EA002167B1

EA002167B1 - Вакцинная композиция против малярии

Info

Publication number: EA002167B1
Application number: EA199900069A
Authority: EA
Inventors: Джозеф Коэн
Original assignee: Смитклайн Бичем Байолоджикалз С.А.
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2002-02-28
Also published as: BG103141A; WO1998005355A1; TR199900195T2; DZ2283A1; US20060292170A1; AP1166A; BR9710913A; UA68336C2; ATE394119T1; ID17860A; EP1623720A2; PL331424A1; KR20000029747A; BG63290B1; US20020172692A1; AU4204097A; CZ29299A3; MY116128A; OA10969A; EP0957933A1

Abstract

Изобретение относится к вакцинной композиции, полезной при предупреждении или лечении малярии, содержащей множество антигенов в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН1 клеточного ответа; ее применению в медицине и производстве лекарственного средства и способу лечения или предупреждения малярии.

Description

Настоящее изобретение относится к новой вакцинной композиции и к ее применению в медицине, в частности, при предупреждении малярийных инфекций.

Малярия, от которой умирает 2-4 миллиона людей в год, представляет собой одну из главных проблем всемирного здравоохранения. Одна из наиболее острых форм заболевания вызывается простейшим паразитом Р1а§тобшт £а1с1рагит, который ответственен за большинство смертельных исходов, связанных с малярией.

Жизненный цикл Р.£а1с1ратит представляет собой сложный цикл, для завершения которого необходимы два хозяина, человек и комар. Инфекция у человека инициируется инокуляцией спорозоитов в слюну инфицированного комара. Спорозоиты мигрируют в печень и там инфицируют гепатоциты, где через экзоэритроцитарную внутриклеточную стадию они дифференцируются в стадию мерозоита, который инфицирует красные кровяные клетки (КБ С) для инициации циклической репликации в бесполой кровяной стадии. Цикл завершается дифференцировкой ряда мерозоитов в КВС в половую стадию гаметоцитов, которые проглатываются комаром, где они развиваются через серию стадий в его средней кишке с образованием спорозоитов, которые мигрируют в слюнную железу.

Стадия спорозоита РТаШратит идентифицирована как потенциальная мишень для малярийной вакцины. Главный поверхностный белок спорозоита известен как белок, окружающий спорозоит (С8 белок). Этот белок из штамма 708 клонирован, получена его экспрессия и определена последовательность (Оате е! а1., 8с1епсе 225 (1984) р593). Белок из штамма 708 отличается тем, что он имеет центральный иммунодоминантный район повторов, содержащий тетрапептид Л8п-Л1а-Л8п-Рго, повторяющийся 37 раз, но встроенный в промежутки между четырьмя минорными повторами Акп-УаГАкр-Рто. В других штаммах число мажорных и минорных повторов, также как и их относительное расположение, варьирует. Данный центральный участок фланкирован N и С-концевыми участками, состоящими из неповторяющихся аминокислотных последовательностей, обозначенных как участок С8 белка, лишенный повторов.

Показано, что облученные спорозоиты могут обеспечить значительную защиту против исследуемой малярии у человека (Ат. 1. Тгор. Меб. Нуд. 24: 297-402, 1975). Однако трудности производства делают применение облученного спорозоита непрактичным с точки зрения производства вакцины. Несколько групп исследователей предложили субъединичные вакцины на основе белка, окружающего спорозоит. Некоторые из этих вакцин прошли клинические испытания; одна из них представляет собой синтетический пептид, другая представляет собой рекомбинантный белок (Ва11ои е! а1. Ьапсе!: ί 1277 (1987) и Нетпд!оп е! а1. №Ш.1ге 328: 257 (1987)).

Данные вакцины успешно стимулировали антиспорозоитный ответ. Тем не менее, величина ответа оказалась разочаровывающей, причем, некоторые вакцинированные вовсе не давали ответа. Кроме того, отсутствие реиммунизации уровней антител при последовательных инъекциях и результаты анализов пролиферации лимфоцитов 1п уйго позволили предположить, что Т-клетки большинства из этих добровольцев не распознавали иммунодоминантный повтор. Тем не менее, у одного вакцинированного в каждом исследовании не развивалась паразитемия.

