AT216147B - Verfahren zur Herstellung stabiler, wässeriger Lipoid-Dispersionen - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung stabiler, wässeriger Lipoid-Dispersionen 
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O. WestphalundO. Lüderitz, Angew. Chemie,mäss der österr. Patentschrift Nr. 212491 entfernt werden. 



   Weiter wurde gefunden, dass die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten kolloidalen wässerigen Dispersionen des gereinigten Lipoids eine weitere, zusätzliche Stabilisierung durch Zusatz von Trägersubstanzen zur wässerigen Lösung erfahren. Als solche eignen sich ausser Proteinen oder   wasserlös-   lichen Netzmitteln, wie Tween (Polyoxyalkylenderivate   langkettigerMonofettsäuren   von Sorbit) vor allem gewisse Oligosaccharide, und insbesondere niedermolekulare Dextrane, wie sie als Plasmaersatzstoffe klinisch umfangreich angewendet werden. 



   Zur Gewinnung stabiler kolloidaler   wässerigerlösungen des gereinigten Lipoids   geht man vorzugsweise so vor, dass das Bakterien-Lipoid in einem organischen Lösungsmittel, welches gutes Lösungsvermögen für das Lipoid besitzt, mit Wasser in jedem Verhältnis mischbar ist und beim Einengen der wässerigen Zubereitung bevorzugt flüchtig ist, gelöst wird. Diese Bedingungen erfüllt beispielsweise Pyridin. Die PyridinLösung des Lipoids kann man dann tropfenweise mit einer wässerigen Dextranlösung, vorzugsweise von 0, 5% Gehalt versetzen. Das Pyridin wird unter vermindertem Druck abdestilliert unter gelegentlichem Ersatz des teilweise mit abdestillierenden Wassers durch frisches destilliertes Wasser. 



   Auf diese Weise lassen sich   wässerigeLipoid-Dispersionen   bis zu Konzentrationen von etwa 10 mg/ml herstellen, welche nur mässig opaleszieren und bei Zimmertemperatur mehr als 1 Jahr unverändert haltbar sind. Auf den üblichen Laboratoriums-Zentrifugen (bei 3000-4000 Umdr/min) lässt sich dasLipoid aus derartigen kolloidalen Lösungen nicht abscheiden. Zur Konservierung kann man Mittel, wie z. B. Merthiolat (1 : 20000)   (o-Äthylquecksilber)-thiobenzoesaures   Natrium hinzufügen. 



   Isotonische Lipoidlösungen erhält man durch Zusatz von Rohrzucker oder andern niedermolekularen Substanzen von geringer Polarität. Das Verfahren ist infolge seiner Anwendbarkeit auf alle gereinigten Lipoid-Präparate aus endotoxischen Lipopolysacchariden gram-negativer Bakterien weiter Anwendung fähig. Mit einer erfindungsgemäss hergestellten   Coli-Lipoid-Dispersion   wurden folgende biologische Teste durchgeführt, aus denen sich die Aktivität entnehmen   lässt :  
1. Unspezifische Infektresistenz. Es ist bekannt, dass   die Injektion vonLipopolysacchariden gram-ne-   gativer Bakterien bei Mäusen und andern Versuchstieren zu signifikanten Änderungen der unspezifischen 
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  Einige Stunden nach der Injektion zeigen die Tiere, je nach der Dosierung des Lipopolysaccharids, eine mehr oder weniger erhöhte Empfindlichkeit gegen Infekte (negative Phase), während sie 24-48 Stunden später eine stark erhöhte Resistenz aufweisen. Die Injektion der erfindungsgemäss hergestellten LipoidDispersion in einer Dosierung von 5 bis 50   i g führt   bei Mäusen zu einer starken Steigerung der Infektresistenz ohne negative Vorphase. Auch bei erhöhter Dosierung ist die negative Phase wenig ausgesprochen, die anschliessende Resistenzsteigerung aber in gleicher Weise nachweisbar und verlängert, offenbar weil das injizierte Lipoid wegen seiner besonderen Löslichkeit zunächst zu einem grossen Teil an lipoidalen Zellstrukturen absorbiert und von hier aus erst nach und nach freigesetzt wird, so dass es zu einer Art Depotwirkung   kommt.

