ES2741730T3

ES2741730T3 - Sistema de administración doble para antígenos heterólogos que comprende una cepa de Listeria recombinante atenuada por la mutación de dal/dat y la deleción de ActA que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de listeriolisina O - antígeno prostático específico

Info

Publication number: ES2741730T3
Application number: ES14190388T
Authority: ES
Inventors: Paulo Maciag; Anu Wallecha; Vafa Shahabi
Original assignee: Advaxis Inc
Current assignee: Ayala Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-05-19
Filing date: 2009-05-19
Publication date: 2020-02-12
Anticipated expiration: 2029-05-19
Also published as: EP2853269A1; EP2288379A2; JP2017195888A; WO2009143167A2; EP2288379A4; US9644212B2; HK1207315A1; JP2015213500A; JP2011529684A; WO2009143167A3; DK2853269T3; EP2853269B1; US20140314708A1; JP5757863B2; US20110129499A1; JP6182172B2

Abstract

Una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión antigénico de listeriolisina O (LLO) - antígeno prostático (PSA), en la que dicha Listeria recombinante es un mutante dal/dat auxotrófico atenuado, que comprende un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofia de dicho mutante auxotrófico y en la que dicha Listeria recombinante comprende además una deleción del gen ActA endógeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de administración doble para antígenos heterólogos que comprende una cepa de Listeria recombinante atenuada por la mutación de dal/dat y la deleción de ActA que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de listeriolisina O - antígeno prostático específico

Campo de la invención

En la presente memoria se proporcionan cepas de Listeria recombinantes que expresan un polipéptido antigénico específico de tumor y, opcionalmente, un polipéptido angiogénico en el que una molécula de ácido nucleico que codifica al menos uno de los polipéptidos se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene PEST, métodos para preparar el mismo y métodos para inducir una respuesta inmune, y para tratar, inhibir o suprimir el cáncer o los tumores, que comprenden administrar el mismo.

Antecedentes de la invención

Una gran cantidad de evidencia preclínica y datos de ensayos clínicos preliminares sugieren que las capacidades antitumorales del sistema inmunitario pueden aprovecharse para tratar a pacientes con cánceres establecidos. La estrategia de vacunas aprovecha los antígenos tumorales asociados con varios tipos de cánceres. La inmunización con vacunas vivas, como los vectores virales o bacterianos que expresan un antígeno asociado a un tumor, es una estrategia para provocar respuestas de CTL fuertes contra tumores.

Listeria monocytogenes (Lm) es una bacteria intracelular facultativa grampositiva que tiene acceso directo al citoplasma de las células presentadoras de antígenos, como macrófagos y células dendríticas, en gran parte debido a la actividad de formación de poros de la listeriolisina-O (LLO). La LLO es secretada por Lm después de que las células la fagociten, y perfora la membrana fagolisosómica, lo que permite que la bacteria escape de la vacuola y entre en el citoplasma. La LLO se presenta de manera muy eficiente al sistema inmunitario a través de moléculas MHC de clase I. Además, los péptidos derivados de Lm también tienen acceso a la presentación de MHC de clase II a través del fagolisosoma. El documento WO 2006/017856 describe cepas de vacuna de Listeria que expresan un antígeno heterólogo y una enzima metabólica, y métodos para su generación.

El cáncer es una enfermedad compleja, y es más probable que los enfoques terapéuticos combinados tengan éxito. No solo las células tumorales, sino también el microambiente que soporta el crecimiento tumoral, deben ser seleccionados como objetivo para maximizar la eficacia terapéutica. La mayoría de las inmunoterapias se centran en antígenos individuales para atacar a las células tumorales y, por lo tanto, han demostrado un éxito limitado contra los cánceres humanos. Un único agente terapéutico capaz de dirigirse a las células tumorales y al microentorno del tumor simultáneamente tendría una ventaja sobre otros enfoques inmunoterapéuticos, especialmente si produce un efecto antitumoral sinérgico.

Compendio de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas, y cualquier otro aspecto o realización expuesta en la presente memoria que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones es solo a título informativo.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, y cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en donde dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno. En otro aspecto, la presente descripción proporciona una vacuna que comprende tal cepa de Listeria recombinante.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para inducir una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto, en donde dicha cepa de Listeria recombinante comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, y cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido antigénico heterólogo o fragmento del mismo, en el que dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para tratar, suprimir o inhibir un cáncer en un sujeto que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante que comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, y cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en donde dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para tratar, suprimir o inhibir al menos un tumor en un sujeto que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante que comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, y cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido o fragmento antigénico heterólogo del mismo, en donde dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en donde dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para producir una cepa de Listeria recombinante que expresa dos antígenos, y el método comprende fusionar genéticamente un primer ácido nucleico que codifica un primer antígeno y un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno; y expresar dichos primer y segundo antígenos en condiciones conducentes a la expresión antigénica en dicha cepa de Listeria recombinante.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para producir una cepa de Listeria recombinante que expresa dos antígenos. En un aspecto, el método comprende fusionar genéticamente un primer ácido nucleico que codifica un primer antígeno en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno; transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que comprende un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno; y expresar dichos primer y segundo antígenos en condiciones conducentes a la expresión antigénica en dicha cepa de Listeria recombinante.

La presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión antigénico de listeriolisina O (LLO) - antígeno prostático específico (PSA), en el que dicha Listeria recombinante es un mutante dal/dat auxotrófico atenuado, que comprende un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofia de dicho mutante auxotrófico, y en el que dicha Listeria recombinante comprende además una deleción del gen ActA endógeno. La presente invención proporciona además:

- una composición inmunogénica que comprende la cepa de Listeria recombinante de la invención, y un adyuvante;

- una cepa de Listeria recombinante de la invención, para uso como un medicamento;

- una cepa de Listeria recombinante de la invención, para uso en la inducción de una respuesta inmune al PSA en un sujeto;

- una cepa de Listeria recombinante de la invención, para uso en un método para prevenir o retrasar la aparición de un cáncer en un sujeto; y

- una cepa de Listeria recombinante de la invención, para uso en el tratamiento, supresión o inhibición de un cáncer o tumor en un sujeto.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. (A) Representación esquemática de la región cromosómica de Lmdd-143 y LmddA-143 después de la integración de klk3 y la deleción de actA; (B) El gen klk3 está integrado en los cromosomas Lmdd y LmddA. La PCR de la preparación de ADN cromosómico de cada construcción utilizando cebadores específicos de klk3 amplifica una banda de 714 pb correspondiente al gen klk3, que carece de la secuencia señal de secreción de la proteína de tipo natural.

Figura 2. (A) Mapa del plásmido pADV134. (B) Las proteínas del sobrenadante de cultivo de LmddA-134 se precipitaron, se separaron en una SDS-PAGE y la proteína LLO-E7 se detectó mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo monoclonal anti-E7. El casete de expresión del antígeno consiste en un promotor hly, un ORF para LLO truncado y un gen de PSA humano (klk3). (C) Mapa del plásmido pADV142. (D) La transferencia de Western mostró la expresión de la proteína de fusión LLO-PSA utilizando anticuerpos anti-PSA y anti-LLO.

FIGURA 3. (A) Estabilidad del plásmido in vitro de LmddA-LLO-PSA si se cultiva con y sin presión selectiva (D-alanina). Las condiciones de la cepa y del cultivo se enumeran primero, y las placas utilizadas para la determinación de UFC se enumeran después. (B) Eliminación de LmddA-LLO-PSA in vivo y evaluación de la pérdida potencial de plásmidos durante este tiempo. Las bacterias se inyectaron i.v. y se aislaron del bazo en el momento indicado. Las UFCs se determinaron en placas de BHI y BHI D-alanina.

FIGURA 4. (A) Aclaramiento in vivo de la cepa LmddA-LLO-PSA después de la administración de 108 UFC en ratones C57BL/6. El número de UFC se determinó colocando en placas BHI/str. El límite de detección de este método fue de 100 UFC. (B) Ensayo de infección celular de células J774 con 10403S, LmddA-LLO-PSA y cepas XFL7.

FIGURA 5. (A) Células específicas de tetrámero de PSA en los esplenocitos de ratones sin tratamiento e inmunizados con LmddA-LLO-PSA en el día 6 después de la dosis de refuerzo. (B) La tinción intracelular de citoquinas para IFN-y en los esplenocitos de ratones sin tratamiento e inmunizados con LmddA-LLO-PSA estimulados con péptido de PSA durante 5 h. Lisis específica de células EL4 pulsadas con péptido de PSA con células T efectoras estimuladas in vitro de ratones inmunizados con LmddA-LLO-PSA y ratones sin tratamiento con una proporción efector/objetivo diferente utilizando un ensayo basado en caspasa (C) y un ensayo basado en europio (D). Número de puntos de IFNy en esplenocitos sin tratamiento e inmunizados obtenidos después de la estimulación durante 24 h en presencia de péptido de PSA o sin péptido (E).

FIGURA 6. La inmunización con LmddA-142 induce la regresión de los tumores Tramp-CI-PSA (TPSA). Los ratones se dejaron sin tratar (n = 8) (A) o se inmunizaron i.p. con LmddA-142 (1x108 UFC/ratón) (n = 8) (B) o Lm-LLO-PSA (n = 8) (C) en días 7, 14 y 21. Los tamaños de los tumores se midieron para cada tumor individual y los valores se expresaron como el diámetro medio en milímetros. Cada línea representa un ratón individual.

FIGURA 7. (A) Análisis de las células T tetrámero de PSA+CD8+ en los bazos y la infiltración de tumores T-PSA-23 de los ratones sin tratar y los ratones inmunizados con una cepa de Lm de control o Lm-ddA-LLO-PSA (LmddA-142). (B) Análisis de las células reguladoras T CD4+, que se definieron como CD25+FoxP3+, en los bazos e infiltradas en tumores T-PSA-23 de los ratones sin tratar y los ratones inmunizados con una cepa de Lm de control o Lm-ddA-LLO-PSA.

FIGURA 8. (A) Representación esquemática de la región cromosómica de Lmdd-143 y LmddA-143 después de la integración de klk3 y la deleción de actA; (B) El gen klk3 está integrado en los cromosomas de Lmdd y LmddA. La PCR de la preparación de ADN cromosómico de cada construcción utilizando cebadores específicos de klk3 amplifica una banda de 760 pb correspondiente al gen klk3.

Figura 9. (A) Lmdd-143 y LmddA-143 secretan la proteína LLO-PSA. Las proteínas de los sobrenadantes de cultivo bacteriano se precipitaron, se separaron en una SDS-PAGE y las proteínas LLO y LLO-PSA se detectaron mediante transferencia de Western utilizando anticuerpos anti-LLO y anti-PSA; (B) La LLO producida por Lmdd-143 y LmddA-143 retiene la actividad hemolítica. Se incubaron glóbulos rojos de ovejas con diluciones en serie de sobrenadantes de cultivos bacterianos, y se midió la actividad hemolítica mediante absorbancia a 590 nm; (C) Lmdd-143 y LmddA-143 crecen dentro de las células J774 de tipo macrófago. Las células J774 se incubaron con bacterias durante 1 hora, seguido de un tratamiento con gentamicina para destruir las bacterias extracelulares. El crecimiento intracelular se midió colocando en placas diluciones en serie de lisados de J774 obtenidos en los momentos indicados. Se utilizó Lm 10403S como control en estos experimentos.

Figura 10. La inmunización de ratones con Lmdd-143 y LmddA-143 induce una respuesta inmune específica de PSA. Se inmunizaron ratones C57BL/6 dos veces a intervalos de 1 semana con 1x108 UFC de Lmdd-143, LmddA-143 o LmddA-142, y 7 días más tarde se recogieron los bazos. Los esplenocitos se estimularon durante 5 horas en presencia de monensina con 1 pM del péptido PSA^65-74. Las células se tiñeron para detectar CD8, CD3, CD62L e IFN-r intracelular, y se analizaron en un citómetro FACS Calibur.

Figura 11. Se diseñaron tres vacunas basadas en Lm que expresaban distintos fragmentos de HMW-MAA según la posición de los epítopos de HLA-A2 previamente cartografiados y predichos (A). La cepa Lm-tLLO-HMW-MMA^2160-2258(también denominada Lm-LLO-HMW-MAA-C) secreta una banda de ~ 62 kDa correspondiente a la proteína de fusión tLLO-HMW-MAA21^60-2258(B). A ratones C57BL/6 (n = 15) se les inocularon s.c. células B16F10 y se inmunizaron i.p. en los días 3, 10 y 17 con Lm-tLLO-HMW-MAA^2160-2258(n = 8) o se dejaron sin tratamiento (n = 7). Se inocularon ratones BALB/c (n = 16) s.c. con células RENCA y se inmunizaron i.p. los días 3, 10 y 17 con Lm-HMw-MAA-C (n = 8) o una dosis equivalente de una vacuna de Lm de control. Los ratones inmunizados con Lm-LLO-HMW-MAA-C impidieron el crecimiento de tumores establecidos (C). Se inocularon a ratones FVB/N (n = 13) s.c. células tumorales NT-2 y se inmunizaron i.p. los días 7, 14 y 21 con Lm-HMW-MAA-C (n = 5) o una dosis equivalente de una vacuna de Lm de control (n = 8). La inmunización de los ratones con Lm-LLO-HMW-MAA-C perjudicó significativamente el crecimiento de los tumores sin modificar para expresar HMW-MAA, como B16F10, RENCA y NT-2 (D). Los tamaños de los tumores se midieron para cada tumor individual, y los valores se expresaron como el diámetro medio en milímetros ± EEM. *, P < 0,05, prueba de Mann-Whitney.

Figura 12. La inmunización con Lm-HMW-MAA-C estimula la infiltración del tumor con las células T CD8+ y disminuye el número de pericitos en los vasos sanguíneos. (A) Se extrajeron los tumores NT-2 y se cortaron para determinar la inmunofluorescencia. Los grupos de tinción están numerados (1-3), y cada tinción se indica a la derecha. Los tejidos secuenciales se tiñeron con el marcador general de vasos anti-CD31 o el anticuerpo anti-NG2 para el homólogo de ratón de HMW-MAA, AN2, junto con anti-CD8a para los posibles TlLs. El grupo 3 muestra controles de isotipo para los anticuerpos anteriores y la tinción DAPI utilizada como marcador nuclear. Se analizaron un total de 5 tumores, y se muestra una única imagen representativa de cada grupo. Las células CD8+ alrededor de los vasos sanguíneos están indicadas por flechas. (B) Los cortes secuenciales se tiñeron para detectar pericitos utilizando los anticuerpos anti-NG2 y anti-actina de células musculares lisas alfa (a-SMA). La doble tinción/colocalización de estos dos anticuerpos (amarillo en la imagen mixta) es indicativa de la tinción de pericitos (parte superior). La colocalización de pericitos se cuantificó utilizando el programa informático Image Pro y el número de objetos colocalizados se muestra en el gráfico (parte inferior). Se analizaron un total de 3 tumores, y se muestra una única imagen representativa de cada grupo. *, P < 0,05, prueba de Mann-Whitney. El gráfico muestra la media ± EEM.

Descripción detallada de la invención

Un aspecto descrito en la presente memoria se refiere a una cepa de Listeria recombinante que expresa un polipéptido antigénico en el que el ácido nucleico que codifica el polipéptido se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno, que, en un aspecto, es LLO. En un aspecto, la Listeria expresa dos polipéptidos, uno de los cuales es un antígeno asociado a un tumor, y uno de los cuales es un polipéptido angiogénico.

Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, y cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en donde la primera molécula de ácido nucleico se integra en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen LLO endógeno, y en donde la segunda molécula de ácido nucleico está presente en un vector de expresión episomal dentro de la cepa de Listeria recombinante. En un aspecto, la primera molécula de ácido nucleico codifica una proteína KLK3 y la segunda molécula de ácido nucleico codifica un péptido HMW-MAA, y, en un aspecto, está en un marco de lectura abierto con un ácido nucleico que codifica una l Lo no hemolítica, ActA truncado, o secuencia PEST.

Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, y cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido antigénico heterólogo.

En un aspecto, la primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con una secuencia de ácido nucleico endógena que codifica un polipéptido que comprende una secuencia PEST. En un aspecto, la primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con una secuencia de ácido nucleico que codifica LLO. En otro aspecto, la primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con una secuencia de ácido nucleico que codifica ActA.

En un aspecto, la primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con una secuencia de ácido nucleico endógena que codifica LLO. En un aspecto, la integración no elimina la funcionalidad de LLO. En otro aspecto, la integración no elimina la funcionalidad de ActA. En un aspecto, la funcionalidad de LLO o Acta es su funcionalidad nativa. En un aspecto, la funcionalidad de LLO es permitir que el organismo escape del fagolisosoma, mientras que en otro aspecto, la funcionalidad de LLO es mejorar la inmunogenicidad de un polipéptido con el que está fusionada. En un aspecto, una Listeria recombinante descrita en la presente memoria retiene la función de LLO, que en un aspecto es una función hemolítica y en otro aspecto es una función antigénica. En la técnica se conocen otras funciones de LLO, como los métodos y ensayos para evaluar la funcionalidad de LLO. En un aspecto, una Listeria recombinante descrita en la presente memoria tiene una virulencia de tipo natural, mientras que en otro aspecto, una Listeria recombinante descrita en la presente memoria tiene una virulencia atenuada. En otro aspecto, una Listeria recombinante de la presente invención es avirulenta. En un aspecto, una Listeria recombinante de la presente invención es suficientemente virulenta para escapar del fagolisosoma y entrar en el citosol. La Listeria recombinante de la presente invención expresa una proteína antígeno-LLO fusionada. Así, en un aspecto, la integración de la primera molécula de ácido nucleico en el genoma de Listeria no altera la estructura del gen que contiene PEST endógeno, mientras que en otro aspecto, no altera la función del gen que contiene PEST endógeno. En un aspecto, la integración de la primera molécula de ácido nucleico en el genoma de Listeria no altera la capacidad de dicha Listeria de escapar del fagolisosoma.

En otro aspecto, la segunda molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria con dicha primera molécula de ácido nucleico en un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST. Por lo tanto, en un aspecto, la primera y segunda moléculas de ácido nucleico se integran en el marco de lectura con una secuencia de ácido nucleico que codifica LLO, mientras que en otro aspecto, se integran en el marco de lectura con una secuencia de ácido nucleico que codifica ActA. En otro aspecto, la segunda molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia PEST en un sitio que es distinto del sitio de integración de la primera molécula de ácido nucleico. En un aspecto, la primera molécula de ácido nucleico se integra en el marco de lectura con una secuencia de ácido nucleico que codifica LLO, mientras que la segunda molécula de ácido nucleico se integra en el marco de lectura con una secuencia de ácido nucleico que codifica ActA, mientras que en otro aspecto, la primera molécula de ácido nucleico se integra en el marco de lectura con una secuencia de ácido nucleico que codifica ActA, mientras que la segunda molécula de ácido nucleico se integra en el marco de lectura con una secuencia de ácido nucleico que codifica LLO.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en donde dicha primera molécula de ácido nucleico se integra en el genoma de Listeria de forma que el primer polipéptido antigénico heterólogo y un polipéptido que contiene PEST endógeno se expresan como una proteína de fusión. En un aspecto, el primer polipéptido antigénico heterólogo y el polipéptido que contiene PEST endógeno se traducen en un único marco de lectura abierto, mientras que en otro aspecto, el primer polipéptido antigénico heterólogo y el polipéptido que contiene PEST endógeno se fusionan después de traducirse por separado.

En un aspecto, el genoma de Listeria comprende una deleción del gen ActA endógeno, que en un aspecto es un factor de virulencia. En un aspecto, dicha deleción proporciona una cepa de Listeria más atenuada y, por lo tanto, más segura para uso humano. De acuerdo con este aspecto, el polipéptido antigénico está integrado en el marco de lectura con LLO en el cromosoma de Listeria. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico integrada se integra en el locus ActA. En otro aspecto, el ácido nucleico cromosómico que codifica ActA se reemplaza por una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno.

En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico integrada se integra en el cromosoma de Listeria.

En un aspecto, dicha primera molécula de ácido nucleico es un vector diseñado para la recombinación homóloga específica de sitio en el genoma de Listeria. En otro aspecto, la construcción o gen heterólogo se integra en el cromosoma de Listeria utilizando la recombinación homóloga.

Las técnicas para la recombinación homóloga son muy conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Frankel, FR, Hegde, S, Lieberman, J e Y Paterson. Induction of a cell-mediated immune response to HIV gag using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector. J. Immunol. 155: 4766 - 4774. 1995; Mata, M, Yao, Z, Zubair, A, Syres, K y Y Paterson, Evaluation of a recombinant Listeria monocytogenes expressing an HIV protein that protects mice against viral challenge. Vaccine 19: 1435-45, 2001; Boyer, JD, Robinson, TM, Maciag, PC, Peng, X, Johnson, RS, Pavlakis, G, Lewis, MG, Shen, A, Siliciano, R, Brown, CR, Weiner, D y Y Paterson. DNA prime Listeria boost induces a cellular immune response to SIV antigens in the Rhesus Macaque model that is capable of limited suppression of SIV239 viral replication. Virology. 333: 88-101, 2005. En otro aspecto, la recombinación homóloga se realiza como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.855.320. En otro aspecto, se usa un plásmido sensible a la temperatura para seleccionar los recombinantes. Cada técnica representa un aspecto distinto de los métodos y composiciones como se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la construcción o gen heterólogo se integra en el cromosoma de Listeria mediante la inserción de transposones. Las técnicas para la inserción de transposones son muy conocidas en la técnica y se describen, entre otros, por Sun et al. (Infection and Immunity 1990, 58: 3770-3778) en la construcción de DP-L967. La mutagénesis por transposones tiene la ventaja, en un aspecto, de que se puede formar un mutante de inserción genómica estable. En otro aspecto, se desconoce la posición en el genoma donde el gen exógeno se ha insertado por la mutagénesis por transposones.

En otro aspecto, la construcción o gen heterólogo se integra en el cromosoma de Listeria utilizando sitios de integración de fagos (Lauer P, Chow MY et al, Construction, characterization, and use of two LM site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002; 184 (15): 4177-86). En otro aspecto, se utiliza un gen de integrasa y un sitio de unión de un bacteriófago (por ejemplo, listeriófago U153 o PSA) para insertar el gen heterólogo en el sitio de unión correspondiente, que puede ser cualquier sitio apropiado en el genoma (por ejemplo, comK o el extremo 3' del gen arg tRNA). En otro aspecto, los profagos endógenos se eliminan del sitio de unión utilizado antes de la integración de la construcción o gen heterólogo. En otro aspecto, este método da como resultado integrantes de copia única. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En otro aspecto, la primera secuencia de ácido nucleico de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria está unida de forma operable a una secuencia promotora/reguladora. En otro aspecto, la segunda secuencia de ácido nucleico está unida de forma operable a una secuencia promotora/reguladora. En otro aspecto, cada una de las secuencias de ácido nucleico está unida de forma operable a una secuencia promotora/reguladora. En un aspecto, la secuencia promotora/reguladora está presente en un plásmido episomal que comprende dicha secuencia de ácido nucleico. En un aspecto, la secuencia promotora/reguladora de Listeria endógena controla la expresión de una secuencia de ácido nucleico de los métodos y composiciones descritos en la presente memoria. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, una secuencia de ácido nucleico como se proporciona en la presente memoria está unida de forma operable a un promotor, secuencia reguladora o combinación de los mismos que controla la expresión del péptido codificado en la cepa de Listeria. El promotor, las secuencias reguladoras y sus combinaciones útiles para controlar la expresión constitutiva de un gen son muy conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, los promotores de Listeria PhlyA, PActA, hly, ActA y p60, el promotor bac de Streptococcus, el promotor de Streptomyces griseus sgiA y el promotor phaZ de B. thuringiensis. En otro aspecto, la expresión inducible y específica de tejido del ácido nucleico que codifica un péptido como se proporciona en la presente memoria se logra colocando el ácido nucleico que codifica el péptido bajo control de una secuencia reguladora/promotora inducible o específica de tejido. Los ejemplos de secuencias reguladoras, promotoras y combinaciones de las mismas específicas de tejido que son útiles para este propósito incluyen, pero sin limitación, el promotor inducible por LTR de MMTV y el potenciador/promotor tardío de SV40. En otro aspecto, se utiliza un promotor que se induce en respuesta a agentes inductores tales como metales, glucocorticoides y similares. Por lo tanto, se apreciará que la invención incluye el uso de cualquier promotor o secuencia reguladora, que sea conocida o desconocida, y que sea capaz de controlar la expresión de la proteína deseada unida de forma operable a la misma. En un aspecto, una secuencia reguladora es un promotor, mientras que en otro aspecto, una secuencia reguladora es un potenciador, mientras que en otro aspecto, una secuencia reguladora es un supresor, mientras que en otro aspecto, una secuencia reguladora es un represor, mientras que en otro aspecto, una secuencia reguladora es un silenciador.

En un aspecto, la construcción de ácido nucleico utilizada para la integración en el genoma de Listeria contiene un sitio de integración. En un aspecto, el sitio es un sitio de integración attPP' de PhSA (fago de Scott A). PhSA es, en otro aspecto, el profago de la cepa ScottA de L. monocytogenes (Loessner, MJ, IB Krause, T. Henle y S. Scherer).

1994. Structural proteins and DNA characteristics of 14 Listeria typing bacteriophages. J. Gen. Virol. 75: 701-710), una cepa de serotipo 4b que se aisló durante una epidemia de listeriosis humana. En otro aspecto, el sitio es cualquier otro sitio de integración conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la construcción de ácido nucleico contiene un gen de integrasa. En otro aspecto, el gen de la integrasa es un gen de la integrasa PhSA. En otro aspecto, el gen de la integrasa es cualquier otro gen de la integrasa conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, la construcción de ácido nucleico es un plásmido. En otro aspecto, la construcción de ácido nucleico es un plásmido lanzadera. En otro aspecto, la construcción de ácido nucleico es un vector de integración. En otro aspecto, la construcción de ácido nucleico es un vector de integración específico de sitio. En otro aspecto, la construcción de ácido nucleico es cualquier otro tipo de construcción de ácido nucleico conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

El vector de integración de los métodos y las composiciones que se proporciona en la presente memoria es, en otro aspecto, un vector de fago. En otro aspecto, el vector de integración es un vector de integración específico de sitio. En otro aspecto, el vector comprende además un sitio attPP'. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el vector de integración es un vector U153. En otro aspecto, el vector de integración es un vector A118. En otro aspecto, el vector de integración es un vector PhSA.

En otro aspecto, el vector es un vector A511 (por ejemplo, n° de acceso de GenBank: X91069). En otro aspecto, el vector es un vector A006. En otro aspecto, el vector es un vector B545. En otro aspecto, el vector es un vector B053. En otro aspecto, el vector es un vector A020. En otro aspecto, el vector es un vector A500 (por ejemplo, n° de acceso de GenBank: X85009). En otro aspecto, el vector es un vector B051. En otro aspecto, el vector es un vector B052. En otro aspecto, el vector es un vector B054. En otro aspecto, el vector es un vector B055. En otro aspecto, el vector es un vector B056. En otro aspecto, el vector es un vector B101. En otro aspecto, el vector es un vector B110. En otro aspecto, el vector es un vector Bill. En otro aspecto, el vector es un vector A153. En otro aspecto, el vector es un vector D441. En otro aspecto, el vector es un vector A538. En otro aspecto, el vector es un vector B653. En otro aspecto, el vector es un vector A513. En otro aspecto, el vector es un vector A507. En otro aspecto, el vector es un vector A502. En otro aspecto, el vector es un vector A505. En otro aspecto, el vector es un vector A519. En otro aspecto, el vector es un vector B604. En otro aspecto, el vector es un vector C703. En otro aspecto, el vector es un vector B025. En otro aspecto, el vector es un vector A528. En otro aspecto, el vector es un vector B024. En otro aspecto, el vector es un vector B012. En otro aspecto, el vector es un vector B035. En otro aspecto, el vector es un vector C707.

