BRPI0210317B1 - complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos - Google Patents
complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos Download PDFInfo
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Abstract
"complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos". complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos e em particular no homem, nos caninos, nos felinos e nos eqüídeos, caracterizado pelo fato de que ele é composto por moléculas de excreção secreção provenientes de promastigotos de leishmania sp. produzidos em um meio sem germes e sem soro definido.
Description
(54) Título: COMPLEXO DE VACINA TERAPÊUTICA DESTINADO À PREVENÇÃO OU AO TRATAMENTO DE LEISHMANIOSES E INFECÇÕES MEDIADAS POR MICROORGANISMOS PATOGÊNICOS INTRACELULARES NOS MAMÍFEROS (51) Int.CI.: A61K 39/008; A61P 33/02 (30) Prioridade Unionista: 11/06/2001 FR 01/07606 (73) Titular(es): BIO VETO TESTS (72) Inventor(es): GÉRARD PAPIEROK; SERGE VICENS; JEAN-LOUP LEMESRE (85) Data do Início da Fase Nacional: 10/12/2003
1/28
COMPLEXO DE VACINA TERAPÊUTICA DESTINADO À PREVENÇÃO OU AO TRATAMENTO DE LEISHMANIOSES E INFECÇÕES MEDIADAS POR MICROORGANISMOS PATOGÊNICOS INTRACELULARES NOS MAMÍFEROS [0001] A presente invenção refere-se a um complexo imunomodulador específico composto de antígenos de excreção e secreção de Leishmania e sua utilização nas infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares junto ao mamífero e em particular no homem, nos caninos, nos felinos e nos eqüídeos.
[0002] Mais precisamente, a presente invenção refere-se a um complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares junto ao mamífero e em particular no homem, nos caninos, nos felinos e nos eqüídeos, este complexo de vacina sendo notadamente notável em que é composto por moléculas de excreção secreção provenientes de amastigotos e/ou promastigotos de Leishmania sp. produzidas em um meio sem germes e sem soro definido.
[0003] As leishmanioses constituem um grupo de infecções parasitárias endêmicas, até mesmo epidêmicas, das regiões tropicais e subtropicais do mundo. As Leishmania, protozoários flagelados da família dos tripanosomatídeos e do gênero Leishmania, são agentes patogênicos responsáveis por esta doenças. Estes parasitas afetam numerosas espécies de mamíferos, cujo homem e cão constituem os principais reservatórios domésticos destas doenças. As leishmanias são transmitidas a estes diferentes hospedeiros quando da picada infectante de um pequeno mosquito que se chama flebótomo. Dezenove espécies de leishmanias são potencialmente capazes de infectar o homem e de acordo com as espécies de leishmanias consideradas e os fatores apropriados do hospedeiro (genético, imunológico,..) elas são a origem de manifestações clínicas muito diversas. Elas evoluem principalmente em direção a três formas clinicas distintas: cutânea, mucocutânea, e visceral de acordo com os parasitas afetam o sistema fogocítico mononucleado da derme, as mucosas ou das vísceras. A lesão cutânea pode permanecer localizada no ponto de inoculação do parasita e corresponder a uma forma benigna com cura espontânea. Ao lado disto, existem patologias mais graves
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2/28 mediadas por as leishmanioses cutâneo-difusas e cutâneo-mucosas que são muito mutilantes e desfigurantes.
[0004] A leishmaniose visceral afeta o sistema fagocítico mononucleado de numerosos órgãos e tecidos e notadamente o fígado, o baço e a medula óssea (hepatomegalia e esplenomegalia) e é fatal em ausência de tratamento.
[0005] Como todas as doenças com transmissão vectorial, as leishmanioses se caracterizam por um ciclo evolutivo que é relativamente simples porque se divide em dois hospedeiros, mamíferos e flebótomos, e compreende duas formas principais:
- uma forma flagelada chamada promastigoto, presente no tubo digestivo do vetor flebótomo, onde se multiplica antes de adquirir sua forma infectante para o hospedeiro mamífero, ainda chamado metacíclico;
- uma forma não flagelada chamada amastigoto, presente junto ao hospedeiro mamífero dos quais o cachorro e o homem.
[0006] O flebótomo vive nas regiões quentes do globo (clima quente mediterrâneo ou tropical). Para se desenvolver, ele exige uma temperatura superior a 17oC (condições ideais entre 22 a 25oC) uma atmosfera úmida e a ausência de vento.
[0007] As zonas suburbanas dos países mediterrâneos ou a presença de cães é muito importante, reúnem as condições ambientais adequadas para que os flebótomos possam se reproduzir (montes de estrume, propriedades rurais, jardins, abrigos de madeira, muros, gramados regados...), o que favorece uma maior densidade de insetos na proximidade de cães domésticas e do homem.
[0008] As leishmanioses representa ainda hoje um importante problema de saúde pública particularmente nos países em desenvolvimento e um notável assunto de estudo e de pesquisa tão bem fundamental que aplicado particularmente no domínio de imunoprofilaxia. Oitenta e sete países divididos nos 4 dos 5 continentes estão preocupados com as leishmanioses. Ameaçando em torno de 380 milhões de pessoas em todo o mundo, estas parasitoses afetam cerca de 18 milhões de pessoas no mundo, com cerca de 2 milhões de novos casos por ano, 90% destes casos sendo anotados em censos na Índia, Sultão e Brasil. Há quinze anos, a
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3/28 freqüência anual mundial era estimada em 400.000 casos (300.000 casos de leishmaniose cutânea (LC) e 100.000 casos de leishmaniose visceral (LV)), com uma incidência geral de 12 milhões de casos clínicos, e uma população em risco de cerca de 350 milhões de indivíduos. Atualmente, a freqüência anual global é estimada entre 1,5 e 2 milhões de novos casos por ano, portanto 1 a 1,5 milhões de casos de LC e 500.000 casos de LV.
[0009] Se as populações tropicais e subtropicais estão em primeira linha face a estas doenças, os riscos de contaminação canina e humana na região mediterrânea são com freqüência sub-estimados. A leishmaniose visceral a Leishmania infantum que é muito difundida nos diferentes continentes do mundo antigo, está presente sobretudo no circuito mediterrâneo, o sul da França constituindo um dos lugares. Se o vetor como o parasita presentes no sul da França parece ser melhor adaptado ao cão que ao homem, o número de casos humanos de leishmaniose, atualmente estimado a uma centena de casos anuais, está em pleno crescimento depois 10 anos e é ainda agravado pelo número crescente de indivíduos imuno-deprimidos. [0010] As leishmanioses são também consideradas como uma das doenças oportunísticas da AIDS. Numera-se cerca de 1500 casos de co-infecção de HIV / Leismania no sul da Europa, o que representa 90% dos casos recenseados no mundo sendo a Espanha o mais atacado com cerca de 60% dos casos.
[0011] O cão doméstico é o reservatório principal de parasita. A leishmaniose canina que é uma patologia corrente no circuito mediterrâneo se traduz por diversas formas clínicas que conduzem com freqüência à morte do animal. A prevalência da leishmaniose canina pode atingir 30% da população canina em algumas zonas periurbanas. De acordo com Berrahal e colaboradores (Am. J. Trop. Med. Hyg, 1996, 55, 273-277), 85% dos cães são positivos para PCR (reação de cadeia polimerase) em zona endêmica.
[0012] Atualmente, não existem meios imunoprofiláticos eficazes contra estas doenças. A terapia das leishmanioses emprega algumas moléculas disponíveis: antimônio pentavalente, pentamidina, pirazolopirimidinas, anfotericina B, aminosidina. Hoje em dia, um consenso parece se impor para considerar a
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4/28 associação de sais de antimônio pirazol pirimidinas como o tratamento de escolha da leishmaniose canina. No entanto, os cães sob tratamento permanecem infecciosos, apesar da aparente cura clínica do animal.
