DE602004006493T2

DE602004006493T2 - Zusammensetzungen und Verfahren zur Erzeugung einer schützenden Immunantwort gegen Malaria

Info

Publication number: DE602004006493T2
Application number: DE602004006493T
Authority: DE
Inventors: Gerd Pluschke; Markus Müller; John Robinson; Rinaldo Zurbriggen; Annabelle Freund-Renard
Original assignee: SWISS TROPICAL INST; Universitaet Zuerich; Pevion Biotech Ltd
Current assignee: Mymetics Corp
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2024-03-04
Also published as: EP1599225A2; DK1599225T3; WO2004078099A3; EP1599225B1; AU2004216833A1; ES2283992T3; CA2545779A1; DE602004006493D1; US7198791B2; WO2004078099A2; ATE362378T1; US20040175392A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete der Immunologie, Chemie und Molekularbiologie. Besonders betrifft die Erfindung immunstimulatorische Zusammensetzungen, umfassend Epitope aus einem Protein des Blutstadiums des Malariaparasiten, die im Stande sind Wachstum hemmende Immunantworten auszulösen.
Mit derzeit bis zu 300 Millionen betroffenen Menschen, von denen zwischen 2 und 3 Millionen jedes Jahr sterben, und zusätzlich 2 Milliarden infektionsgefährdeten Menschen bleibt Malaria eine der Hauptbürden der Gesundheit der Bevölkerung in vielen Tropenländern (WHO. 1997; Weekly Epidemiol. Rec. 69: 309 – 314). Wegen der Verbreitung von Arzneimittel-resistenten Parasiten und dem Auftreten von Insektizidresistenten Mücken ist die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen die schwerste durch Plasmodium falciparum verursachte Form von Malaria eine Angelegenheit von höchster Dringlichkeit. Impfstoffkandidaten sind gegen Antigene gerichtet, die in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus des Parasiten exprimiert werden (Richie, T. L. und A. Saul, 2002, Nature 415: 694 – 701). Die Effektormechanismen, die Immunität gegen Malaria verleihen können, sind unvollständig verstanden, allerdings zeigen mehrere Beweise, dass Antikörper gegen Antigene asexueller Blutstadium-Parasiten die mit einer Malariainfektion assoziierte Morbidität und Mortalität reduzieren können. Bei Kindern mit Parasitämie ist zum Beispiel gezeigt worden, dass passiver Antikörpertransfer von Erwachsenen mit natürlich erworbener Immunität gegen Malaria die Parasitenspiegel merklich herabdrücken (Cohen, S., et al. 1961, Nature 192: 733 – 737; Sabchareon, A., et al. 1991, Am. J. Trop. Med. Hyg. 45: 297 – 308).
Der Lebenszyklus des Malariaparasiten ist komplex, er umfasst mehrere verschiedene Stadien der Entwicklung. Wenn eine infizierte Mücke einen menschlichen Wirt sticht, werden Malariaparasiten in den Blutstrom als Sporozoiten inokuliert, welche rasch in Leberzellen eindringen. Innerhalb der nächsten Tage durchlaufen die Sporozoiten in den Wirtsleberzellen eine massive Vermehrung, was zur Folge hat, dass die Leberzellen platzen und viele tausende Tochtermerozoiten in den Blutstrom freisetzen. Die Merozoiten zielen und infizieren rasch zirkulierende rote Blutkörperchen (Erythrozyten), wo sie weitere Multiplikationen durchlaufen. In den infizierten Erythrozyten vervielfachen sich die Merozoiten alle paar Tage exponentiell und brechen hervor, um andere rote Blutkörperchen zu infizieren. Diese zyklische und massive Zunahme der Parasitenlast ist für die klinischen Manifestationen von Malaria verantwortlich, die zu schwerer Morbidität, wenn nicht Mortalität, des Patienten führen kann.
Weil infizierte Hepatozyten und Erythrozyten Merozoiten in den Blutstrom freisetzen, sind die freigesetzten Merozoiten, bevor sie wieder in Erythrozyten eindringen, Antikörpern und Effektorzellen des Immunsystems direkt zugänglich. Diese Blutstadium-Exposition macht Merozoiten zu einem primären Ziel für die Entwicklung eines Impfstoffs gegen Malaria, indem Immuneffektorzellen und im Plasma für Merozoiten-Antigene vorhandene spezifische Antikörper die Parasiteninvasion von Erythrozyten blockieren könnten. Von mehreren Merozoiten-Antigenen wird geglaubt, dass sie im Stande sind schützende Antikörper zu induzieren, und sie werden gegenwärtig für Antigenkandidaten eines Impfstoffes gehalten (Kumar, S., et al. 2002, Chem. Immunol. 80: 262 – 286). Einer der führenden Kandidaten ist das Apikale Membran Antigen 1 (AMA-1), ein 83 kDa Protein, das in reifen Stadien des Parasiten synthetisiert wird und zuerst im Hals der Rhoptrien, den am apikalen Ende des Parasiten gefundenen keulenförmigen Sekretionsorganellen, lokalisiert ist (Crewther, P. E., et al. 1990, Exp. Parasitol. 70: 193 – 206; Peterson, M. G., et al. 1989, Mol. Cell Biol. 9: 3151 – 3154). Mehrere Studien zu passiver und aktiver Immunisierung, basierend auf dem ganzen Protein, haben angezeigt, dass AMA-1 in das Auslösen schützender Immunantworten involviert ist (Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine 16: 240 – 247; Collins, W. E., et al. 1994, Am. J. Trop. Med. Hyg. 51: 711 – 719; Crewther, P. E., et al. 1996, Infect. Immun. 64: 3310 – 3317; Deans, J. A., et al. 1982, Clin. Exp. Immunol. 49: 297 – 309; Deans, J. A., et al. 1988, Parasite Immunol. 10: 535 – 552; Kucken, C. H., et al. 2000, Mol. Biochem. Parasitol. 109: 147 – 156; Narum, D. L., et al. 2000, Infect. Immun. 68: 2899 – 2906; Xu, H., et al. 2000, J. Immunol. 165: 389 – 396) und als ein Ziel für Antikörper dient, welche die Invasion blockieren (Deans, J. A., et al. 1982, Clin. Exp. Immunol. 49: 297 – 309; Deans, J. A., et al. 1988, Parasite Immunol. 10: 535 – 552; Hodder, A. N et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294; Kucken, C. H., et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 15119 – 15124).
AMA-1 ist ein integrales Membranprotein vom Typ I mit einer kleinen Transmembrandomäne und einer großen extrazellulären Ektodomäne. Von schützenden Immunantworten, errichtet gegen gesamtes AMA-1, ist gezeigt worden, dass diese primär gegen konformative Epitope gerichtet sind, da reduziertes und alkyliertes AMA-1 einen schwachen Schutz gibt (Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine 16: 240 – 247) und durch Hyperimmunsseren von Personen, die in Regionen mit endemischer Malaria leben (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294) schlecht erkannt wird. Um wirksam zu sein, scheint ein auf rekombinantem AMA-1 basierender Impfstoff daher die richtige Faltung des Proteins in seine native oder nahezu native Struktur zu benötigen. Obwohl Malariaimpfstoffe, basierend auf vollständigem AMA-1 oder seiner Ektodomäne getestet worden sind, leiden sie an mehreren signifikanten Nachteilen. Erstens, AMA-1 ist offenkundig schwer herzustellen. Es ist gezeigt worden, dass die Produktion von AMA-1 in E.coli zu einer inkorrekten Faltung des Proteins führt und daher zusätzliche Schritte von Reinigung und erneuter Faltung benötigt, die für die Produktion ausreichender Mengen von reinem Material klinischer Güte nicht geeignet sind. Ähnlich führt die Produktion von AMA-1 in eukaryotischen Wirtszell-Expressionssystemen ungewünschte Glycosylierung und von der Wirtszelle abgeleitete Lipide ein, die weitere Reinigung benötigen, um die Heterogenität von rekombinant hergestelltem AMA-1, weiches für die klinische Verwendung unakzeptabel sein würde, zu verhindern.
Die Produktion kürzerer AMA-1 Peptide umgeht viele der Probleme, die mit der Produktion der gesamten Ektodomäne assoziiert sind, da Peptide in hohen Ausbeuten ohne Wirtszellkontamination chemisch synthetisiert werden können. Peptid-Impfstoffe, basierend auf kürzeren Fragmenten oder Teilsequenzen von AMA-1, sind getestet worden, allerdings ist ein erfolgreicher Peptid-basierter AMA-1 Impfstoff auf Grund einer Vielfalt ungelöster Probleme noch nicht erreicht worden. Erstens, die dreidimensionale Konformation von AMA-1 in Lösung muss noch bestimmt werden, was eine Strukturbasierte Peptidgestaltung überaus schwierig macht. Zweitens, Peptide, die bestimmte Regionen von AMA-1 abdecken, können nicht alle immunogenen Epitope umfassen, und schaffen es nicht ausreichende Immunantworten zu erzeugen. Die Hinlänglichkeit der erzeugten Immunantwort ist signifikant, weil die Malaria-Merozoiten dem Blutstrom nur für eine kurze Zeitspanne ausgesetzt sind und die Beseitigung der Blutstadium-Parasiten deshalb eine starke Immunantwort benötigt. Schließlich haben selbst Peptide, die nachweislich hoch immunogen sind, es nicht geschafft Antikörper herzustellen, welche die Parasiteninvasion von Erythrozyten hemmen (Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine 16: 240 – 247; Salvatore, D., et al. 2002, Vaccine 20: 3477 – 3484), was anzeigt, dass es sich bei der Feinspezifität eines durch die Untereinheit eines Peptid-Impfstoffkandidaten erzeugten anti-AMA-1 Antikörpers um eine wichtige Determinante der Impfstoffwirksamkeit der Untereinheit beim Blockieren der Merozoiteninvasion handelt. Die Identifizierung von Epitopen, die im Stande sind starke Wachstum hemmende Immunantworten gegen den Blutstadium-Malariaparasiten zu erzeugen, stellt daher einen großen Vorteil für die Gestaltung Peptid-basierter Malariaimpfstoffe dar.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Strukturen der synthetischen Peptide, einschließlich AMA49-L1, AMA49-C1 und AMA49-12, ebenso wie die Bank der Matrizen-gebundenen cyclischen Peptide, wobei jedes 12 Reste von AMA-1 enthält. Die in jedem cyclischen Peptid enthaltenen Sequenzen werden in Tabelle 2 gezeigt.
2 zeigt die AMA49-L1 spezifischen IgG-Titer im ELISA nach drei Immunisierungen von Mäusen mit AMA49-L1 beladenem IRIV. Antworten einzelner Mäuse werden gezeigt. Ihre Prä-Immunseren zeigten keine signifikante Reaktivität mit AMA49-L1 (Ergebnisse nicht gezeigt).
3 zeigt die Immunfluoreszenzfärbung reifer Schizonten des P. falciparum Stamms K1 durch mit AMA49-L1-beladenem IRIV ausgelöste Antikörper. 3B: kennzeichnende Immunfärbung von AMA-1 mit Immunserum. 3D: Fehlen der Färbung mit Prä-Immunserum. Repräsentative Ergebnisse mit Seren von einer der immunisierten Mäuse werden gezeigt. Alle anderen mit AMA49-L1 immunisierten Mäuse zeigten vergleichbare IFA-Reaktivitäten. 3A und 3C: Kontrollfärbung der Parasiten-DNA mit dem Hoechst Farbstoff 33258.
4 zeigt die Western-Blotanalyse der Reaktivität von anti-AMA49-L1 Antiseren mit Lysaten des Blutstadiums von P. falciparum K1 als Antigen. Seren aller getesteten einzelnen Mäuse ergaben ein Doppelbandenmuster (angezeigt durch Pfeile), was für das gesamte AMA-1 und sein Hauptprozessierungsprodukt (83 bzw. 66 kDa) kennzeichnend ist.
