Verfahren zur Darstellung therapeutischer Reizstoffe
Es ist bekannt, da¯ eine Reihe somatischer Polysaccharide und Polysaccha. rid-Symplexe gramnegativer Bakterien starke Reizstoffe sind. Sie sind deshalb wiederholt zur klinischen Anwendung bei der Reiztherapie vorgeschlagen worden. Es ist ferner bekannt, dass eine wesentliche Wirkung derartiger Bakterien-Polysaccharide oder ihrer Symplexe darin besteht, dass sie eine Stimulierung der Hypophysen-Nebennierenrinden-Funktion her vorrlifen. Injiziert man jedoeh derartige Bakterienpolysaceharidle oder ihre Symplexe in der Klinik zum Zweeke einer therapeutischen Nebennierenrinden-Stimu.
Lilerung, so muss man im allgemeinen ausser der erwünschten Wirkung eine Reihe von Nebenwirkungen in Kauf nehmen, wie das Auftreten starken Fie hers, Belastungen des Kreislaufes, erhebliche Verschiebungen im weissen Blutbild (Links- versehiebung) u. a. Am Tier lässt sich histo- logisch an den Nebennieren (z. B. bei Ratten) zeigen, dass nach der Injektion therapeuti- scher Dosen genuiner Bakterienpolysaceharide, ihrer Symplexe oder entsprechender bakte- rieller Vaeeine, das derart aktivierte Organ nach 1-2 Tagen regelmässig kleinere oder grössere Necrosen aufweist, die nur langsam verschwinden.
Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Darstellung von Reizstoffen für Zwecke der klinischen und ambulanten Reiztherapie, das dadurchgekennzeichnet,ist,dass man pyrogene Polysaccharide gramnegativer Bakterien mindestens 3 Stunden mit einem Acylierungsmittel behandelt.
Es wurde nÏmlich gefunden, da¯ es m¯glieh ist, durch Einwirkung van Acylierungs- mitteln auf Bakterienpolysaceharide Stoffe zn erhalten-Acyl-polysaecbaride-welche in passender Dosierung nach intravenöser, intramuskularer oder kutaner Injektion eine kräftige Stimulierung des Hypophysen-Neben- nierenrinden-Systemsbewirken, wobei Fieber-, Kreislauf- oder Leucocytenwirkungen minimal sind oder teilweise ganz fehlen. Am Tier ergibt sich histologisch, da¯ auch bei therapeutischer Überdosierung trotz starker Aktivierung keinerlei Neerosen in den Nebennieren auftreten.
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung der- artiger Acylpolysaceha. rdde diienen vorzugs- weise somatische Polysaccharide gramnegativer Bakterien, wie man sie mit Hilfe eines Phenol/Wassser-Verfahrens [Schweizer Patent Nr. 308684 ; 0. Westphal et al., Zf. Naturf. 7b, 148 (1952)] darstellen kann. D.ieAcylierung kann in an sich bekannter Weise angesetzt werden, z. B. mittels dem Anhydrid der betreffenden organischen Säure (Acetanhydrid, Propionanhydrid u. a.), vorzugsweise mit Acetanhydrid und Pyridin mit wenig Wasser (vgl. G. G. Freeman, Biochm. J. 36, 340, 1942 ; H. P.
Treffers, (Schence 103, 387, 1946) und/oder Formamid (I. F. Carson und W. D.
Maclay, J. Am. Chem. Sac. 68, 1015, 1946).
Prinzipiell ist es auch möglieh, die getrock neten Bakterien direkt zu aeylieren. Aus dem Reaktionsprodwkt kann die Acylpolysaccharid Fraktion in Lösung gebracht werden, während die übrige bakterielle Substanz ungelöst bleibt. A. us der Losung kann das Acylpolysaccharid in einfacher Weise isoliert werden.
Wie gesagt, lϯt man die Aeylierungmit- tel erfindungsgemäss mindestens 3 Stunden auf die Polysaeeharide einwirken.
