespedes humanos y otros mairnferos. Tales metodos y composiciones pueden usarse para conferir inmunidad protectora contra la malaria causada por P. falciparum y otras especies de Plasmodium, sin complicaciones que puedan resultar del uso de preparaciones no purificadas.

En una realizacion util para comprender la invencion, se proporcionan composiciones de esporozoftos patogenicos de Plasmodium sustancialmente purificados y metodos para usarlos como herramientas de investigacion, en ensayos clrnicos y en regfmenes de vacunacion profilactica.

Se proporcionan composiciones de esporozoftos vivos, infecciosos, atenuados, sustancialmente purificados, asf como dosificaciones, regfmenes y vfas de administracion a seres humanos y otros sujetos mamfferos.

En una realizacion util para comprender la invencion, se proporcionan parasitos de Plasmodium purificados en un excipiente, particularmente parasitos en la etapa de desarrollo de esporozoftos, siendo dichos parasitos metabolicamente activos, infecciosos y estando sustancialmente libres de material contaminante. En otra realizacion, los esporozoftos se preparan asepticamente. En otra realizacion, los esporozoftos estan suficientemente atenuados para evitar el desarrollo mas alla del estadio hepatico (etapa de esquizonte maduro) del ciclo de vida del parasito.

En otra realizacion util para comprender la invencion, se proporcionan metodos para conferir inmunidad protectora en huespedes mamfferos y humanos contra la malaria causada por una especie de Plasmodium, que comprende proporcionar esporozoftos vivos, metabolicamente activos, infecciosos, atenuados de una especie de Plasmodium en un excipiente y estando sustancialmente libres de material asistente y administrar al menos una dosis de dicha preparacion de esporozoftos a dicho huesped; en el que se evitan las manifestaciones patologicas de la malaria y se protege al huesped contra el desarrollo de la malaria despues de una exposicion consecuente a esporozoftos de Plasmodium patogenos de dicha especie.

En otra realizacion util para comprender la invencion, se proporcionan metodos para purificar parasitos infecciosos metabolicamente activos, particularmente esporozoftos de Plasmodium, proporcionando una preparacion acuosa de pre-purificacion que comprende esporozoftos y material no esporozofto auxiliar, pasando secuencialmente la preparacion a traves de un conjunto de filtros de exclusion por tamano que comprende: a) un primer filtro de exclusion con un tamano de poro nominal capaz de retener el material auxiliar mayor de 10 micrometros y permitir el paso de los esporozoftos; b) un segundo filtro de exclusion con un tamano de poro nominal capaz de retener el material auxiliar mayor de aproximadamente 0,6 micrometros y permitir el paso de los esporozoftos; y c) un tercer filtro de membrana de exclusion por tamanos con un tamano de poro preciso capaz de retener sustancialmente todo el material auxiliar que sea mayor de 1,2 micrometros y permitir el paso de los esporozoftos. Los esporozoftos sustancialmente purificados se recogen entonces sobre un filtro colector con un tamano de poro capaz de retener los esporozoftos, y la preparacion de esporozofto purificado se eluye despues del filtro colector y se resuspenden a la concentracion deseada.

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En otra realizacion util para comprender la invencion, se proporcionan composiciones utiles para determinar la eficacia de farmacos, vacunas y similares relacionados con el paludismo. Las composiciones comprenden parasitos de Plasmodium patogenos vivos y sustancialmente purificados.

Breve descripcion de los dibujos/figuras

Figura 1 - Observacion foto-micrografica de preparaciones crudas y purificadas de PfSPZ (Campana 3).

Fotomicrograffas tomadas con un aumento de 200X.

Figura 1a - Antes de la purificacion SGM = 837 ng / 25.000 PfSPZ (Las muestras se ajustaron a 15 x 106 PfSPZ/ml)

Figura 1b - Despues de la purificacion SGM = 0,23 ng/25.000 PfSPZ (Las muestras se ajustaron a 18 x 106

PfSPZ/ml)

Figura 2 - Observacion foto-micrografica de preparaciones crudas y purificadas de PfSPZ (Campana 6).

Fotomicrograffas tomadas con un aumento de 200X.

Figura 2a - Antes de la purificacion - SGM = 781 ng/25.000 PfSPZ (Las muestras se ajustaron a 17,78 x 106 PfSPZ/ml)

Figura 2b - Despues de la purificacion - SGM = 0,65 ng/25.000 PfSPZ (Las muestras se ajustaron a 16,71 X 106 PfSPZ/ml)

Figura 3 - Expresion espedfica en la etapa de PfLSA-1 (Esporozoffos de P. falciparum versus parasitos de la etapa hepatica de 3 dfas).

Figura 3a - PfSPZ incubado con un anticuerpo monoclonal anti-PfCSP.

Figura 3b - PfSPZ incubado con anticuerpos policlonales anti-PfLSA-1.

Figura 3c - Parasitos de la etapa hepatica de 3 dfas incubados con anticuerpos policlonales anti-PfLSA-1.

Descripcion detallada de la invencion

En la actualidad no existe ninguna vacuna aprobada por la FDA para la malaria. Sin embargo, los resultados publicados en los ultimos 30 anos han demostrado que la administracion de esporozoffos de P. falciparum atenuados por radiacion, por la mordedura de mas de 1000 mosquitos infectados por P. falciparum, proporciona inmunidad protectora esteril en mas del 90% de los individuos expuestos durante al menos 42 semanas, y fue eficaz contra multiples aislamientos de P. falciparum de todo el mundo. Aunque pueden ser muy provocativas estas observaciones, no ha surgido una vacuna, o un enfoque obvio para desarrollar una vacuna contra la malaria, debido a varios obstaculos tecnicos, incluyendo aislar y purificar los esporozoffos y hacerlo bajo condiciones asepticas. Por otra parte, el trabajo de un numero de cienffficos indico que solo podna lograrse una proteccion excelente en el sistema del modelo de raton mediante la administracion intravenosa de esporozoffos atenuados. Debido a que las vfas de administracion parenteral no intravenosas utilizadas convencionalmente en la inmunizacion humana, p. ej., subcutanea e intramuscular, no condujeron a una inmunidad protectora adecuada en este sistema modelo de raton, no se considero posible desarrollar una vacuna atenuada de esporozoffos para humanos. Utilizando un sistema modelo de raton que se considera mas analogo a la malaria humana causada por P. falciparum, se ha encontrado que la administracion parenteral no intravenosa de esporozoffos conduce a una proteccion de alto nivel (Publicacion de EE.UU. No. 2005/0208078). Tambien se han superado muchos otros obstaculos tecnicos de desarrollo para una vacuna antipaludica viva atenuada farmaceuticamente aceptable, entre ellos, la produccion aseptica de cantidades suficientes de esporozoffos aislados del material auxiliar (vease particularmente Hoffman, SL y TC Luke, documento de EE.UU. 7.229.627 B2).

Sin embargo, una vacuna adecuada para uso rutinario en sujetos humanos requiere un inoculo sustancialmente puro y un inoculo de esporozoffos requiere esporozoffos que se han purificado sustancialmente de la fuente desde la cual se produjeron. Las composiciones de vacuna proporcionadas en este documento comprenden esporozoffos de Plasmodium en una forma sustancialmente purificada, sustancialmente libre de material (fuente) auxiliar, que no es espedfico para los mismos esporozoftos. Adicionalmente, en algunas realizaciones de composiciones de vacunas proporcionadas en la presente invencion, las composiciones de vacunas estan sustancialmente exentas de material contaminante, microorganismos y patogenos exogenos. Se proporcionan esporozoftos sustancialmente purificados y metodos de purificacion de esporozoftos, y composiciones de esporozoftos y excipientes purificados.

Definiciones

El termino "aproximadamente" significa dentro de una desviacion estandar segun la practica en la tecnica.

"Aditivo", tal como se utiliza en este documento como sustantivo, es un compuesto o composicion anadido a una preparacion de esporozoffo para facilitar la conservacion de la preparacion. Los aditivos pueden incluir crioprotectores, tales como DMSo y glicerol, antioxidantes, y similares.

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"Aseptico", tal como se usa en la presente memoria, significa ausencia de la introduccion de contaminacion detectable de otros microorganismos tales como bacterias, hongos, virus patologicos y similares. Un metodo aseptico de preparacion de esporozottos da como resultado una preparacion esteril de esporozottos, libres de cualquier otro tipo de microorganismo o agente infeccioso. Los ensayos microbiologicos utilizados para monitorear una metodologfa aseptica evaluan la presencia o ausencia de contaminacion. Estos incluyen, pero no se limitan a, la Prueba de Lfmites Microbianos, la actual USP <61>.

Material "auxiliar", tal como se usa en la presente memoria, significa el material en una preparacion cruda de parasitos que no es espedfica de los parasitos per se. Por ejemplo, en una preparacion de esporozottos, el material auxiliar es el que no es espedfico del esporozotto per se. El material auxiliar incluye el material espedfico para la fuente a partir de la cual se cultivaron o produjeron los esporozottos, particularmente restos biologicos, mas particularmente protemas, aislando dicho material junto con los esporozottos en una preparacion cruda. Lo que hace una preparacion "cruda" es el material auxiliar en la preparacion, y con respecto a los esporozottos, incluye material espedfico para el sustrato del que se han desarrollado los esporozottos o de los cuales se han aislado los esporozottos. Con respecto a los esporozottos disecados y aislados de las glandulas salivales de los mosquitos huesped, el material auxiliar es el material huesped, la protema huesped, el material de las glandulas salivales, la saliva y similares. El material auxiliar no incluye componentes que se han anadido intencionalmente a una preparacion, por ejemplo, excipientes, diluyentes, aditivos y similares. En algunas realizaciones, se puede volver a anadir a la preparacion purificada un componente de material auxiliar que se ha retirado de una preparacion en bruto para optimizar la inmunogenicidad del esporozotto de la infecciosidad de esporozottos o la presentacion de esporozottos al huesped. Dicho material anadido posteriormente no se considera auxiliar como se define en este documento.

"Atenuar", tal como se utiliza en la presente memoria, significa hacer que un organismo vivo no pueda completar su ciclo de vida sin matarlo. El organismo puede tener una capacidad limitada para replicarse, expresar protemas y desarrollarse a traves de algunas etapas del ciclo de vida, pero detiene el desarrollo en una etapa del ciclo de vida particular y es incapaz de progresar en el desarrollo mas alla de esa etapa. Con respecto a los parasitos de Plasmodium atenuados descritos en la presente memoria, es decir, parasitos que han estado expuestos a la radiacion en la etapa de esporozottos, retienen la capacidad de infectar hepatocitos del huesped y expresar protemas espedficas del estadio, pero son incapaces de desarrollarse mas alla de la etapa hepatica, son incapaces de volver a entrar al flujo sangumeo de huespedes infectados despues de la fase hepatica (etapa de merozotto), son incapaces de causar la patologfa de la enfermedad de la malaria. Otros parasitos de especies de Plasmodium atenuados pueden retener la capacidad de infectar hepatocitos del huesped, desarrollarse mas alla del estadio hepatico, volver a entrar en el flujo sangumeo de huespedes infectados despues del estadio hepatico (etapa de merozotto) e incluso infectar eritrocitos, pero detienen posteriormente el desarrollo antes del estadio en el que se manifiesta la patologfa de la enfermedad de la malaria.