   Lipopolysaccharide   geben bei vergleichbarer Resistenzsteigerung viel stärkere initiale Resistenzminderungen, sind also vergleichsweise toxischer. 



   Mäuse wurden mit der erfindungsgemäss hergestellten Lipoid-Dispersion vorbehandelt und   4, 8, 24, 48   und 72 Stunden später in Gruppen zu je 10 Tieren mit dem für Mäuse hochvirulenten   E. coli-Stamm   145 (Rowley) intraperitoneal infiziert. Es wurde dann ermittelt, wieviele Mäuse innerhalb von 48 Stunden sterben. Aus diesen Werten lässt sich die jeweilige Bakterienverdünnung berechnen, welche zum Tod von 50% der Tiere führt. Der Unterschied der    DL   zwischen vorbehandelten Mäusen und Kontrollen zeigt an, ob eine Resistenzbeeinflussung im positiven oder negativen Sinn eingetreten ist. Ergebnisse derartiger Versuche an Mäusen zeigt die nachstehende Tabelle. 
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  Präparat <SEP> Dosierung <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> Vorbehandlung
<tb> jeweils <SEP> in <SEP> mg/kg
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48
<tb> Erfindungsgemäss <SEP> hergestellte <SEP> Dis- <SEP> 30 <SEP> J. <SEP> lg <SEP> i. <SEP> p. <SEP> 1,2-1, <SEP> 5 <SEP> +1, <SEP> 2 <SEP> +1,8 <SEP> +3, <SEP> 0 <SEP> +3,1
<tb> persion <SEP> des <SEP> gereinigten <SEP> Lipoids <SEP> aus <SEP> 4-5 <SEP> -0, <SEP> 4 <SEP> +0, <SEP> 5 <SEP> +3, <SEP> 2 <SEP> +3, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> dem <SEP> LipopoJysaccharid <SEP> von <SEP> E. <SEP> coli <SEP> 100 <SEP> mg <SEP> i. <SEP> p.
<tb> in <SEP> 0, <SEP> 50/0 <SEP> Dextran
<tb> 0, <SEP> 5% <SEP> Dextran <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> unwirksam--------- > 
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Tabelle :

   Resistenz-Änderungen von Mäusen 4,8, 24 und 48 Stunden nach Vorbehandlung (intraperitoneal) mit dem gereinigten Lipoid aus dem Lipopolysaccharid von E. coli, getestet durch Infektion mit demE. coli-Stamm 145 (Rowley). Die Werte bedeuten die Differenzen der Exponenten    (fix-no)   der Keim-   zahlen, die injiziert werden müssen, um 500/0 der Tiere zu töten (lolo = Keimzahl für DL50 der Kontrollez ; lynx = Keimzahl DL der vorbehandelten Versuchsgruppe). 



  Die akute Toxizität für Mäuse (DL ) liegt mit > 100 mg/kg weit über den in diesen Testen effek-   tiven Dosen. 



   Die erfindungsgemässe Lipoid-Dispersion wirkt nicht nur intravenös oder intraperitoneal, sondern auch subkutan, wobei der Anstieg etwas flacher, die Verträglichkeit aber erhöht ist, derart, dass höhere Dosen appliziert werden können, da das Lipoid in dieser Anordnung weniger akut wirkt. 



   2. Adjuvanzwirkung. Die nach dem hier beschriebenen Verfahren erhaltene Lipoid-Dispersion aus dem Lipopolysaccharid von E. coli und andern Enterobacteriaceen verursacht nach intravenöser Injektion bei Kaninchen und Rindern eine starke Steigerung der Antikörperbildung (Adjuvanzwirkung). 