Es hat sich nämlieh überraschend gezeigt, da¯ die Gewinnung klinisch optimaler PrÏparate nieht so sehr von einem bestimmten Acylierungsgrad des Endproduktes, als vielmehr von der Dauer des Kontaktes der Substanz im Aeyliertmgsgemisch abhängt, indem ansser der eigentlichen Acylierung noch eine weitere Wirkung des Acylierungsgemisches auf das Reaktionsprodukt eintritt. Für die Acetylierung von Polysacchariden aus Coli Bakterien ist erwiesen, dass es sich dabei um eine Depolymerisation handelt.
Beispielsweise ergibt die Acetylierung eines hoehgereinigten Polysaccharid-Pyrogens aus Colikeimen mittels Pyridin, wenig Wasser und Essigsäureanhydrid bei stets gleichem Ansatz nach 1, 5, 10, 17 und 24 Stunden Reaktionsdauer bei Zimmertemperatur fünf in Chloroform l¯sliche Acetylpolysaccharid-Produkte von praktisch der gleichen analytischen Zusammensetzung. Bei der Prüfung am m Tier und am Menschen zeigen diese fünf Präparate indessen sehr verschiedene Wirksamkeit.
Das 1-St. unden-Produkt übt auf den Menschen nahezu die gleichen Einflüsse aus wie das Aussgangspolysaeeharid (das genuine Pyrogen) und zeigt schon bei der intravenösen Injek- tion von nur 1, Ág starke, unerw nschte Nebenwirkungen (¯belkeit, Fieber, Kollapsneigung msw.).
Die pyrogene Grenzdosis bei dem 5 Stunden-Produkt hat sich auf 25-50 Ág i. v., beim 10-Stunden-Produkt auf 50-100 ug, beim 16-Stunden-Produkt auf 300-500 Ág und beim 24-Stunden-Produkt. auf 1000 bis 1500 Ág verschoben
Die länger als 4 Stunden acetylierten Produkte zeigen bei den genannten Grenzdoseii keine initiale Leucopenie und nur mässige Leucocytosen nach 4-8 Stunden, wenig oder gar kein Fieber, keine Aussehüttung von stab- kernigen, wohl aber signifikante Eosinopenien.
Die subjektiven Nebenwirkungen sind ver- gleichsweise gering. ¯ber entsprechende Werte am gesunden Menschen orientiert Ta. belle 1.
Bei Patienten liegt die Dosis mitunter niedri- ger, z. B. bei der halben Dosis.
Tabelle 1
Wirkungen von Acetylpolysaccharid-PrÏparaten (Coli) nach intraven¯ser Injektion am
Mensehen (Mittelwerte von je drei Vers-Lichen) -parant Maximaler Anstieg Maximaler Abfall Maximale (Dauer der Dosis der Leucocyten der Eosinophilen K¯rpertemperatur Acetylierung) i.v. in % in % rektal (4-Stundenwert) (4-Stundenwert) (Spitze)
1 Stunde 1, ug 85% 76% 38, 2 (8-Stundenwert
215% !)
5 Stunden 50 Ág 95% 62% 37, 8
10 Stunden 100 Ág 70% 61% 37, 5 17 Stunden 400 ug 62% 81% 38, 3 (8-Stundenwert 73 /o) 24 Stunden 1500, ug 80% 82% 37, 4¯ (8-St.
undenwert
76 /o)
An der Ratte zeigt das 5-bzw-10-Stunden-Produkt mit Injektionsdosen bis zu 50 und 100 Ág/kg i. v. das histologische Bild einer starken Nebennierenrinden-Aktivierang olme irgendwelehe Neerosen. Während das genuine Coli-Polysaceharid schon, in kleinen Dosen das Shwartzman-Sanarelli-Phänomen auslosen kann, beobachtet man das Phänomen auch nach hohen Dosen dles passend aeylierten Polysaccharids niemals.
Kliniseh bewähren sich Präparate, welche in der besehriebenen Wense während wenig- stens 3 Stunden im Aeylierungsansatz verblieben sind. Da mit der Dauer der Acylierung die klinische Grenzreizdosis der erhaltenen Präparate ziemlich rasch ansteigt, sind aus ökonomischen Gründen3-bis10-Stunden-Prä- parate zu bevorzugen.