5 zeigt die, das Wachstum des Parasiten hemmende in vitro Aktivität von anti-AMA49 MAks. 5A: MAk DV5; 5B: MAk DV11; 5C: Isotypübereinstimmende Kontrollantikörper. Jedes Symbol repräsentiert den Mittelwert eines unabhängigen sechsfachen Experiments und Fehlerbalken zeigen die 95% Cl (P < 0,05, zweiseitiger t- Test)
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Zusammensetzungen und Verfahren für das Herstellen wirksamer Wachstum hemmender Immunantworten gegen das Blutstadium des Malariaparasiten bereit. Ausführungsformen der Erfindung basieren auf der Entdeckung, dass Peptide, die Epitope umfassen, die in Schleife I der Domäne III des Merozoiten-Proteins AMA-1 vorliegen, überraschenderweise beim Stimulieren starker Immunantworten gegen AMA-1 wirksam sind. Die Ektodomäne von AMA-1 umfasst eine Region, die 16 zwischen verschiedenen Arten konservierte Cysteinreste ausmacht, die vernetzt sind, um acht Disulfidbrücken zu bilden. Die dreidimensionale Struktur des AMA-1 Proteins wird durch diese acht intramolekularen Disulfidbindungen stabilisiert, welche wiederum die Ektodomäne in drei Unterdomänen (I, II und III) unterteilen. Vorherige Ansätze, wobei die vollständige AMA-1 Ektodomäne verwendet wurde, zeigten, dass die Mehrheit der gegen die Ektodomäne errichteten Antikörper Epitope in Domäne I, einer hoch variablen Region des Proteins, erkennen. Bemühungen kleinere Peptidmimetika zu gestalten, basierend auf den Schleifenstrukturen der Domäne I, erzeugten jedoch keine schützenden Immunantworten, möglicherweise auf Grund der Unfähigkeit der Peptide die native Tertiärstruktur des Proteins genau nachzuahmen (Salvatore, D., et al. 2002, Vaccine 20: 3477 – 3484).
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung immunstimulatorische Zusammensetzungen, basierend auf der Aminosäuresequenz von Schleife I der Domäne III von AMA-1 bereit. Mit immunstimulatorisch ist die Fähigkeit der Zusammensetzungen gemeint, das Wachstum des Malariaparasiten hemmende Immunantworten zu erzeugen. Derartig Immunantworten können humoral oder Zell-vermittelt oder beides sein, und ihre Gegenwart und Wirksamkeit kann durch die Gegenwart von Antikörpern, die an lebende Malariaparasiten binden und das Wachstum von lebenden Malariaparasiten hemmen, leicht bestimmt werden. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung in Schleife I der Domäne III identifizierte Epitope bereit, die für die Gestaltung immunstimulatorischer Peptide nützlich sind, welche im Stande sind mit dem Parasiten kreuzreagierende Wachstum hemmende Immunantworten gegen die Blutstadium-Merozoiten der Malaria zu erzeugen. Mit Epitop ist der Anteil des AMA-1 Moleküls gemeint auf den T-Zellrezeptoren reagieren oder gegen den ein Wachstum hemmender Antikörper hergestellt werden wird und an den er binden wird. Derartige Epitope können linear, konformativ, kontinuierlich oder diskontinuierlich sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung immunstimulatorische Zusammensetzungen, bestehend aus mindestens einem Peptidepitop ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3 und 4, bereit. Starker bevorzugt besteht die immunstimulatorische Zusammensetzung aus mindestens zwei Epitopen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 2, 3 und 4, und am meisten bevorzugt besteht die Zusammensetzung aus den Epitopen der SEQ ID NO: 1 und 2. Die durch die vorliegende Erfindung identifizierten Epitope können selbst als einzelne Peptide verwendet werden, um wirksame Immunantworten gegen AMA-1 exprimierende Parasiten zu erzeugen oder sie können miteinander in Kombination verwendet werden. In starker bevorzugten Ausführungsformen gehören die Epitope zu einem längeren, wie zum Beispiel dem durch SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 repräsentierten Peptid. Die Epitope der vorliegenden Erfindung, wenn sie zu einem längeren Peptid (oder Polypeptid) gehören, können in jeder Orientierung oder Reihenfolge, einschließlich ineinander geschachtelten oder überlappenden Anordnungen, geordnet werden und die Peptide, die unterschiedliche Anordnungen der Epitope enthalten, können auf Immunogenität und immunstimulatorische Wirkung durch Verfahren getestet werden, die Fachleuten bekannt sind und wie hierin ferner beschrieben werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können durch chemische Synthese hergestellt werden oder sie können rekombinanten Ursprungs sein. Zusätzlich können ihre Sequenzen modifiziert werden, so lange sie ihre immunstimulatorische Wirkung behalten, was an ihrer Fähigkeit gemessen werden kann das Parasitenwachstum hemmende Immunantworten auszulösen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung daher funktionale Varianten der erfindungsgemäßen Peptide. Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einer _"funktionalen Variante" oder _"Variante" eines Peptids um ein Peptid, das eine oder mehrere Modifikationen in der primären Aminosäuresequenz der Peptide der vorliegende Erfindung enthält, während die hierin offenbarte immunstimulatorische Wirkung behalten wird. Falls eine funktionale Variante eines Peptids der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresubstitution einbezieht, werden typischerweise konservative Aminosäuresubstitutionen bevorzugt sein, d. h. Substitutionen, die eine Eigenschaft der ursprünglichen Aminosäure, wie zum Beispiel Größe, Ladung, Hydrophobizität, Konformation usw. behalten. Beispiele für konservative Substitutionen von Aminosäuren schließen Substitutionen ein, die zwischen Aminosäuren innerhalb der folgenden Gruppen durchgeführt werden: (Amit, A. G., et al. 1986, Science 233: 747 – 753) M, I, L, V; (Anders, R. F., et al. 1998, Vaccine 16: 240 – 247) F, Y, W; (Barlow, D. Jet al. 1986, Nature 322: 747 – 748) K, R, H; (Cheng, Q. und A. Saul. 1994. Mol. Biochem. Parasitol. 65: 183 – 187) A, G; (Cohen, S., et al. 1961, Nature 192: 733 – 737) S, T; (Coley, A. M., et al. 2001, Protein Eng 14: 691 – 698) Q, N; und (Collins, W. E., et al. 1994, Am. J. Trop. Med. Hyg. 51: 711 – 719) E, D. Andere geeignete Substitutionen werden durch den Fachmann leicht etabliert und können zusätzlich durch Bezugnahme auf Veröffentlichungen, wie zum Beispiel Voet, Biochemistry, Wiley, 1990; Stryer Biochemistry, 4. Aufl., Freeman New York, 1995; Peptide Chemistry. A Practical Textbook, 2. Aufl., Miklos Bodanszky, Springer-Verlag, Berlin, 1993; Principles of Peptide Synthesis, 2. Aufl., Miklos Bodanszky, Springer-Verlag, Berlin, 1993; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, P. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, CRC Press, Boca Raton, 1997; Bioorganic Chemistry: Peptides and Proteins, S. M. Hecht, Hrsg., Oxford Press, Oxford, 1998, Synthetic Peptides: A User's Guide, Gregory A. Grant (Herausgeber), Oxford University Press, 2002, und dergleichen bestimmt werden.
Verfahren für das Identifizieren funktionaler Varianten von immunstimulatorischen Peptiden der vorliegenden Erfindung werden gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung bereitgestellt. In einer ersten Ausführungsform können funktionale Varianten der Peptide der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7, durch Durchsuchen der öffentlich verfügbaren Literatur oder Datenbanken nach Protein- und/oder Nukleotidsequenzen für AMA-1 verschiedener Plasmodiumstämme oder -arten identifiziert werden. Sobald die abweichenden Aminosäuren und ihre Positionen bestimmt sind können sie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ersetzt werden. Zum Beispiel können D448, K451 und K485 von SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO:7 durch jeden Aminosäurerest der Wahl ersetzt werden, einschließlich D448 in N448, K451 in M451 und K485 in 1485, um abweichende Peptide herzustellen. Zusätzlich kann K473 in E473 geändert werden, und D484 kann ganz und gar entfernt werden. Die Nummerierung der Aminosäurereste bezieht sich während der ganzen Beschreibung auf ihre wie in 1 dargestellte Position in den Peptiden, wonach die Zählung von Position 446 z. B des ersten Peptids AMA-1^446–490 in 1A mit der Aminosäure Tyrosin (Y) beginnt. Die Fähigkeit der abweichende Peptide Wachstum von Merozoiten hemmende Antikörper zu erzeugen und an Wachstum von Merozoiten hemmende Antikörper zu binden, wird dann bestimmt, wobei das Binden an oder das Erzeugen das Wachstum von Merozoiten hemmenden Antikörpern, vergleichbar zu dem für die ursprünglichen Peptide gezeigten, anzeigt, dass das abweichende Peptid eine funktionale Variante ist.
Modifikationen, die funktionale Varianten der Peptide der vorliegenden Erfindung erzeugen, können auch die Zugabe von Aminosäuren an einem der beiden Enden der Peptide umfassen, d. h. an den N- oder C-Termini. Abermals kann jedes gut bekannte Verfahren zum Herstellen der modifizierten oder abweichenden Proteine angewendet werden, wie zum Beispiel die Synthese des modifizierten oder abweichenden Proteins oder seine rekombinate Produktion unter Verwendung eines mutierten Nukleinsäuremoleküls. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auch modifiziert werden, um resistenter gegen Hydrolyse durch Proteasen zu sein, wie zum Beispiel durch das Enthalten von D-Aminosäuren oder einem oder mehreren nicht hydrolysierbaren Peptidbindungen, die Aminosäuren verbinden. Nicht hydrolysierbare Peptidbindungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend -psi [CH₂NH]-reduzierte Amidpeptidbindungen, -psi [COCH₂]-Ketomethylen-Peptidbindungen, -psi [CH(CN)NH]-(Cyanomethylen)amino-Peptidbindungen, -psi [CH₂CH(OH)]-Hydroxyethylen-Peptidbindungen, -psi [CH₂O]-Peptidbindungen und -psi [CH₂S]-Thiomethylen-Peptidbindungen. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auch nicht natürliche und ungewöhnliche Aminosäuren und Aminosäureanaloga, wie zum Beispiel Ornithin, Norleucin, L-Malonyltyrosin und andere, dem Fachmann bekannte umfassen. Alternativ dazu können die Peptide der vorliegenden Erfindung und ihre funktionalen Varianten durch die Aufnahme von Nichtpeptideinheiten gegen Degradation resistenter gemacht werden oder ihre strukturelle Stabilität kann gesteigert werden. Die Nichtpeptideinheiten erlauben den Peptiden vorzugsweise ihre natürliche Konformation zu behalten oder eine optimierte bioaktive Konformation zu stabilisieren. Beispiele für geeignete Substitutionen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Isomer Aminosäuren, N-methyl Aminosäuren, L-Isomer Aminosäuren, modifizierten L-Isomer Aminosäuren und cyclisierten Derivaten. Derartige Peptidmimetica können in wie hierin beschriebenen molekularen oder Zell-basierten Bindungsassays getestet werden, um die Wirkung der Substitution(en) auf die Konformation und/oder Aktivität festzustellen. Verfahren der medizinischen Chemie können durch einen Fachmann unter Verwendung von Routine-Versuchsverfahren von z. B. rationaler Wrkstoffentwicklung (rational drug design), auf Strukturinformation von Kernspinresonanz- und Röntgendiffraktionsdaten und anderen rechnerischen Verfahren basierendes molekulares Modellieren angewendet werden. Die Erfindung schließt daher alle vorhergehenden Modifikationen an den Peptiden ein.
