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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete der Immunologie, Chemie
und Molekularbiologie. Besonders betrifft die Erfindung immunstimulatorische
Zusammensetzungen, umfassend Epitope aus einem Protein des Blutstadiums
des Malariaparasiten, die im Stande sind Wachstum hemmende Immunantworten
auszulösen.
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Mit
derzeit bis zu 300 Millionen betroffenen Menschen, von denen zwischen
2 und 3 Millionen jedes Jahr sterben, und zusätzlich 2 Milliarden infektionsgefährdeten
Menschen bleibt Malaria eine der Hauptbürden der Gesundheit der Bevölkerung
in vielen Tropenländern
(WHO. 1997; Weekly Epidemiol. Rec. 69: 309 – 314). Wegen der Verbreitung
von Arzneimittel-resistenten Parasiten und dem Auftreten von Insektizidresistenten Mücken ist
die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen die schwerste
durch Plasmodium falciparum verursachte Form von Malaria eine Angelegenheit
von höchster
Dringlichkeit. Impfstoffkandidaten sind gegen Antigene gerichtet,
die in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus des Parasiten exprimiert
werden (Richie, T. L. und A. Saul, 2002, Nature 415: 694 – 701).
Die Effektormechanismen, die Immunität gegen Malaria verleihen können, sind
unvollständig
verstanden, allerdings zeigen mehrere Beweise, dass Antikörper gegen
Antigene asexueller Blutstadium-Parasiten die mit einer Malariainfektion
assoziierte Morbidität
und Mortalität
reduzieren können.
Bei Kindern mit Parasitämie
ist zum Beispiel gezeigt worden, dass passiver Antikörpertransfer
von Erwachsenen mit natürlich
erworbener Immunität
gegen Malaria die Parasitenspiegel merklich herabdrücken (Cohen,
S., et al. 1961, Nature 192: 733 – 737; Sabchareon, A., et al.
1991, Am. J. Trop. Med. Hyg. 45: 297 – 308).
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Der
Lebenszyklus des Malariaparasiten ist komplex, er umfasst mehrere
verschiedene Stadien der Entwicklung. Wenn eine infizierte Mücke einen
menschlichen Wirt sticht, werden Malariaparasiten in den Blutstrom
als Sporozoiten inokuliert, welche rasch in Leberzellen eindringen.
Innerhalb der nächsten
Tage durchlaufen die Sporozoiten in den Wirtsleberzellen eine massive
Vermehrung, was zur Folge hat, dass die Leberzellen platzen und
viele tausende Tochtermerozoiten in den Blutstrom freisetzen. Die
Merozoiten zielen und infizieren rasch zirkulierende rote Blutkörperchen
(Erythrozyten), wo sie weitere Multiplikationen durchlaufen. In
den infizierten Erythrozyten vervielfachen sich die Merozoiten alle
paar Tage exponentiell und brechen hervor, um andere rote Blutkörperchen
zu infizieren. Diese zyklische und massive Zunahme der Parasitenlast
ist für
die klinischen Manifestationen von Malaria verantwortlich, die zu
schwerer Morbidität,
wenn nicht Mortalität, des
Patienten führen
kann.
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Weil
infizierte Hepatozyten und Erythrozyten Merozoiten in den Blutstrom
freisetzen, sind die freigesetzten Merozoiten, bevor sie wieder
in Erythrozyten eindringen, Antikörpern und Effektorzellen des
Immunsystems direkt zugänglich.
Diese Blutstadium-Exposition macht Merozoiten zu einem primären Ziel
für die
Entwicklung eines Impfstoffs gegen Malaria, indem Immuneffektorzellen
und im Plasma für
Merozoiten-Antigene vorhandene spezifische Antikörper die Parasiteninvasion
von Erythrozyten blockieren könnten.
Von mehreren Merozoiten-Antigenen wird geglaubt, dass sie im Stande
sind schützende
Antikörper
zu induzieren, und sie werden gegenwärtig für Antigenkandidaten eines Impfstoffes
gehalten (Kumar, S., et al. 2002, Chem. Immunol. 80: 262 – 286).
Einer der führenden
Kandidaten ist das Apikale Membran Antigen 1 (AMA-1), ein 83 kDa
Protein, das in reifen Stadien des Parasiten synthetisiert wird
und zuerst im Hals der Rhoptrien, den am apikalen Ende des Parasiten
gefundenen keulenförmigen
Sekretionsorganellen, lokalisiert ist (Crewther, P. E., et al. 1990,
Exp. Parasitol. 70: 193 – 206;
Peterson, M. G., et al. 1989, Mol. Cell Biol. 9: 3151 – 3154).
Mehrere Studien zu passiver und aktiver Immunisierung, basierend
auf dem ganzen Protein, haben angezeigt, dass AMA-1 in das Auslösen schützender
Immunantworten involviert ist (Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine
16: 240 – 247; Collins,
W. E., et al. 1994, Am. J. Trop. Med. Hyg. 51: 711 – 719; Crewther,
P. E., et al. 1996, Infect. Immun. 64: 3310 – 3317; Deans, J. A., et al.
1982, Clin. Exp. Immunol. 49: 297 – 309; Deans, J. A., et al.
1988, Parasite Immunol. 10: 535 – 552; Kucken, C. H., et al.
2000, Mol. Biochem. Parasitol. 109: 147 – 156; Narum, D. L., et al.
2000, Infect. Immun. 68: 2899 – 2906;
Xu, H., et al. 2000, J. Immunol. 165: 389 – 396) und als ein Ziel für Antikörper dient,
welche die Invasion blockieren (Deans, J. A., et al. 1982, Clin.
Exp. Immunol. 49: 297 – 309; Deans,
J. A., et al. 1988, Parasite Immunol. 10: 535 – 552; Hodder, A. N et al.
2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294;
Kucken, C. H., et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 15119 – 15124).
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AMA-1
ist ein integrales Membranprotein vom Typ I mit einer kleinen Transmembrandomäne und einer großen extrazellulären Ektodomäne. Von
schützenden
Immunantworten, errichtet gegen gesamtes AMA-1, ist gezeigt worden,
dass diese primär
gegen konformative Epitope gerichtet sind, da reduziertes und alkyliertes AMA-1 einen
schwachen Schutz gibt (Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine 16: 240 – 247) und
durch Hyperimmunsseren von Personen, die in Regionen mit endemischer
Malaria leben (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294)
schlecht erkannt wird. Um wirksam zu sein, scheint ein auf rekombinantem
AMA-1 basierender Impfstoff daher die richtige Faltung des Proteins
in seine native oder nahezu native Struktur zu benötigen. Obwohl
Malariaimpfstoffe, basierend auf vollständigem AMA-1 oder seiner Ektodomäne getestet worden
sind, leiden sie an mehreren signifikanten Nachteilen. Erstens,
AMA-1 ist offenkundig schwer herzustellen. Es ist gezeigt worden,
dass die Produktion von AMA-1 in E.coli zu einer inkorrekten Faltung
des Proteins führt
und daher zusätzliche
Schritte von Reinigung und erneuter Faltung benötigt, die für die Produktion ausreichender
Mengen von reinem Material klinischer Güte nicht geeignet sind. Ähnlich führt die
Produktion von AMA-1 in eukaryotischen Wirtszell-Expressionssystemen
ungewünschte
Glycosylierung und von der Wirtszelle abgeleitete Lipide ein, die
weitere Reinigung benötigen,
um die Heterogenität
von rekombinant hergestelltem AMA-1, weiches für die klinische Verwendung
unakzeptabel sein würde,
zu verhindern.
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Die
Produktion kürzerer
AMA-1 Peptide umgeht viele der Probleme, die mit der Produktion
der gesamten Ektodomäne
assoziiert sind, da Peptide in hohen Ausbeuten ohne Wirtszellkontamination
chemisch synthetisiert werden können.
Peptid-Impfstoffe, basierend auf kürzeren Fragmenten oder Teilsequenzen
von AMA-1, sind getestet worden, allerdings ist ein erfolgreicher
Peptid-basierter AMA-1 Impfstoff auf Grund einer Vielfalt ungelöster Probleme
noch nicht erreicht worden. Erstens, die dreidimensionale Konformation
von AMA-1 in Lösung
muss noch bestimmt werden, was eine Strukturbasierte Peptidgestaltung überaus schwierig macht.
Zweitens, Peptide, die bestimmte Regionen von AMA-1 abdecken, können nicht
alle immunogenen Epitope umfassen, und schaffen es nicht ausreichende
Immunantworten zu erzeugen. Die Hinlänglichkeit der erzeugten Immunantwort
ist signifikant, weil die Malaria-Merozoiten dem Blutstrom nur für eine kurze
Zeitspanne ausgesetzt sind und die Beseitigung der Blutstadium-Parasiten
deshalb eine starke Immunantwort benötigt. Schließlich haben
selbst Peptide, die nachweislich hoch immunogen sind, es nicht geschafft
Antikörper
herzustellen, welche die Parasiteninvasion von Erythrozyten hemmen
(Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine 16: 240 – 247; Salvatore, D., et al.
2002, Vaccine 20: 3477 – 3484),
was anzeigt, dass es sich bei der Feinspezifität eines durch die Untereinheit
eines Peptid-Impfstoffkandidaten erzeugten anti-AMA-1 Antikörpers um
eine wichtige Determinante der Impfstoffwirksamkeit der Untereinheit
beim Blockieren der Merozoiteninvasion handelt. Die Identifizierung
von Epitopen, die im Stande sind starke Wachstum hemmende Immunantworten
gegen den Blutstadium-Malariaparasiten zu erzeugen, stellt daher
einen großen
Vorteil für
die Gestaltung Peptid-basierter Malariaimpfstoffe dar.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt die Strukturen der synthetischen
Peptide, einschließlich
AMA49-L1, AMA49-C1 und AMA49-12, ebenso wie die Bank der Matrizen-gebundenen
cyclischen Peptide, wobei jedes 12 Reste von AMA-1 enthält. Die
in jedem cyclischen Peptid enthaltenen Sequenzen werden in Tabelle
2 gezeigt.
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2 zeigt
die AMA49-L1 spezifischen IgG-Titer im ELISA nach drei Immunisierungen
von Mäusen mit
AMA49-L1 beladenem IRIV. Antworten einzelner Mäuse werden gezeigt. Ihre Prä-Immunseren
zeigten keine signifikante Reaktivität mit AMA49-L1 (Ergebnisse
nicht gezeigt).
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3 zeigt die Immunfluoreszenzfärbung reifer
Schizonten des P. falciparum Stamms K1 durch mit AMA49-L1-beladenem
IRIV ausgelöste
Antikörper. 3B:
kennzeichnende Immunfärbung
von AMA-1 mit Immunserum. 3D: Fehlen
der Färbung
mit Prä-Immunserum.
Repräsentative
Ergebnisse mit Seren von einer der immunisierten Mäuse werden
gezeigt. Alle anderen mit AMA49-L1 immunisierten Mäuse zeigten
vergleichbare IFA-Reaktivitäten. 3A und 3C:
Kontrollfärbung
der Parasiten-DNA
mit dem Hoechst Farbstoff 33258.
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4 zeigt
die Western-Blotanalyse der Reaktivität von anti-AMA49-L1 Antiseren
mit Lysaten des Blutstadiums von P. falciparum K1 als Antigen. Seren
aller getesteten einzelnen Mäuse
ergaben ein Doppelbandenmuster (angezeigt durch Pfeile), was für das gesamte
AMA-1 und sein Hauptprozessierungsprodukt (83 bzw. 66 kDa) kennzeichnend
ist.
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5 zeigt die, das Wachstum des Parasiten
hemmende in vitro Aktivität
von anti-AMA49 MAks. 5A: MAk DV5; 5B:
MAk DV11; 5C: Isotypübereinstimmende Kontrollantikörper. Jedes
Symbol repräsentiert
den Mittelwert eines unabhängigen
sechsfachen Experiments und Fehlerbalken zeigen die 95% Cl (P < 0,05, zweiseitiger
t- Test)
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue Zusammensetzungen und Verfahren
für das
Herstellen wirksamer Wachstum hemmender Immunantworten gegen das
Blutstadium des Malariaparasiten bereit. Ausführungsformen der Erfindung
basieren auf der Entdeckung, dass Peptide, die Epitope umfassen,
die in Schleife I der Domäne
III des Merozoiten-Proteins AMA-1 vorliegen, überraschenderweise beim Stimulieren
starker Immunantworten gegen AMA-1 wirksam sind. Die Ektodomäne von AMA-1
umfasst eine Region, die 16 zwischen verschiedenen Arten konservierte
Cysteinreste ausmacht, die vernetzt sind, um acht Disulfidbrücken zu
bilden. Die dreidimensionale Struktur des AMA-1 Proteins wird durch
diese acht intramolekularen Disulfidbindungen stabilisiert, welche
wiederum die Ektodomäne
in drei Unterdomänen
(I, II und III) unterteilen. Vorherige Ansätze, wobei die vollständige AMA-1
Ektodomäne
verwendet wurde, zeigten, dass die Mehrheit der gegen die Ektodomäne errichteten
Antikörper
Epitope in Domäne
I, einer hoch variablen Region des Proteins, erkennen. Bemühungen kleinere
Peptidmimetika zu gestalten, basierend auf den Schleifenstrukturen
der Domäne
I, erzeugten jedoch keine schützenden
Immunantworten, möglicherweise
auf Grund der Unfähigkeit
der Peptide die native Tertiärstruktur
des Proteins genau nachzuahmen (Salvatore, D., et al. 2002, Vaccine
20: 3477 – 3484).