[0013] Isto significa que a melhora sintomática não está correlacionada com a diminuição significativa da carga parasitária e que existe um risco epidemiológico mesmo se a cura clínica persistir. Esta situação é ainda complicada pela emergência de fenômenos de quimio-resistência.
[0014] Agora, apesar dos problemas de quimio-resistência que complicam consideravelmente o tratamento, ainda não se consegue determinar a prevalência desta em zona de endemia e de seu diagnóstico junto aos pacientes. Do mesmo modo, as bases moleculares desta resistência induzida no estado medicamente importante do parasita (isto é, amastigoto) não são sempre conhecidas.
[0015] Por fim, os casos de co-infecção AIDS /leishmaniose colocam um sério problema de saúde pública na medida em que as terapêuticas disponíveis são pouco eficazes junto aos doentes de AIDS assim como qualquer outra pessoa imuno-deprimida.
[0016] Hoje, nenhuma vacina eficaz se encontra disponível para combater estas doenças e seu controle passa necessariamente pela quimioterapia. Esta última é infelizmente colocada em perigo pelos tratamentos longos, tóxicos e onerosos que acompanham numerosos casos de recaída e pela emergência de fenômenos de quimio-resistência. Parece, atualmente, como evidente, que o tratamento destas doenças parasitárias a longo prazo depende da descoberta de novos alvos terapêuticos e/ou de vacina.
[0017] A presente invenção propõe um complexo de vacina terapêutica específico de Leishmania atuando sobre a resposta imune do hospedeiro mamífero infectado.
[0018] Numerosos estudos com referência a respostas imunes durante as leishmanioses de murinos experimentais conduziram à demonstração do papel preponderante da imunidade com mediação celular e existência de uma dualidade da resposta imune. Existem, fundamentalmente, dois tipos de respostas ao encontro
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5/28 de leishmanias: uma qualificada de sensibilidade, a outra de resistência. É pela situação de linfocinas que elas secretam que as diferentes sub-populações de linfócitos T (CD4+) limitam ou exacerbam a infecção. Demonstrou-se, assim, que a sub-população de linfócitos T auxiliares de tipo Th1 (produtor de interferon gama e de interleucina 2) era capaz de eliminar as forma amastigotos intracelulares através da ativação de macrófagos (Reiner S.L. et al, Annu. Rev. Immunol. 1995, 13, 151177. Estudo). Inversamente, a sub-população de linfócitos T auxiliares de tipo Th2 (produtor de interleucina 4) é responsável pela exacerbação da doença.
[0019] No homem, alguns fatos são de natureza comparável. No cão (hospedeiro natural reservatório receptivo do ciclo evolutivo de L. infantum), a dualidade da resposta imunológica é provável. Somente um estudo realizado por Pinelli et al (Infect Immun. 62: 229, 1994) em animais experimentalmente e naturalmente infectados por L. infantum, permitiu mostrar que o assintomatismo do cão (estado cínico encontrado com freqüência) era acompanhado por uma ausência de uma resposta humoral e do desenvolvimento de uma imunidade com mediação celular de tipo Th1 com uma reação de hipersensibilidade de tipo retardada positiva e taxas elevadas de interleucina 2 e de caquectina (TNF-α) circulando nos líquidos biológicos.
[0020] Um bom candidato vacina deve, portanto, corresponder a um ou vários antígenos parasitários fortemente imunogene(s) capazes seja de bloquear a diferenciação dos linfócitos Th2 (Gurunathan S. et al, J. Exp. Med. 1997 6 out, 186, 1137- 1147) (modo de intervenção comparável aos tratamentos de dessensibilização atualmente praticados nos casos de alergia), seja favorecer a emergência de linfócitos Th1 assegurando a ocorrência de uma imunidade protetora. [0021] A presente invenção refere-se a um complexo de vacina terapêutica e preventivo anti-Leishmania que possui uma potência de vacina ligada à presença de antígenos de excreção secreção específicos contra Leishmania por ativação da via Th1.
[0022] Visar vacinar contra as leishmanias permanece ainda hoje em dia problemático. As tentativas são numerosas mas os resultados são fracos e/ou
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6/28 contraditórios. Pode-se citar a utilização de parasitas vivos, de parasitas irradiados e parasitas mortos completos (Moreau Y e colaboradores, 1994, Médecine et Armées, 22, 1, 89-93) que deram níveis de proteção variável junto aos camundongos e ao homem.
[0023] Nos anos 80, extratos purificados de antígenos parasitários foram usados junto ao cão e induzem uma exacerbação da doença: fração LIF2 e vacina antiidiotípica da equipe do Dr. Montjour (CHAUVY, J. Eassais d'imunothérapie sur une population canine en zone d'endémie leishmanienne, tese no. 36, 1993OGUNKOLADE B.W. e colaboradores. Vet Parasitol. 1988, 28, 33-41). Outros antígenos como os antígenos membranários GP63 e lipofosfoglucano (MOREAU Y e colaboradores,. Médecine et Armées, 1994, 22, 1, 89-93) não deram resultado satisfatório. Atualmente, várias moléculas estão em estudo e em espera de resultado final. Deve-se citar a proteína de choque térmico (heat shock) HSP83 de Leishmania major que estimula a via Th1 e a proteína DP72 (JAFFE. C. et al, J of Immunol. 1990, 144, 699-706). No entanto, nenhum dos protocolos atuais de imunização permite obter um nível suficiente de proteção ou não é, de nenhum modo, reprodutível.
[0024] Até agora, nenhum trabalho foi efetuado com os antígenos de excreção secreção de Leishmania.
[0025] A presente invenção consiste em um complexo imunomodulador usando estas proteínas de excreção secreção com um adjuvante induzindo seja uma imunoestimulação do sistema linfocitário T de tipo Th 1 de modo reprodutível, seja uma imunomodulação de linfócitos de tipo Th 2 para um tipo Th1.
[0026] Em numerosos parasitas como Plasmodium, Babesia, Trypanosoma, toxoplasma ou Shistosoma, foi demonstrado que os antígenos de excreção secreção (AES) desempenhavam um papel preponderante no estabelecimento da resposta imune do hospedeiro. Os AES de leishmanias parecem implicados na penetração do macrófago pelos parasitas, na inibição de enzimas proteolíticas lisossomais do macrófago e a regulação negativas das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (Alexander et Russel, Adv. Parasitol. 1992, 31, 175- 254). Aliás,
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7/28 abordagens de vacinas feitas com camundongos utilizando os AES já foram visadas com sucesso em diferentes parasitoses (Ouaissi et al, Parasitology, 1990, 100, 11524, James et al Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg, 1989, 83, 67-72; Précigout et al, Infect. Immun. 1991, 59, 2799- 805, Darcy et al, Ann. Biol. Clin, 1989, 47, 451- 7, Capron et al, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 1995, 90, 235-4).
[0027] Mas a dificuldade de obtenção e os numerosos contaminantes séricos e/ou celulares contidos nos sobrenadantes de cultura tornaram difícil sua utilização em vacinação.
[0028] O meio de cultura descrito no pedido de patente de invenção WO 94 /26 899 permite resolver parcialmente estas dificuldades e dispor de uma fonte abundante, apropriada e pouco onerosa de AES dos principais estados parasitários de leishmanias.