Derartige Coli-Acylpolysaccharide mit Acetylgehalten von 23 bis 27 /o oder entsprechend acylierte Polysaccha- rid-Pyrogene anderer gramnegativer Bakte- rien können klinisch zur Behandlung aller Er krankungen verwendet werden, die auch auf Cort. icalextralite, Cortison oder ACTH (adrenocorticotropes Hormon) ansprechen, wie Asthma, Allergien, manche Rheumatiden u. a. Der Vorteil einer Therapie. der Stimulie- rang körpereigener Hormonfunktionen gegen- über der Substitutionstherapie mit exogenen.
Hormonpräparaten besteht (abgesehen von den wesentlich höheren Kosten der letzteren) tinter anderem darin, da, ss nach Absetzen der exogen zugef hrten Hormone vielfach schwere Rüekfälie beobachtet worden sind, während diese nach Verabreichung von Acylpoly- saccharid-Reizstoff viel seltener und dann niemals so rasch wie nach exogenen Hormonprä parat. en eintreten.
Die beschriebenen Acylpolysaccharide zeigen im allgemeinen nur in sehr geringem Masse das Phänomen der Gewöhnung, das besonders für bakterielle Vaccine-Reizstoffe so typisch und klinisch unerwünscht ist. Eine Gewöhnung ist im allgemeinen nur nach der Erstinjektion deutlieh ; nach wenigen weiteren Injektionen können mit der gleichen Dosis im allgemeinen stets gleichbleibende klinische Reizwirkungen ausgelost werden. Die Acylpolysaccharide l¯sen praktisch keine nachweis- baren prÏcipitierenden Antikörper aus. Sensi bilisierungen sind nicht beobachtet worden.
Unterbrechung der Behand'lung und'Wieder- aufnahme nach wochen- oder monatelangen Intervallen sind unbedenklich.
Während, die genuinen Polysaecharid Pyrogene gramnegativer Balterien oder die entsprechenden Vaccine bei subkutaner, intramuskulärer oder kutaner Injektion schon in Dosen von 0, 5-5 Ág am Menschen starke, schmerzha. fte lokale entzündliche Reaktionen ohne Allgemeinwirkungen verursachen, kann man von einem passenden Aeylpolysaccharid, z. B. Coli-8-Stunden-Produkt, bis zu 100 bis 200 Ág lokal injizieren, ohne da¯ entz ndliche Reaktionen auftreten. Der Aeylreizstoff diffundiert vielmehr langsam in die Zirkulation und ergibt dann protrahierte und flachere Wirkungskurven, welche vielfach kli nisch erwünscht sind.
Daher ist die Appli kationsart bei den Acylpolysacchariden nicht auf die intravenöse Injektion beschränkt, sondern kann auch auf verschiedene andere'Weisen erfolgen. Bei passender Dosierung kann ein solcher Aeylreizstoff auch ohne Gefahr ambulant appliziert werden. Die subjektiven Nebenwirkungen fehlen ganz oder sind (ge legentlich bei der Erstinjektion) so gering, dass eine Ïrztliche Überwachung des Patienten im allgemeinen nieht notwendig ist.
Auch bei ¯berdosiernng bis zur doppelten oder dreifachen pyrogenen Grenzdosis sind die uner- wünschten Nebenwirkungen immer noch re- lativ gering, während Überdosierungen ge- nuiner Polysaccharid-Pyrogene bekamitlich mitunter zu schweren ZwLSehenfällen führen können.
Die besehriebene Umwandlung eineis Poly- saeeharid-Pyrogens in klinisch gut verträgliche Acylpolysaceharide mit selektiver'Wir- kung auf das Hypophysen-Nebennierenrinden System durch Acylierung bei einer Mindsst- reaktionsdauer von 3 Stunden bei Zimmertemperatur gilt allgemein für Polysaecharid Pyrogene gramnegativer Bakterien und kann prinzipiell für jedes solche Pyrogen nach dem gleichen Verfahren durchgeführt, werden.