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Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung immunstimulatorische Zusammensetzungen,
basierend auf der Aminosäuresequenz
von Schleife I der Domäne
III von AMA-1 bereit. Mit immunstimulatorisch ist die Fähigkeit
der Zusammensetzungen gemeint, das Wachstum des Malariaparasiten
hemmende Immunantworten zu erzeugen. Derartig Immunantworten können humoral
oder Zell-vermittelt oder beides sein, und ihre Gegenwart und Wirksamkeit
kann durch die Gegenwart von Antikörpern, die an lebende Malariaparasiten
binden und das Wachstum von lebenden Malariaparasiten hemmen, leicht
bestimmt werden. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende
Erfindung in Schleife I der Domäne
III identifizierte Epitope bereit, die für die Gestaltung immunstimulatorischer
Peptide nützlich
sind, welche im Stande sind mit dem Parasiten kreuzreagierende Wachstum
hemmende Immunantworten gegen die Blutstadium-Merozoiten der Malaria zu erzeugen. Mit
Epitop ist der Anteil des AMA-1 Moleküls gemeint auf den T-Zellrezeptoren
reagieren oder gegen den ein Wachstum hemmender Antikörper hergestellt
werden wird und an den er binden wird. Derartige Epitope können linear,
konformativ, kontinuierlich oder diskontinuierlich sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung immunstimulatorische Zusammensetzungen,
bestehend aus mindestens einem Peptidepitop ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3 und 4, bereit. Starker
bevorzugt besteht die immunstimulatorische Zusammensetzung aus mindestens
zwei Epitopen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3 und 4, und am meisten
bevorzugt besteht die Zusammensetzung aus den Epitopen der SEQ ID
NO: 1 und 2. Die durch die vorliegende Erfindung identifizierten
Epitope können
selbst als einzelne Peptide verwendet werden, um wirksame Immunantworten
gegen AMA-1 exprimierende Parasiten zu erzeugen oder sie können miteinander
in Kombination verwendet werden. In starker bevorzugten Ausführungsformen
gehören
die Epitope zu einem längeren, wie
zum Beispiel dem durch SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO:
7 repräsentierten
Peptid. Die Epitope der vorliegenden Erfindung, wenn sie zu einem
längeren
Peptid (oder Polypeptid) gehören,
können
in jeder Orientierung oder Reihenfolge, einschließlich ineinander
geschachtelten oder überlappenden
Anordnungen, geordnet werden und die Peptide, die unterschiedliche
Anordnungen der Epitope enthalten, können auf Immunogenität und immunstimulatorische
Wirkung durch Verfahren getestet werden, die Fachleuten bekannt sind
und wie hierin ferner beschrieben werden.
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Die
Peptide der vorliegenden Erfindung können durch chemische Synthese
hergestellt werden oder sie können
rekombinanten Ursprungs sein. Zusätzlich können ihre Sequenzen modifiziert
werden, so lange sie ihre immunstimulatorische Wirkung behalten,
was an ihrer Fähigkeit
gemessen werden kann das Parasitenwachstum hemmende Immunantworten
auszulösen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung
daher funktionale Varianten der erfindungsgemäßen Peptide. Wie hierin verwendet,
handelt es sich bei einer "funktionalen Variante" oder "Variante" eines Peptids um
ein Peptid, das eine oder mehrere Modifikationen in der primären Aminosäuresequenz
der Peptide der vorliegende Erfindung enthält, während die hierin offenbarte
immunstimulatorische Wirkung behalten wird. Falls eine funktionale
Variante eines Peptids der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresubstitution
einbezieht, werden typischerweise konservative Aminosäuresubstitutionen
bevorzugt sein, d. h. Substitutionen, die eine Eigenschaft der ursprünglichen
Aminosäure,
wie zum Beispiel Größe, Ladung,
Hydrophobizität,
Konformation usw. behalten. Beispiele für konservative Substitutionen
von Aminosäuren
schließen
Substitutionen ein, die zwischen Aminosäuren innerhalb der folgenden
Gruppen durchgeführt
werden: (Amit, A. G., et al. 1986, Science 233: 747 – 753) M,
I, L, V; (Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine 16: 240 – 247) F,
Y, W; (Barlow, D. Jet al. 1986, Nature 322: 747 – 748) K, R, H; (Cheng, Q.
und A. Saul. 1994. Mol. Biochem. Parasitol. 65: 183 – 187) A,
G; (Cohen, S., et al. 1961, Nature 192: 733 – 737) S, T; (Coley, A. M.,
et al. 2001, Protein Eng 14: 691 – 698) Q, N; und (Collins,
W. E., et al. 1994, Am. J. Trop. Med. Hyg. 51: 711 – 719) E,
D. Andere geeignete Substitutionen werden durch den Fachmann leicht
etabliert und können
zusätzlich
durch Bezugnahme auf Veröffentlichungen,
wie zum Beispiel Voet, Biochemistry, Wiley, 1990; Stryer Biochemistry,
4. Aufl., Freeman New York, 1995; Peptide Chemistry. A Practical Textbook,
2. Aufl., Miklos Bodanszky, Springer-Verlag, Berlin, 1993; Principles
of Peptide Synthesis, 2. Aufl., Miklos Bodanszky, Springer-Verlag,
Berlin, 1993; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and
Proteins, P. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, CRC Press,
Boca Raton, 1997; Bioorganic Chemistry: Peptides and Proteins, S.
M. Hecht, Hrsg., Oxford Press, Oxford, 1998, Synthetic Peptides:
A User's Guide,
Gregory A. Grant (Herausgeber), Oxford University Press, 2002, und
dergleichen bestimmt werden.
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Verfahren
für das
Identifizieren funktionaler Varianten von immunstimulatorischen
Peptiden der vorliegenden Erfindung werden gemäß einer anderen Ausführungsform
der Erfindung bereitgestellt. In einer ersten Ausführungsform
können
funktionale Varianten der Peptide der vorliegenden Erfindung, zum
Beispiel SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7, durch Durchsuchen
der öffentlich
verfügbaren
Literatur oder Datenbanken nach Protein- und/oder Nukleotidsequenzen
für AMA-1
verschiedener Plasmodiumstämme
oder -arten identifiziert werden. Sobald die abweichenden Aminosäuren und
ihre Positionen bestimmt sind können
sie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ersetzt werden.
Zum Beispiel können
D448, K451 und K485 von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO:7
durch jeden Aminosäurerest
der Wahl ersetzt werden, einschließlich D448 in N448, K451 in
M451 und K485 in 1485, um abweichende Peptide herzustellen. Zusätzlich kann
K473 in E473 geändert
werden, und D484 kann ganz und gar entfernt werden. Die Nummerierung der
Aminosäurereste
bezieht sich während
der ganzen Beschreibung auf ihre wie in 1 dargestellte
Position in den Peptiden, wonach die Zählung von Position 446 z. B
des ersten Peptids AMA-1446–490 in 1A mit der
Aminosäure
Tyrosin (Y) beginnt. Die Fähigkeit
der abweichende Peptide Wachstum von Merozoiten hemmende Antikörper zu
erzeugen und an Wachstum von Merozoiten hemmende Antikörper zu
binden, wird dann bestimmt, wobei das Binden an oder das Erzeugen
das Wachstum von Merozoiten hemmenden Antikörpern, vergleichbar zu dem
für die
ursprünglichen
Peptide gezeigten, anzeigt, dass das abweichende Peptid eine funktionale
Variante ist.
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Modifikationen,
die funktionale Varianten der Peptide der vorliegenden Erfindung
erzeugen, können auch
die Zugabe von Aminosäuren
an einem der beiden Enden der Peptide umfassen, d. h. an den N-
oder C-Termini. Abermals kann jedes gut bekannte Verfahren zum Herstellen
der modifizierten oder abweichenden Proteine angewendet werden,
wie zum Beispiel die Synthese des modifizierten oder abweichenden
Proteins oder seine rekombinate Produktion unter Verwendung eines
mutierten Nukleinsäuremoleküls. Die
Peptide der vorliegenden Erfindung können auch modifiziert werden,
um resistenter gegen Hydrolyse durch Proteasen zu sein, wie zum
Beispiel durch das Enthalten von D-Aminosäuren oder einem oder mehreren
nicht hydrolysierbaren Peptidbindungen, die Aminosäuren verbinden.
Nicht hydrolysierbare Peptidbindungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt
und können
ausgewählt
werden aus der Gruppe enthaltend -psi [CH2NH]-reduzierte Amidpeptidbindungen,
-psi [COCH2]-Ketomethylen-Peptidbindungen, -psi [CH(CN)NH]-(Cyanomethylen)amino-Peptidbindungen,
-psi [CH2CH(OH)]-Hydroxyethylen-Peptidbindungen,
-psi [CH2O]-Peptidbindungen und -psi [CH2S]-Thiomethylen-Peptidbindungen. Die Peptide
der vorliegenden Erfindung können
auch nicht natürliche
und ungewöhnliche
Aminosäuren
und Aminosäureanaloga,
wie zum Beispiel Ornithin, Norleucin, L-Malonyltyrosin und andere,
dem Fachmann bekannte umfassen. Alternativ dazu können die
Peptide der vorliegenden Erfindung und ihre funktionalen Varianten
durch die Aufnahme von Nichtpeptideinheiten gegen Degradation resistenter
gemacht werden oder ihre strukturelle Stabilität kann gesteigert werden. Die
Nichtpeptideinheiten erlauben den Peptiden vorzugsweise ihre natürliche Konformation
zu behalten oder eine optimierte bioaktive Konformation zu stabilisieren.
Beispiele für
geeignete Substitutionen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus D-Isomer Aminosäuren,
N-methyl Aminosäuren,
L-Isomer Aminosäuren,
modifizierten L-Isomer Aminosäuren
und cyclisierten Derivaten. Derartige Peptidmimetica können in
wie hierin beschriebenen molekularen oder Zell-basierten Bindungsassays
getestet werden, um die Wirkung der Substitution(en) auf die Konformation
und/oder Aktivität
festzustellen. Verfahren der medizinischen Chemie können durch
einen Fachmann unter Verwendung von Routine-Versuchsverfahren von z. B. rationaler
Wrkstoffentwicklung (rational drug design), auf Strukturinformation
von Kernspinresonanz- und Röntgendiffraktionsdaten
und anderen rechnerischen Verfahren basierendes molekulares Modellieren
angewendet werden. Die Erfindung schließt daher alle vorhergehenden
Modifikationen an den Peptiden ein.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
umfassen die Peptide an oder nahe den Enden der Peptide lokalisierte
Aminosäurereste
mit für
die Bildung einer intramolekularen Vernetzung für die Zwecke der Cyclisierung der
Peptide geeigneten Seitenketten. Für das Vernetzen geeignete Reste
sind einem Fachmann wohlbekannt und können aus der Gruppe umfassend
Disulfid- (Cystein – Cystein),
Thioether- (Cystein -Elektrophil, wie zum Beispiel Bromacetyl, Maleimidyl
usw.) und andere Bindungen ausgewählt werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird die Vernetzung für
die Cyclisierung durch eine Disulfidbrücke zwischen an oder nahe den N-
und C-Termini der Peptide lokalisierten Cysteinresten bereitgestellt.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen
werden terminale Spacerreste zu den Peptiden der Erfindung hinzugefügt, um die
räumliche
Verfügbarkeit
der vernetzenden Reste zu gewährleisten,
wie zum Beispiel für
die Aufnahme des cyclischen Peptids in Liposome, Virosome oder andere
geeignete Abgabevehikel. Zum Beispiel kann eine GGC-Sequenz zum N-Terminus und ein
zusätzlicher
Glycinrest zum C-Terminus hinzugefügt werden, für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung können
allerdings viele andere, Fachleuten bekannte Spacerreste verwendet
werden, solange die Seitenketten der Spacerreste klein genug sind,
um die intramolekulare Vernetzung sterisch nicht zu stören. Beispiele
für geeignete
Spacerreste werden aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren, wie
zum Beispiel Alanin, Serin, Asparagin, Glutamin oder Glycin, ausgewählt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden daher die Domäne 111 -Schleife I AMA-1-Peptide
durch die Bildung einer intramolekularen Vernetzung cyclisiert.