[0029] A fim de obter um bom rendimento de cultura dos promastigotos e amastigotos de Leishmanias, o meio da patente Wo 96 /26 899 foi modificado como a seguir • Para uma cultura de amastigotos, a adição de compostos sulfurados como a L-cisteína e/ou produtos nutritivos como o ácido batocuproina sulfônico foi suprimida, [0030] O meio MA1 de base com os compostos sulfurados é tal que:
| Constituintes | Quantidades para 800 ml |
| Meio de base | |
| - meio 199 H® (x10) com sais de | 100 ml |
| Hanks)* | 5 g |
| - Trypto-caseíne de soja ® | 0,35 g |
| -NaHCO3 | 0,75 g |
| - L-glutamina | 5,95 g |
| -HEPES | 2,50 g |
| - D(+) glucose | Q.S. 800 ml |
| - H20 | |
| - Meio 199 H modificado ® | |
| - (x10)** | 4 ml (5%) |
| Aditivos | |
| -hemina bovina | 0,009 mM |
| - Glutathion reduzido | 0,08 mM |
| - solução de vitaminas (x100) | 2% |
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8/28 [0031] Adiciona-se a 1000 ml do meio MA1, L-cisteína (3 mM) e ácido batocuproina dissulfônica (0,01 mM).
[0032] O meio MA1m (m para modificado) é o meio mA1 sem L-cisteína e sem ácido batocuproina dissulfônica de um lado, a hemina bovina foi substituída pela hemina porcina irradiada a 25 kilogray a uma concentração nitidamente mais baixa (0,003 mM).
[0033] Os meios MA1 e MA1m foram semeados com uma cepa de Leishmania infantum MON1 e uma comparação do crescimento dos amastigotos é efetuada no tempo (ver figura 1).
[0034] Para a cultura de promastigotos, uma baixa da concentração de 2 componentes (RPMI e hemina) assim como a adição de um antibiótico (gentamicina) constituem a principal modificação do meio de referência.
[0035] É necessário acrescentar que a hemina bovina foi substituída pela hemina porcina irradiada a 25 kilogray como no caso da modificação do meio para amastigotos.
| Meio MP para promastigotos | Meio MPm (modificado) para promastigotos |
| RPMI 1640 (1,1x) 1000 ml Com L glutamina e Hepes Meio 199H modificado (10 x) 2% Hemina bovina 0,0005% | RPMI 1640 (1x) 1000 ml Meio 199H modificado 10x 2% Hemina porcina irradiada 0,0002% Gentamicina sulfato 0,04 mg |
[0036] Os meios MP e MPm foram semeados com uma cepa de Leishmania infantum MON1 e uma comparação do crescimento dos promastigotos e efetuados no tempo (ver figura 2) [0037] O complexo obtido de acordo com a invenção compreende moléculas naturalmente excretadas pelos promastigotos e/ou amastigotos de Leishmania sp. assim como um adjuvante que induz preferivelmente uma resposta a mediação celular.
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9/28 [0038] Estas moléculas apresentam pelo menos um epítopo comum levado por uma ou várias proteínas principais. Seu peso molecular varia de 32Kda a 200 Kda de acordo com as espécies de Leishmanias e em função do estado parasitário considerado (figura 3, detecção de um epítopo comum junto às diversas espécies de Leishmanias por anticorpo monoclonal F5. A: extratos Triton x 100 de promastigotos 1 e 2; L. amazonensis (45 kDa) 3 e 4. L. infantum (54 kDa), 5: L. chagasi (36 kDa), B: AES de promastigotos). Estas moléculas nativa expressam atividades proteásicas (figura 4a, atividade proteásica (gel de eletroforese compreendendo gelatina) 1 = testemunho complexo vacinal, 2 e 3 = complexo de vacina estudado) não registrados (nem metalo, nem serina, sem cisteína protease) são desprovidos de qualquer contaminante sérico ou celular.
[0039] As formas de promastigotos ou amastigotos são cultivadas em meio sem germes e sem soro completamente definido pelo processo descrito no pedido de patente de invenção WO 94 /26 899 acima citado e a modificação apresentada pelo requerente.
[0040] As culturas são inoculadas à razão de 5.105 parasitas por mililitro de meio de cultura. Os parasitas, após incubação, são eliminados por filtração tangencial contra uma membrana de 0,16 μ em poliétersulfona e o filtrado é concentrado 100 vezes por filtração tangencial contra um filtro de 3 kDa em poliétersulfona.
[0041] Cada dose liofilizada, estabelecida após estudo efeito dose (figura 5, 6, e 7) é constituída por um liofilizado de 100 μg de proteínas de excreção secreção de Leishmanias e um diluente composto de 1 ml de soro fisiológico estéril.
[0042] A composição assim obtida é administrada ao mamífero infectado em presença de um adjuvante, preferivelmente muramil dipeptídeo.
[0043] De modo preferido, a relação proteína /adjuvante está compreendida entre 1 /0,5 e 1 /4.
[0044] Os estudos efetuados junto ao cão permitiram determinar a dose de vacina ótima a 200 μg de muramil dipeptídeo com um começo de resposta a partir de 100 μg de proteínas infectadas.
[0045] O mecanismo de ação específica do complexo de vacina obtido de acordo
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10/28 com a invenção é verificado com a ajuda de métodos clássicos permitindo a dosagem das proteínas, sua identificação, e a medida de sua atividade proteásica (técnicas Western blot ou immunoblotting e SDS-PAGE), e com a ajuda de métodos mais específicos demonstrando que o complexo de vacina terapêutica inovante atuava seja por imunoestimulação do sistema linfocitário de tipo Th1, seja por imunomodulação de um tipo Th2 para um tipo Th1.
[0046] O processo Western blot permite a detecção individual de proteínas notadamente proteínas de excreção secreção amastigotos (ESA) e excreções secreções promastigotos (ESP) por reação antígeno /anticorpo com os imuno-soros correspondentes.
[0047] Para cada mamífero estudado (cão por exemplo), uma análise sorológica é efetuada com os ESA e ESP.
[0048] As proteínas do complexo de vacina são a princípio separadas por eletroforese descontínua em gel poliacrilamida (PAGE) em presença de dodecil sulfato de sódio (SDS). Esta separação é seguida por uma transferência eletroforética de proteínas em uma membrana de nitrocelulose de acordo com o processo de Towbin et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76, 4350-4354). Estas proteínas são em seguida detectadas por reação imuno-enzimática por meio de um anticorpo monoclonal Anti-ESP (figura 4b: Western blot obtido com um anticorpo monoclonal anti-AES de promastigotos, 4b1: proteínas de marcação (kDa), 4b2: lote ESP a controlar, 4b3: lote ESP de referência).
[0049] Um exame parasitológico é efetuado a partir de amostra retirada diretamente sobre o candidato estudado, cão, por exemplo.
[0050] Um esfregaço a partir de punção de medula óssea é efetuado em uma lâmina. Este esfregaço, uma vez fixado em metanol, é colorido com May Grumwald Giemsa e observado em microscópio com imersão (x 1000).
[0051] As retiradas de medula óssea são colocadas em cultura em meio de cultura bifásica NNN (Novy e Mac Neal, 1904, J. Infec. Dis. 1-1-30) portanto RPMI 1640 adicionado de 20% de soro de bezerro fetal descomplementado constitui a fase líquida. Retiradas cego são realizadas todos os quatro a seis dias. As culturas
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11/28 são regularmente observadas em microscópio fotônico (X 400) durante 20 min.
[0052] As parasitemias são quantificadas como a seguir:
+ / - : formas alongadas refringente imóvel;
+ : 1 a 5 formas promastigotos móveis / campos, ++ : > 5 formas promastigotos móveis / campos;
+++ : cultura com confluência.