La expresion "conferir inmunidad protectora", tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a proporcionar a una poblacion o a un huesped (es decir, a un individuo) la capacidad de generar una respuesta inmune para proteger contra una enfermedad (por ejemplo, paludismo) causada por un patogeno (por ejemplo, Plasmodium falciparum), de tal manera que las manifestaciones clmicas, la patologfa o los smtomas de la enfermedad en un huesped se reducen en comparacion con un huesped no tratado, o tal que la velocidad a la cual la infeccion, las manifestaciones clmicas, la patologfa o los smtomas de la enfermedad aparecen dentro de una poblacion se reducen, en comparacion con una poblacion no tratada.

“Contaminante” y contaminacion, como se usan en la presente memoria, significan contaminacion microbiana o viral adventicia o contaminacion patogena, incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias, virus, micoplasma, hongos y similares. Se disena un proceso aseptico para prevenir la introduccion de contaminacion y una preparacion esteril que esta ausente de la presencia de contaminacion. Los contaminantes tambien pueden ser toxicos no biologicos o inorganicos. Los contaminantes pueden ser introducidos accidental o inadvertidamente en cualquier etapa durante el proceso.

"Diluyente", tal como se usa en la presente memoria, es un medio en el que se preparan composiciones de esporozottos y esporozoftos para conseguir una concentracion deseada. El diluyente puede ser, por ejemplo, una solucion salina normal o solucion salina tamponada con fosfato, o medios tales como medio 199 o medio E199 (medio 199 con sales balanceadas de Earle).

"Excipiente" significa una sustancia inactiva utilizada como vehmulo, portador o diluyente para el ingrediente activo de una preparacion farmaceutica, tal como una vacuna. Como se usa en la presente memoria, un excipiente es un ingrediente anadido a la preparacion durante el proceso de aislamiento y purificacion para ayudar en el proceso, minimizar las interacciones no espedficas o adsorciones, y/o proporcionar volumen. Ejemplos de excipientes incluyen protemas inactivas, tales como albuminas de suero, particularmente albumina de suero humano, de cualquier fuente, incluyendo, pero no limitandose a, purificado de sangre, producido como una protema recombinante o producido sinteticamente. Los esporozoftos disecados de las glandulas salivales del mosquito pueden colocarse en un excipiente para su posterior procesamiento. El excipiente puede anadirse a preparaciones farmaceuticas por varias razones, incluyendo el mantenimiento de la actividad, el aumento de la estabilidad o la prevencion de la perdida inadvertida de esporozoftos aislados durante todo el proceso de purificacion.

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"Respuesta inmunitaria", tal como se usa en la presente memoria, significa una respuesta en el receptor a la introduccion de esporozottos atenuados caracterizados generalmente, pero sin limitacion, por la produccion de anticuerpos y/o celulas T. Generalmente, una respuesta inmune puede ser una respuesta celular, tal como la induccion o activacion de celulas T CD4 + o celulas T CD8 + espedficas para epftopos de especies de Plasmodium, una respuesta humoral de produccion aumentada de anticuerpos espedficos de Plasmodium o respuestas tanto celulares como humorales. Con respecto a una vacuna contra el paludismo, la respuesta inmune establecida por una vacuna que comprende esporozottos incluye, pero no se limita a, respuestas frente a protemas expresadas por esporozottos extracelulares u otras etapas del parasito despues de que los parasitos han entrado en las celulas huesped, especialmente hepatocitos y celulas mononucleares, tales como celulas dendnticas y/o componentes de dichos parasitos. En la presente invencion, tras la subsiguiente exposicion de organismos infecciosos, la respuesta inmune impide el desarrollo de parasitos patogenos a la fase eritrodtica asexual que causa la enfermedad.

"Intravenosa", como se define en este documento, significa la introduccion intencional, directamente en el lumen de un vaso sangumeo grande identificado, tal como una vena.

"Metabolicamente activo", tal como se utiliza en la presente memoria, significa vivo, y capaz de realizar funciones sustentativas y algunos procesos de ciclo de vida. Con respecto a los esporozottos atenuados, esto incluye, pero no se limita a, esporozottos capaces de invadir hepatocitos en cultivo e in vivo, potencialmente con una capacidad limitada para dividir y progresar a traves de algunas etapas de desarrollo, y expresar de novo protemas espedficas del estadio.

"Mitigar", segun se define en el presente documento, significa reducir sustancialmente, o moderar en intensidad, los smtomas y/o la patologfa del paludismo que de otro modo podna manifestarse despues de la vacunacion.

"Nominal", como se define en este documento y con respecto al tamano de poro de un filtro, significa el tamano de poro efectivo y se refiere al tamano de poro aparente para el paso de partfculas globulares a traves del filtro de manera que el 90% de las partfculas de dicho tamano sean excluidas por el filtro.

"Parenteral", como se define en la presente memoria, no significa a traves del canal alimentario, sino mas bien por introduccion a traves de alguna otra via, intradermica, subcutanea, intramuscular, intraorbitaria, intracapsular, intraespinal, intraesternal, intravenosa, transcutanea y similares.

"Prevenir", tal como se define en el presente documento y es utilizado en el contexto de la prevencion de la malaria, significa evitar que se manifiesten una mayona, y hasta todas, las manifestaciones patologicas y clmicas de la malaria.

"Purificar", como se define en la presente memoria y con respecto a las preparaciones de esporozottos, significa separar del material auxiliar o separar del material considerado que es indeseable.

"Esteril", como se define en este documento y con respecto a esporozottos, significa ausencia de cualquier microorganismo contaminante. Se obtiene una preparacion esteril de esporozottos mediante una metodologfa de preparacion aseptica. La esterilidad de una preparacion se determina mediante ensayos espedficos, incluyendo, pero sin limitarse a, la actual prueba de esterilidad USP <71>.

"Sustancialmente purificado", con respecto a una preparacion de esporozottos, significa la reduccion en la cantidad de contaminante auxiliar a menos de 85 ng/25.000 esporozottos o al menos una reduccion de 18 veces en la contaminacion auxiliar. La satisfaccion de cualquiera de los criterios antes mencionados es suficiente para hacer una preparacion de esporozottos "sustancialmente purificada".

"Terapeutico", como se define en la presente memoria, se refiere a la reduccion de manifestaciones clmicas o de la patologfa que ya se ha manifestado. Una "cantidad terapeuticamente eficaz", tal como se usa en la presente memoria, significa una cantidad suficiente para reducir las manifestaciones clmicas, la patologfa o los smtomas de la enfermedad en un individuo, o una cantidad suficiente para disminuir la velocidad a la que aparecen las manifestaciones clmicas, la patologfa o los smtomas de la enfermedad una poblacion.

"Vacuna", tal como se utiliza en la presente invencion, es una preparacion que comprende un agente inmunogenico y un diluyente farmaceuticamente aceptable potencialmente en combinacion con excipientes, adyuvantes y/o aditivos o protectores. El inmunogeno puede estar constituido por un agente infeccioso completo o un subconjunto molecular del agente infeccioso (producido por el agente infeccioso, de forma sintetica o recombinante). Cuando la vacuna se administra a un sujeto, el inmunogeno estimula una respuesta inmunitaria que, despues de una exposicion posterior con un agente infeccioso, protege al sujeto de una enfermedad o mitiga la patologfa, los smtomas o las manifestaciones clmicas causadas por ese agente. Una vacuna terapeutica (tratamiento) se administra despues de la infeccion y esta destinada a reducir o detener la progresion de la enfermedad. Una vacuna preventiva (profilactica) esta destinada a prevenir la infeccion inicial o reducir la tasa o la carga de la infeccion. Los agentes utilizados en las vacunas contra una enfermedad parasitaria, tal como la malaria, pueden ser parasitos muertos por completo (inactivos), parasitos atenuados vivos (incapaces de progresar completamente a lo largo de su ciclo de vida), o moleculas purificadas o artificialmente fabricadas asociadas con el parasito - p. ej. protemas recombinantes, peptidos sinteticos, plasmidos de ADN, y virus recombinantes o bacterias que expresan protemas de

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Plasmodium. Una vacuna puede comprender esporozoftos junto con otros componentes tales como excipientes, diluyentes, vetftculos, conservantes, adyuvantes u otros potenciadores inmunes, o combinaciones de los mismos, tal como senan facilmente comprendidos por los expertos en la tecnica.

Purificacion de esporozoftos

Los parasitos de especies de Plasmodium se cultivan asepticamente en cultivos, asf como in vivo en hospedadores de mosquitos de especies Anopheles, mas ftpicamente huespedes de Anopheles stephensi. Metodos de cultivo axenico de parasitos del estadio hepatico de especies de Plasmodium (Kappe et al., Pub. de EE.UU. 2005/0233435) y metodos para producir esporozoftos de especies de Plasmodium atenuados y no atenuados, en particular metodos de cultivo y atenuacion de parasitos en mosquitos y de recoleccion atenuada y esporozoftos no atenuados son conocidos en la tecnica y han sido descritos (vease, Hoffman & Luke, Patente de Estados Unidos N° 7.229.627; Pub. de EE.UU. No. 2005/0220822.

El aspecto de purificacion de la invencion separa los esporozoftos del material auxiliar, tal como el material de la glandula salival del mosquito huesped (en lo sucesivo, "SGM"), los materiales especfticos del mosquito y cualquier otro material o componente no esporozoftico, logrando asf una preparacion sustancialmente purificada que contiene esporozoftos. Como un aspecto de la purificacion, los esporozoftos se concentran con respecto al material contaminante auxiliar, tal como SGM. En este caso, la pureza de una preparacion se mide utilizando un ensayo de inmunoabsorcion enzimatica (ELISA) para cuantificar el SGM antigenico auxiliar presente en preparaciones crudas y purificadas de esporozoftos (en lo sucesivo en este documento, "SGM - ELISA"). Otros metodos, tales como, pero no limitados a, electroforesis capilar, espectrometna de masas, cromatograffa de fase inversa, inmunotransferencia, dispersion de luz y espectrometna UV, pueden adaptarse de manera similar para medir el material auxiliar. Con respecto a la purificacion de esporozoftos de fuentes distintas de los mosquitos, se adaptaran de manera similar ensayos similares, tales como ELISA, relevantes para el material auxiliar en la preparacion cruda a partir de la cual se purificaran los esporozoftos. El desarrollo de tales ensayos ELISA adaptados a anftgenos del material auxiliar a partir de fuentes distintas de las glandulas salivales de mosquito usana un protocolo similar, comunmente conocido por los expertos en la tecnica. Para ilustrar, se proporciona un protocolo para un ensayo de impurezas del SGM auxiliar. Se debe entender que este protocolo se proporciona para ilustracion y puede ser modificado, p. ej., por ampliacion o modificacion, y no pretende limitar el alcance de la invencion como se reivindica.

Metodos de purificacion

Se describen en este documento metodos de purificacion de especies de Plasmodium vivo, p. ej., Falciparum, vivax, malariae u ovale.