В Международной заявке на патент № \¥О 93/10152 (8тййк1те Веесйат Вю1одюаК) описывается и заявляется гибридный белок, содержащий по существу весь С-концевой участок С8 белка, четыре или более чем четыре тандемных повтора иммунодоминантного района и поверхностный антиген вируса гепатита В (НВ5Ад). Предпочтительно гибридный белок включает в себя последовательность, которая содержит, по меньшей мере, 160 аминокислот, которые являются по существу гомологичными С-концевому участку С8 белка. С8 белок может быть свободен от последних 12 аминокислот С-конца.

В частности, описывается белок, который содержит участок С8 белка РТаШратит, по существу соответствующий аминокислотам 210398 708 РТаШратит, слитый через линейный линкер в одну рамку считывания с Ν-концом НВкАд. Линкер может содержать участок пре82 из НВкАд.

Конкретное воплощение, описанное в \УО 93/10152, представляет собой гибридный белок, обозначенный КТ8. Данный гибрид состоит из

- метионинового остатка, кодируемого нуклеотидами с 1059 по 1061, производного от последовательности гена ТЭН3 Зассйатотусек сетеуШае (нуклеотиды 1-1058 в данной рамке считывания образуют сам ТЭН3 промотор) (Микб А. М. е! а1. 0епе 1983 25 133-143);

- трех аминокислот, Ме! А1а Рго, производных от нуклеотидной последовательности (1062-1070), созданной посредством процедуры клонирования, использованной для конструирования гибридного гена;

- фрагмента из 189 аминокислот, кодируемых нуклеотидами с 1071 по 1637, представляющих собой аминокислоты с 210 по 398 белка, окружающего спорозиот (С8 белка), штамма 708 Р1а§тобшт ТаШрагит (Оате е! а1., см. выше);

- аминокислоты (Агд), кодируемой нуклеотидами с 1638 по 1640, созданными посредством процедуры клонирования, использованной для конструирования гибридного гена;

- четырех аминокислот, Рго Уа1 Т1г Аки, кодируемых нуклеотидами с 1641 по 1652 и представляющих собой четыре карбоксилтерминальных остатка пре82 белка (9) вируса гепатита В (серотип аб\т);

- фрагмента из 226 аминокислот, кодируемых нуклеотидами с 1653 по 2330 и точно определяющих 8 белок вируса гепатита В (серотип аб\у).

Кроме того, в XVО 93/10152 описывается экспрессия гибридного белка в штаммереципиенте дрожжей, который уже несет в своем геноме несколько интегрированных копий полигенного экспрессирующего кластера 8 гепатита В. Полученный в результате штамм синтезирует два полипептида, 8 и КТ8 (или другой гибридный белок по изобретению), которые спонтанно собираются вместе в смешанные (например КТ8. 8) липопротеиновые частицы. На поверхности данных частиц преимущественно представлена последовательность С8 белка этого гибрида.

Задачей именно настоящего изобретения является обеспечение иммунитета против инвазии Р.1а1с1рагит и/или Ρ.νίναχ посредством иммунизации с использованием композиции, содержащей множество антигенов в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН1 клеточного ответа.

Соответственно, в настоящем изобретении предлагается вакцинная композиция, содержащая, по меньшей мере, два антигена в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН1 клеточного ответа, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, два антигена выбраны из группы, включающей в себя (а) гибридный белок, содержащий, по существу, весь С-концевой участок С8 белка, четыре или более чем четыре тандемных повтора иммунодоминантного района С8 белка и поверхностный антиген вируса гепатита В (НВкАд), где С8 белок представляет собой белок, окружающий спорозоит, являющийся главным поверхностным белком спорозоита Р.1а1с1рагит;

(б) родственный тромбоспондину безымянный белок (ТКАР) клонированного изолята Р. 1а1с1рагит из Таиланда, известного как Т/9/96, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты;

(в) главный поверхностный белок 1 (М8Р1) Р.1а1с1рагит или Р.у1уах, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

Предпочтительно, по меньшей мере, один из антигенов представляет собой гибридный белок, как определено выше, такой как КТ8. более предпочтительно в форме смешанных частиц, как определено выше, таких как КТ8. 8.