[0053] Colocação em evidência de implicação de uma imunidade com mediação celular de tipo Th1 [0054] Leishmanias de formas promastigotos são cultivadas nos meios de cultura definidos de acordo com os métodos descritos previamente. Parasitas de fim de fase exponencial (6-7 dias) são coletados. O caldo parasitário é lavado três vezes por centrifugação (2500 g, 15 min, 4 °C), em tampão PBS. Após ter verificado a viabilidade de parasitas com a ajuda de um colorante vital (o azul tripano), uma suspensão contendo 2 x 108 parasitas por ml é inativada por tampão PBS contendo 0,01% de mertiolate (Pinelli et al, 1994, Infect. Immun 62, 229-235). Isto constitui as leishmaninas para o teste de intradermoreação (JDR).
[0055] O estudo da resposta imunitária de tipo Th1 abaixo é efetuado nos cães. [0056] Os cães são colocados em decúbito lateral e uma dosa delicada e não irritante e efetuada na zona torácica de cerca de 5 cm em 10 cm na traseira da cauda. Quatro círculos de 10 mm de diâmetro são delimitados com a ajuda de um feltro.
[0057] Injeta-se, no centro dos círculos 0,1 ml de solução em intra dermoinjeção. Dois círculos recebem a solução de leishmaninas e os dois outros círculos recebem solução salina com mertiolato em controle negativo. A leitura da intra dermo reação (IDR) ocorre 48 h mais tarde por meio de uma régua pequena de alergólogo. [0058] O teste é considerado positivo se a média de dois diâmetros de induração observada é superior ou igual a 5 mm. A observação de um eritema sem induração será considerada como um teste negativo (Pinelli et al, 1994, Infect. Immun. 62 229235, Marty et al, 1994, Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg, 88, 658- 659).
[0059] Efetua-se, em seguida, um teste de proliferação linfocitária.
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12/28 [0060] As células mononucleadas de sangue periférico (PBMC) dos cães são separadas sobre gradiente de Ficoll (densidade 1,078) por centrifugação a 800 g durante 20 min em temperatura ambiente. As células são colocadas em cultura em placa de 96 reservatórios na concentração de 2.105 células por reservatório em presença de 2 ,ug por ml de Concanavalina A (Sigma), 5 ,ug por ml de ES P ou 20 ml de sobrenadantes de cultura coletados em fase estacionária de crescimento dos promastigotos (SP) por reservatórios, e em ausência de qualquer aditivo em um volume de 200 ml de meio RPMI 1640 contendo 5% de soro de bezerro fetal descomplementado, 2 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina por ml, 100 mg de estreptomicina por ml. As concentrações ótimas de antígenos e de mitogenes foram determinadas nas experiências anteriores. Os PBMC são incubados durante 72 h em uma atmosfera úmida 37 °C em presença de 5% de CO2, depois durante 20 h com 0,5 pCi de 3 H timidina. As células são coletadas em filtro e incorporação da radioatividade é determinada por contagem em líquido cintilante (contador β). Todos os testes são realizados em triplicata.
[0061] Um método imuno-histoquímico mais rápido e mais sensível usando o BrdU (5-bromo-2'- desoxiuridina), um análogo estrutural da timidina é também usado para medir a proliferação celular (BrdU, kit de detecção de proliferação de célula, BrdU, III, Boehringer Manheim, Alemanha. Nas experiências dos requerentes, o BrdU é adicionado durante 18 h após 72 h de incubação. As células que incorporaram o BrdU em seu DNA são facilmente detectáveis em presença de um anticorpo monoclonal dirigido contra o BrdU.
[0062] As respostas proliferativas são expressas em índices de estimulação que representam a relação da média de proliferação após estimulação sobre a média de proliferação em ausência de antígeno.
[0063] A proliferação linfocitária foi também estimada nas leituras visuais em microscopia fotônica (- : negativo, + /- : leve proliferação; + : pequena proliferação em menos de 5 pontos por campo microscópico; ++ : proliferação média em mais de 5 pontos; +++ forte proliferação).
[0064] A titulação da atividade leishmanicida dos monócitos é efetuada de acordo
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13/28 com o método LEMESRE descrito abaixo.
[0065] Para este teste, os monócitos e os linfócitos são isolados a partir de sangue venoso dos cães. Os monócitos são colocados em cultura durante 3 dias à razão de 105 células por reservatório nas câmaras de cultura (Labteck) em um meio RPMI 1640 completo (contendo 25 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina por ml, 100 mg de estreptomicina por ml e 10% de soro de bezerro fetal inativado) a 37°C em uma atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após 3 dias de cultura, os macrófagos são lavados em meio RPMI completo, adicionados de meio novo e colocados em contato com as formas de promastigotos metacíclicas de L. infantum em uma relação de 5 parasitas por células, a 37°C, durante uma noite ou 5 h de acordo com as experiências. Os macrófagos são então lavados com meio RPMI completo novo para eliminar os parasitas não fagocitados. As células são colocadas em incubação seja sozinhas, seja em presença de 5 ,ug de antígenos ESP, seja em presença de linfócitos autólogos, seja em presença de sobrenadantes de co-cultura de macrófagos infectados e linfócitos autólogos e testemunhos correspondentes (coletados em 5 h) e isto a 37°C em uma atmosfera úmida a 5% de CO2 para uma duração de 48 h. Quando são usados, os linfócitos cultivados separadamente são lavados, contados e adicionados aos macrófagos na proporção de 2 linfócitos por macrófago.
[0066] Após 48 h de incubação, as células são lavadas três vezes em tampão PBS 0,01 M, pH 7,2, fixadas em metanol depois coloridas com Giemsa. A atividade leishmanicida dos macrófagos é estimada em microscopia fotônica (1000X) determinando a porcentagem de macrófagos infectados e o número de formas de amastigotos intactos para 100 células (2 vezes 200 células são observadas em duplicata). Os resultados são expressos em porcentagem de inibição de índice parasitário = 100 - (IP x 100).
[0067] IP = índice parasitário = [(o número médio de amastigotos por macrófago na amostra tratada) x (a porcentagem média de macrófagos infectados na amostra tratada)] / [(o número médio de amastigotos por macrófago na amostra testemunho) x (a porcentagem média de macrófagos infectados na amostra testemunho)].
[0068] Pode-se igualmente proceder à dosagem do monóxido de nitrogênio (NO)
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14/28 para conhecer a atividade destrutiva de monócitos ao encontro de Leishmanias. A síntese de NO pelos monócitos é, com efeito, sinal de destruição das leishmaninas pelos monócitos tendo sido ativados pelas citocinas de tipo interferon gama (IFN γ). [0069] O NO possui uma alta reatividade química. Em presença d'água e de oxigênio, esta molécula é rapidamente oxidada de modo estequiométrico e forma, assim, nitritos (NO2-) de acordo com a reação:
NOo + O2 = 2H2O --- 4 NO2 + 4 H+ [0070] Os nitritos se acumulam nos meios e são facilmente detectáveis quimicamente pelo método de Griess.
[0071] A 50 gl de sobrenadante a testar, adiciona-se 60 μ! de Griess A (sulfanilamida 1% em HCI 1,2N) e 60 μl de Griess B (N-(l-naftil)-etil- enodiamina 0,3%). A reação colorimétrica se desenvolve ao abrigo da luz durante 2 minutos. As densidades ópticas obtidas a 540 nm são corrigidas pela subtração dos DO obtidos sobre os reservatórios contendo o meio de cultura apenas.
[0072] Os valores obtidos são relatados em uma curva padrão (DO = f(NO2-) realizada a partir de concentrações conhecidas de NO2-.
