DE2214229A1

DE2214229A1 - Impfstoffpräparat mit Adjuvans

Info

Publication number: DE2214229A1
Application number: DE19722214229
Authority: DE
Inventors: Alfons Dr.med. Kessel-Lo; Somer Pierre de Dr.med. Leuven; Billiau (Belgien)
Original assignee: Recherche Et Industrie Therapeutiques R.I.T., Genval (Belgien)
Priority date: 1971-03-26
Filing date: 1972-03-23
Publication date: 1972-09-28
Also published as: FR2130132B2; IN139166B; GB1327740A; CY840A; BE781028R; NL7202698A; CA980251A; FR2130132A2; US3839555A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A. Weickmann, Dipl.-Chem. B. Hujber

I MÜNCHEN «6, DEN

POSTFACH 860 »20

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 413921/22

Kn..

CASE: A-I

RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAPEUTIQUES, R.I.T. ruo au ¹DiIIeUl, 13, 1520 Genval, Belgien

"ImpfstoffprSparat mit Adjuvans ¹' (Zusatz zu Potent ......... Pa tents nnslchms P 20 28 590.9)

In der Hauptanmeldung P 20 28 590.9 wird die Verwendung oxydierter Polysaccharide als antiinfektiöse Mittel beschrieben. Dort wurde auch erwogen, sie als solche mit Impfstoffen zu vereinigen.

Nun wurde gefunden, daß diene oxydierten Polysaccharide, unabhängig von ihrer antiinfektiösen Wirksamkeit, tatsächlich auch wertvolle Hilfsstoffe für Impfstoffe sind.

Die vorliegende Zusatzerfindung betrifft daher pharmazeutische Zusammeη»etzungen, die Impfstoffpräparate mit einem Adjuvans darstellen und die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie pro Doaiseinhiit In.pfstoff 1 bis ?C0 mg eines oxydierten Polysacchariden, bei dom wenigstens 50 % der Konosaccharidringe geöffnet sind, im vrei;entliehen alle geöffneten Hinge zur Carbon-

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säurestufe oxydiert sind und Im wesentlichen alle C-O-C-Bindurigen, die im ursprünglichen Polysaccharid vorlagen, noch intakt sind, als Adjuvans enthalten. Vorzugsweise liegt dieses oxydierte Polysaccharid im Präparat in Form der freien Säure oder in der Form eines physiologisch verträglichen Alkalisalzes vor. Vorzugsweise liegt das Molekulargewicht des oxydierten Polysaccharides bei wenigstens 5 000.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Stei gerung der Antigenwirkung eines Impfstoffes, dieses Verfahren Ist dadurch gekennzeichnet, daß man au dem Impfstoff pro Dosiseinheit Impfstoff als Adjuvans 1 bis 200 mg eines oxydierten Polysaccharides, bei dem wenigstens 50 % der Monosaccharidringe geöffnet sind, im wesentlichen alle offenen Ringe zur Carbonsäurestufe oxydiert sind und im wesentlichen alle C-O-C-Dindungen, die im ursprünglichen Polysaccharid vorhanden waren, noch intakt sind, gibt. In diesem Verfahren wird das oxydierte Polysaccharid in Form der freien Säure oder in Form · eines physiologisch verträglichen Alkalisalzes verwendet. Vorzugsweise liegt auch hier das Molekulargewicht des verwende- · ten oxydierten Polysaccharides bei wenigstens 5 000.

Die oxydierten Polysaccharide, die gemäß der vorliegenden Erfindung Impfstoff-IIilfsstoffe darstellen, sowie deren Herstellung sind in der Hauptanmeldung P 20 28 590.9 vollständig beschrieben.

Die Polysaccharide sind im wesentlichen Amylose, Amylopectin, Dextran, Polygalacturonsäure, Alginsäure, Cellulose und Guaran.

Nun wurde gefunden, daß die oxydierten Polysaccharide die Antigenwirkung der Impfstoffe, denen sie zugesetzt werden, beträchtlich steigern.

Das bevorzugte Adjuvans der vorliegenden Erfindung ist ein

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lineares kondensiertes Copolymer, das 1,^-verknüpfte AnhydrooC-D-glucopyranose-EInheiten und 1,^-verknüpfte Anhydro-1,'4-dihydrox.y~l,^-dicarboxy-3-hydroxymethyl-2-oxabutan-Einheiten (COAM) enthalt. Es wird durch Oxydation von Amylose mit Natriummetaperjcdat und dann mit Natriumchlorit erhalten. Man fand, daß es ein hochwirksames Impfstoff-Adjuvans ist.