Los metodos descritos utilizan una serie de filtros de exclusion de tamanos de diferentes tipos y con tamanos de poro diferentes, ensamblados de una manera novedosa y no obvia. La metodologfa elimina el material auxiliar de las preparaciones de parasitos vivos y moviles. Un aspecto de este metodo es que el tamano de poro de un filtro de exclusion de tamanos en secuencia no siempre es menor que el tamano de poro del filtro de exclusion de tamanos que lo precede. Otro aspecto es que algunos filtros proporcionan una matriz con un tamano de poro nominal y al menos un filtro proporciona un filtro grabado en pista con un diametro de poro preciso. Al menos un filtro tiene un tamano de poro cercano o ligeramente menor que el diametro del parasito.

A modo de ejemplo, se describe la purificacion de esporozoftos de especies de Plasmodium; sin embargo, los expertos en la tecnica entenderan que, basandose en el tamano ftsico del organismo, el ajuste del tamano del poro del filtro dara una purificacion similar. La presente invencion se dirige a la purificacion de esporozoftos de especies de Plasmodium. Por ejemplo, el esporozofto de Plasmodium falciparum tiene forma de varilla, y aproximadamente 0,8 + 0,2 |im de diametro y 8,5 +1,5 |im de longitud. Hoffman, SL et al en Tropical Infectious Disease 2a Ed. 2006, Elsevier, Philadelphia, PA pag. 1027; Xu, L.H. et al., 1985 Zoo. Res. 6: 33-6.

Tfpicamente en una preparacion para la purificacion, las glandulas salivales de 150 a 400 mosquitos se disecan. Los esporozoftos son liberados de las glandulas salivales por el paso de ida y vuelta en una aguja y jeringa (trituracion), y los esporozoftos de estas glandulas son colectivamente purificados. Sin embargo, se pueden diseccionar varios mosquitos veces mas en preparaciones escaladas, en una realizacion hasta 1.000 mosquitos, en otra realizacion hasta 5.000 mosquitos, en otra realizacion hasta 10.000 mosquitos. Los esporozoftos son liberados de las glandulas salivales por trituracion y las preparaciones de glandulas salivales trituradas (preparaciones de purificacion previa) se purifican mediante el proceso de filtracion por exclusion de tamanos descrito en la presente memoria. Los esporozoftos se mantienen durante todo el proceso de purificacion en un excipiente, ftpicamente un por ciento de albumina de suero humano (HSA) en Medio 199 con sales de Earle (E-199).

A - Preparacion del material para la purificacion

El producto de diseccion triturado (preparacion de pre-purificacion) se recibe en conjunto en un solo tubo a la vez. Esta es la preparacion de pre-purificacion SGM. Representa aproximadamente de 100.000 a 1.000 millones de esporozoftos, preferiblemente al menos 1 millon de esporozoftos y mas preferiblemente al menos 25 millones de esporozoftos. La cantidad medida de SGM en la preparacion de pre-purificacion esta usualmente entre 300 ng y 12.000 ng por 25.000 esporozoftos, mas ftpicamente, entre 400 ng y 1.100 ng por cada 25.000 esporozoftos. La

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preparacion de pre-purificacion se diluye entonces hasta 10 ml con excipiente. Las soluciones y muestras se mantienen entre 15-30°C durante la duracion de la purificacion.

B - Procedimiento de purificacion

Usando una bomba peristaltica, se bombea la preparacion de pre-purificacion diluida a traves de una serie de filtros de exclusion de tamanos a un caudal de al menos 1 ml/min pero no mas de 1000 ml/min, preferiblemente al menos 2 ml/min, pero no mas de 500 ml/min, y mas preferiblemente con un caudal de al menos 3 ml/min y no mas de 200 ml/min. El flujo correspondiente a traves de cada filtro es al menos de 1 L/h/m2 pero no mas de 2000 L/h/m2, preferiblemente de 3 L/h/m2 a 1500 L/h/m2, y lo mas preferiblemente de al menos 125 L/h/m2 pero no mas de 250 L/h/m2. Los filtros estan conectados en serie, usualmente con tubos de silicona de grado medico. Preferiblemente, el filtro inicial (Filtro N° 1) o los dos filtros iniciales (Filtros N° 1 y N° 2) son filtros de matriz y estan hechos de polipropileno, sin embargo, puede ser utilizado nylon, ester de celulosa mezclado y vidrio de borosilicato u otros materiales conocidos por los expertos en la tecnica. Preferiblemente, el penultimo filtro (Filtro N° 3) es un filtro de membrana, lo mas preferiblemente un filtro de policarbonato grabado en pista, aunque pueden usarse otros filtros con propiedades similares conocidas por los expertos en la tecnica. Para procedimientos asepticos, los filtros son esteriles. En una realizacion, tres filtros (Filtro N° 1, Filtro N° 2 y Filtro N° 3) estan conectados en serie y los esporozoftos son capturados por filtracion final sin fin en el Filtro N° 4. Pueden utilizarse filtros adicionales. Alternativamente, solo se pueden usar uno o dos filtros (como se describe mas adelante en el Parrafo 59), sin embargo el uso de tres filtros es optimo. En una realizacion util para comprender la invencion, el filtro N° 1 es una matriz de membrana con un tamano de poro nominal de al menos aproximadamente 2,5 micras, pero no mas de aproximadamente 30 micras, preferiblemente de al menos aproximadamente 5 micras, pero no mas de 20 micras. En una realizacion, el filtro usado tiene un tamano de poro nominal de aproximadamente 10 micrometros con un area de filtracion de 17,5 cm2. (Polygard®-CN Optiscale - Millipore Cat. N° SN1HA47HH3). En una realizacion escalada, el area de filtracion es de 1800 cm2. El tamano de poro nominal del filtro N° 2 (tambien una matriz de membrana) es de al menos aproximadamente 0,3 micrometros pero no mayor de aproximadamente 1,2 micrometros. En una realizacion, el tamano de poro es de aproximadamente 0,6 micrometros con un area de filtracion de 17,5 cm2. (Filtro Polygard®-CN Optiscale - Millipore Cat. No. SN06A47HH3) - menor que el diametro de Plasmodium. En una realizacion escalada, el area de filtracion es de 1800 cm2. En una realizacion, el filtro N° 3 es un filtro de membrana grabado en pista con un diametro de poro preciso y un tamano de poro constante, y tiene un tamano de poro de al menos 1,2 micrometros pero no mayor de 3 micras, mayor que el tamano de poro nominal del filtro precedente. En una realizacion util para comprender la invencion, el filtro utilizado tiene un tamano de poro de 1,2 micrometros con un area de filtracion de 11,3 cm2. (Membrana Isopore, 47 mm de diametro - Millipore Cat. No. RTTP04700) mantenido en un soporte de filtro Swin-Loc (Whatman Cat. No. 420400). En una realizacion escalada, el area de filtracion es de 127 cm2. El material filtrado se captura en el filtro N° 4 en una celda de ultrafiltracion agitada (Millipore, modelo 8200) provista de una membrana Isopore, de 90 mm de diametro con un area de filtracion de 28,7 cm2 y un tamano de poro grabado en pista de no mas de 0,8 micras, preferiblemente no mas de 0,6 micrometros, y preferiblemente no mas de 0,2 micrometros. En una realizacion, el tamano de poro es de 0,4 micrometros (Millipore Cat. N° HTTP09030). En una realizacion escalada, el area de filtracion es de 162 cm2. En otra realizacion escalada, el area de filtracion es de 63 cm2. El sistema se lava varias veces con medios. Cuando el volumen de retenido alcanza aproximadamente 40 ml en la celula agitada, se abre la salida del recipiente celular agitado y se drena por gravedad dejando aproximadamente 5-10 ml de retenido residual, aunque el volumen de retenido puede ser reducido por otros metodos tales como aplicar presion a partir de gas comprimido, tal como nitrogeno o un dispositivo mecanico tal como un piston, la gravedad es el metodo preferido. Este retentado residual se recoge y se transfiere, junto con tres lavados usando medios de purificacion hasta un total de aproximadamente 35 ml, ftpicamente en un tubo de Oak Ridge de 35 ml esteril o un tubo de centrftuga similar (el tamano del tubo variara dependiendo del volumen de la preparacion). Los esporozoftos purificados en medios en el tubo de Oak Ridge de 35 ml se centrifugan de 5.000 g hasta 25,000 g, preferiblemente a 16,300 g, durante 2 minutos a 12 minutos, preferiblemente cinco minutos, para sedimentar los esporozoftos. El medio sobrenadante se decanta. Este paso purifica adicionalmente la preparacion de esporozoftos mediante la eliminacion de materiales mas flotantes mas pequenos y materiales solubles que permanecen en el sobrenadante.

Usando la metodologfa de filtro de exclusion de tamanos 3, este procedimiento proporciona una reduccion mayor que una reduccion sustancial del material auxiliar en la preparacion de esporozoftos purificados con respecto al material auxiliar en la preparacion de prepurificacion (factor de reduccion) de 200 a 10.000 veces. La cantidad de SGM residual en las preparaciones purificadas de esporozoftos purificados esteriles rutinariamente es inferior a 25 ng de material auxiliar por 25.000 esporozoftos (mayor que el 97% de reduccion con relacion a la cantidad inicial de SGM), preferiblemente menos de 15 ng por 25.000 esporozoftos (98% de reduccion), y mas preferiblemente menos de 1 ng por 25.000 esporozoftos (99,9%). El SGM contaminante en cada preparacion purificada descrita en la presente se reduce usualmente varios miles de veces con respecto a SGM en el material de glandula salivar prepurificada inicial triturado del que se deriva cada preparacion purificada. Preferiblemente, el factor de reduccion de purificacion es al menos 15 veces, mas preferiblemente, el factor de purificacion es al menos 1500 veces, y lo mas preferiblemente al menos 3500 veces. La media geometrica del factor de reduccion en las 10 campanas descritas en el Ejemplo 1 es 1625, una reduccion de 99,93% en SGM durante el proceso de purificacion.

Por ejemplo, las preparaciones de esporozoftos purificadas, aisladas de las glandulas salivales de los mosquitos disecados mostradas en el Ejemplo 1 (Tabla 2) conteman un intervalo de 0,19 ng a 1,01 ng SGM por 25.000

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esporozoftos y el porcentaje de reduccion de SGM auxiliar vario de 99,91% a 99,97%. Alternativamente, el metodo descrito en el Parrafo 59 a continuacion proporciona una preparacion de esporozoftos con no mas de 85 ng de SGM por 25.000 (reduccion del 95% del material SGM asociado) y se consideran sustancialmente purificados. La media geometrica de SGM en preparaciones purificadas de las 10 campanas de produccion de la Tabla 2 (utilizando 3 filtros de exclusion por tamanos) fue de 0,51 ng SGM por 25.000 esporozoftos con un intervalo de confianza del 95% de 0,34 a 0,67 ng SGM por 25.000 esporozoftos.

En una realizacion alternativa no abarcada por las reivindicaciones, el filtro N° 3 se elimina del tren de filtros descrito en el parrafo 56 anterior y se utiliza una metodologfa de filtro de exclusion de tamanos 2 (Filtro Intermedio N° 1 y Filtro N° 2). Los esporozoftos se capturan como se describe en el parrafo 56 anterior. En un ejemplo de esta realizacion, se cargo una preparacion cruda de 1.555 ng/25.000 esporozoftos y se purifico como se describe (menos el filtro N° 3). Despues de la recoleccion (ya sea en un filtro de 0,4 micras o de 0,45 micras) y la resuspension, la preparacion purificada contema 84 ng/25.000 esporozoftos. En este caso, el factor de reduccion fue mayor de 18 veces y se elimino el 94,6% de la contaminacion por SGM. Esta preparacion se considera sustancialmente purificada.