Die Cyclisierung der Peptide der Erfindung stellt die Emulation
der nativen dreidimensionalen Struktur von AMA-1 Schleife I in Domäne III bereit
und ist für
das weitere Optimieren von Wachstum hemmenden Immunantworten gegen
den Parasiten gedacht. Wiederum können interne Vernetzungen über eine Anzahl
von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Resten, sowohl natürlichen
als auch synthetischen, eingeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen
werden terminal positionierte (lokalisiert an oder nahe den N- und C-Termini des Peptids)
Cysteinreste verwendet, um die Peptide durch eine Disulfidbindung
zu cyclisieren. Ein Beispiel derartig terminal positionierter Reste
für das
Vernetzen wird in SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gefunden. Die immunstimulatorische
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in einer bevorzugten Ausführungsform
das Polypeptid nach SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7
und funktionale Varianten davon umfassen, wobei die Zusammensetzungen
durch intramolekulare Vernetzung cyclisiert werden.
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In
einer anderren bevorzugten Ausführungsform
werden die Peptide der vorliegenden Erfindung und funktionale Varianten
davon durch die Verwendung einer Matrize cyclisiert, wie zum Beispiel
die in 1B dargestellte. Ein Vorteil
derartiger breit verfügbarer
Matrizen ist ihre Rigidität,
welche die dreidimensionale Konformation der cyclisierten Peptide
wirksamer stabilisieren kann als die Verwendung interner Vernetzungen, die
typischerweise mehrere rotierbare Bindungen einführen, wobei dadurch die cyclisierte
Peptidstruktur destabilisiert wird. Geeignete Matrizen für die Cyclisierung
der Peptidketten sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können aus
der Gruppe bestehend aus tricyclischen (Beeli et al., Helvetica
Chimica Acta 79: 2235 – 2248,
1996), auf Diketopiperazin basierenden (Eisang et al., Helvetica
Chimica Acta 79: 1825 – 1842,
1996), bicyclischen, wie zum Beispiel einer von auf differentielle
Weise substituierten Diaminoprolinen (Pfeifer et al., Chem. Commun.
1977 – 78,
1988) oder heterochiralen Diprolinen (Favre er al., J. Am. Chem.
Soc. 121: 2679 – 2685,
1999) abgeleiteten Matrize, um nur einige zu nennen, ausgewählt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die immunstimulatorische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
die Polypeptide nach SEQ ID NO:5 oder funktionale arianten davon
umfassen, wobei die Zusammensetzung durch intramolekulare Vernetzung
oder eine Matrize cyclisiert wird.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die entweder
cyclisierte (Matrizengebunden oder intern vernetzt) oder lineare
AMA-1-Peptide der Schleife I in Domäne III, einschließlich funktionale
Varianten davon, und ein geeignetes Abgabevehikel, wie zum Beispiel
Mikroteilchen, einschließlich
Mikrokugeln, Nanokugeln, Polymere, leere Bakterien (bacterial ghosts),
bakterielle Polysaccharide, attenuierte Bakterien, Virus ähnliche
Teilchen, attenuierte Viren, immunstimulierende Komplexe (ISCOMS),
ein Liposom oder Virosom (IRIV), umfassen. IRIVs (immunstimulatorisch rekonstituierte
Influenzavirosome) sind modifizierte Liposome, die rekonstituierte
Fusions-aktive virale Hüllproteine
enthalten, die in der Phospholipid-Doppelschicht verankert sind.
Sowohl Liposome als auch Virosome sind wohlbekannte in Impfprotokollen
verwendete Adjuvantien. Herstellung und Verwendung von Liposomen als
Adjuvantien ist auf dem Fachgebiet Standard und in: The Theory and
Practical Application of Adjuvants, D. E. S. Stewart-Tull (Hersg.),
Wiley, 1995 und Fries et al., PNAS 89: 358 – 362, 1992, unter vielen anderen
Referenzen beschrieben. Virosome können durch Detergensentfernung
aus einem Gemisch natürlicher
und synthetischer Phospholipide und Glycoproteinen der Influenzaoberfläche, den
auf dem Fachgebiet wohlbekannten Protokollen folgend, hergestellt
werden (Poltl-Frank, F., et al. 1999, Clin. Exp. Immunol. 117: 496 – 503).
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Die
Peptide der Erfindung können
an der Oberfläche
des Abgabevehikels befestigt werden oder durch das Abgabevehikel
eingekapselt werden. Das Befestigen der Peptide der Erfindung an
der Oberfläche
von Abgabevehikeln umfasst die Aufnahme in, Vernetzen oder Adsorption
an der Oberfläche
der Abgabevehikel, welches alles Fachleuten wohlbekannte Verfahren
sind. Das Vernetzen der Peptide mit der Oberfläche von Liposomen kann zum
Beispiel durch die Verwendung von amphiphilen PEG-Derivaten durchgeführt werden,
die Ober den PE-Rest, der primäre
Aminogruppen enthaltende Liganden über Wasser-ausgesetzte pNP-Gruppen leicht
bindet, in Liposome und Mizellen leicht aufgenommen werden. Die
Peptide der Erfindung können
durch die Liposome unter Verwendung von Verfahren, wie zum Beispiel
den in Christodoulides et al., Microbiology 144: 3027 – 3027 (1998)
beschriebenen, eingekapselt werden. In ähnlicher Weise können die
Peptide der vorliegenden Erfindung durch Virosome (IRIV) durch auf
dem Fachgebiet wohlbekannte und ferner in Beispiel 5 beschriebene
Verfahren eingekapselt werden. Das Befestigen der Peptide an der
Oberfläche
der Virosome kann durch jedes Fachleuten bekannte Verfahren durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform
der Erfindung werden die Peptide der vorliegenden Erfindung an den
Virosomen befestigt, indem die Peptide durch einen Succinatlinker
am N-Terminus an ein Regioisomer von Phosphatidylethanolamin (PE)
konjugiert werden. Das PE-Peptidkonjugat
wird anschließend
in IRIV als Antigen-Abgabesystem aufgenommen. Die oben genannten
Peptide können
daher zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für das Auslösen einer
das Wachstum des Malariaparasiten hemmenden Immunantwort in einem
Wirt verwendet werden oder zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung für
das Erzeugen von Antikörpern
gegen AMA-1 in einem Wirt durch das Einführen der Zusammensetzung in
den Wirt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
stellt die Erfindung Kits bereit, umfassend die oben genannten Zusammensetzungen,
die es dem Fachmann ermöglichen,
ein gewünschtes
immunprophylaktisches/-therapeutisches Regime herzustellen. Ein
Beispiel für
einen Kit umfasst die Peptide der Erfindung und auch ihre vorher
diskutierten funktionalen Varianten. Der Kit kann auch mit den Peptiden
der Erfindung und funktionalen Varianten davon formulierte Liposome
oder Virosome entweder durch Einkapselung oder durch Oberflächen-Befestigung
enthalten, was Vernetzen, Konjugation und Oberflächenassoziation oder -adsorption
einschließt.
In bevorzugten Ausführungsformen
umfasst ein durch die vorliegende Erfindung bereitgestellter Kit Liposomen-
oder Virosomengemische, welche die Peptide der vorliegenden Erfindung
einschließlich
funktionalen Varianten davon einkapseln, mit Liposomen oder Virosomen,
welche die Peptide der vorliegenden Erfindung einschließlich funktionaler
Varianten davon an ihren Oberflächen
befestigt haben. Derartige Gemische können besonders beim gleichzeitigen
Stimulieren verschiedener Zweige des Immunsystems wirksam sein. Der
Kit schließt
vorzugsweise Anweisungen für
die Verwendung der bereitgestellten Zusammensetzungen ein. Andere
Komponenten können
wie gewünscht
zu den Kits hinzugefügt
werden.
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Der
Verabreichung oder Einführung
der Peptid beladenen Virosome ist/sind wahlweise eine oder mehrere
Prä-Immunisierungen
mit den leeren Virosomen oder IRIV vorausgegangen. Auf Anfangsdosen
des Peptid-IRIV Abgabesystems können
Dosen zur Auffrischung folgen, wobei den Immunisierungs-Standardprotokollen
auf dem Fachgebiet gefolgt wird, und ihre Wirkung kann durch auf
dem Fachgebiet wohlbekannte Adjuvantien oder Cytokine potenziert
werden. Wiederum können
die Peptide der vorliegenden Erfindung ebenso wie funktionale Varianten
davon in linearer oder cyclisierter Form eingekapselt werden durch
oder befestigt werden an der Oberfläche der Abgabevehikel. Die
vorliegende Erfindung stellt auch die Verabreichung der immunstimulatorischen
AMA-1 Peptide in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung
bereit. Mit Verabreichung, Verabreichen, Einführen oder Einführung ist
das Bereitstellen eines Peptids oder mehrerer Peptide oder Peptid enthaltenden
Zusammensetzungen der Erfindung an eine Person gemeint, welche der
Behandlung oder Verhütung
von Malaria bedarf. Eine derartige Zusammensetzung, welche ein Peptid
oder mehrere der Peptide und/oder Peptid enthaltenden Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung, einschließlich funktionale Varianten
davon, als den Hauptwirkstoff oder Teil des Wirkstoffs zur Verwendung
bei der Behandlung oder Verhütung
von Malaria enthält,
kann zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet
werden, die in einer breiten Vielfalt von therapeutischen und prophylaktischen
Dosierungsformen in den herkömmlichen
Vehikeln zur topischen oralen, systemischen, lokalen und parenteralen
Verabreichung verabreicht wird. Daher stellt die Erfindung Zusammensetzungen
bereit, die zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
zur parenteralen Verabreichung verwendet werden sollen, welche eine
Lösung
der in einem verträglichen
Träger,
vorzugsweise einem wässrigen
Träger,
gelösten
oder suspendierten Peptide und ihre funktionalen Varianten umfasst.
Eine Vielfalt wässriger
Träger
kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3%
Glycin, Hyaluronsäure
und dergleichen. Diese Zusammensetzungen, die für die Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung verwendet werden, können durch herkömmliche wohlbekannte
Sterilisierungstechniken sterilisiert werden oder können steril
filtriert werden. Die so erhaltenen wässrigen Lösungen können zur Verwendung im ist-Zustand
verpackt oder gefriergetrocknet werden, die gefriergetrocknete Herstellung
ist vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung zu kombinieren. Die Zusammensetzungen
können,
um physiologische Bedingungen anzugleichen, wie benötigt pharmazeutisch
verträgliche
Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel pH-Wert einstellende und
puffernde Mittel, Tonizität
einstellende Mittel, Benetzungsmittel und dergleichen, unter vielen
anderen zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid,
Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat.
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Der
Weg und das Verabreichungregime werden variieren. Zum Beispiel können immunstimulatorische Peptide,
einschließlich
ihre funktionalen Varianten, und die Peptid enthaltenden Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch Injektion (intraperitoneal,
intradermal, subkutan oder intramuskulär) verabreicht werden. Zusätzliche
Anwendungsformen schließen
derartige orale Dosierungsformen zum Beispiel als Tabletten, Kapseln
(wobei jede zeitlich festgelegte Freisetzungs- und verzögerte Freisetzungsformulierungen
einschließt),
Pillen, Pulver, Granulatkörner,
Elixiere, Tinkturen, Lösungen,
Suspensionen, Sirupe und Emulsionen ein. Alle diese Formen sind
Fachleuten auf dem pharmazeutischen Fachgebiet wohlbekannt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
können
die Peptide der Erfindung und ihre funktionalen Varianten zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, um durch
Injektion an einen Patienten in der Form eines Peptid-basierten
Impfstoffs verabreicht zu werden. Die Peptide werden vorzugsweise
intramuskulär,
intradermal oder subkutan injiziert, um die Aufnahme durch oder
Exposition zu in der Haut, Epidermis oder Dermis lokalisierten Antigen
präsentierenden
Zellen zu ermöglichen,
obwohl andere auf dem Fachgebiet bekannte Verabreichungswege ebenso
geeignet sein können
und vorgesehen sind, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen
werden. In einer starker bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide
der vorliegenden Erfindung vor Verabreichung an den Patienten, wie
vorstehend beschrieben, durch Einkapselung oder Oberflächen-Befestigung auf Virosome
oder Liposome geladen. Die Peptid beladenen Abgabevehikel können dann
in den Patienten, entsprechend zu der vorher beschriebenen Verabreichung
der Peptide, über
intramuskuläre,
intradermale, subkutane oder andere geeignete Wege injiziert werden.
