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Verfahren zur Herstellung therapeutischer Reizstoffe Es ist bekannt,
daß eine Reihe somatischer Polysaccharide und Polysaccharid-Symplexe gramnegativer
Bakterien starte Reizstoffe sind. Hiermit sind an der Bakterienzelle verankerte
Polysaccharide gemeint. Sie sind wiederholt zur klinischen Anwendung bei der Reiztherapie
vorgeschlagen worden. Es ist ferner bekannt, daß eine wesentliche Wirkung derartiger
Bakterienpolysaccharide oder ihrer Symplexe darin besteht, daß sie eine Stimulierung
der Hypophysen-Nebennierenrinden-Funktion hervorrufen. Injiziert man jedoch derartige
Bakterienpolysaccharide oder ihre Symplexe in der Klinik zum Zwecke einer therapeutischen
Nebennierenrinden-Stimulierung, so muß man im allgemeinen außer der erwünschten
Wirkung eine Reihe von Nebenwirkungen in Kauf nehmen, wie das Auftreten starken
Fiebers, Belastungen des Kreislaufs, erhebliche Verschiebungen im weißen Blutbild
(Linksverschiebung) u. a. Am Tier läßt sich histologisch an den Nebennieren (z.
B. bei Ratten) zeigen, daß nach der Injektion therapeutischer Dosen genuiner Bakterienpolysaccharide,
ihrer Symplexe oder entsprechender bakterieller Vaccine das derart aktivierte Organ
nach I bis 2 Tagen regelmäßig kleinere oder größere Necrosen aufweist, die nur langsam
verschwinden.
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Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, durch O-Acylierung geeigneter
Bakterienpolysaccharide Stoffe zu erhalten - Acyl-polysaccharide -, welche in passender
Dosierung nach intravenöser, intramuskularer oder kutaner Injektion eine kräftige
Stimulierung des Hypophysen-Neben-
nierenrinden-Systems bewirken,
wobei Fieber-, Kreislauf- oder Leucocytenwirkungen minimal sind oder teilweise fehlen.
Am Tier ergibt sich histologisch, daß auch bei therapeutischer Uberdosierung trotz
starker Aktivierung keinerlei Necrosen in den Nebennieren auftreten.
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Als Ausgangsmaterial zur Herstellung derartiger Acylpolysaccharide
dienen vorzugsweise somatische Polysaccharide gramnegativer Bakterien. Man erhält
diese durch Behandlung der Keime mit homogenen Phenol-Wasser-Mischungen in der Wärme
und anschließende Kühlung und Trennung der Phasen in der wäßrigen Schicht. Der erhaltene
wäßrige Rohextrakt wird durch Fraktionierung mit Alkohol gereinigt (0. Westphal
u. Mitarbeiter, Zf. f. Naturf., 7b, I48 [1952]). Die so gewonnenen proteinfreien
Polysaccharide werden anschließend der Acylierung unterworfen. Die Acylierung wird
in an sich bekannter Weise angesetzt, z. B. mittels des Anhydrids der betreffenden
organischen Säure (Acetanhydrid, Propionanhydrid u. a.), vorzugsweise mit Acetanhydrid
und Pyridin mit wenig Wasser (vgl. G. G. Freeman, Biochem. J. 36, 340 [I942] ; H.
P. T r e f f e rs, Science Io3, 387 [I946]) und/oder Formamid (I. F. C a r 5 0 n
und W. D. Maclay, J.Am.Chem.Soc. 68, 115 [I946]).
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Prinzipiell ist es auch möglich, die getrockneten Bakterien direkt
zu acylieren. Aus dem Reaktionsprodukt kann die Acylpolysaccharid-Fraktion mit Hilfe
von organischen Lipoidlösungsmitteln, wie Gemische von chlorierten Kohlenwasserstoffen,
mit einfachen Alkoholen in Lösung gebracht werden, während die übrige bakterielle
Substanz ungelöst bleibt. Aus der Lösung kann das Acylpolysaccharid in einfacher
Weise isoliert werden.
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Es hat sich nun überraschend gezeigt, daß die Gewinnung klinisch
optimaler Präparate nicht so sehr von einem bestimmten Acylierungsgrad des Endproduktes
als vielmehr von der Dauer des Kontaktes der Substanz im Acylierungsgemisch abhängt,
indem außer der eigentlichen Acylierung noch eine Wirkung des Acylierungsgemisches
auf das Reaktionsprodukt eintritt, wobei dieses sich nach und nach in das gewünschte
Endprodukt verwandelt.