[0073] A tabela abaixo mostra as respostas sorológicas obtidas quando das experiências dos requerentes e a seqüência da parasitemia (análises efetuadas 2 meses e 8 meses após prova infecciosa).
| SOROLOGIA | PARASITEMIA (sob punção de medula) | ||||||
| Cães | IF Quantitat ivo | WB (ESA) | WB (ESP) | ELISA (IgG2) ESA/ ESP | Exame Direto | Cultura sob meio NNN | |
| Cães Testemu nhas | MUMA | + | ++ | ||||
| LEO | - | - | - | - | + | ++ | |
| Cães imunizad os ESA | LOUBA RD | 1/200 | + | + (0,700 ) | |||
| MINA | 1/200 | ± | ± | + | - | - |
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15/28
| (0,450 ) | |||||||
| Cães imunizad os ESP | NOUGA T | 1/800 | + | + | + (0,780 ) | ||
| MINON | 1/100 | ± | ± | + (0,520 ) |
Legenda
IF: imunofluorescência (considerada positiva se o título for > 1 /100)
WB : Western blot
ELISA: corte = 0,300 em DO (densidade óptica)
Parasitemia: cultura em meio NNN
- = ausência ++ = mais de 5 formas de promastigotos móveis / campos [0074] A tabela seguinte mostra as respostas obtidas de tipo celular e o papel inibidor de soros sobre a proliferação parasitária (análises efetuadas 2 meses após a prova infecciosa).
| RESPOSTA À MEDIAÇÃO CELULAR | Porcentagem de inibição da proliferação de leishmanias | ||||||
| Cães | IDR | Teste de prolif. De linfoblás tico | Atividad e leshman icida de monócit os | Dosage m de NO (em pM) | Prolif. De promasti gotos | Prolifer ação de amastig otos | |
| Cães | MUMA | + | + 2,1 (3) | 15,5% | 0,3 | 20% | 15% |
| Testemunh as | LEO | - | + 1,2 (3,1) | 21,5% | ND | ND | ND |
| Cães imunizados | LOUBAR D | + | ++ 2,9 (3,2) | 58,9% | ND | 50% | 41% |
| ESA | MINA | + | ++ 3,8 (4,2) | 47,8% | ND | 69% | 52% |
| Cães imunizados | NOUGA T | + | ++ 3,1 (4,2) | 75,6% | 3,9 | 98% | 54% |
| ESP | MINON | + | +++ 3,5 (4,5) | 64,1% | 2,8 | 72% | 56% |
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16/28
Legenda
IDR : O teste intra dermo reação é considerado positivo (+) se a induração for de > 5 mm 48 h após intradermoinjeção
Teste de proliferação linfoblástica: os resultados são expressos pela leitura em microscopia fotônica e em índices de estimulação (entre parênteses, índice de estimulação do testemunho + concanavalina A) + pequena proliferação ++ : média proliferação +++ forte proliferação atividade leishmanicida dos monócitos: expressa em porcentagem de inibição de índice parasitário dosagem do NO:
papel inibidor dos soros: resultados expressos em porcentagem de inibição do crescimento
ND = não determinado [0075] Papel inibidor dos anticorpos anti-fatores de excreção secreção sobre o desenvolvimento parasitário de L. infantum [0076] Estes teste visam mostrar o eventual efeito inibidor dos anticorpos anti-ES sobre a proliferação e a diferenciação in vitro de parasitas.
[0077] 100 μ! de imuno-soro previamente inativado (56 °C duração 45 min) de diferentes grupos de cães são colocados em contato duração três minutos a temperatura ambiente com 5 x 106 formas de promastigotos metacíclicos. Os testes de viabilidade antes e após tratamento (cf. acima) são realizados para estabelecer as porcentagens de mortalidade. Os parasitas assim tratados são colocados em cultura, seja a 25 °C, no meio RPMI 1640 contendo 10% SVF (soro bezerro fetal), seja a 37 °C no meio MAA /20 (106 parasitas por ml de meio). As cinéticas de proliferação de formas de promastigotos assim como de amastigotos são estabelecidas por contagem diária das células em microscopia fotônica. Os resultados são expressos em porcentagem de inibição de crescimento.
[0078] O caráter inovador do complexo de vacina de acordo com a invenção não reside apenas na indução de uma resposta celular específica de tipo Th1 mas
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17/28 igualmente na produção de fracas taxas de anticorpos muito eficazes para os promastigotos e os amastigotos de Leishmania.
[0079] Para o desenvolvimento dos estudos, outras técnicas particulares foram usadas.
[0080] Método de prova infecciosa [0081] A prova infecciosa consiste em injetar em intravenosa 106 promastigotos em fase metacíclica tratados com complemento para cães sadios e de 5.106 macrófagos peritoneais de cão sadio, infectados in vitro pelos amastigotos.
[0082] Os promastigotos e os macrófagos infectados são diluídos em soro fisiológico estéril para um volume final de 1,5 ml. Esta mistura é efetuada logo antes da injeção.
[0083] Detecção de imunoglobulinas de tipo G2 (IgG2) de cães, específicos de ES [0084] Esta detecção é efetuada pelo método Western blot usando um conjugado anti IgG2 (imunoglobulinas G2) de cão e pelo método ELISA de acordo com a técnica de microtitulação de Kweider et al (J. Immunol. 1987, 138, 299).
[0085] O complexo vacinal de acordo com a invenção pode ser administrado de diversos modos. No entanto, ele é administrado de modo preferencial por 4 vias:
- seja por injeção sub-cutânea
- seja por injeção intra-dérmica
- seja por injeção intra-muscular
- seja por via oral [0086] Outros modos de administração podem ser empregados como a via parenteral ou intravenosa.
[0087] De modo geral, uma vacina se apresenta sob uma forma injetável composta de uma fração liofilizada que se retoma por uma fração líquida ou diluente. As doses usadas para a prevenção e a imunoterapia são diferentes, e são igualmente diferentes de acordo com o modo de injeção:
• por via sub-cutânea e intra-muscular
- injeção de uma dose (100 ,ug de proteínas excretadas secretadas e
200 ,ug de adjuvante) junto aos cães, qualquer que seja a raça, idade, sexo para um
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18/28 efeito preventivo).
- injeção de semi-doses (50 gg de proteínas excretadas secretadas e 100 gg de adjuvante) para a imunoterapia de cães leishmanianos.
• por via intra-dermo
- injeção de semi-dose junto aos cães para um efeito preventivo.
- injeção de quarto de dose para os cães leishmanianos para um efeito terapêutico.
[0088] Os métodos de injeções são retomados nos exemplos de imunoterapia e de vacinação, assim como nos estudos de inocuidade.
[0089] Os estudos de inocuidade sobre o complexo vacinal foram feitos em 30 cães.
[0090] Todos os cães são beagles adultos de 1 ano a 6 anos, 50% machos, 50% fêmeas, provenientes de zona não endêmica. Estes cães são perfeitamente saudáveis, apresentando uma sorologia e um teste intra-dermo reação (IDR) negativos frente a Leishmania.
[0091] Dentre os cães, alguns recebem placebos. Paralelamente ao acompanhamento clínico, uma seqüência do estado imunitário específico frente ao complexo de vacina é efetuada (demonstração de indução de imunidade com mediação celular e humoral de tipo Th1 apenas junto aos cães vacinados).
[0092] Desenvolvimento dos testes [0093] Os testes foram feitos em BPL (Boas práticas de laboratório) e em BPC (boas práticas clínicas).
[0094] (primo vacinação) 4 semanas dose 4 semanas dose suplementar 4 semanas de observação reiterada de observação (2 doses de observação simultâneas) [0095] As doses são injetadas por via sub-cutânea.
[0096] Uma seqüência da tolerância é efetuada:
[0097] Após administração, um exame visual direto: dor, tumefação, calor e prurido é efetuado quotidianamente ao ponto de injeção duração 14 dias.
[0098] Uma seqüência da tolerância geral é igualmente efetuada. Trata-se de um
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19/28 exame rápido diário com tomada da temperatura, um exame clínico veterinário semanal incluindo uma palpação ganglionar (poplíteo), uma palpação abdominal, a seqüência de artrites e uveítes e uma pesagem.