Количество антигена, присутствующего в каждой дозе вакцины, выбрано как количество, которое индуцирует иммунозащитный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов, характерных при применении типичных вакцин. Такое количество должно варьировать в зависимости от того, какие конкретные иммуногены используются. Как правило, ожидается, что каждая доза будет содержать в целом от 1 до 1000 мкг белка, предпочтительно от 1 до 200 мкг, наиболее предпочтительно от 10 до 100 мкг. Оптимальное количество для конкретной вакцины можно установить посредством стандартных исследований, которые включают в себя наблюдение за иммунными ответами у субъектов. После первичной вакцинации субъекты предпочтительно должны получать реиммунизацию в течение примерно 4 недель с последующей многократной иммунизацией каждые 6 месяцев в течение того времени, пока существует риск инфекции.

Адъюванты, которые способны к предпочтительной стимуляции ТН1 клеточного ответа, описаны в Международных заявках на патент №№ \νθ 94/00153 и \νθ 95/17209.

Конкретный предпочтительный адъювант содержит 0821, очищенную ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) нетоксичную фракцию, полученную из коры Ош11а)а 8аропапа Мойиа, и 3 Де-О-ацилированный монофосфорил липид А (3Э-МРБ). возможно вместе с эмульсией типа «масло в воде».

Таким образом, в еще одном аспекте данного изобретения предложена вакцинная композиция, отличающаяся тем, что адьювант содержит 3 Де-О-ацилированный монофосфорил липид А (МРЬ).

Де-О-ацилированный монофосфорил липид А известен из СВ 2220211 (К1Ы). Химически он представляет собой смесь 3 Де-Оацилированного монофосфорил липида А с 4. 5 или 6 ацилированными цепями и производится В1Ы 1ттипос11ст Мойала. Предпочтительная форма 3 Де-О-ацилированного монофосфорил липида А описана в Международной заявке на патент № 92/116556.

Согласно следующему аспекту изобретения предложена вакцинная композиция, отличающаяся тем, что адъювант содержит очищенную высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) нетоксичную фракцию сапонина из коры ОиШапа 8ароиапа Мойиа (0821).

Способ производства 0821 описан (как 0А21) в патенте США № 5057540.

Предпочтительной является вакцинная композиция, отличающаяся тем, что адъювант содержит эмульсию типа масло в воде.

Предпочтительная эмульсия типа «масло в воде» содержит масло, преобразующееся в ходе обмена веществ, такое как сквален, альфатокоферол и твин 80. Дополнительно эмульсия типа «масло в воде» может содержать спан 85 и/или лецитин.

Соотношение С821:3Э-МРБ типично должно быть порядка от 1:10 до 10:1; предпочтительно от 1:5 до 5:1 и часто по существу 1:1. Предпочтительный диапазон для оптимальной синергии составляет от 2,5:1 до 1:1 3ΌМРБ:О821. Типично для введения человеку 0821 и 30-МРБ должны быть представлены в вакцине в пределах от 1 до 200 мкг, как, например, от 1 до 100 мкг, предпочтительно от 10 до 50 мкг на дозу. Типично эмульсия типа «масло в воде» должна содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфа-токоферола и от 0,3 до 3% твина 80. Предпочтительно соотношение сквален: альфа-токоферол является равным 1 или менее чем 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Спан 85 может также быть представлен на уровне 1%. В некоторых случаях может быть преимуществом, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.

Получение вакцин в общих чертах описано в Αν Тгепбз апб Осус1ортсп15 ίη Уасстез, изданном Уо11ет е! а1., Ишуегайу Рагк Ргсзз. ВаП1тоге, Магу1апб, И.8.Л. 1978. Инкапсулирование внутрь липосом описано, например, Ри11епоп (патент США № 4235877). Конъюгация белков с макромолекулами описана, например, Ык1Ше (патент США № 4372945) и Агтог е! а1. (патент США № 4474757).