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Beispielsweise ergibt die Acetylierung eines hochgereinigten Polysaccharid-Pyrogens
aus Colikeimen mittels Pyridin, wenig Wasser und Essigsäureanhydrid bei stets gleichem
Ansatz nach I, 5, I0, I7 und 24 Stunden Reaktionsdauer bei Zimmertemperatur fünf
in Chloroform lösliche Acetylpolysaccharid-Produkte von praktisch der gleichen analytischen
Zusammensetzung. Bei der Prüfung am Tier und am Menschen zeigen diese fünf Präparate
indessen sehr verschiedene Wirksamkeit.
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Das I-Stunden-Produkt übt auf den Menschen nahezu die gleichen Einflüsse
aus wie das Ausgangspolysaccharid (das genuine Pyrogen) und zeigt schon bei der
intravenösen Injektion von nur I ,ug starke, unerwünschte Nebenwirkungen (Übelkeit,
Fieber, Kollapsneigung usw.). Die pyrogene Grenzdosis bei dem 5-Stunden-Produkt
hat sich auf 25 bis 50,ug i. v., beim Io-Stunden-Produkt auf 50 bis I00,Ug, beim
I6-Stunden-Produkt auf 300 bis 500,ug und beim 24-Stunden-Produkt auf I000 bis 1500
pg verschoben.
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Die länger als 4 Stunden acetylierten Produkte zeigen bei den genannten
Grenzdosen keine initiale Leucopenie und nur mäßige Leucocytosen nach 4 bis 8 Stunden,
wenig oder gar kein Fieber, keine Ausschüttung von stabkernigen, wohl aber signifikante
Eosinopenien. Die subjektiven Nebenwirkungen sind vergleichsweise gering. Über entsprechende
Werte am gesunden Menschen orientiert Tabelle I.
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Bei Patienten liegt die Dosis mitunter niedriger, z. B. bei der halben
Dosis.
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Tabelle I Wirkungen von Acetylpolysaccharid-Präparaten (Coli) nach
intravenöser Injektion am Menschen (Mittelwerte von je drei Versuchen)
| Präparat Max. Anstieg der Max. Abfall der Max. Körpertemp. |
| (Dauer der Dosis i. v. Leucocyten in °/0 Eosinophilen ill 0/o
rektal |
| Acetylierung) (4-Stunden-Wert) (4-Stunden-Wert) (Spitze) |
| I Stunde 1 Iug g 85 Olo 76 0/, 38,2° |
| acetyliert (8-Stunden-Wert |
| 215 010) |
| 5 Stunden 50 U g - 95 Olo 62 0/0 37,8" |
| 10 Stunden 100 µg 70 Olo 6I 01e 37,5" |
| 17 Stunden 400 ,i g 62 0/o 8x 010 38,3 ° |
| (8-Stunden-Wert |
| 73 O/o) |
| 24 Stunden I500 H g 80 0/, 82 O/o 37,4 |
| (8-Stunden-Wert |
| 76%) |
An der Ratte zeigt das 5- bzw. Io-Stunden-Produkt mit Injektionsdosen
bis zu 50 und Ioo Lrg/kg i. v. das histologische Bild einer starken Nebennierenrinden-Aktivierung
ohne irgendwelche Necrosen. Während das genuine Coli-Polysaccharid schon in kleinen
Dosen das Shwartzman-Sanarelli-Phänomen auslösen kann, beobachtet man das Phänomen
auch nach hohen Dosen des passend acylierten Polysaccharids niemals.
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Klinisch bewähren sich Präparate, welche in der beschriebenen Weise
während wenigstens 5 Stunden im Acetylierungsansatz verblieben sind. Da mit der
Dauer der Acylierung die klinische Grenzreizdosis der erhaltenen Präparate ziemlich
rasch ansteigt, sind aus ökonomischen Gründen 5- bis I5-Stunden-Präparate zu bevorzugen.