En otro aspecto, el vector es un vector A005. En otro aspecto, el vector es un vector A620. En otro aspecto, el vector es un vector A640. En otro aspecto, el vector es un vector B021. En otro aspecto, el vector es un vector HSO47. En otro aspecto, el vector es un vector H10G. En otro aspecto, el vector es un vector H8/73. En otro aspecto, el vector es un vector H19. En otro aspecto, el vector es un vector H21. En otro aspecto, el vector es un vector H43. En otro aspecto, el vector es un vector H46. En otro aspecto, el vector es un vector H107. En otro aspecto, el vector es un vector H108. En otro aspecto, el vector es un vector H110. En otro aspecto, el vector es un vector H163/84. En otro aspecto, el vector es un vector H312. En otro aspecto, el vector es un vector H340. En otro aspecto, el vector es un vector H387. En otro aspecto, el vector es un vector H391/73. En otro aspecto, el vector es un vector H684/74. En otro aspecto, el vector es un vector H924A. En otro aspecto, el vector es un vector fMLUP5. En otro aspecto, el vector es un vector syn (= P35). En otro aspecto, el vector es un vector 00241. En otro aspecto, el vector es un vector 00611. En otro aspecto, el vector es un vector 02971A. En otro aspecto, el vector es un vector 02971C. En otro aspecto, el vector es un vector 5/476. En otro aspecto, el vector es un vector 5/911. En otro aspecto, el vector es un vector 5/939. En otro aspecto, el vector es un vector 5/11302. En otro aspecto, el vector es un vector 5/11605. En otro aspecto, el vector es un vector 5/11704. En otro aspecto, el vector es un vector 184. En otro aspecto, el vector es un vector 575. En otro aspecto, el vector es un vector 633. En otro aspecto, el vector es un vector 699/694. En otro aspecto, el vector es un vector 744. En otro aspecto, el vector es un vector 900. En otro aspecto, el vector es un vector 1090. En otro aspecto, el vector es un vector 1317. En otro aspecto, el vector es un vector 1444. En otro aspecto, el vector es un vector 1652. En otro aspecto, el vector es un vector 1806. En otro aspecto, el vector es un vector 1807. En otro aspecto, el vector es un vector 1921/959. En otro aspecto, el vector es un vector 1921/11367. En otro aspecto, el vector es un vector 1921/11500. En otro aspecto, el vector es un vector 1921/11566. En otro aspecto, el vector es un vector 1921/12460. En otro aspecto, el vector es un vector 1921/12582. En otro aspecto, el vector es un vector 1967. En otro aspecto, el vector es un vector 2389. En otro aspecto, el vector es un vector 2425. En otro aspecto, el vector es un vector 2671. En otro aspecto, el vector es un vector 2685. En otro aspecto, el vector es un vector 3274. En otro aspecto, el vector es un vector 3550. En otro aspecto, el vector es un vector 3551. En otro aspecto, el vector es un vector 3552. En otro aspecto, el vector es un vector 4276. En otro aspecto, el vector es un vector 4277. En otro aspecto, el vector es un vector 4292. En otro aspecto, el vector es un vector 4477. En otro aspecto, el vector es un vector 5337. En otro aspecto, el vector es un vector 5348/11363. En otro aspecto, el vector es un vector 5348/11646. En otro aspecto, el vector es un vector 5348/12430. En otro aspecto, el vector es un vector 5348/12434. En otro aspecto, el vector es un vector 10072. En otro aspecto, el vector es un vector 11355C. En otro aspecto, el vector es un vector 11711A. En otro aspecto, el vector es un vector 12029. En otro aspecto, el vector es un vector 12981. En otro aspecto, el vector es un vector 13441. En otro aspecto, el vector es un vector 90666. En otro aspecto, el vector es un vector 90816. En otro aspecto, el vector es un vector 93253. En otro aspecto, el vector es un vector 907515. En otro aspecto, el vector es un vector 910716. En otro aspecto, el vector es un vector NN-Listeria. En otro aspecto, el vector es un vector O1761. En otro aspecto, el vector es un vector 4211. En otro aspecto, el vector es un vector 4286.

En otro aspecto, el vector de integración es cualquier otro vector de integración específico de sitio conocido en la técnica que sea capaz de infectar Listeria. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria. En otro aspecto, el vector de integración o plásmido de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria no confiere resistencia a antibióticos a la cepa de vacuna de Listeria. En otro aspecto, el vector de integración o plásmido no contiene un gen de resistencia a antibióticos. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido recombinante. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos un 85% de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante como se proporciona en la presente memoria. En otro aspecto, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos un 90% de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante como se proporciona en la presente memoria. En otro aspecto, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos un 95% de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante como se proporciona en la presente memoria. En otro aspecto, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos un 97% de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante como se proporciona en la presente memoria. En otro aspecto, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos un 99% de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante como se proporciona en la presente memoria.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para producir una cepa de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos. En otro aspecto, la Listeria recombinante expresa al menos 3 o más antígenos heterólogos distintos. En otro aspecto, la Listeria recombinante expresa 4 o más antígenos heterólogos distintos. En otro aspecto, la Listeria recombinante expresa 5 o más antígenos heterólogos distintos.

En otro aspecto, el método comprende fusionar genéticamente un primer ácido nucleico que codifica un primer antígeno en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, el método comprende fusionar genéticamente al menos 2 ácidos nucleicos que codifican dos antígenos heterólogos distintos en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, el método comprende fusionar genéticamente al menos 3 ácidos nucleicos que codifican dos antígenos heterólogos distintos en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, el método comprende fusionar genéticamente al menos 4 ácidos nucleicos que codifican dos antígenos heterólogos distintos en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, el método comprende fusionar genéticamente al menos 5 ácidos nucleicos que codifican dos antígenos heterólogos distintos en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST.

En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que comprende un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno. En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que comprende al menos 2 ácidos nucleicos que codifican al menos dos antígenos heterólogos distintos. En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que comprende al menos 3 ácidos nucleicos que codifican al menos tres antígenos heterólogos distintos. En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que comprende al menos 4 ácidos nucleicos que codifican al menos cuatro antígenos heterólogos distintos. En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que comprende al menos 5 ácidos nucleicos que codifican al menos cinco antígenos heterólogos distintos.

En otro aspecto más, el método comprende expresar dichos primer y segundo antígenos en condiciones conducentes a la expresión antigénica, que se conocen en la técnica, en dicha cepa de Listeria recombinante.

En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con al menos 1 vector de expresión episomal que comprende los antígenos heterólogos como se describieron anteriormente en la presente memoria. En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con al menos 2 vectores de expresión episomal que comprenden los antígenos heterólogos como se describieron anteriormente en la presente memoria. En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con al menos 3 vectores de expresión episomal que comprenden los antígenos heterólogos como se describieron anteriormente en la presente memoria. En otro aspecto, el método comprende transformar dicha Listeria recombinante con al menos 4 vectores de expresión episomal que comprenden los antígenos heterólogos como se describieron anteriormente en la presente memoria.

En otro aspecto, la cepa de Listeria recombinante puede expresar más de dos antígenos, algunos de los cuales se expresan a partir de una o más moléculas de ácido nucleico integradas en el cromosoma de Listeria, y algunos de los cuales se expresan a través de uno o más vectores de expresión episomal presentes en la cepa de Listeria recombinante. Por lo tanto, como se describió anteriormente en la presente memoria, en un aspecto, una cepa de Listeria recombinante como se proporciona en la presente memoria comprende dos o más vectores de expresión episomal, cada uno de los cuales expresa un polipéptido antigénico distinto, en un aspecto. En un aspecto, uno o más de los antígenos se expresan como una proteína de fusión con LLO, que, en un aspecto, es LLO no hemolítica y, en otro aspecto, LLO truncada. En un aspecto, una cepa de Listeria recombinante como se proporciona en la presente memoria selecciona como objetivo los tumores provocando respuestas inmunes a dos antígenos distintos, que se expresan mediante dos tipos de células diferentes, que en un aspecto son un antígeno de superficie celular y un polipéptido anti-angiogénico, mientras que, en otro aspecto, una cepa de Listeria recombinante como se proporciona en la presente memoria selecciona como objetivo los tumores provocando una respuesta inmune a dos antígenos diferentes expresados por el mismo tipo de célula, que en un aspecto son el antígeno prostático específico (PSA) y el antígeno prostático específico de membrana (PSMA), que en un aspecto es FOLH1. En otro aspecto, una cepa de Listeria recombinante, como se proporciona en la presente memoria, se dirige a los tumores provocando una respuesta inmune a dos antígenos diferentes como se describe a continuación o como se conoce en la técnica.

En un aspecto, un primer antígeno de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria se dirige contra un antígeno de superficie celular específico o un objetivo tumoral, y un segundo antígeno se dirige contra un antígeno angiogénico o un microentorno tumoral. En otro aspecto, el primer y segundo antígenos de las composiciones y métodos del presente documento son polipéptidos expresados por células tumorales, o, en otro aspecto, polipéptidos expresados en un microentorno tumoral. En otro aspecto, el primer antígeno de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria es un polipéptido expresado por un tumor y el segundo antígeno de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria es un receptor objetivo, la NO sintetasa, Arg-1 u otra enzima conocida en la técnica.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para producir una cepa de Listeria recombinante que expresa dos antígenos, y el método comprende, en un aspecto, fusionar genéticamente un primer ácido nucleico que codifica un primer antígeno y un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un polipéptido nativo que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, la expresión de dichos primer y segundo antígenos se produce en condiciones conducentes a la expresión antigénica en dicha cepa de Listeria recombinante.

En un aspecto, la cepa de Listeria recombinante de la composición y los métodos que se proporcionan en la presente memoria comprende un vector de expresión episomal que comprende la segunda molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo. En otro aspecto, la segunda molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo está presente en dicho vector de expresión episomal en un marco de lectura abierto con un polipéptido que comprende una secuencia PEST.

En otro aspecto, un vector de expresión episomal de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende un antígeno fusionado en el marco de lectura a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia AA de tipo PEST. En un aspecto, el antígeno es HMW-MAA, y en otro aspecto, un fragmento de HMW-MAA. En otro aspecto, la secuencia AA de tipo PEST es KENSISS-MAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (SEQ ID N°: 1). En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es KENSISSMAP-PASPPASPK (SEQ ID N°: 2). En otro aspecto, la fusión de un antígeno a cualquier secuencia de LLO que incluya una de las secuencias AA de tipo PEST enumeradas en la presente memoria puede mejorar la inmunidad mediada por células contra HMW-MAA.

En otro aspecto, la secuencia AA de tipo PEST es una secuencia de tipo PEST de una proteína ActA de Listeria. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es KTEEQPSEVNTGPR (SEQ ID N°: 3), KASVTDTSEGDLD SSMQSADESTPQPLK (SEQ ID N°: 4), KNEEVNASDFPPPPTDEELR (SEQ ID N°: 5), o RGGIPTSEEFSSLNSG DFTDDENSETTEEEIDR (SEQ ID N°: 6). En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es de la citolisina de Listeria seeligeri, codificada por el gen lso. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es RSEVTISPAETPESPPATP (SEQ ID N°: 7). En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es de la proteína estreptolisina O de Streptococcus sp. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es de estreptolisina O de Streptococcus pyogenes, por ejemplo, KQNTASTETTTTNEQPK (SEQ ID N°: 8) en AA 35-51. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es de estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, por ejemplo, KQNTANTETTTTNEQPK (SEQ ID N°: 9) en AA 38-54. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID N°s: 3-9. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID N°s: 1-9. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es otra secuencia AA de tipo PEST derivada de un organismo procariótico.

La identificación de secuencias de tipo PEST es muy conocida en la técnica, y se describe, por ejemplo, en Rogers S et al (Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 1986; 234 (4774): 364-8) y Rechsteiner M et al. (PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 1996; 21 (7): 267 71). "Secuencia de tipo PEST" se refiere, en otro aspecto, a una región rica en prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T). En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST está flanqueada por una o más agrupaciones que contienen varios aminoácidos cargados positivamente. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST media en la degradación intracelular rápida de las proteínas que la contienen. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST se ajusta a un algoritmo descrito en Rogers et al. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST se ajusta a un algoritmo descrito en Rechsteiner et al. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST contiene uno o más sitios de fosforilación interna, y la fosforilación en estos sitios precede a la degradación de proteínas. En un aspecto, una secuencia a la que se hace referencia en la presente memoria como una secuencia de tipo PEST es una secuencia PEST.

En un aspecto, las secuencias de tipo PEST de organismos procarióticos se identifican de acuerdo con métodos como los descritos, por ejemplo, por Rechsteiner y Rogers (1996, Trends Biochem. Sci. 21: 267-271) para LM y en Rogers S et al. (Science 1986; 234 (4774): 364-8). Alternativamente, las secuencias AA de tipo PEST de otros organismos procarióticos también se pueden identificar en base a este método. Otros organismos procarióticos en los que se esperarían las secuencias AA de tipo PEST incluyen, pero sin limitación, otras especies de Listeria. En un aspecto, la secuencia de tipo PEST se ajusta a un algoritmo descrito en Rogers et al. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST se ajusta a un algoritmo descrito en Rechsteiner et al. En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST se identifica mediante el programa PEST-find.

En otro aspecto, la identificación de los motivos PEST se logra mediante un escaneo inicial en busca de aminoácidos R, H y K cargados positivamente dentro de la secuencia de la proteína especificada. Se cuentan todos los aminoácidos entre los flancos cargados positivamente, y solo se consideran adicionalmente los motivos que contienen una cantidad de aminoácidos igual o superior al parámetro del tamaño de la ventana. En otro aspecto, una secuencia de tipo PEST debe contener al menos 1 P, 1 D o E, y al menos 1 S o T.

En otro aspecto, la calidad de un motivo PEST se refina por medio de un parámetro de puntuación basado en el enriquecimiento local en aminoácidos críticos, así como la hidrofobicidad de los motivos. El enriquecimiento en D, E, P, S y T se expresa en porcentaje de masas (p/p) y se corrige para 1 equivalente de D o E, 1 de P y 1 de S o T. En otro aspecto, el cálculo de la hidrofobicidad sigue en principio el método de J. Kyte y RF Doolittle (Kyte, J y Dootlittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 (1982). Para cálculos simplificados, los índices de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle, que originalmente oscilaban entre -4,5 para la arginina y 4,5 para la isoleucina, se convierten en enteros positivos, utilizando la siguiente transformación lineal, que produjo valores de 0 para la arginina a 90 para la isoleucina.

Índice de hidrofobicidad = 10 * Índice de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle 45

En otro aspecto, la hidrofobicidad de un motivo PEST potencial se calcula como la suma sobre los productos del porcentaje molar y el índice de hidrofobicidad para cada especie de aminoácido. La puntuación PEST deseada se obtiene como una combinación del término de enriquecimiento local y el término de hidrofobicidad expresados por la siguiente ecuación:

Puntuación PEST = 0,55 * DEPST - 0,5 * índice de hidrofobicidad.

En otro aspecto, "secuencia PEST", "secuencia de tipo PEST" o "péptido de secuencia de tipo PEST" se refiere a un péptido que tiene una puntuación de al menos 5, utilizando el algoritmo anterior. En otro aspecto, el término se refiere a un péptido que tiene una puntuación de al menos 6. En otro aspecto, el péptido tiene una puntuación de al menos 7. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 8. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 9. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 10. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 11. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 12. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 13. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 14. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 15. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 16. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 17. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 18. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 19. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 20. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 21. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 22. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 22. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 24. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 24. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 25. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 26. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 27. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 28. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 29. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 30. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 32. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 35. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 38. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 40. En otro aspecto, la puntuación es de al menos 45. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST se identifica utilizando cualquier otro método o algoritmo conocido en la técnica, por ejemplo, el CaSPredictor (Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. junio de 2005; 21 Supl. 1: i169-76). En otro aspecto, se utiliza el siguiente método:

Se calcula un índice PEST para cada tramo de longitud apropiada (por ejemplo, un tramo de 30-35 aminoácidos) asignando un valor de 1 a los aminoácidos Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn o Gln. El valor del coeficiente (CV) para cada uno de los residuos PEST es 1 y para cada uno de los otros aminoácidos (no PEST) es 0.

Cada método para identificar una secuencia de tipo PEST representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En otro aspecto, la secuencia de tipo PEST es cualquier otra secuencia de tipo PEST conocida en la técnica. Cada secuencia de tipo PEST y su tipo representan un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona proteínas de fusión, que en un aspecto se expresan mediante Listeria. En un aspecto, tales proteínas de fusión se fusionan con una secuencia de tipo PEST que, en un aspecto, se refiere a la fusión con un fragmento de proteína que comprende una secuencia de tipo PEST. En otro aspecto, el término incluye casos en los que el fragmento de proteína comprende una secuencia circundante distinta de la secuencia de tipo PEST. En otro aspecto, el fragmento de proteína consiste en la secuencia de tipo PEST. Por lo tanto, en otro aspecto, "fusión" se refiere a dos péptidos o fragmentos de proteínas, ya sea unidos entre sí en sus respectivos extremos o incrustados uno dentro del otro. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, una cepa de Listeria recombinante de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria comprende un polipéptido LLO de longitud completa, que en un aspecto, es hemolítico.

En otro aspecto, la cepa de Listeria recombinante comprende un polipéptido LLO no hemolítico. En otro aspecto, el polipéptido es un fragmento de LLO. En otro aspecto, el oligopéptido es una proteína LLO completa. En otro aspecto, el polipéptido es cualquier proteína LLO o fragmento de la misma conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, se utiliza un fragmento de proteína LLO en las composiciones y métodos como se proporciona en la presente memoria. En un aspecto, una proteína LLO truncada está codificada por el vector de expresión episomal como se proporciona en la presente memoria que expresa un polipéptido, es decir, en un aspecto, un antígeno, en otro aspecto, un factor angiogénico o, en otro aspecto, ambos antígenos y factor angiogénico. En otro aspecto, el fragmento LLO es un fragmento N-terminal.

En otro aspecto, el fragmento de LLO N-terminal tiene la secuencia: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAF NKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSIN QNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVER WNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRP SRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKA VIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGG YVAQFNISWDEVNYD (SEQ ID N°: 10). En otro aspecto, una secuencia de AA de LLO de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 10. En otro aspecto, la secuencia de AA de l Lo es un homólogo de la SEQ ID N°: 10. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una variante de la SEQ ID N°: 10. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es un fragmento de la SEQ ID N°: 10. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una isoforma de la SEQ ID N°: 10. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el fragmento de LLO tiene la secuencia: mkkimlvfitlilvslpiaqqteakdasafnkensissvappasppaspktpiek khadeidkyiqgldynknnvlvyhgdavtnvpprkgykdgneyiwekkkksinqnnadiqwnaissltypgalvkanselvenqpdvlpvkrdsltlsidlpgmtn qdnkivvknatksnvnnavntlverwnekyaqaysnvsakidyddemaysesqliakfgtafkavnnslnvnfgaisegkmqeevisfkqiyynvnvneptrpsrff gkavtkeqlqalgvnaenppayissvaygrqvylklstnshstkvkaafdaavsgksvsgdveltniiknssfkaviyggsakdevqiidgnlgdlrdilkkgatfnretp gvpiayttnflkdnelaviknnseyiettskaytd (SEQ ID N°: 11). En otro aspecto, una secuencia de AA de LLO de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 11. En otro aspecto, la secuencia de AA de l Lo es un homólogo de la SEQ ID N°: 11. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una variante de la SEQ ID N°: 11. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es un fragmento de la SEQ ID N°: 11. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una isoforma de la SEQ ID N°: 11. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

La proteína LLO utilizada en las composiciones y métodos que se proporcionan en la presente memoria tiene, en otro aspecto, la secuencia: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIE KKHADEID KYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVEN QPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLI AKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSV AYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATF NRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSE NNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE (n° de acceso de GenBank P13128; SEQ ID N°: 12; la secuencia de ácido nucleico se expone en el n° de acceso de GenBank X15127). Los primeros 25 AA de la proproteína correspondientes a esta secuencia son la secuencia señal y se escinden de LLO cuando es secretada por la bacteria. Por lo tanto, en este aspecto, la proteína LLO activa de longitud completa tiene una longitud de 504 residuos. En otro aspecto, el fragmento de LLO anterior se usa como fuente del fragmento de LLO incorporado en una vacuna como se proporciona en la presente memoria. En otro aspecto, una secuencia de AA de LLO de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 12. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es un homólogo de la SEQ ID N°: 12. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una variante de la SEQ ID N°: 12. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es un fragmento de la SEQ ID N°: 12. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una isoforma de la SEQ ID N°: 12. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

La proteína LLO utilizada en las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria tiene, en otro aspecto, la secuencia: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIE KKHADEIDK YIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQ PDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIA KFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVA YGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFN RETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD (SEQ ID N°: 13). En otro aspecto, una secuencia de AA de LLO de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 13. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es un homólogo de la SEQ ID N°: 13. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una variante de la SEQ ID N°: 13. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es un fragmento de la SEQ ID N°: 13. En otro aspecto, la secuencia de AA de LLO es una isoforma de la SEQ ID N°: 13. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del polipéptido LLO de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria proviene de la cepa 10403S de Listeria monocytogenes, como se establece en el número de acceso de Genbank: ZP_01942330, EBA21833, o está codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en el número de acceso de Genbank: NZ_AARZ01000015 o AARZ01000015.1. En otro aspecto, la secuencia de LLO para uso en las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria es de Listeria monocytogenes, que en un aspecto es la cepa 4b F2365 (en un aspecto, el número de acceso de Genbank: YP_012823), la cepa EGD-e (en un aspecto, el número de acceso de Genbank: NP_463733), o cualquier otra cepa de Listeria monocytogenes conocida en la técnica.

En otro aspecto, la secuencia de LLO para uso en las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria es de la bacteria HTCC2170 de Flavobacteriales (en un aspecto, el número de acceso de Genbank: ZP_01106747 o EAR01433; en un aspecto, codificado por el número de acceso de Genbank: NZ_AAOC01000003). En un aspecto, las proteínas que son homólogas a LLO en otras especies, como la alveolisina, que, en un aspecto, se encuentra en Paenibacillus alvei (en un aspecto, el número de acceso de Genbank: P23564 o AAA22224; en un aspecto, codificado por el número de acceso de Genbank : M62709) se pueden usar en las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria. Otras proteínas homólogas de este tipo son conocidas en la técnica.

Cada proteína LLO y el fragmento de LLO representan un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, se pueden usar homólogos de LLO de otras especies, incluidas lisinas conocidas, o fragmentos de las mismas, para crear una proteína de fusión de LLO con un antígeno de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria, que, en un aspecto, es HMW-MAA, y en otro aspecto es un fragmento de HMW-MAA.

En otro aspecto, el fragmento de LLO de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria es un dominio de tipo PEST. En otro aspecto, un fragmento de LLO que comprende una secuencia PEST se utiliza como parte de una composición o en los métodos que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el fragmento de LLO no contiene el dominio de activación en el extremo carboxiterminal. En otro aspecto, el fragmento de LLO no incluye la cisteína 484. En otro aspecto, el fragmento de LLO es un fragmento no hemolítico. En otro aspecto, el fragmento de LLO se vuelve no hemolítico por deleción o mutación del dominio de activación. En otro aspecto, el fragmento de LLO se vuelve no hemolítico por deleción o mutación de la cisteína 484. En otro aspecto, una secuencia de LLO se convierte en no hemolítica por deleción o mutación en otra ubicación.

En otro aspecto, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los primeros 441 AA de la proteína LLO. En otro aspecto, el fragmento de LLO comprende aproximadamente los primeros 400-441 AA de la proteína LLO de longitud completa de 529 AA. En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los AA 1-441 de una proteína LLO descrita en la presente memoria. En otro aspecto, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los primeros 420 AA de LLO. En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los AA 1-420 de una proteína LLO descrita en la presente memoria. En otro aspecto, el fragmento de LLO consta de aproximadamente los AA 20-442 de LLO. En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los AA 20-442 de una proteína LLO descrita en la presente memoria. En otro aspecto, cualquier LLO sin el dominio de activación que comprende cisteína 484, y en particular sin cisteína 484, es adecuada para los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 400 AA de una proteína LLO. En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 300 AA de una proteína LLO. En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 200 AA de una proteína LLO. En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 100 AA de una proteína LLO. En otro aspecto, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 50 AA de una proteína LLO, que, en un aspecto, comprende una o más secuencias de tipo PEST.

En otro aspecto, el fragmento LLO contiene residuos de una proteína LLO homóloga que corresponde a uno de los rangos de AA anteriores. Los números de residuos no necesitan, en otro aspecto, corresponder exactamente con los números de residuos enumerados anteriormente; por ejemplo, si la proteína LLO homóloga tiene una inserción o deleción, en relación con una proteína LLO utilizada en la presente memoria.

En otro aspecto, una cepa de Listeria recombinante de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende una molécula de ácido nucleico integrada de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con una secuencia de ActA endógena. En otro aspecto, un vector de expresión episomal como se proporciona en la presente memoria comprende una proteína de fusión que comprende un antígeno fusionado a un ActA o un ActA truncado. En un aspecto, el antígeno es HMW-MAA, mientras que en otro aspecto, es un fragmento inmunogénico de HMW-MAA.

En un aspecto, un antígeno de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria se fusiona con una proteína ActA, que, en un aspecto, es un fragmento N-terminal de una proteína ActA, que, en un aspecto, comprende o consiste en los primeros 390 AA de ActA, en otro aspecto, los primeros 418 AA de ActA, en otro aspecto, los primeros 50 AA de ActA, en otro aspecto, los primeros 100 AA de ActA, que, en un aspecto, comprenden una secuencia de tipo PEST tal como se proporciona en la SEQ ID N°: 2. En otro aspecto, un fragmento N-terminal de una proteína ActA utilizada en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende o consiste en los primeros 150 AA de ActA, en otro aspecto, aproximadamente los primeros 200 AA de ActA, que en un aspecto comprenden 2 secuencias de tipo PEST como se describe en la presente memoria. En otro aspecto, un fragmento N-terminal de una proteína ActA utilizada en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende o consiste en los primeros 250 AA de ActA, en otro aspecto, los primeros 300 AA de ActA. En otro aspecto, el fragmento de ActA contiene los residuos de una proteína ActA homóloga que corresponde a uno de los rangos de AA anteriores. Los números de los residuos no necesitan, en otro aspecto, corresponder exactamente a los números de los residuos enumerados anteriormente; por ejemplo, si la proteína ActA homóloga tiene una inserción o deleción, en relación con una proteína ActA utilizada en la presente memoria, entonces los números de los residuos pueden ajustarse en consecuencia, como sería rutinario para un técnico experto utilizando herramientas de alineación de secuencias como NCBI BLAST, que son muy conocidas en la técnica.

En otro aspecto, la porción N-terminal de la proteína ActA comprende 1, 2, 3 o 4 secuencias de tipo PEST, que en un aspecto son las secuencias de tipo PEST mencionadas específicamente en la presente memoria, o sus homólogos, como se describe en la presente memoria, u otras secuencias de tipo PEST como pueden determinarse usando los métodos y algoritmos descritos en la presente memoria o usando métodos alternativos conocidos en la técnica.