Антигены, подходящие для включения в вакцины по изобретению, могут быть выбраны из следующего:

1. Г ибридный белок, как определено выше, такой как РТ8. более предпочтительно в форме смешанных частиц, как определено выше, таких как ВТ8,8.

2. ТВАР клонированного изолята Р.ГаШратит из Таиланда, известного как Т/9/96, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты (описаны в публикациях международных заявок на патент №№ АО 90/01496, АО 91/11516 (Οΐ Ехр1ойа1юп Ь1тйеб) и АО 92/11868 (И8 Ыауу)).

3. Белок 16 кД, описанный в публикации международной заявки АО 91/18922, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

4. Апикальный мембранный антиген-1 (АМА-1) Р.ГаШратит или Р.у1уах, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

5. Белок, окружающий спорозоит (сзбелок), Р.ГаШратит или Р.у1уах, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

6. М8Р-1 Р.Га1е1ратит или Р.у1уах (патент США № 4837016) и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

7. Другие белки экзоэритроцитарной стадии и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

8. Возможно, белки кровяной стадии и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

Термин иммуногенное производное относится к любой молекуле, как например усеченной, или другому производному белка, которое сохраняет способность индуцировать иммунный ответ на белок после внутреннего введения человеку. Такие другие производные можно получить посредством добавления, делеции, замены или перестройки аминокислот либо посредством их химических модификаций.

Иммуногенные фрагменты белка, которые могут быть пригодны при получении субъединичных вакцин, можно получить посредством экспрессии подходящих фрагментов гена или посредством пептидного синтеза, например, с использованием синтеза по Меррифилду (Метйе1б) (Тйе Рерйбез, Уо1. 2, Асабет1с Ргезз, ΝΥ, раде 3).

Иммуногенное производное может представлять собой гибрид, который является полипептидом слияния, содержащим дополнительные последовательности, которые могут нести один или более чем один эпитоп для других иммуногенов Р1азтобшт, либо для других иммуногенов не Р1азтобшт. Альтернативно иммуногенное производное по изобретению может быть слито с полипептидом-носителем, таким как поверхностный или коровый антиген вируса гепатита В, либо с другим носителем, который обладает иммуностимулирующими свойствами, как в случае адъюванта, или который иным путем усиливает иммунный ответ на белок или его производное, или является пригодным для экспрессии, очистки или изготовления препарата белка или его производного.

Белки или их иммуногенные производные, которые являются пригодными по изобретению, могут быть химически соединены с макромолекулой с использованием стандартного связывающего агента, такого как глутаральдегид (Сеебшдз е! а1. (1988) 1. 1ттипо1. Ме1йобз, 106, 239-244).

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение вакцинной композиции, как она определена выше, для лечения или предупреждения малярии.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предложено применение вакцинной композиции, как она определена выше, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики малярии.

Также, в соответствии с дальнейшим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или предупреждения малярии, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество вакцинной композиции, как она определена выше.

Следующий пример иллюстрирует изобретение.

Пример.

Конструирование и экспрессия рекомбинантного ТКАР

Данную конструкцию получали, как описано в АО 90/01496.

Конструирование и экспрессия КТ8,8.

Данную конструкцию получали, как описано в АО 93/10152.

Адъювантация

Готовили два препарата адъюванта, каждый из которых содержал следующие компоненты эмульсии типа «масло в воде».

8В 26: 5% сквалена 5% токоферола 0,4% твин 80; размер частиц составлял 500 нм

8В 62: 5% сквалена 5% токоферола 2,0% твин 80; размер частиц составлял 180 нм

Изготовление эмульсии 8В 62 (2-кратный концентрат)

Твин 80 растворяли в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (ФСБ), с получением 2% раствора в ФСБ. Чтобы получить 100 мл эмульсии двукратной концентрации, 5 г ИЬ альфа-токоферола и 5 мл сквалена тщательно перемешивали на вортексе. Добавляли 90 мл раствора ФСБ/Твин и тщательно перемешивали. Полученную в результате эмульсию затем пропускали через шприц и, наконец, микрофлюидизировали с использованием аппарата для микрофлюидизации М1108. Размер полученных в результате капелек масла составлял примерно 180 нм.