Geeignete Formulierungen der vorliegenden Erfindung können zweckmäßigerweise
in einer einzigen Tagesdosis verabreicht werden oder die tägliche Gesamtdosis
kann in Teildosen, zum Beispiel zwei-, drei- oder viermal täglich, verabreicht
werden. Die Peptide, einschließlich
funktionale Varianten, und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
können
verwendet werden, um ein für
die Behandlung von Malaria nützliches Medikament
oder Mittel herzustellen. Darüber
hinaus können
die immunstimulatorischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung,
besonders jene, die Virosome oder Liposome enthalten, in intranasaler
Form oder Ober Fachleuten bekannte transdermale Wege verabreicht
werden.
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Für die Behandlung
und Verhütung
von Malaria können
die Peptide, einschließlich
funktionaler Varianten davon, und Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung zusammen mit anderen Mitteln, von denen bekannt ist, dass
sie beim Behandeln von Malaria nützlich
sind, verwendet werden. Derartige Mittel können chemotherapeutische Arzneimittel,
wie zum Beispiel Chinin, Chinidin, Chloroquin, Mefloquin, Tetracyclin, Mefloxin,
Halofantrin, Artemisinin und Derivate (Artemether, Artesunat), Lumefantrin,
Doxycyclin, Proguanil, Primaquin, Atovaquon – Proguanil, Pyrimethamin – Sulfadoxin
usw. einschließen.
Für eine
Kombinationsbehandlung mit mehr als einem Wirkstoff, können die
Wirkstoffe, wo die Wirkstoffe gleichzeitig verabreicht werden können, gleichzeitig
verabreicht werden oder sie können
getrennt Zeitversetzt verabreicht werden.
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Die
immunstimulatorischen Peptide, einschließlich funktionale Varianten
davon, und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können an
eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt werden, wie
zum Beispiel Polymilchsäure,
Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale,
Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipathische
Blockcopolymere von Hydrogelen, die beim Erreichen kontrollierter
Freisetzung der bioaktiven Substanz nützlich sind. Im Allgemeinen
können
die Patienten eine intradermale Injektion einer wirksamen Menge
der Peptide entweder in Kombination mit den Abgabevektoren, wie
zum Beispiel Virosome, oder sich selbst erhalten. Die Peptide der
vorliegenden Erfindung können
auch in Form von Liposom-Abgabesystemen, wie zum Beispiel kleinen
einschichtigen Vesikeln, großen
einschichtigen Vesikeln und mehrschichtigen Vesikeln, verabreicht
werden. Liposome können aus
einer Vielfalt von Verbindungen, einschließlich zum Beispiel Cholesterin,
Stearylamin und verschiedenen Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
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Auf
Anfangsdosen können
Dosen zur Auffrischung folgen, wobei Immunisierungs-Standardprotokollen
auf dem Fachgebiet gefolgt wird. Die immunsstimulatorische Wirkung
der Zusammensetzungen und Verwendungen der vorliegenden Erfindung
kann ferner durch das Kombinieren jeder der vorstehend erwähnten Peptid-Zusammensetzungen,
einschließlich
ihre Kombination mit Virosomen oder Liposomen, mit einer die Immunantwort
potenzierenden Verbindung weiter erhöht werden. Immunantwort potenzierende
Verbindungen werden entweder als Adjuvantien oder Cyctokine klassifiziert.
Adjuvantien können
die immunologische Antwort durch Bereitstellen eines Antigenreservoirs
(extrazellulär
oder in Makrophagen), Aktivieren von Makrophagen und Stimulieren
besonderer Gruppen von Lymphocyten steigern. Auf dem Fachgebiet
sind vielerlei Adjuvantien wohlbekannt; besondere Beispiele, die
mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können,
schließen
Freunds Adjuvans (komplett oder inkomplett), Mycobakterien, wie
zum Beispiel BCG. M. Vaccae oder Corynebacterium parvum, Quil-Saponin-Gemische,
wie zum Beispiel QS-21
(SmithKline Beecham), MF59 (Chiron) und verschiedene Öl/Wasser
Emulsionen (z. B. IDEC-AF) ein. Andere Adjuvatien, die verwendet
werden können,
schließen:
Mineralsalze oder Mineralgele, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid,
Aluminiumphosphat und Calciumphosphat; LPS-Derivate, Saponine, oberflächenwirksame
Substanzen, wie zum Beispiel Lysolecithin, Pluron-Polyole, Polyanione,
Peptide, Keyhole-Limpet-Hemocycanine
und Dinitrophenol; immunstimulatorische Moleküle, wie zum Beispiel Saponine,
Dipeptid- und Tripeptidderivate von Muramyl, CpG-Dinukleotide, CpG-Oligonukleotide,
Monophosphoryl-Lipid A und Polyphosphazene; teilchenförmige und
mikroteilchenförmige
Adjuvantien, wie zum Beispiel Emulsionen, Liposome, Virosome, Cochleate; oder
immunstimulierende komplexe mukosale Adjuvantien ein, sind aber
nicht darauf beschränkt.
Cyctokine sind bei Impfprotokollen aufgrund der Lymphocyten stimulierenden
Eigenschaften auch nützlich.
Viele für
derartige Zwecke nützliche
Cyctokine, einschließlich
Interleukin-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF und viele andere, werden einem
Fachmann wohlbekannt sein.
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Wenn
sie verabreicht werden, werden therapeutische oder prophylaktische
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch verträglichen
Herstellungen verabreicht. Derartige Herstellungen können routinemäßig pharmazeutisch
verträgliche
Konzentrationen von Salzen, Puffermitteln, Antioxidantien, Konservierungsmitteln,
kompatiblen Trägern,
ergänzenden
Immun-potenzierenden Mitteln, wie zum Beispiel Aduvantien und Cyctokine,
und hinzugefügtenfalls
anderen therapeutischen Mitteln enthalten. Die Herstellungen der
Erfindung werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine wirksame
Menge ist die Menge einer pharmazeutischen Herstellung, die allein
oder zusammen mit weiteren Dosen die gewünschte Antwort stimuliert. Im
Allgemeinen werden Dosen der Immunogene als wirksam angesehen, die
von einem Nanogramm/Kilogramm bis 100 Milligramm/Kilogramm reichen,
abhängig
von der Verabreichungsart. Es wird geglaubt, dass der bevorzugte
Bereich zwischen 500 Nanogramm und 500 Mikrogramm pro Kilogramm
liegt. Die absolute Menge wird von einer Vielfalt von Faktoren abhängen, einschließlich der
für die
Verabreichung ausgewählten Zusammensetzung,
ob es sich bei der Verabreichung um einzelne oder mehrere Dosen
handelt, und individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter,
körperlicher
Zustand, Größe, Gewicht
und das Krankheitsstadium. Diese Faktoren sind Fachleuten wohlbekannt
und können
mit nicht mehr als dem routinemäßigen Experimentieren
angesprochen werden.
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In
weiteren bevorzugten Ausführungsformen,
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erzeugen von das
Wachstum des Parasiten hemmenden Immunantworten bereit, umfassend
das Verabreichen der Peptide, einschließlich funktionale Varianten
davon, und Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten. Im
Fall des Behandelns von Malaria hemmt die gewünschte Antwort das Fortschreiten
der Infektion, reduziert die parasitäre Last und/oder beseitigt
den Parasiten aus dem Patienten. Im Fall des Verhütens von
Malaria handelt es sich bei der gewünschten Antwort um die Induktion
von starken Antikörper-
und/oder Zell-vermittelten Immunantworten gegen AMA-1 exprimierende
Parasiten. Diese gewünschten
Antworten können
durch Routineverfahren überwacht
werden oder können
gemäß hierin
offenbarten Diagnoseverfahren der Erfindung überwacht werden.
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Die
vorliegende Erfindung demonstriert zum ersten Mal, dass es möglich ist
das Wachstum des Parasiten hemmende Antikörper mit Formulierungen von
Peptiden auszulösen,
die Epitope umfassen, die in Schleife I der Domäne III von P. falciparum AMA-1
gefunden werden. Die Entwicklung von Peptid- basierten Impfstoffen
ist sowohl durch die schwache Immunogenität vieler Peptide, möglicherweise
teilweise aufgrund des Fehlens konformativer Ähnlichkeit zwischen kleinen
linearen Peptiden und der entsprechenden Sequenz in dem nativen
Zielprotein, behindert worden. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung
immunstimulatorische Peptide bereit, umfassend neu identifizierte
immunogene Epitope, die mit humankompatiblen Abgabesystemen, einschließlich Mikroteilchen
(z. B. Mikrokugeln und Nanokugeln), Polymeren, bacterial ghosts,
bakteriellen Polysacchariden, attenuierten Bakterien, Virus-ähnlichen
Teilchen, attenuierten Viren, ISCOMS, Liposomen und vorzugsweise
Virosomen (IRIVs) kombiniert werden können. Die Peptide der Erfindung
können
für die
effiziente Erzeugung von AMA-1 spezifischen Immunantworten eingekapselt
werden durch oder an den Abgabevehikeln befestigt werden. IRIVs
oder Virosome sind kugelige einschichtige Vesikel, hergestellt durch
Detergensentfernung aus einem Gemisch natürlicher und synthetischer Pospholipide
und Glycoproteinen der Influenzaoberfläche. Von ihnen wurde gezeigt,
dass sie als eine effiziente und hoch wirksame Einrichtung zum Steigern
der Immunantwort auf eine Vielfalt von Antigenen wirken, was so
ihre umfassende Eignung als ein Impfstoff-Abgabesystem veranschaulicht
(Gluck, R., 1999, Vaccine 17: 1782 – 1787). Das Membranglycoprotein
Hämaglutinin
des Influenzavirus spielt bei der Wirkungsweise von IRIVs eine wichtige
Rolle. Dieses Hauptantigen des Influenzavirus ist eine Fusions-induzierende
Komponente, welche die Antigenabgabe an immunkompetente Zellen erleichtert.
Im Fall des IRIV-basierten Hepatitis A-Impfstoffs Epaxal-Berna,
wobei es sich um den ersten zugelassenen Impfstoff handelt, in welchem
IRIVs als ein Abgabesystem für
ein Nicht-Influenza-Antigen verwendet werden, bindet das Hepatitis
A-Antigen spontan an die IRIVs, wobei sie so an den Abgabevehikeln
befestigt werden. Kleinere Antigene, einschließlich die Peptide der vorliegenden
Erfindung, können
an ein Phospolipid (PE) gebunden werden und die PE-Antigenkonjugate
können
während
des Virosom-Rekonstitutionsvorgangs in die virosomale Membran integriert
werden (Moreno, R., et al., 2001, Chembiochem 2: 838 – 843; Poltl-Frank,
F., et al., 1999, Clin. Exp. Immunol. 117:496 – 503).
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Im
Vergleich zu einer Formulierung für Virosome, beladen mit einem
PE-Konjugat eines cyclischen Peptid-Mimotops der Repeat-Region des
Circumsporozoiten-Proteins von P. falciparum, scheiterte ein mit
dem Adjuvans Alaun ergänztes
Mimotop/MAP (multiple antigenic peptide)-Konstrukt Antikörper herzustellen,
die in wirksamer Weise an die Parasiten binden, obwohl imstande
vergleichbare Spiegel an Antworten von anti-Mimotop Antikörpern in Mäusen auszulösen, was anzeigt, dass PE-gekuppelte
Antigene sich in einem mehr nativ-ähnlichen Zustand auf der Oberfläche der
Virosome befinden. Diese Ergebnisse können anzeigen, dass intramolekulare
Wechselwirkungen zu einer korrekten Faltung des linearen Peptids
führen
und, dass das Verankern an der Oberfläche von IRIVs keine schädlichen
Wirkungen auf diesen Vorgang aufweist. Die Lösungsstruktur der AMA-1 Domäne III,
bestimmt durch NMR-Spektroskopie, besteht aus einer Disulfid stabilisierenden
Kernregion, die alle drei Disulfidbindungen einschließt, allerdings
auch signifikante Regionen der Unordnung enthält (Nair, M., et al. 2002,
J. Mol. Biol. 322: 741 – 753).
Die Epitop-Analyse von Wachstum hemmenden anti-AMA49 MAks, hierin
unter Verwendung einer Bank von cyclischen Peptiden mit 12 Resten
durchgeführt,
umfassend die AMA444–449-Sequenz (1), stellt den Beweis bereit, dass mindestens
einige der MAks diskontinuierliche Epitope erkennen können. Da
diskontinuierliche Epitope kurze Strecken kontinuierlicher Sequenzen
enthalten können
(Amit, A. G., et al. 1986, Science 233: 747 – 753; Barlow, D. J., et al.