Der Ir.pfstoff-Adjuvans-Efi'ekt von COAM wurde wie folgt demonstriert:

Gruppen von 12 Mäusen wurde ein der folgenden Formulierungen intraperitoneal injiziert: Influenzava.kzin (Ap Hongkong/1/1968 oder 33/Keth strains), Vakzin plus COAM, Vakzin plus unvollständiges Freund'sches Adjuvans (IFA), Vakzin plus Polyinosinpolycytidylspure (poly I~C), Vakain plus IFA und poly I-C, und Vakzin plus IFA und COAM. Die Dosierung betrug 0,0625 ml . Vakzin pro Maus, 25/ug poly I-C pro Maus, ¹I mg COAM pro Maus und 0,125 ml IFA pro Ilaus. Das Experiment wurde mit drei MSusegruppen durchgeführt, denen 7, 1*1 und 28 Tage nach der Injektion Blut entnommen wurde, Das Blut wurde den Mäusen am orbital sinus entnommen und das Blut wurde sofort 1:5 verdünnt in Phosphat-gepufferter Salzlösung (HaCl 8 g, KCl 0,20 g, Na₂KPO^ 12 aqu« 2,89 g, KH₂POj₄ 0,2 g, mit keimfreiem destillierten Wasser auf 1 Ltr. aufgefüllt). Die Antikörpertiter wurden an einzelnen Proben unter Anwendung des Hcimagglutinations-Inhibierungstests (HA-I) bestimmt. Der Impfstoff enthielt 10 500 hA-Einheiten/ml des A₂ Hk/l/68-Stammes oder 7 500 HA-Eiriheiten/ml des B/Neth-Stammes.

Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in den Tabellen I und II zus airnn enge faßt.

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TABELLl·: I

IlittlCi¹Ci- IiA-T-T^TER von mit Vakzin behandelten Mausen (A, Hlr-Ctiu :v.) _} COAM, FOLY I-C und IFA *

T I T E R

Behandlung

nur Vakzin Vakzin + poly I-C Vakzin + COAM Vakzin η IFA Vakzin + IFA + poly I-C Vakzin + IFA + COAM

Ta cc l'l Tage

< 10

K ίο

<^ 10
's ^O

32

10
16
66
26

90

21 Tn.^c

< 10

20 200

63 220 350

Die Seruinproben wurden einzeln untersucht. Die in der Tabelle angegebenen Iverte sind Ke2iproJ;v-;ertc des c^eo~ metrischen Mittels von Enäpunktver'dünnun_f":cn.

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TABELLE II

Mittlerer KA-X-To-TER von mit Vakzin behandelten Mä'iisen, (D/NETIi-Starnm), COAM, POLY I-C und IPA *

	I-C	T	ITER	21 Tage
Behandlung		7 Tage	1^JI Tage	25
nur Vakzin		50	71	32
Vakzin + poly	poly I-C	80	160	100
Vakzin + COAM	COAM	320	550	80
Vakzin + IFA	160	200	210
Vakzin + IPA +	220	370	280
Vakzin + IFA +	210	500

* Die Serurnproben· wurden einzeln untersucht. Die in der Tabelle angegebenen Werte sind Reziprokwerte des geometrischen Mittels von EndpunktVerdünnungen.

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Die Ergebnisse zeigen, daß eine COAM-Dcsis von l6O mg/kg· bei Mäusen,entweder allein oder in Kombination mit IFA, beträchtlich höhere Antikörpertiter erzeugte als mit dem Vakzin allein. Sie war auch besser als IFA oder poly I-C.