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Peptide an oder nahe den Enden der Peptide lokalisierte Aminosäurereste mit für die Bildung einer intramolekularen Vernetzung für die Zwecke der Cyclisierung der Peptide geeigneten Seitenketten. Für das Vernetzen geeignete Reste sind einem Fachmann wohlbekannt und können aus der Gruppe umfassend Disulfid- (Cystein – Cystein), Thioether- (Cystein -Elektrophil, wie zum Beispiel Bromacetyl, Maleimidyl usw.) und andere Bindungen ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Vernetzung für die Cyclisierung durch eine Disulfidbrücke zwischen an oder nahe den N- und C-Termini der Peptide lokalisierten Cysteinresten bereitgestellt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden terminale Spacerreste zu den Peptiden der Erfindung hinzugefügt, um die räumliche Verfügbarkeit der vernetzenden Reste zu gewährleisten, wie zum Beispiel für die Aufnahme des cyclischen Peptids in Liposome, Virosome oder andere geeignete Abgabevehikel. Zum Beispiel kann eine GGC-Sequenz zum N-Terminus und ein zusätzlicher Glycinrest zum C-Terminus hinzugefügt werden, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können allerdings viele andere, Fachleuten bekannte Spacerreste verwendet werden, solange die Seitenketten der Spacerreste klein genug sind, um die intramolekulare Vernetzung sterisch nicht zu stören. Beispiele für geeignete Spacerreste werden aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren, wie zum Beispiel Alanin, Serin, Asparagin, Glutamin oder Glycin, ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden daher die Domäne 111 -Schleife I AMA-1-Peptide durch die Bildung einer intramolekularen Vernetzung cyclisiert. Die Cyclisierung der Peptide der Erfindung stellt die Emulation der nativen dreidimensionalen Struktur von AMA-1 Schleife I in Domäne III bereit und ist für das weitere Optimieren von Wachstum hemmenden Immunantworten gegen den Parasiten gedacht. Wiederum können interne Vernetzungen über eine Anzahl von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Resten, sowohl natürlichen als auch synthetischen, eingeführt werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden terminal positionierte (lokalisiert an oder nahe den N- und C-Termini des Peptids) Cysteinreste verwendet, um die Peptide durch eine Disulfidbindung zu cyclisieren. Ein Beispiel derartig terminal positionierter Reste für das Vernetzen wird in SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gefunden. Die immunstimulatorische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in einer bevorzugten Ausführungsform das Polypeptid nach SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 und funktionale Varianten davon umfassen, wobei die Zusammensetzungen durch intramolekulare Vernetzung cyclisiert werden.
In einer anderren bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide der vorliegenden Erfindung und funktionale Varianten davon durch die Verwendung einer Matrize cyclisiert, wie zum Beispiel die in 1B dargestellte. Ein Vorteil derartiger breit verfügbarer Matrizen ist ihre Rigidität, welche die dreidimensionale Konformation der cyclisierten Peptide wirksamer stabilisieren kann als die Verwendung interner Vernetzungen, die typischerweise mehrere rotierbare Bindungen einführen, wobei dadurch die cyclisierte Peptidstruktur destabilisiert wird. Geeignete Matrizen für die Cyclisierung der Peptidketten sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können aus der Gruppe bestehend aus tricyclischen (Beeli et al., Helvetica Chimica Acta 79: 2235 – 2248, 1996), auf Diketopiperazin basierenden (Eisang et al., Helvetica Chimica Acta 79: 1825 – 1842, 1996), bicyclischen, wie zum Beispiel einer von auf differentielle Weise substituierten Diaminoprolinen (Pfeifer et al., Chem. Commun. 1977 – 78, 1988) oder heterochiralen Diprolinen (Favre er al., J. Am. Chem. Soc. 121: 2679 – 2685, 1999) abgeleiteten Matrize, um nur einige zu nennen, ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die immunstimulatorische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Polypeptide nach SEQ ID NO:5 oder funktionale arianten davon umfassen, wobei die Zusammensetzung durch intramolekulare Vernetzung oder eine Matrize cyclisiert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die entweder cyclisierte (Matrizengebunden oder intern vernetzt) oder lineare AMA-1-Peptide der Schleife I in Domäne III, einschließlich funktionale Varianten davon, und ein geeignetes Abgabevehikel, wie zum Beispiel Mikroteilchen, einschließlich Mikrokugeln, Nanokugeln, Polymere, leere Bakterien (bacterial ghosts), bakterielle Polysaccharide, attenuierte Bakterien, Virus ähnliche Teilchen, attenuierte Viren, immunstimulierende Komplexe (ISCOMS), ein Liposom oder Virosom (IRIV), umfassen. IRIVs (immunstimulatorisch rekonstituierte Influenzavirosome) sind modifizierte Liposome, die rekonstituierte Fusions-aktive virale Hüllproteine enthalten, die in der Phospholipid-Doppelschicht verankert sind. Sowohl Liposome als auch Virosome sind wohlbekannte in Impfprotokollen verwendete Adjuvantien. Herstellung und Verwendung von Liposomen als Adjuvantien ist auf dem Fachgebiet Standard und in: The Theory and Practical Application of Adjuvants, D. E. S. Stewart-Tull (Hersg.), Wiley, 1995 und Fries et al., PNAS 89: 358 – 362, 1992, unter vielen anderen Referenzen beschrieben. Virosome können durch Detergensentfernung aus einem Gemisch natürlicher und synthetischer Phospholipide und Glycoproteinen der Influenzaoberfläche, den auf dem Fachgebiet wohlbekannten Protokollen folgend, hergestellt werden (Poltl-Frank, F., et al. 1999, Clin. Exp. Immunol. 117: 496 – 503).
Die Peptide der Erfindung können an der Oberfläche des Abgabevehikels befestigt werden oder durch das Abgabevehikel eingekapselt werden. Das Befestigen der Peptide der Erfindung an der Oberfläche von Abgabevehikeln umfasst die Aufnahme in, Vernetzen oder Adsorption an der Oberfläche der Abgabevehikel, welches alles Fachleuten wohlbekannte Verfahren sind. Das Vernetzen der Peptide mit der Oberfläche von Liposomen kann zum Beispiel durch die Verwendung von amphiphilen PEG-Derivaten durchgeführt werden, die Ober den PE-Rest, der primäre Aminogruppen enthaltende Liganden über Wasser-ausgesetzte pNP-Gruppen leicht bindet, in Liposome und Mizellen leicht aufgenommen werden. Die Peptide der Erfindung können durch die Liposome unter Verwendung von Verfahren, wie zum Beispiel den in Christodoulides et al., Microbiology 144: 3027 – 3027 (1998) beschriebenen, eingekapselt werden. In ähnlicher Weise können die Peptide der vorliegenden Erfindung durch Virosome (IRIV) durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte und ferner in Beispiel 5 beschriebene Verfahren eingekapselt werden. Das Befestigen der Peptide an der Oberfläche der Virosome kann durch jedes Fachleuten bekannte Verfahren durchgeführt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Peptide der vorliegenden Erfindung an den Virosomen befestigt, indem die Peptide durch einen Succinatlinker am N-Terminus an ein Regioisomer von Phosphatidylethanolamin (PE) konjugiert werden. Das PE-Peptidkonjugat wird anschließend in IRIV als Antigen-Abgabesystem aufgenommen. Die oben genannten Peptide können daher zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für das Auslösen einer das Wachstum des Malariaparasiten hemmenden Immunantwort in einem Wirt verwendet werden oder zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für das Erzeugen von Antikörpern gegen AMA-1 in einem Wirt durch das Einführen der Zusammensetzung in den Wirt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Kits bereit, umfassend die oben genannten Zusammensetzungen, die es dem Fachmann ermöglichen, ein gewünschtes immunprophylaktisches/-therapeutisches Regime herzustellen. Ein Beispiel für einen Kit umfasst die Peptide der Erfindung und auch ihre vorher diskutierten funktionalen Varianten. Der Kit kann auch mit den Peptiden der Erfindung und funktionalen Varianten davon formulierte Liposome oder Virosome entweder durch Einkapselung oder durch Oberflächen-Befestigung enthalten, was Vernetzen, Konjugation und Oberflächenassoziation oder -adsorption einschließt. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein durch die vorliegende Erfindung bereitgestellter Kit Liposomen- oder Virosomengemische, welche die Peptide der vorliegenden Erfindung einschließlich funktionalen Varianten davon einkapseln, mit Liposomen oder Virosomen, welche die Peptide der vorliegenden Erfindung einschließlich funktionaler Varianten davon an ihren Oberflächen befestigt haben. Derartige Gemische können besonders beim gleichzeitigen Stimulieren verschiedener Zweige des Immunsystems wirksam sein. Der Kit schließt vorzugsweise Anweisungen für die Verwendung der bereitgestellten Zusammensetzungen ein. Andere Komponenten können wie gewünscht zu den Kits hinzugefügt werden.
Der Verabreichung oder Einführung der Peptid beladenen Virosome ist/sind wahlweise eine oder mehrere Prä-Immunisierungen mit den leeren Virosomen oder IRIV vorausgegangen. Auf Anfangsdosen des Peptid-IRIV Abgabesystems können Dosen zur Auffrischung folgen, wobei den Immunisierungs-Standardprotokollen auf dem Fachgebiet gefolgt wird, und ihre Wirkung kann durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Adjuvantien oder Cytokine potenziert werden. Wiederum können die Peptide der vorliegenden Erfindung ebenso wie funktionale Varianten davon in linearer oder cyclisierter Form eingekapselt werden durch oder befestigt werden an der Oberfläche der Abgabevehikel. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verabreichung der immunstimulatorischen AMA-1 Peptide in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung bereit. Mit Verabreichung, Verabreichen, Einführen oder Einführung ist das Bereitstellen eines Peptids oder mehrerer Peptide oder Peptid enthaltenden Zusammensetzungen der Erfindung an eine Person gemeint, welche der Behandlung oder Verhütung von Malaria bedarf. Eine derartige Zusammensetzung, welche ein Peptid oder mehrere der Peptide und/oder Peptid enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, einschließlich funktionale Varianten davon, als den Hauptwirkstoff oder Teil des Wirkstoffs zur Verwendung bei der Behandlung oder Verhütung von Malaria enthält, kann zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die in einer breiten Vielfalt von therapeutischen und prophylaktischen Dosierungsformen in den herkömmlichen Vehikeln zur topischen oralen, systemischen, lokalen und parenteralen Verabreichung verabreicht wird. Daher stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung verwendet werden sollen, welche eine Lösung der in einem verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, gelösten oder suspendierten Peptide und ihre funktionalen Varianten umfasst. Eine Vielfalt wässriger Träger kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen, die für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, können durch herkömmliche wohlbekannte Sterilisierungstechniken sterilisiert werden oder können steril filtriert werden. Die so erhaltenen wässrigen Lösungen können zur Verwendung im ist-Zustand verpackt oder gefriergetrocknet werden, die gefriergetrocknete Herstellung ist vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung zu kombinieren. Die Zusammensetzungen können, um physiologische Bedingungen anzugleichen, wie benötigt pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel pH-Wert einstellende und puffernde Mittel, Tonizität einstellende Mittel, Benetzungsmittel und dergleichen, unter vielen anderen zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat.
Der Weg und das Verabreichungregime werden variieren. Zum Beispiel können immunstimulatorische Peptide, einschließlich ihre funktionalen Varianten, und die Peptid enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch Injektion (intraperitoneal, intradermal, subkutan oder intramuskulär) verabreicht werden. Zusätzliche Anwendungsformen schließen derartige orale Dosierungsformen zum Beispiel als Tabletten, Kapseln (wobei jede zeitlich festgelegte Freisetzungs- und verzögerte Freisetzungsformulierungen einschließt), Pillen, Pulver, Granulatkörner, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Emulsionen ein. Alle diese Formen sind Fachleuten auf dem pharmazeutischen Fachgebiet wohlbekannt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Peptide der Erfindung und ihre funktionalen Varianten zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, um durch Injektion an einen Patienten in der Form eines Peptid-basierten Impfstoffs verabreicht zu werden. Die Peptide werden vorzugsweise intramuskulär, intradermal oder subkutan injiziert, um die Aufnahme durch oder Exposition zu in der Haut, Epidermis oder Dermis lokalisierten Antigen präsentierenden Zellen zu ermöglichen, obwohl andere auf dem Fachgebiet bekannte Verabreichungswege ebenso geeignet sein können und vorgesehen sind, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden. In einer starker bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide der vorliegenden Erfindung vor Verabreichung an den Patienten, wie vorstehend beschrieben, durch Einkapselung oder Oberflächen-Befestigung auf Virosome oder Liposome geladen. Die Peptid beladenen Abgabevehikel können dann in den Patienten, entsprechend zu der vorher beschriebenen Verabreichung der Peptide, über intramuskuläre, intradermale, subkutane oder andere geeignete Wege injiziert werden. Geeignete Formulierungen der vorliegenden Erfindung können zweckmäßigerweise in einer einzigen Tagesdosis verabreicht werden oder die tägliche Gesamtdosis kann in Teildosen, zum Beispiel zwei-, drei- oder viermal täglich, verabreicht werden. Die Peptide, einschließlich funktionale Varianten, und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um ein für die Behandlung von Malaria nützliches Medikament oder Mittel herzustellen. Darüber hinaus können die immunstimulatorischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, besonders jene, die Virosome oder Liposome enthalten, in intranasaler Form oder Ober Fachleuten bekannte transdermale Wege verabreicht werden.