El intervalo del rendimiento de esporozoftos purificados fue entre el 30% y el 100% del numero de esporozoftos en la preparacion de partida, usualmente entre 50% y 70%.

Este metodo es eficaz para reducir la contaminacion en una preparacion de esporozoftos crudos. Los esporozoftos se conservan entonces. En una realizacion, los esporozoftos son crioconservados (Leef J.L. et al., Bull WHO 57 (supl. 1) (1979) 87-91, Orjih A.U., F. y Nussenzweig RS, Am. J. TroP. Med. Hyg. (1980) 29 (3): 343 - 7). En una realizacion, los esporozoftos se conservan por liofilizacion. En una realizacion, los esporozoftos se conservan por refrigeracion. Otros metodos de conservacion son conocidos por los expertos en la tecnica.

Atenuacion

Se conocen varios medios para inducir la atenuacion del esporozofto de Plasmodium. Estos incluyen la alteracion genetica hereditaria, la mutacion genetica, la exposicion a la radiacion y la exposicion a sustancias qmmicas mutagenicas, la exposicion a productos qmmicos de inhibicion metabolica y la exposicion a condiciones ambientales tales como alta o baja temperatura o presion.

Se han descrito metodos para inducir la atenuacion de esporozoftos por exposicion a la radiacion (vease, por ejemplo, Hoffman & Luke, Patente de Estados Unidos N° 7.229.627; publicacion de Estados Unidos N° 2005/0220822). Los esporozoftos pueden atenuarse por al menos 100 Gy pero no mas de 1000 Gy, preferiblemente de 120 a 200 Gy, y lo mas preferiblemente aproximadamente 150 Gy. La atenuacion de los parasitos de Plasmodium de la vacuna descrita en este documento permite que los parasitos del estadio de los esporozoftos permanezcan metabolicamente activos, infecciosos con la capacidad de invadir hepatocitos (potencia); al tiempo que se asegura que los parasitos no se desarrollen a la etapa completamente madura del esquizonte del hngado, no pueden volver a entrar en el torrente sangumeo del anfitrion, invadir eritrocitos ni alcanzar las etapas de desarrollo que causan la enfermedad (seguridad). Los expertos en la tecnica pueden determinar rutinariamente las etapas de desarrollo del parasito y ajustar la atenuacion segun sea necesario.

La biologfa de la infeccion por Plasmodium de los hepatocitos proporciona oportunidades para ensayos in vitro para demostrar tanto la potencia como la seguridad. Normalmente, los esporozoftos migran desde el lugar de la picadura del mosquito al fngado, principalmente a traves del torrente sangumeo, pero potencialmente a traves del sistema linfatico. En el hngado se multiplican dentro de los hepatocitos, produciendo, en el caso de P. falciparum, aproximadamente 10.000-40.000 progenie (merozoftos) por celula infectada. Estos parasitos en el estadio hepatico expresan multiples protemas, que no se expresan en esporozoftos o en etapas posteriores de desarrollo. Despues de desarrollarse en el hngado hasta la fase de merozofto, se liberan de los hepatocitos y vuelven a entrar en el torrente sangumeo, expresando un conjunto diferente de protemas espedficas del estadio - diferentes de las expresadas durante el esporozofto y los estadios hepaticos tempranos - e invaden los eritrocitos, donde la adicional multiplicacion aumenta el numero de parasitos en aproximadamente de 10 a 20 veces cada 48 horas. A diferencia del desarrollo de cinco a diez dfas en el hngado, que no induce ningun smtoma o signo de enfermedad, la infeccion no tratada de la fase sangumea provoca hemolisis, escalofnos temblorosos, fiebres altas y postracion y muchos otros smtomas y signos de malaria.

Ensayo de potencia

El nivel de potencia infecciosa de los esporozoftos de P. falciparum atenuados por radiacion y purificados puede evaluarse midiendo la expresion del Antfgeno 1 de la Etapa Hepatica de P. falciparum (PfLSA-1) en cultivos de hepatocitos humanos usando un ensayo de inmunofluorescencia (IFA). PfLSA-1 es una protema que no esta expresada por esporozoftos, pero que se expresa por parasitos de P. falciparum (tanto atenuados como naturales) despues de haber invadido con exito hepatocitos (Figura 3). La expresion de PfLSA-1 indica que los esporozoftos atenuados son metabolicamente activos.

Los hepatocitos humanos (lmea celular HC-04 [1F9], vease Prachumsri, J. y N. Yimamnuaychok, documento de EE.UU. 7.015.036) se sembraron aproximadamente 24 ± 6 horas antes de la infeccion usando una relacion 1:1 de

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medio Eagle modificado de Dulbecco y mezcla de Ham F-12 suplementada con suero bovino fetal al 10% y solucion de penicilina/estreptomicina al 2% (medio de crecimiento HC-04). Las celulas se sembraron a una concentracion de 4,0 x 104 celulas/0,3 ml/pocillo en placas de laboratorio de 8 pocillos de laboratorio Tek Permanox (NUNC) recubiertas con laminina de colageno-IV de Entactin (ECL) (Upstate) y se incubaron a 37 ± 1°C, 5% de CO2 y 80% de humedad relativa. Cuando la confluencia de la monocapa alcanza > 80% a 24 ± 6 horas despues de la siembra, el sobrenadante del cultivo se aspira de cada pocillo, se reemplaza con 0,3 ml de medio de crecimiento HC-04 fresco y se devuelve a la incubadora.

Los esporozoftos atenuados de P. falciparum se diluyen con medio de crecimiento HC-04 hasta una concentracion de 500 esporozoftos/jl. A continuacion se anaden 50 jl de la muestra de parasito diluido a cada pocillo, despues de aspirar 300 jl de medio, permitiendo que un total de 2,5 x 104 celulas infecten las celulas HC-04 en cada pocillo. Los hepatocitos infectados se incuban durante 3 ± 0,5 horas, se lavan tres veces con medio de crecimiento HC-04 por aspiracion suave del sobrenadante y se cultivan con 0,3 ml de medio fresco por pocillo. Los cultivos se observan diariamente durante tres dfas para cualquier indicacion de la presencia de contaminacion. En ausencia de contaminacion, el sobrenadante de cultivo se aspira de los pocillos individuales y se reemplaza con 0,3 ml de medio de crecimiento HC-04 fresco diariamente y se devuelve a la incubadora. A 72 ± 6 horas despues de la infeccion, los cultivos se observan microscopicamente para detectar una posible contaminacion. En ausencia de contaminacion, los cultivos se lavan tres veces con 0,3 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), se fijan a temperatura ambiente con 0,3 ml de metanol fno (almacenado a -20°C), se lavan tres veces con 0,3 ml de PBS y se almacenan en 0,3 ml del mismo. Los portaobjetos se pueden almacenar en un refrigerador a 2-8°C durante un maximo de 72 horas hasta que se tinen para inmunofluorescencia usando un suero de conejo policlonal anti-PfLSA-1 como anticuerpo primario y un anticuerpo secundario anti-conejo marcado con Alexa fluor-488. La camara de plastico y la junta se retiran de los portaobjetos tenidos. Los portaobjetos se montan utilizando el medio de montaje Vectashield (Vector) y se cubren con una cubierta sliP. Los portaobjetos se evaluan contando todos los parasitos que expresan PfLSA-1 por pocillo usando un microscopio de epifluorescencia con contraste de fase (Figura 3). Los esporozoftos se consideran potentes si no hay contaminacion de las preparaciones en ninguna etapa y el numero de parasitos fluorescentes es de al menos 200/pocillo.

Composiciones de vacuna

Se han proporcionado composiciones farmaceuticas que comprenden esporozoftos de Plasmodium vivos, tanto atenuados como patogenicos, y metodos de uso de estas composiciones como composiciones preventivas de vacuna para prevenir la enfermedad y como composiciones patogenas de desaffo para infectar a voluntarios en la prueba de vacunas y farmacos (vease particularmente Hoffman, documento de eE.UU. N° US2005/0220822). Se han considerado diversas categonas de esporozoftos atenuados para su uso en vacunas. Estos incluyen esporozoftos atenuados por diversos metodos incluyendo alteracion genetica hereditaria, mutacion genetica, exposicion a radiacion y exposicion qrnmica. Se han descrito varios aislamientos atenuados creados por manipulacion genetica directa de los parasitos para P. falciparum (van Schaijk et al., PLoS ONE (2008) 3:e3549), asf como especies de Plasmodium espedficas murinas (Kappe et al., Patente de Estados Unidos 7.122.179; Van Dijk et al., PNAS (2005) 102: 12194 - 12199, Labaied et al Infect Immun. (2007) 75: 3758). En una realizacion, la atenuacion de la radiacion de Plasmodium humano-espedfico se logra mediante la exposicion a la radiacion gamma. (Hoffman, S.L. et al. (2002)185: 1155 - 1164). Los procedimientos de purificacion proporcionados en el presente documento estan destinados a la purificacion de esporozoftos totalmente infecciosos asf como de esporozoftos atenuados.

En una realizacion, los esporozoftos de Plasmodium atenuados pueden manipularse geneticamente para contener genes exogenos de otras especies de Plasmodium o de otros organismos patogenos que se pueden expresar antes, durante o despues de la infeccion.

Tambien se contemplan metodologfas de vacunacion que comprenden esporozoftos patogenos purificados. Por ejemplo, se pueden administrar esporozoftos patogenos a individuos tratados simultaneamente con antipaludicos (por ejemplo, cloroquina) eficaces contra los parasitos asexuales de los eritrocitos o administrados a individuos tratados posteriormente con antipaludicos eficaces contra los parasitos asexuales de los eritrocitos, evitando asf la patologfa causada por los parasitos in vivo, permitiendo al mismo tiempo a los parasitos estimular respuestas inmunes protectoras. Roestenberg, M., et al. (2009) NEJM 361: 468 - 478; Pombo, DJ. et al. (2002) Lancet 360: 610 - 617.

Esporozoftos patogenos purificados y esteriles son tambien utiles en protocolos de desaffo para evaluar la efectividad de vacunas y metodologfas de vacunacion en estudios de desaffo de voluntarios previamente tratados con estas vacunas y metodologfas de vacunas. Del mismo modo, los esporozoftos patogenos purificados son utiles para generar los smtomas, signos o patologfa de la malaria en los estudios para evaluar la eficacia de los farmacos quimioprofilacticos y terapeuticos.

Los esporozoftos patogenos vivos esteriles que han sido purificados, asf como los esporozoftos atenuados vivos esteriles que han sido purificados son generalmente mas utiles que sus contrapartes no purificadas no esteriles porque las composiciones y vacunas que comprenden esporozoftos purificados esterilizados reducen o eliminan el riesgo de que el material auxiliar o contaminacion causara respuestas inmunes indeseadas, infecciones adventicias

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u otras consecuencias inesperadas. Las vacunas que comprenden esporozottos de especies de Plasmodium atenuados, vivos, purificados normalmente se administran por v^a parenteral y por otras vfas como se describe en la presente memoria. Tales vacunas son utiles para la prevencion o reduccion de la gravedad de la malaria, sus manifestaciones, smtomas o su patologfa.