[0099] As seqüências hematológicas e bioquímicas (creatinina, uréia, transaminases) são efetuadas 3 semanas após cada injeção vacinal.
[00100] Resultados de inocuidade [00101] Dentre os 30 cães, que compreendem 7 placebos, nenhum mal geral foi observado. Apenas algumas reações locais menores devem ser notadas: leve edema no ponto de injeção, eritema moderado e leve prurido. Estes males são benignos e retrocedem espontaneamente em 24 a 48 h. Eles são totalmente lógicos para uma vacina com mediação celular.
[00102] Nenhuma anomalia foi notada ao nível de seqüências hematológicas e bioquímicas. Os resultados similares foram obtidos após injeção intra-dérmica junto a 5 cães e após injeção intra-muscular junto a 5 cães.
[00103] O complexo de vacina não apresenta, portanto, nenhum problema de inocuidade.
[00104] Ativação específica de linfócitos T de tipo Th1 [00105] Paralelamente à seqüência sorológica por imunofluorescência clássica usando lâminas revestidas por promastigotos (método de referência sorológico para a leishmaniose canina) que se revela fraca em todos os cães, o estudo da resposta com mediação celular por teste de proliferação linfoblástica e por estudo da atividade leishmanicida dos monócitos, é efetuada sobre os 30 cães.
[00106] Os 7 placebos não induzem uma resposta celular específica de antígeno de vacina, por outro lado os 23 cães apresentam bem uma indução do sistema Th1 com notadamente os índices de proliferação linfocitários específicos do complexo de vacina comparáveis ao índice testemunho (concanavalina A) que são acompanhados por porcentagens de inibição do índice parasitário elevados (> 40% com uma média de 60% sobre 23 cães vacinados).
[00107] O complexo de vacina tem portanto o efeito de ativar os monócitos para as Leishmania por intermediário de linfócitos ao mesmo tempo não tendo nenhum efeito
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20/28 sobre o sistema Th2.
[00108] Estudo efeito da dose do complexo de vacina [00109] Esta experiência tem por fim determinar a dose de vacina mínima que induz uma resposta Th1 eficaz.
[00110] Para isto 12 cães beagle adultos de 1 a 6 anos de zona não endêmica são divididos em 6 grupos de 2?
1o. grupo : placebo
2o. grupo : placebo + 200 ,ug de adjuvante
3o. grupo : 25 ,ug proteínas excretadas secretadas e 50 ,ug de adjuvante 4o grupo : 50 ,ug proteínas excretadas secretadas e 100 ,ug de adjuvante 5o. grupo : 100 ,ug proteínas excretadas secretadas e 200 ,ug de adjuvante 6 o. grupo : 200 ,ug proteínas excretadas secretadas e 400 ,ug de adjuvante [00111] Estes ensaios foram feitos em BPL e BPC.
[00112] Primo vacinação 4 semanas 2a. injeção 4 semanas Prova infecciosa [00113] A prova infecciosa consiste em infectar os cães por via intra venosa com a ajuda de promastigotos em fase metacíclica e monócitos infectados de amastigotos [00114] Após a 2a. injeção, o estudo do estado imune permite afirmar que os cães tendo recebido o complexo de vacina estão bem em Th1 com um começo de resposta máxima em patamar a partir de 50 ,ug de proteínas excretadas secretadas injetadas. Este fenômeno de patamar é também observado no teste de proliferação linfocitária como para a atividade de monócitos.
[00115] O gráfico da figura 5 mostra os resultados dados pelo estudo de efeito de dose: estudo da proliferação linfoblástica de acordo com a dose de vacina injetada. [00116] Por outro lado, um estudo parasitêmico sobre punção de medula é efetuado 2 meses após a prova infecciosa usando o meio de cultura de referência NNN (Novy e Mac Neal, J. Infect. Dis, 1904, 1, 1-30).
[00117] Os 4 cães placebo e um cão tendo recebido 50 ,ug de proteínas excretadas secretadas apresentam uma parasitemia positiva.
[00118] O grafismo da figura 6 mostra os resultados dados para o estudo de efeito
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21/28 de dose: estudo da parasitemia, 6 semanas após a prova infecciosa de acordo com a dose de vacina injetada.
[00119] Anticorpos específicos ligados ao sistema Th1 [00120] Como foi demonstrado previamente, o sistema Th1 corresponde a uma resposta com mediação celular com uma ativação de macrófagos via os linfócitos produtores de citocinas específicas. Este é o papel principal do complexo de vacina de acordo com a invenção. Esta resposta celular é acompanhada por uma fraca resposta humoral que pode-se demonstrar facilmente pelo método clássico de imunofluorescência usando um conjugado anti IgG total marcado com fluoresceína. [00121] No entanto, alguns trabalhos preliminares junto ao homem (KAWANO.P et al, Parasite Immunol. 1995, 17, 451- 458) e junto ao cão (NIETO C.G. et al, Vet Immunol. and Immunopathology, 1999, 67, 117- 130) demonstram que os isotipos de IgG seriam marcadores da dicotomia imune Th1/Th2. Mais precisamente, um cão atingido pela leishmaniose com sinais clínicos de comprovação apresenta uma taxa elevada de anticorpos principalmente de isotipo IgG1 enquanto que um cão assintomático apresenta anticorpos específicos de isotipo IgG2. Os cães tendo recebido o complexo de vacina de acordo com a invenção apresentam taxas baixas de IgG2 específicas das proteínas excretadas secretadas, o que está de acordo com a expansão preferencial de linfócitos T de tipo Th1.
[00122] O gráfico da figura 7 mostra a resposta específica dos cães vacinados em IgG2 para o complexo de vacina objeto da invenção de acordo com a dose de vacina injetada (método ELISA sobre recipientes).
[00123] RESULTADOS EM IMUNOTERAPIA [00124] De acordo com os versados como PINELLI (PINELLI. E et al, Infect. Immun. 1994, 62, 229- 235), os cães leishmanianos correspondendo à ativação do sistema linfocitário de tipo Th2 apresentam uma resposta em anticorpos elevada.
[00125] Esta produção aumentada em anticorpos corresponde à hiperproteinemia e induz o aparecimento de imunocomplexos acarretando atingir o rim (aumento da creatinina e da uréia sangüíneas).
[00126] Quando de estudos e testes, foi portanto testado modular para um estado
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Th1 administrando-se aos cães perfeitamente leishmanianos por via intra muscular doses do complexo de vacina. A seqüência do estado imune, assim como a observação clínica, são efetuadas antes e após o tratamento.
[00127] Exemplo 1. Cão LOYD [00128] Um cão macho de raça Epagneul Breton LOYD, idade de 6 anos, pertencendo a Sra. C. apresenta numerosas lesões cutâneas acompanhadas por um estado de fadiga geral e um aspecto magro, o todo lembrando uma leishmaniose canina. LOYD vive perto de Aix-en-Provence, em plena zona endêmica e passa a maior parte do tempo em ambientes externos. É portanto um animal predisposto a ser picado pelos flebótomos.
[00129] Estas lesões cutâneas são de vários tipos: pústulas e pápulas ao nível da parte anterior da cabeça, eritema sobre o flanco e na face interna das orelhas, prurido, escamas e crostas ao nível dos cotovelos.
[00130] O veterinário, o Dr. DM diagnosticou um pênfigo foliáceo acompanhado de uma leishmaniose. Este último diagnóstico é confirmado por uma observação direta ao microscópio de leishmanias a partir de um modelo cutâneo e uma análise sorológica que dá um título em imunofluorescência leishmaniose positivo a 1 /1600.