Un fragmento N-terminal de una proteína ActA utilizada en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria tiene, en otro aspecto, la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 14:

MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTN KADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTY PDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIV DKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLL GFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP

(SEQ ID N°: 14). En otro aspecto, el fragmento de ActA comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 14. En otro aspecto, el fragmento de ActA es cualquier otro fragmento de ActA conocido en la técnica. En otro aspecto, la proteína ActA es un homólogo de la SEQ ID N°: 14. En otro aspecto, la proteína ActA es una variante de la SEQ ID N°: 14. En otro aspecto, la proteína ActA es una isoforma de la SEQ ID N°: 14. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de la SEQ ID N°: 14. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de un homólogo de la SEQ ID N°: 14. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de una variante de la SEQ ID N°: 14. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de una isoforma de la SEQ ID N°: 14. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En otro aspecto, el nucleótido recombinante que codifica un fragmento de una proteína ActA comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 15: atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcg acagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgc acgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaa aaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcg tcatecaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcateggatagtgagcttgaaagccttacttatecggataaacca acaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaaccttt aaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagc gattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaa gacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgc tttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccggg aaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacaga agaagagttgaacgggagaggcggtagacca (SEQ ID N°: 15). En otro aspecto, el nucleótido recombinante tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 15. En otro aspecto, el nucleótido recombinante comprende cualquier otra secuencia que codifica un fragmento de una proteína ActA. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

Un fragmento N-terminal de una proteína ActA utilizado en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria tiene, en otro aspecto, la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 16: MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTN KADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLT YPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIV DKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLL GFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPLIPTEEELNGRGGRP

(SEQ ID N°: 16), que en un aspecto es los primeros 390 AA para ActA de Listeria monocytogenes, cepa 10403S. En otro aspecto, el fragmento ActA comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 16. En otro aspecto, el fragmento de ActA es cualquier otro fragmento de ActA conocido en la técnica. En otro aspecto, la proteína ActA es un homólogo de la SEQ ID N°: 16. En otro aspecto, la proteína ActA es una variante de la SEQ ID N°: 16. En otro aspecto, la proteína ActA es una isoforma de la SEQ ID N°: 16. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de la SEQ ID N°: 16. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de un homólogo de la SEQ ID N°: 16. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de una variante de la SEQ ID N°: 16. En otro aspecto, la proteína ActA es un fragmento de una isoforma de la SEQ ID N°: 16. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el nucleótido recombinante que codifica un fragmento de una proteína ActA comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 17: atgcgtgcgatgatggtagttttcattactgccaactgcattacgattaaccccgacataatatttgcagc gacagatagcgaagattccagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcagccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaact gcacgtgaagtaagttcacgtgatattgaggaactagaaaaatcgaataaagtgaaaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagcaaaagcag agaaaggtccgaataacaataataacaacggtgagcaaacaggaaatgtggctataaatgaagaggcttcaggagtcgaccgaccaactctgcaagtggagcg tcgtcatccaggtctgtcatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaagaaaagccatagcgtcgtcggatagtgagcttgaaagccttacttatccagataaac caacaaaagcaaataagagaaaagtggcgaaagagtcagttgtggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagacgagtctacaccacaac ctttaaaagcaaatcaaaaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaa agcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagt taagacttgctttgccagagacaccgatgcttctcggttttaatgctcctactccatcggaaccgagctcattcgaatttccgccgccacctacggatgaagagttaagac ttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcattcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaattatgcg ggaaacagcaccttcgctagattctagttttacaagcggggatttagctagtttgagaagtgctattaatcgccatagcgaaaatttctctgatttcccactaatcccaaca gaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca (SEQ ID N°: 17), que, en un aspecto, son los primeros 1170 nucleótidos que codifican ActA en la cepa 10403S de Listeria monocytogenes. En otro aspecto, el nucleótido recombinante tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 17. En otro aspecto, el nucleótido recombinante comprende cualquier otra secuencia que codifica un fragmento de una proteína ActA. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el fragmento de ActA es otro fragmento de ActA conocido en la técnica, que, en un aspecto, es cualquier fragmento que comprende una secuencia PEST. Por lo tanto, en un aspecto, el fragmento de ActA son los aminoácidos 1-100 de la secuencia de ActA. En otro aspecto, el fragmento de ActA son los aminoácidos 1-200 de la secuencia de ActA. En otro aspecto, el fragmento de ActA son los aminoácidos 200-300 de la secuencia de ActA. En otro aspecto, el fragmento de ActA son los aminoácidos 300-400 de la secuencia de ActA. En otro aspecto, el fragmento de ActA son los aminoácidos 1-300 de la secuencia de ActA. En otro aspecto, un nucleótido recombinante como se proporciona en la presente memoria comprende cualquier otra secuencia que codifique un fragmento de una proteína ActA. En otro aspecto, el nucleótido recombinante comprende cualquier otra secuencia que codifique una proteína ActA completa. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, la secuencia de ActA para uso en las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria es de Listeria monocytogenes, que en un aspecto es la cepa EGD, la cepa 10403S (número de acceso de Genbank: DQ054585) la cepa NICPBP 54002 (número de acceso de Genbank : EU394959), la cepa S3 (número de acceso de Genbank: EU394960), la cepa NCt C 5348 (número de acceso de Genbank: EU394961), la cepa NICPBP 54006 (número de acceso de Genbank: EU394962), la cepa M7 (número de acceso de Genbank: EU394963), la cepa S19 (número de acceso de Genbank: EU394964), o cualquier otra cepa de Listeria monocytogenes que se conoce en la técnica.

En un aspecto, la secuencia de la región actA delecionada en la cepa, LmddAactA es como sigue: gcgccaaatcattggttgattggtgaggatgtctgtgtgcgtgggtcgcgagatgggcgaataagaagcattaaagatcctgacaaatataatcaagcggctcatatg aaagattacgaatcgcttccactcacagaggaaggcgactggggcggagttcattataatagtggtatcccgaataaagcagcctataatactatcactaaacttgga aaagaaaaaacagaacagctttattttcgcgccttaaagtactatttaacgaaaaaatcccagtttaccgatgcgaaaaaagcgcttcaacaagcagcgaaagattt atatggtgaagatgcttctaaaaaagttgctgaagcttgggaagcagttggggttaactgattaacaaatgttagagaaaaattaattctccaagtgatattcttaaaata attcatgaatattttttcttatattagctaattaagaagataactaactgctaatccaatttttaacggaacaaattagtgaaaatgaaggccgaattttccttgttctaaaaag gttgtattagcgtatcacgaggagggagtataagtgggattaaacagatttatgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacgtc gacccatacgacgttaattcttgcaatgttagctattggcgtgttctctttaggggcgtttatcaaaattattcaattaagaaaaaataattaaaaacacagaacgaaaga aaaagtgaggtgaatgatatgaaattcaaaaaggtggttctaggtatgtgcttgatcgcaagtgttctagtctttccggtaacgataaaagcaaatgcctgttgtgatgaa tacttacaaacacccgcagctccgcatgatattgacagcaaattaccacataaacttagttggtccgcggataacccgacaaatactgacgtaaatacgcactattgg ctttttaaacaagcggaaaaaatactagctaaagatgtaaatcatatgcgagctaatttaatgaatgaacttaaaaaattcgataaacaaatagctcaaggaatatatg atgcggatcataaaaatccatattatgatactagtacatttttatctcatttttataatcctgatagagataatacttatttgccgggttttgctaatgcgaaaataacaggagc a aagtatttcaatcaatcggtgactgattaccgagaagggaa (SEQ ID N°: 18). En un aspecto, la región subrayada contiene el elemento de secuencia de actA que está presente en la cepa LmddAactA. En un aspecto, la secuencia en negrita gtcgac representa el sitio de unión de la secuencia NT y CT.

En un aspecto, la cepa de Listeria recombinante de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria comprende una primera o segunda molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) o, en otro aspecto, un fragmento de HMW-MAA.

En un aspecto, HMW-MAA también se conoce como condroitina sulfato proteoglicano de melanoma (MCSP), y en otro aspecto, es una proteína unida a la membrana de 2322 residuos. En un aspecto, e1HMW-MAA se expresa en más del 90% de las lesiones de nevos benignos y melanomas extirpados quirúrgicamente, y también se expresa en el carcinoma de células basales, tumores de origen de la cresta neural (por ejemplo, astrocitomas, gliomas, neuroblastomas y sarcomas), leucemias infantiles y lesiones de carcinomas de mama lobulillares. En otro aspecto, HMW-MAA se expresa a nivel elevado tanto en pericitos activados como en pericitos de la vasculatura angiogénica tumoral que, en otro aspecto, está asociada con la neovascularización in vivo. En otro aspecto, la inmunización de ratones con Listeria recombinante, como se proporciona en la presente memoria, que expresa un fragmento de HMW-MAA (residuos 2160 a 2258), perjudica el crecimiento de tumores no modificados para expresar HMW-MAA (Figura 9D). En otro aspecto, la inmunización de ratones con Listeria recombinante que expresa un fragmento de HMW-MAA (residuos 2160 a 2258) disminuye el número de pericitos en la vasculatura del tumor. En otro aspecto, la inmunización de ratones con Listeria recombinante que expresa un fragmento de HMW-MAA (residuos 2160 a 2258) causa la infiltración de células T CD8+ alrededor de los vasos sanguíneos y en el tumor.

En un aspecto, un homólogo murino de HMW-MAA, conocido como NG2 o AN2, tiene un 80% de homología con HMW-MAA, así como un patrón y función de expresión similares. En otro aspecto, HMW-MAA se expresa a nivel elevado tanto en pericitos activados como en pericitos en la vasculatura angiogénica del tumor. En un aspecto, los pericitos activados están asociados con la neovascularización in vivo. En un aspecto, los pericitos activados están implicados en la angiogénesis. En otro aspecto, la angiogénesis es importante para la supervivencia de los tumores. En otro aspecto, los pericitos de la vasculatura angiogénica tumoral están asociados con la neovascularización in vivo. En otro aspecto, los pericitos activados son células importantes en el desarrollo vascular, la estabilización, la maduración y la remodelación. Por lo tanto, en un aspecto, además de su papel como antígeno asociado a tumor, HMW-MAA también es un objetivo universal potencial para la anti-angiogénesis que utiliza un enfoque inmunoterapéutico. Como se describe en la presente memoria (Ejemplo 8), los resultados obtenidos utilizando una vacuna basada en Lm contra este antígeno han respaldado esta posibilidad.

En otro aspecto, uno de los antígenos de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria se expresa en pericitos activados. En otro aspecto, al menos uno de los antígenos se expresa en pericitos activados.

La proteína HMW-MAA de la que derivan los fragmentos de HMW-MAA que se proporcionan en la presente memoria es, en otro aspecto, una proteína HMW-MAA humana. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es una proteína de ratón. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es una proteína de rata. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es una proteína de primate. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es de cualquier otra especie conocida en la técnica. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es proteoglicano de condroitina sulfato de melanoma (MCSP). En otro aspecto, una proteína AN2 se usa en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria. En otro aspecto, una proteína NG2 se usa en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína HMW-MAA de los métodos y las composiciones como se proporcionan en la presente memoria tiene la secuencia: MQSGRGPPLPAPGLALALTLTMLARLASAASFFGENHLEVPVATALTDIDLQLQFS TSQPEALLLLAAGPADHLLLQLYSGRLQVRLVLGQEELRLQTPAETLLSDSIPHTVVLTVVEGWATLSVDGFLNASSAV PGAPLEVPYGLFVGGTGTLGLPYLRGTSRPLRGCLHAATLNGRSLLRPLTPDVHEGCAEEFSASDDVALGFSGPHSL AAFPAWGTQDEGTLEFTLTTQSRQAPLAFQAGGRRGDFIYVDIFEGHLRAVVEKGQGTVLLHNSVPVADGQPHEVSV HINAHRLEISVDQYPTHTSNRGVLSYLEPRGSLLLGGLDAEASRHLQEHRLGLTPEATNASLLGCMEDLSVNGQRRGL REALLTRNMAAGCRLEEEEYEDDAYGHYEAFSTLAPEAWPAMELPEPCVPEPGLPPVFANFTQLLTISPLVVAEGGT AWLEWRHVQPTLDLMEAELRKSQVLFSVTRGARHGELELDIPGAQARKMFTLLDVVNRKARFIHDGSEDTSDQLVLE VSVTARVPMPSCLRRGQTYLLPIQVNPVNDPPHIIFPHGSLMVILEHTQKPLGPEVFQAYDPDSACEGLTFQVLGTSS GLPVERRDQPGEPATEFSCRELEAGSLVYVHRGGPAQDLTFRVSDGLQASPPATLKVVAIRPAIQIHRSTGLRLAQGS AMPILPANLSVETNAVGQDVSVLFRVTGALQFGELQKQGAGGVEGAEWWATQAFHQRDVEQGRVRYLSTDPQHHA YDTVENLALEVQVGQEILSNLSFPVTIQRATVWMLRLEPLHTQNTQQETLTTAHLEATLEEAGPSPPTFHYEVVQAPR KGNLQLQGTRLSDGQGFTQDDIQAGRVTYGATARASEAVEDTFRFRVTAPPYFSPLYTFPIHIGGDPDAPVLTNVLLV VPEGGEGVLSADHLFVKSLNSASYLYEVMERPRHGRLAWRGTQDKTTMVTSFTNEDLLRGRLVYQHDDSETTEDDI PFVATRQGESSGDMAWEEVRGVFRVAIQPVNDHAPVQTISRIFHVARGGRRLLTTDDVAFSDADSGFADAQLVLTRK DLLFGSIVAVDEPTRPIYRFTQEDLRKRRVLFVHSGADRGWIQLQVSDGQHQATALLEVQASEPYLRVANGSSLVVPQ GGQGTIDTAVLHLDTNLDIRSGDEVHYHVTAGPRWGQLVRAGQPATAFSQQDLLDGAVLYSHNGSLSPRDTMAFSV EAGPVHTDATLQVTIALEGPLAPLKLVRHKKIYVFQGEAAEIRRDQLEAAQEAVPPADIVFSVKSPPSAGYLVMVSRGA LADEPPSLDPVQSFSQEAVDTGRVLYLHSRPEAWSDAFSLDVASGLGAPLEGVLVELEVLPAAIPLEAQNFSVPEGGS LTLAPPLLRVSGPYFPTLLGLSLQVLEPPQHGALQKEDGPQARTLSAFSWRMVEEQLIRYVHDGSETLTDSFVLMANA SEMDRQSHPVAFTVTVLPVNDQPPILTTNTGLQMWEGATAPIPAEALRSTDGDSGSEDLVYTIEQPSNGRVVLRGAP GTEVRSFTQAQLDGGLVLFSHRGTLDGGFRFRLSDGEHTSPGHFFRVTAQKQVLLSLKGSQTLTVCPGSVQPLSSQ TLRASSSAGTDPQLLLYRVVRGPQLGRLFHAQQDSTGEALVNFTQAEVYAGNILYEHEMPPEPFWEAHDTLELQLSS PPARDVAATLAVAVSFEAACPQRPSHLWKNKGLWVPEGQRARITVAALDASNLLASVPSPQRSEHDVLFQVTQFPSR GQLLVSEEPLHAGQPHFLQSQLAAGQLVYAHGGGGTQQDGFHFRAHLQGPAGASVAGPQTSEAFAITVRDVNERPP QPQASVPLRLTRGSRAPISRAQLSVVDPDSAPGEIEYEVQRAPHNGFLSLVGGGLGPVTRFTQADVDSGRLAFVANG SSVAGIFQLSMSDGASPPLPMSLAVDILPSAIEVQLRAPLEVPQALGRSSLSQQQLRVVSDREEPEAAYRLIQGPQYG HLLVGGRPTSAFSQFQIDQGEVVFAFTNFSSSHDHFRVLALARGVNASAVVNVTVRALLHVWAGGPWPQGATLRLD PTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGPRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAG DSLTLELWAQGVPPAVASLDFATEPYNAARPYSVALLSVPEAARTEAGKPESSTPTGEPGPMASSPEPAVAKGGFLS FLEANMFSVIIPMCLVLLLLALILPLLFYLRKRNKTGKHDVQVLTAKPRNGLAGDTETFRKVEPGQAIPLTAVPGQGPPP G GQPDPELLQFCRTPNPALKNGQYWV (SEQ ID N°: 19). En otro aspecto, una secuencia de AA de HMW-MAA de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende el conjunto de secuencias expuestas en la SEQ ID N°: 19. En otro aspecto, la secuencia de AA de HMW-MAA es un homólogo de la SEQ ID N°: 19. En otro aspecto, la secuencia de AA de HMW-MAA es una variante de la SEQ ID N°: 19. En otro aspecto, la secuencia de Aa de HMW-MAA es un fragmento de la SEQ ID N°: 19. En otro aspecto, la secuencia de AA de HMW-MAA es una isoforma de la SEQ ID N°: 19. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína HMW-MAA de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria está codificada por la secuencia: atgcagtccggccgcggccccccacttccagcccccggcctggccttggctttgaccctgac tatgttggccagacttgcatccgcggcttccttcttcggtgagaaccacctggaggtgcctgtggccacggctctgaccgacatagacctgcagctgcagttctccacgt cccagcccgaagccctccttctcctggcagcaggcccagctgaccacctcctgctgcagctctactctggacgcctgcaggtcagacttgttctgggccaggaggag ctgaggctgcagactccagcagagacgctgctgagtgactccatcccccacactgtggtgctgactgtcgtagagggctgggccacgttgtcagtcgatgggtttctga acgcctcctcagcagtcccaggagcccccctagaggtcccctatgggctctttgttgggggcactgggacccttggcctgccctacctgaggggaaccagccgaccc ctgaggggttgcctccatgcagccaccctcaatggccgcagcctcctccggcctctgacccccgatgtgcatgagggctgtgctgaagagttttctgccagtgatgatgt ggccctgggcttctctgggccccactctctggctgccttccctgcctggggcactcaggacgaaggaaccctagagtttacactcaccacacagagccggcaggcac ccttggccttccaggcagggggccggcgtggggacttcatctatgtggacatatttgagggccacctgcgggccgtggtggagaagggccagggtaccgtattgctc cacaacagtgtgcctgtggccgatgggcagccccatgaggtcagtgtccacatcaatgctcaccggctggaaatctccgtggaccagtaccctacgcatacttcgaa ccgaggagtcctcagctacctggagccacggggcagtctccttctcggggggctggatgcagaggcctctcgtcacctccaggaacaccgcctgggcctgacacc agaggccaccaatgcctccctgctgggctgcatggaagacctcagtgtcaatggccagaggcgggggctgcgggaagctttgctgacgcgcaacatggcagccg gctgcaggctggaggaggaggagtatgaggacgatgcctatggacattatgaagctttctccaccctggcccctgaggcttggccagccatggagctgcctgagcc atgcgtgcctgagccagggctgcctcctgtctttgccaatttcacccagctgctgactatcagcccactggtggtggccgaggggggcacagcctggcttgagtggag gcatgtgcagcccacgctggacctgatggaggctgagctgcgcaaatcccaggtgctgttcagcgtgacccgaggggcacgccatggcgagctcgagctggacat cccgggagcccaggcacgaaaaatgttcaccctcctggacgtggtgaaccgcaaggcccgcttcatccacgatggctctgaggacacctccgaccagctggtgct ggaggtgtcggtgacggctcgggtgcccatgccctcatgccttcggaggggccaaacatacctcctgcccatccaggtcaaccctgtcaatgacccaccccacatca tcttcccacatggcagcctcatggtgatcctggaacacacgcagaagccgctggggcctgaggttttccaggcctatgacccggactctgcctgtgagggcctcacctt ccaggtccttggcacctcctctggcctccccgtggagcgccgagaccagcctggggagccggcgaccgagttctcctgccgggagttggaggccggcagcctagt ctatgtccaccgcggtggtcctgcacaggacttgacgttccgggtcagcgatggactgcaggccagccccccggccacgctgaaggtggtggccatccggccggc catacagatccaccgcagcacagggttgcgactggcccaaggctctgccatgcccatcttgcccgccaacctgtcggtggagaccaatgccgtggggcaggatgtg agcgtgctgttccgcgtcactggggccctgcagtttggggagctgcagaagcagggggcaggtggggtggagggtgctgagtggtgggccacacaggcgttccac cagcgggatgtggagcagggccgcgtgaggtacctgagcactgacccacagcaccacgcttacgacaccgtggagaacctggccctggaggtgcaggtgggcc aggagatcctgagcaatctgtccttcccagtgaccatccagagagccactgtgtggatgctgcggctggagccactgcacactcagaacacccagcaggagaccc tcaccacagcccacctggaggccaccctggaggaggcaggcccaagccccccaaccttccattatgaggtggttcaggctcccaggaaaggcaaccttcaacta cagggcacaaggctgtcagatggccagggcttcacccaggatgacatacaggctggccgggtgacctatggggccacagcacgtgcctcagaggcagtcgagg acaccttccgtttccgtgtcacagctccaccatatttctccccactctataccttccccatccacattggtggtgacccagatgcgcctgtcctcaccaatgtcctcctcgtgg tgcctgagggtggtgagggtgtcctctctgctgaccacctctttgtcaagagtctcaacagtgccagctacctctatgaggtcatggagcggccccgccatgggaggttg gcttggcgtgggacacaggacaagaccactatggtgacatccttcaccaatgaagacctgttgcgtggccggctggtctaccagcatgatgactccgagaccacag aagatgatatcccatttgttgctacccgccagggcgagagcagtggtgacatggcctgggaggaggtacggggtgtcttccgagtggccatccagcccgtgaatgac cacgcccctgtgcagaccatcagccggatcttccatgtggcccggggtgggcggcggctgctgactacagacgacgtggccttcagcgatgctgactcgggctttgct gacgcccagctggtgcttacccgcaaggacctcctctttggcagtatcgtggccgtagatgagcccacgcggcccatctaccgcttcacccaggaggacctcagga agaggcgagtactgttcgtgcactcaggggctgaccgtggctggatccagctgcaggtgtccgacgggcaacaccaggccactgcgctgctggaggtgcaggcct cggaaccctacctccgtgtggccaacggctccagccttgtggtccctcaagggggccagggcaccatcgacacggccgtgctccacctggacaccaacctcgaca tccgcagtggggatgaggtccactaccacgtcacagctggccctcgctggggacagctagtccgggctggtcagccagccacagccttctcccagcaggacctgct ggatggggccgttctctatagccacaatggcagcctcagcccccgcgacaccatggccttctccgtggaagcagggccagtgcacacggatgccaccctacaagt gaccattgccctagagggcccactggccccactgaagctggtccggcacaagaagatctacgtcttccagggagaggcagctgagatcagaagggaccagctgg aggcagcccaggaggcagtgccacctgcagacatcgtattctcagtgaagagcccaccgagtgccggctacctggtgatggtgtcgcgtggcgccttggcagatga gccacccagcctggaccctgtgcagagcttctcccaggaggcagtggacacaggcagggtcctgtacctgcactcccgccctgaggcctggagcgatgccttctcg ctggatgtggcctcaggcctgggtgctcccctcgagggcgtccttgtggagctggaggtgctgcccgctgccatcccactagaggcgcaaaacttcagcgtccctgag ggtggcagcctcaccctggcccctccactgctccgtgtctccgggccctacttccccactctcctgggcctcagcctgcaggtgctggagccaccccagcatggagcc ctgcagaaggaggacggacctcaagccaggaccctcagcgccttctcctggagaatggtggaagagcagctgatccgctacgtgcatgacgggagcgagacac tgacagacagttttgtcctgatggctaatgcctccgagatggatcgccagagccatcctgtggccttcactgtcactgtcctgcctgtcaatgaccaaccccccatcctca ctacaaacacaggcctgcagatgtgggagggggccactgcgcccatccctgcggaggctctgaggagcacggacggcgactctgggtctgaggatctggtctaca ccatcgagcagcccagcaacgggcgggtagtgctgcggggggcgccgggcactgaggtgcgcagcttcacgcaggcccagctggacggcgggctcgtgctgtt ctcacacagaggaaccctggatggaggcttccgcttccgcctctctgacggcgagcacacttcccccggacacttcttccgagtgacggcccagaagcaagtgctcc tctcgctgaagggcagccagacactgactgtctgcccagggtccgtccagccactcagcagtcagaccctcagggccagctccagcgcaggcactgacccccag ctcctgctctaccgtgtggtgcggggcccccagctaggccggctgttccacgcccagcaggacagcacaggggaggccctggtgaacttcactcaggcagaggtct acgctgggaatattctgtatgagcatgagatgccccccgagcccttttgggaggcccatgataccctagagctccagctgtcctcgccgcctgcccgggacgtggccg ccacccttgctgtggctgtgtcttttgaggctgcctgtccccagcgccccagccacctctggaagaacaaaggtctctgggtccccgagggccagcgggccaggatc accgtggctgctctggatgcctccaatctcttggccagcgttccatcaccccagcgctcagagcatgatgtgctcttccaggtcacacagttccccagccggggccagc tgttggtgtccgaggagcccctccatgctgggcagccccacttcctgcagtcccagctggctgcagggcagctagtgtatgcccacggcggtgggggcacccagca ggatggcttccactttcgtgcccacctccaggggccagcaggggcctccgtggctggaccccaaacctcagaggcctttgccatcacggtgagggatgtaaatgag cggccccctcagccacaggcctctgtcccactccggctcacccgaggctctcgtgcccccatctcccgggcccagctgagtgtggtggacccagactcagctcctgg ggagattgagtacgaggtccagcgggcaccccacaacggcttcctcagcctggtgggtggtggcctggggcccgtgacccgcttcacgcaagccgatgtggattca gggcggctggccttcgtggccaacgggagcagcgtggcaggcatcttccagctgagcatgtctgatggggccagcccacccctgcccatgtccctggctgtggacat cctaccatccgccatcgaggtgcagctgcgggcacccctggaggtgccccaagctttggggcgctcctcactgagccagcagcagctccgggtggtttcagatcgg gaggagccagaggcagcataccgcctcatccagggaccccagtatgggcatctcctggtgggcgggcggcccacctcggccttcagccaattccagatagacca gggcgaggtggtctttgccttcaccaacttctcctcctctcatgaccacttcagagtcctggcactggctaggggtgtcaatgcatcagccgtagtgaacgtcactgtgag ggctctgctgcatgtgtgggcaggtgggccatggccccagggtgccaccctgcgcctggaccccaccgtcctagatgctggcgagctggccaaccgcacaggcag tgtgccgcgcttccgcctcctggagggaccccggcatggccgcgtggtccgcgtgccccgagccaggacggagcccgggggcagccagctggtggagcagttca ctcagcaggaccttgaggacgggaggctggggctggaggtgggcaggccagaggggagggcccccggccccgcaggtgacagtctcactctggagctgtggg cacagggcgtcccgcctgctgtggcctccctggactttgccactgagccttacaatgctgcccggccctacagcgtggccctgctcagtgtccccgaggccgcccgg acggaagcagggaagccagagagcagcacccccacaggcgagccaggccccatggcatccagccctgagcccgctgtggccaagggaggcttcctgagcttc cttgaggccaacatgttcagcgtcatcatccccatgtgcctggtacttctgctcctggcgctcatcctgcccctgctcttctacctccgaaaacgcaacaagacgggcaa gcatgacgtccaggtcctgactgccaagccccgcaacggcctggctggtgacaccgagacctttcgcaaggtggagccaggccaggccatcccgctcacagctgt gcctggccaggggccccctccaggaggccagcctgacccagagctgctgcagttctgccggacacccaaccctgcccttaagaatggccagtactgggtgtgagg cctggcctgggcccagatgctgatcgggccagggaca ggc (SEQ ID N°: 20). En otro aspecto, el nucleótido recombinante tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 20. En otro aspecto, un nucleótido que codifica HMW-MAA de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 20. En otro aspecto, el nucleótido que codifica HMW-MAA es un homólogo de la SEQ ID N°: 20. En otro aspecto, el nucleótido que codifica HMW-MAA es una variante de la SEQ ID N°: 20. En otro aspecto, el nucleótido que codifica HMW-MAA es un fragmento de la SEQ ID N°: 20. En otro aspecto, el nucleótido que codifica HMW-MAA es una isoforma de la SEQ ID N°: 20. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína HMW-MAA de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria tiene una secuencia de AA establecida en una entrada de GenBank que tiene un número de acceso seleccionado de NM_001897 y X96753. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA está codificada por una secuencia de nucleótidos establecida en una de las entradas de GenBank anteriores. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA comprende una secuencia establecida en una de las entradas de GenBank anteriores. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es un homólogo de una secuencia establecida en una de las entradas de GenBank anteriores. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es una variante de una secuencia establecida en una de las entradas de GenBank anteriores. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es un fragmento de una secuencia expuesta en una de las entradas de GenBank anteriores. En otro aspecto, la proteína HMW-MAA es una isoforma de una secuencia establecida en una de las entradas de GenBank anteriores. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

El fragmento de HMW-MAA utilizado en la presente descripción comprende, en otro aspecto, los AA 360-554. En otro aspecto, el fragmento consiste esencialmente en los AA 360-554. En otro aspecto, el fragmento consiste en los AA 360-554. En otro aspecto, el fragmento comprende los AA 701-1130. En otro aspecto, el fragmento consiste esencialmente en los AA 701-1130. En otro aspecto, el fragmento consiste en los AA 701-1130. En otro aspecto, el fragmento comprende los AA 2160-2258. En otro aspecto, el fragmento consiste esencialmente en 2160-2258. En otro aspecto, el fragmento consta de 2160-2258. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la Listeria recombinante de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria comprende un plásmido que codifica un polipéptido recombinante que es, en un aspecto, angiogénico, y en otro aspecto, antigénico. En un aspecto, el polipéptido es HMW-MAA, y en otro aspecto, el polipéptido es un fragmento de HMW-MAA. En otro aspecto, el plásmido codifica además un péptido distinto de HMW-MAA. En un aspecto, el péptido distinto de HMW-MAA potencia la inmunogenicidad del polipéptido. En un aspecto, el fragmento de HMW-MAA de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria se fusiona con la secuencia de AA distinta de HMW-MAA. En otro aspecto, el fragmento de HMW-MAA está incorporado dentro de la secuencia de AA distinta de HMW-MAA. En otro aspecto, un péptido derivado de HMW-MAA se incorpora en un fragmento de LLO, proteína o fragmento de ActA, o secuencia de tipo PEST. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

El péptido distinto de HMW-MAA es, en un aspecto, un oligopéptido de listeriolisina (LLO). En otro aspecto, el péptido distinto de HMW-MAA es un oligopéptido de ActA. En otro aspecto, el péptido distinto de HMW-MAA es un oligopéptido de tipo PEST. En un aspecto, la fusión a LLO, ActA, las secuencias de tipo PEST y sus fragmentos potencia la inmunogenicidad de antígenos mediada por células. En un aspecto, la fusión a LLO, ActA, secuencias de tipo PEST y sus fragmentos potencia la inmunogenicidad de antígenos mediada por células en una variedad de sistemas de expresión. En otro aspecto, el péptido distinto de HMW-MAA es cualquier otro péptido inmunogénico distinto de HMW-MAA conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, la cepa de Listeria recombinante de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria expresa un polipéptido antigénico heterólogo que se expresa en una célula tumoral. En un aspecto, la cepa de Listeria recombinante de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria comprende una primera o segunda molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno prostático específico (PSA), que en un aspecto, es un marcador del cáncer de próstata que se expresa a nivel elevado en los tumores de próstata, que en un aspecto es el tipo de cáncer más frecuente en los hombres estadounidenses y, en otro aspecto, es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en los hombres estadounidenses. En un aspecto, el PSA es una calicreína con actividad de serín proteasa (KLK3) secretada por las células epiteliales prostáticas, que, en un aspecto, se usa ampliamente como marcador del cáncer de próstata.