1986, Nature 322: 747 – 748;
Sheriff, S., et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 8075 – 8079)
sind Analysen mit Gruppen von überlappenden
Peptiden geeignet, um sowohl kontinuierliche lineare Epitope als
auch Teile von diskontinuierlichen Epitopen zu definieren (Gomme,
P. T., et al. 1999, J. Biochem. Biophys. Methods 38: 53 – 70; Uthaipibull,
C., et al. 2001, J. Mol. Biol. 307: 1381 – 1394). Die Analysen zeigen
an, dass K459RIKLN484 (SEQ ID
NO: 1) und D467DEGNKKII475 (SEQ
ID NO: 2) Sequenzstrecken diskontinuierlicher Epitope, die durch
hemmende anti-AMA-1 MAks erkannt werden, repräsentieren. In einer bevorzugten
Ausführungsform
umfasst die immunstimulatorische Zusammensetzung der Erfindung,
die zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet
werden kann, deshalb die Epitope der SEQ ID NO: 1 und 2.
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Die
in vielen anderen Antigenen von P. falciparum gefundenen tandemartigen
Sequenzwiederholungen fehlen bei AMA-1. Jedoch ist ein wesentlicher
Grad an Sequenzvielfalt zu beobachten, der den disruptiven Selektionsdruck
auf natürlicherweise
erworbene Immunantworten reflektieren mag (Crewther, P. E., et al. 1996,
Infect. Immun. 64: 3310 – 3317;
Escalante, A. A., et al., 2001, Mol. Biochem. Parasitol. 113: 279 – 287; Polley,
S. D. und D. J. Conway, 2001, Genetics 158: 1505 – 1512;
Verra, F. und A. L. Hughes, 2000, Mol. Biochem. Parasitol. 105:
149 – 153).
Die meisten der polymorphen oder dimorphen Aminosäurereste
der relativ konservierten Domäne
III sind in der Primärsequenz
weit voneinander entfernt lokalisiert, können sich allerdings in der
dreidimensionalen Struktur des Moleküls in der Region des Disulfidkerns
anhäufen
(Nair, M., et al. 2002, J. Mol. Biol. 322: 741 – 753). Dies ist auch der Fall
für die
drei variablen Reste (D448, K451 und
K485), die in der hierin analysierten Sequenz
von AMA-1446–490 vorliegen.
Die virosomale Formulierung dieses Peptids scheint die Antikörperantwort
primär
auf konservierte Schleifenstrukturen entfernt von dieser Kernregion
zu konzentrieren. Gegenseitiger Schutz, erhalten mit gegen auf rekombinate
Weise exprimiertes AMA-1 errichtete Antikörper hat den Nachweis für die Existenz
derartig verbreiteter schützender
Epitope erbracht (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69:
3286 – 3294;
Kocken, C. H., et al. 2002, Infect. Immun. 70: 4471 – 4476). Zusammengenommen
zeigen diese Ergebnisse an, dass die Sequenz von Schleife I aus
Domäne
III von AMA1 eine geeignete Komponente eines IRIV- basierten Multi-Antigen
Multi-Stadium synthetischen Peptid-Impfstoffkandidaten gegen Malaria
repräsentiert.
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Demgemäß wurde
eine Sequenz, umfassend 45 Aminosäurereste, Y446KDEIKKEIERESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLKC490 (SEQ ID NO: 5), aus Schleife I in Domäne III von
AMA-1 mit einer an den C-Terminus hinzugefügten GGC-Sequenz und einem
zusätzlichen
Glycinrest am N-Terminus (SEQ ID NO: 7, siehe auch 1A)
durch standardiserte Peptid-Festphasenchemie synthetisiert. Um das
Peptid auf Virosome zu laden, wurde es durch einen Succinatlinker
am N-Terminus mit einem Regioisomer von Phosphatidylethanolamin
(PE) konjugiert, und das PE-Peptidkonjugat,
bezeichnet AMA49-L1 (1, wobei L für die lineare
Form steht) wurde in IRIV als Antigenabgabesystem aufgenommen. Nach
einer Prä-Immunisierung
mit dem Influenza-Impfstoff Inflexal wurden Mäuse mit AMA49-L1 beladenem IRIV
immunisiert.
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Alle
vier immunisierten Mäuse
produzierten Antikörper,
die im ELISA (2) mit AMA49-L1 reagierten.
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Die
ausgelösten
Antikörper
waren kreuzreaktiv mit Blutstadium-Parasiten in der IFA (3), was ein für AMA-1 kennzeichnendes gepunktetes
Färbungsmuster
(Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294;
Miller, L. H und S.L. Hoffman, 1998, Nat. Med. 4: 520 – 524) ergibt.
Wechselwirkung von Maus anti-AMA49-L1 Serum mit vom Parasiten exprimiertem
AMA-1 wurde durch Western-Blotanalyse unter Verwendung von Gesamtproteinlysaten
von P. falciparum Blutstadium- Parasiten (4) bestätigt. Die
anti-AMA49-L1 Antiseren färbten
primär
Proteine mit einem apparenten Molekulargewicht von ungefähr 83 und 66
kDa an, wobei es sich um die Größe des gesamten
AMA-1 bzw. seines prozessierten Hauptproduktes handelt (Hodder,
A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294; Narum, D. L. und A.
W. Thomas, 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 67: 59 – 68). Einige
der anti-AMA49-L1 Antiseren färbten
eine zusätzliche
Proteinbande an, die dem vorher beschriebenen 46 kDa-Prozessierungsprodukt
von AMA-1 (Howell, S. A., et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 31311 – 31320),
das denselben N-Terminus wie das 66 kDa Fragment besitzt, entsprechen kann.
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Um
zu untersuchen ob die Cyclisierung des Peptids über die Cysteinreste nahe der
C- und N-Termini die Ausbeute von Parasiten-bindenden Antikörpern verbessert,
wurden Mäuse
mit IRIV, beladen mit einer cyclisierten (AMA49-C1) und einer linearen
(AMA49-L2) Version von AMA49-L1 (1),
immunisiert. Während AMA49-L1
freie Thiole enthielt, wurden im Fall von AMA49-12 beide Thiolgruppen
der terminalen Cysteinreste durch Alkylierung blockiert. Die mit
den zwei Konstrukten erhaltenen IFA-Titer unterschieden sich nicht signif kaut,
und waren mit jenen vergleichbar, die mit AMA49-L1 erhalten wurden
(Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Für eine detaillierte
Analyse der humoralen Immunantwort wurden AMA49-C1 spezifische Maus B-Zell-Hybridome
erzeugt. Alle 11 erhaltenen Hybridomklone sezernierten IgG:κ (10 MAk
waren gG1, MAk DV3 war IgG2a), das im ELISA sowohl mit dem cyclischen
als auch dem linearen Peptid mit vergleichbarer Wirksamkeit reagierte.
Alle diese 11 MAk färbten
Blutstadium-Parasiten in der IFA (Ergebnisse nicht gezeigt). ELISA-Konkurrenzexperimente
mit einer Gruppe von 4 überlappenden
linearen Peptiden, umfassend die Sequenzen AMA446–462,
AMA452–472,
AMA462–482 und
AMA472–490 1), wurden für die Epitopkartierung verwendet und
unterschieden zwischen vier verschiedenen Antikörpergruppen (Tabelle 2).
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Wie
aus Tabelle 2 gesehen werden kann, wurde die Antigenbindung der
MAk DV2 und DV6 durch AMA446–462 blockiert, MAk DV7
wurde sowohl durch AMA446–462 als auch AMA452–472 blockiert,
MAk DV5 und DV8 wurden durch AMA452–472 blockiert
und MAk DV1, DV3, DV4, DV9, DV10 und DV11 wurden durch AMA462–482 blockiert.
Keiner der Antikörper
wurde durch die C-terminale Sequenz AMA472–490 blockiert.
Eine Bank von 35 cyclischen Peptiden, wobei jedes 12 Reste der AMA444–489-Sequenz überstreicht,
jedes mit einer Verschiebung von einer Aminosäure, wurde für eine detailliertere
Epitopkartierung (siehe 1B und
Tabelle 2) verwendet. Diese Peptide wurden auf konformative Weise
durch Cyclisierung durch Verbindung mit einer Matrize aus einem
Dipeptid, umfassend ein D-Prolin und ein mit Succ-PE konjugiertes
L-4-Aminoprolin,
eingeschränkt.
In einem ELISA banden die beiden durch AMA446–462 gehemmten
MAk DV2 und DV6 an keines der kurzen cyclischen Peptide. MAk DV7
band an die hintereinander folgenden cyclischen Peptide, umfassend
die Reste 450 – 461
bis 455 – 466,
welche die Sequenz E455RESKRI461 (SEQ
ID NO: 3) miteinander teilen, die auch in der Überlappung der zwei hemmenden
langen Peptide AMA446–462 und AMA452–472 vorliegt.
MAk DV5 und DV8 banden an die cyclischen Peptide 453 – 464 bis
459 – 470,
welche die Sequenz K459RIKLN464 (SEQ
ID NO: 1) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden Peptids
AMA452–472 lokalisiert
iat. Zusätzliche
Bindung beider MAk an das nicht hintereinander folgende cyclische
Peptid 477 – 488,
und von MAk DV5 an das cyclische Peptid 474 – 485 ist bezeichnend für ein diskontinuierliches
Epitop. Alle sechs MAk, die durch AMA462–482 gehemmt wurden,
zeigten Bindung an die hintereinander folgenden Peptide 464 – 475 bis
467 – 478,
welche die Sequenz D467DEGNKKII475 (SEQ
ID NO: 2) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden langen
Peptids AMA462–482 lokalisiert ist.
MAk DV1 reagierte zusätzlich
mit dem überlappenden
Peptid 462 – 473.
Im Fall von MAk DV3 war die Reaktivität mit Peptid N466DDEGNKKIIAP477 (SEQ ID NO: 8) außerordentlich. Mit den anderen
vier MAk DV4, DV9, DV10 und DV11 zeigen die Reaktivitätsmuster
mit nicht überlappenden
Peptiden die Erkennung eines diskontinuierlichen Epitops an. Alle
vier MAk zeigten Reaktivität
mit dem Peptid 456 – 67,
das nur an der Position D467 mit der mutmaßlichen
zentralen Erkennungssequenz D467DEGNKKII475 (SEQ ID NO: 2) überlappt. Zusätzlich banden
MAk DV4 und DV9 auch an die nicht hintereinander folgenden Peptide
474 – 485
und 478 – 489
und an die Peptide 462 – 473,
463 – 474,
welche die Sequenz D467DEGNKK473 (SEQ
ID NO: 9) mit der zentralen Erkennungssequenz teilen.
-
Mäuse wurden
mit IRIV immunisiert, beladen mit PE-Konjugaten von jedem der cyclischen
12-mer Peptide, um zu analysieren ob einige von ihnen als Mimotope
der Oberflächenschleifen
von AMA-1 wirken können
und Parasiten-bindende Antikörper
auslösen.
Während
alle 35 Strukturen signifikante Antikörpertiter gegen die entsprechende
immunisierende Peptidsequenz selbst auslösten, waren nur die gegen AMA458–469 (welche
die zentrale Erkennungseinheit K459RIKLN464 (SEQ ID NO: 1) der MAk DV5 und DV8 enthält) und AMA464–475 (welche
die zentrale Erkennungseinheit D467DEGNKKII475 (SEQ ID NO: 2) der MAk DV1, DV3, DV4, DV9,
DV10 und DV11 enthält)
errichteten Seren schwach kreuzreaktiv mit Blutstadium-Parasiten
in der IFA (Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Wenn
MAk DV5 und DV11, welche die zwei hauptsächlichen Feinspezifitäten repräsentieren,
in einem in vitro Assay zur Wachstumshemmung von P. falciparum getestet
wurden, zeigten beide wesentliche hemmende Aktivität (5). Eine 95,3% Reduktion des Wachstums
von Parasiten wurde nach Zugabe von MAk DV5 bei einer Endkonzentration
von 300 μg/ml
(Mittelwert aus fünf
unabhängigen
sechsfachen Experimenten) beobachtet. MAk DV11 zeigte auch eine
signifikante, allerdings geringere Wachstum hemmende Aktivität, während ein
Isotyp-übereinstimmender
Kontroll-MAk keine Wirkung hatte. Zusammengenommen demonstrieren
diese Ergebnisse eindeutig, dass es durch Immunisierung mit AMA-1446–490 in
Kombination mit IRIV als ein humankompatibles Antigenabgabesystem
möglich
ist Parasiten bindende und das Wachstum hemmende Antikörper auszulösen.