[00131] Durante 8 meses, um tratamento clássico com sais de antimônio e corticóides demonstrou ser negativo. Instaurou-se portanto uma imunoterapia que consiste em efetuar, por via intramuscular, 4 injeções de 50 ,ug de complexo de vacina (1/2 dose), cada injeção sendo espaçada de 10 dias.
[00132] A análise do estado imune antes de qualquer injeção permite afirmar que o cão se encontra bem em um estado imune de tipo Th2 com um título em anticorpo elevado, assim como testes de proliferação linfoblásticos e ativação monocitária negativos.
[00133] Uma semana após a segunda injeção, o cão LOYD retoma o apetite e uma certa vitalidade. O Dr. DM começa a observar uma leve melhora cutânea.
[00134] Um mês após a última injeção, LOYD encontrou um aspecto clínico normal com notadamente um aumento de peso de 1 kg e um desaparecimento a 80% de todas as lesões cutâneas. A análise do estado imune permite afirmar uma baixa em
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23/28 título em anticorpo anti-leishmania que desce a 1/400 em imuno-fluorescência. Paralelamente, os monócitos encontraram uma atividade leishmanicida (com uma porcentagem de inibição de índice parasitário igual a 75%) e o teste de proliferação linfoblástico é perfeitamente positivo.
[00135] Uma busca de parasitas por cultura em meio NNN demonstra ser negativa. 8 meses após o tratamento, o cão LOYD apresenta às vezes lesões na parte anterior da cabeça, que correspondem ao pênfigo foliáceo, lesões desaparecendo após um tratamento corticóide. As análises biológicas permitem afirmar que LOYD está sempre em estado imune Th1.
[00136] Exemplo 2 - Cão JAZZ [00137] Um cão macho, de raça rottweiler, JAZZ, com 5 anos, pertencendo ao Sr. C apresenta sinais clínicos específicos de leishmaniose. De acordo com o Dr. GH, presença de numerosas esquemas brilhantes, depilação periocular direita, lesões ulcerosas ao nível de 2 cotovelos anteriores e um estado de fadiga pronunciado. As análises biológicas com notadamente uma sorologia leishmaniose positiva em 1/400 em imuno-fluorescência confirmam o diagnóstico clínico.
[00138] Uma imunoterapia consistindo em efetuar, por via intramuscular, 3 injeções de 5 gg de complexo de vacina (1/2 dose), cada injeção sendo espaçada de 10 dias, é instaurada. A análise do estado imune antes de qualquer injeção demonstra que o cão JAZZ desenvolve um sistema imune de tipo Th2 com uma parasitemia fortemente positiva a partir da medula óssea.
[00139] Um mês após a última injeção, os sinais clínicos leishmanianos de JAZZ retrocedem com notadamente uma cicatrização das lesões ulcerosas, um desaparecimento grande das escamas assim como uma depilação periocular quase inexistente. A sorologia apresenta sempre um título em imunofluorescência igual a 1/400. Por outro lado, a análise da resposta celular permite afirmar que JAZZ representa um estado Th1 ativo com um teste de proliferação linfoblástico positivo e uma atividade leishmanicida intramacrofágica elevada.
[00140] Paralelamente, a parasitemia foi negativada (cultura de medula óssea em meio NNN).
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24/28 [00141] A presente invenção consiste, portanto, bem a um complexo de vacina e terapêutico que induz a passagem de um estado imune de tipo Th2 com produção importante de anticorpos que exacerba as manifestações clinicas para um estado imune de tipo Th1 acarretando a cura.
[00142] RESULTADOS EM VACINAÇÃO [00143] A fim de avaliar a eficácia do complexo de vacina de acordo com a invenção, o complexo de vacina é testado em 6 cães perfeitamente saudáveis. Os 6 cães apresentam uma sorologia leishmaniose negativa, uma parasitemia negativa assim como testes de resposta celular específica a leishmania perfeitamente negativos.
[00144] Estes 6 cães vivem em um local isento de qualquer flebótomo. Os requerentes definiram 3 grupos de cães, cada grupo compreendendo um macho e uma fêmea.
• - Grupo testemunho (placebos)
- testemunho negativo cão LEO de raça Pointer, sexo masculino, idade 3 anos
- testemunho adjuvante apenas: cadela MUMA de raça Epagneul Breton, sexo fêmea, idade 6 anos.
• Grupos cães vacinados com proteínas de excreção secreção de promastigotos (ESP)
- Cadela MINON de raça Braque de Weymar, sexo feminino. Idade 2 anos e meio.
- Cão NOUGAT de raça pointer, sexo masculino, idade 2 anos e meio.
• Grupos de cães vacinados com proteínas de excreção secreção de amastigotos (ESA)
- Cão LOUBARD de raça Epagneul Breton, sexo masculino, idade : 4 anos
- Cadela MINA de raça Braque de Weymar, sexo feminino, idade 3 anos. [00145] O esquema de injeção de vacina é o seguinte
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Dia 0 Dia 28 Dia 84
1a. injeção 2a. injeção dose em sub 4 semanas 1 dose em sub 8 semanas prova cutânea cutânea infecciosa [00146] Uma seqüência clínica dos 6 cães é feita todas as duas semanas. As análises biológicas são esquematizadas de modo seguinte:
Dia 0_Dia 28_Dia 84_Dia 84
1a. Injeção 4 2a. Injeção 4 prova + 2 meses
Dia 14 Dia 56 infecciosa 4
Análises biológicas Análises biológicas Análises biológicas [00147] As Análises biológicas consistem em:
- análises bioquímicas: uréia, creatina, transaminases
- análises hematológicas: numeração, fórmula
- sorologia leishmaniose: imunofluorescência quantitativa anti-leishmania, por método Western Blot, para os antígenos de excreção secreção e dosagem por método ELISA de IgG2 específicos.
- testes de resposta celular: teste de proliferação linfoblástica, estudo de ativação de macrófagos e teste IDR (intra dermo reação) dosagem do NO.
- estudo do papel neutralizando os anticorpos anti ES.
[00148] É necessário acrescentar a estas análises, a pesquisa de leishmania por observação direta ao microscópio e cultura em meio NNN a partir de medula óssea após a prova infecciosa.
[00149] Resultados [00150] Sequência clínica:
[00151] Nenhuma manifestação clínica importante apareceu durante todo o estudo. É necessário notar um leve emagrecimento e aparecimento de algumas escamas no cão LEO 2 meses após a prova infecciosa.
[00152] Sequência biológica • Os parâmetros bioquímicos e hematológicos permaneceram normais durante todo o estudo.
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26/28 • sorologia leishmaniose e parasitemia [00153] Antes de qualquer injeção, os 6 cães apresentaram sorologias e parasitemias negativos. A tabela abaixo mostra respostas sorológicas obtidas quando de experiências efetuadas e a seqüência da parasitemia (análises efetuadas meses e 8 meses após a prova infecciosa).
| SOROLOGIA | PARASITEMIA (sob porção de medula) | ||||||
| Cães | IF Quantitiv o | WB (ESA) | WB (ESP) | ELISA (IgG2) ESA/E SP | Exam e Direto | Cultura em meio NNN | |
| Cães Testemunha s | MUMA | - | - | - | - | + | ++ |
| LEO | - | - | - | - | + | ++ | |
| Cães imunizados ESA | LOUBAR D | 1/200 | + | + | + (0,700) | - | - |
| MINA | 1/200 | ± | ± | + (0,450) | - | - | |
| Cães imunizados ESP | NOUGA T | 1/800 | + | + | + (0,780) | - | - |
| MINON | 1/100 | ± | ± | + (0,520) | - | - |
Legenda
IF: imunofluorescência (considerada positiva se o título for > 1 /100)
WB: Western blot
ELISA: corte = 0,300 em DO (densidade óptica)
Parasitemia: cultura em meio NNN
- = ausência ++ = mais de 5 formas de promastigotos móveis / campos [00154] Somente os cães imunizados apresentam anticorpos específicos para ESA e ESP (Western blot), IgG2 específicos (ELISA) assim como parasitemias negativas. Deve-se notar um leve aparecimento de anticorpos totais (1/200 em IF) em todos os cães após prova infecciosa.