En un aspecto, la cepa de Listeria recombinante que se proporciona en la presente memoria comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína KLK3.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKH SQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFL RPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVH PQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP

(SEQ ID N°: 21; n° de acceso de GenBank CAA32915). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 21. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 21. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 21. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ iD N°: 21. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKV MDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSG GPLVCYGVLQGITSWGSEPCALP-ERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID N°: 22). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 22. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 22. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 22. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 22. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAA HCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLP TQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLV CNGVLQGITSWGSEPCALP-ERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID N°: 23; n° de acceso de GenBank AAA59995.1). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 23. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 23. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 23. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 23. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: ggtgtcttaggcacactggtcttggagtgcaaaggatctaggcacgtgaggctttgtatgaagaatcggggatcgtacccaccccctgtttctgtttcatcctgggcatgtc tcctctgcctttgtcccctagatgaagtctccatgagctacaagggcctggtgcatccagggtgatctagtaattgcagaacagcaagtgctagctctccctccccttcca cagctctgggtgtgggagggggttgtccagcctccagcagcatggggagggccttggtcagcctctgggtgccagcagggcaggggcggagtcctggggaatga aggttttatagggctcctgggggaggctccccagccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtga cgtggattggtgagaggggccatggttggggggatgcaggagagggagccagccctgactgtcaagctgaggctctttcccccccaacccagcaccccagccca gacagggagctgggctcttttctgtctctcccagccccacttcaagcccatacccccagtcccctccatattgcaacagtcctcactcccacaccaggtccccgctccct cccacttaccccagaactttcttcccatttgcccagccagctccctgctcccagctgctttactaaaggggaagttcctgggcatctccgtgtttctctttgtggggctcaaa acctccaaggacctctctcaatgccattggttccttggaccgtatcactggtccatctcctgagcccctcaatcctatcacagtctactgacttttcccattcagctgtgagtg tccaaccctatcccagagaccttgatgcttggcctcccaatcttgccctaggatacccagatgccaaccagacacctccttctttcctagccaggctatctggcctgaga caacaaatgggtccctcagtctggcaatgggactctgagaactcctcattccctgactcttagccccagactcttcattcagtggcccacattttccttaggaaaaacatg agcatccccagccacaactgccagctctctgagtccccaaatctgcatccttttcaaaacctaaaaacaaaaagaaaaacaaataaaacaaaaccaactcagac cagaactgttttcteaacctgggacttcctaaactttccaaaaccttcctettccagcaactgaacctegccataaggcacttatccctggttcctagcaccccttateccct cagaatecacaacttgtaccaagtttcccttctcccagtecaagaccccaaateaccacaaaggacccaatecccagacteaagatatggtctgggcgctgtcttgtgt ctcctaccctgatccctgggttcaactctgctcccagagcatgaagcctctccaccagcaccagccaccaacctgcaaacctagggaagattgacagaattcccagc ctttcccagctccccctgcccatgtcccaggactcccagccttggttctctgcccccgtgtcttttcaaacccacatcctaaatccatctcctatccgagtcccccagttccc cctgtcaaccctgattcccctgatctagcaccccctctgcaggcgctgcgcccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctg gcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagtgagtaggggcctg gggtctggggagcaggtgtctgtgtcccagaggaataacagctgggcattttccccaggataacctctaaggccagccttgggactgggggagagagggaaagttc tggttcaggtcacatggggaggcagggttggggctggaccaccctccccatggctgcctgggtctccatctgtgtccctctatgtctctttgtgtcgctttcattatgtctcttg gtaactggcttcggttgtgtctctccgtgtgactattttgttctctctctccctctcttctctgtcttcagtctccatatctccccctctctctgtccttctctggtccctctctagccagtg tgtctcaccctgtatctctctgccaggctctgtctctcggtctctgtctcacctgtgccttctccctactgaacacacgcacgggatgggcctgggggaccctgagaaaag gaagggctttggctgggcgcggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccaaggcaggtagatcacctgaggtcaggagttcgagaccagcctggcc aactggtgaaaccccatctctactaaaaatacaaaaaattagccaggcgtggtggcgcatgcctgtagtcccagctactcaggagctgagggaggagaattgcatt gaacctggaggttgaggttgcagtgagccgagaccgtgccactgcactccagcctgggtgacagagtgagactccgcctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaagaaaagaaaagaaaagaaaaggaagtgttttatccctgatgtgtgtgggtatgagggtatgagagggcccctctcactccattccttctccaggacatc cctccactcttgggagacacagagaagggctggttccagctggagctgggaggggcaattgagggaggaggaaggagaagggggaaggaaaacagggtatg ggggaaaggaccctggggagcgaagtggaggatacaaccttgggcctgcaggcaggctacctacccacttggaaacccacgccaaagccgcatctacagctga gccactctgaggcctcccctccccggcggtccccactcagctccaaagtctctctcccttttctctcccacactttatcatcccccggattcctctctacttggttctcattcttc ctttgacttcctgcttccctttctcattcatctgtttctcactttctgcctggttttgttcttctctctctctttctctggcccatgtctgtttctctatgtttctgtcttttctttctcatcctgtgtatt ttcggctcaccttgtttgtcactgttctcccctctgccctttcattctctctgcccttttaccctcttccttttcccttggttctctcagttctgtatctgcccttcaccctctcacactgctg tttcccaactcgttgtctgtattttggcctgaactgtgtcttcccaaccctgtgttttctcactgtttctttttctcttttggagcctcctccttgctcctctgtcccttctctctttccttatcat cctcgctcctcattcctgcgtctgcttcctccccagcaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagcca cagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgc cgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagt gtacgcctgggccagatggtgcagccgggagcccagatgcctgggtctgagggaggaggggacaggactcctgggtctgagggaggagggccaaggaacca ggtggggtccagcccacaacagtgtttttgcctggcccgtagtcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttc accctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcggtgagtcatccctactcccaagatcttgagggaaaggt gagtgggaccttaattctgggctggggtctagaagccaacaaggcgtctgcctcccctgctccccagctgtagccatgccacctccccgtgtctcatctcattccctcctt ccctcttctttgactccctcaaggcaataggttattcttacagcacaactcatctgttcctgcgttcagcacacggttactaggcacctgctatgcacccagcactgcccta gagcctgggacatagcagtgaacagacagagagcagcccctcccttctgtagcccccaagccagtgaggggcacaggcaggaacagggaccacaacacaga aaagctggagggtgtcaggaggtgatcaggctctcggggagggagaaggggtggggagtgtgactgggaggagacatcctgcagaaggtgggagtgagcaaa cacctgcgcaggggaggggagggcctgcggcacctgggggagcagagggaacagcatctggccaggcctgggaggaggggcctagagggcgtcaggagc agagaggaggttgcctggctggagtgaaggatcggggcagggtgcgagagggaacaaaggacccctcctgcagggcctcacctgggccacaggaggacact gcttttcctctgaggagtcaggaactgtggatggtgctggacagaagcaggacagggcctggctcaggtgtccagaggctgcgctggcctcctatgggatcagactg cagggagggagggcagcagggatgtggagggagtgatgatggggctgacctgggggtggctccaggcattgtccccacctgggcccttacccagcctccctcac aggctcctggccctcagtctctcccctccactccattctccacctacccacagtgggtcattctgatcaccgaactgaccatgccagccctgccgatggtcctccatggct ccctagtgccctggagaggaggtgtctagtcagagagtagtcctggaaggtggcctctgtgaggagccacggggacagcatcctgcagatggtcctggcccttgtcc caccgacctgtctacaaggactgtcctcgtggaccctcccctctgcacaggagctggaccctgaagtcccttcctaccggccaggactggagcccctacccctctgtt ggaatccctgcccaccttcttctggaagtcggctctggagacatttctctcttcttccaaagctgggaactgctatctgttatctgcctgtccaggtctgaaagataggattgc ccaggcagaaactgggactgacctatctcactctctccctgcttttacccttagggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatgggg cagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcaccccta tcaagtccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctagg aaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaat ttctctgaggacacagttaggat ggggtgtctgtgttatttgtgggatacagagatgaaagaggggtgggatcc (SEQ ID N°: 24; n° de acceso de GenBank X14810). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 401..446, 1688..1847, 3477..3763, 3907..4043 y 5413..5568 de la SEQ ID N°: 24. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 24. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ ID N°: 24. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 24. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ ID N°: 24. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLV ASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSH DLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFML CAGRWTGGKSTCSW-VILITELTMPALPMVLHGSLVPWRGGV (SEQ ID N°: 25; n° de acceso de GenBank NP_001025218). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 25. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 25. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 25. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 25. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctc ggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgg gtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacag cttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccga gctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttctt gaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctgga cagggggcaaaagcacctgctcgtgggtcattctgatcaccgaactgaccatgccagccctgccgatggtcctccatggctccctagtgccctggagaggaggtgtc tagtcagagagtagtcctggaaggtggcctctgtgaggagccacggggacagcatcctgcagatggtcctggcccttgtcccaccgacctgtctacaaggactgtcct cgtggaccctcccctctgcacaggagctggaccctgaagtcccttccccaccggccaggactggagcccctacccctctgttggaatccctgcccaccttcttctggaa gtcggctctggagacatttctctcttcttccaaagctgggaactgctatctgttatctgcctgtccaggtctgaaagataggattgcccaggcagaaactgggactgacct atctcactctctccctgcttttacccttagggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccga aaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttg gaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacag gtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggat ggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagc agaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtg agccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtc ctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtg (SEQ ID N°: 26; número de acceso de GenBank NM_001030047). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 42-758 de la SEQ ID N°: 26. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 26. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ ID N°: 26. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 26. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ ID N°: 26. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVG-GWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRK (SEQ ID N°: 27; número de acceso de GenBank NP_001025221). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 27. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 27. En otro aspecto, la secuencia de la proteína KLK3 comprende la SEQ ID N°: 27. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 27. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 27. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcacccttccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcg gattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggt cctcacagctgcccactgcatcaggaagtgagtaggggcctggggtctggggagcaggtgtctgtgtcccagaggaataacagctgggcattttccccaggataac ctctaaggccagccttgggactgggggagagagggaaagttctggttcaggtcacatggggaggcagggttggggctggaccaccctccccatggctgcctgggtc tccatctgtgttcctctatgtctctttgtgtcgctttcattatgtctcttggtaactggcttcggttgtgtctctccgtgtgactattttgttctctctctccctctcttctctgtcttcagt (SEQ ID N°: 28; n° de acceso de GenBank NM_001030050). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 42-758 de la SEQ ID N°: 28. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 28. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ ID N°: 28. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 28. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ ID N°: 28. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 que es la fuente del péptido KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIG AAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVS HSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSG DSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID N°: 29; n° de acceso de GenBank NP_001025220). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 29. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 29. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 29. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 29. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctc ggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgg gtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacag cttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttca gtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacc tgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaa ggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggc caagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaa atggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggt acagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgca ccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcct ttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgat gatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtg (SEQ ID N°: 30; número de acceso de GenBank NM_001030049). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 42-758 de la SEQ ID N°: 30. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 30. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ ID N°: 30. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 30. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ ID N°: 30. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVG-GWECEKHSQPWQV LVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRKPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSI EPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCAL PERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID N°: 31; n° de acceso de GenBank NP_001025219). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 31. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 31. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la s Eq ID N°: 31. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 31. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctc ggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgg gtcctcacagctgcccactgcatcaggaagccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggt catggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagt gtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctg ctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaagg tggtgcattacccaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagc ctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgt cctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaa agaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactca cagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcctttggcatgggat ggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagta gaactcacagaaataaagagctgttatactgtg (SEQ ID N°: 32; n° de acceso de GenBank NM_001030048). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 42-758 de la SEQ ID N°: 32. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 32. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ ID N°: 32. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 32. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ ID N°: 32. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVG-GWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYD MSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKD TIVANP (SEQ ID N°: 33; n° de acceso de GenBank NP_001639). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 33. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 33. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 33. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 33. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctc ggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgg gtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacag cttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccga gctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttctt gaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctgga cagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaa ggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttgga accttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggt gtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatgg ggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcag aagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgag ccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcct ccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtg (SEQ ID N°: 34; n° de acceso de GenBank NM_001648). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 42-827 de la SEQ ID N°: 34. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 34. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ Id N°: 34. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 34. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ iD N°: 34. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQ PWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRP GDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQ KVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID N°: 35; n° de acceso de GenBank AAX29407.1). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 35. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 35. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 35. En otro aspecto, la secuencia de la proteína KLK3 comprende la s Eq ID N°: 35. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 35. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: gggggagccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatc ctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcaccccc agtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagcc acagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctg ccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagagga gttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacg ctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcc cgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaactccctattgtagtaaac ttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaggcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacac aggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagatagg atggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgag cagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgt gagccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtagggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaag tcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa (SEQ ID N°: 36; n° de acceso de GenBank BC056665). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 47 832 de la SEQ ID N°: 36. En otro aspecto, la proteína Kl K3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 36. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ ID N°: 36. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 36. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ ID N°: 36. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVG-GWECEKHSQPWQ VLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDD SSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEP CALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVA (SEQ ID N°: 37; n° de acceso de GenBank AJ459782). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 37. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 37. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 37. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 37. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVG-GWECEKHSQPW QVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGD DSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVT KFMLCAGRWTGGKSTCSVSHPYSQDLEGKGEWGP (SEQ ID N°: 38, n° de acceso GenBank AJ512346). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 38. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 38. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 38. En otro aspecto, la secuencia de la proteína KLK3 comprende la SEQ ID N°: 38. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 38. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la siguiente secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGERGHGWGDAGEGASPDC-QAEALSPPTQHPSPDRELGSFLSLPAPLQAHTPSPSILQQSSLPHQVPAPSHLPQNFLPIAQPAPCSQLLY (SEQ ID N°: 39; n° de acceso de GenBank AJ459784). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 39. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 39. En otro aspecto, la secuencia de la proteína KLK3 comprende la SEQ ID N°: 39. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 39. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 39. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVG-GWECEKHSQPWQVL VASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSS HDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFM LCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID N°: 40; n° de acceso de GenBank AJ459783). En otro aspecto, la proteína KLK3 es un homólogo de la SEQ ID N°: 40. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una variante de la SEQ ID N°: 40. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un isómero de la SEQ ID N°: 40. En otro aspecto, la proteína KLK3 es un fragmento de la SEQ ID N°: 40. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una molécula de nucleótidos que tiene la secuencia: aagtttcccttctcccagtccaagaccccaaatcaccacaaaggacccaatccccagactcaagatatggtctgggcgctgtcttgtgtctcctaccctgatccctgggt tcaactctgctcccagagcatgaagcctctccaccagcaccagccaccaacctgcaaacctagggaagattgacagaattcccagcctttcccagctccccctgccc atgtcccaggactcccagccttggttctctgcccccgtgtetttteaaacccacatectaaatecatctectatecgagtcccccagttectectgteaaccctgatteccctg atctagcaccccctetgcaggtgctgcacccctcatcctgteteggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcatteccaaccctggcaggtgcttgtagcctetegtg gcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctacccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttc atcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactcca gccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctatgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgct acgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccc tcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggt atcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacc cctgagcacccctatcaactccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaggcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggt ccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctgga gacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggaga gtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactct gtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgaaccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactgaccccctg gaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtgaa (SEQ ID N°: 41; n° de acceso de GenBank X07730). En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por los residuos 67-1088 de la SEQ ID N°: 41. En otro aspecto, la proteína KLk 3 está codificada por un homólogo de la SEQ ID N°: 41. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variante de la SEQ ID N°: 41. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un isómero de la SEQ ID N°: 41. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por un fragmento de la SEQ ID N°: 41. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una secuencia establecida en uno de los siguientes números de acceso de GenBank: BC005307, AJ310938, AJ310937, AF335478, AF335477, M27274 y M26663. En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una secuencia establecida en uno de los números de acceso de GenBank anteriores. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una secuencia establecida en uno de los siguientes números de acceso de GenBank: NM_001030050, NM_001030049, NM_001030048, NM_001030047, NM_001648, AJ459782, AJ512346 o AJ459784. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria. En un aspecto, la proteína KLK3 está codificada por una variación de cualquiera de las secuencias descritas en la presente memoria, en la que la secuencia carece de MWVPVVFLFLVLSWTWIGAAPLILSR (SEQ ID N°: 55).

En otro aspecto, la proteína KLK3 tiene la secuencia que comprende una secuencia establecida en uno de los siguientes números de acceso de GenBank: X13943, X13942, X13940, X13941 y X13944. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 es cualquier otra proteína KLK3 conocida en la técnica. Cada proteína KLK3 representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el péptido KLK3 es cualquier otro péptido KLK3 conocido en la técnica. En otro aspecto, el péptido KLK3 es un fragmento de cualquier otro péptido KLK3 conocido en la técnica. Cada tipo de péptido KLK3 representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

"Péptido KLK3" se refiere, en otro aspecto, a una proteína KLK3 de longitud completa. En otro aspecto, el término se refiere a un fragmento de una proteína KLK3. En otro aspecto, el término se refiere a un fragmento de una proteína KLK3 que carece del péptido señal de KLK3. En otro aspecto, el término se refiere a una proteína KLK3 que contiene la secuencia de KLK3 completa, excepto el péptido señal de KLK3. "Secuencia señal de KLK3" se refiere, en otro aspecto, a cualquier secuencia señal encontrada en la naturaleza en una proteína KLK3. En otro aspecto, una proteína KLK3 de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria no contiene ninguna secuencia señal. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la peptidasa relacionada con la calicreína 3 (proteína KLK3), que es la fuente de un péptido KLK3 para el uso en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria, es una proteína PSA. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína antigénica P-30. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína gamma-seminoproteína. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína calicreína 3. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína semenogelasa. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína seminina. En otro aspecto, la proteína KLK3 es cualquier otro tipo de proteína KLK3 que se conoce en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de corte y empalme 1. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de corte y empalme 2. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de corte y empalme 3. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de transcripción 1. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de transcripción 2. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de transcripción 3. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de transcripción 4. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de transcripción 5. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 variante de transcripción 6. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína RP5 KLK3 variante de corte y empalme. En otro aspecto, la proteína KLK3 es cualquier otra proteína KLK3 variante de corte y empalme conocida en la técnica. En otro aspecto, la proteína KLK3 es cualquier otra proteína KLK3 variante de transcripción conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 madura. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una pro-proteína KLK3. En otro aspecto, la secuencia líder se ha eliminado de una proteína KLK3 madura de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína KLK3 que es la fuente de un péptido KLK3 de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria es una proteína KLK3 humana. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 de primate. En otro aspecto, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 de cualquier otra especie conocida en la técnica. En otro aspecto, una de las proteínas KLK3 anteriores se denomina en la técnica "proteína KLK3". Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, el antígeno de interés es un polipéptido KLK9.

En otro aspecto, el antígeno de interés es HPV-E7. En otro aspecto, el antígeno es HPV-E6. En otro aspecto, el antígeno es Her-2/neu. En otro aspecto, el antígeno es NY-ESO-1. En otro aspecto, el antígeno es telomerasa (TERT). En otro aspecto, el antígeno es SCCE. En otro aspecto, el antígeno es CEA. En otro aspecto, el antígeno es LMP-1. En otro aspecto, el antígeno es p53. En otro aspecto, el antígeno es la anhidrasa carbónica IX (CAIX). En otro aspecto, el antígeno es PSMA. En otro aspecto, el antígeno es el antígeno de células madre de próstata (PSCA). En otro aspecto, el antígeno es HMW-MAA. En otro aspecto, el antígeno es WT-1. En otro aspecto, el antígeno es HIV-1 Gag. En otro aspecto, el antígeno es proteinasa 3. En otro aspecto, el antígeno es proteína 2 relacionada con tirosinasa. En otro aspecto, el antígeno es PSA (antígeno prostético específico). En otro aspecto, el antígeno se selecciona de HPV-E7, HPV-E6, Her-2, NY-ESO-1, telomerasa (TERT), SCCE, HMW-MAA, WT-1, Gag del VIH-1, CEA, LMP-1, p53, PSMA, PSCA, proteinasa 3, proteína 2 relacionada con tirosinasa, Mucl, PSA (antígeno prostético específico), o una combinación de los mismos.

En otro aspecto, el antígeno es un antígeno asociado a un tumor, que en un aspecto es uno de los siguientes antígenos tumorales: una proteína MAGE (antígeno E asociado a melanoma), por ejemplo, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, una tirosinasa; una proteína ras mutante; una proteína p53 mutante; antígeno de melanoma p97, un péptido ras o péptido p53 asociado con cánceres avanzados; los antígenos HPV 16/18 asociados con cánceres de cuello uterino, antígeno KLH asociado con carcinoma de mama, CEA (antígeno carcinoembrionario) asociado con cáncer colorrectal, gp100, un antígeno MART1 asociado con melanoma o el antígeno PSA asociado con cáncer de próstata. En otro aspecto, el antígeno para las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria son antígenos asociados a melanoma, que en un aspecto son TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, tirosinasa, HSP-70, beta-HCG, o una combinación de los mismos.

En un aspecto, el primer y segundo ácido nucleico pueden codificar dos antígenos distintos que sirven como objetivos tumorales, que en un aspecto son el antígeno prostático específico (PSA) y el antígeno de células madre del cáncer de próstata (PSCA). En un aspecto, el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico puede complementar o sinergizar la respuesta inmune al primer ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico. En otro aspecto, el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico afecta al crecimiento vascular. En un aspecto, el primer y segundo ácido nucleico pueden codificar dos polipéptidos que afectan al crecimiento vascular, que, en un aspecto, funcionan a través de distintos mecanismos para afectar al crecimiento vascular. En un aspecto, tales polipéptidos son EGFR-III, HMW-MAA, o una combinación de los mismos. En un aspecto, un polipéptido puede servir como antígeno tumoral y como factor angiogénico. En un aspecto, el primer ácido nucleico puede codificar un antígeno tumoral, y el segundo ácido nucleico puede codificar un polipéptido que es un inhibidor de la función o expresión de ARG-1 o NOS o una combinación. En un aspecto, un inhibidor de NOS es NG-mono-metil-L-arginina (L-NMmA), éster metílico de NG_nitro-L-arginina (L-NAME), 7-NI, L-NIL, o L-NIO. En un aspecto, el ácido nucleico puede codificar la N-omega-nitro-L-arginina, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa, y el inhibidor competitivo de la L-arginina. En un aspecto, el segundo ácido nucleico puede codificar un ARNm que inhibe la función o expresión de ARG-1 o NOS.

En un aspecto, un polipéptido expresado por la Listeria descrita en la presente memoria puede ser un antagonista del factor de crecimiento neuropeptídico, que en un aspecto es [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] sustancia P, [Arg6, D-Trp7,9, NmePhe8] sustancia P (6-11). Estos aspectos y los aspectos relacionados los entiende un experto en la técnica.

En otro aspecto, el antígeno es un antígeno de una enfermedad infecciosa. En un aspecto, el antígeno es un autoantígeno o un antígeno propio.

En otros aspectos, el antígeno deriva de un patógeno fúngico, bacterias, parásitos, helmintos o virus. En otros aspectos, el antígeno se selecciona de toxoide tetánico, moléculas de hemaglutinina del virus de la gripe, toxoide de la difteria, gp120 del VIH, proteína gag del VIH, proteasa de IgA, péptido de insulina B, antígenos de Spongospora subterranea, antígenos de vibrios, antígenos de salmonela, antígenos de neumococos, antígenos del virus sincitial respiratorio, proteínas de la membrana externa de Haemophilus influenzae, ureasa de Helicobacter pylori, pilinas de Neisseria meningitidis, pilinas de N. gonorrhoeae, antígenos E1 y E2 del virus del papiloma humano de tipo HPV-16, -18, -31, -33, -35 o -45 humanos, o una combinación de los mismos.

En otros aspectos, el antígeno está asociado con una de las siguientes enfermedades; cólera, difteria, Haemophilus, hepatitis A, hepatitis B, gripe, sarampión, meningitis, paperas, tos ferina, viruela, neumonía neumocócica, poliomielitis, rabia, rubéola, tétanos, tuberculosis, fiebre tifoidea, Varicella-zóster, tos ferina, fiebre amarilla, los inmunógenos y antígenos de la enfermedad de Addison, alergias, anafilaxia, síndrome de Bruton, cáncer, que incluye los tumores sólidos y los sanguíneos, eccema, tiroiditis de Hashimoto, polimiositis, dermatomiositis, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, rechazo de trasplantes, como de riñón, corazón, páncreas, pulmón, hueso e hígado, enfermedad de Graves, enfermedad autoinmune poliendocrina, hepatitis, poliarteritis microscópica, poliarteritis nodosa, pénfigo, cirrosis biliar primaria, anemia perniciosa, enfermedad celíaca, nefritis mediada por anticuerpos, glomerulonefritis, enfermedades reumáticas, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, espondiloartritis seronegativa, rinitis, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica, colangitis esclerosante, granulomatosis de Wegener, dermatitis herpetiforme, psoriasis, vitíligo, esclerosis múltiple, encefalomielitis, síndrome de Guillain-Barré, miastenia grave, síndrome de Lambert-Eaton, esclerótica, epiesclerótica, uveítis, candidiasis mucocutánea crónica, urticaria, hipogamaglobulinemia transitoria infantil, mieloma, síndrome de hiper IgM asociado al cromosoma X, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune, neutropenia autoinmune, macroglobulinemia de Waldenstrom, amiloidosis, leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, proteína del circumsporozoito de la malaria, antígenos microbianos, antígenos virales, autoantígenos, y listeriosis. Cada antígeno representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

La respuesta inmune inducida por los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria es, en otro aspecto, una respuesta de células T. En otro aspecto, la respuesta inmune comprende una respuesta de células T. En otro aspecto, la respuesta es una respuesta de células T CD8+. En otro aspecto, la respuesta comprende una respuesta de células T CD8+. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En un aspecto, una Listeria recombinante de las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria comprende un polipéptido angiogénico. En otro aspecto, los enfoques antiangiogénicos para la terapia del cáncer son muy prometedores, y, en un aspecto, un tipo de terapia antiangiogénica de este tipo selecciona como objetivo los pericitos. En otro aspecto, los objetivos moleculares en las células endoteliales vasculares y los pericitos son objetivos importantes para las terapias antitumorales. En otro aspecto, la señalización del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-B/PDGFR-p) es importante para reclutar pericitos en los vasos sanguíneos recién formados. Por lo tanto, en un aspecto, los polipéptidos angiogénicos que se proporcionan en la presente memoria inhiben las moléculas involucradas en la señalización de pericitos, que, en un aspecto, es PDGFR-p.