Die nach dem. erfindungsgemässen Verfahren dargestellten Acyl-Polysaccharide sind löslich in Lipoiden und Lipoidlösungsmitteln mit Ausnahme von Benzin, Benzol und ¯ther ; sie sind dagegen schwer löslieh in Wasser. Es ist. jedoch möglieh, haMbare wässrige Lösun- gen f r Ampullen usw. herzustellen. In hoher Verdünnung lassen sich nämlich stabile wäss- rige Losungen-speziell der Acetylpolysaceharide-erhalten, indem man zunächst das Präparat in m¯glichst wenig heissem Äthanol lost und die klare, noch warme Losung rasch in viel kaltes Wasser einfliessen lässt. Die sich bildende, nahezu klare Lösung kann nvnmehr auf die gew nschte Endverdünnung gebracht werden, bei dem Coli-8-Stunden-Produkt z.
B. auf eine Konzentration von 100, ug/cm3. Derartige Lösungen sind in der KÏlte und bei Zimmertemperatur jahrelang haltbar, sie flokken nicht aus und behalten ihre Aktivität. unverändert.
Beispiel 1
Die hochgereinigten, proteinfreien Poly saeeharide der gramnegativen Bakterien, z. B.
Colipolysaccharid, werden entsprechend der Vorschrift der schweizerischen Patentschrift Nr. 308684, 0. Westphal et a1., Zf. f. Natur- forsch. 7b, 148, 1952, dargestellt (Phenol/Wasser-Verfahren). l g Polysaceharid-Pyrogen aus Colibak- terien (am besten lyophilgetrocknetes PrÏparat) wird mit 4 em3 Wasser gut verrieben ; es bildet sich eine viskose Masse, lad der grösste Teil des Materials löst sich auf. Hinzu fügt man unter gutem Rühren mit einem Glasstab 50 em3 Pyridin. Es bildet sich eine viskose Lösung, welehe nur wenig ungelöste Flocken enthält.
Hierzu, gibt man nach und nach, etwa im Laufe von 20 Minuten, 50 cm3 EssigsÏureanhydrid, wobei man durch ge legentliche Kühlung mit Eiswasser dafür sorgt, dass die Temperatur des Ansatzes nicht über 25-30 C ansteigt. Nachdem kein Temperaturanstieg mehr erfolgt, lϯt man 3-10 Stunden, vorzugsweise 8 Stunden, bei Zimmertemperatur (18-23¯ C) stehen.
Die Isolierung des Beaktionsprod. uktes er- folgt jeweils durch Zent. rifugation des An sat. zes, wobei sich geringe Mengen (etwa 50 mg) ungelösten Materials niederschlagen, und Eingiessen in 250-300 cm3 destilliertes Wasser. Ungeachtet des Auftretens von mehr oder weniger gefälltem Material wird der Ansatz gegen dest. Wasser dÏalysiert. Das trübe, teilweise flockige Innendialysat wird im Vakuum bei etwa 30 C auf ein Volumen von etwa. 10 cm3 eingeengt, und. anschlie¯end lyophil getrocknet. Man erhält jeweils 1 bis 1, 25 g Acetylpolysaccharid, das sich klar in Chloroform oder in hei¯em Methanol oder Äthanol löst.
Das Produkt kann durch Losen in Chloroform und fraktionierte Fällung mit troekenem Äther oder Petroläther wie folgt weiter gereinigt werden : 1 g Aeetylpoly- saccharid wird in 20 em3 3Chloroform gelost ; hinzu fügt man 7 cm 3 Äther. Die sich bil dense Fällung (25-30 mg) wird abzentrifugiert und verworfen. Auf Zusatz von weiteren 21-22 cm3 ¯ther fÏllt dias gereinigte Material nahezu vollstÏndig aus (etwa 850 mg).
Das so erhaltene Acetylprodtikt ist ein weisses Pulver mit 23-27% Acetyl (COOH3-Gruppen).
Andere hochgereinigte, proteinfreie Polysaccharid-Pyrogene gramnegativer Bakterien, z. B. die somatischen Polysaccharidpyrogene der Salmonellen, Brucellen, MilchsÏurebakterien u. a.., dargestellt mit Hilfe des Phe nol/Wasser-Verfahrens, können nach der gleichen Vorsehrift in entsprechende Acetylderivate bergef hrt werden. F r die Einhaltung bestimmter Acetylierungszeiten, vorzugsweise 3-15 Stunden bei Zimmertemperatur, gelten hinsichtlich der klinisehen Wirksamkeiten und Grenzdosen die gleichen VerhÏltnisse wie beim Colipolysaccharid.