    Die Immunisierung von Kaninchen gegen Protein-Antigene (z. B. Rinderserum-Proteine) mit oderohne    gleichzeitigen Zusatz von 10 Mg gereinigtem Bakterien-Lipoid führt innerhalb von 14 Tagen nach einmaliger intravenöser Antigen-Injektion (zirka 15 mg Protein) zu einer durchschnittlichen 5-6fachen Steigerung der Quantität kreisender,   pr1tcipitierender   Antikörper. 
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 wiederholt. 



   Weitere 40 trächtige Kühe (unter   gleichenLebensbedingungen)   erhielten in gleicher Weise nur Mischimpfstoff ohne Lipoid-Adjuvans. 



   Wenige Tage vor der Geburt war der Antikörpergehalt im Serum aller mit Lipoid behandelten Tiere höher als bei den Kontrollieren,   u. zw.   durchschnittlich um   100 - 2000/0.   Nach der Geburt wurden im Colostrum der mit Lipoid behandelten Mutterkühe wesentlich grössere Quantitäten, durchschnittlich die 3-4fache Menge, an   Pneumococcen-Antikörpern   ausgeschieden als bei den Kontrollieren. So enthielten   z. B.   16 Liter einer lipoidvorbehandelten Kuh 122 g Pneumococcen-Antikörper.

   Es zeigte sich, dass die   perorale   Applikation   von-25   mg Antikörper pro Kalb genügt, um die Jungtiere sicher für die Dauer vieler Wochen gegen die andernfalls tödliche Pneumococcen-Infektion (tägliche intranasale Infektion mit 
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 nen virulenten Pneumococcen-Typen passiv (peroral) zu immunisieren. 



   Im folgenden wird in beispielhafter Form die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens dargestellt. 



   Aus Colibakterien wird in bekannter Weise mitHilfe des Phenol/Wasser-Verfahrens und anschliessende Aufarbeitung der wässerigen Phase nach bekannten Verfahren hochgereinigtes endotoxisches Lipopolysaccharid hergestellt (vgl. deutsche Patentschrift Nr. 918405, O.   Westphal et al.,   Zf. Naturforschg. 7b   [1952],   S. 536-548). Aus diesem wird vorzugsweise mit verdünnter Mineralsäure in Lösungen hoher Ionenstärke hydrolytisch das in Wasser schwerlösliche rohe Lipoid, Lipoid A, gewonnen (vgl.   O.   Westphal und 
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 Fettsäuren, aminosäurehaltigen Komplexen und lecithinartigen Verbindungen befreit, was vorzugsweise gemäss dem Verfahren nach der österr. Patentschrift Nr. 212491 erfolgt. 



   Herstellung stabiler kolloidaler wässeriger Lösungen. 0,2 g des gereinigten, von langkettigen Fettsäuren, aminosäurehaltigen Komplexen und lecithinartigen Verbindungen freien   Coli-Lipoids   werden in 10 ml abs. Pyridin gelöst, wozu man vorteilhaft den Ansatz 10 Minuten lang auf 40-500C erwärmt. Die 
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 (Reinsubstanz) des Handels verwendet werden. Man erhält eine opaleszierende, kolloidale Lösung, aus welcher das Pyridin durch Vakuumdestillation entfernt wird. Hiezu wird die Lösung bei 14-16 mm Hg auf dem Wasserbad bei 30-400C auf etwa die Hälfte des Ausgangsvolumens eingeengt. Die eingeengte Lösung wird mit zirka 100 ml   dest. Wasser   auf das ursprüngliche Volumen gebracht und erneut im Vakuum auf etwa die Hälfte eingeengt.

   Im allgemeinen lässt sich nun kein Pyridin mehr nachweisen, andernfalls wird die Operation zur Sicherheit nochmals wiederholt. Man füllt nun auf ein Volumen von 200 ml mit   dest. Wasser   auf und erhält so eine kolloidale Lösung des gereinigten Coli-Lipoids in 0, 5% Dextran in 

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