En un aspecto, las composiciones de la presente invención comprenden un factor angiogénico, o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde, en un aspecto, el fragmento inmunogénico comprende uno o más epítopos reconocidos por el sistema inmune del huésped. En un aspecto, un factor angiogénico es una molécula involucrada en la formación de nuevos vasos sanguíneos. En un aspecto, el factor angiogénico es VEGFR2. En otro aspecto, un factor angiogénico descrito en la presente memoria es angiogenina; Angiopoyetina-1; Del-1; Factores de crecimiento de fibroblastos: ácido (aFGF) y básico (bFGF); Folistatina; Factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersión (SF); Interleucina-8 (IL-8); Leptina; Midkina; Factor de crecimiento placentario; Factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF); Factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB); Pleiotrofina (PTN); Progranulina; Prolifina; Factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa); Factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta); Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa); Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)/factor de permeabilidad vascular (VPF). En otro aspecto, un factor angiogénico es una proteína angiogénica. En un aspecto, un factor de crecimiento es una proteína angiogénica. En un aspecto, una proteína angiogénica para uso en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria son los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF); VEGF; VEGFR y neuropilina 1 (NRP-1); Angiopoyetina 1 (Ang1) y Tie2; Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF; homodímero BB) y PDGFR; Factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), endoglina y receptores de TGF-p; proteína-1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1); Integrinas aVp3, aVp5 y a5p1; VE-cadherina y CD31; efrina; activadores de plasminógeno; inhibidor del activador de plasminógeno-1; óxido nítrico sintasa (NOS) y COX-2; AC133; o Id1/Id3. En un aspecto, una proteína angiogénica para uso en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria es una angiopoyetina, que en un aspecto es la angiopoyetina 1, la angiopoyetina 3, la angiopoyetina 4 o la angiopoyetina 6. En un aspecto, la endoglina también se conoce como CD105; EDG; HHT1; ORW; u ORW1. En un aspecto, la endoglina es un co-receptor de TGFbeta.

En un aspecto, las vacunas contra el cáncer que se proporcionan en la presente memoria generan células T efectoras que pueden infiltrarse en el tumor, destruir las células tumorales y erradicar la enfermedad. En un aspecto, los linfocitos infiltrantes de tumores que se dan de manera natural (TlLs) están asociados a un mejor pronóstico en varios tumores, como los de colon, ovario y melanoma. En el cáncer de colon, los tumores sin signos de micrometástasis tienen una mayor infiltración de células inmunitarias y un perfil de expresión Th1, que se correlaciona con una mejor supervivencia de los pacientes. Además, la infiltración del tumor por las células T se ha asociado con el éxito de los enfoques inmunoterapéuticos tanto en ensayos preclínicos como en humanos. En un aspecto, la infiltración de linfocitos en el sitio del tumor depende de la regulación al alza de las moléculas de adhesión en las células endoteliales de la vasculatura del tumor, generalmente por citoquinas proinflamatorias, tales como IFN-y, TNF-a e IL-1. Se han implicado varias moléculas de adhesión en el proceso de infiltración de linfocitos en tumores, incluida la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), la molécula de adhesión de células endoteliales vasculares 1 (V-CAM-1), la proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1) y E-selectina. Sin embargo, estas moléculas de adhesión celular suelen estar reguladas a la baja en la vasculatura del tumor. Por lo tanto, en un aspecto, las vacunas contra el cáncer que se proporcionan en la presente memoria aumentan los TlLs, regulan al alza las moléculas de adhesión (en un aspecto, ICAM-1, V-CAM-1, VAP-1, E-selectina, o una combinación de las mismas), regulan las citocinas proinflamatorias (en un aspecto, IFN-y, TNF-a, IL-1, o una combinación de las mismas), o una combinación de las mismas.

En un aspecto, las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria proporcionan una terapia antiangiogénica, que, en un aspecto, puede mejorar las estrategias de inmunoterapia. En un aspecto, las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria evitan la anergia de las células endoteliales in vivo mediante el aumento de las moléculas de adhesión en los vasos tumorales y la mejora de las interacciones de los leucocitos y los vasos, lo que aumenta el número de leucocitos infiltrantes de tumores, como las células T CD8+. Curiosamente, la protección antitumoral mejorada se correlaciona con un número aumentado de células T infiltrantes en tumores CD4+ y CD8+ activadas y una disminución pronunciada del número de células T reguladoras en el tumor tras el bloqueo de VEGF.

En un aspecto, la administración de un antígeno antiangiogénico simultáneamente con un antígeno asociado a un tumor a un huésped afectado por un tumor, como se describe en la presente memoria, tendrá un efecto sinérgico en el impacto del crecimiento tumoral y una eficacia terapéutica más potente.

En otro aspecto, la selección como objetivo de los pericitos mediante la vacunación conducirá a la infiltración de linfocitos T citotóxicos (CTL), la destrucción de pericitos, la desestabilización de los vasos sanguíneos y la inflamación vascular, que en otro aspecto está asociada con la regulación positiva de las moléculas de adhesión en las células endoteliales que son importantes para la adherencia y la transmigración de los linfocitos, mejorando en última instancia la capacidad de los linfocitos de infiltrarse en el tejido tumoral. En otro aspecto, la administración concomitante de un antígeno específico del tumor genera linfocitos capaces de invadir el sitio tumoral y destruir las células tumorales.

En un aspecto, la señalización del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-B/PDGFR-p) es importante para incorporar pericitos en los vasos sanguíneos recién formados. En otro aspecto, la inhibición de VEGFR-2 y PDGFR-p induce de manera concomitante la apoptosis de las células endoteliales y la regresión de los vasos sanguíneos tumorales, en una realización, aproximadamente del 40% de los vasos sanguíneos tumorales.

La cepa de Listeria recombinante de la invención es una cepa de Listeria auxotrófica que es un mutante dal/dat. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico se mantiene estable en la cepa bacteriana recombinante en ausencia de selección con antibióticos.

Los mutantes auxótrofos útiles como vectores de vacunas se pueden generar de varias maneras. Los mutantes auxotróficos de D-alanina se pueden generar, en un aspecto, a través de la ruptura del gen dal y del gen dat para generar una cepa auxotrófica atenuada de Listeria que requiere D-alanina añadida exógenamente para el crecimiento.

La generación de cepas AA de Listeria deficientes en D-alanina, por ejemplo, puede llevarse a cabo de varias maneras que son muy conocidas para los expertos en la técnica, incluyendo mutagénesis por deleción, mutagénesis por inserción y mutagénesis que resulta en la generación de mutaciones de desplazamiento del marco de lectura, mutaciones que causan la terminación prematura de una proteína, o la mutación de secuencias reguladoras que afectan a la expresión génica. En otro aspecto, la mutagénesis se puede lograr usando técnicas de ADN recombinante o utilizando la tecnología de mutagénesis tradicional usando productos químicos mutagénicos o radiación, y la posterior selección de mutantes. En otro aspecto, se prefieren los mutantes por deleción debido a la baja probabilidad asociada de reversión del fenotipo auxotrófico. En otro aspecto, los mutantes de D-alanina que se generan de acuerdo con los protocolos presentados en la presente memoria pueden ensayarse para determinar su capacidad de crecer en ausencia de D-alanina en un ensayo de cultivo de laboratorio simple. En otro aspecto, los mutantes que no pueden crecer en ausencia de este compuesto se seleccionan para un estudio adicional.

En otro aspecto, además de los genes asociados a D-alanina mencionados anteriormente, se pueden usar otros genes implicados en la síntesis de una enzima metabólica, como se proporciona en la presente memoria, como objetivos para la mutagénesis de Listeria.

La cepa de Listeria auxotrófica de la invención comprende un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofia de dicha cepa de Listeria auxotrófica. En otro aspecto, la construcción está contenida en la cepa de Listeria de una manera episomal. En otro aspecto, el antígeno exógeno se expresa a partir de un vector albergado por la cepa de Listeria recombinante. En otro aspecto, dicho vector de expresión episomal carece de un marcador de resistencia a antibióticos. En un aspecto, un antígeno de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria se fusiona genéticamente con un oligopéptido que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, dicho polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST es LLO. En otro aspecto, dicho polipéptido endógeno que comprende una secuencia PESt es ActA. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la enzima metabólica complementa un gen metabólico endógeno que falta en el resto del cromosoma de la cepa bacteriana recombinante. En un aspecto, el gen metabólico endógeno está mutado en el cromosoma. En otro aspecto, el gen metabólico endógeno está delecionado del cromosoma. En otro aspecto, dicha enzima metabólica es una enzima del metabolismo de aminoácidos. En otro aspecto, dicha enzima metabólica cataliza la formación de un aminoácido utilizado para la síntesis de la pared celular en dicha cepa de Listeria recombinante. En otra realización, dicha enzima metabólica es una enzima alanina racemasa. En otra realización, dicha enzima metabólica es una enzima D-aminoácido transferasa. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la enzima metabólica cataliza la formación de un aminoácido (AA) utilizado en la síntesis de la pared celular. En otro aspecto, la enzima metabólica cataliza la síntesis de un AA utilizado en la síntesis de la pared celular. En otro aspecto, la enzima metabólica está involucrada en la síntesis de un AA usado en la síntesis de la pared celular. En otro aspecto, el AA se utiliza en la biogénesis de la pared celular. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la enzima metabólica es una enzima sintética para el ácido D-glutámico, un componente de la pared celular.

En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por un gen de alanina racemasa (dal). En otro aspecto, el gen dal codifica alanina racemasa, que cataliza la reacción L-alanina ^ D-alanina.

El gen dal de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria está codificado, en otro aspecto, por la secuencia: atggtgacaggctggcatcgtccaacatggattgaaatagaccgcgcagcaattcgcgaaaatataaaaaatgaacaaaa taaactcccggaaagtgtcgacttatgggcagtagtcaaagctaatgcatatggtcacggaattatcgaagttgctaggacggcgaaagaagctggagcaaaaggt ttctgcgtagccattttagatgaggcactggctcttagagaagctggatttcaagatgactttattcttgtgcttggtgcaaccagaaaagaagatgctaatctggcagcca aaaaccacatttcacttactgtttttagagaagattggctagagaatctaacgctagaagcaacacttcgaattcatttaaaagtagatagcggtatggggcgtctcggt attcgtacgactgaagaagcacggcgaattgaagcaaccagtactaatgatcaccaattacaactggaaggtatttacacgcattttgcaacagccgaccagctaga aactagttattttgaacaacaattagctaagttccaaacgattttaacgagtttaaaaaaacgaccaacttatgttcatacagccaattcagctgcttcattgttacagcca caaatcgggtttgatgcgattcgctttggtatttcgatgtatggattaactccctccacagaaatcaaaactagcttgccgtttgagcttaaacctgcacttgcactctatacc gagatggttcatgtgaaagaacttgcaccaggcgatagcgttagctacggagcaacttatacagcaacagagcgagaatgggttgcgacattaccaattggctatgc ggatggattgattcgtcattacagtggtttccatgttttagtagacggtgaaccagctccaatcattggtcgagtttgtatggatcaaaccatcataaaactaccacgtgaat ttcaaactggttcaaaagtaacgataattggcaaagatcatggtaacacggtaacagcagatgatgccgctcaatatttagatacaattaattatgaggtaacttgtttgtt aaatgagcgcataccta-gaaaatacatccattag (SEQ ID N°: 42; n° de acceso de GenBank: AF038438). En otro aspecto, el nucleótido que codifica dal es homólogo a la SEQ ID N°: 42. En otro aspecto, el nucleótido que codifica dal es una variante de la SEQ ID N°: 42. En otro aspecto, el nucleótido que codifica dal es un fragmento de la SEQ ID N°: 42. En otro aspecto, la proteína dal está codificada por cualquier otro gen dal conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína dal tiene la secuencia: MVTGWHRPTWIEIDRAAIRENIKNEQNKLPESVDLWAVVKANAY GHGIIEVARTAKEAGAKGFCVAILDEALALREAGFQDDFILVLGATRKEDANLAAKNHISLTVFREDWLENLTLEATLRIH LKVDSGMGRLGIRTTEEARRIEATSTNDHQLQLEGIYTHFATADQLETSYFEQQLAKFQTILTSLKKRPTYVHTANSAA SLLQPQIGFDAIRFGISMYGLTPSTEIKTSLPFELKPALALYTEMVHVKELAPGDSVSYGATYTATEREWVATLPIGYAD GURHYSGFHVLVDGEPAPIIGRVCMDQTNKLPREFQTGSKVTNGKDHGNTVTADDAAQYLDTINYEVTCLLNERIPRK YIH (SEQ ID N°: 43; n° de acceso de GenBank: AF038428). En otro aspecto, la proteína dal es homóloga a la SEQ ID N°: 43. En otro aspecto, la proteína dal es una variante de la SEQ ID N°: 43. En otro aspecto, la proteína dal es un isómero de la SEQ ID N°: 43. En otro aspecto, la proteína dal es un fragmento de la SEQ ID N°: 43. En otro aspecto, la proteína dal es un fragmento de un homólogo de la SEQ ID N°: 43. En otro aspecto, la proteína dal es un fragmento de una variante de la SEQ ID N°: 43. En otro aspecto, la proteína dal es un fragmento de un isómero de la SEQ ID N°: 43.

En otro aspecto, la proteína dal es cualquier otra proteína dal de Listeria conocida en la técnica. En otro aspecto, la proteína dal es cualquier otra proteína dal grampositiva conocida en la técnica. En otro aspecto, la proteína dal es cualquier otra proteína dal conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína dal de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria conserva su actividad enzimática. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 90% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 80% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 70% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 60% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 50% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 40% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 30% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 20% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 10% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dal retiene el 5% de la actividad de tipo natural. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por un gen de D-aminoácido aminotransferasa (dat). La síntesis de ácido D-glutámico está controlada en parte por el gen dat, que está involucrado en la conversión de D-glu pyr a alfa-cetoglutarato D-ala, y la reacción inversa.

En otro aspecto, un gen dat utilizado en la presente invención tiene la secuencia expuesta en el número de acceso de GenBank AF038439. En otro aspecto, el gen dat es cualquier otro gen dat conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

El gen dat de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria está codificado, en otro aspecto, por la secuencia: atgaaagtattagtaaataaccatttagttgaaagagaagatgccacagttgacattgaagaccgcggatatca gtttggtgatggtgtatatgaagtagttcgtctatataatggaaaattctttacttataatgaacacattgatcgcttatatgctagtgcagcaaaaattgacttagttattcctta ttccaaagaagagctacgtgaattacttgaaaaattagttgccgaaaataatatcaatacagggaatgtctatttacaagtgactcgtggtgttcaaaacccacgtaatc atgtaatccctgatgatttccctctagaaggcgttttaacagcagcagctcgtgaagtacctagaaacgagcgtcaattcgttgaaggtggaacggcgattacagaag aagatgtgcgctggttacgctgtgatattaagagcttaaaccttttaggaaatattctagcaaaaaataaagcacatcaacaaaatgctttggaagctattttacatcgcg gggaacaagtaacagaatgttctgcttcaaacgtttctattattaaagatggtgtattatggacgcatgcggcagataacttaatcttaaatggtatcactcgtcaagttatc attgatgttgcgaaaaagaatggcattcctgttaaagaagcggatttcactttaacagaccttcgtgaagcggatgaagtgttcatttcaagtacaactattgaaattaca cctattacgcatattgacggagttcaagtagctgacggaaaacgtggaccaattacagcgcaacttcatcaatattttgtagaagaaatcactcgtgcatgtggcgaatt agagtttgcaaaataa (SEQ ID N°: 44; n° de acceso de GenBank: AF038439). En otro aspecto, el nucleótido que codifica dat es homólogo a la SEQ ID N°: 44. En otro aspecto, el nucleótido que codifica dat es una variante de la SEQ ID N°: 44. En otro aspecto, el nucleótido que codifica dat es un fragmento de la SEQ ID N°: 44. En otro aspecto, la proteína dat está codificada por cualquier otro gen dat conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína dat tiene la secuencia: MKVLVNNHLVEREDATVDIEDRGYQFGDGVYEVVRLYNGKF FTYNEHIDRLYASAAKIDLVIPYSKEELRELLEKLVAENNINTGNVYLQVTRGVQNPRNHVIPDDFPLEGVLTAAAREVP RNERQFVEGGTAITEEDVRWLRCDIKSLNLLGNILAKNKAHQQNALEAILHRGEQVTECSASNVSIIKDGVLWTHAADN LILNGITRQVIIDVAKKNGIPVKEADFTLTDLREADEVFISSTTIEITPITHIDGVQVADGKRGPITAQLHQYFVEEITRACG ELEFAK (SEQ ID N°: 45; n° de acceso de GenBank: AF038439). En otro aspecto, la proteína dat es homóloga a la SEQ ID N°: 45. En otro aspecto, la proteína dat es una variante de la SEQ ID N°: 45. En otro aspecto, la proteína dat es un isómero de la SEQ ID N°: 45. En otro aspecto, la proteína dat es un fragmento de la SEQ ID N°: 45. En otro aspecto, la proteína dat es un fragmento de un homólogo de la SEQ ID N°: 45. En otro aspecto, la proteína dat es un fragmento de una variante de la SEQ ID N°: 45. En otro aspecto, la proteína dat es un fragmento de un isómero de la SEQ ID N°: 45.

En otro aspecto, la proteína dat es cualquier otra proteína dat de Listeria conocida en la técnica. En otro aspecto, la proteína dat es cualquier otra proteína dat grampositiva conocida en la técnica. En otro aspecto, la proteína dat es cualquier otra proteína dat conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la proteína dat de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria retiene su actividad enzimática. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 90% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 80% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 70% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 60% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 50% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 40% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 30% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 20% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 10% de la actividad de tipo natural. En otro aspecto, la proteína dat retiene el 5% de la actividad de tipo natural. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por dga. La síntesis de ácido D-glutámico también está controlada en parte por el gen dga, y un mutante auxotrófico para la síntesis de ácido D-glutámico no crecerá en ausencia de ácido D-glutámico (Pucci et al, 1995, J. Bacteriol. 177: 336-342). En otro sentido, la Listeria recombinante es auxotrófica para el ácido D-glutámico. Un ejemplo adicional incluye un gen involucrado en la síntesis del ácido diaminopimélico. Dichos genes de síntesis codifican la beta-semialdehído deshidrogenasa, y cuando se inactivan, hacen que un mutante sea auxotrófico para esta vía de síntesis (Sizemore et al, 1995, Science 270: 299-302). En otro aspecto, la proteína dga es cualquier otra proteína dga de Listeria conocida en la técnica. En otro aspecto, la proteína dga es cualquier otra proteína dga grampositiva conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por un gen air (alanina racemasa). En otro aspecto, la enzima metabólica es cualquier otra enzima conocida en la técnica que participa en la síntesis de alanina. En otro aspecto, la enzima metabólica es cualquier otra enzima conocida en la técnica que participa en la síntesis de L-alanina. En otro aspecto, la enzima metabólica es cualquier otra enzima conocida en la técnica que participa en la síntesis de D-alanina. En otro aspecto, la Listeria recombinante es auxotrófica para la D-alanina. Las bacterias auxotróficas para la síntesis de alanina son muy conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en E. coli (Strych et al, 2002, J. Bacteriol.

184: 4321-4325), Corynebacterium glutamicum (Tauch et al., 2002, J. Biotechnol 99: 79-91), y Listeria monocytogenes (Frankel et al., Patente de EE. UU. 6.099.848), género Lactococcus y género Lactobacillus (Bron et al, 2002, Appl Environ Microbiol, 68: 5663-70). En otro aspecto, cualquier gen de síntesis de D-alanina conocido en la técnica está inactivado. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la enzima metabólica es una aminoácido aminotransferasa.

En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por serC, una fosfoserina aminotransferasa. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por la asd (aspartato beta-semialdehído deshidrogenasa), que participa en la síntesis del ácido diaminopimélico de la pared celular. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por gsaB-glutamato-1-semialdehído aminotransferasa, que cataliza la formación de 5-aminolevulinato a partir de (S)-4-amino-5-oxopentanoato. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por HemL, que cataliza la formación de 5-aminolevulinato a partir de (S)-4-amino-5-oxopentanoato. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por aspB, una aspartato aminotransferasa que cataliza la formación de oxaloacetato y L-glutamato a partir de L-aspartato y 2-oxoglutarato. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por argF-1, involucrada en la biosíntesis de arginina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por aroE, involucrada en la biosíntesis de aminoácidos. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por aroB, involucrada en la biosíntesis de 3-deshidroquinato. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por aroD, involucrada en la biosíntesis de aminoácidos. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por aroC, involucrada en la biosíntesis de aminoácidos. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por hisB, involucrada en la biosíntesis de histidina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por hisD, involucrada en la biosíntesis de histidina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por hisG, involucrada en la biosíntesis de histidina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por metX, involucrada en la biosíntesis de metionina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por proB, involucrada en la biosíntesis de prolina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por argR, involucrada en la biosíntesis de arginina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por argJ, involucrada en la biosíntesis de arginina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por thiI, involucrada en la biosíntesis de tiamina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por LMOf2365_1652, involucrada en la biosíntesis de triptófano. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por aroA, involucrada en la biosíntesis de triptófano. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por ilvD, involucrada en la biosíntesis de valina e isoleucina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por ilvC, involucrada en la biosíntesis de valina e isoleucina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por leuA, involucrada en la biosíntesis de leucina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por dapF, involucrada en la biosíntesis de lisina. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por thrB, involucrada en la biosíntesis de treonina (todas con el n° de acceso de GenBank NC_002973).

En otro aspecto, la enzima metabólica es una ARNt sintetasa. En otro aspecto, la enzima metabólica está codificada por el gen trpS, que codifica la triptofanilo ARNt sintetasa. En otro aspecto, la enzima metabólica es cualquier otra ARNt sintetasa conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, una cepa de Listeria recombinante como se proporciona en la presente memoria se ha pasado a través de un huésped animal. En otro aspecto, el paso maximiza la eficacia de la cepa como vector de vacuna. En otro aspecto, el paso estabiliza la inmunogenicidad de la cepa de Listeria. En otro aspecto, el paso estabiliza la virulencia de la cepa de Listeria. En otro aspecto, el paso aumenta la inmunogenicidad de la cepa de Listeria. En otro aspecto, el paso aumenta la virulencia de la cepa de Listeria. En otro aspecto, el paso elimina las subcepas inestables de la cepa de Listeria. En otro aspecto, el paso reduce la prevalencia de las subcepas inestables de la cepa de Listeria. En otro aspecto, el paso atenúa la cepa, o, en otro aspecto, hace que la cepa sea menos virulenta. Los métodos para hacer pasar una cepa de Listeria recombinante a través de un huésped animal son muy conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos de n° de serie 10/541.614. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

La cepa de Listeria recombinante de la invención es, en otra realización, una cepa de Listeria monocytogenes recombinante. En otro aspecto, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria seeligeri recombinante. En otro aspecto, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria grayi recombinante. En otro aspecto, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria ivanovii recombinante. En otro aspecto, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria murrayi recombinante. En otro aspecto, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria welshimeri recombinante. En otro aspecto, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de cualquier otra especie de Listeria conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria. En otro aspecto, las secuencias de proteínas de Listeria para el uso en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria son de cualquiera de las cepas descritas anteriormente.

En un aspecto, una cepa de Listeria monocytogenes, como se proporciona en la presente memoria, es la cepa EGD, la cepa 10403S, la cepa NICPBP 54002, la cepa S3, la cepa NCTC 5348, la cepa NICPBP 54006, la cepa M7, la cepa S19 u otra cepa de Listeria monocytogenes que se conoce en la técnica.

En otro aspecto, la cepa de Listeria recombinante es una cepa de vacuna, que, en un aspecto, es una cepa de vacuna bacteriana.

En un aspecto, una vacuna es una composición que provoca una respuesta inmune a un antígeno o polipéptido de la composición como resultado de la exposición a la composición. En otro aspecto, la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante, citocina, quimiocina o una combinación de los mismos. En otro aspecto, la vacuna o composición comprende adicionalmente células presentadoras de antígenos (APC), que en un aspecto son autólogas, mientras que, en otro aspecto, son alogénicas para el sujeto.

En un aspecto, una "vacuna" es una composición que provoca una respuesta inmune en un huésped a un antígeno o polipéptido de la composición como resultado de la exposición a la composición. En un aspecto, la respuesta inmune es a un antígeno particular o a un epítopo particular del antígeno. En un aspecto, la vacuna puede ser una vacuna peptídica, en otro aspecto, una vacuna de ADN. En otro aspecto, la vacuna puede estar contenida dentro y, en otro aspecto, se puede administrar mediante, una célula, que en un aspecto es una célula bacteriana, que en un aspecto es una Listeria. En un aspecto, una vacuna puede evitar que un sujeto contraiga o desarrolle una enfermedad o afección, en el que, en otro aspecto, una vacuna puede ser terapéutica para un sujeto que tiene una enfermedad o afección. En un aspecto, una vacuna descrita en la presente memoria comprende una composición descrita en la presente memoria y un adyuvante, citocina, quimiocina o una combinación de los mismos.

La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una Listeria recombinante de la presente invención. En otro aspecto, la composición inmunogénica de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende un vector de vacuna recombinante descrito en la presente memoria. En otro aspecto, la composición inmunogénica comprende un plásmido descrito en la presente memoria. La composición inmunogénica de la presente invención comprende un adyuvante. En un aspecto, un vector descrito en la presente memoria puede administrarse como parte de una composición de vacuna. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de la presente descripción.

En otro aspecto, una vacuna descrita en la presente memoria se administra con un adyuvante. En un aspecto, el adyuvante favorece una respuesta inmune predominantemente mediada por Th1. En otro aspecto, el adyuvante favorece una respuesta inmune de tipo Th1. En otro aspecto, el adyuvante favorece una respuesta inmune mediada por Th1. En otro aspecto, el adyuvante favorece una respuesta inmune mediada por células sobre una respuesta mediada por anticuerpos. En otro aspecto, el adyuvante es cualquier otro tipo de adyuvante conocido en la técnica. En otro aspecto, la composición inmunogénica induce la formación de una respuesta inmune de células T contra la proteína objetivo.

En otro aspecto, el adyuvante es MPL. En otra realización, el adyuvante es QS21. En otro aspecto, el adyuvante es un agonista de TLR. En otro aspecto, el adyuvante es un agonista de TLR4. En otro aspecto, el adyuvante es un agonista de TLR9. En otro aspecto, el adyuvante es Resiquimod®. En otro aspecto, el adyuvante es imiquimod. En otro aspecto, el adyuvante es un oligonucleótido CpG. En otro aspecto, el adyuvante es una citocina o un ácido nucleico que codifica la misma. En otro aspecto, el adyuvante es una quimiocina o un ácido nucleico que codifica la misma. En otro aspecto, el adyuvante es IL-12 o un ácido nucleico que codifica la misma. En otro aspecto, el adyuvante es IL-6 o un ácido nucleico que codifica la misma. En otro aspecto, el adyuvante es un lipopolisacárido. En otro aspecto, el adyuvante es como se describe en Fundamental Immunology, 5a ed. (Agosto de 2003): William E. Paul (Editor); Lippincott Williams & Wilkins Publishers; Capítulo 43: Vacunas, GJV Nossal. En otro aspecto, el adyuvante es cualquier otro adyuvante conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En una realización, en la presente memoria se proporciona una cepa de Listeria de la invención para el uso en la inducción de una respuesta inmune al PSA en un sujeto. En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para inducir una respuesta inmune anti-angiogénica a un antígeno en un sujeto que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto. En otro aspecto, dicha cepa de Listeria recombinante comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico. En otro aspecto, cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifica un antígeno heterólogo. En otro aspecto más, dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST.