Derartige Coli-Acylpolysaccharide mit Acetylgehalten von 23 bis 27 °/o oder entsprechend
acylierte Polysaccharid-Pyrogene anderer gramnegativer Bakterien können klinisch
zur Behandlung aller Erkrankungen verwendet werden, die auch auf Corticalextrakte,
Cortison oder ACTH (adrenocorticotropes Hormon) ansprechen, wie Asthma, Allergien,
manche Rheumatiden u. a. Der Vorteil einer Therapie der Stimulierung körpereigener
Hormonfunktionen gegenüber der Substitutionstherapie mit exogenen Hormonpräparaten
besteht (abgesehen von den wesentlich höheren Kosten der letzteren) unter anderem
darin, daß nach Absetzen der exogen zugeführten Hormone vielfach schwere Rückfälle
beobachtet worden sind, während diese nach Acylpolysaccharid-Reizstoff viel seltener
und dann niemals so rasch wie nach exogenen Hormonpräparaten eintreten.
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Die beschriebenen Acylpolysaccharide zeigen im allgemeinen nur in
sehr geringem Maße das Phänomen der Gewöhnung, das besonders für bakterielle Vaccine-Reizstoffe
so typisch und klinisch unerwünscht ist. Eine Gewöhnung ist im allgemeinen nur nach
der Erstinjektion deutlich; nach wenigen weiteren Injektionen können mit der gleichen
Dosis im allgemeinen stets gleichbleibende klinische Reizwirkungen ausgelöst werden.
Die Acylpolysaccharide lösen praktisch keine nachweisbaren präcipitierenden Antikörper
aus. Sensibilisierungen sind nicht beobachtet worden. Unterbrechung der Behandlung
und Wiederaufnahme nach wochen- oder monatelangen Intervallen sind unbedenklich.
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Während die genuinen Polysaccharid-Pyrogene gramnegativer Bakterien
oder die entsprechenden Vaccine bei subkutaner, intramuskulöser oder kutaner Injektion
schon in Dosen von 0,5 bis 5 jug am Menschen starke, schmerzhafte lokale entzündliche
Reaktionen ohne Allgemeinwirkungen verursachen, kann man von einem passenden Acylpolysaccharid,
z. B. Coli- 1 o-Stunden-Produkt, bis zu 100 bis 200 Mg lokal injizieren, ohne daß
entzündliche Reaktionen auftreten. Der Acylreizstoff diffundiert vielmehr langsam
in die Zirkulation und ergibt dann protrahierte und flachere Wirkung kurven, welche
vielfach klinisch erwünscht sind.
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Daher ist die Applikationsart bei den Acylpolysacchariden nicht auf
die intravenöse Injektion beschränkt, sondern kann auch auf verschiedene andere
Weisen erfolgen. Bei passender Dosierung kann ein solcher Acylreizstoff auch ohne
Gefahr ambulant appliziert werden. Die subjektiven Nebenwirkungen fehlen ganz oder
sind (gelegentlich bei der Erstinjektion) so gering, daß eine ärztliche Überwachung
des Patienten im allgemeinen nicht notwendig ist. Auch bei Überdosierung bis zur
doppelten oder dreifachen pyrogenen Grenzdosis sind die unerwünschten Nebenwirkungen
immer noch relativ gering, während Überdosierungen genuiner Polysaccharid-Pyrogene
bekanntlich mitunter zu schweren Zwischenfällen führen können.
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Die beschriebene Umwandlung eines Polysaccharid-Pyrogens in klinisch
gut verträgliche Acylpolysaccharide mit selektiver Wirkung auf das Hypophysen-Nebennierenrinden-System
durchAcylierung bei einer Mindestreaktionsdauer von 4 bis 5 Stunden bei Zimmertemperatur
gilt allgemein für Polysaccharid-Pyrogene gramnegativer Bakterien und kann prinzipiell
für jedes solcher Pyrogen nach dem gleichen Verfahren durchgeführt werden.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dargestellten Acylpolysaccharide
sind löslich in Lipoiden und Lipoidlösungsmitteln mit Ausnahme von Benzin, Benzol
und Äther; sie sind dagegen schwerlöslich in Wasser. Es ist jedoch möglich, haltbare
wäßrige Lösungen für Ampullen usw. herzustellen.