En una realizacion util para comprender la invencion, las composiciones y vacunas que comprenden esporozottos purificados, atenuados, preparados asepticamente proporcionan proteccion parcial, mejorada o completa en sujetos humanos y otros mairnferos no expuestos previamente a un patogeno causante de malaria o expuestos, pero no completamente protegidos. Estas composiciones y vacunas son igualmente utiles para reducir la posibilidad de desarrollar una infeccion que produce enfermedades a partir de parasitos que causan paludismo, incluyendo especies de Plasmodium, p. ej. P. falciparum o P. vivax y similares, y reducir la posibilidad de enfermar cuando se infecta, reducir la gravedad de la enfermedad, como la fiebre, cuando uno se infecta, reducir la concentracion de parasitos en la persona infectada, o reducir las tasas de mortalidad por paludismo en poblaciones expuestas a parasitos de la malaria. En muchos casos, es beneficiosa incluso una proteccion parcial o retraso en el tiempo que toma un individuo inmunizado en comparacion con un individuo no inmunizado a infectarse con los parasitos o enfermarse de la infeccion. De manera similar, una estrategia de tratamiento de la vacuna que da lugar a cualquiera de estos beneficios en aproximadamente el 30% de una poblacion puede tener un impacto significativo en la salud de una comunidad y de los individuos que residen en la comunidad. En otras realizaciones que comprenden esporozottos patogenos, las composiciones descritas son utiles para demostrar la eficacia de vacunas, farmacos para el tratamiento de la malaria y otros tratamientos y prevenciones de la malaria.

Se proporcionan metodos para la prevencion de la malaria en un sujeto util para comprender la invencion. Los metodos comprenden administrar al sujeto una vacuna que ha sido preparada asepticamente y comprende esporozottos de Plasmodium atenuados, vivos, sustancialmente purificados en una cantidad eficaz para prevenir la malaria.

El sujeto al que se administra la vacuna de acuerdo con estos metodos puede ser cualquier humano u otro mamffero, susceptible a la infeccion con un parasito de la malaria. Para tales metodos, la administracion puede ser a traves del tracto alimentario, tal como oral, o la administracion puede ser parenteral, incluyendo, pero no limitado a, mucosa, intranasal, epidermica, cutanea, intramuscular, subcutanea, intradermica, submucosa, intravenosa y similares. Ademas, la administracion puede ser por infusion continua o por bolos unicos o multiples, asf como administracion mediada por microagujas.

La prevencion y/o el tratamiento de la malaria pueden ser facilmente comprobados por el experto en la practica mediante la evaluacion de las manifestaciones clmicas o patologicas asociadas con la infeccion paludica, por ejemplo, temperatura elevada, dolor de cabeza, fatiga, coma o porcentaje de eritrocitos parasitados. Por lo tanto, de acuerdo con los metodos de la presente descripcion, el sujeto muestra signos clmicos mejorados o ausentes, smtomas o manifestaciones patologicas de la malaria despues de la administracion de una vacuna que comprende esporozottos de Plasmodium atenuados, vivos, purificados.

Los intervalos de dosificacion eficaces y optimos para vacunas e inmunogenos pueden determinarse usando metodos conocidos en la tecnica. Se proporciona orientacion sobre las dosificaciones apropiadas para conseguir un efecto antipaludico a partir de los ensayos ejemplificados descritos en la presente memoria. Mas espedficamente, los resultados del patron de inmunizacion descrito en el presente documento y en las referencias citadas pueden ser extrapolados por personas con experiencia en la tecnica necesaria para proporcionar un programa de vacunacion de prueba. Los sujetos voluntarios son inoculados con dosis variables a intervalos programados y las muestras de sangre de prueba se evaluan para los niveles de proteccion contra la malaria despues de un desaffo posterior con parasitos infecciosos. Tales resultados se pueden usar para refinar una dosis de inmunizacion optimizada y un regimen de dosificacion (programa) para la inmunizacion eficaz de sujetos mamfferos, espedficamente humanos. Una dosis eficaz para conferir una inmunidad protectora es de 5.000 a 400.000 esporozottos atenuados purificados administrados en un regimen de dosificacion de 1 a 6 dosis, mas particularmente una dosis de 15.000 a 270.000 esporozottos atenuados purificados en un regimen de dosificacion de al menos 2 dosis y mas particularmente una dosis de 25.000 a 150.000 esporozottos atenuados purificados en un regimen de dosificacion de 3 o 4 dosis.

Una respuesta inmune en un sujeto puede medirse mediante pruebas estandar incluyendo, pero sin limitarse a ellas, la evaluacion de respuestas inmunes humorales y celulares, incluyendo, pero sin limitarse a: medicion de respuestas de anticuerpos espedficos de antfgeno o de fase de parasito; medicion directa de linfocitos de sangre periferica por medios conocidos en la tecnica; ensayos de citotoxicidad de celulas asesinas naturales (Provinciali et al. (1992) J. Immunol. Meth. 155: 19 - 24), ensayos de proliferacion celular (Vollenweider et al., 1992) J. Immunol. Meth. 149: 133 - 135), inmunoensayos de celulas inmunes y subconjuntos (Loeffler et al. (1992) Cytom. 13:169 - 174; Rivoltini et al. (1992) Can. Immunol. Immunother. 34: 241 - 251); y pruebas cutaneas para la inmunidad mediada por celulas (Chang et al. (1993) Cancer Res. 53:1043 - 1050). Se han descrito varios metodos y analisis para medir la fuerza del sistema inmune, por ejemplo, Coligan et al. (Ed.) (2000) Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley & Sons.

Las vacunas proporcionadas comprenden composiciones asepticas y no asepticas de esporozotto de Plasmodium atenuados, vivos, purificados, sustancialmente libres de material auxiliar, y composiciones con un diluyente, excipiente o vehmulo farmaceuticamente aceptable. Estas vacunas son eficaces para prevenir o mitigar la malaria

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despues de la exposicion a parasitos infecciosos. Los metodos de formulacion de composiciones farmaceuticas y vacunas son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Remington, The Science and Practice de Pharmacy 21a Edicion, Hendrickson, ed. (USIP: 2005)).

Estan comprendidas por la invencion composiciones de vacuna, preparadas asepticamente, o de otro modo, que comprenden esporozottos de Plasmodium purificados, vivos, atenuados o no atenuados, junto con un diluyente y tampon apropiado. Los diluyentes, comunmente la solucion salina tamponada con fosfato (PBS), o la solucion salina normal (NS), tienen diferentes pH y fuerza ionica en el contenido del tampon. Tales composiciones pueden incluir tambien un excipiente tal como albumina de suero, particularmente albumina de suero humano. La albumina serica puede purificarse a partir de fuentes naturales tales como sangre humana, o puede producirse mediante tecnologfas de ADN o smtesis recombinante. Dichas composiciones tambien pueden incluir aditivos tales como antioxidantes, por ejemplo, acido ascorbico, metabisulfito sodico, y/o conservantes o criopreservadores. Tambien se puede usar la incorporacion del material en preparaciones en partmulas de compuestos polimericos tales como acido polilactico, acido poliglicolico, etc., o en liposomas. (Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) paginas 1435 - 1712.

Con el fin de determinar la cantidad efectiva de las vacunas, el experto en la materia, teniendo en cuenta el contexto terapeutico, la edad y la salud general del receptor, sera capaz de determinar la dosificacion adecuada. La dosificacion seleccionada depende del efecto terapeutico deseado, de la via de administracion y de la duracion del tratamiento deseado. Los experimentos para determinar los niveles para dosificaciones pueden ser determinados por cualquier experto en la tecnica mediante ensayos clmicos humanos apropiados en los que se evaluan diversos regfmenes de dosificacion para determinar su capacidad para obtener proteccion contra la malaria.

Las vacunas descritas y los metodos divulgados de uso de estas vacunas pueden ser utiles como un componente en un regimen de vacuna, comprendiendo cada componente una vacuna discreta que se administrara por separado a un sujeto. Los regfmenes pueden incluir la inmunizacion secuencial con esporozottos atenuados de especies de Plasmodium y otros tipos de vacunas de Plasmodium, las llamadas estrategias de sensibilizacion-recuerdo “prime- boost”. Esto puede incluir los esporozoftos atenuados como una protema primaria o protemas recombinantes relacionadas con Plasmodium en un adyuvante como un refuerzo o viceversa. Esto tambien puede incluir vacunas de ADN relacionadas con Plasmodium o un virus recombinante, tal como un adenovirus, que expresa protemas relacionadas con Plasmodium, como una vacuna primaria y purificada, atenuada de esporozoftos como un refuerzo, o viceversa. Tambien puede incluir inmunizacion secuencial o mixta con esporozoftos atenuados de especies de Plasmodium y alguna forma de parasitos del estadio eritrodtico, incluyendo, muertos y vivos atenuados. Un complejo de vacuna que comprende componentes separados puede denominarse un regimen de vacuna, un regimen de cebado/refuerzo, una vacuna de componente, un kit de vacuna de componente o un envase de vacuna de componente, que comprende componentes de vacuna separados. Por ejemplo, un complejo de vacuna puede comprender como componente, una vacuna que comprende esporozoftos atenuados vivos, purificados y asepticos. El complejo puede comprender adicionalmente uno o mas componentes de vacuna subunitarios recombinantes o sinteticos, incluyendo, pero sin limitarse a, protema recombinante, polipeptido sintetico, ADN que codifica estos elementos per se o incorporado funcionalmente en virus recombinantes, bacterias recombinantes o parasitos recombinantes. Un componente de vacuna puede incluir tambien esporozoftos axenicos, atenuados, asepticos que se permiten desarrollar extracelularmente a la etapa hepatica temprana.

Se han descrito cepas de P. falciparum de diferentes partes del mundo - Africa Occidental, Africa Oriental, SE Asia, y similares. Los voluntarios inmunizados con una cepa de esporozotto atenuado exhiben proteccion contra otras cepas (Hoffman, S. L. et al. (2002) J. Inf. Dis. 185: 1155 - 1164). En una realizacion, se combinan multiples aislamientos y/o cepas de una especie de Plasmodium en una composicion de esporozotto o en una formulacion de vacuna.

Se sabe que varias especies de Plasmodium causan paludismo en los seres humanos, predominantemente P. falciparum y P. vivax. Otras especies de Plasmodium tambien causan malaria, incluyendo P. malariae y P. ovale. P. knowlesi tambien es conocido por causar enfermedades humanas. En una realizacion, dos o mas especies de Plasmodium se combinan en una formulacion de vacuna. En aun otras realizaciones, los componentes separados de un regimen de vacuna pueden derivarse de diferentes especies, por ejemplo, algunas dosis de P. falciparum y otras de P. vivax.