Weitere Untersuchungen über die VJirkungssteigerung von Influenza-Vakzin wurden an Meerschweinchen durchgeführt. In einem ersten Experiment wurde bestimmt, daß ein Adjuvans-Effekt sowohl nach intramuskulärer als auch nach intraperitoneaier Injektion erhalten wurde. Der Effekt der Dosierung von COAM wurde ebenfalls untersucht:

Eine Gruppe Meerschweinchen erhielt die gleiche Formulierung wie die Mäuse, d.h. ¹I mg COAM pro Dosis Vakzin. Einer zweiten Gruppe wurde die gleiche Dosis COAi! wie den Mäusen verabreicht aber berechnet auf der Basis des Gewichts, d.h. ¹JO mg pro Meersehweinehen. Es wurde erwartet, daß dies einen Hinweis geben würde, ob die Aktivität des Adjuvans auf lokale oder systemische Effekte gegründet ist. Gruppen von 10 Meerschweinchen wurden verwendet. Ihnen wurden 0,5 ml Vakzin verabreicht, das A äqul/l Antigen enthielt. Die Antikörper wurden 3, 6, 9 und 12 Wochen nach der Impfung bestimmt. Die Mittelwerte sind in Tabelle III zusammengefaßt.

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TAFiELLE III

Adjuvans-Effekt von COAM auf die Antikörperinduktion durch Influensa-Vaksin bei Meerschweinchen

Impfplan

Antikörpertiter ^RK

3 6 9 1? Wochen Wochen Wochen Wochen

Intramuskuläre Impfung nui' Vakzin Vakzin + COAM 4 mg Vakzin + COAM MO mg

96	80	85	30
216	108	112	60
368	270	182	112'

Intraperitorieale Impfung nur Vakzin Vakzin + COAM H mg Vakzin + COAM HQ mg

120	158	91	28
209	138	98	37
W .	364	295	.98

* Die Formulierungen waren derart, daß die Tiere 0,5 ml A cLqui/1-Vakzin, vermischt mit 0,5 ml entweder Salzlösung oder COAH bei der angegebenen Dosis erhielten.

^Häi Die Serumproben wurden einzeln geprüft. Die in der Tabelle angegebenen Werte nind Reziprokwerte des geometrischen Mittels von Kruipunktverdünnu

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BAO

Eine Adjuvans-Aktivität war sowohl bei intramuskulärer als auch bei"intraperitonealer Behandlung (P <0,001) vorhanden. E^ine kleine Dosis COAM stimulierte jedoch nur die frühe Induktion von Antikörper (3 Wochen), da der Effekt bei 6, 9 und 12 Wochen abnahm (Wechselwirkung zwischen der Blutentnahmezeit und der Behandlung signifikant bei P <0,001).

Die Tatsache, daß bei Meerschweinchen eine höhere Dosis nötig ist als bei Mäusen könnte eher auf einen systemischen als auf einen lokalen Mechanismus hinweisen. In einem letzten Versuch wurde daher untersucht, ob COAM auch dann Adjuvans-Aktivität besitzt, wenn es an einer anderen Stelle als das Vakzin Injiziert wird. Gruppen von 7 Meerschweinchen wurde A äqui/1-Vakzin intraperitoneal oder Intravenös verabreicht. Das COAN. (^O mg pro Dosis) war darin enthalten oder es wurde separat an einer anderen Stelle verabreicht.

Wie Tabelle IV zeigt, besaß COAM eine Adjuvans-Aktivität nur dann, wenn es an der gleichen Injektionsstelle wie das Vakzin verabreicht wurde. Es sieht daher nicht danach aus, daß es über eine allgemeine Stimulierung des ImmunisationGmechanismus wirkt.

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TABELLE IV

Adjuvans-Effekt von COAM auf die Antikörperinduktion .durch' Influenza-Vakzin bei Meerschweinchen :

Impfpian

Antiköi'pertiter 3 VJochen nach der Impfung **

Intramuskuläre Impfung nur Vakzin Vakzin + COAM ^O mg Vakzin + QOAM *10 mg i.p.

195

Intraperitoneale Impfung nur Vakzin Vakzin + COAM kO mg Vakzin + COAM ^l\0 mg i.m

-64

182

80

Die Formulierungen waren derart, daß die Tiere 0,5 ml des A äqui/1-Vakzins, vermischt mit 0,5 ml entv/eder Salzlösung oder COAM bei der angegebenen Dosis erhielten.

Die Serumproben wurden einzeln unterrsucht. DIe^ in der Tabelle angegebenen Vierte sind Reziprokwerte des geometrischen Mittels von EndpunktVerdünnungen.