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In hoher Verdünnung lassen sich nämlich stabile wäßrige Lösungen -
speziell der Acetylpolysaccharide - erhalten, indem man zunächst das Präparat in
möglichst wenig heißem Äthanol löst und die klare, noch warme Lösung rasch in viel
kaltes Wasser einfließen läßt. Die sich bildende, nahezu klare Lösung kann nunmehr
auf die gewünschte Endverdünnung gebracht werden, bei dem Coli-Io-Stunden-Produkt
z. B. auf eine Konzentration von I00 ,ug/ccm. Derartige Lösungen sind in der Kälte
und bei Zimmertemperatur jahrelang haltbar, sie flocken nicht aus und behalten ihre
Aktivität unverändert.
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Beispiel I Die hochgereinigten proteinfreien Polysaccharide der gramnegativen
Bakterien, z. B. Coli-Polysaccharid, werden entsprechend nach den Angaben von 0.
Westphal und Mitarb., Zf. f. Naturf., 7b, I48 (I952) dargestellt, indem man die
Keime mit homogenen Phenol-Wasser-Mischungen in der Wärme behandelt, abkühlt und
die entstandenen Phasen trennt. Der abgetrennte wäßrigeRohextrakt wird durch Fraktionierung
mit Alkohol gereinigt.
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1 g Polysaccharid-Pyrogen aus Colibakterien (am besten lyophil-getrocknetes
Präparat) wird mit 4 ccm Wasser gut verrieben; es bildet sich eine viskose Masse,
der größte Teil des Materials löst sich auf. Hinzu fügt man unter gutem Rühren mit
einem Glasstab 50 ccm Pyridin. Es bildet sich eine viskoseLösung, welche nur wenig
ungelöste Flocken enthält. Hierzu gibt man nach und nach, etwa im Laufe von 20 Minuten,
50 ccm Essigsäureanhydrid,
wobei man durch gelegentliche Kühlung
mit Eiswasser dafür sorgt, daß die Temperatur des Ansatzes nicht über 25 bis 300
C ansteigt. Nachdem kein Temperaturanstieg mehr erfolgt, läßt man über die gewünschte
Reaktionszeit bei Zimmertemperatur (I8 bis 230 C) stehen, und zwar a) weitere 5
Stunden zur Darstellung des 5-Stunden-Produktes oder b), c) bzw. d) weitere I0,
I7 bzw. 24 Stunden zur Darstellung des I0-, 7- bzw. 24-Stunden-Produktes.
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Die Isolierung des Reaktionsproduktes erfolgt jeweils durch Zentrifugation
des Ansatzes, wobei sich geringe Mengen (etwa 50 mg) ungelösten Materials niederschlagen,
und Eingießen in 250 bis 300 ccm destilliertem Wasser. Ungeachtet des Auftretens
von mehr oder weniger gefälltem Material wird der Ansatz gegen dest. Wasser dialysiert.
Das trübe, teilweise flockige Innendialysat wird im Vakuum bei etwa 300 C auf ein
Volumen von etwa 10 ccm eingeengt und anschließend lyophil-getrocknet. Man erhält
jeweils I bis I,25 g Acetylpolysaccharid, das sich klar in Chloroform oder in heißem
Methanol oder Äthanol löst. Das Produkt kann durch Lösen in Chloroform und fraktionierte
Fällung mit trockenem Äther oder Petroläther wie folgt weitergereinigt werden: 1
g Acetylpolysaccharid wird in 20 cem Chloroform gelöst; hinzu fügt man 7 ccm Äther.
Die sich bildende Fällung (25 bis 30 mg) wird abzentrifugiert und verworfen. Auf
Zusatz von weiteren 21 bis 22 ccm Äther fällt das gereinigte Material nahezu vollständig
aus (etwa 850 mg). Die so gewonnenen Acetylpolysaccharid-Präparate enthalten 23
bis 27 0/e Acetyl (COCH3-Gruppen).
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Andere hochgereinigte, proteinfreie Polysaccharid-Pyrogene gramnegativer
Bakterien, z. B. die somatischen Polysaccharid-Pyrogene der Salmonellen, Brucellen,
Milchsäurebakterien u. a., dargestellt mit Hilfe des Phenol-Wasser-Verfahrens, können
nach der gleichen Vorschrift in entsprechende Acetylderivate übergeführt werden.