[00155] Somente os cães testemunhos (LEO e MUMA) apresentam parasitemias positivas assim como uma ausência de anticorpos específicos IgG2 anti ES.
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27/28 • Resposta com mediação celular [00156] Antes de qualquer injeção, os 6 cães apresentam uma resposta com mediação celular para leishmania infantum perfeitamente negativa. De acordo com a tabela II, apenas os cães imunizados apresentam testes de proliferação linfoblástica, atividades leishmanicidas intramacrofágicas positivas associadas a produção de NO por monócitos.
[00157] A tabela seguinte mostra as respostas obtidas de tipo celular e o papel inibidor de soros sobre a proliferação parasitária (análises efetuadas 2 meses após a prova infecciosa).
| RESPOSTA À MEDIAÇÃO CELULAR | % de inibição da proliferação de leishmanias | ||||||
| Cães | IDR | Teste de prolif. De linfoblás tico | Atividad e leshman icida de monócit os | Dosage m de NO (em pM) | Prolif. De promasti gotos | Prolifer ação de amastig otos | |
| Cães | MUMA | + | + 2,1 (3) | 15,5% | 0,3 | 20% | 15% |
| Testemunh as | LEO | - | + 1,2 (3,1) | 21,5% | ND | ND | ND |
| Cães imunizados | LOUBAR D | + | ++ 2,9 (3,2) | 58,9% | ND | 50% | 41% |
| ESA | MINA | + | ++ 3,8 (4,2) | 47,8% | ND | 69% | 52% |
| Cães imunizados | NOUGA T | + | ++ 3,1 (4,2) | 75,6% | 3,9 | 98% | 54% |
| ESP | MINON | + | +++ 3,5 (45 | 64,1% | 2,8 | 72% | 56% |
Legenda
IDR: O teste intra dermo reação é considerado positivo (+) se a induração for de > 5 mm 48 h após intradermoinjeção
Teste de proliferação linfoblástica: os resultados são expressos pela leitura em microscopia fotônica e em índices de estimulação (entre parênteses, índice de estimulação do testemunho + concanavalina A) + pequena proliferação ++ : média proliferação +++ forte proliferação atividade leishmanicida dos monócitos: expressa em porcentagem de inibição de
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28/28 índice parasitário dosagem do NO:
papel inibidor dos soros: resultados expressos em porcentagem de inibição do crescimento
ND = não determinado • Estudo do papel neutralizante de anticorpos anti ES [00158] Esta análise efetuada sobre 1 cão de cada grupo (tabela I) permite afirmar que os cães imunizados pelos ES apresentam anticorpos muito eficazes inibindo tão bem a proliferação de promastigotos como as de amastigotos, contrariamente aos cães testemunhos.
[00159] Além destas análises, o complexo de vacina induz bem uma imunidade com mediação celular de tipo Th1 protetor ao qual é necessário acrescentar uma indução de anticorpos específicos de isotipo IgG2 inibindo de modo significativo a proliferação de leishmanias.
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Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES1. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos e em particular no homem, nos caninos, nos felinos e nos eqüídeos, caracterizado pelo fato de que ele é composto- por um lado, de moléculas de excreção secreção provenientes de amastigotos e/ou de promastigotos de Leishmania infantum tendo um peso molecular entre 32 e 200 Kda produzidos em um meio sem germes e sem soro perfeitamente definido tal que o meio compreende:para os amastigotos (quantidades por 800 ml):
- meio 199 H® (x10) com sais de 100 ml Hanks)* - Trypto-caseína de soja ® 5 g -NaHCOs 0,35 g - L-glutamina 0,75 g -HEPES 5,95 g - D(+) glucose 2,50 g - H20 Q.S. 800 ml - Meio 199 H modificado ® 4 ml (5%) (x10) -Hemina porcina irradiada a 25 quilogray 0,003 mM - Glutathion reduzido 0,08 mM - solução de vitaminas (x100) 2% para os promastigotos:RPMI 1640 (1 x) 1000 ml Meio 199 H modificado 10 x 2% Hemina porcina irradiada a 25 quilogray 0,0002% Sulfato de gentamicina 0,04 mg e por outro lado o muramil dipeptídeo. - 2. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismosPetição 870180061733, de 18/07/2018, pág. 39/432/4 patogênicos intracelulares nos mamíferos, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o muramil dipeptídeo é associado às moléculas de excreção secreção provenientes de promastigotos e/ou amastigotos de Leishmania infantum em uma relação proteína/adjuvante de 1/0,5 a 1/4.
- 3. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares junto aos caninos, de acordo com as reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o muramil dipeptídeo é associado às moléculas de excreção secreção provenientes de promastigotos e/ou amastigotos de Leishmania infantum em uma relação de 100 pg de proteínas para 200 pg de muramil dipeptídeo.
- 4. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as moléculas de excreção secreção são obtidas por um processo no curso do qual é realizada uma filtração tangencial contra uma membrana de 0,16 μ em poliétersulfona para a separação dos parasitas e depois uma concentração por um fato de 100 do filtrado por filtração tangencial contra um filtro de 3kDa em poliétersulfona.
- 5 Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que tem a particularidade de induzir, nos mamíferos,, uma atividade leishmanicida dos monócitos parasitados mensuráveis de acordo com o método de LEMESRE de determinação da inibição do índice parasitário com 48 h de incubação.
- 6. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tem a particularidade de induzir,Petição 870180061733, de 18/07/2018, pág. 40/433/4 nos mamíferos, uma ativação da imunidade com mediação celular dependente de linfócitos T e preferivelmente linfócitos T de tipo Th1.
- 7. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que tem a particularidade de induzir, nos mamíferos,, a passagem de um estado imunitário de tipo Th2 para um estado imunitário de tipo Th1.
- 8. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos de acordo com uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que tem a particularidade de induzir, nos mamíferos, anticorpos específicos e mais particularmente anticorpos específicos de isotipo IgG2.
- 9. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as moléculas de excreção secreção provenientes de promastigotos e/ou amastigotos de Leishmania infantum apresentam, pelo menos, um epítopo transportado pela proteína imunogênica principal no cão.
- 10. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que algumas das moléculas de excreção secreção provenientes de promastigotos e/ou amastigotos de Leishmania infantum apresentam atividades proteásicas não repertoriadas (nem metalo, nem serina, nem cisteína protease).
- 11. Complexo de vacina terapêutica destinado à prevenção ou ao tratamento de leishmanioses e infecções mediadas por microorganismos patogênicos intracelulares nos mamíferos de acordo com qualquer uma dasPetição 870180061733, de 18/07/2018, pág. 41/434/4 reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é acondcionado sob uma forma tal que ele pode ser administrado por diferentes vias: subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, parental e oral.Petição 870180061733, de 18/07/2018, pág. 42/431/5Comparação de meios mA1 e mA1m para a cultura de amastigotos (Z) j1 j2 j3 j4 j5 j'6 j7 j8Dias
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| B21H | Decision of lapse of a patent or of a certificate of addition of invention cancelled [chapter 21.8 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 21.6 NA RPI NO 2725 DE 28/03/2023 POR TER SIDO INDEVIDA, UMA VEZ QUE O PRAZO DE VALIDADE DA PATENTE TERMINOU EM 30/05/2022. |
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| B21A | Patent or certificate of addition expired [chapter 21.1 patent gazette] |
Free format text: PATENTE EXTINTA EM 30/05/2022 |