Für die Behandlung und Verhütung von Malaria können die Peptide, einschließlich funktionaler Varianten davon, und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen Mitteln, von denen bekannt ist, dass sie beim Behandeln von Malaria nützlich sind, verwendet werden. Derartige Mittel können chemotherapeutische Arzneimittel, wie zum Beispiel Chinin, Chinidin, Chloroquin, Mefloquin, Tetracyclin, Mefloxin, Halofantrin, Artemisinin und Derivate (Artemether, Artesunat), Lumefantrin, Doxycyclin, Proguanil, Primaquin, Atovaquon – Proguanil, Pyrimethamin – Sulfadoxin usw. einschließen. Für eine Kombinationsbehandlung mit mehr als einem Wirkstoff, können die Wirkstoffe, wo die Wirkstoffe gleichzeitig verabreicht werden können, gleichzeitig verabreicht werden oder sie können getrennt Zeitversetzt verabreicht werden.
Die immunstimulatorischen Peptide, einschließlich funktionale Varianten davon, und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können an eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt werden, wie zum Beispiel Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipathische Blockcopolymere von Hydrogelen, die beim Erreichen kontrollierter Freisetzung der bioaktiven Substanz nützlich sind. Im Allgemeinen können die Patienten eine intradermale Injektion einer wirksamen Menge der Peptide entweder in Kombination mit den Abgabevektoren, wie zum Beispiel Virosome, oder sich selbst erhalten. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auch in Form von Liposom-Abgabesystemen, wie zum Beispiel kleinen einschichtigen Vesikeln, großen einschichtigen Vesikeln und mehrschichtigen Vesikeln, verabreicht werden. Liposome können aus einer Vielfalt von Verbindungen, einschließlich zum Beispiel Cholesterin, Stearylamin und verschiedenen Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Auf Anfangsdosen können Dosen zur Auffrischung folgen, wobei Immunisierungs-Standardprotokollen auf dem Fachgebiet gefolgt wird. Die immunsstimulatorische Wirkung der Zusammensetzungen und Verwendungen der vorliegenden Erfindung kann ferner durch das Kombinieren jeder der vorstehend erwähnten Peptid-Zusammensetzungen, einschließlich ihre Kombination mit Virosomen oder Liposomen, mit einer die Immunantwort potenzierenden Verbindung weiter erhöht werden. Immunantwort potenzierende Verbindungen werden entweder als Adjuvantien oder Cyctokine klassifiziert. Adjuvantien können die immunologische Antwort durch Bereitstellen eines Antigenreservoirs (extrazellulär oder in Makrophagen), Aktivieren von Makrophagen und Stimulieren besonderer Gruppen von Lymphocyten steigern. Auf dem Fachgebiet sind vielerlei Adjuvantien wohlbekannt; besondere Beispiele, die mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Freunds Adjuvans (komplett oder inkomplett), Mycobakterien, wie zum Beispiel BCG. M. Vaccae oder Corynebacterium parvum, Quil-Saponin-Gemische, wie zum Beispiel QS-21 (SmithKline Beecham), MF59 (Chiron) und verschiedene Öl/Wasser Emulsionen (z. B. IDEC-AF) ein. Andere Adjuvatien, die verwendet werden können, schließen: Mineralsalze oder Mineralgele, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Calciumphosphat; LPS-Derivate, Saponine, oberflächenwirksame Substanzen, wie zum Beispiel Lysolecithin, Pluron-Polyole, Polyanione, Peptide, Keyhole-Limpet-Hemocycanine und Dinitrophenol; immunstimulatorische Moleküle, wie zum Beispiel Saponine, Dipeptid- und Tripeptidderivate von Muramyl, CpG-Dinukleotide, CpG-Oligonukleotide, Monophosphoryl-Lipid A und Polyphosphazene; teilchenförmige und mikroteilchenförmige Adjuvantien, wie zum Beispiel Emulsionen, Liposome, Virosome, Cochleate; oder immunstimulierende komplexe mukosale Adjuvantien ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Cyctokine sind bei Impfprotokollen aufgrund der Lymphocyten stimulierenden Eigenschaften auch nützlich. Viele für derartige Zwecke nützliche Cyctokine, einschließlich Interleukin-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF und viele andere, werden einem Fachmann wohlbekannt sein.
Wenn sie verabreicht werden, werden therapeutische oder prophylaktische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch verträglichen Herstellungen verabreicht. Derartige Herstellungen können routinemäßig pharmazeutisch verträgliche Konzentrationen von Salzen, Puffermitteln, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, kompatiblen Trägern, ergänzenden Immun-potenzierenden Mitteln, wie zum Beispiel Aduvantien und Cyctokine, und hinzugefügtenfalls anderen therapeutischen Mitteln enthalten. Die Herstellungen der Erfindung werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine wirksame Menge ist die Menge einer pharmazeutischen Herstellung, die allein oder zusammen mit weiteren Dosen die gewünschte Antwort stimuliert. Im Allgemeinen werden Dosen der Immunogene als wirksam angesehen, die von einem Nanogramm/Kilogramm bis 100 Milligramm/Kilogramm reichen, abhängig von der Verabreichungsart. Es wird geglaubt, dass der bevorzugte Bereich zwischen 500 Nanogramm und 500 Mikrogramm pro Kilogramm liegt. Die absolute Menge wird von einer Vielfalt von Faktoren abhängen, einschließlich der für die Verabreichung ausgewählten Zusammensetzung, ob es sich bei der Verabreichung um einzelne oder mehrere Dosen handelt, und individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, körperlicher Zustand, Größe, Gewicht und das Krankheitsstadium. Diese Faktoren sind Fachleuten wohlbekannt und können mit nicht mehr als dem routinemäßigen Experimentieren angesprochen werden.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erzeugen von das Wachstum des Parasiten hemmenden Immunantworten bereit, umfassend das Verabreichen der Peptide, einschließlich funktionale Varianten davon, und Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten. Im Fall des Behandelns von Malaria hemmt die gewünschte Antwort das Fortschreiten der Infektion, reduziert die parasitäre Last und/oder beseitigt den Parasiten aus dem Patienten. Im Fall des Verhütens von Malaria handelt es sich bei der gewünschten Antwort um die Induktion von starken Antikörper- und/oder Zell-vermittelten Immunantworten gegen AMA-1 exprimierende Parasiten. Diese gewünschten Antworten können durch Routineverfahren überwacht werden oder können gemäß hierin offenbarten Diagnoseverfahren der Erfindung überwacht werden.
Die vorliegende Erfindung demonstriert zum ersten Mal, dass es möglich ist das Wachstum des Parasiten hemmende Antikörper mit Formulierungen von Peptiden auszulösen, die Epitope umfassen, die in Schleife I der Domäne III von P. falciparum AMA-1 gefunden werden. Die Entwicklung von Peptid- basierten Impfstoffen ist sowohl durch die schwache Immunogenität vieler Peptide, möglicherweise teilweise aufgrund des Fehlens konformativer Ähnlichkeit zwischen kleinen linearen Peptiden und der entsprechenden Sequenz in dem nativen Zielprotein, behindert worden. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung immunstimulatorische Peptide bereit, umfassend neu identifizierte immunogene Epitope, die mit humankompatiblen Abgabesystemen, einschließlich Mikroteilchen (z. B. Mikrokugeln und Nanokugeln), Polymeren, bacterial ghosts, bakteriellen Polysacchariden, attenuierten Bakterien, Virus-ähnlichen Teilchen, attenuierten Viren, ISCOMS, Liposomen und vorzugsweise Virosomen (IRIVs) kombiniert werden können. Die Peptide der Erfindung können für die effiziente Erzeugung von AMA-1 spezifischen Immunantworten eingekapselt werden durch oder an den Abgabevehikeln befestigt werden. IRIVs oder Virosome sind kugelige einschichtige Vesikel, hergestellt durch Detergensentfernung aus einem Gemisch natürlicher und synthetischer Pospholipide und Glycoproteinen der Influenzaoberfläche. Von ihnen wurde gezeigt, dass sie als eine effiziente und hoch wirksame Einrichtung zum Steigern der Immunantwort auf eine Vielfalt von Antigenen wirken, was so ihre umfassende Eignung als ein Impfstoff-Abgabesystem veranschaulicht (Gluck, R., 1999, Vaccine 17: 1782 – 1787). Das Membranglycoprotein Hämaglutinin des Influenzavirus spielt bei der Wirkungsweise von IRIVs eine wichtige Rolle. Dieses Hauptantigen des Influenzavirus ist eine Fusions-induzierende Komponente, welche die Antigenabgabe an immunkompetente Zellen erleichtert. Im Fall des IRIV-basierten Hepatitis A-Impfstoffs Epaxal-Berna, wobei es sich um den ersten zugelassenen Impfstoff handelt, in welchem IRIVs als ein Abgabesystem für ein Nicht-Influenza-Antigen verwendet werden, bindet das Hepatitis A-Antigen spontan an die IRIVs, wobei sie so an den Abgabevehikeln befestigt werden. Kleinere Antigene, einschließlich die Peptide der vorliegenden Erfindung, können an ein Phospolipid (PE) gebunden werden und die PE-Antigenkonjugate können während des Virosom-Rekonstitutionsvorgangs in die virosomale Membran integriert werden (Moreno, R., et al., 2001, Chembiochem 2: 838 – 843; Poltl-Frank, F., et al., 1999, Clin. Exp. Immunol. 117:496 – 503).
Im Vergleich zu einer Formulierung für Virosome, beladen mit einem PE-Konjugat eines cyclischen Peptid-Mimotops der Repeat-Region des Circumsporozoiten-Proteins von P. falciparum, scheiterte ein mit dem Adjuvans Alaun ergänztes Mimotop/MAP (multiple antigenic peptide)-Konstrukt Antikörper herzustellen, die in wirksamer Weise an die Parasiten binden, obwohl imstande vergleichbare Spiegel an Antworten von anti-Mimotop Antikörpern in Mäusen auszulösen, was anzeigt, dass PE-gekuppelte Antigene sich in einem mehr nativ-ähnlichen Zustand auf der Oberfläche der Virosome befinden. Diese Ergebnisse können anzeigen, dass intramolekulare Wechselwirkungen zu einer korrekten Faltung des linearen Peptids führen und, dass das Verankern an der Oberfläche von IRIVs keine schädlichen Wirkungen auf diesen Vorgang aufweist. Die Lösungsstruktur der AMA-1 Domäne III, bestimmt durch NMR-Spektroskopie, besteht aus einer Disulfid stabilisierenden Kernregion, die alle drei Disulfidbindungen einschließt, allerdings auch signifikante Regionen der Unordnung enthält (Nair, M., et al. 2002, J. Mol. Biol. 322: 741 – 753). Die Epitop-Analyse von Wachstum hemmenden anti-AMA49 MAks, hierin unter Verwendung einer Bank von cyclischen Peptiden mit 12 Resten durchgeführt, umfassend die AMA^444–449-Sequenz (1), stellt den Beweis bereit, dass mindestens einige der MAks diskontinuierliche Epitope erkennen können. Da diskontinuierliche Epitope kurze Strecken kontinuierlicher Sequenzen enthalten können (Amit, A. G., et al. 1986, Science 233: 747 – 753; Barlow, D. J., et al. 1986, Nature 322: 747 – 748; Sheriff, S., et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 8075 – 8079) sind Analysen mit Gruppen von überlappenden Peptiden geeignet, um sowohl kontinuierliche lineare Epitope als auch Teile von diskontinuierlichen Epitopen zu definieren (Gomme, P. T., et al. 1999, J. Biochem. Biophys. Methods 38: 53 – 70; Uthaipibull, C., et al. 2001, J. Mol. Biol. 307: 1381 – 1394). Die Analysen zeigen an, dass K⁴⁵⁹RIKLN⁴⁸⁴ (SEQ ID NO: 1) und D⁴⁶⁷DEGNKKII⁴⁷⁵ (SEQ ID NO: 2) Sequenzstrecken diskontinuierlicher Epitope, die durch hemmende anti-AMA-1 MAks erkannt werden, repräsentieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die immunstimulatorische Zusammensetzung der Erfindung, die zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden kann, deshalb die Epitope der SEQ ID NO: 1 und 2.