En una realización, en la presente memoria se proporciona una cepa de Listeria de la invención para el uso en el tratamiento, la supresión o inhibición de un cáncer o un tumor en un sujeto. En otro aspecto, dicha cepa de Listeria recombinante comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico. En otro aspecto, cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifica un antígeno heterólogo. En otro aspecto más, dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, al menos uno de dichos antígenos se expresa en al menos una célula de dichas células cancerosas.

En una realización, en la presente memoria se proporciona una cepa de Listeria de la invención para el uso en la prevención o el retraso de la aparición de un cáncer en un sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para retrasar la progresión hasta un cáncer en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para prolongar la remisión de un cáncer en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para disminuir el tamaño de un tumor existente en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para prevenir el crecimiento de un tumor existente en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para prevenir el crecimiento de tumores nuevos o adicionales en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto.

En un aspecto, el cáncer o los tumores se pueden prevenir en poblaciones específicas que se sabe que son susceptibles a un cáncer o un tumor en particular. En un aspecto, tal susceptibilidad puede deberse a factores ambientales, como el tabaquismo, que, en un aspecto, puede provocar que una población esté sujeta al cáncer de pulmón, mientras que, en otro aspecto, tal susceptibilidad puede deberse a factores genéticos, por ejemplo la población con mutaciones BRCA1/2 puede ser susceptible, en un aspecto, al cáncer de mama, y, en otro aspecto, al cáncer de ovario. En otro aspecto, una o más mutaciones en el cromosoma 8q24, el cromosoma 17q12 y el cromosoma 17q24.3 pueden aumentar la susceptibilidad al cáncer de próstata, como se conoce en la técnica. Otros factores genéticos y ambientales que contribuyen a la susceptibilidad al cáncer son conocidos en la técnica.

En otro aspecto, un método descrito en la presente memoria comprende además la etapa de reforzar al sujeto humano con una cepa de Listeria recombinante como se proporciona en la presente memoria. En otro aspecto, la cepa de Listeria recombinante usada en la inoculación de refuerzo es la misma que la cepa usada en la inoculación inicial de "sensibilización". En otro aspecto, la cepa de refuerzo es diferente de la cepa de sensibilización. En otro aspecto, se usan las mismas dosis en las inoculaciones de sensibilización y refuerzo. En otro aspecto, se usa una dosis mayor en el refuerzo. En otro aspecto, se usa una dosis menor en el refuerzo. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica un antígeno prostático específico (PSA), y el método es para tratar, inhibir o suprimir el cáncer de próstata. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica PSA y el método es para tratar, inhibir o suprimir el cáncer de ovario. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica PSA y el método es para tratar, inhibir o suprimir la metástasis del cáncer de próstata, que en un aspecto comprende la metástasis en el hueso, y en otro aspecto, la metástasis en otros órganos. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica PSA y el método es para tratar, inhibir o suprimir la metástasis del cáncer de próstata en los huesos. En otro aspecto más, el método es para tratar, inhibir o suprimir la metástasis del cáncer de próstata en otros órganos. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica PSA y el método es para tratar, inhibir o suprimir el cáncer de mama. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica PSA y el método es para tratar, inhibir o suprimir el cáncer de ovario y de mama.

En un aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica un antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) y el método es para tratar, inhibir o suprimir el melanoma. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir el cáncer de mama. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir el cáncer de ovario. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir las lesiones de nevos benignos. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir el carcinoma de células basales. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir un tumor de origen de la cresta neural, que, en un aspecto, es un astrocitoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma o una combinación de los mismos. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir una leucemia infantil, que, en un aspecto, es leucemia linfoblástica aguda infantil, y, en otro aspecto, es leucemia mieloide aguda infantil (que, en un aspecto, es leucemia mielógena aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielocítica aguda o leucemia no linfocítica aguda) y, en otro aspecto, es leucemia linfocítica aguda (que, en un aspecto, se llama leucemia linfoblástica aguda, y, en otro aspecto, es leucemia mielógena aguda (también llamada leucemia mieloide aguda, leucemia mielocítica aguda o leucemia no linfocítica aguda) y, en otro aspecto, es la leucemia de linaje híbrido o mixto. En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir la leucemia mielógena crónica o la leucemia mielomonocítica juvenil (JMML). En otro aspecto, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico codifica HMW-MAA y el método es para tratar, inhibir o suprimir las lesiones de carcinoma de mama lobulillar.

El cáncer que es el objetivo de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria es, en otro aspecto, un melanoma. En otro aspecto, el cáncer es un sarcoma. En otro aspecto, el cáncer es un carcinoma. En otro aspecto, el cáncer es un mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma maligno). En otro aspecto, el cáncer es un glioma. En otro aspecto, el cáncer es un tumor de células germinales. En otro aspecto, el cáncer es un coriocarcinoma.

En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de páncreas. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de ovario. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer gástrico. En otro aspecto, el cáncer es una lesión carcinomatosa del páncreas. En otro aspecto, el cáncer es un adenocarcinoma pulmonar. En otro aspecto, el cáncer es un adenocarcinoma colorrectal. En otro aspecto, el cáncer es un adenocarcinoma escamoso pulmonar. En otro aspecto, el cáncer es un adenocarcinoma gástrico. En otro aspecto, el cáncer es una neoplasia epitelial superficial ovárica (por ejemplo, una variedad benigna, proliferativa o maligna de la misma). En otro aspecto, el cáncer es un carcinoma oral de células escamosas. En otro aspecto, el cáncer es un carcinoma pulmonar no microcítico. En otro aspecto, el cáncer es un carcinoma endometrial. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de vejiga. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de cabeza y cuello. En otro aspecto, el cáncer es un carcinoma de próstata.

En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC). En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de colon. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de pulmón. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de ovario. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer uterino. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de tiroides. En otro aspecto, el cáncer es un carcinoma hepatocelular. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de tiroides. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer de hígado. En otro aspecto, el cáncer es un cáncer renal. En otro aspecto, el cáncer es un sarcoma de Kaposi. En otro aspecto, el cáncer es un sarcoma. En otro aspecto, el cáncer es otro carcinoma o sarcoma. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, las composiciones y los métodos que se proporcionan en la presente memoria pueden usarse para tratar tumores sólidos relacionados con o resultantes de cualquiera de los cánceres que se describieron anteriormente en la presente memoria. En otro aspecto, el tumor es un tumor de Wilms. En otro aspecto, el tumor es un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para impedir la angiogénesis de un tumor sólido en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una Listeria recombinante que codifica un antígeno heterólogo. En otro aspecto, el antígeno es HMW-MAA. En otro aspecto, el antígeno es el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). En otro aspecto, el antígeno es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En otro aspecto, el antígeno es cualquier otro antígeno que se sabe en la técnica que está implicado en la angiogénesis. En otro aspecto, los métodos y las composiciones para impedir la angiogénesis de un tumor sólido en un sujeto, como se proporciona en la presente memoria, comprenden administrar al sujeto una composición que comprende una Listeria recombinante que codifica dos antígenos heterólogos. En otro aspecto, uno de los dos antígenos heterólogos es HMW-MAA. En otro aspecto, el antígeno es cualquier otro antígeno que se sabe en la técnica que está implicado en la angiogénesis. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

Los métodos para evaluar la eficacia de las vacunas contra el cáncer de próstata son muy conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Dzojic H et al. (Adenovirus-mediated CD40 ligand therapy induces tumor cell apoptosis and systemic immunity in the TRAMP-C2 mouse prostate cancer model. Prostate. 1 de junio de 2006; 66 (8): 831-8), Naruishi K et al. (Adenoviral vector- mediated RTVP-1 gene-modified tumor cell-based vaccine suppresses the development of experimental prostate cancer. Cancer Gene Ther. julio de 2006; 13 (7): 658-63), Sehgal I et al (Cancer Cell Int. 23 de agosto de 2006; 6: 21), y Heinrich JE et al (Vaccination against prostate cancer using a live tissue factor deficient cell line in Lobund-Wistar rats. Cancer Immunol Immunother 2007; 56 (5): 725-30). Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En otro aspecto, el modelo de cáncer de próstata usado para probar los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria es el modelo de ratón TPSA23 (derivado de la línea celular TRAMP-C1 que expresa de manera estable PSA). En otro aspecto, el modelo de cáncer de próstata es un modelo de células 178-2 BMA. En otro aspecto, el modelo de cáncer de próstata es un modelo de células de adenocarcinoma PAIII. En otro aspecto, el modelo de cáncer de próstata es un modelo PC-3M. En otro aspecto, el modelo de cáncer de próstata es cualquier otro modelo de cáncer de próstata conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la vacuna se prueba en sujetos humanos y la eficacia se controla mediante métodos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo directamente las respuestas de las células T CD4+ y CD8+, o midiendo la progresión de la enfermedad, por ejemplo, determinando el número o el tamaño de las metástasis del tumor, o monitorizando los síntomas de la enfermedad (tos, dolor torácico, pérdida de peso, etc.). Los métodos para evaluar la eficacia de una vacuna contra el cáncer de próstata en sujetos humanos son muy conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Uenaka A et al (T cell immunomonitoring and tumor responses in patients immunized with a complex of cholesterol-bearing hydrophobized pullulan (CHP) and NY-ESO-1 protein. Cancer Immun. 19 de abril de 2007; 7:9) y Thomas-Kaskel AK et al. (Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptideloaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival. Int J Cancer. 15 de noviembre de 2006; 119(10): 2428-34). Cada método representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para tratar la hiperplasia benigna de próstata (BPH) en un sujeto. Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para tratar la neoplasia intraepitelial prostética (PIN) en un sujeto.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico integrada de forma operable en el genoma de Listeria. En otro aspecto, dicha molécula de ácido nucleico codifica (a) un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST y (b) un polipéptido que comprende un antígeno en un marco de lectura abierto.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para tratar, suprimir o inhibir al menos un tumor en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto. En otro aspecto, dicha cepa de Listeria recombinante comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico. En otro aspecto, cada una de dichas moléculas de ácido nucleico codifica un antígeno heterólogo. En otro aspecto, dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con un polipéptido nativo que comprende una secuencia PEST y en la que dicho antígeno se expresa en al menos una célula de dicho tumor.

En un aspecto, "antígeno" se usa en la presente memoria para referirse a una sustancia que cuando se pone en contacto con un organismo, da como resultado una respuesta inmune detectable del organismo. Un antígeno puede ser un lípido, péptido, proteína, carbohidrato, ácido nucleico, o combinaciones y variaciones de los mismos.

En un aspecto, "variante" se refiere a un aminoácido o secuencia de ácido nucleico (o en otros aspectos, un organismo o tejido) que es diferente de la mayoría de la población, pero aún es lo suficientemente similar a la modalidad común como para ser considerado uno de ellos, por ejemplo, las variantes de corte y empalme.

En un aspecto, "isoforma" se refiere a una versión de una molécula, por ejemplo, una proteína, con solo pequeñas diferencias en comparación con otra isoforma, o versión, de la misma proteína. En un aspecto, las isoformas pueden producirse a partir de genes diferentes pero relacionados, o, en otro aspecto, pueden surgir del mismo gen mediante un corte y empalme alternativo. En otro aspecto, las isoformas están provocadas por polimorfismos de un solo nucleótido.

En un aspecto, "fragmento" se refiere a una proteína o polipéptido que es más corto o comprende menos aminoácidos que la proteína o polipéptido de longitud completa. En otro aspecto, el fragmento se refiere a un ácido nucleico que es más corto o comprende menos nucleótidos que el ácido nucleico de longitud completa. En otro aspecto, el fragmento es un fragmento N-terminal. En otro aspecto, el fragmento es un fragmento C-terminal. En un aspecto, el fragmento es una sección intrasecuencial de la proteína, péptido o ácido nucleico. En un aspecto, el fragmento es un fragmento funcional. En otro aspecto, el fragmento es un fragmento inmunogénico. En un aspecto, un fragmento tiene 10-20 nucleótidos o aminoácidos, mientras que en otro aspecto un fragmento tiene más de 5 nucleótidos o aminoácidos, mientras que en otro aspecto un fragmento tiene 100-200 nucleótidos o aminoácidos, mientras que en otro aspecto un fragmento tiene 100-500 nucleótidos o aminoácidos, mientras que en otro aspecto un fragmento tiene 50-200 nucleótidos o aminoácidos, mientras que en otro aspecto un fragmento tiene 10-250 nucleótidos o aminoácidos.

En un aspecto, "inmunogenicidad" o "inmunogénico" se usa en la presente memoria para referirse a la capacidad innata de una proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo de provocar una respuesta inmune en un animal cuando la proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo se administra al animal. Por lo tanto, "mejorar la inmunogenicidad", en un aspecto, se refiere a aumentar la capacidad de una proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo de provocar una respuesta inmunitaria en un animal cuando se administra la proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo a un animal. El aumento de la capacidad de una proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo de provocar una respuesta inmunitaria puede medirse, en un aspecto, por un mayor número de anticuerpos contra una proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo, una mayor diversidad de anticuerpos contra un antígeno u organismo, un mayor número de células T específicas de una proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo, una mayor respuesta de células T citotóxicas o auxiliares a una proteína, péptido, ácido nucleico, antígeno u organismo, y similares.

En un aspecto, un "homólogo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico o aminoácido que comparte un cierto porcentaje de identidad de secuencia con una secuencia particular de ácido nucleico o aminoácidos. En un aspecto, una secuencia útil en la composición y los métodos que se proporcionan en la presente memoria puede ser un homólogo de una secuencia de LLO particular o un fragmento N-terminal de la misma, una secuencia de ActA o un fragmento N-terminal de la misma, o una secuencia de tipo PEST descrita en la presente memoria o conocida en la técnica. En otro aspecto, una secuencia útil en la composición y los métodos que se proporcionan en la presente memoria puede ser un homólogo de un polipéptido antigénico, que, en un aspecto, es KLK3 o HMW-MAA o un fragmento funcional de los mismos. En un aspecto, un homólogo de un polipéptido y, en un aspecto, el ácido nucleico que codifica dicho homólogo, descrito en la presente memoria mantiene las características funcionales del polipéptido original. Por ejemplo, en un aspecto, un homólogo de un polipéptido antigénico descrito en la presente memoria mantiene la característica antigénica del polipéptido original. En otro aspecto, una secuencia útil en la composición y los métodos proporcionados en la presente memoria puede ser un homólogo de cualquier secuencia descrita en la presente memoria. En un aspecto, un homólogo comparte al menos un 70% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 72% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 75% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 78% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 80% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 82% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 83% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 85% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 87% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 88% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 90% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 92% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 93% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 95% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 96% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 97% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 98% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte al menos un 99% de identidad con una secuencia particular. En otro aspecto, un homólogo comparte una identidad del 100% con una secuencia particular. Cada posibilidad representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

En un aspecto, debe entenderse que un homólogo de cualquiera de las secuencias que se proporcionan en la presente memoria y/o que se describen en la presente memoria se considera parte de la descripción.

En un aspecto, "funcional", dentro del significado de la descripción, se usa en la presente memoria para referirse a la capacidad innata de una proteína, péptido, ácido nucleico, fragmento o una variante de los mismos de exhibir una actividad o función biológica. En un aspecto, tal función biológica es su propiedad de unión a una molécula de interacción, por ejemplo, un receptor asociado a la membrana, y, en otro aspecto, su propiedad de trimerización. En el caso de los fragmentos funcionales y las variantes funcionales descritas en la presente memoria, estas funciones biológicas se pueden cambiar, por ejemplo, con respecto a su especificidad o selectividad, pero con la retención de la función biológica básica.

En un aspecto, "tratar" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o disminuir la afección o trastorno patológico objetivo como se describe en la presente memoria. Por lo tanto, en un aspecto, el tratamiento puede incluir afectar o curar directamente, suprimir, inhibir, prevenir, reducir la gravedad, retrasar la aparición, reducir los síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o afección, o una combinación de los mismos. Por lo tanto, en un aspecto, "tratar" se refiere, entre otras cosas, a retrasar la progresión, acelerar la remisión, inducir la remisión, aumentar la remisión, acelerar la recuperación, aumentar la eficacia o disminuir la resistencia a terapias alternativas, o una combinación de ellas. En un aspecto, "prevenir" o "impedir" se refiere, entre otras cosas, a retrasar la aparición de los síntomas, prevenir la recaída de una enfermedad, disminuir el número o la frecuencia de los episodios de recaída, aumentar la latencia entre los episodios sintomáticos o una combinación de los mismos. En un aspecto, "suprimir" o "inhibir" se refiere, entre otras cosas, a reducir la gravedad de los síntomas, reducir la gravedad de un episodio agudo, reducir el número de síntomas, reducir la incidencia de síntomas relacionados con la enfermedad, reducir la latencia de los síntomas, mejorar los síntomas, reducir los síntomas secundarios, reducir las infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente o una combinación de los mismos.

En un aspecto, los síntomas son primarios, mientras que, en otro aspecto, los síntomas son secundarios. En un aspecto, "primario" se refiere a un síntoma que es un resultado directo de una enfermedad o trastorno particular, mientras que, en un aspecto, "secundario" se refiere a un síntoma que procede o es consecuencia de una causa primaria. En un aspecto, los compuestos para el uso como se describe en la presente memoria tratan síntomas primarios o secundarios o complicaciones secundarias. En otro aspecto, los "síntomas" pueden ser cualquier manifestación de una enfermedad o afección patológica.

En algunos aspectos, el término "que comprende" se refiere a la inclusión de otros polipéptidos recombinantes, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico, así como a la inclusión de otros polipéptidos, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico, que se pueden conocer en la técnica, que en un aspecto pueden comprender antígenos o polipéptidos de Listeria, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a una composición para el uso en los métodos que se proporcionan en la presente memoria, que tiene el polipéptido recombinante específico, la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico, o un fragmento del mismo. Sin embargo, se pueden incluir otros polipéptidos, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico que no están directamente involucrados en la utilidad de el/los polipéptido(s) recombinante(s). En algunos aspectos, el término "que consiste" se refiere a una composición para el uso en los métodos que se proporcionan en la presente memoria que tienen un polipéptido recombinante, secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico particular, o fragmento o combinación de polipéptidos recombinantes, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico o fragmentos como se proporcionan en la presente memoria, en cualquier forma o aspecto como se describe en la presente memoria.

En un aspecto, las composiciones para el uso en los métodos que se proporcionan en la presente memoria se administran por vía intravenosa. En otro aspecto, la vacuna se administra por vía oral, mientras que, en otro aspecto, la vacuna se administra por vía parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular y similares).

Además, en otro aspecto, las composiciones o vacunas se administran como un supositorio, por ejemplo, un supositorio rectal o un supositorio uretral. Además, en otro aspecto, las composiciones farmacéuticas se administran mediante la implantación subcutánea de una esfera. En un aspecto adicional, el sedimento proporciona la liberación controlada de un agente a lo largo de un período de tiempo. En otro aspecto más, las composiciones farmacéuticas se administran en forma de una cápsula.

En un aspecto, la vía de administración puede ser parenteral. En otro aspecto, la vía puede ser intraocular, conjuntival, tópica, transdérmica, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, vaginal, rectal, intratumoral, parcanceral, transmucosa, intramuscular, intravascular, intraventricular, intracraneal, por inhalación (aerosol), aspiración nasal (espray), intranasal (gotas), sublingual, oral, en aerosol o supositorio o una combinación de los mismos. Para la administración intranasal o la aplicación por inhalación, son adecuadas las disoluciones o suspensiones de los compuestos mezclados y en aerosol o nebulizados en presencia del vehículo apropiado. Dicho aerosol puede comprender cualquier agente descrito en la presente memoria. En un aspecto, las composiciones que se exponen en la presente memoria pueden estar en una forma adecuada para la administración intracraneal, que, en un aspecto, es administración intratecal e intracerebroventricular. En un aspecto, el régimen de administración lo determinarán médicos expertos, según factores tales como la naturaleza exacta de la afección que se está tratando, la gravedad de la afección, la edad y el estado físico general del paciente, el peso corporal y la respuesta del paciente individual, etc.

En un aspecto, la aplicación parenteral, particularmente adecuada, son soluciones inyectables, estériles, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, así como suspensiones, emulsiones o implantes, que incluyen los supositorios y enemas. Las ampollas son dosis unitarias convenientes. Dicho supositorio puede comprender cualquier agente descrito en la presente memoria.

En un aspecto, pueden formularse composiciones de liberación sostenida o dirigida, por ejemplo, liposomas o aquellos en los que el compuesto activo está protegido con recubrimientos diferencialmente degradables, por ejemplo, mediante microencapsulación, recubrimientos múltiples, etc. Dichas composiciones pueden formularse para la liberación inmediata o lenta. También es posible liofilizar los nuevos compuestos y utilizar los liofilizados obtenidos, por ejemplo, para la preparación de productos para inyección.

En un aspecto, para las formulaciones líquidas, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, emulsiones o aceites. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen medios salinos y tamponados. Los ejemplos de aceites son los de petróleo, animales, vegetales o de origen sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de oliva, aceite de girasol y aceite de hígado de pescado.

En un aspecto, las composiciones de esta invención son farmacéuticamente aceptables. En un aspecto, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier formulación que sea segura y proporcione el suministro apropiado para la vía de administración deseada de una cantidad eficaz de al menos un compuesto para el uso en la presente invención. Este término también se refiere al uso de formulaciones tamponadas, en donde el pH se mantiene en un valor particular deseado, que va desde pH 4,0 a pH 9,0, de acuerdo con la estabilidad de los compuestos y la vía de administración.

En un aspecto, una composición de la invención o usada en los métodos descritos en la presente memoria puede administrarse sola o dentro de una composición. En otro aspecto, las composiciones de esta invención se pueden mezclar con excipientes convencionales, es decir, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para la aplicación parenteral, enteral (por ejemplo, oral) o tópica que no reaccionan de manera perjudicial con los compuestos activos. En un aspecto, los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, entre otros, agua, soluciones salinas, alcoholes, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, parafina blanca, glicerol, alginatos, ácido hialurónico, colágeno, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos y pentaeritritol, hidroxi metilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. En otro aspecto, las preparaciones farmacéuticas se pueden esterilizar y, si se desea, mezclarlas con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan de forma perjudicial con los compuestos activos. En otro aspecto, también pueden combinarse cuando se desee con otros agentes activos, por ejemplo, vitaminas.

En un aspecto, las composiciones para el uso de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria pueden administrarse con un vehículo/diluyente. Los vehículos/diluyentes sólidos incluyen, pero sin limitación, una goma, un almidón (por ejemplo, almidón de maíz, almidón pregelatinizado), un azúcar (por ejemplo, lactosa, manitol, sacarosa, dextrosa), un material celulósico (por ejemplo, celulosa microcristalina), un acrilato (p. ej., polimetilacrilato), carbonato de calcio, óxido de magnesio, talco o mezclas de los mismos.

En un aspecto, las composiciones de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria pueden comprender la composición de esta invención y uno o más compuestos adicionales eficaces para prevenir o tratar el cáncer. En algunos aspectos, el compuesto adicional puede comprender un compuesto útil en quimioterapia, que, en un aspecto, es cisplatino. En otro aspecto, se puede administrar Ifosfamida, Fluorouracilo 5-FU, Irinotecano, Paclitaxel (Taxol), Docetaxel, Gemcitabina, Topotecano o una combinación de los mismos, con una composición que se proporciona en la presente memoria para el uso en los métodos que se proporcionan en la presente memoria. En otro aspecto, puede administrarse Amsacrina, Bleomicina, Busulfán, Capecitabina, Carboplatino, Carmustina, Clorambucilo, Cisplatino, Cladribina, Clofarabina, Crisantaspasa, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etopósido, Fludarabina, Fluorouracilo, Gemcitabina, implantes de Gliadel, Hidroxicarbamida, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Leucovorina, doxorrubicina liposomal, daunorrubicina liposomal, Lomustina, Melfalano, Mercaptopurina, Mesna, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Pemetrexed, Pentostatina, Procarbazina, Raltitrexed, Satraplatino, Streptozocina, Tegafur-uracilo, Temozolomida, Tenipósido, Tiotepa, Tioguanina, Topotecán, Treosulfán, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, o una combinación de los mismos, con una composición que se proporciona en la presente memoria para su uso en los métodos que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, las proteínas de fusión que se proporcionan en la presente memoria se preparan mediante un proceso que comprende la subclonación de secuencias apropiadas, seguido de la expresión del nucleótido resultante. En otro aspecto, las subsecuencias se clonan y las subsecuencias apropiadas se escinden utilizando enzimas de restricción apropiadas. Los fragmentos se ligan luego, en otro aspecto, para producir la secuencia de ADN deseada. En otro aspecto, el ADN que codifica la proteína de fusión se produce utilizando métodos de amplificación de ADN, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Primero, se amplifican los segmentos del ADN nativo a ambos lados del nuevo extremo por separado. El extremo 5' de una secuencia amplificada codifica el enlazador peptídico, mientras que el extremo 3' de la otra secuencia amplificada también codifica el enlazador peptídico. Dado que el extremo 5' del primer fragmento es complementario al extremo 3' del segundo fragmento, los dos fragmentos (después de la purificación parcial, por ejemplo, en agarosa LMP) se pueden usar como un molde solapante en una tercera reacción de PCR. La secuencia amplificada contendrá codones, el segmento en el lado carboxiterminal del sitio de apertura (que ahora forma la secuencia amino), el enlazador y la secuencia del lado amino del sitio de apertura (que ahora forma la secuencia carboxilo). El inserto se liga después en un plásmido. En otro aspecto, se usa una estrategia similar para producir una proteína en la que un fragmento de HMW-MAA está incrustado dentro de un péptido heterólogo.

Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona una Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en el que dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una Listeria recombinante capaz de expresar y secretar dos antígenos heterólogos distintos que comprenden un primer antígeno que se integra de forma operable en el genoma como un marco de lectura abierto con un primer polipéptido o un fragmento del mismo que comprende una secuencia PEST y un segundo antígeno que se integra de forma operable en el genoma como un marco de lectura abierto con un segundo polipéptido o fragmento del mismo que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, dicho primer o segundo polipéptido o fragmento del mismo es ActA, o LlO. En otro aspecto, dicho primer o segundo antígeno es un antígeno asociado a un tumor de próstata (PSA), o un antígeno asociado a melanoma con alto peso molecular (HMW-MAA). En otro aspecto, dicho fragmento es un fragmento inmunogénico. En otro aspecto más, dicho vector de expresión episomal carece de un marcador de resistencia a antibióticos.

En otro aspecto, el primer y segundo antígeno son distintos. En otro aspecto, dichos primer y segundo antígenos se expresan de manera concomitante. En otro aspecto, dicho primer o segundo antígeno se expresan al mismo nivel. En otro aspecto, dicho primer o segundo antígeno se expresan de manera diferencial. En otro aspecto, la expresión de genes o proteínas se determina mediante métodos que son muy conocidos en la técnica, que, en otro aspecto, comprenden PCR en tiempo real, transferencia de Northern, inmunotransferencia, etc. En otro aspecto, dicha expresión del primer o segundo antígeno está controlada por un sistema inducible, mientras que, en otro aspecto, dicha expresión del primer o segundo antígeno está controlada por un promotor constitutivo. En otro aspecto, los sistemas de expresión inducibles son muy conocidos en la técnica.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para preparar una Listeria recombinante capaz de expresar y secretar dos antígenos heterólogos distintos que seleccionan como objetivo las células tumorales y la angiogénesis de manera concomitante. En otro aspecto, dicho método para preparar dicha Listeria recombinante comprende las etapas de fusionar genéticamente un primer antígeno en el genoma que está unido de forma operable a un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido o fragmento del mismo que comprende una secuencia PEST, y transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que codifica un segundo antígeno que está unido de forma operable a un marco de lectura abierto que codifica un segundo polipéptido o fragmento del mismo que comprende una secuencia PEST. En otro aspecto, dicho método para preparar dicha Listeria recombinante comprende las etapas de fusionar genéticamente un primer antígeno en el genoma que está unido de forma operable a un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido o fragmento del mismo que comprende una secuencia PEST, y fusionar genéticamente un segundo antígeno que está unido de forma operable a un marco de lectura abierto que codifica un segundo polipéptido o fragmento del mismo que comprende una secuencia PEST.