En otra realizacion, el esporozotto puede ser un parasito transgenico o recombinante, es decir, un parasito que incluya y exprese una secuencia de ADN o un gen que es extrano a la especie de parasito que la contiene, a la que se hace referencia en la presente memoria como un transgen. (Vease, p. ej., Franke-Fayard, et al. Molec. and Biochem. Parasitol. 2004, “A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle”. 137: 23 - 33; Wengelnik, K. et al. The EMbO J. 1999 The A-domain and the thrombospondin-related motif of Plasmodium falciparum TRAP are implicated in the invasion process of mosquito salivary glands. 18: 5195-5204). Los expertos en la tecnica entenderan que un parasito transgenico, es decir, que contiene un transgen, puede purificarse de acuerdo con la metodologfa descrita en la presente memoria de la misma manera y en el mismo grado que el parasito parental del que se ha creado el parasito transgenico.

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Recientemente, los resultados publicados indican la proteccion cruzada de especies en un sistema de malaria de roedores que ha demostrado tener un alto grado de predictibilidad de lo que ocurre con el sistema de malaria humano (Sedegah, M. et al (2007) Parasite Immunol. 29: 559 - 565). Esto sugiere que una composicion de vacuna que comprende P. falciparum puede proporcionar inmunidad protectora contra P. vivax y/u otras especies de Plasmodium humano.

Las composiciones farmaceuticas pueden ser conservadas, crioconservadas, liofilizadas, secadas por pulverizacion, refrigeradas, o termoestabilizadas a temperatura ambiente y similares.

Tanto la descripcion anterior como los ejemplos siguientes son ejemplares y explicativos solamente y no son restrictivos de la invencion, como se reivindica. Ademas, la invencion no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. Ademas, la terminologfa usada para describir realizaciones particulares no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invencion estara limitado solamente por sus reivindicaciones.

A menos que se defina lo contrario, los significados de todos los terminos tecnicos y cientfticos usados en la presente invencion son los entendidos comunmente por cualquier experto en la tecnica al que pertenece esta invencion. Un experto normal en la tecnica apreciara tambien que cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria descriptiva tambien puede usarse para practicar o probar la invencion.

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "a", "o", "el" y "la" incluyen a los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "una vacuna de esporozoftos atenuados" incluye una pluralidad de tales esporozoftos y la referencia a "el agente" incluye a la referencia a uno o mas agentes y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica, y asf sucesivamente.

Ademas, los esporozoftos que son metabolicamente activos y que estan vivos, pero atenuados en su ciclo de vida, y que tienen la capacidad de causar las manifestaciones clmicas y la patologfa de la malaria, se denominan diversamente atenuados, vivos atenuados y metabolicamente activos, vivos atenuados.

Los parametros numericos expuestos en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas de la presente invencion. Como mmimo, y no como un intento de limitar la aplicacion de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debena al menos ser interpretado a la luz del numero de dfgitos significativos reportados, aplicando tecnicas de redondeo ordinarias. Sin embargo, los valores numericos expuestos en los ejemplos espedficos se informan con la mayor precision posible. Cualquier valor numerico obtenido a partir de una medicion experimental, sin embargo, inherentemente contiene ciertos errores de la desviacion estandar de su medicion experimental.

Son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invencion a la luz de las ensenanzas anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invencion se puede practicar de manera diferente a como se describe espedficamente.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invencion. Son meramente ilustrativos de la invencion y revelan diversas propiedades beneficiosas de deltas realizaciones de la invencion. Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitantes de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Determinacion del SGM auxiliar - ELISA

Los esporozoftos de cualquier especie de Plasmodium pueden purificarse por los metodos proporcionados. Los ejemplos proporcionados en este documento describen la purificacion de los esporozoftos de P. falciparum (PfSPZ). Sin embargo, otras realizaciones utilizan P. vivax, P. ovale, P. malariae y/o P. knowlesi. Todavfa otras realizaciones utilizan mezclas de estos parasitos. Todavfa otras realizaciones utilizan esporozoftos atenuados de cada especie. Aun otras realizaciones utilizan esporozoftos atenuados que incluyen y expresan una secuencia de ADN o gen que es extrano a ese parasito.

A - Preparacion de anti-suero anti-SGM de conejo

i) Extraccion de glandulas salivales de mosquitos

Para generar anti-sueros de conejo contra las glandulas salivales de los mosquitos, se inmovilizaron mosquitos de Anopheles stephensi de 10 a 14 dfas de edad criados con insectos, colocandolos en un refrigerador a 4°C durante aproximadamente cinco minutos. Los mosquitos inmovilizados se colocaron brevemente en una placa Petri que contema etanol al 70% y luego se transfirieron a una placa Petri que contema solucion salina tamponada con fosfato IX (PBS). Un par de glandulas salivales de cada mosquito se diseco a mano en 1X PBS en un portaobjetos de vidrio de microscopio y se transfirio a un microtubo esteril claro de 1,7 ml (Axygen Scientific Inc. CA) que contiene 20-30 pl de IX PBS. Diariamente, se diseccionaron aproximadamente 100 mosquitos y se pusieron 100 pares de glandulas

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salivales en 30 |jl de PBS en un congelador a -70°C. Cuando se obtuvieron suficientes glandulas salivales para una inmunizacion, los viales se retiraron del congelador, se descongelaron a temperatura ambiente y se agruparon.

ii) Procesamiento de las glandulas salivales

Para la inoculacion primaria, las glandulas salivales se diseccionaron a partir de 1.000 mosquitos y se almacenaron a -70°C. El dfa de la inoculacion, las muestras se descongelaron, se reunieron y se lisaron por tres ciclos de congelacion-descongelacion adicionales usando un bano de hielo seco/etanol y descongelacion a temperatura ambiente. Las glandulas salivales se reconstituyeron en un volumen final de 600 jl de 1X PBS y se emulsionaron con Montanide ISA 720 (SEPPIC, Inc., Fairfield, NJ).

Para todas las inmunizaciones posteriores, las glandulas salivales se disecaron a partir de 500 mosquitos y se almacenaron a -70°C diariamente. El dfa de la inoculacion, las muestras se descongelaron, se agruparon y se homogeneizaron con un mazo (Kontes EF2488A). El mazo se enjuago con 100 jl de PBS que se anadio al grupo. La muestra se reconstituyo hasta un volumen final de 600 jl de PBS y se emulsiono en los 30 minutos despues de la reconstitucion.

iii) Emulsion de las glandulas salivales

Se obtuvieron viales de vidrio de dos ml (dos viales para el control adyuvante, dos viales para las glandulas salivales en adyuvante). 750 jl de adyuvante Montanide ISA 720 se extrajeron a traves de una jeringa de filtro de 5 micras. Se inyectaron 700 jl del coadyuvante filtrado en cada vial de vidrio. Se anadieron 300 jl de PBS al vial de control y trescientos jl de glandulas salivales en PBS al vial experimental. Los viales se cubrieron con un tapon de caucho. Cada vial se tapo adicionalmente con una tapa de sellado de aluminio y se prenso el sello con un punzonador. Los viales se colocaron en los pequenos orificios de una almohadilla de vortice, se unieron con cinta adhesiva y se sometieron a vortice durante 30 minutos.

iv) Cantidades de emulsion e inoculacion

Para la inmunizacion primaria se usaron dos viales de vidrio para emulsionar el antfgeno de 1.000 mosquitos, (cada uno de los cuales contema 1000 jl de una proporcion en volumen 300:700 de glandula salival/PBS:adyuvante de Montanide) dando un volumen de emulsion total de 2 ml. Para inmunizaciones posteriores, el antfgeno de 500 mosquitos se emulsiono de forma similar en un volumen total de 2.000 jl. Por lo tanto, se inyecto la mitad de la concentracion de antfgeno en inmunizaciones posteriores en el mismo volumen de emulsion que el inoculo primario. Los conejos de control en todas las inmunizaciones recibieron 2 ml de emulsion que contema una proporcion en volumen de 300:700 de PBS:adyuvante. Todas las emulsiones se inocularon en conejos en una hora de emulsificacion.

Los conejos experimentales recibieron 2.000 jl de emulsion de glandulas salivales:adyuvante (proporcion 300:700 en volumen) inyectada subcutaneamente en ocho sitios, 250 jl por sitio. Los conejos de control recibieron 2.000 jl de emulsion de PBS:adyuvante (proporcion 300:700 en volumen) inyectada subcutaneamente en ocho sitios, 250 jl por sitio.

v) Programa de inmunizacion de conejos

La Tabla 1 proporciona el programa de inmunizacion utilizado para generar el anticuerpo policlonal utilizado en los ejemplos proporcionados en la presente memoria. Este esquema no pretende ser limitativo con respecto al metodo de la preparacion de anticuerpos policlonales, sino que se proporciona solo como un ejemplo y la descripcion del anticuerpo usado en la presente memoria

Tabla 1 - Programa de inmunizacion

Tiempo (dfas)

Procedimiento

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Dos conejos pre-sangrados (uno control y uno experimental) para el suero que se utilizara como referencia para evaluar los tftulos de anticuerpos.

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Primera inoculacion de conejo experimental con 2.000 jl de emulsion de material de glandula salivar diseccionada de 1.000 mosquitos y conejo de control con 2.000 jl de emulsion de 1X PBS y Montanide ISA 720.

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Segunda inoculacion de conejo experimental con 2.000 jl de emulsion de material de glandulas salivales diseccionado de 500 mosquitos y conejo de control con 2.000 jl de emulsion de 1X PBS y Montanide ISA 720.

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Prueba sangrado N° 1; pre-sangrado y sueros de prueba recibidos para su evaluacion

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Tercera inoculacion de conejo experimental con 2.000 pl de emulsion de material de glandula salival diseccionada a partir de 500 mosquitos y conejo de control con 2.000 pl de emulsion de 1X PBS y Montanide ISA 720

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Prueba sangrado N° 2; sueros recibidos para su evaluacion

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Cuarta inoculacion de conejo experimental con 2.000 pl de emulsion de material de la glandula salival diseccionada de 500 mosquitos y conejo de control con 2.000 pl de emulsion de 1X PBS y Montanide ISA 720.

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Ensayo sangrado N° 3; sueros recibidos para su evaluacion.

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Basandose en los resultados del sangrado de prueba N° 3, se administro una inoculacion adicional de material de la glandula salival. La quinta inoculacion de conejo experimental con 2.000 pl de emulsion de material de glandulas salivales diseccionado a partir de 500 mosquitos y control de conejo con emulsion de 2.000 pl de 1x PBS y Montanide ISA 720.

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Se exsanguinaron conejos y se obtuvieron 45 ml de suero de cada conejo.

B - Ensayo ELISA de SGM

Se utilizo un ensayo inmunoenzimatico (ELISA) para cuantificar el material auxiliar. Como ejemplo, se cuantifico el material de las glandulas salivales (SGM) procedente de las glandulas salivales de A. stephensi en preparaciones de esporozoftos de P. falciparum. Las placas de ELISA (Nunc MaxiSorp Cert, N/Ster, PS, 96 pocillos de fondo plano Immuno Plate, Cat. 439454) con diluciones de los patrones SGM (preparados a partir de glandulas salivales de mosquitos no infectados) y muestras de esporozoftos de preparaciones de glandulas salivales crudas, asf como muestras de las preparaciones de esporozoftos purificadas fueron preparadas para el ensayo. El anticuerpo primario era suero anti-SGM de conejo (descrito en A, anterior) diluido 1:200. El anticuerpo secundario fue IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina diluida 1:5.000 (Promega, Cat. N° S373B). Se usaron los Kits KPL Blue Phos Substrate and Stop (KPL, Cat No. 50-88-06 y 50-89-00). Las placas se leyeron en un lector de microplacas Molecular Devices a 635 nm.