Die in vielen anderen Antigenen von P. falciparum gefundenen tandemartigen Sequenzwiederholungen fehlen bei AMA-1. Jedoch ist ein wesentlicher Grad an Sequenzvielfalt zu beobachten, der den disruptiven Selektionsdruck auf natürlicherweise erworbene Immunantworten reflektieren mag (Crewther, P. E., et al. 1996, Infect. Immun. 64: 3310 – 3317; Escalante, A. A., et al., 2001, Mol. Biochem. Parasitol. 113: 279 – 287; Polley, S. D. und D. J. Conway, 2001, Genetics 158: 1505 – 1512; Verra, F. und A. L. Hughes, 2000, Mol. Biochem. Parasitol. 105: 149 – 153). Die meisten der polymorphen oder dimorphen Aminosäurereste der relativ konservierten Domäne III sind in der Primärsequenz weit voneinander entfernt lokalisiert, können sich allerdings in der dreidimensionalen Struktur des Moleküls in der Region des Disulfidkerns anhäufen (Nair, M., et al. 2002, J. Mol. Biol. 322: 741 – 753). Dies ist auch der Fall für die drei variablen Reste (D⁴⁴⁸, K⁴⁵¹ und K⁴⁸⁵), die in der hierin analysierten Sequenz von AMA-1^446–490 vorliegen. Die virosomale Formulierung dieses Peptids scheint die Antikörperantwort primär auf konservierte Schleifenstrukturen entfernt von dieser Kernregion zu konzentrieren. Gegenseitiger Schutz, erhalten mit gegen auf rekombinate Weise exprimiertes AMA-1 errichtete Antikörper hat den Nachweis für die Existenz derartig verbreiteter schützender Epitope erbracht (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294; Kocken, C. H., et al. 2002, Infect. Immun. 70: 4471 – 4476). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse an, dass die Sequenz von Schleife I aus Domäne III von AMA1 eine geeignete Komponente eines IRIV- basierten Multi-Antigen Multi-Stadium synthetischen Peptid-Impfstoffkandidaten gegen Malaria repräsentiert.
Demgemäß wurde eine Sequenz, umfassend 45 Aminosäurereste, Y⁴⁴⁶KDEIKKEIERESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLKC⁴⁹⁰ (SEQ ID NO: 5), aus Schleife I in Domäne III von AMA-1 mit einer an den C-Terminus hinzugefügten GGC-Sequenz und einem zusätzlichen Glycinrest am N-Terminus (SEQ ID NO: 7, siehe auch 1A) durch standardiserte Peptid-Festphasenchemie synthetisiert. Um das Peptid auf Virosome zu laden, wurde es durch einen Succinatlinker am N-Terminus mit einem Regioisomer von Phosphatidylethanolamin (PE) konjugiert, und das PE-Peptidkonjugat, bezeichnet AMA49-L1 (1, wobei L für die lineare Form steht) wurde in IRIV als Antigenabgabesystem aufgenommen. Nach einer Prä-Immunisierung mit dem Influenza-Impfstoff Inflexal wurden Mäuse mit AMA49-L1 beladenem IRIV immunisiert.
Alle vier immunisierten Mäuse produzierten Antikörper, die im ELISA (2) mit AMA49-L1 reagierten.
Die ausgelösten Antikörper waren kreuzreaktiv mit Blutstadium-Parasiten in der IFA (3), was ein für AMA-1 kennzeichnendes gepunktetes Färbungsmuster (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294; Miller, L. H und S.L. Hoffman, 1998, Nat. Med. 4: 520 – 524) ergibt. Wechselwirkung von Maus anti-AMA49-L1 Serum mit vom Parasiten exprimiertem AMA-1 wurde durch Western-Blotanalyse unter Verwendung von Gesamtproteinlysaten von P. falciparum Blutstadium- Parasiten (4) bestätigt. Die anti-AMA49-L1 Antiseren färbten primär Proteine mit einem apparenten Molekulargewicht von ungefähr 83 und 66 kDa an, wobei es sich um die Größe des gesamten AMA-1 bzw. seines prozessierten Hauptproduktes handelt (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294; Narum, D. L. und A. W. Thomas, 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 67: 59 – 68). Einige der anti-AMA49-L1 Antiseren färbten eine zusätzliche Proteinbande an, die dem vorher beschriebenen 46 kDa-Prozessierungsprodukt von AMA-1 (Howell, S. A., et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 31311 – 31320), das denselben N-Terminus wie das 66 kDa Fragment besitzt, entsprechen kann.
Um zu untersuchen ob die Cyclisierung des Peptids über die Cysteinreste nahe der C- und N-Termini die Ausbeute von Parasiten-bindenden Antikörpern verbessert, wurden Mäuse mit IRIV, beladen mit einer cyclisierten (AMA49-C1) und einer linearen (AMA49-L2) Version von AMA49-L1 (1), immunisiert. Während AMA49-L1 freie Thiole enthielt, wurden im Fall von AMA49-12 beide Thiolgruppen der terminalen Cysteinreste durch Alkylierung blockiert. Die mit den zwei Konstrukten erhaltenen IFA-Titer unterschieden sich nicht signif kaut, und waren mit jenen vergleichbar, die mit AMA49-L1 erhalten wurden (Ergebnisse nicht gezeigt).
Für eine detaillierte Analyse der humoralen Immunantwort wurden AMA49-C1 spezifische Maus B-Zell-Hybridome erzeugt. Alle 11 erhaltenen Hybridomklone sezernierten IgG:κ (10 MAk waren gG1, MAk DV3 war IgG2a), das im ELISA sowohl mit dem cyclischen als auch dem linearen Peptid mit vergleichbarer Wirksamkeit reagierte. Alle diese 11 MAk färbten Blutstadium-Parasiten in der IFA (Ergebnisse nicht gezeigt). ELISA-Konkurrenzexperimente mit einer Gruppe von 4 überlappenden linearen Peptiden, umfassend die Sequenzen AMA^446–462, AM^A452–472, AMA^462–482 und AMA^472–490 1), wurden für die Epitopkartierung verwendet und unterschieden zwischen vier verschiedenen Antikörpergruppen (Tabelle 2).
Wie aus Tabelle 2 gesehen werden kann, wurde die Antigenbindung der MAk DV2 und DV6 durch AMA^446–462 blockiert, MAk DV7 wurde sowohl durch AMA^446–462 als auch AMA^452–472 blockiert, MAk DV5 und DV8 wurden durch AMA^452–472 blockiert und MAk DV1, DV3, DV4, DV9, DV10 und DV11 wurden durch AMA^462–482 blockiert. Keiner der Antikörper wurde durch die C-terminale Sequenz AMA^472–490 blockiert. Eine Bank von 35 cyclischen Peptiden, wobei jedes 12 Reste der AMA^444–489-Sequenz überstreicht, jedes mit einer Verschiebung von einer Aminosäure, wurde für eine detailliertere Epitopkartierung (siehe 1B und Tabelle 2) verwendet. Diese Peptide wurden auf konformative Weise durch Cyclisierung durch Verbindung mit einer Matrize aus einem Dipeptid, umfassend ein D-Prolin und ein mit Succ-PE konjugiertes L-4-Aminoprolin, eingeschränkt. In einem ELISA banden die beiden durch AMA^446–462 gehemmten MAk DV2 und DV6 an keines der kurzen cyclischen Peptide. MAk DV7 band an die hintereinander folgenden cyclischen Peptide, umfassend die Reste 450 – 461 bis 455 – 466, welche die Sequenz E⁴⁵⁵RESKRI⁴⁶¹ (SEQ ID NO: 3) miteinander teilen, die auch in der Überlappung der zwei hemmenden langen Peptide AMA^446–462 und AMA^452–472 vorliegt. MAk DV5 und DV8 banden an die cyclischen Peptide 453 – 464 bis 459 – 470, welche die Sequenz K⁴⁵⁹RIKLN⁴⁶⁴ (SEQ ID NO: 1) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden Peptids AMA^452–472 lokalisiert iat. Zusätzliche Bindung beider MAk an das nicht hintereinander folgende cyclische Peptid 477 – 488, und von MAk DV5 an das cyclische Peptid 474 – 485 ist bezeichnend für ein diskontinuierliches Epitop. Alle sechs MAk, die durch AMA^462–482 gehemmt wurden, zeigten Bindung an die hintereinander folgenden Peptide 464 – 475 bis 467 – 478, welche die Sequenz D⁴⁶⁷DEGNKKII⁴⁷⁵ (SEQ ID NO: 2) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden langen Peptids AMA^462–482 lokalisiert ist. MAk DV1 reagierte zusätzlich mit dem überlappenden Peptid 462 – 473. Im Fall von MAk DV3 war die Reaktivität mit Peptid N⁴⁶⁶DDEGNKKIIAP⁴⁷⁷ (SEQ ID NO: 8) außerordentlich. Mit den anderen vier MAk DV4, DV9, DV10 und DV11 zeigen die Reaktivitätsmuster mit nicht überlappenden Peptiden die Erkennung eines diskontinuierlichen Epitops an. Alle vier MAk zeigten Reaktivität mit dem Peptid 456 – 67, das nur an der Position D⁴⁶⁷ mit der mutmaßlichen zentralen Erkennungssequenz D⁴⁶⁷DEGNKKII⁴⁷⁵ (SEQ ID NO: 2) überlappt. Zusätzlich banden MAk DV4 und DV9 auch an die nicht hintereinander folgenden Peptide 474 – 485 und 478 – 489 und an die Peptide 462 – 473, 463 – 474, welche die Sequenz D⁴⁶⁷DEGNKK⁴⁷³ (SEQ ID NO: 9) mit der zentralen Erkennungssequenz teilen.
Mäuse wurden mit IRIV immunisiert, beladen mit PE-Konjugaten von jedem der cyclischen 12-mer Peptide, um zu analysieren ob einige von ihnen als Mimotope der Oberflächenschleifen von AMA-1 wirken können und Parasiten-bindende Antikörper auslösen. Während alle 35 Strukturen signifikante Antikörpertiter gegen die entsprechende immunisierende Peptidsequenz selbst auslösten, waren nur die gegen AMA^458–469 (welche die zentrale Erkennungseinheit K⁴⁵⁹RIKLN⁴⁶⁴ (SEQ ID NO: 1) der MAk DV5 und DV8 enthält) und AMA^464–475 (welche die zentrale Erkennungseinheit D⁴⁶⁷DEGNKKII⁴⁷⁵ (SEQ ID NO: 2) der MAk DV1, DV3, DV4, DV9, DV10 und DV11 enthält) errichteten Seren schwach kreuzreaktiv mit Blutstadium-Parasiten in der IFA (Ergebnisse nicht gezeigt).
Wenn MAk DV5 und DV11, welche die zwei hauptsächlichen Feinspezifitäten repräsentieren, in einem in vitro Assay zur Wachstumshemmung von P. falciparum getestet wurden, zeigten beide wesentliche hemmende Aktivität (5). Eine 95,3% Reduktion des Wachstums von Parasiten wurde nach Zugabe von MAk DV5 bei einer Endkonzentration von 300 μg/ml (Mittelwert aus fünf unabhängigen sechsfachen Experimenten) beobachtet. MAk DV11 zeigte auch eine signifikante, allerdings geringere Wachstum hemmende Aktivität, während ein Isotyp-übereinstimmender Kontroll-MAk keine Wirkung hatte. Zusammengenommen demonstrieren diese Ergebnisse eindeutig, dass es durch Immunisierung mit AMA-1^446–490 in Kombination mit IRIV als ein humankompatibles Antigenabgabesystem möglich ist Parasiten bindende und das Wachstum hemmende Antikörper auszulösen.