Los métodos para transformar bacterias son muy conocidos en la técnica, e incluyen métodos basados en células competentes con cloruro de calcio, métodos de electroporación, transducción mediada por bacteriófagos, técnicas de transformación química y física (de Boer et al, 1989, Cell 56: 641-649; Miller et al, 1995, FASEB J., 9: 190-199; Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York; Gerhardt et al., Eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC; Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). En otro aspecto, la cepa de vacuna de Listeria que se proporciona en la presente memoria se transforma mediante electroporación. Cada método representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria hacia un antígeno en un sujeto, que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante a dicho sujeto, en donde dicha cepa de Listeria recombinante comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica un polipéptido antigénico heterólogo o fragmento del mismo, en el que dicha primera molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria como un marco de lectura abierto con un ácido nucleico que codifica un polipéptido endógeno que comprende una secuencia PEST.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para inhibir la aparición del cáncer, y dicho método comprende la etapa de administrar una composición de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos expresados específicamente en dicho cáncer.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para tratar un primer y un segundo tumor en un sujeto, y dicho método comprende la etapa de administrar una composición de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos expresados específicamente en dicho primer y segundo tumor.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para mejorar los síntomas que están asociados con un cáncer en un sujeto, y dicho método comprende la etapa de administrar una composición de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos expresados específicamente en dicho cáncer.

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para proteger a un sujeto del cáncer, y dicho método comprende la etapa de administrar una composición de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos expresados específicamente en dicho cáncer.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para retrasar la aparición del cáncer, y dicho método comprende la etapa de administrar una composición de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos expresados específicamente en dicho cáncer. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para tratar el cáncer metastásico, y dicho método comprende la etapa de administrar una composición de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos expresados específicamente en dicho cáncer. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para prevenir el cáncer metastásico o la micrometástasis, y dicho método comprende la etapa de administrar una composición de Listeria recombinante que expresa dos antígenos heterólogos distintos expresados específicamente en dicho cáncer. En otro aspecto, la composición de Listeria recombinante se administra por vía oral o parenteral.

Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para producir una cepa de Listeria recombinante que expresa dos antígenos, y el método comprende: (a) fusionar genéticamente un primer ácido nucleico que codifica un primer antígeno en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno; (b) transformar dicha Listeria recombinante con un vector de expresión episomal que comprende un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno; y (c) expresar dichos primer y segundo antígenos en condiciones conducentes a la expresión antigénica en dicha cepa de Listeria recombinante. Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para producir una cepa de Listeria recombinante que expresa dos antígenos, y el método comprende: (a) fusionar genéticamente un primer ácido nucleico que codifica un primer antígeno y un segundo ácido nucleico que codifica un segundo antígeno en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno; y (b) expresar dichos primer y segundo antígenos en condiciones conducentes a la expresión antigénica en dicha cepa de Listeria recombinante. En un aspecto, la fusión genética es mediante recombinación homóloga, como se describe en la presente memoria. En un aspecto, las condiciones que conducen a la expresión antigénica se conocen en la técnica.

En otro aspecto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria, "ácidos nucleicos" o "nucleótido" se refiere a una cadena de al menos dos combinaciones de base-azúcar-fosfato. El término incluye, en un aspecto, ADN y ARN. "Nucleótidos" se refiere, en un aspecto, a las unidades monoméricas de los polímeros de ácido nucleico. El ARN puede estar, en un aspecto, en forma de un ARNt (ARN de transferencia), ARNsn (ARN nuclear pequeño), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero), ARN inverso, ARN inhibitorio pequeño (siARN), micro ARN (miARN) y ribozimas. Se ha descrito el uso de siARN y miARN (Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96 y las referencias citadas en ese documento). El ADN puede estar en forma de ADN plasmídico, ADN viral, ADN lineal o ADN cromosómico o derivados de estos grupos. Además, estas formas de ADN y ARN pueden ser de cadena simple, doble, triple o cuádruple. El término también incluye, en otro aspecto, ácidos nucleicos artificiales que pueden contener otros tipos de esqueletos pero las mismas bases. En un aspecto, el ácido nucleico artificial es un APN (ácido peptidonucleico). Los APN contienen esqueletos peptídicos y bases de nucleótidos y son capaces de unirse, en un aspecto, tanto a las moléculas de ADN como a las de ARN. En otro aspecto, el nucleótido está modificado con oxetano. En otro aspecto, el nucleótido se modifica mediante la sustitución de uno o más enlaces fosfodiéster con un enlace fosforotioato. En otro aspecto, el ácido nucleico artificial contiene cualquier otra variante del esqueleto de fosfato de los ácidos nucleicos nativos conocida en la técnica. Los expertos en la técnica conocen el uso de ácidos nucleicos de fosfotiorato y APN, y se describe, por ejemplo, en Neilsen Pe , Curr Opin Struct Biol 9: 353-57; y Raz NK et al Biochem Biophys Res Commun. 297: 1075-84. Los expertos en la técnica conocen la producción y el uso de ácidos nucleicos, y se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, (2001), Sambrook y Russell, eds. y Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio y G. C. Fareed. Cada derivado de ácido nucleico representa un aspecto distinto como se proporciona en la presente memoria.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "péptido recombinante" se refieren, en otro aspecto, a un péptido o polipéptido de cualquier longitud. En otro aspecto, un péptido o péptido recombinante como se proporciona en la presente memoria tiene una de las longitudes enumeradas anteriormente para un fragmento de HMW-MAA. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria. En un aspecto, el término "péptido" se refiere a péptidos nativos (ya sea productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y/o moléculas peptidomiméticas (péptidos sintetizados sintéticamente, típicamente), tales como peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que hacen que los péptidos sean más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, la modificación del extremo N-terminal, la modificación del extremo C-terminal, la modificación del enlace peptídico, incluidos, entre otros, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, las modificaciones del esqueleto y la modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos son muy conocidos en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, CA Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). Se proporcionan más detalles a este respecto a continuación en la presente memoria.

En un aspecto, el "polipéptido antigénico" se usa en la presente memoria para referirse a un polipéptido, péptido o péptido recombinante como se describió anteriormente en la presente memoria que es exógeno para un huésped y conduce a la generación de una respuesta inmune cuando está presente, o, en otro aspecto, lo detecta, el huésped.

Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido se pueden sustituir, por ejemplo, por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces éster (-C(R)HCOOC(R)-N-), enlaces de cetometileno (-CO-CH2-), *-aza enlaces (-NH-N(r )-CO-), en donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-), enlaces retro amida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", presentada naturalmente en el átomo de carbono.

Estas modificaciones pueden ocurrir en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo. Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, se pueden sustituir por ácidos artificiales sintéticos tales como TIC, naftilelanina (Nol), derivados metilados en el anillo de Phe, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr.

Además de lo anterior, los péptidos que se proporcionan en la presente memoria también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros que no son aminoácidos (por ejemplo, ácidos grasos, carbohidratos complejos, etc.).

En un aspecto, el término "oligonucleótido" es intercambiable con el término "ácido nucleico", y puede referirse a una molécula, que puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, ARNm eucariótico, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamíferos), e incluso secuencias de ADN sintético. El término también se refiere a secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidas de ADN y ARN.

"Mantenido de forma estable" se refiere, en otro aspecto, al mantenimiento de una molécula de ácido nucleico o plásmido en ausencia de selección (por ejemplo, selección con antibióticos) durante 10 generaciones, sin una pérdida detectable. En otro aspecto, el periodo es de 15 generaciones. En otro aspecto, el período es de 20 generaciones. En otro aspecto, el período es de 25 generaciones. En otro aspecto, el período es de 30 generaciones. En otro aspecto, el período es de 40 generaciones. En otro aspecto, el período es de 50 generaciones. En otro aspecto, el período es de 60 generaciones. En otro aspecto, el periodo es de 80 generaciones. En otro aspecto, el período es de 100 generaciones. En otro aspecto, el período es de 150 generaciones. En otro aspecto, el período es de 200 generaciones. En otro aspecto, el período es de 300 generaciones. En otro aspecto, el período es de 500 generaciones. En otro aspecto, el período es de más de 500 generaciones. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico o plásmido se mantiene estable in vitro (por ejemplo, en cultivo). En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico o plásmido se mantiene estable in vivo. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico o plásmido se mantiene estable tanto in vitro como in vivo. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, el término "aminoácido" o "aminoácidos" se entiende que incluye los 20 aminoácidos naturales; esos aminoácidos a menudo se modifican después de la traducción in vivo, e incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, entre otros, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" puede incluir tanto D-como L-aminoácidos.

El término "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un oligonucleótido desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma mono- o bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares o mejoradas, para los fines deseados, como el ácido nucleico de referencia. El término también incluye ácidos nucleicos que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos naturales o a velocidades que se mejoran en los mismos para los fines deseados. El término también abarca estructuras similares a los ácidos nucleicos con esqueletos sintéticos. Los análogos del esqueleto de ADN descritos en la presente memoria incluyen fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquilfosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno (metilimino), 3'-N-carbamato, morfolino carbamato y ácidos peptidonucleicos); véase, por ejemplo, Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, editado por F. Eckstein, IRL Press de Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volumen 600, Eds. Baserga y Denhardt (NYAS 1992); Mulligan (1993) J. Med. Chem.

36:1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Los APN contienen esqueletos no iónicos, tales como unidades de N-(2-aminoetil) glicina. Los enlaces de fosforotioato se describen, por ejemplo, en los documentos WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appi. Pharmacol. 144: 189-197. Otros esqueletos sintéticos abarcados por el término incluyen enlaces metilfosfonato o enlaces alternativos de metil-fosfonato y fosfodiéster (Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698), y enlaces de bencilfosfonato (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6: 153-156). El término ácido nucleico se usa indistintamente con un gen, ADNc, ARNm, cebador oligonucleotídico, sonda y producto de amplificación.

En un aspecto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria, el término "sitio de recombinación" o "sitio de recombinación específico de sitio" se refiere a una secuencia de bases en una molécula de ácido nucleico que es reconocida por una recombinasa (junto con proteínas asociadas, en algunos casos) que media en el intercambio o la escisión de los segmentos de ácido nucleico que flanquean los sitios de recombinación. Las recombinasas y las proteínas asociadas se denominan colectivamente "proteínas de recombinación", véase, por ejemplo, Landy, A., (Current Opinion in Genetics & Development) 3: 699-707; 1993).

Un "vector de expresión en fago" o "fagémido" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante basado en fagos con el fin de expresar una secuencia de ácido nucleico de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria in vitro o in vivo, de forma constitutiva o inducible, en cualquier célula, lo que incluye las células procarióticas, de levadura, fúngicas, vegetales, de insectos o mamíferos. Un vector de expresión en fago típicamente puede reproducirse en una célula bacteriana y, en condiciones adecuadas, producir partículas de fago. El término incluye los sistemas de expresión lineal o circular, y abarca los vectores de expresión basados en fagos que permanecen episomales o se integran en el genoma de la célula huésped.

En un aspecto, el término "unido de forma operable", como se usa en la presente memoria, significa que el ácido nucleico regulador de la transcripción y la traducción se posiciona con relación a cualquier secuencia codificante de tal manera que se inicie la transcripción. En general, esto significará que el promotor y las secuencias de inicio de la transcripción están posicionadas en 5' respecto de la región codificante.

En un aspecto, un "marco de lectura abierto" u "ORF" es una parte del genoma de un organismo que contiene una secuencia de bases que potencialmente podría codificar una proteína. En otro aspecto, los extremos inicial y final del ORF no son equivalentes a los extremos del ARNm, pero generalmente están contenidos dentro del ARNm. En un aspecto, los o Rf están ubicados entre la secuencia del codón de inicio (codón de iniciación) y la secuencia de codón de parada (codón de terminación) de un gen. Por lo tanto, en un aspecto, una molécula de ácido nucleico integrada de forma operable en un genoma como un marco de lectura abierto con un polipéptido endógeno es una molécula de ácido nucleico que se ha integrado en un genoma en el mismo marco de lectura abierto que un polipéptido endógeno.

Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona un polipéptido de fusión que comprende una secuencia enlazadora. En un aspecto, una "secuencia enlazadora" se refiere a una secuencia de aminoácidos que une dos polipéptidos heterólogos, o fragmentos o dominios de los mismos. En general, como se usa en la presente memoria, un enlazador es una secuencia de aminoácidos que une covalentemente los polipéptidos para formar un polipéptido de fusión. Un enlazador incluye típicamente los aminoácidos traducidos de la señal de recombinación restante después de la eliminación de un gen indicador de un vector de expresión para crear una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un marco de lectura abierto y la proteína de expresión. Como apreciará un experto en la técnica, el enlazador puede comprender aminoácidos adicionales, tales como glicina y otros aminoácidos neutros pequeños.

En un aspecto, "endógeno", como se usa en la presente memoria, describe un artículo que se ha desarrollado o se ha originado dentro del organismo de referencia, o que ha surgido dentro del organismo de referencia. En otro aspecto, endógeno se refiere a nativo.

En un aspecto, "heterólogo", como se usa en la presente memoria, describe un ácido nucleico, aminoácido, péptido, polipéptido o proteína derivada de una especie diferente de la especie de referencia. Así, por ejemplo, una cepa de Listeria que expresa un polipéptido heterólogo, en un aspecto, expresaría un polipéptido que no es nativo o endógeno respecto de la cepa de Listeria, o en otro aspecto, un polipéptido que normalmente no se expresa en la cepa de Listeria, o en otro aspecto, un polipéptido de una fuente distinta de la cepa de Listeria. En otro aspecto, se puede usar heterólogo para describir algo derivado de un organismo diferente dentro de la misma especie. En otro aspecto, el antígeno heterólogo se expresa mediante una cepa recombinante de Listeria, y se procesa y presenta a las células T citotóxicas tras la infección de células de mamífero por la cepa recombinante. En otro aspecto, el antígeno heterólogo expresado por las especies de Listeria no necesita coincidir con precisión con el antígeno o la proteína sin modificar correspondiente en la célula tumoral o el agente infeccioso, siempre que dé como resultado una respuesta de células T que reconozca el antígeno o la proteína sin modificar que se expresa naturalmente en el mamífero.

En un aspecto, un "vector de expresión episomal", como se describe en la presente memoria, se refiere a un vector de ácido nucleico que puede ser lineal o circular, y que normalmente tiene una forma bicatenaria. En una realización, un vector de expresión episomal comprende un gen de interés. En otro aspecto, el gen de interés insertado no se interrumpe ni se somete a las restricciones regulatorias que a menudo se producen por la integración en el ADN celular. En otro aspecto, la presencia del gen heterólogo insertado no conduce a la reorganización o la interrupción de las regiones importantes propias de la célula. En otro aspecto, los vectores episómicos persisten en múltiples copias en el citoplasma bacteriano, lo que da como resultado la amplificación del gen de interés y, en otro aspecto, se suministran factores virales que actúan en trans cuando es necesario. En otro aspecto, en procedimientos de transfección estable, el uso de vectores episomales a menudo da como resultado una mayor eficiencia de transfección que el uso de plásmidos de integración cromosómica (Belt, P.B.G.M., et al (1991) Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of a mutant human cell line (HPRT2) using an Epstein-Barr virus-derived cDNA expression vector. Nucleic Acids Res. 19, 4861-4866; Mazda, O., et al. (1997) Extremely efficient gene transfection into lymphohematopoietic cell lines by Epstein-Barr virusbased vectors. J. Immunol. Methods 204, 143-151). En un aspecto, los vectores de expresión episomal de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria pueden administrarse a células in vivo, ex vivo o in vitro mediante cualquiera de una variedad de los métodos empleados para suministrar moléculas de ADN a las células. Los vectores también pueden administrarse solos o en forma de una composición farmacéutica que mejora la administración a las células de un sujeto.

En un aspecto, "fusionado" se refiere a la unión mediante enlaces covalentes.

"Transformación", en un aspecto, se refiere a la modificación de una célula bacteriana para captar un plásmido u otra molécula de ADN heteróloga. En otro aspecto, "transformar" se refiere a la modificación de una célula bacteriana para expresar un gen de un plásmido u otra molécula de ADN heteróloga. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En otro aspecto, la conjugación se usa para introducir material genético y/o plásmidos en bacterias. Los métodos para la conjugación son muy conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Nikodinovic J et al. (A second generation snp- derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation. Plasmid. nov. de 2006; 56 (3): 223-7) y Auchtung JM et al (Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response. Proc Natl Acad Sci U S A. 30 de agosto de 2005; 102 (35): 12554-9). Cada método representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

"Enzima metabólica" se refiere, en otro aspecto, a una enzima involucrada en la síntesis de un nutriente requerido por las bacterias huésped. En otro aspecto, el término se refiere a una enzima requerida para la síntesis de un nutriente requerido por las bacterias huésped. En otro aspecto, el término se refiere a una enzima involucrada en la síntesis de un nutriente utilizado por las bacterias huésped. En otro aspecto, el término se refiere a una enzima involucrada en la síntesis de un nutriente requerido para el crecimiento sostenido de las bacterias huésped. En otro aspecto, la enzima es necesaria para la síntesis del nutriente. Cada posibilidad representa un aspecto distinto de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria.

En un aspecto, el término "atenuación", como se usa en la presente memoria, significa una disminución de la capacidad de la bacteria de causar una enfermedad en un animal. En otras palabras, las características patógenas de la cepa de Listeria atenuada se han reducido en comparación con la Listeria de tipo natural, aunque la Listeria atenuada es capaz de crecer y mantenerse en cultivo. Usando como ejemplo la inoculación intravenosa en ratones Balb/c de Listeria atenuada, la dosis letal a la que sobreviven el 50% de los animales inoculados (DL50) se incrementa preferiblemente por encima de la DL50 de Listeria de tipo natural en al menos aproximadamente 10 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 1.000 veces, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 10.000 veces, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 100.000 veces. Una cepa atenuada de Listeria es, por lo tanto, una que no mata a un animal al que se administra, o es una que mata al animal solo cuando el número de bacterias administradas es mucho mayor que el número de bacterias no atenuadas de tipo natural que serían necesarias para matar al mismo animal. Una bacteria atenuada también debe interpretarse como una que es incapaz de replicarse en el medio general porque el nutriente necesario para su crecimiento no está presente en el mismo. Por lo tanto, la bacteria se limita a la replicación en un medio controlado en el que se proporciona el nutriente necesario. Las cepas atenuadas de la presente invención son, por lo tanto, seguras para el medio ambiente en el sentido de que son incapaces de tener una replicación incontrolada.

El término "aproximadamente", como se usa en la presente memoria, significa en términos cuantitativos más o menos un 5%, o, en otro aspecto, más o menos un 10%, o, en otro aspecto, más o menos un 15%, o, en otro aspecto, más o menos un 20%.

El término "sujeto" se refiere en un aspecto a un mamífero que incluye un ser humano que necesita terapia o es susceptible a una afección o a sus secuelas. El sujeto puede incluir perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, cabras, caballos, ratas y ratones y humanos. En un aspecto, el término "sujeto" no excluye a un individuo que esté sano en todos los aspectos y que no tenga ni muestre signos de enfermedad o trastorno.

En un aspecto, la Listeria como se proporciona en la presente memoria expresa un polipéptido heterólogo, como se describe en la presente memoria, en otro aspecto, la Listeria como se proporciona en la presente memoria secreta un polipéptido heterólogo, como se describe en la presente memoria, y en otro aspecto, la Listeria como se proporciona en la presente memoria expresa y secreta un polipéptido heterólogo, como se describe en la presente memoria. En otro aspecto, la Listeria como se proporciona en la presente memoria comprende un polipéptido heterólogo, y, en otro aspecto, comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

En un aspecto, las cepas de Listeria como se proporcionan en la presente memoria pueden usarse en la preparación de vacunas. En un aspecto, las cepas de Listeria tal como se proporcionan en la presente memoria pueden usarse en la preparación de vacunas peptídicas. Los métodos para preparar vacunas peptídicas son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento EP1408048, el número de solicitud de patente de Estados Unidos 20070154953, y OGASAWARA et al. (Proc. Nati. Acad Sci. USA, vol. 89, págs. 8995-8999, octubre de 1992). En un aspecto, se utilizan técnicas de evolución de péptidos para crear un antígeno con mayor inmunogenicidad. Las técnicas de evolución de péptidos son muy conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 6773900.

En un aspecto, las vacunas de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente memoria pueden administrarse a un animal vertebrado huésped, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un ser humano, ya sea solas o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la vacuna se administra en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune hacia la propia cepa de Listeria o hacia un antígeno heterólogo que la especie de Listeria ha sido modificada para expresar. En otro aspecto, la cantidad de vacuna a administrar la puede determinar rutinariamente un experto en la técnica cuando está en posesión de la presente descripción. En otro aspecto, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir, pero sin limitación, agua destilada estéril, solución salina, soluciones tamponadas con fosfato o soluciones tamponadas con bicarbonato. En otro aspecto, el vehículo farmacéuticamente aceptable seleccionado y la cantidad de vehículo a usar dependerán de varios factores que incluyen el modo de administración, la cepa de Listeria y la edad y el estado de la enfermedad del vacunado. En otro aspecto, la administración de la vacuna puede ser por vía oral, o puede ser parenteral, intranasal, intramuscular, intravascular, intrarrectal, intraperitoneal, o cualquiera de una variedad de vías de administración muy conocidas. En otro aspecto, la vía de administración puede seleccionarse de acuerdo con el tipo de agente infeccioso o tumor a tratar.

Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en el que dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para inducir una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en el que dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para tratar, suprimir o inhibir un cáncer en un sujeto que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en el que dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para tratar, suprimir o inhibir al menos un tumor en un sujeto que comprende administrar una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en el que dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un método para producir una cepa de Listeria recombinante que expresa un antígeno, y el método comprende fusionar genéticamente un primer ácido nucleico que codifica un antígeno en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno; y expresar dicho antígeno en condiciones conducentes a la expresión antigénica en dicha cepa de Listeria recombinante.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona cualquiera de los métodos descritos anteriormente en la presente memoria utilizando una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico heterólogo o un fragmento del mismo, en el que dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen que contiene PEST endógeno.

Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un kit para poner en práctica convenientemente los métodos que se proporcionan en la presente memoria, que comprende una o más cepas de Listeria tal como se proporciona en la presente memoria, un aplicador y material instructivo que describe cómo usar los componentes del kit al poner en práctica los métodos tal como se proporcionan en la presente memoria.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más detalladamente los aspectos descritos en la presente memoria.

Ejemplos

Se desarrolló una Lm recombinante que secreta PSA fusionado a tLLO (Lm-LLO-PSA), que provoca una potente respuesta inmune específica de PSA asociada a la regresión de tumores en un modelo de ratón del cáncer de próstata, en donde la expresión de tLLO-PSA procede de un plásmido basado en pGG55 (Tabla 1), que confiere resistencia a antibióticos al vector. Recientemente se desarrolló una nueva cepa para la vacuna de PSA basada en el plásmido pADV142, que no tiene marcadores de resistencia a antibióticos, y se denomina LmddA-142 (Tabla 1). Esta nueva cepa está 10 veces más atenuada que Lm-LLO-PSA. Además, LmddA-142 fue ligeramente más inmunogénica y significativamente más eficaz en la regresión de tumores que expresan PSA que la Lm-LLO-PSA.

Tabla 1. Plásmidos y cepas

La secuencia del plásmido pAdv142 (6523 pb) fue la siguiente: cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgaggg tgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgct cggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggca aagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttcc ccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggc agttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagc accactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaag ccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacg atctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaa 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Este plásmido se secuenció en la instalación de Genewiz a partir de la cepa de E. coli el 2-20-08.

EJEMPLO 1: Construcción de la cepa de Listeria atenuada-LmddAacM e inserción del gen klk3 humano en el marco de lectura del gen hly en las cepas Lmdd y Lmdda.

La cepa Lm dal dat (Lmdd) se atenuó mediante la deleción irreversible del factor de virulencia, ActA. Se construyó una deleción en el marco de lectura de actA en el fondo de Lmdaldat (Lmdd) para evitar cualquier efecto polar en la expresión de los genes posteriores. El Lm dal dat AactA contiene los primeros 19 aminoácidos del extremo N-terminal y 28 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal con una deleción de 591 aminoácidos de ActA.

El mutante de deleción de actA se produjo amplificando la región cromosómica correspondiente a las porciones anteriores (oligo de 657 pb Adv 271/272) y posteriores (oligo de 625 pb Adv 273/274) de actA y uniéndolas mediante PCR. La secuencia de los cebadores utilizados para esta amplificación se da en la Tabla 2. Las regiones de ADN anteriores y posteriores de actA se clonaron en el pNEB193 en el sitio de restricción EcoRI/PstI y, a partir de este plásmido, el EcoRI/PstI se clonó adicionalmente en el plásmido pKSV7 sensible a la temperatura, dando como resultado AactA/pKSV7 (pAdv120).

Tabla 2: Secuencias de los cebadores que se usaron para la amplificación de las secuencias de ADN anteriores y posteriores de actA

La deleción del gen de su ubicación cromosómica se verificó utilizando cebadores que se unen externamente a la región de deleción de actA, que se muestran en la Figura 1 como cebador 3 (Adv 305-tgggatggccaagaaattc, SEQ ID N°: 51) y cebador 4 (Adv304-ctaccatgccttcccttttcttg) SEQ ID N°: 52). El análisis de PCR se realizó en el ADN cromosómico aislado de Lmdd y LmddAactA. Se esperaba que los tamaños de los fragmentos de ADN después de la amplificación con dos conjuntos diferentes de pares de cebadores 1/2 y 3/4 en el ADN cromosómico de Lmdd fueran de 3,0 Kb y 3,4 Kb. Por otro lado, los tamaños esperados de la PCR utilizando los pares de cebadores 1/2 y 3/4 para el LmddAactA fueron de 1,2 Kb y 1,6 Kb. Por lo tanto, el análisis de PCR de la Figura 1 confirma que la región de actA de 1,8 kb se delecionó en la cepa LmddAactA. La secuenciación del ADN también se realizó en productos de PCR para confirmar la deleción de la región que contenía actA en la cepa LmddAactA.

EJEMPLO 2: Construcción del sistema de expresión episomal independiente de antibióticos para la administración de antígenos mediante vectores de Lm.

El sistema de expresión episomal independiente de antibióticos para la administración de antígenos mediante vectores de Lm (pAdv142) es la próxima generación del plásmido pTV3 sin antibióticos (Verch et al., Infect Immun, 2004. 72 (11): 6418-25). El gen para el activador de la transcripción del gen de virulencia, prfA, se delecionó de pTV3 ya que la cepa Lmdd de Listeria contiene una copia del gen prfA en el cromosoma. Además, el casete para p60-dal de Listeria en el sitio de restricción NheI/PacI se reemplazó por p60-dal de Bacillus subtilis que dio como resultado el plásmido pAdv134 (Figura 2A). La similitud de los genes dal de Listeria y Bacillus es del -30%, eliminando virtualmente la posibilidad de recombinación entre el plásmido y el fragmento restante del gen dal en el cromosoma Lmdd. El plásmido pAdv134 contenía el casete de expresión de antígeno tLLO-E7. La cepa LmddA se transformó con el plásmido pADV134 y la expresión de la proteína LLO-E7 a partir de los clones seleccionados se confirmó mediante transferencia de Western (Figura 2B). El sistema Lmdd derivado de la cepa de tipo natural 10403S carece de marcadores de resistencia a antibióticos, a excepción de la resistencia a estreptomicina de Lmdd.

Además, pAdv134 se restringió con XhoI/XmaI para clonar PSA humano, klk3 lo que dio como resultado el plásmido, pAdv142. El nuevo plásmido, pAdv142 (Figura 2C, Tabla 1) contiene dal de Bacillus (B-Dal) bajo el control del promotor de p60 de Listeria. El plásmido lanzadera pAdv142 complementó el crecimiento tanto de E. coli ala drx MB2159 como de la cepa Lmdd de Listeria monocytogenes en ausencia de D-alanina exógena. El casete de expresión de antígeno en el plásmido pAdv142 consiste en un promotor hly y una proteína de fusión LLO-PSA (Figura 2C).