Beispiel 3
1 g Polysaccharid-Pyrogen (Coli) wird in 40 cm3 Formamid verrieben. Nach Zugabe von 20 em3 Pyridin entsteht eine klare Losung.
Nun fügt man nach und nach 20 em3 Essig- säureanhydrid hinzu, wobei vorübergehend Gasentwicklung beobachtet wird. Die klare Lösung wird 15 Stunden lang bei Zimmer temperatur stehengelassen. Man gie¯t in 300 cm3 Wasser, dialysiert ungeachtet der auftretenden FÏllung bis zum Verschwinden des Pyridingeruches md engt im Vakuum auf etwa 10 cm3 Volumen ein. Nach Lyophil- trocknung erhält man 1, 1 g des s Acetylpolysaccharids mit 23-27% Acetylgehalt als wei sses, lockeres, in Chloroform lbsliches Pulver.
Beispiel 3 10 g getrocknete Colibakterien, durch Abzentrifugation aus flüssigem Nährmedium (z. B. Hefe-BouiUon-Kultu.r),'Waschen mit Wasser und Aceton und anschliessendes Trocknen im Vakuum gewonnen, werden mit einem Gemisch von Chloroform-Äthanol (1 : 1) mehr- mals bei Zimmertemperatur extrahiert und anschliessend wieder getrocknet. Das grau brame Pulver wird 5 Stunden lang mit 20 cm3 Wasser gut. verr hrt. Dann fügt man 300 em3 Pyridin hinzu und schüttelt Linter Zusatz von Glasperl. en t/2 Stunde auf der Schüttelmaschine.
Nun werden unter gelegent- licher Kühlung nach und. nach 300 em3 Essig- säureanhydrid hinzugefügt. Der Ansatz wird d 8-10 Stunden lang bei Zimmertemperatur gesch ttelt. Dann wird in 2 Lite, r eisgekühl- tes Wasser eingerührt, von den Glaskugeln abgegossen und die trübe, Flocken enthaltende Lösung'dialysiert. Nach dem Einengen im Vakuum auf etwa. 30-40 em3 Volumen wird der gesamte Ansatz lyophil getrocknet.
Ausbeute 9, 5 g. Das so gewonnene Material wird 12 Stunden lang mit einem Gemisch von 80 em3 Chloroform und 120 cm3 Äthanol geschüttelt. Nach Hinzufügen von weiteren 200 cm3 Athanol wird kurz auf 60-70"C er wärmtundzentrifug.iert. Der ungelöste Rüelstand wird noch zweimal in gleicher Weise extrahiert. Es hinterbleiben 4, 15 5 g ungelöstes Material. Die vereinigten, schwach gelben Extrakte werden bei vermin. derbem Druck zur Trockne eingeengt.. Den Rückstand ! nimmt man in 1. 5 cm3 Chloroform auf und entfernt wenig unl¯sliches Material durch Filtration oder Zentrifugation. Das Acetylpolysaecharid wird anschlie¯end durch ¯ther und/oder Petroläther als grauweisses Pulver gefällt.
Ausbeute 550-650 mg. Acetylgehalt 22 bis 27%
Beispiel 4
1 g Polysaccharid-Pyrogen (Coli) wird in 4 cm3 Wasser gut verrieben. Man f gt 50 cm3 Pyridin hinzu und erhÏlt eine fast klare L¯ sang. Bei Zugabe von 50 cm3 Propionsäure- anhydrid scheidet sieh eine starke Fällung aus, welche sich nach weiteren 5 Minuten gel¯st hat. Die Zugabe weiterer 10 em3 Propionsäureanhydrid ergibt keine weitere Fäl- lung. Der klare Ansatz bleibt 10 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird in 1, 5 Liter eiskaltes Wasser eingegossen.
Die ausgeschiedenen weissen Flocken werden auf einer Glasfiltemutsche abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuumexikator getrocknet. Ausbeute 1,1-1,3 g. Propionylgehalt : 29-35%. Das PrÏparat ist in den meisten organischen Lipoidl¯sungsmitteln leicht l¯slich.