-
AMA-1
ist ein führender
Blut-Stadium Impfstoffkandidat der Malaria, von dem gezeigt worden
ist, dass, wenn er als ganzes Protein verabreicht wird, schützende Immunantworten
auslöst.
Parasiteninvasion hemmende Aktivitäten der anti-AMA-1 Antikörper zeigen
an, dass der humorale Zweig der Immunantwort eine wichtige Rolle
bei dem AMA-1 vermittelten Immunschutz spielt. Die Ektodomäne von AMA-1
ist in drei durch Disulfidbindungen definierte Unterdomänen unterteilt
(Hodder, A. N., et al. 1996, J. Biol. Chem. 271: 29446 – 29452).
Es gibt Beweise, dass die Mehrheit der hemmenden Antikörper in
Seren von der Malaria ausgesetzten Menschen und in Kaninchenseren,
errichtet gegen die rückgefaltete
AMA-1 Ektodomäne,
gegen Stamm-spezifische Epitope in Domäne I (Hodder, A. N., et al.
2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294)
gerichtet sind. Eine Analyse tryptischer Fragmente von P. chabaudi
adami AMA-1 identifizierte vor kurzem eine schleifenähnliche Struktur
innerhalb der vermutlichen Domäne
I als ein Ziel von Antikörpern
aus Seren hyperimmuner Mäuse (Salvatore,
D., et al. 2002, Vaccine 20: 3477 – 3484). Es wurde festgestellt,
dass ein synthetisches 45-mer Schleifenmimetikum, das dieses Element
einschließt,
AMA-1 bindende Antikörper
auslöst.
Diese Antikörper schützten jedoch
in passiven Immunisierungsexperimenten P. chabaudi adami herausgeforderte
Mäuse nicht. Da
es sich bei Domäne
I um die am meisten unterschiedliche Region von AMA-1 handelt (Marshall,
V. M., et al. 1996, Mol. Biochem. Parasitol. 77: 109 – 113; Zhang,
L., et al. 1995, Zhongguo Ji. Sheng Chong. Xue. Yu Ji. Sheng Chong.
Bing. Za Zhi. 13: 203 – 208),
kann eine AMA-1 Impfstoffkomponente bevorzugt werden, der diese
Domäne
fehlt, um die Immunantwort auf die Region(en) zu richten, die mehrere
konservierte Epitope enthalten (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect.
Immun. 69: 3286 – 3294).
Da die Produktion von großen
Chargen in klinischer Güte
in rekombinanter Weise exprimiertem AMA-1 offenkundig schwierig
gewesen ist, ist die vorliegende Erfindung auf die Entwicklung einer
synthetischen Peptid-basierten AMA-1 Impfstoff-Formulierung gerichtet.
Die durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Ergebnisse zeigen,
dass es möglich
ist das Wachstum des Parasiten hemmende Antikörper mit einer virosomalen
Formulierung von Peptiden auszulösen,
die Teile der Sequenz von Schleife I der Domäne III von P. falciparum AMA-1
umfassen.
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Beispiele
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Die
folgenden Abkürzungen
werden hierin verwendet: AMA-1, das Apikale Membran Antigen 1; ELISA,
enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay; IFA, indirekter Immunfluoreszenz-Assay;
Ig, Immunglobulin; IRIV(s), Immunpotenzierende(s) rekonstituierte(s)
Influenza-Virosom(e); MAk, monoklonale(r) Antikörper; MSP-1, merozoite surface
Protein 1 (Merozoit-Oberflächenprotein
1); P. falciparum, Plasmodium falciparum; PE, Phosphatidylethanolamin;
SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel zeigt die Gestaltung und Synthese eines linearen auf Schleife
1 der Domäne
III von AMA-1 basierten Peptids. Ein Peptid von 49 Resten, umfassend
die Reste AMA-1446–490, mit drei zusätzlichen Aminosäuren (GGC)
am N-Terminus und einem zusätzlichen
G-Rest am C-Terminus (1A, SEQ ID NO: 7) wurde durch
Festphasen-Peptidsynthese auf Sieber Amidharz (0,5 mmol/g) unter
Verwendung von Fmoc-Chemie und einem ABI433A Peptidsyntheseautomaten
hergestellt. Die Pseudoprolineinheit Fmoc-IleSer( <Me,Mepro)-OH
wurde an Stelle von Ile39 und Ser40 verwendet. Nach dem Zusammensetzen wurde
das Peptid aus einem Anteil des Harzes unter Verwendung von TFA
: H2O: EDT : TIS (92,5 : 2,5 : 2,5 : 2,5)
3,5 Std. lang bei Raumtemperatur gespalten. Das Peptid wurde nach
Konzentrierung in vacuo mit Diethylether präzipitiert, und durch Umkehrphasen-HPLC
(C18 Säule)
unter Verwendung eines Gradienten aus MeCN in Wasser (25% bis 50%)
mit 0,1% TFA über
15 min. hinweg gereinigt. Die Reinheit war > 95% durch analytische HPLC. Die Konstitution
wurde durch eine Aminosäureanalyse
und Elektrospray-Massenspektometrie bestätigt (Tabelle 1). Ein anderer
Anteil des Harzes, welcher die intakte Peptidkette (ca. 60 μmol) tragt,
wurde mit PE-Succ-OH (130 mg, 160 μmol) (1),
HATU (61 mg, 160 μmol),
HOAt (22 mg, 160 μmol)
und iPr2EtN (82 μl) in DMF : CH2Cl2 (4 ml, 1 : 2) 18 Std. lang bei Raumtemp.
behandelt. Nach dem Waschen des Harzens mit DMF (4 ×) und CH2Cl2 (4 ×) wurde
das Peptidkonjugat mit 1% TFA in CH2Cl2 (4 × 4
ml) von dem Harz gespalten. Die vereinigten organischen Fraktionen
wurden in vacuo konzentriert und das Konjugat neu in TFA : H2O : EDT : TIS (92,5 : 2,5 : 2,5 : 2,5) 4
Std. lang bei Raumtemp. aufgelöst.
Die TFA wurde dann in vacuo entfernt und AMA49-L1 wurde mit iPr2O präzipitiert
und dann durch HPLC auf einer C4-Säule unter Verwendung eines
Gradienten von 10 bis 100% MeCN/Wasser mit 0,1% TFA gereinigt. Die
Reinheit war > 95%
durch analytische HPLC. Die Konstitution wurde durch eine Aminosäureanalyse
und Elektrospray-Massenspektrometrie (Tabelle 1) bestätigt. Die
Gegenwart von zwei freien Thiolen wurde durch einen Ellman-Test
und durch Reaktion mit N-Ethylmaleimid (NEM) im Überschuss, und Nachweis des
bis-NEM-Derivats durch HPLC-MS, überprüft. AMA49-C1
wurde auf die gleiche Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass
sPE-Succ-OH verwendet
wurde (1) und das Konjugat (4 mg)
im letzten Schritt in Ammoniumacetat-Puffer (50 mM, pH 8) und 2,2,2-Trifluorethanol
(TFE) (1 : 1, 100 ml) 4 Tage lang bei Raumtemperatur oxidiert wurde.
Nach Zugabe von AcOH (100 μl)
und Gefriertrocknung wurde AMA49-C1, wie vorstehend für AMA49-L1,
durch HPLC gereinigt. Die Bildung der Disulfidbrücke wurde über einen negativen Ellman-Test
und durch versuchte Derivatisierung mit NEM, was kein bis-NEM-Derivat
durch HPLC-MS gab, bestätigt.
Für die
Synthese von AMA49-L2 wurde das Dithiol (6 mg) mit lodacetamid (43 μmol) in einem
Gemisch (5 : 4) aus Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,5) und TFE alkyliert. Das
AMA49-L2 wurde durch HPLC auf einer C4-Säule unter Verwendung eines
Gradienten von 10 bis 100% MeCN/Wasser mit 0,1% TFA gereinigt. Die
Reinheit war > 95%
durch analytische HPLC. Elektrospray-Massenspektrometrie zeigte
die erwarteten Massen (Tabelle 1).
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Tabelle
1: Massenspektrometrische Kennzeichnung von synthetisierten Peptiden
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Electrospray-Massenspektren
wurden auf einem Bruker Esquire-LC-MS oder unter Verwendung eines Finnegan-TSQ-700
Spektrometers aufgezeichnet.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel zeigt die Produktion der linearen Peptide AMA1446–462 AMA1452–472,
AMA1462–482 und AMA1467–490 und
von einer Bank aus 35 cyclischen 12-mer Peptiden, welche die AMA444–489-Sequenz
für die
Epitopkartierung der Schleife I überstreichen.
AMA1446–462,
AMA1452–472,
AMA1462–482 und
AMA1467–490 wurden
durch standardisierte Fmoc Festphasen-Peptidsynthese (Beispiel 1)
hergestellt, durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C18-Säule und
einem Gradienten von MeCN in Wasser mit 0,1% TFA gereinigt, und
durch eine Aminosäureanalyse
und Elektrospray-Massenspektrometrie
(Tabelle 1) gekennzeichnet.
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Eine
Bank aus 35 cyclischen 12-mer Peptiden, welche die AMA444–489-Sequenz überstreichen
(1 und Tabelle 2), wurde hergestellt.
Jedes Mimetikum war ≥ 95%
rein durch HPLC und die Struktur wurde durch Elektrospray-Massenspektrometrie
bestätigt.
Die Primärstruktur
aller synthetisierten Peptide basiert auf der Sequenz der AMA-1
Domäne
III des P. falciparum Stammes K1 (Zugangsnummer U33279).
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung von Peptid-beladenen Virosomen, wobei
die Peptide in die Virosomeoberfläche aufgenommen werden. Zur
Herstellung des PE-Mimetikum-IRIV
wurde eine Lösung
aus gereinigtem Influenza A/Singapur-Hämagglutinin
(4 mg) in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) 30 min. lang bei
100.000 g zentrifugiert, und der Niederschlag in PBS (1,33 ml),
die 100 mM Octaethylenglycolmonodecylether (PBS-OEG) enthält, gelöst. Peptid-PE
Konjugate (4 mg), Phosphatidylcholin (32 mg; Lipoid, Ludwigshafen,
Deutschland) und Phosphatidylethanolamin (6 mg) wurden in einem
Gesamtvolumen von 2,66 ml PBS-OEG
gelöst.
Die Phospholipid- und die Hämagglutininlösungen wurden
gemischt und 1 min. lang beschallt. Diese Lösung wurde dann 1 Stunde lang
bei 100.000 g zentrifugiert, und der Überstand unter sterilen Bedingungen
filtriert (0,22 μm).
Virosome wurden dann durch Detergensentfernung unter Verwendung
von BioRad SM BioBeads (BioRad, Glattbrugg, Schweiz) gebildet.
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Beispiel 4
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Dieses
Beispiel zeigt wie das Vernetzen der Peptide an IRIVs durchgeführt wird.
Phosphatidylethanolamin PE wurde in Methanol gelöst und 0,1% (Vol./Vol.) Triethylamin
wurde hinzugefügt.
Die Lösung
wurde dann mit dem heterobifunktionalen Vernetzungsmittel N-γ-Maleimidobutyryloxysuccimidester
(GMBS) (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), (Verhältnis PE
: GMBS = 5 : 1), das vorher in Dimethylsulfoxid (DMSO) (20 μl) gelöst worden
war, gemischt. Nach der 30 Minuten langen Inkubation bei Raumtemperatur
wurden die Lösungsmittel
1 Std. lang unter Vakuum in einer Speedvac-Zentrifuge verdampft. Das GMBS-PE wurde
dann in 1 ml PBS, was 100 mM Octaethylenglycol (OEG) (Fluka Chemicals,
Schweiz) enthält
(PBS-OEG), gelöst
und das Peptid wurde hinzugefügt
(Verhältnis
PE-GMBS : Peptid = 5 : 1). Bei diesem Schritt reagiert das Phosphatidylethanolamin-GMBS
mit einem freien Cystein des Peptids. Nach einer Inkubationszeit
von 30 Minuten wurde freies Cystein hinzugefügt, um freies GMBS (Verhältnis Cystein
: GMBS = 10 : 1) zu inaktivieren.