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HU229

Die Impfstoff-Hilfsstoffe der vorliegenden Erfindung können, verwendet werden, um die Wirkung von Impfstoffen zu erhöhen. Sie können verwendet werden mit Impfstoffen, wie Influenza-, Parainfluenza-, Polio-, Masern-, Mumps-, Hepatitis-, "Eastern"- und "WestenV-Pferde-Encephalomyelitis-, Katzenvirus-Rhinotracheitis-, Maul- und Klauenseuche-, Cytomegaloviren-, Katzen-Picornaviren-, Streptococcus-, Tetanus-, Diphterie-, Pertussis-, Colibaclllose-, Pasteurellose- und Leptospira-Impfstoff.

Im allgemeinen können sie den Impfstoffen in solchen Mengen zugesetzt werden, daß, wenn, die, passende Menge Impfstoff verabreicht wird, die Dosis Adjuv'ans etwa 1 mg bis 200 mg pro Dosis Impfstoff beträgt. Die mit Adjuvans versehenen Impfstoffe werden durch Injektion verabreicht, vorzugsweise intramuskulär,

Andere Adjuvantien als COAM der vorliegenden Erfindung sind oxydiertes Amylopectin ( ein verzweigtes kondensiertes Copolymer, das 1,4- und 1,6-verknüpfte Anhydro-a-D-glucopyranose-Einheiten und 1,4-verknüpfte Anhydro-1,4-dihydroxy-l,4-dicarboxy-3-hydroxymethyl-2-oxabutan--Einheiten enthält), oxydierte Polygalacturönsäure (ein lineares kondensiertes Copolymer, das l,*}- verknüpf te Anhydro-a~D~galacturonopyranose-Einheiten und 1,4-verknüpfte Anhydro-1,4-dihydroxy-l,3,4-tri~ earboxy-2-oxabutan-Einheiten enthält), oxydierte Alginsäure (ein lineares kondensiertes Copolymer, das 1,4-verknüpfte Anhydro-ß-D-mannuronopyranose-Einheitcn, 1,4-verknüpft e Anhydro-a-L-guluronopyranose-Einheiten und 1,4-verknüpfte Anhydro-1,4-dihydroxy-l,3,4-tricarboxy-2-oxabutan-Einheiten enthält), oxydierte Cellulose (ein lineares kondensiertes Copolymer, das 1,4-verknüpfte ß-D-Glucopyranose-K.inheiten und 1,4-verknüpfte Anhydro-1,4-dihydroxy-l,4-dicarboxy-3-hydroxymethyl-2-oxabutan-Einheiten enthält), oxydiertes Dextran (ein kondensiertes Copolymer, das 1,6-verknüpfte a-D-Glucopyrf.nose-Einheiten und 1,4-verknüpfte Anhydro-1,4-dihyaroxy-l,3-dicarboxy-2-oxabutan-Elnheiten enthält) und. oxydiertes Guaran

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- ii -

(e.in kondensiertes Copolymer ,.-das aus einer linearen Kette von 1,4 -v er knüpf ten Anhydro-ß-D-ruannopyranose-Einheiten und l,*l-- · verknüpften Anhydro-1, 4-d!hydroxy-1, 4-dicarbcxy--3~hydröxymethyl-2-oxabutan~Einhelten als Ersatz der Hälfte der Hydroxymethy If unkt ionen der Hauptkette besteht)·.

Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht einschränken sollen, beschreiben einige Impfstoffpräparate mit erfindungsgemäßen Hilfsstoffen.

B e i s ρ i e 1 1

Mach Beispiel 1 der Hauptanineldung (P 20 28 590.9) erhaltene oxydierte Amylose (20 mg) wird in 2 ml steriler mit Phosphat gepufferter Salzlösung (KaCl 8 g, KCl 0,20 g, Na₂HPO₁₁ 12 aqu, 2*89 6, ΚΙΪρΡΟ;. 0,2 g, keimfreies destilliertes Wasser zum Auffüllen auf 1 Ltr.) gelöst,

Die Lösung gibt man zu einer Einzeldosis von lyophilisiertem abgetötetem Influenza-Vakzin und verabreicht das Präparat intramuskulär.

Beispiel

Nach Beispiel 8 der Hauptanmeldung erhaltenes oxydiertes Amylopectin (50 mg) wird in 2 ml steriler mit Phosphat.gepufferter Salzlösung (NaCl 8 g, KCl 0,20 g, Na_?HPO_i( 12 aqu. 2,89 g, KH₂POjJ 0,2 g, keimfreies destilliertes Wasser zum · Auffüllen auf 1 Ltr.) gelöst.