AMA-1 ist ein führender Blut-Stadium Impfstoffkandidat der Malaria, von dem gezeigt worden ist, dass, wenn er als ganzes Protein verabreicht wird, schützende Immunantworten auslöst. Parasiteninvasion hemmende Aktivitäten der anti-AMA-1 Antikörper zeigen an, dass der humorale Zweig der Immunantwort eine wichtige Rolle bei dem AMA-1 vermittelten Immunschutz spielt. Die Ektodomäne von AMA-1 ist in drei durch Disulfidbindungen definierte Unterdomänen unterteilt (Hodder, A. N., et al. 1996, J. Biol. Chem. 271: 29446 – 29452). Es gibt Beweise, dass die Mehrheit der hemmenden Antikörper in Seren von der Malaria ausgesetzten Menschen und in Kaninchenseren, errichtet gegen die rückgefaltete AMA-1 Ektodomäne, gegen Stamm-spezifische Epitope in Domäne I (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294) gerichtet sind. Eine Analyse tryptischer Fragmente von P. chabaudi adami AMA-1 identifizierte vor kurzem eine schleifenähnliche Struktur innerhalb der vermutlichen Domäne I als ein Ziel von Antikörpern aus Seren hyperimmuner Mäuse (Salvatore, D., et al. 2002, Vaccine 20: 3477 – 3484). Es wurde festgestellt, dass ein synthetisches 45-mer Schleifenmimetikum, das dieses Element einschließt, AMA-1 bindende Antikörper auslöst. Diese Antikörper schützten jedoch in passiven Immunisierungsexperimenten P. chabaudi adami herausgeforderte Mäuse nicht. Da es sich bei Domäne I um die am meisten unterschiedliche Region von AMA-1 handelt (Marshall, V. M., et al. 1996, Mol. Biochem. Parasitol. 77: 109 – 113; Zhang, L., et al. 1995, Zhongguo Ji. Sheng Chong. Xue. Yu Ji. Sheng Chong. Bing. Za Zhi. 13: 203 – 208), kann eine AMA-1 Impfstoffkomponente bevorzugt werden, der diese Domäne fehlt, um die Immunantwort auf die Region(en) zu richten, die mehrere konservierte Epitope enthalten (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294). Da die Produktion von großen Chargen in klinischer Güte in rekombinanter Weise exprimiertem AMA-1 offenkundig schwierig gewesen ist, ist die vorliegende Erfindung auf die Entwicklung einer synthetischen Peptid-basierten AMA-1 Impfstoff-Formulierung gerichtet. Die durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist das Wachstum des Parasiten hemmende Antikörper mit einer virosomalen Formulierung von Peptiden auszulösen, die Teile der Sequenz von Schleife I der Domäne III von P. falciparum AMA-1 umfassen.
Beispiele
Die folgenden Abkürzungen werden hierin verwendet: AMA-1, das Apikale Membran Antigen 1; ELISA, enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay; IFA, indirekter Immunfluoreszenz-Assay; Ig, Immunglobulin; IRIV(s), Immunpotenzierende(s) rekonstituierte(s) Influenza-Virosom(e); MAk, monoklonale(r) Antikörper; MSP-1, merozoite surface Protein 1 (Merozoit-Oberflächenprotein 1); P. falciparum, Plasmodium falciparum; PE, Phosphatidylethanolamin; SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Gestaltung und Synthese eines linearen auf Schleife 1 der Domäne III von AMA-1 basierten Peptids. Ein Peptid von 49 Resten, umfassend die Reste AMA-1^446–490, mit drei zusätzlichen Aminosäuren (GGC) am N-Terminus und einem zusätzlichen G-Rest am C-Terminus (1A, SEQ ID NO: 7) wurde durch Festphasen-Peptidsynthese auf Sieber Amidharz (0,5 mmol/g) unter Verwendung von Fmoc-Chemie und einem ABI433A Peptidsyntheseautomaten hergestellt. Die Pseudoprolineinheit Fmoc-IleSer( <^Me,Mepro)-OH wurde an Stelle von Ile³⁹ und Ser⁴⁰ verwendet. Nach dem Zusammensetzen wurde das Peptid aus einem Anteil des Harzes unter Verwendung von TFA : H₂O: EDT : TIS (92,5 : 2,5 : 2,5 : 2,5) 3,5 Std. lang bei Raumtemperatur gespalten. Das Peptid wurde nach Konzentrierung in vacuo mit Diethylether präzipitiert, und durch Umkehrphasen-HPLC (C18 Säule) unter Verwendung eines Gradienten aus MeCN in Wasser (25% bis 50%) mit 0,1% TFA über 15 min. hinweg gereinigt. Die Reinheit war > 95% durch analytische HPLC. Die Konstitution wurde durch eine Aminosäureanalyse und Elektrospray-Massenspektometrie bestätigt (Tabelle 1). Ein anderer Anteil des Harzes, welcher die intakte Peptidkette (ca. 60 μmol) tragt, wurde mit PE-Succ-OH (130 mg, 160 μmol) (1), HATU (61 mg, 160 μmol), HOAt (22 mg, 160 μmol) und iPr₂EtN (82 μl) in DMF : CH₂Cl₂ (4 ml, 1 : 2) 18 Std. lang bei Raumtemp. behandelt. Nach dem Waschen des Harzens mit DMF (4 ×) und CH₂Cl₂ (4 ×) wurde das Peptidkonjugat mit 1% TFA in CH₂Cl₂ (4 × 4 ml) von dem Harz gespalten. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden in vacuo konzentriert und das Konjugat neu in TFA : H₂O : EDT : TIS (92,5 : 2,5 : 2,5 : 2,5) 4 Std. lang bei Raumtemp. aufgelöst. Die TFA wurde dann in vacuo entfernt und AMA49-L1 wurde mit iPr₂O präzipitiert und dann durch HPLC auf einer C4-Säule unter Verwendung eines Gradienten von 10 bis 100% MeCN/Wasser mit 0,1% TFA gereinigt. Die Reinheit war > 95% durch analytische HPLC. Die Konstitution wurde durch eine Aminosäureanalyse und Elektrospray-Massenspektrometrie (Tabelle 1) bestätigt. Die Gegenwart von zwei freien Thiolen wurde durch einen Ellman-Test und durch Reaktion mit N-Ethylmaleimid (NEM) im Überschuss, und Nachweis des bis-NEM-Derivats durch HPLC-MS, überprüft. AMA49-C1 wurde auf die gleiche Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass sPE-Succ-OH verwendet wurde (1) und das Konjugat (4 mg) im letzten Schritt in Ammoniumacetat-Puffer (50 mM, pH 8) und 2,2,2-Trifluorethanol (TFE) (1 : 1, 100 ml) 4 Tage lang bei Raumtemperatur oxidiert wurde. Nach Zugabe von AcOH (100 μl) und Gefriertrocknung wurde AMA49-C1, wie vorstehend für AMA49-L1, durch HPLC gereinigt. Die Bildung der Disulfidbrücke wurde über einen negativen Ellman-Test und durch versuchte Derivatisierung mit NEM, was kein bis-NEM-Derivat durch HPLC-MS gab, bestätigt. Für die Synthese von AMA49-L2 wurde das Dithiol (6 mg) mit lodacetamid (43 μmol) in einem Gemisch (5 : 4) aus Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,5) und TFE alkyliert. Das AMA49-L2 wurde durch HPLC auf einer C4-Säule unter Verwendung eines Gradienten von 10 bis 100% MeCN/Wasser mit 0,1% TFA gereinigt. Die Reinheit war > 95% durch analytische HPLC. Elektrospray-Massenspektrometrie zeigte die erwarteten Massen (Tabelle 1).
Tabelle 1: Massenspektrometrische Kennzeichnung von synthetisierten Peptiden
Electrospray-Massenspektren wurden auf einem Bruker Esquire-LC-MS oder unter Verwendung eines Finnegan-TSQ-700 Spektrometers aufgezeichnet.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Produktion der linearen Peptide AMA1^446–462 AMA1^452–472, AMA1^462–482 und AMA1^467–490 und von einer Bank aus 35 cyclischen 12-mer Peptiden, welche die AMA^444–489-Sequenz für die Epitopkartierung der Schleife I überstreichen. AMA1^446–462, AMA1^452–472, AMA1^462–482 und AMA1^467–490 wurden durch standardisierte Fmoc Festphasen-Peptidsynthese (Beispiel 1) hergestellt, durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C18-Säule und einem Gradienten von MeCN in Wasser mit 0,1% TFA gereinigt, und durch eine Aminosäureanalyse und Elektrospray-Massenspektrometrie (Tabelle 1) gekennzeichnet.
Eine Bank aus 35 cyclischen 12-mer Peptiden, welche die AMA^444–489-Sequenz überstreichen (1 und Tabelle 2), wurde hergestellt. Jedes Mimetikum war ≥ 95% rein durch HPLC und die Struktur wurde durch Elektrospray-Massenspektrometrie bestätigt. Die Primärstruktur aller synthetisierten Peptide basiert auf der Sequenz der AMA-1 Domäne III des P. falciparum Stammes K1 (Zugangsnummer U33279).
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Peptid-beladenen Virosomen, wobei die Peptide in die Virosomeoberfläche aufgenommen werden. Zur Herstellung des PE-Mimetikum-IRIV wurde eine Lösung aus gereinigtem Influenza A/Singapur-Hämagglutinin (4 mg) in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) 30 min. lang bei 100.000 g zentrifugiert, und der Niederschlag in PBS (1,33 ml), die 100 mM Octaethylenglycolmonodecylether (PBS-OEG) enthält, gelöst. Peptid-PE Konjugate (4 mg), Phosphatidylcholin (32 mg; Lipoid, Ludwigshafen, Deutschland) und Phosphatidylethanolamin (6 mg) wurden in einem Gesamtvolumen von 2,66 ml PBS-OEG gelöst. Die Phospholipid- und die Hämagglutininlösungen wurden gemischt und 1 min. lang beschallt. Diese Lösung wurde dann 1 Stunde lang bei 100.000 g zentrifugiert, und der Überstand unter sterilen Bedingungen filtriert (0,22 μm). Virosome wurden dann durch Detergensentfernung unter Verwendung von BioRad SM BioBeads (BioRad, Glattbrugg, Schweiz) gebildet.
Beispiel 4
Dieses Beispiel zeigt wie das Vernetzen der Peptide an IRIVs durchgeführt wird. Phosphatidylethanolamin PE wurde in Methanol gelöst und 0,1% (Vol./Vol.) Triethylamin wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde dann mit dem heterobifunktionalen Vernetzungsmittel N-γ-Maleimidobutyryloxysuccimidester (GMBS) (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), (Verhältnis PE : GMBS = 5 : 1), das vorher in Dimethylsulfoxid (DMSO) (20 μl) gelöst worden war, gemischt. Nach der 30 Minuten langen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel 1 Std. lang unter Vakuum in einer Speedvac-Zentrifuge verdampft. Das GMBS-PE wurde dann in 1 ml PBS, was 100 mM Octaethylenglycol (OEG) (Fluka Chemicals, Schweiz) enthält (PBS-OEG), gelöst und das Peptid wurde hinzugefügt (Verhältnis PE-GMBS : Peptid = 5 : 1). Bei diesem Schritt reagiert das Phosphatidylethanolamin-GMBS mit einem freien Cystein des Peptids. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wurde freies Cystein hinzugefügt, um freies GMBS (Verhältnis Cystein : GMBS = 10 : 1) zu inaktivieren.
32 mg Ei-Phosphatidylcholin (PC), (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Deutschland) und 6 mg Phosphatidylethanolamin (PE), (R. Berchtold, Biochemisches Labor, Bern, Schweiz) wurden in 2,66 ml PBS, was 100 mM Octaethylenglycol (OEG) (Fluka Chemicals, Schweiz) enthält (PBS-OEG), gelöst. Das Influenza A/Singapur-Hämagglutinin wurde wie vorher beschrieben gereinigt. Eine Lösung, die 4 mg Hämagglutinin enthält, wurde 30 min. lang bei 100.000 g zentrifugiert, und der Niederschlag wurde in 1,33 ml PBS-OEG gelöst. Das Peptid-GMBS-PE Konstrukt und Phospholipide wurden zu der Hämagglutininlösung hinzugefügt, gut gemischt und 1 min. lang beschallt. Dieses Gemisch wurde dann 1 Std. lang bei at 100.000 g zentrifugiert und der Überstand steril filtriert (0,22 mm). Virosome wurden dann durch Detergensentfernung unter Verwendung von BioRad SM BioBeads gebildet.
Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt die Einkapselung von Peptiden in IRIVs. 32 mg Ei-Phosphatidylcholin (PC), (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Deutschland) und 6 mg Phosphatidylethanolamin (PE), (R. Berchtold, Biochemisches Labor, Bern, Schweiz) wurden in 2,66 ml PBS, was 100 mM Octaethylenglycol (OEG) (Fluka Chemicals, Schweiz) enthält (PBS-OEG), gelöst. Das Influenza A/Singapur-Hämagglutinin wurde wie vorher beschrieben gereinigt (J. J. Skehel, G. C. Schild, The polypeptid composition of Influenza A viruses. Virology 44 (1971), 396 – 408).