El plásmido pAdv142 se transformó en las cepas de fondo de Listeria, la cepa LmddactA que dio como resultado LmddA-LLO-PSA. La expresión y secreción de la proteína de fusión LLO-PSA por la cepa, Lm-ddA-LLO-PSA se confirmó mediante transferencia de Western utilizando anticuerpos anti-LLO y anti-PSA (Figura 2D). Hubo una expresión y secreción estable de la proteína de fusión LLO-PSA por la cepa, Lm-ddA-LLO-PSA después de dos pases in vivo.

EJEMPLO 3: Estabilidad in vitro e in vivo de la cepa LmddA-LLO-PSA

La estabilidad in vitro del plásmido se examinó cultivando la cepa de Listeria LmddA-LLO-PSA en presencia o ausencia de presión selectiva durante ocho días. La presión selectiva para la cepa LmddA-LLO-PSA es D-alanina. Por lo tanto, la cepa LmddA-LLO-PSA se pasó en infusión de cerebro-corazón (BHI) y BHI 100 pg/ml de D-alanina. Las UFCs se determinaron para cada día después de la siembra en placas en medio selectivo (BHI) y no selectivo (BHI D-alanina). Se esperaba que una pérdida de plásmido resultara en una UFC más alta después de la colocación en placas en un medio no selectivo (BHI D-alanina). Como se muestra en la Figura 3A, no hubo diferencia entre el número de UFC en el medio selectivo y el no selectivo. Esto sugiere que el plásmido pAdv142 fue estable durante al menos 50 generaciones, cuando terminó el experimento.

El mantenimiento del plásmido in vivo se determinó mediante inyección intravenosa de 5 x 107 UFC de LmddA-LLO-PSA en ratones C57BL/6. Las bacterias viables se aislaron de bazos homogeneizados en PBS a las 24 h y 48 h. Las UFCs para cada muestra se determinaron en cada punto de tiempo en placas BHI y BHI 100 pg/ml de D-alanina. Después de sembrar los esplenocitos en un medio selectivo y no selectivo, las colonias se recuperaron después de 24 h. Dado que esta cepa está muy atenuada, la carga bacteriana se elimina in vivo en 24 h. No se detectaron diferencias significativas de UFCs en las placas selectivas y no selectivas, lo que indica la presencia estable del plásmido recombinante en todas las bacterias aisladas (Figura 3B).

EJEMPLO 4: Pases in vivo, virulencia y eliminación de la cepa LmddA-142 (LmddA-LLO-PSA)

LmddA-142 es una cepa de Listeria recombinante que secreta la proteína de fusión tLLO-PSA expresada episómicamente. Para determinar una dosis segura, los ratones se inmunizaron con LmddA-LLO-PSA a varias dosis y se determinaron los efectos tóxicos. LmddA-LLO-PSA causó efectos tóxicos mínimos (datos no mostrados). Los resultados sugirieron que los ratones toleraron bien una dosis de 108 UFC de LmddA-LLO-PSA. Los estudios de virulencia indican que la cepa LmddA-LLO-PSA estuvo altamente atenuada.

Se determinó la eliminación in vivo de LmddA-LLO-PSA después de la administración de la dosis segura, 108 UFC por vía intraperitoneal en ratones C57BL/6. No hubo colonias detectables en el hígado y el bazo de los ratones inmunizados con LmddA-LLO-PSA después del día 2. Dado que esta cepa está muy atenuada, se eliminó completamente in vivo a las 48 h (Figura 4A).

Para determinar si la atenuación de LmddA-LLO-PSA atenuó la capacidad de la cepa LmddA-LLO-PSA de infectar macrófagos y crecer intracelularmente, se realizó un ensayo de infección celular. La línea celular de tipo macrófago de ratón, tal como J774A.1, se infectó in vitro con construcciones de Listeria y se cuantificó el crecimiento intracelular. La cepa de control positivo, la cepa de Listeria 10403S de tipo natural crece intracelularmente, y el control negativo XFL7, un prfA mutante, no puede escapar del fagolisosoma y, por lo tanto, no crece en las células J774. El crecimiento intracitoplasmático de LmddA-LLO-PSA fue más lento que 10403S debido a la pérdida de la capacidad de esta cepa de propagarse desde una célula a otra (Figura 4B). Los resultados indican que LmddA-LLO-PSA tiene la capacidad de infectar macrófagos y crecer intracitoplasmáticamente.

EJEMPLO 5: Inmunogenicidad de la cepa LmddA-LLO-PSA en ratones C57BL/6

Las respuestas inmunes específicas hacia PSA provocadas por la construcción LmddA-LLO-PSA en ratones C57BL/6 se determinaron usando una tinción con tetrámero de PSA. Los ratones se inmunizaron dos veces con LmddA-LLO-PSA a intervalos de una semana, y los esplenocitos se tiñeron para el tetrámero de PSA en el día 6 después del refuerzo. La tinción de los esplenocitos con el tetrámero específico de PSA mostró que LmddA-LLO-PSA provocó un 23% de células tetrámero de PSA+CD8+CD62Lbajo (Figura 5A).

La capacidad funcional de las células T específicas de PSA de secretar IFN-y después de la estimulación con el péptido de PSA durante 5 h se examinó utilizando la tinción de citoquinas intracelulares. Hubo un aumento de 200 veces en el porcentaje de células secretoras de CD8+CD62LbajoIFN-Y estimuladas con el péptido de PSA en el grupo LmddA-LLO-PSA en comparación con los ratones sin exposición (Figura 5B), lo que indica que la cepa LmddA-LLO-PSA es muy inmunogénica y estimula niveles altos de respuestas de células T CD8+ funcionalmente activas contra el PSA en el bazo.

Para determinar la actividad funcional de las células T citotóxicas generadas contra el PSA después de inmunizar ratones con LmddA-LLO-PSA, se ensayó la capacidad de los CTL específicos de PSA de lisar células EL4 pulsadas con el péptido H-2Db en un ensayo in vitro. Se utilizó un ensayo de caspasa basado en FACS (Figura 5C) y la liberación de Europio (Figura 5D) para medir la lisis celular. Los esplenocitos de ratones inmunizados con LmddA-LLO-PSA contenían CTL con una alta actividad citolítica hacia las células que expresan el péptido PSA como antígeno objetivo.

Se realizó un Elispot para determinar la capacidad funcional de las células T efectoras de secretar IFN-y después de 24 h de estimulación con el antígeno. Usando ELISpot, se observó que hubo un aumento de 20 veces en el número de puntos para IFN-y en los esplenocitos de ratones inmunizados con LmddA-LLO-PSA estimulados con un péptido específico en comparación con los esplenocitos de los ratones sin exponer (Figura 5E).

EJEMPLO 6: La inmunización con las cepas LmddA-142 induce la regresión de un tumor que expresa PSA y la infiltración del tumor con CTL específicos de PSA.

La eficacia terapéutica de la construcción LmddA-142 (LmddA-LLO-PSA) se determinó utilizando una línea celular de adenocarcinoma de próstata diseñada para expresar PSA (Tramp-Cl-PSA (TPSA); Shahabi et al., 2008). Se implantaron subcutáneamente 2 x 106 células TPSA a los ratones. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño palpable de 4-6 mm, en el día 6 después de la inoculación del tumor, los ratones se inmunizaron tres veces a intervalos de una semana con 108 UFC de LmddA-142, 107 UFC de Lm-LLO-PSA (control positivo) o se dejaron sin tratar Los ratones sin tratamiento desarrollaron tumores gradualmente (Figura 6A). Los ratones inmunizados con LmddA-142 estuvieron sin tumores hasta el día 35 y, gradualmente, 3 de los 8 ratones desarrollaron tumores, que crecieron a una velocidad mucho más lenta en comparación con los ratones sin tratamiento (Figura 6B). Cinco de cada ocho ratones permanecieron sin tumores hasta el día 70. Como se esperaba, los ratones vacunados con Lm-LLO-PSA tuvieron menos tumores que los controles sin tratamiento, y los tumores se desarrollaron más lentamente que en los controles (Figura 6C). Por lo tanto, la construcción LmddA-LLO-PSA pudo hacer retroceder el 60% de los tumores establecidos por la línea celular TPSA y frenar el crecimiento de los tumores en otros ratones. Los ratones curados que permanecieron sin tumores se volvieron a exponer a tumores TPSA en el día 68.

La inmunización de los ratones con LmddA-142 puede controlar el crecimiento e inducir la regresión de los tumores Tramp-Cl establecidos durante 7 días que se modificaron para expresar el PSA en más del 60% de los animales experimentales (Figura 6B), en comparación con ninguno en el grupo sin tratar (Figura 6A). El LmddA-142 se construyó utilizando un vector altamente atenuado (LmddA) y el plásmido pADV142 (Tabla 1).

Además, se investigó la capacidad de los linfocitos CD8 específicos de PSA generados mediante la construcción LmddA-LLO-PSA de infiltrarse en tumores. Los ratones se implantaron subcutáneamente con una mezcla de tumores y matrigel, seguido de dos inmunizaciones a intervalos de siete días con Listeria sin tratar o de control (Lm-LLO-E7), o con LmddA-LLO-PSA. Los tumores se extirparon en el día 21 y se analizaron para determinar la población de células T reguladoras CD8+CD62Lbajo PSAtetrámero+ y CD4+ CD25+FoxP3+ que infiltraban los tumores.

Se observó un número muy bajo de linfocitos infiltrantes en el tumor (TlLs) CD8+CD62Lbajo PSAtetrámero+ específicos de PSA que estaban presentes tanto en ratones sin tratamiento como en ratones inmunizados con el control de Lm-LLO-E7. Sin embargo, hubo un aumento de 10-30 veces en el porcentaje de TlLs CD8+CD62Lbajo PSAtetrámero+ específicos de PSA en los ratones inmunizados con LmddA-LLO-PSA (Figura 7A). Curiosamente, la población de células CD8+CD62Lbajo PSAtetrámero+ en el bazo fue 7,5 veces menor que en el tumor (Figura 7A).

Además, se determinó la presencia de células T reguladoras (regs) CD4+/CD25+/Foxp3+ en los tumores de ratones sin tratar y de ratones inmunizados con Listeria. Curiosamente, la inmunización con Listeria produjo una disminución considerable del número de T-regs CD4+ CD25+FoxP3+ en el tumor, pero no en el bazo (Figura 7B). Sin embargo, la construcción LmddA-LLO-PSA tuvo un mayor impacto en la disminución de la frecuencia de T-regs CD4+ CD25+FoxP3+ en los tumores en comparación con el grupo sin tratamiento e inmunizado con Lm-LLO-E7 (Figura 7B).

Por lo tanto, la vacuna LmddA-142 puede inducir células T CD8+ específicas de PSA que pueden infiltrarse en el sitio tumoral (Figura 7A). Curiosamente, la inmunización con LmddA-142 se asoció con un número reducido de células T reguladoras en el tumor (Figura 7B), probablemente creando un entorno más favorable para una actividad eficaz de CTL antitumorales.

EJEMPLO 7: Lmdd-143 y LmddA-143 secretan una LLO funcional a pesar de la fusión de PSA.

Lmdd-143 y LmddA-143 contienen el gen klk3 humano de longitud completa, que codifica la proteína PSA, insertado mediante recombinación homóloga en una posición posterior y en el marco de lectura del gen hly en el cromosoma. Estas construcciones se realizaron mediante recombinación homóloga utilizando el plásmido pKSV7 (Smith y Youngman, Biochimie. 1992; 74 (7-8) p. 705-711), que tiene un replicón sensible a la temperatura, que lleva el casete de recombinación hly-klk3-mpl. Debido a la escisión del plásmido después del segundo evento de recombinación, el marcador de resistencia a antibióticos utilizado para la selección por integración se pierde. Además, el gen actA se deleciona en la cepa LmddA-143 (Figura 8A). La inserción de klk3 en el marco de lectura con hly en el cromosoma se verificó mediante PCR (Figura 8B) y secuenciación (datos no mostrados) en ambas construcciones.

Un aspecto importante de estas construcciones cromosómicas es que la producción de LLO-PSA no eliminaría completamente la función de LLO, que es necesaria para el escape de Listeria del fagosoma, la invasión del citosol y una inmunidad eficiente generada por L. monocytogenes. El análisis de transferencia de Western de las proteínas secretadas en los sobrenadantes de cultivo de Lmdd-143 y LmddA-143 reveló una banda de ~81 kDa correspondiente a la proteína de fusión LLO-PSA y una banda de ~60 kDa, que es el tamaño esperado de LLO (Figura 9A), lo que indica que la LLO se escinde de la fusión LLO-PSA o aún se produce como una proteína única en L. monocytogenes, a pesar del gen de fusión en el cromosoma. La LLO secretada por Lmdd-143 y LmddA-143 retuvo un 50% de la actividad hemolítica, en comparación con la L. monocytogenes 10403S de tipo natural (Figura 9B). De acuerdo con estos resultados, tanto Lmdd-143 como LmddA-143 fueron capaces de replicarse intracelularmente en la línea celular J774 de tipo macrófago (Figura 9C).

Ejemplo 8: Tanto Lmdd-143 como LmddA-143 provocan respuestas inmunes mediadas por células contra el antígeno PSA.

Después de demostrar que tanto Lmdd-143 como LmddA-143 son capaces de secretar PSA fusionado a LLO, se investigó si estas cepas podrían provocar respuestas inmunes específicas de PSA in vivo. Los ratones C57B1/6 se dejaron sin tratar o se inmunizaron dos veces con Lmdd-143, LmddA-143 o LmddA-142. Las respuestas de células T c D8+ específicas de PSA se midieron mediante la estimulación de esplenocitos con el péptido PSA^65-74y la tinción intracelular para IFN-y. Como se muestra en la Figura 10, la respuesta inmune inducida por los vectores cromosómicos y basados en plásmidos es similar.

EJEMPLO 9: Una cepa de Lm recombinante que secreta una proteína de fusión LLO-HMW-MAA da como resultado una amplia respuesta antitumoral.

Se diseñaron tres vacunas basadas en Lm que expresaban distintos fragmentos de HMW-MAA según la posición de los epítopos HLA-A2 previamente cartografiados y predichos (Figura 11A). La Lm-tLLO-HMW-MMA^2160-2258(también denominada Lm-LLO-HMW-MAA-C) se basa en la cepa de Lm XFL-7 avirulenta y un plásmido basado en pGG55. Esta cepa secreta una banda de ~62 kDa que corresponde a la proteína de fusión tLLO-HMW-MAA^2160-2258(Figura 11B). La secreción de tLLO-HMW-MAA^2160-2258es relativamente débil, probablemente debido a la alta hidrofobicidad de este fragmento, que corresponde al dominio transmembrana de HMW-MAA. Usando células de melanoma B16F10 transfectadas con el gen HMW-MAA de longitud completa, se observó que hasta el 62,5% de los ratones inmunizados con la Lm-LLO-HMW-MAA-C pudieron impedir el crecimiento de tumores establecidos (Figura 11C). Este resultado muestra que HMW-MAA puede usarse como un antígeno objetivo en las estrategias de vacunación. Curiosamente, también se observó que la inmunización de ratones con Lm-LLO-HMW-MAA-C perjudicó significativamente el crecimiento de tumores no modificados para expresar HMW-MAA, como B16F10, RENCA y NT-2 (Figura 11D), que se obtuvieron de distintas cepas de ratón. En el modelo de tumor NT-2, que es una línea celular de carcinoma mamario que expresa la proteína HER-2/neu de rata y procede de ratones transgénicos FVB/N, la inmunización con Lm-LLO-HMW-MAA-C 7 días después de la inoculación del tumor no solo afectó al crecimiento del tumor sino que también indujo la regresión del tumor en 1 de cada 5 ratones (Figura 11D).

EJEMPLO 10: La inmunización de ratones con Lm-LLO-HMW-MAA-C induce la infiltración del estroma tumoral con células T CD8+ y una reducción significativa de la cobertura de pericitos en la vasculatura tumoral.

Aunque las células NT-2 no expresan el homólogo NG2 de HMW-MAA, la inmunización de ratones FVB/N con Lm-LLO-HMW-MAA-C perjudicó significativamente el crecimiento de los tumores NT-2 y finalmente condujo a la regresión tumoral (Figura 11D). Este modelo de tumor se usó para evaluar las células T CD8+ y los pericitos en el sitio tumoral mediante inmunofluorescencia. La tinción de cortes del tumor NT-2 para CD8 mostró la infiltración de células T CD8+ en los tumores y alrededor de los vasos sanguíneos en los ratones inmunizados con la vacuna Lm-LLO-HMW-MAA-C, pero no en los ratones inmunizados con la vacuna de control (Figura 12A). Los pericitos en los tumores NT-2 también se analizaron mediante tinción doble con anticuerpos hacia aSMA y NG2 (homólogo murino de HMW-MAA). El análisis de los datos de tres tumores NT-2 independientes mostró una disminución significativa del número de pericitos en los ratones inmunizados con Lm-LLO-HMW-MAA-C, en comparación con el control (P < 0,05) (Figura 12B). Se obtuvieron resultados similares cuando el análisis se limitó a las células teñidas para aSMA, que la vacuna no selecciona como objetivo (datos no mostrados). Por lo tanto, la vacunación con Lm-LLO-HMW-MAA-C afecta a la formación de vasos sanguíneos en el sitio tumoral al atacar a los pericitos.

EJEMPLO 11: Desarrollo de un vector de L. monocytogenes recombinante con una actividad antitumoral mejorada mediante la expresión y secreción concomitante de proteínas de fusión LLO-PSA y tLLO-HMW-MAA^2160-2258, que provoca respuestas inmunes hacia ambos antígenos heterólogos.

Materiales y métodos:

Construcción del plásmido pADV168. El fragmento HMW-MAA-C se escinde de un plásmido pCR2.1-HMW-MAA2160-²²⁵⁸mediante doble digestión con endonucleasas de restricción Xhol y Xmal. Este fragmento se clona en el plásmido pADV134 ya digerido con Xhol y Xmal para extirpar el gen E7. El plásmido pADV168 se somete a electroporación en la cepa de E. coli dal(- dat(_) MB2159 electrocompetente y los clones positivos se criban con respecto a RFLP y el análisis de secuencia.

Construcción de Lmdd-143/168, LmddA-143/168 y las cepas de control LmddA-168, Lmdd-143/134 y LmddA-143/134. Lmdd, Lmdd-143 y LmddA-143 se transforman con el plásmido pADV168 o pADV134. Los transformantes se seleccionan en placas de agar de infusión de cerebro-corazón suplementadas con estreptomicina (250 pg/ml) y sin D-alanina (medio BHIs). Los clones individuales se criban en busca de LLO-PSA, tLLO-HMW-MAA^2160-2258y la secreción de tLLO-E7 en sobrenadantes de cultivos bacterianos mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo anti LLO, anti-PSA o anti-E7. Se evaluará un clon seleccionado de cada cepa para determinar la virulencia in vitro e in vivo. Cada cepa se somete a pases dos veces in vivo para seleccionar los clones recombinantes más estables. Brevemente, se cultiva un clon seleccionado de cada construcción y se inyecta i.p. a un grupo de 4 ratones a 1x108 UFC/ratón. Los bazos se recogen en los días 1 y 3, se homogeneizan y se colocan en placas de agar BHIs. Después del primer pase, se selecciona una colonia de cada cepa y se realiza un pase in vivo por segunda vez. Para evitar una mayor atenuación del vector, a un nivel que perjudique su viabilidad, se generan construcciones en dos vectores con distintos niveles de atenuación (Lmdd-143/168, LmddA-143/168).

Determinación de la virulencia in vitro mediante replicación intracelular en células J774. La captación de Lm por los macrófagos, seguida de la invasión citosólica y la proliferación intracelular, son necesarias para la administración y presentación eficaz del antígeno por parte de las vacunas basadas en Lm. Se utiliza un ensayo de invasión in vitro, que utiliza una línea celular J774 de tipo macrófago para ensayar estas propiedades en nuevas cepas de Lm recombinantes. Brevemente, las células J774 se infectan durante 1 hora en un medio sin antibióticos a una MOI de 1:1 con la cepa 10403S de Lm de tipo natural de control o con las nuevas cepas de Lm que se van a ensayar. Las bacterias extracelulares se destruyen mediante incubación de 1 hora en un medio con 10 pg/ml de gentamicina. Las muestras se recogen a intervalos regulares y las células se lisan con agua. Se colocan en placas diluciones en serie de diez veces de los lisados por duplicado en placas de BHIs y se cuentan las unidades formadoras de colonias (UFC) en cada muestra.

Estudios de virulencia in vivo. Se inyectan a grupos de cuatro ratones C57BL/6 (7 semanas de edad) i.p. dos dosis diferentes (1 x 108 y 1 x 109 UFC/dosis) de cepas Lmdd-143/168, LmddA-143/168, LmddA-168, Lmdd-143/134 o LmddA-143/134. Los ratones se siguen durante 2 semanas con respecto a la supervivencia y la estimación de la DL⁵⁰. Una DL⁵⁰de > 1 x 108 constituye un valor aceptable basado en la experiencia previa con otras vacunas basadas en Lm.

RESULTADOS

Una vez que el plásmido pADV168 se construye con éxito, se secuencia con respecto a la presencia de la secuencia de HMW-MAA correcta. Este plásmido en estas nuevas cepas expresa y secreta las proteínas de fusión de LLO específicas para cada construcción. Estas cepas están muy atenuadas, con una DL50 de al menos 1x108 UFC, y probablemente más de 1x109 UFC para las cepas deficientes de actA (LmddA), que carecen del gen actA y en consecuencia de la capacidad de propagación de célula a célula. La construcción se ensaya y se selecciona la que tiene un mejor equilibrio entre la atenuación y la eficacia terapéutica.

EJEMPLO 12: Detección de respuestas inmunes y efectos antitumorales provocados por la inmunización con Lmdd-143/168 y LmddA-143/168.

Las respuestas inmunitarias a PSA y HMW-MAA se estudian en ratones tras la inmunización con cepas Lmdd-143/168 y LmddA-143/168 utilizando métodos habituales, como la detección de IFN-y y la actividad específica de CTL contra estos antígenos. La eficacia terapéutica de los vectores de expresión doble se analiza en el modelo de tumor TPSA23.

Tinción intracelular de citoquinas para IFN-y. Los ratones C57BL/6 (3 ratones por grupo de tratamiento) se inmunizan dos veces a intervalos de 1 semana con las cepas Lmdd-143/168 y LmddA-143/168. Como controles para este experimento, los ratones se inmunizan con Lmdd-143, LmddA-143, LmddA-142, LmddA-168, Lmdd-143/134, LmddA-143/134 o se dejan sin tratar (grupo sin tratamiento). Los bazos se recogen después de 7 días y se prepara una suspensión de esplenocitos de células individuales. Estos esplenocitos se cultivan en placas a 2x106 células/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, en medio RPMI completo recién preparado con IL-2 (50 U/ml) y se estimulan con el péptido de PSA H-2Db, HCIRNKSVIL, (SEQ ID N°: 53), o el péptido de control de HPV16 E7 H-2Db RAHYNIVTF (SEQ ID N°: 54) a una concentración final de 1 pM. Como los epítopos de HMW-MAA no se han cartografiado en el ratón C57B1/6, las respuestas inmunes específicas de HMW-MAA se detectan incubando 2x106 esplenocitos con 2x105 células EL4-HMW-MAA. Las células se incuban durante 5 horas en presencia de monensina para retener el IFN-y intracelular en las células. Después de la incubación, las células se tiñen con anticuerpos anti ratón CD8-FITC, CD3-PerCP, CD62L-APC. Luego se permeabilizan y se tiñen para detectar IFNy-PE y se analizan en un FACS Calibur de cuatro colores (BD Biosciences).

Ensayo de citotoxicidad. Para investigar la actividad efectora de las células T específicas de PSA y HMW-MAA generadas tras las vacunaciones, se incuban esplenocitos aislados durante 5 días en medio RPMI completo que contiene 20 U/ml de IL-2 de ratón (Sigma), en presencia de células estimuladoras (células MC57G tratadas con mitomicina C infectadas con vacuna de PSA o h MW-MAA). Para el ensayo de citotoxicidad, las células objetivo EL4 se marcan durante 15 minutos con DDAO-SE (0,6 mM) (Molecular Probes) y se lavan dos veces con medio completo. Las células objetivo marcadas se pulsan durante 1 hora con el péptido PSA H-2Db o con el péptido de control HPV16 E7 H-2Db, a una concentración final de 5 mM. Para las respuestas citotóxicas específicas de HMW-MAA, las células EL4-HMW-MAA se utilizan como objetivos. El ensayo de citotoxicidad se realiza durante 2 horas incubando las células diana (T) con células efectoras (E) a diferentes proporciones E:T durante 2-3 horas. Las células se fijan con formalina, se permeabilizan y se tiñen para escindir la caspasa-3 para detectar la inducción de la apoptosis en las células objetivo.

Eficacia antitumoral. La eficacia antitumoral de las cepas Lmdd-143/168 y LmddA-143/168 se compara con la de LmddA-142 y LmddA-168, utilizando el modelo de tumor T-PSA23 (TrampC-1/PSA). Se inocularon grupos de 8 ratones C57BL/6 macho (6-8 semanas de edad) s.c. con 2 x 106 células T-PSA23, y 7 días después se inmunizaron i.p. con dosis 0,1 x DL50 de Lmdd-143/168, LmddA-143/168, LmddA-142 y LmddA-168. Como controles, los ratones se dejan sin tratar o se inmunizan con una cepa de control de Lm (LmddA-134). Cada grupo recibe dos dosis adicionales de las vacunas a intervalos de 7 días. Los tumores se monitorizan durante 60 días o hasta que alcanzan un tamaño de 2 cm, momento en el que se sacrifican los ratones.

RESULTADOS

La inmunización de ratones con LmddA-168 da como resultado la inducción de respuestas específicas contra HMW-MAA. De manera similar, Lmdd-143/168 y LmddA-143/168 provocan una respuesta inmune contra PSA y HMW-MAA que es comparable a las respuestas inmunes generadas por los vectores de L. monocytogenes que expresan cada antígeno individualmente. La inmunización de ratones portadores de T-PSA-23 con Lmdd-143/168 y LmddA-143/168 da como resultado una mejor eficacia terapéutica antitumoral que la inmunización con LmddA-142 o LmddA-168.

EJEMPLO 13: La inmunización con Lmdd-143/168 o LmddA-143/168 da como resultado la destrucción de pericitos,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión antigénico de listeriolisina O (LLO) - antígeno prostático (PSA), en la que dicha Listeria recombinante es un mutante dal/dat auxotrófico atenuado, que comprende un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofia de dicho mutante auxotrófico y en la que dicha Listeria recombinante comprende además una deleción del gen ActA endógeno.

2. La Listeria recombinante de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ácido nucleico se integra de forma operable en el genoma de Listeria en un marco de lectura abierto con un gen LLO endógeno.

3. La Listeria recombinante de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ácido nucleico está en un plásmido en dicha cepa de Listeria recombinante.

4. La cepa de Listeria recombinante de la reivindicación 3, en la que dicho polipéptido PSA-LLO fusionado comprende un fragmento de LLO N-terminal.

5. La Listeria recombinante de la reivindicación 3 o 4, en donde dicho plásmido se mantiene de manera estable en dicha cepa de vacuna de Listeria recombinante en ausencia de selección con antibióticos.

6. La Listeria recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde dicho plásmido no confiere resistencia a los antibióticos en dicha Listeria recombinante.

7. La cepa de Listeria recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha enzima metabólica es una enzima alanina racemasa o una enzima D-aminoácido transferasa.

8. La cepa de Listeria recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha cepa de Listeria es una cepa de Listeria monocytogenes.

9. Una composición inmunogénica que comprende la cepa de Listeria recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y un adyuvante.

10. Una composición inmunogénica según la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante comprende QS21 o un oligonucleótido que contiene CpG.

11. Una cepa de Listeria recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para el uso como un medicamento.

12. Una cepa de Listeria recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para el uso en la inducción de una respuesta inmune al PSA en un sujeto.

13. Una cepa de Listeria recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para el uso en un método para prevenir o retrasar la aparición de un cáncer en un sujeto.

14. Una cepa de Listeria recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para el uso en el tratamiento, la supresión o la inhibición de un cáncer o un tumor en un sujeto.

15. La cepa de Listeria recombinante según la reivindicación 13 o 14 para el uso de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde dicho cáncer o tumor es un cáncer o tumor de próstata.