Die Lösung gibt man zu einer Einzeldosis von lyophilisiertem abgetötetem Parainfluenza-Vakzin. und verabreicht das Präparat intramuskulär. . ■; . ;

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Beispiel

[ϊθ mg der nach Beispiel 9 der Hauptanmeldung erhaltenen oxydierten Polygalacturonsäure (Natriumsalz) werden in 2 ml steriler mit Phosphat gepufferter Salzlösung (IJaCl 8 g, KCl 0,20 g, Na₂HPO₁, 12 aqu. 2,89 G, KH₂PO₁₁ 0,2 g, keimfreies destilliertes Wasser zum Auffüllen auf 1 Ltr.) gelöst,

Die Lösung gibt man zu einer Einzeldosis von inaktiviertem Poliomyelitisvakzin und man verabreicht das Präparat intramuskulär.

Beispiel

Nach Beispiel 1 der Hauptanmeldung erhaltene oxydierte Amylose (50 mg) wird in 2 ml steriler mit Phosphat gepufferter Salzlösung (WaCl 8 g, KCl 0,20 g, Na₂HPO₁, 12 aqu. 2,89 g, KH₂PO₁, 0,2 g, keimfreies destilliertes Wasser zum Auffüllen auf 1 Ltr.) gelöst.

Die Lösung gibt man zu einer Einzeldosis von lyophilisiertem abgetötetem Influenza-Vakzin und man.verabreicht das Präparat intramuskulär.

Beispiel 5

Nach Beispiel Ik der Hauptanmeldung erhaltenes oxydiertes Dextran (100 mg) wird in 2 ml steriler mit Phosphat gepufferter Salzlösung (NaCl 8 g, KCl 0,20 g, Na₂HPO₁, 12 aqu. 2,89 g, KH₂PO₁J 0,2 g, keimfreies destilliertes Wasser zum Auffüllen auf 1 Ltr.) gelöst.

Die Lösung gibt man zu einer Einzeldosis von Diphtefie-Tetanus-Toxoiden, das Präparat wird intramuskulär verabreicht.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE :

1. Impfstoffpräparat mit Ädjuvans, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Dosiseinheit Impfstoff 1 bis 200 mg eines \ oxydierten Polysaccharides, bei dem wenigstens 50 % der Monos ac char !dringe geöffnet, sind, im wesentlichen alle offenen Ringe zur Garbonsäurestufe oxydiert sind und im wesentlichen ■ alle C-O-C-Bindungen, die im ursprünglichen PolysaccharJd vorhanden waren, noch intakt sind,- als Adjuvans enthält.

2. Impfstoffpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Amylose ist.

3* ■ · Impfstoffpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Amylopectin, Dextran, Polygalacturonsäure, Alginsäure, Cellulose oder Guaran ist.

*!. Impf stoffpräparat nach den Ansprüchen 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet_s daß das oxydierte Polysaccharid in Form der freien Säure oder in Form eines physiologisch verträglichen Alkalisalzes vorliegt.

5« Impfstoffpräparat nach den Ansprüchen 1 bis ^, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des oxydierteri Polyyacchiirides wenigstens 5 000 beträgt.

6. Verfahren zur Steigerung der antigeneη 'Wirksamkeit eines Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß pro Dosiseinheit Impfstoff 1 bis 200 mg eines oxydierten Polysaccharides,

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- Ill -

bei dem wenigstens 50 % der Monosaccharidringe geöffnet sind_s im wesentlichen alle offenen Ringe zur Carbonsäurestufe oxydiert sind und im v/esentlichen alle C-O-C-Bindungen, die im ursprünglichen Polysaccharid vorhanden waren, noch intakt sind, als Adjuvans zu dem Impfstoff gegeben werden.

7« Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Polysaccharid Amylose verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Polysaccharid Amylopectin, Dextran, PoIygalacturonsäure, Alginsäure, Cellulose oder Guaran verwendet wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das oxydierte Polysaccharid in Form der freien Säure oder in Form eines physiologisch verträglichen Alkallsalzes verwendet wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein oxydiertes Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von wenigstens 5 000 verwendet wird.

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