Existen dos componentes para el ensayo utilizado para cuantificar SGM en las preparaciones de esporozoftos. El primero consiste en generar una curva estandar con SGM de referencia de concentracion conocida, y el segundo consiste en cuantificar la cantidad de SGM presente en las muestras de pre-purificacion y post-purificacion. Se genera una nueva curva estandar para cada ensayo usando un estandar de referencia SGM (RS-SGM) de concentracion SGM conocida como antfgeno de captura. Para establecer la curva estandar, se preparo una dilucion en serie de concentracion decreciente (de 2,0 a 0,05 pg/ml) de RS-SGM en E-199 con 1% de HSA. Para evaluar el SGM residual en preparaciones de esporozoftos de pre-purificacion y post-purificacion, estas muestras tambien se diluyeron en serie en E-199 con HSA al 1%. Las muestras de RS-SGM diluidas y las preparaciones de esporozoftos se diluyeron adicionalmente a HSA al 0,25% con 1XPBS y se anadieron a la placa de ELISA por triplicado. Esta dilucion en PBS es necesaria porque disminuye el contenido de HSA. El HSA actua como agente bloqueante y puede disminuir la sensibilidad del ensayo. Las placas de ELISA recubiertas con SGM se incubaron primero con el antisuero anti-SGM policlonal de conejo (vease el parrafo 100) y luego con los anticuerpos anti-conejo marcados con enzima y finalmente con un sustrato enzimatico (vease el parrafo 101). En la presencia de SGM, el sustrato enzimatico cambia de color y las densidades opticas (OD) del contenido de los pocillos cambian. La OD de cada muestra se determino usando el lector de microplacas. Para determinar la cantidad de SGM en las preparaciones de esporozoftos, los valores de OD de estas muestras y el patron de referencia se ajustaron con un modelo mixto logfstico que tiene asmtotas comunes y pendiente pero valores de ED50 separados para cada muestra. Los valores relativos del ED50 se usaron en combinacion con la concentracion conocida (o asignada) de SGM en la muestra de referencia para estimar la concentracion de SGM en las muestras de esporozofto y VBP de prepurificacion. Los ftmites de confianza inferior y superior del 95% se determinaron de manera similar para las preparaciones de esporozoftos a partir de los datos globales que incorporaron una estimacion de la variacion basada en tres ensayos experimentales que conteman un patron de referencia comun y muestras de ensayo. A partir de los numeros de esporozoftos que se sabe que estan presentes en cada preparacion de esporozoftos, se calculo los ng de esporozoftos SGM/25.000, asf como los factores de reduccion y las reducciones porcentuales del material auxiliar.

La Tabla 2 muestra los resultados de 10 campanas de produccion. "Inicio" representa las cantidades medidas en ng de SGM/25.000 esporozoftos en preparaciones crudas agrupadas despues de la trituracion de las glandulas salivales disecadas de mosquitos infectados. "Final" representa la cantidad medida correspondiente de SGM en preparaciones que se purificaron por los metodos proporcionados en la presente memoria. Esta metodologfa da lugar a una purificacion sustancial de los esporozoftos - 99,9% o mas.

Se reconoce que los valores que surgen de las mediciones experimentales proporcionadas para ng SGM/25.000 esporozoftos se basan en los resultados del ensayo actual como se describe, no son absolutos y pueden ser algo diferentes si se usa otro ensayo o metodo de analisis.

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Tabla 2. Purificacion de esporozoftos

Numero de campana

ng[SGM]/25,000spz Factor de reduccion SGM residual (%) % de reduccion

... . 95% Cl 95% Cl Inicio Final . , . . inferior superior

1

1.091,65 1,01 0,74 1,38 1,081 0,09 99,91

2

511,00 0,19 0,12 0,28 2,689 0,04 99,96

3

836,64 0,23 0,16 0,35 3,637 0,03 99,97

4

757,11 0,29 0,20 0,41 2,610 0,04 99,96

5

847,90 0,70 0,51 0,96 1,211 0,08 99,92

6

780,66 0,65 0,47 0,90 1,201 0,08 99,92

7

893,88 0,61 0,44 0,85 1,465 0,07 99,93

8

407,37 0,29 0,19 0,44 1,404 0,07 99,93

9

508,42 0,35 0,24 0,52 1,452 0,07 99,93

10

719,45 0,67 0,48 0,94 1,073 0,09 99,91

Media geometricaa

706,88 0,51 0,34 0,67 1,625 0,07 99,93

a - Los datos que comprenden las columnas 'Inicio', 'Factor de reduccion' y 'Reduccion porcentual' estan sesgados. Por lo tanto, se calcularon las medias geometricas para estos datos. Los datos en las otras columnas se trataron de la misma manera para la consistencia.

Ejemplo 2 - Purificacion de los esporozoftos en la campana 3

Los esporozoftos se purificaron a partir de preparaciones de glandulas salivales trituradas usando filtracion de exclusion de tamanos como se describe. Los esporozoftos se mantuvieron durante todo el proceso de purificacion en medio de purificacion. Al final de la purificacion, se retiraron muestras para su observacion visual (examen microscopico), pruebas de biocarga (USP <61>), pruebas de Mycoplasma y Spiroplasma, determinacion in vitro de contaminantes virales; y el ensayo SGM-ELISA.

A - Purificacion de los esporozoftos

Preparacion del material para la purificacion: El producto de diseccion triturado de entre 272 y 356 mosquitos fue recibido en conjunto en un tubo. Se retiro una muestra (5 jl) del producto de diseccion y se dejo de lado a 22°C para su observacion visual despues de la agrupacion (Fig. 1a). El producto de diseccion restante se diluyo entonces hasta 10 ml con el medio de purificacion. Se retiro una muestra (total de 100 jl) en este punto para el recuento (20 jl) y el ensayo SGM (60 jl). Todas las soluciones y muestras se mantuvieron a aproximadamente 22°C durante la duracion de la purificacion.

Procedimiento de purificacion: Utilizando una bomba peristaltica a un caudal de aproximadamente 4 ml/min (aproximadamente 140 l/h/m2), el producto de diseccion diluido se bombeo a traves de tres filtros (filtro n° 1, filtro n° 2 y filtro n° 3) conectados en serie y capturados por filtracion sin fin en el filtro n° 4. El filtro n° 1, un filtro de profundidad, tema un tamano de poro de 10 micras (Polygard®-CN Optiscale - Millipore Cat. N° SN1HA47HH3). El tamano de poro del Filtro n° 2, un filtro de profundidad, fue de 0,6 micras (filtro Polygard®-CN Optiscale -Millipore Cat. N° SN06A47HH3). El filtro n° 3 tema un tamano de poro de 1,2 micrometres (membrana Isopore, 47 mm de diametro - Millipore Cat. RTTP04700) mantenido en un soporte de filtro Swin-Loc (Whatman Cat. No. 420400). El material filtrado se capture en el filtro n° 4 en una celula de ultrafiltracion agitada (Millipore, modelo 8200) equipada con una membrana Isopore, 90 mm de diametro y un tamano de poro de 0,4 jm (Millipore Cat. N° HTTP09030). Se bombearon un total de 100 ml de medios de purificacion para la operacion n° 1 y un total de 120 ml para las operaciones n° 2-5 a traves de las membranas junto con el producto de diseccion diluido. Esto se siguio con otros 100 ml de medio de purificacion aplicado al Filtro n° 4. Cuando el volumen de retenido alcanzo aproximadamente 5-

5

10

15

20

25

30

35

10 ml, se recogio junto con lavados utilizando medios de purificacion en un total de 35 ml que se transfirio a un tubo de centnfuga Oak Ridge de 35 ml esteril. Se recogieron otros 35 ml de lavado de una manera similar y tambien se transfirieron a un segundo tubo esteril de centnfuga Oak Ridge de 35 ml. Los tubos de Oak Ridge de 35 ml se centrifugaron a 16,340 g durante cinco minutos y se resuspendieron para contar y se mantuvieron a aproximadamente 22°C.

Despues de contar, el material se resuspendio a una concentracion de aproximadamente 15-18 x 106 esporozoftos/ml. Se retiraron 150 pl para la evaluacion de SGM y se almacenaron congelados a -70°C antes de realizar el ensayo SGM-ELISA. Se retiraron 20 pl de la preparacion de PfSPZ purificada y se aplicaron a un portaobjetos de microscopio (Figura 1b). Se dejo reposar los esporozoftos durante al menos 5 minutos, hasta 30 minutos, y se observaron los esporozoftos a un aumento de 200X. Se llevo a cabo un procedimiento similar para la muestra de pre-purificacion (Figuras 1a y 1b). Los datos espedficos para cada operacion en la campana se presentan en la Tabla 3 y un analisis microscopico (fotomicrograffa) de muestras pre- y post-purificacion se presenta en la Figura 1a y 1b.

En la campana 3, siete operaciones que utilizan entre 272 y 356 mosquitos por operacion (2146 mosquitos totales) con rendimientos de esporozoftos purificados por operacion que van del 40% al 75% (media del 57%) dando un total de 61,3 x 106 esporozoftos purificados antes de la eliminacion de todas las muestras para ensayos en proceso y de liberacion. El ensayo de SGM (Ejemplo 1 - Tabla 2 - Campana 3) mostro que los esporozoftos purificados conteman 0,23 ng SGM/25.000 esporozoftos. El contenido de SGM del material de pre-purificacion reunido contema 836,64 ng/25.000 esporozoftos. En este ejemplo hubo una purificacion total de 3.637 veces de esporozoftos en el proceso de purificacion. El ensayo de biocarga modificado uSp <61> mostro que no habfa unidades formadoras de colonias, es decir, ninguna contaminacion microbiana.

Tabla 3. Produccion de esporozoftos - Campana 3

N° de operacion

Inicio de Purificacion Final de Purificacion

Mosquitos diseccionados

PfSPZ/Mosquito (x10-3) Total PfSPZ (x10-6) Total PfSPZ (x10-6) Rendimiento (%)*

1

356 36,5 13,0 9,8 75,4

2

330 43,9 14,5 9,2 63,4

3

272 57,9 15,8 6,6 41,8

4

298 47,8 14,3 10,6 74,1

5

326 65,2 21,3 12,7 59,6

6

274 65,2 17,9 8,1 45,3

7

290 37,1 10,8 4,3 39,8

TOTAL

2146 107,6 61,3

MEDIA

50,5 57,1

% Rendimiento = 100 x (N° SPZ al final/N° SPZ al inicio)

Ejemplo 3 - Purificacion de esporozoftos en la campana 6

Los esporozoftos se purificaron a partir de preparaciones de glandulas salivales trituradas usando filtracion por exclusion de tamanos como se describe en el Ejemplo 2 anterior. Los esporozoftos se mantuvieron durante todo el proceso de purificacion en medio de purificacion. Se retiraron muestras para su observacion visual (examen microscopico), pruebas microbiologicas y ensayo SGM-ELISA para cuantificar la cantidad de SGM en las muestras. Se prepararon muestras y se purificaron como en el Ejemplo 2.