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32
mg Ei-Phosphatidylcholin (PC), (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Deutschland)
und 6 mg Phosphatidylethanolamin (PE), (R. Berchtold, Biochemisches
Labor, Bern, Schweiz) wurden in 2,66 ml PBS, was 100 mM Octaethylenglycol
(OEG) (Fluka Chemicals, Schweiz) enthält (PBS-OEG), gelöst. Das
Influenza A/Singapur-Hämagglutinin
wurde wie vorher beschrieben gereinigt. Eine Lösung, die 4 mg Hämagglutinin
enthält,
wurde 30 min. lang bei 100.000 g zentrifugiert, und der Niederschlag
wurde in 1,33 ml PBS-OEG gelöst.
Das Peptid-GMBS-PE Konstrukt und Phospholipide wurden zu der Hämagglutininlösung hinzugefügt, gut
gemischt und 1 min. lang beschallt. Dieses Gemisch wurde dann 1
Std. lang bei at 100.000 g zentrifugiert und der Überstand steril
filtriert (0,22 mm). Virosome wurden dann durch Detergensentfernung
unter Verwendung von BioRad SM BioBeads gebildet.
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Beispiel 5
-
Dieses
Beispiel zeigt die Einkapselung von Peptiden in IRIVs. 32 mg Ei-Phosphatidylcholin
(PC), (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Deutschland) und 6 mg Phosphatidylethanolamin
(PE), (R. Berchtold, Biochemisches Labor, Bern, Schweiz) wurden
in 2,66 ml PBS, was 100 mM Octaethylenglycol (OEG) (Fluka Chemicals, Schweiz)
enthält
(PBS-OEG), gelöst.
Das Influenza A/Singapur-Hämagglutinin
wurde wie vorher beschrieben gereinigt (J. J. Skehel, G. C. Schild,
The polypeptid composition of Influenza A viruses. Virology 44 (1971),
396 – 408).
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Eine
Lösung,
die 4 mg Hämagglutinin
enthält,
wurde 30 min. bei 100.000 g zentrifugiert, und der Niederschlag
wurde in 1,33 ml PBS-OEG gelöst.
Das lipophile Peptid und Phospholipide wurden zu der Hämagglutininlösung hinzugefügt, gut
gemischt und 1 min. lang beschallt. Dieses Gemisch wurde dann 1
Std. lang bei at 100.000 g zentrifugiert und der Überstand
steril filtriert (0,22 mm). Virosome wurden dann durch Detergensentfernung
unter Verwendung von BioRad SM BioBeads gebildet.
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Beispiel 6
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Dieses
Beispiel zeigt die Immunogenitätsstudien
der Peptid-beladenen Virosome in Mäusen und ELISA-Analysen. BALB/c
Mäuse wurden
intramuskulär
mit 0,1 ml des kommerziellen Influenza Ganzvirus-Impfstoffes Inflexal
BernaTM (Berns Biotech, Bern, Schweiz) präimmunisiert.
Mindestens drei Wochen später
wurden sie mit Pepidbeladenen IRIVs in Intervallen von mindestens
zwei Wochen immunisiert. Blut wurde vor jeder Immunisierung und
zwei Wochen nach der letzten Injektion gesammelt.
-
ELISA-Analysen
mit Peptid-PE Konjugaten werden im Wesentlichen wie beschrieben
durchgeführt (Moreno,
R., et al. 2001, Chembiochem 2: 838 – 843). Kurz: PolysorpTM Platten (Nunc, Fisher Scientific, Wohlen,
Schweiz) wurden über
Nacht bei 4°C
mit 100 μl
einer 10 mg/ml Lösung
von AMA-1 Peptid-PE Konjugat in PBS (pH 7,2) beschichtet. Die Vertiefungen
wurden dann 30 min. lang bei 37°C
mit 5% Milchpulver in PBS blockiert, gefolgt von drei Waschungen
mit PBS, was 0,05% Tween-20 enthält.
Platten wurden dann 2 Std. lang bei 37°C mit seriellen Verdünnungen
von anti- Mimetikum-Mausseren
oder anti-AMA49-L1 monoklonalen Antikörpern (MAk) in PBS, was 0,05%
Tween-20 und 0,5% Milchpulver enthält, inkubiert. Nach dem Waschen wurden
die Platten mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege anti-Maus γ-schwere
Ketten-Antikörpern (Sigma,
St. Louis, Mo.) inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde die Phosphatase-Substratlösung (1
mg/ml p-Nitrophenylphosphat [Sigma] in einer pH 9,8 Pufferlösung, die
10% [Vol/Vol.] Diethanolamin und 0,02% MgCl2 enthält) hinzugefügt, und
die Platten in Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert bis die farbmetrische Reaktion
ausreichend vorangekommen war. Die optische Dichte wurde auf einem
Titertek Multiscan MCC/340 Lesegerät (Labsystems, Helsinki, Finnland)
bei 405 nm gemessen. In Konkurrenzassays wurden Peptid-PE beschichtete
Platten 2 Std. lang mit MAk in Gegenwart steigender Konzentrationen
von Konkurrenzpeptiden inkubiert. Isotypen der anti-AMA49 MAk wurden
durch das Nachweisen von MAk, die an Peptid-PE beschichtete Platten
banden, mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegenantikörpern, spezifisch
für Maus
Ig γ1-, γ2a-, γ3-, k- oder λ-Ketten (Southern Biotechnology,
Birmingham, Ala.), bestimmt.
-
Beispiel 7
-
Dieses
Beispiel zeigt wie die indirekten Immunfluoreszenz-Assays (IFA)
durchgeführt
wurden. Objektträger
mit vielen Vertiefungen für
die Immunfluoreszenzmikroskopie (Flow Laborstories, Baar, Schweiz)
wurden 30 min. lang bei Raumtemperatur mit 0,01% poly-L-Lysin (Sigma)
vorbehandelt, und fünfmal
mit RPMI Salz-Basalmedium (Gibco BRL, Basel, Schweiz) gewaschen.
Erythrozyten aus in vitro Kulturen von P. falciparum Stamm K1 (Matile,
H. und J. Pink, 1990, Plasmodium falciparum malaria parasite cultures
and their use in immunology, S. 221 – 234. In: I. Lefkovits und
P. Benvenuto (Hersg.) Immunological methods. Academic Press, Inc.,
San Diego, Calif.) mit einer Parasitämie zwischen 5–10% wurden
zweimal in RPMI gewaschen, in RPMI und zwei Volumen einer Lösung, die
4% Formaldehyd und 0,1% Triton X-100 enthält, resuspendiert. Von dieser
Zellsuspension wurden 30 μl
zu jeder Vertiefung hinzugefügt,
30 min. bei Raumtemperatur inkubiert und fünfmal mit PBS gewaschen. Die
Vertiefungen wurden 30 min. lang bei Raumtemperatur mit Blockierlösung, die
1% fettsäurefreies
Rinderserumalbumin (BSA) in PBS enthält, inkubiert. Immunfärbung wurde
durch 1 Std. langes Inkubieren der Vertiefungen mit 25 μl eines geeigneten
Antikörpers
oder einer Serumverdünnung
in Blockierlösung
bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer durchgeführt. Nach
fünf Waschungen
mit Blockierlösung
wurde 25 μl
von 5 μg/ml
Cyaninfarbstoff(Cy3)-konjugiertem affinitätsreinem F(ab')2-Fragment einer
Ziege anti-Maus Ig γ schwere
Ketten-Antikörpern (Jackson
Immuno Research Laborstories, West Grove, Pa.), verdünnt in Blockierlösung, die
0,01 mg/ml Hoechst Farbstoff No. 33256 (Sigma) enthält, zu den
Vertiefungen hinzugefügt,
und 1 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden
die Vertiefungen fünfmal
gewaschen, mit Einbettungsmitteln eingebettet (90% [Vol./Vol.] Glycerin,
das 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0 und 2 mg/ml o-Phenylendiamin enthält) und
mit einem Deckgläschen
bedeckt. Antikörperbindung
und DNA-Färbung
wurden durch Fluoreszenzmikroskopie auf einem Leitz Dialux 20 Fluoreszenzmikroskop
festgestellt und mit einem Leica DC200 Digitalkamerasystem dokumentiert.
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Beispiel 8
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Dieses
Beispiel demonstriert wie die SDS-PAGE- und Immunoblot-Assays durchgeführt wurden.
Parasitenlysate wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Matile,
H. und J. Pink, 1990, Plasmodium falciparum malaria parasite cultures
and their use in immunology, S. 221 – 234. In: I. Lefkovits und
P. Benvenuto (Hersg.) Immunological methods. Academic Press, Inc.,
San Diego, Calif.) durch Saponinlyse von P. falciparum K1 infizierten
Erythrozyten hergestellt. Kurz dargestellt: kultivierte Parasiten
wurden dreimal mit serumfreiem RPMI-Medium gewaschen. Pelletierte
infizierte rote Blutkörperchen
wurden durch Mischen mit einem großen Volumen (eingestellt auf
5% Hämatokrit)
0,015% (Gew./Vol.) Saponin in 150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat (pH
7,0) lysiert, und 20 min. lang auf Eis inkubiert. schließlich wurden
die pelletierten Parasiten in 3 Volumen SSC-Puffer (0,15 M NaCl
plus 0,015 M Natriumcitrat) resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung
bei –80°C aufbewahrt.
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50 μl des Parasitenlysats
wurde in einem gleichen Volumen 2 × Ladepuffer (1,7 ml 0,5M Tris-HCl,
pH 6,8, 2 ml Glycerin, 4,5 ml 10% SDS, 1 ml β-Mercaptoethanol, 0,8 ml Bromophenolblau
(0,3% Gew./Vol.)) aufgelöst,
und 10 min. lang auf 95°C
erhitzt. Proteine wurden auf einem 10% SDS PAGE Minigel getrennt.
Getrennte Proteine wurden elektrophoretisch auf einen Nitrocellulosefilter
(Protran® Nitrocellulose,
BA85, Schleicher & Schuell)
durch Feuchtblotten übertragen.
Blots wurden über
Nacht bei 4°C
mit PBS, das 5% Milchpulver und 0,1% Tween-20 enthält, blockiert.
Der Filter wurde in Streifen geschnitten und 1 Std. lang mit geeigneten Verdünnungen
der Immunseren oder MAk in Blockierpuffer bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dreimal 10 minütigem
Waschen der Streifen mit Blockierpuffer wurden sie zwei Stunden
lang bei Raumtemperatur mit Meerrettich Peroxidase konjugierten
Ziege anti-Maus lgG-Antikörpern (Bio-Rad,
Reinach, Schweiz) inkubiert. Schließlich wurden die Blots nach
dem Waschen, wie vorstehend, durch Zugabe von ECL Substrat (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland) und Exposition mit Kodak Biomax light scientific
imaging Filmen gemäß den Herstellerempfehlungen
entwickelt.
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Beispiel 9
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Dieses
Beispiel demonstriert die Erzeugung von Hybridomen und Produktion
monoklonaler Antikörper (MAk).
Hybridome wurden aus Milzzellen von Mäusen drei Tage nach einer Auffrischimmunisierung
mit AMA49-C1 beladenen IRIVs unter Verwendung von PAI Maus-Myelomzellen
als Fusionspartner erzeugt. Hybride wurden in HAT-Medium selektioniert
und Zellen, die anti-AMA49-L1 MAk sezernieren wurden durch ELISA
identifiziert. Für
eine MAk-Produktion in großem
Maßstab
wurden Hybridomzelllinien in 1 I Spinnerflaschen kultiviert, und
MAk wurden durch Protein G Affinitätschromatographie gereinigt.
Gereinigte MAk wurden gegen PBS dialysiert, aliquotiert und bei –80°C aufbewahrt.
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Beispiel 10
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Dieses
Beispiel zeigt wie die Kultur von Parasiten und Assays zur Wachstumshemmung
in vitro durchgeführt
wurden. P. falciparum Stamm K1 wurde wie beschrieben kultiviert
(Matile, H. und J. Pink, 1990, Plasmodium falciparum malaria parasite
cultures and their use in immunology, S. 221 – 234. In: I. Lefkovits und
P. Benvenuto (Hersg.) Immunological methods. Academic Press, Inc.,
San Diego, Calif.). Das Kulturmedium wurde mit 0,5% AlbuMAX (Gibco,
Paisley, Schottland) als Ersatz für Humanserum ergänzt (Dorn,
A., et al. 1995, Nature 374: 269 – 271). Synchronisation von
Kulturen wurde, wie beschrieben, durch Sorbitolbehandlung erreicht
(Lambros, C. und J. P. Vanderberg, 1979, J. Parasitol. 65: 418 – 420).