Eine Lösung, die 4 mg Hämagglutinin enthält, wurde 30 min. bei 100.000 g zentrifugiert, und der Niederschlag wurde in 1,33 ml PBS-OEG gelöst. Das lipophile Peptid und Phospholipide wurden zu der Hämagglutininlösung hinzugefügt, gut gemischt und 1 min. lang beschallt. Dieses Gemisch wurde dann 1 Std. lang bei at 100.000 g zentrifugiert und der Überstand steril filtriert (0,22 mm). Virosome wurden dann durch Detergensentfernung unter Verwendung von BioRad SM BioBeads gebildet.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt die Immunogenitätsstudien der Peptid-beladenen Virosome in Mäusen und ELISA-Analysen. BALB/c Mäuse wurden intramuskulär mit 0,1 ml des kommerziellen Influenza Ganzvirus-Impfstoffes Inflexal Berna^TM (Berns Biotech, Bern, Schweiz) präimmunisiert. Mindestens drei Wochen später wurden sie mit Pepidbeladenen IRIVs in Intervallen von mindestens zwei Wochen immunisiert. Blut wurde vor jeder Immunisierung und zwei Wochen nach der letzten Injektion gesammelt.
ELISA-Analysen mit Peptid-PE Konjugaten werden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (Moreno, R., et al. 2001, Chembiochem 2: 838 – 843). Kurz: Polysorp^TM Platten (Nunc, Fisher Scientific, Wohlen, Schweiz) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl einer 10 mg/ml Lösung von AMA-1 Peptid-PE Konjugat in PBS (pH 7,2) beschichtet. Die Vertiefungen wurden dann 30 min. lang bei 37°C mit 5% Milchpulver in PBS blockiert, gefolgt von drei Waschungen mit PBS, was 0,05% Tween-20 enthält. Platten wurden dann 2 Std. lang bei 37°C mit seriellen Verdünnungen von anti- Mimetikum-Mausseren oder anti-AMA49-L1 monoklonalen Antikörpern (MAk) in PBS, was 0,05% Tween-20 und 0,5% Milchpulver enthält, inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege anti-Maus γ-schwere Ketten-Antikörpern (Sigma, St. Louis, Mo.) inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde die Phosphatase-Substratlösung (1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat [Sigma] in einer pH 9,8 Pufferlösung, die 10% [Vol/Vol.] Diethanolamin und 0,02% MgCl₂ enthält) hinzugefügt, und die Platten in Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert bis die farbmetrische Reaktion ausreichend vorangekommen war. Die optische Dichte wurde auf einem Titertek Multiscan MCC/340 Lesegerät (Labsystems, Helsinki, Finnland) bei 405 nm gemessen. In Konkurrenzassays wurden Peptid-PE beschichtete Platten 2 Std. lang mit MAk in Gegenwart steigender Konzentrationen von Konkurrenzpeptiden inkubiert. Isotypen der anti-AMA49 MAk wurden durch das Nachweisen von MAk, die an Peptid-PE beschichtete Platten banden, mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegenantikörpern, spezifisch für Maus Ig γ₁-, γ_2a-, γ₃-, k- oder λ-Ketten (Southern Biotechnology, Birmingham, Ala.), bestimmt.
Beispiel 7
Dieses Beispiel zeigt wie die indirekten Immunfluoreszenz-Assays (IFA) durchgeführt wurden. Objektträger mit vielen Vertiefungen für die Immunfluoreszenzmikroskopie (Flow Laborstories, Baar, Schweiz) wurden 30 min. lang bei Raumtemperatur mit 0,01% poly-L-Lysin (Sigma) vorbehandelt, und fünfmal mit RPMI Salz-Basalmedium (Gibco BRL, Basel, Schweiz) gewaschen. Erythrozyten aus in vitro Kulturen von P. falciparum Stamm K1 (Matile, H. und J. Pink, 1990, Plasmodium falciparum malaria parasite cultures and their use in immunology, S. 221 – 234. In: I. Lefkovits und P. Benvenuto (Hersg.) Immunological methods. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) mit einer Parasitämie zwischen 5–10% wurden zweimal in RPMI gewaschen, in RPMI und zwei Volumen einer Lösung, die 4% Formaldehyd und 0,1% Triton X-100 enthält, resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurden 30 μl zu jeder Vertiefung hinzugefügt, 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert und fünfmal mit PBS gewaschen. Die Vertiefungen wurden 30 min. lang bei Raumtemperatur mit Blockierlösung, die 1% fettsäurefreies Rinderserumalbumin (BSA) in PBS enthält, inkubiert. Immunfärbung wurde durch 1 Std. langes Inkubieren der Vertiefungen mit 25 μl eines geeigneten Antikörpers oder einer Serumverdünnung in Blockierlösung bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer durchgeführt. Nach fünf Waschungen mit Blockierlösung wurde 25 μl von 5 μg/ml Cyaninfarbstoff(Cy3)-konjugiertem affinitätsreinem F(ab')2-Fragment einer Ziege anti-Maus Ig γ schwere Ketten-Antikörpern (Jackson Immuno Research Laborstories, West Grove, Pa.), verdünnt in Blockierlösung, die 0,01 mg/ml Hoechst Farbstoff No. 33256 (Sigma) enthält, zu den Vertiefungen hinzugefügt, und 1 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Vertiefungen fünfmal gewaschen, mit Einbettungsmitteln eingebettet (90% [Vol./Vol.] Glycerin, das 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0 und 2 mg/ml o-Phenylendiamin enthält) und mit einem Deckgläschen bedeckt. Antikörperbindung und DNA-Färbung wurden durch Fluoreszenzmikroskopie auf einem Leitz Dialux 20 Fluoreszenzmikroskop festgestellt und mit einem Leica DC200 Digitalkamerasystem dokumentiert.
Beispiel 8
Dieses Beispiel demonstriert wie die SDS-PAGE- und Immunoblot-Assays durchgeführt wurden. Parasitenlysate wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Matile, H. und J. Pink, 1990, Plasmodium falciparum malaria parasite cultures and their use in immunology, S. 221 – 234. In: I. Lefkovits und P. Benvenuto (Hersg.) Immunological methods. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) durch Saponinlyse von P. falciparum K1 infizierten Erythrozyten hergestellt. Kurz dargestellt: kultivierte Parasiten wurden dreimal mit serumfreiem RPMI-Medium gewaschen. Pelletierte infizierte rote Blutkörperchen wurden durch Mischen mit einem großen Volumen (eingestellt auf 5% Hämatokrit) 0,015% (Gew./Vol.) Saponin in 150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat (pH 7,0) lysiert, und 20 min. lang auf Eis inkubiert. schließlich wurden die pelletierten Parasiten in 3 Volumen SSC-Puffer (0,15 M NaCl plus 0,015 M Natriumcitrat) resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
50 μl des Parasitenlysats wurde in einem gleichen Volumen 2 × Ladepuffer (1,7 ml 0,5M Tris-HCl, pH 6,8, 2 ml Glycerin, 4,5 ml 10% SDS, 1 ml β-Mercaptoethanol, 0,8 ml Bromophenolblau (0,3% Gew./Vol.)) aufgelöst, und 10 min. lang auf 95°C erhitzt. Proteine wurden auf einem 10% SDS PAGE Minigel getrennt. Getrennte Proteine wurden elektrophoretisch auf einen Nitrocellulosefilter (Protran^® Nitrocellulose, BA85, Schleicher & Schuell) durch Feuchtblotten übertragen. Blots wurden über Nacht bei 4°C mit PBS, das 5% Milchpulver und 0,1% Tween-20 enthält, blockiert. Der Filter wurde in Streifen geschnitten und 1 Std. lang mit geeigneten Verdünnungen der Immunseren oder MAk in Blockierpuffer bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimal 10 minütigem Waschen der Streifen mit Blockierpuffer wurden sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit Meerrettich Peroxidase konjugierten Ziege anti-Maus lgG-Antikörpern (Bio-Rad, Reinach, Schweiz) inkubiert. Schließlich wurden die Blots nach dem Waschen, wie vorstehend, durch Zugabe von ECL Substrat (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) und Exposition mit Kodak Biomax light scientific imaging Filmen gemäß den Herstellerempfehlungen entwickelt.
Beispiel 9
Dieses Beispiel demonstriert die Erzeugung von Hybridomen und Produktion monoklonaler Antikörper (MAk). Hybridome wurden aus Milzzellen von Mäusen drei Tage nach einer Auffrischimmunisierung mit AMA49-C1 beladenen IRIVs unter Verwendung von PAI Maus-Myelomzellen als Fusionspartner erzeugt. Hybride wurden in HAT-Medium selektioniert und Zellen, die anti-AMA49-L1 MAk sezernieren wurden durch ELISA identifiziert. Für eine MAk-Produktion in großem Maßstab wurden Hybridomzelllinien in 1 I Spinnerflaschen kultiviert, und MAk wurden durch Protein G Affinitätschromatographie gereinigt. Gereinigte MAk wurden gegen PBS dialysiert, aliquotiert und bei –80°C aufbewahrt.
Beispiel 10
Dieses Beispiel zeigt wie die Kultur von Parasiten und Assays zur Wachstumshemmung in vitro durchgeführt wurden. P. falciparum Stamm K1 wurde wie beschrieben kultiviert (Matile, H. und J. Pink, 1990, Plasmodium falciparum malaria parasite cultures and their use in immunology, S. 221 – 234. In: I. Lefkovits und P. Benvenuto (Hersg.) Immunological methods. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.). Das Kulturmedium wurde mit 0,5% AlbuMAX (Gibco, Paisley, Schottland) als Ersatz für Humanserum ergänzt (Dorn, A., et al. 1995, Nature 374: 269 – 271). Synchronisation von Kulturen wurde, wie beschrieben, durch Sorbitolbehandlung erreicht (Lambros, C. und J. P. Vanderberg, 1979, J. Parasitol. 65: 418 – 420). Erythrozyten der Serogruppe A⁺ für Passagen wurden vom Schweizer Roten Kreuz (Basel, Schweiz) erhalten.
Für Assays zur Wachstumshemmung in vitro wurden, um eine Parasitämie von 0,5% zu geben, synchronisierte späte Trophozoiten oder Schizonten mit frischen roten Blutkörperchen verdünnt und mit gereinigten MAk gemischt. Der Endhämatokritwert in Kulturen wurde auf 0,5% eingestellt. Jede Kultur wurde in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden sechsfach vorbereitet. Nach 96 Std. wurden die Platten 5 min. lang bei 180 g zentrifugiert und Kulturüberstände wurden verworfen. Pelletierte Erythrozyten wurden in 200 μl PBS resuspendiert, ergänzt mit 15 μg/ml Hydroethidin fluoreszierendem Vitalfarbstoff (Polysciences Inc., Warrington, Pa.), und 30 min. lang bei 37°C inkubiert. Die Erythrozyten wurden zweimal mit PBS gewaschen, in 400 μl PBS resuspendiert, und in einem FACSscan Durchflusszytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) mit dem Computerprogramm CELLQuest 3.2.1 fl analysiert. Die Hydroethidinemission wurde im FL2-Kanal durch logarithmische Verstärkung nachgewiesen, und die Erythrozyten wurden auf Grund ihrer vorwärts und seitwärts Scatters erfasst. Insgesamt wurden 30.000 Zellen pro Probe analysiert. Die prozentuale Hemmung wurde aus dem geometrischen Parasitämien-Mittelwert des sechsfachen Test- und Kontrollvertiefungen als 100 × (Kontrolle – Test)/Kontrolle errechnet. Statistische Signifikanz wurde durch einen zweisseitigen t-Test errechnet. Konfidenzbereiche (Cl; P < 95%) wurden durch antilogging der auf der log-Skala errechneten Konfidenzgrenzen errechnet.