En la campana 6, ocho operaciones que utilizaron entre 343 y 395 mosquitos por operacion (2997 mosquitos en total) con rendimientos de esporozoftos purificados por operacion que oscilaban entre 51% y 87,5% (media 72,3%) dando un total de 160,5 x 106 esporozoftos purificados antes de la eliminacion de todas las muestras para ensayos en proceso y liberacion (Tabla 4). El ensayo SGM-ELISA (Ejemplo 1 - Tabla 2 - Campana 6) mostro que los esporozoftos purificados conteman 0,65 ng SGM/25.000 esporozoftos. El contenido de SGM del material de pre- purificacion reunido contema 780,66 ng/25.000 esporozoftos. En este ejemplo, hubo una purificacion total de 1,201 veces de esporozoftos en el proceso de purificacion. El ensayo de biocarga modificado USP <61> mostro que no

ha^a unidades formadoras de colonias, es decir, ninguna contaminacion microbiana. Los analisis microscopicos (fotomicrograffa) de las muestras pre- y post-purificacion se presentan en la Figura 2.

Tabla 4. Campana de produccion de esporozottos 6

N° de operacion

Inicio de Purificacion Final de Purificacion

Mosquitos diseccionados

PfSPZ/Mosquito (x10-3) Total PfSPZ (x10-6) Total PfSPZ (x10-6) Rendimiento (%)*

1

372 89,7 33,4 29,2 87,4

2

395 115,2 45,5 23,2 51,0

3

395 101,3 40,0 22,2 55,5

4

384 99,9 38,4 20,6 53,6

5

366 72,4 26,5 14,8 55,8

6

343 43,4 14,9 10,1 67,8

7

363 86,8 31,5 19,3 61,3

8

379 67,3 25,5 21,1 82,7

TOTAL

2997 255,7 160,5

MEAN

84,5 64,4

5

*% Rendimiento = 100 x (N° SPZ al final/ N° SPZ al inicio)

Ejemplo 4: Infeccion de una lmea celular de hepatocitos humanos (HC-04 [1f9]) con esporozoftos de P. Falciparum irradiados (150 gy) de las campanas 5, 6 y 7.

Metodos. Se incubaron PfSPZ durante tres dfas con celulas HC-04 (1F9), y luego se evaluo la expresion de PfLSA- 10 1.

Tabla 5. Expresion de PfLSA-1 en los parasitos de la etapa hepatica despues de la irradiacion de PfSPZ.

Campana

PfSPZ/pocillo Anticuerpo primario contra Dias en cultivo Numero de parasitos que expresan PfLSA-1 Promedio/pocillo Desviacion estandar

Pocillo 1

_o o CM o CL _o O CO o CL

5

25.000 PfLSA-1 3 356 327 387 356,7 30,01

6

25.000 PfLSA-1 3 401 359 378 379,3 21,03

7

25.000 PfLSA-1 3 426 369 381 392,0 30,05

Resultados e Interpretacion. La deteccion del antfgeno 1 del estadio hepatico de Plasmodium falciparum (PfLSA-1), expresada en parasitos del estadio hepatico, es una indicacion de la potencia de los esporozoftos atenuados y 15 purificados. Como se muestra en la Tabla 5, PfLSA-1 se expresa por parasitos de la etapa hepatica de P. falciparum despues de los esporozoftos han sido expuestos a 150 Gy.

Ejemplo 5 Infeccion de una lmea celular de hepatocitos humanos (HC-04 [1F9]) con esporozoftos de P. Falciparum irradiados (100, 120, 142,5, 150 Gy) o no irradiados.

Metodos. Los esporozoftos se incubaron durante tres dfas en celulas HC-04 (1F9), y luego se evaluo la expresion de 20 PfLSA-1.

Tabla 6. Numero de parasitos del estadio hepatico que expresan PfLSA-1 despues de diferentes dosis de irradiacion.

Dosis de radiacion (Gy)

Numero de parasitos que expresan PfLSA-1 por pocillo Desviacion estandar % CV

Pocillo 1 Pocillo 2 Pocillo 3 Media

0

363 322 341 342,0 20,52 1,37

100

321 302 287 303,3 17,04 1,21

120

286 307 323 305,3 18,56 1,22

142,5

318 337 293 316,0 22,07 1,26

150

341 309 285 311,7 28,10 1,25

Resultados e Interpretacion. Fueron anadidos 25.000 PfSPZ, que habfan sido expuestos a diferentes dosis de radiacion como se indica (Tabla 6) a cada pocillo de portaobjetos Lab-Tek de 8 pocillos que conteman celulas HC-04 (1F9). Los portaobjetos se incubaron durante 3 dfas y se evaluaron los parasitos que expresaban PfLSA-1. Como se 10 muestra en la Tabla 6, en comparacion con los esporozortos de Pf no irradiados, los esporozortos de Pf expuestos a 150 Gy teman 91% de la actividad de esporozortos de Pf no irradiados en este ensayo. Esta diferencia no alcanzo el nivel de significacion estadfstica en una prueba t de Student de dos colas (p = 0,21).

15

Claims (21)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una preparacion purificada de esporozoftos infecciosos de especies de Plasmodium de glandulas salivales de mosquitos que comprenden menos de 85 nanogramos de SGM (material de glandula salival) de mosquito por cada 25.000 esporozoftos, medido por ELISA utilizando suero anti-SGM de conejo como anticuerpo primario e IgG anti- conejo conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario.
2. 2. La preparacion purificada de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente un excipiente, y que comprende menos de 15 nanogramos de SGM de mosquito por 25.000 esporozoftos, menos de 1 nanogramo de SGM de mosquito por 25.000 esporozoftos, o menos de 0,12 nanogramos de SGM de mosquito por 25.000 esporozoftos, medido por ELISA usando suero anti-SGM de conejo como anticuerpo primario e IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario.
3. 3. La preparacion purificada de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dichos esporozoftos se purifican a partir de una preparacion de pre-purificacion de material de glandula salivar de mosquito en la que al menos el 98% de SGM de mosquito se ha eliminado de dicha preparacion de pre-purificacion, al menos 99,9% de SGM de mosquito ha sido retirado de dicha preparacion de pre-purificacion, o al menos 99,97% de SGM de mosquito ha sido retirado de dicha preparacion de pre-purificacion.
4. 4. La preparacion purificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 preparada asepticamente.
5. 5. La preparacion purificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dichos esporozoftos contienen uno o mas transgenes.
6. 6. La preparacion purificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la especie de dicho esporozofto de la especie Plasmodium se elige del grupo que consiste en P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. knowlesi y P. ovale.
7. 7. La preparacion purificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dichos esporozoftos estan suficientemente atenuados de manera que despues de la infeccion de un huesped, dichos parasitos no causan patologfa de la enfermedad de la malaria y en la que dicha atenuacion se establece mediante la introduccion de una alteracion genetica hereditaria o mutacion genetica, o por exposicion a la radiacion, exposicion qrnmica o exposicion ambiental.
8. 8. La preparacion purificada de la reivindicacion 7, en la que la atenuacion se establece por exposicion a la radiacion y donde dicha exposicion a la radiacion es de al menos 100 Gy, pero no mas de 1000 Gy de radiacion o donde dicha exposicion a la radiacion es 150 Gy.
9. 9. La preparacion purificada de la reivindicacion 7 u 8 para su uso en conferir inmunidad protectora frente a la malaria inducida por una infeccion por parasitos de la especie de Plasmodium de un huesped humano o de otro mamfero, comprendiendo dicho uso la administracion de al menos una dosis de la preparacion purificada de esporozoftos atenuados metabolicamente activos; en el que dicha preparacion purificada se prepara asepticamente y en donde las manifestaciones patologicas de dicha malaria se previenen en dicho huesped tras la exposicion subsiguiente a parasitos patogenos de dichas especies de Plasmodium.
10. 10. La preparacion purificada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, comprendiendo dicho uso la administracion de al menos dos o al menos tres dosis de dicha preparacion.
11. 11. La preparacion purificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en la confeccion de inmunidad protectora contra la malaria inducida por una infeccion parasitaria de la especie de Plasmodium en un huesped humano u otro mairftfero, comprendiendo dicho uso la administracion de un regimen de un farmaco antipaludico concurrente con la administracion de al menos una dosis de la preparacion purificada de esporozoftos patogenos asepticamente preparados de dichas especies de Plasmodium, en la que se confiere inmunidad protectora en dicho huesped humano u otro mairftfero y se evitan las manifestaciones patologicas de dicha malaria.
12. 12. La preparacion purificada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que dicho farmaco antipaludico es cloroquina.
13. 13. Un metodo para la purificacion de esporozoftos de Plasmodium metabolicamente activos, comprendiendo dicho metodo:

    a. Proporcionar una preparacion acuosa de pre-purificacion derivada de las glandulas salivales de mosquitos que comprenden esporozoftos de Plasmodium y material no esporozoftico espedfico para las glandulas salivales de los mosquitos;

    b. Hacer pasar dicha preparacion de pre-purificacion secuencialmente a traves de un conjunto de filtros de exclusion de tamanos que comprende:

    i) un primer filtro de matriz con un tamano de poro nominal de 5 a 20 micrometros;

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    ii) un segundo filtro de matriz con un tamano de poro nominal de 0,6 a 1,2 micrometros;

    iii) un tercer filtro de membrana grabado en pista con un tamano de poro de 1,2 a 3,0 micrometros;

    c. Recoger dicha preparacion de esporozottos purificados en un filtro colector de filtracion sin fin con un tamano de poro capaz de retener dichos esporozoftos; y

    d. Retirar dicha preparacion de esporozoftos purificados del filtro colector; en el que dicha preparacion de esporozoftos purificada comprende menos de 85 ng de material no esporozottico espedfico a las glandulas salivales de mosquitos por 25.000 esporozoftos, medido por ELISA usando suero anti-SGM de conejo como anticuerpo primario e IgG anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 13 en el que dichos primer, segundo y tercer filtros estan conectados secuencialmente en un sistema en el que dichos esporozoftos pasan a traves de dichos filtros con un flujo.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 14, en el que dicho sistema tiene un flujo de al menos 3 l/h/m2 pero no mas de 1500 l/h/m2, o al menos 125 l/h/m2, pero no mas de 250 l/h/m2.
16. 16. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que dicho primer filtro tiene un tamano de poro nominal de 10 micrometros.
17. 17. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en el que dicho segundo filtro tiene un tamano de poro nominal de 0,6 micrometros.
18. 18. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que dicho tercer filtro tiene un tamano de poro de 1,2 micrometros.
19. 19. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en el que dicho filtro de recogida tiene un tamano de poro de 0,4 micrones.
20. 20. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en el que dicha preparacion purificada comprende menos de 85 nanogramos de dicho material por cada 25.000 esporozoftos, menos de 15 nanogramos de dicho material por 25.000 esporozoftos, menos de 1 nanogramo de dicho material por 25.000 esporozoftos o menos de 0,12 nanogramos de dicho material por 25.000 esporozoftos.
21. 21. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 13-20, en el que al menos el 98% de dicho material se ha eliminado de la preparacion de pre-purificacion, se ha eliminado al menos el 99,9% de dicho material de la preparacion de pre-purificacion, o al menos el 99,97% de dicho material se ha eliminado de la preparacion de pre- purificacion.