Получение эмульсии 8В26

Данную эмульсию получали аналогичным способом с использованием 0,4% твин 80.

Другие эмульсии, как показано в таблице, получали аналогичным способом.

К каждым 100 мл эмульсии добавляли два антигена (10 мг каждого антигена, эквивалентные 50 мкг на дозу) и смешивали. Данную смесь объединяли со 100 мкг/мл 3Ό-ΜΡΕ и 100 мкг/мл 0821 с получением конечного препарата. Буфер составляли в соответствии с содержанием соли и рН.

Таблица. Носители двукратной концентрации

Эмуль сии 8В	Токоферол %	Сквален %	Твин 80 %	Спан 85 %	Лецитин %	Размер
26	5	5	0,4	0	0	500 нм
						90-100%
						800 нм
						10-0%
26.1	5	5	0,4	0	0,1	500 нм
63	5	5	0,6	0	0	500 нм
64	5	5	0,8	0	0	500 нм
61	5	5	1	0	0	250-300 нм
62	5	5	2	0	0	180нм
40	5	5	0,4	1	0	500 нм
						80-100%
						800 нм
						20-0%
40,1	5	5	0,4	1	0,1	500 нм
60	5	5	1	1	0	300 нм
65	5	5	0,4	1,5	0	500 нм
66	5	5	0,4	2	0	500 нм

Справочный пример. Различные препараты КТ8,8.

КТ8,8 описан в Международной заявке на патент № АО 93/10152, и препарат был изготовлен для вакцинации мышей Ьа1Ь/с. В каждой группе находилось пять животных. 7 групп животных получали следующие препараты:

Группа 1	КТ8,8 8В62
Группа 2	КТ8,8 Р821 3Ό-ΜΡΕ
Группа 3	КТ8,8 Р821 3Ό-ΜΡΕ 8В62
Группа 4	КТ8,8 3Ό-ΜΡΕ А1(ОН)₃
Группа 5	КТ8,8 А1(ОН)э
Группа 6	Интактная
Группа 7	Отрицательный контроль

(КТ8,8 - 5 мкг/доза, 3Ό-ΜΡΕ 5 мкг/доза,

Р821 5 мкг/доза).

Животных заражали и брали у них кровь на 15-й день после первой иммунизации и на 7-й день и на 15-й день после второй иммунизации и анализировали на анти-НВ8Ад подтип антител. Эмульсия 8В62 при изготовлении препарата с использованием 0821 и 3Ό-ΜΡΕ предпочтительно повышала в синергичной форме ответ антител 1§С2а по сравнению с одной эмульсией 8В62.

Повышенный ответ антител 1§С2а у мышей является мерой способности системы адъювантов стимулировать ответ ТН1 типа.

Claims

1. Вакцинная композиция, содержащая, по меньшей мере, два антигена в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН1 клеточного ответа, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, два антигена выбраны из группы, включающей в себя:

(а) гибридный белок, содержащий, по существу, весь С-концевой участок С8 белка, четыре или более чем четыре тандемных повтора иммунодоминантного района С8 белка и поверхностный антиген вируса гепатита В (НВкАд), где С8 белок представляет собой белок, окружающий спорозоит, являющийся главным поверхностным белком спорозоита РТаЮрагиш;

(б) родственный тромбоспондину безымянный белок (ТКАР) клонированного изолята Р.ГаЮрагиш из Таиланда, известного как Т/9/96, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты;

(в) главный поверхностный белок 1 (Μ8Ρ1) Р.ГаШрагиш или Р.уАах и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты.

2. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что адъювант содержит 3 Де-Оацилированный монофосфорил липид А (МРЬ).

3. Вакцинная композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что адъювант содержит очищенную высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) нетоксичную фракцию сапонина из коры ОнШапа 8аропапа Мойиа (0821).

4. Вакцинная композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что адъювант содержит эмульсию типа «масло в воде».

5. Применение вакцинной композиции по любому из пп. 1-4 для лечения или предупреждения малярии.

6. Применение вакцинной композиции по любому из пп. 1-4 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики малярии.

7. Способ лечения или предупреждения малярии, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество вакцинной композиции по любому из пп.1-4.