Beispiel 11
Dieses Beispiel zeigt die Konstruktion Peptid-beladener Virosome und die Erzeugung von gegen das Wachstum des Parasiten reaktiven Antikörpern. Eine Sequenz, die 45 Aminosäurereste der Schleife I in Domäne III von AMA-1 umfasst, Y⁴⁴⁶KDEIKKEIERESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLKC⁴⁹⁰ (SEQ ID NO: 5), mit einer an den C-Terminus angefügten GGC-Sequenz und einem zusätzlichen Glycinrest am N-Terminus wurde durch standardisierte Festphasen-Peptidchemie synthetisiert. Um das Peptid auf die Virosome zu laden, wurde es durch einen Succinatlinker am N-Terminus an ein Regioisomer von Phosphatidylethanolamin (PE) konjugiert, und das PE-Peptidkonjugat, bezeichnet AMA49-L1 (1A), wurde in IRIV als Antigenabgabesystem aufgenommen. Nach einer Präimmunisierung mit dem Influenzaimpfstoff Inflexal wurden Mäuse mit AMA49-L1 beladenem IRIV immunisiert. Alle vier immunisierten Mäuse stellten Antikörper her, die im ELISA mit AMA49-L1 reagierten (2).
Die ausgelösten Antikörger waren im IFA (3) kreuzreaktiv mit Blutstadium-Parasiten, was ein für AMA-1 kennzeichnendes gepunktetes Färbungsmuster ergibt (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294; Miller, L. H. und S. L. Hoffman. 1998, Nat. Med. 4: 520 – 524). Wechselwirkung der Maus anti-AMA49-L1 Seren mit Parasiten exprimiertem AMA-1 wurde durch Westernblot-Analyse unter Verwendung von Gesamtproteinlysaten der P. falciparum Blutstadium-Parasiten (4) bestätigt. Die anti-AMA49-L1 Antiseren färbten primär Proteine einer apparenten Molekülmasse von ungefähr 83 und 66 kDa, wobei es sich um die Größe des gesamten AMA-1 bzw. ihres prozessierten Hauptproduktes handelt (Hodder, A. N., et al. 2001, Infect. Immun. 69: 3286 – 3294; Narum, D. L. und A. W. Thomas. 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 67: 59 - 68). Einige der anti-AMA49-L1 Antiseren färbten eine zusätzliche Proteinbande, welche dem vorher beschriebenen 46 kDa Prozessierungsprodukt von AMA-1 (Howell, S. A. et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 31311 – 31320), das denselben N-Terminus wie das 66 kDa-Fragment besitzt, entsprechen kann.
Beispiel 12
Dieses Beispiel zeigt die Induktion der kreuzreaktiven Antikörper unter Verwendung der cyclisierten Peptide der vorliegenden Erfindung und die Identifizierung der Epitope, die durch die Antikörper erkannt werden. Um zu untersuchen ob die Cycliserung der Peptide über Cysteinreste nahe an den C- und N-Termini die Ausbeute an Parasiten bindenden Antikörpern verbessert, wurden Mäuse mit IRIV, beladen mit einer cyclisierten (AMA49-C1) und einer linearen (AMA49-12) Version von AMA49-L1 (1A), immunisiert. Während AMA49-L1 freie Thiole enthielt, wurden im Fall von AMA49-12 beide Thiolgruppen der endständigen Cysteinreste durch Alkylierung blockiert. Mit den zwei Konstrukten erhaltene IFA-Titer unterschieden sich nicht signifikant und waren vergleichbar mit jenen mit AMA49-L1 erhaltenen (Ergebnisse nicht gezeigt).
Für eine detaillierte Analyse der humoralen Immunantwort wurden AMA49-C1 spezifische Maus B-Zellhybridome erzeugt. Alle erhaltenen 11 Hybridomklone sezernierten IgG:κ (10 MAk waren IgG1, MAk DV3 war IgG2a), das im ELISA sowohl mit dem cyclischen als auch dem linearen Peptid mit vergleichbarer Wirksamkeit reagierte. Alle diese 11 MAk färbten im IFA Blutstadium-Parasiten (Ergebnisse nicht gezeigt). ELISA-Konkurrenzexperimente mit einer Gruppe von 4 überlappenden linearen Peptiden welche die Sequenzen AMA^446–462, AMA^452–472, AMA^462–482, AMA^472–490 1A) umfassen, wurden für die Epitopkartierung verwendet und unterschieden zwischen vier Gruppen von Antikörpern (Tabelle 2).
Tabelle 2: Reaktivität von anti-AMA49C1 mMAk
Antigenbindung von MAk DV2 und DV6 wurde durch AMA^446–462 blockiert, MAk DV7 wurde sowohl durch AMA^446–462 als auch AMA^452–472 blockiert, MAk DV5 und DV8 wurden durch AMA^452–472 blockiert und MAk DV1, DV3, DV4, DV9, DV10 und DV11 wurden durch AMA^462–482 blockiert. Keiner der Antikörper wurde durch die C-terminale Sequenz AMA^472–490 blockiert. Eine Bank aus 35 cyclischen Peptiden, wobei jedes 12 Reste enthält, welche die AMA^444–489-Sequenz überstreichen, jedes mit einer Verschiebung von einer Aminosäure, wurde für eine detailliertere Epitopkartierung (siehe 1 und Tabelle 2) verwendet. Diese Peptide wurden auf konformative Weise durch Cyclisierung durch Verbindung mit einer Matrize aus einem Dipeptid, umfassend ein D-Prolin und ein mit Succ-PE konjugiertes L-4-Aminoprolin, eingeschränkt. In einem ELISA banden die beiden durch AMA^446–462 gehemmten MAk DV2 und DV6 an keines der kurzen cyclischen Peptide. MAk DV7 band an die hintereinander folgenden cyclischen Peptide, umfassend die Reste 450 – 461 bis 455 – 466, welche die Sequenz E⁴⁵⁵RESKRI⁴⁶¹ (SEQ ID NO: 3) miteinander teilen, die auch in der Überiappung der zwei hemmenden langen Peptide AMA^446–462 und AMA^452–472 vorliegt. MAk DV5 und DV8 banden an die cyclischen Peptide 453 – 464 bis 459 – 470, welche die Sequenz K⁴⁵⁹RIKLN⁴⁶⁴ (SEQ ID NO: 1) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden Peptids AMA^452–472 lokalisiert ist. Zusätzliche Bindung beider MAk an das nicht hintereinander folgende cyclische Peptid 477 – 488, und von MAk DV5 an das cyclische Peptid 474 – 485 (P⁴⁷⁷RIFISDD⁴⁸⁴; (SEQ ID NO: 4)), ist bezeichnend für ein diskontinuierliches Epitop. Alle sechs MAk, die durch AMA^462–482 gehemmt wurden, zeigten Bindung an die hintereinander folgenden Peptide 464 – 475 bis 467 – 478, welche die Sequenz D⁴⁶⁷DEGNKKII⁴⁷⁵ (SEQ ID NO: 2) miteinander teilen, die im Zentrum des hemmenden langen Peptids AMA^462–482 lokalisiert ist. MAk DV1 reagierte zusätzlich mit dem überlappenden Peptid 462 – 473. Im Fall von MAk DV3 war die Reaktivität mit Peptid N⁴⁶⁶DDEGNKKIIAP⁴⁷⁷ (SEQ ID NO: 8) außerordentlich. Mit den anderen vier MAk DV4, DV9, DV10 und DV11 zeigen die Reaktivitätsmuster mit nicht überlappenden Peptiden die Erkennung eines diskontinuierlichen Epitops an. Alle vier MAk zeigten Reaktivität mit dem Peptid 456 – 67, das nur an Position D⁴⁶⁷ mit der mutmaßlichen zentralen Erkennungssequenz D⁴⁶⁷DEGNKKII⁴⁷⁵ (SEQ ID NO: 2) überlappt. Zusätzlich banden MAk DV4 und DV9 auch an die nicht hintereinander folgenden Peptide 474 – 485 und 478 – 489 und an die Peptide 462 – 473, 463 – 474, welche die Sequenz D⁴⁶⁷DEGNKK⁴⁷³ (SEQ ID NO: 9) mit der zentralen Erkennungssequenz teilen.
Mäuse wurden mit IRIV immunisiert, die mit mit PE-Konjugaten von jedem der cyclischen 12-mer Peptide beladen waren, um zu analysieren ob einige von ihnen als Mimotope der Oberflächenschleifen von AMA-1 wirken können und Parasiten-bindende Antikörper auslösen. Während alle 35 Strukturen signifikante Antikörpertiter gegen die entsprechende immunisierende Peptidsequenz selbst auslösten, waren nur gegen AMA^458–469 (welche die zentrale Erkennungseinheit K⁴⁵⁹RIKLN⁴⁶⁴ (SEQ ID NO: 1) der MAk DV5 und DV8 enthält) und AMA^464–475(welche die zentrale Erkennungseinheit D⁴⁶⁷DEGNKKII⁴⁷⁵ (SEQ ID NO: 2) der MAk DV1, DV3, DV4, DV9, DV10 und DV11 enthält) errichtete Seren schwach kreuzreaktiv mit Blutstadium-Parasiten in IFA (Ergebnisse nicht gezeigt).
Beispiel 13
Dieses Beispiel zeigt die das Wachstum des Parasiten hemmende Wirkung der Antikörper, ausgelöst durch die Verwendung der Peptide der Erfindung. Wenn MAk DV5 und DV11, welche die zwei hauptsächlichen Feinspezifitäten repräsentieren, in einem P. falciparum in vitro Wachstums-Inhibitionsassay getestet wurden, zeigten beide eine wesentliche hemmende Aktivität (5). Eine 95,3% Reduktion des Parasitenwachstums wurde nach der Zugabe von MAk DV5 bei einer Endkonzentration von 300 μg/ml (Mittelwert aus fünf unabhängigen sechsfachen Experimenten) beobachtet. MAk DV11 zeigte auch eine signifikante, allerdings geringere Wachstum hemmende Aktivität, während ein Isotyp-übereinstimmender Kontroll-MAk keine Wirkung hatte. Zusammengenommen demonstrieren diese Ergebnisse eindeutig, dass es durch Immunisierung mit AMA-1^446–490 in Kombination mit IRIV als ein humankompatibles Antigenabgabesystem möglich ist, Parasiten-bindende und das Wachstum hemmende Antikörper auszulösen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Immunstimulatorische Zusammensetzung, bestehend aus mindestens einem aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 1, 2, 3 und 4 ausgewählten Peptid.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung aus den Peptiden von SEQ ID NO: 1 und 2 besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung aus mindestens zwei aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 1, 2, 3 und 4 ausgewählten Peptiden besteht.
Immunstimulatorische Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid von SEQ ID NO: 5 oder funktionale Varianten davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid cyclisiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid durch intramolekulare Vernetzung oder eine Matrize cyclisiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid ferner C- und N-terminale Spacer- und vernetzende Reste umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die vernetzenden Reste aus der Gruppe umfassend Cystein-, Bromacetyl- und Maleimidylreste ausgewählt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Spacer-Reste aus der Gruppe umfassend Glycin-, Alanin-, Serin-, Asparagin- und Glutaminreste ausgewählt sind.
Immunstimulatorische Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid von SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 und funktionale Varianten davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid cyclisiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid durch intramolekulare Vernetzung cyclisiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Vernetzung zwischen N- und C-terminal lokalisierten Cysteinresten ist.
Arzneimittel, umfassend die immunstimulatorische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Arzneimittel nach Anspruch 14, ferner ein Adjuvans umfassend.
Arzneimittel nach Anspruch 14 oder 15, ferner ein Abgabevehikel umfassend.
Arzneimittel nach Anspruch 16, wobei das Abgabevehikel aus der Gruppe bestehend aus Virosomen und Liposomen ausgewählt ist.
Arzneimittel nach Anspruch 14 oder 15, wobei die immunstimulatorische Zusammensetzung an der Oberfläche des Abgabevehikels befestigt ist.
Arzneimittel nach Anspruch 14 oder 15, wobei die immunstimulatorische Zusammensetzung durch das Abgabevehikel eingekapselt ist. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels für das Auslösen einer das Wachstum des Malariaparasiten hemmenden Immunantwort in einem Wirt durch das Einbringen des Arzneimittels in den Wirt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels für das Erzeugen von Antikörpern gegen AMA-1 durch das Einbringen des Arzneimittels in einen Wirt.
Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Arzneimittel ferner ein Adjuvans umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Arzneimittel ferner ein Abgabevehikel umfasst. Kit, umfassend die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13.