Erythrozyten der Serogruppe A+ für Passagen
wurden vom Schweizer Roten Kreuz (Basel, Schweiz) erhalten.
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Für Assays
zur Wachstumshemmung in vitro wurden, um eine Parasitämie von
0,5% zu geben, synchronisierte späte Trophozoiten oder Schizonten
mit frischen roten Blutkörperchen
verdünnt
und mit gereinigten MAk gemischt. Der Endhämatokritwert in Kulturen wurde
auf 0,5% eingestellt. Jede Kultur wurde in Kulturplatten mit 96
Vertiefungen mit flachem Boden sechsfach vorbereitet. Nach 96 Std.
wurden die Platten 5 min. lang bei 180 g zentrifugiert und Kulturüberstände wurden
verworfen. Pelletierte Erythrozyten wurden in 200 μl PBS resuspendiert,
ergänzt
mit 15 μg/ml
Hydroethidin fluoreszierendem Vitalfarbstoff (Polysciences Inc.,
Warrington, Pa.), und 30 min. lang bei 37°C inkubiert. Die Erythrozyten
wurden zweimal mit PBS gewaschen, in 400 μl PBS resuspendiert, und in
einem FACSscan Durchflusszytometer (Becton-Dickinson, San Jose,
CA) mit dem Computerprogramm CELLQuest 3.2.1 fl analysiert. Die
Hydroethidinemission wurde im FL2-Kanal durch logarithmische Verstärkung nachgewiesen,
und die Erythrozyten wurden auf Grund ihrer vorwärts und seitwärts Scatters
erfasst. Insgesamt wurden 30.000 Zellen pro Probe analysiert. Die
prozentuale Hemmung wurde aus dem geometrischen Parasitämien-Mittelwert
des sechsfachen Test- und Kontrollvertiefungen als 100 × (Kontrolle – Test)/Kontrolle
errechnet. Statistische Signifikanz wurde durch einen zweisseitigen
t-Test errechnet. Konfidenzbereiche (Cl; P < 95%) wurden durch antilogging der
auf der log-Skala errechneten Konfidenzgrenzen errechnet.
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Beispiel 11
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Dieses
Beispiel zeigt die Konstruktion Peptid-beladener Virosome und die
Erzeugung von gegen das Wachstum des Parasiten reaktiven Antikörpern. Eine
Sequenz, die 45 Aminosäurereste
der Schleife I in Domäne
III von AMA-1 umfasst, Y446KDEIKKEIERESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLKC490 (SEQ ID NO: 5), mit einer an den C-Terminus
angefügten
GGC-Sequenz und einem zusätzlichen
Glycinrest am N-Terminus wurde durch standardisierte Festphasen-Peptidchemie
synthetisiert. Um das Peptid auf die Virosome zu laden, wurde es
durch einen Succinatlinker am N-Terminus
an ein Regioisomer von Phosphatidylethanolamin (PE) konjugiert,
und das PE-Peptidkonjugat,
bezeichnet AMA49-L1 (1A), wurde in IRIV als Antigenabgabesystem
aufgenommen. Nach einer Präimmunisierung
mit dem Influenzaimpfstoff Inflexal wurden Mäuse mit AMA49-L1 beladenem
IRIV immunisiert. Alle vier immunisierten Mäuse stellten Antikörper her,
die im ELISA mit AMA49-L1 reagierten (2).
-
Die
ausgelösten
Antikörger
waren im IFA (3) kreuzreaktiv mit
Blutstadium-Parasiten,
was ein für AMA-1
kennzeichnendes gepunktetes Färbungsmuster
ergibt (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294;
Miller, L. H. und S. L. Hoffman. 1998, Nat. Med. 4: 520 – 524).
Wechselwirkung der Maus anti-AMA49-L1 Seren mit Parasiten exprimiertem
AMA-1 wurde durch Westernblot-Analyse unter Verwendung von Gesamtproteinlysaten
der P. falciparum Blutstadium-Parasiten (4) bestätigt. Die
anti-AMA49-L1 Antiseren färbten
primär
Proteine einer apparenten Molekülmasse
von ungefähr
83 und 66 kDa, wobei es sich um die Größe des gesamten AMA-1 bzw.
ihres prozessierten Hauptproduktes handelt (Hodder, A. N., et al. 2001,
Infect. Immun. 69: 3286 – 3294;
Narum, D. L. und A. W. Thomas. 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 67:
59 - 68). Einige der anti-AMA49-L1 Antiseren färbten eine zusätzliche
Proteinbande, welche dem vorher beschriebenen 46 kDa Prozessierungsprodukt
von AMA-1 (Howell, S. A. et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 31311 – 31320),
das denselben N-Terminus wie das 66 kDa-Fragment besitzt, entsprechen kann.
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Beispiel 12
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Dieses
Beispiel zeigt die Induktion der kreuzreaktiven Antikörper unter
Verwendung der cyclisierten Peptide der vorliegenden Erfindung und
die Identifizierung der Epitope, die durch die Antikörper erkannt
werden. Um zu untersuchen ob die Cycliserung der Peptide über Cysteinreste
nahe an den C- und N-Termini die Ausbeute an Parasiten bindenden
Antikörpern
verbessert, wurden Mäuse
mit IRIV, beladen mit einer cyclisierten (AMA49-C1) und einer linearen
(AMA49-12) Version von AMA49-L1 (1A), immunisiert.
Während AMA49-L1
freie Thiole enthielt, wurden im Fall von AMA49-12 beide Thiolgruppen
der endständigen
Cysteinreste durch Alkylierung blockiert. Mit den zwei Konstrukten
erhaltene IFA-Titer unterschieden sich nicht signifikant und waren
vergleichbar mit jenen mit AMA49-L1 erhaltenen (Ergebnisse nicht
gezeigt).
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Für eine detaillierte
Analyse der humoralen Immunantwort wurden AMA49-C1 spezifische Maus B-Zellhybridome
erzeugt. Alle erhaltenen 11 Hybridomklone sezernierten IgG:κ (10 MAk
waren IgG1, MAk DV3 war IgG2a), das im ELISA sowohl mit dem cyclischen
als auch dem linearen Peptid mit vergleichbarer Wirksamkeit reagierte.
Alle diese 11 MAk färbten
im IFA Blutstadium-Parasiten (Ergebnisse nicht gezeigt). ELISA-Konkurrenzexperimente
mit einer Gruppe von 4 überlappenden
linearen Peptiden welche die Sequenzen AMA446–462,
AMA452–472,
AMA462–482,
AMA472–490 1A)
umfassen, wurden für
die Epitopkartierung verwendet und unterschieden zwischen vier Gruppen
von Antikörpern
(Tabelle 2).
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Tabelle
2: Reaktivität
von anti-AMA49C1 mMAk
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Antigenbindung
von MAk DV2 und DV6 wurde durch AMA446–462 blockiert,
MAk DV7 wurde sowohl durch AMA446–462 als
auch AMA452–472 blockiert,
MAk DV5 und DV8 wurden durch AMA452–472 blockiert
und MAk DV1, DV3, DV4, DV9, DV10 und DV11 wurden durch AMA462–482 blockiert.
Keiner der Antikörper
wurde durch die C-terminale Sequenz AMA472–490 blockiert.
Eine Bank aus 35 cyclischen Peptiden, wobei jedes 12 Reste enthält, welche
die AMA444–489-Sequenz überstreichen,
jedes mit einer Verschiebung von einer Aminosäure, wurde für eine detailliertere
Epitopkartierung (siehe 1 und Tabelle
2) verwendet. Diese Peptide wurden auf konformative Weise durch
Cyclisierung durch Verbindung mit einer Matrize aus einem Dipeptid,
umfassend ein D-Prolin und ein mit Succ-PE konjugiertes L-4-Aminoprolin,
eingeschränkt.
In einem ELISA banden die beiden durch AMA446–462 gehemmten
MAk DV2 und DV6 an keines der kurzen cyclischen Peptide. MAk DV7
band an die hintereinander folgenden cyclischen Peptide, umfassend
die Reste 450 – 461
bis 455 – 466,
welche die Sequenz E455RESKRI461 (SEQ
ID NO: 3) miteinander teilen, die auch in der Überiappung der zwei hemmenden langen
Peptide AMA446–462 und AMA452–472 vorliegt.
MAk DV5 und DV8 banden an die cyclischen Peptide 453 – 464 bis
459 – 470,
welche die Sequenz K459RIKLN464 (SEQ
ID NO: 1) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden Peptids
AMA452–472 lokalisiert
ist. Zusätzliche
Bindung beider MAk an das nicht hintereinander folgende cyclische
Peptid 477 – 488,
und von MAk DV5 an das cyclische Peptid 474 – 485 (P477RIFISDD484; (SEQ ID NO: 4)), ist bezeichnend für ein diskontinuierliches
Epitop. Alle sechs MAk, die durch AMA462–482 gehemmt wurden,
zeigten Bindung an die hintereinander folgenden Peptide 464 – 475 bis
467 – 478,
welche die Sequenz D467DEGNKKII475 (SEQ
ID NO: 2) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden langen
Peptids AMA462–482 lokalisiert ist.
MAk DV1 reagierte zusätzlich
mit dem überlappenden
Peptid 462 – 473.
Im Fall von MAk DV3 war die Reaktivität mit Peptid N466DDEGNKKIIAP477 (SEQ ID NO: 8) außerordentlich. Mit den anderen
vier MAk DV4, DV9, DV10 und DV11 zeigen die Reaktivitätsmuster
mit nicht überlappenden
Peptiden die Erkennung eines diskontinuierlichen Epitops an. Alle
vier MAk zeigten Reaktivität
mit dem Peptid 456 – 67,
das nur an Position D467 mit der mutmaßlichen
zentralen Erkennungssequenz D467DEGNKKII475 (SEQ ID NO: 2) überlappt. Zusätzlich banden
MAk DV4 und DV9 auch an die nicht hintereinander folgenden Peptide
474 – 485 und
478 – 489
und an die Peptide 462 – 473,
463 – 474,
welche die Sequenz D467DEGNKK473 (SEQ
ID NO: 9) mit der zentralen Erkennungssequenz teilen.
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Mäuse wurden
mit IRIV immunisiert, die mit mit PE-Konjugaten von jedem der cyclischen
12-mer Peptide beladen waren, um zu analysieren ob einige von ihnen
als Mimotope der Oberflächenschleifen
von AMA-1 wirken können
und Parasiten-bindende Antikörper
auslösen.
Während
alle 35 Strukturen signifikante Antikörpertiter gegen die entsprechende
immunisierende Peptidsequenz selbst auslösten, waren nur gegen AMA458–469 (welche
die zentrale Erkennungseinheit K459RIKLN464 (SEQ ID NO: 1) der MAk DV5 und DV8 enthält) und
AMA464–475 (welche
die zentrale Erkennungseinheit D467DEGNKKII475 (SEQ ID NO: 2) der MAk DV1, DV3, DV4,
DV9, DV10 und DV11 enthält)
errichtete Seren schwach kreuzreaktiv mit Blutstadium-Parasiten
in IFA (Ergebnisse nicht gezeigt).
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Beispiel 13
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Dieses
Beispiel zeigt die das Wachstum des Parasiten hemmende Wirkung der
Antikörper,
ausgelöst durch
die Verwendung der Peptide der Erfindung. Wenn MAk DV5 und DV11,
welche die zwei hauptsächlichen Feinspezifitäten repräsentieren,
in einem P. falciparum in vitro Wachstums-Inhibitionsassay getestet
wurden, zeigten beide eine wesentliche hemmende Aktivität (5). Eine 95,3% Reduktion des Parasitenwachstums wurde
nach der Zugabe von MAk DV5 bei einer Endkonzentration von 300 μg/ml (Mittelwert
aus fünf
unabhängigen
sechsfachen Experimenten) beobachtet. MAk DV11 zeigte auch eine
signifikante, allerdings geringere Wachstum hemmende Aktivität, während ein
Isotyp-übereinstimmender
Kontroll-MAk keine Wirkung hatte. Zusammengenommen demonstrieren
diese Ergebnisse eindeutig, dass es durch Immunisierung mit AMA-1446–490 in
Kombination mit IRIV als ein humankompatibles Antigenabgabesystem
möglich
ist, Parasiten-bindende und das Wachstum hemmende Antikörper auszulösen.
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