Für die Einhaltung bestimmter Acetylierungszeiten, vorzugsweise 5 bis 15 Stunden
bei Zimmertemperatur, gelten hinsichtlich der klinischen Wirksamkeiten und Grenzdosen
die gleichen Verhältnisse wie beim Colipolysaccharid.
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Beispiel 2 I g Polysaccharid-Pyrogen~(Coli) wird in 40 ccm Formamid
verrieben. Nach Zugabe von 20 ccm Pyridin entsteht eine klare Lösung. Nun fügt man
nach und nach 20 ccm Essigsäureanhydrid hinzu, wobei vorübergehend Gasentwicklung
beobachtet wird. Die klare Lösung wird I5 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Man gießt in 300 ccm Wasser, dialysiert ungeachtet der auftretenden Fällung bis
zum Verschwinden des Pyridingeruchs und engt im Vakuum auf etwa 10 ccm Volumen ein.
Nach Lyophiltrocknung erhält man I,I g des Acetylpolysaccharids mit 23 bis 27 0/o
Acetylgehalt als weißes, lockeres, in Chloroform lösliches Pulver.
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Beispiel 3 10 g getrocknete Colibakterien, durch Abzentrifugation
aus flüssigem Nährmedium (z. B. Hefe-Bouillon-Kultur), Waschen mit Wasser und Aceton
und anschließendes Trocknen im Vakuum gewonnen, werden mit einem Gemisch von Chloroform-Äthanol
(i : 1) mehrmals bei Zimmertemperatur extrahiert und anschließend wieder getrocknet.
Das graubraune Pulver wird 5 Stunden lang mit 20 ccm Wasser gut verrührt. Dann fügt
man 300 ccm Pyridin hinzu und schüttelt unter Zusatz von Glasperlen 1/2 Stunde auf
der Schüttelmaschine. Nun werden unter gelegentlicher Kühlung nach und nach 300
ccm Essigsäureanhydrid hinzugefügt.
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Der Ansatz wird 8 bis IO Stunden lang bei Zimmertemperatur geschüttelt.
Dann wird in 2 1 eisgekühltes Wasser eingerührt, von den Glaskugeln abgegossen und
die trübe, Flocken enthaltende Lösung dialysiert. Nach dem Einengen im Vakuum auf
etwa 30 bis 40 ccm Volumen wird der gesamte Ansatz lyophil getrocknet. Ausbeute
9,5 g. Das so gewonnene Material wird I2 Stunden lang mit einem Gemisch von so ccm
Chloroform und 120 ccm Äthanol geschüttelt. Nach Hinzufügen von weiteren 200 ccm
Äthanol wird kurz auf 6c bis 700 C erwärmt und zentrifugiert. Der ungelöste Rückstand
wird noch zweimal in gleicher Weise extrahiert. Es hinterbleiben 4,I5 g ungelöstes
Material. Die vereinigten, schwach gelben Extrakte werden bei vermindertem Druck
zur Trockne eingeengt. Den Rückstand nimmt man in 15 ccm Chloroform auf und entfernt
wenig unlösliches Material durch Filtration oder Zentrifugation. Der Acetylpolysaccharid
wird anschließend durch Äther und/oder Petroläther als grau weißes Pulver gefällt.
Ausbeute: 550 bis 650 mag. Acetylgehalt: 22 bis 270/0.
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Beispiel 4 I g Polysaccharid-Pyrogen (Coli) wird in 4 ccm Wasser
gut verrieben. Man fügt 50 ccm Pyridin hinzu und erhält eine fast klare Lösung.
Bei Zugabe von 50 cem Propionsäureanhydrid scheidet sich eine starke Fällung aus,
welche sich nach weiteren 5 Minuten gelöst hat. Die Zugabe weiterer IO ccm Propionsäureanhydrid
ergibt keine weitere Fällung. Der klare Ansatz bleibt IO Stunden bei Zimmertemperatur
stehen. Dann wird in I,51 eiskaltes Wasser eingegossen. Die ausgeschiedenen weißen
Flocken werden auf einer Glasfilternutsche abfiltriert, mit Wasser gewaschen und
im Vakuumexsikkator getrocknet. Ausbeute: I,I bis 1,3 g.
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Propionylgehalt: 29 bis 35°/0. Das Präparat ist in den meisten organischen
Lipoidlösungsmitteln leicht löslich.