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Verfahren zur Anreicherung eines antithyreotropen Schutzstoffes .
Die Erfindung bezieht sich auf die Darstellung eines antithyreotropen Schutzstoffes.
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Es ist bekannt, daß im Blut antithyreotrope Wirkstoffe vorhanden sind,
d. h. Stoffe, die die Wirkung des thyreotropen Hormons auf die Schilddrüse unterbinden.
Sie kommen im Blut jedoch nur in sehr geringen Mengen vor. Die Gewinnung eines solchen
Stoffes erfolgte bisher in; :der Weise, daß Serum von mit thyreotropem Hormon vorbehandelten
Tieren mit Azeton fraktioniert gefällt wurde. Die eiweißfreien Extrakte enthalten
den antithyreotropen Wirkstoff. Nach einem anderen Verfahren gelingt es, den antithyreotropen
Wirkstoff mit Äther aus Blut nicht vorbehandelter Tiere oder aus Menschenblut zu
extrahieren. -Es wurde gefunden, daß man ein wesentlich reineres, geschmack- und
geruchloses, in nlioo Natronlauge lösliches Produkt in guter Ausbeute erhalten kann,
wenn man die Wirkstoffe aus wäßrigen Zubereitungen der Ausgangsstoffe mit solchen
in organischen wasserlöslichen Lösungsmitteln löslichen organischen Säuren ausfällt,
die aus ihren Lösungen durch Wasser fällbar sind. Besonders geeignet für diesen
Zweck ist die Benzoesäure; doch kann man auch .andere Säuren mit entsprechenden
Eigenschaften, wie Saldcylsäure, Naphtholcarbonsäuren, Phthalsäureu.a., verwenden.
Als Ausgangsstoffe kommen in Betracht Blut, Serum oder blutreiche Organe, wie Leber
oder Milz. Einen besonders hohen Gehalt an antithyreotropem Wirkstoff weist das
Hammel- oder S.chafsblut auf. Zur Erzielung reinerer Produkte kann man die Ausgangsstoffe
auch einer Vor- und/oder weiteren Nachbehandlung unterwerfen.
Die
Fällung wird zweckmäßig in der Weise durchgeführt, daß man eine alkoholische Lösung
der Säure in die wäßrige Lösung bzw. den wäßrigen Extrakt des Wirkstoffes einfließen
läßt, wobei die ausfallende Säure das wirksame Prinzip mitreißt. Die Abtrennung
von der Säure erfolgt dann in der Weise, daß der Niederschlag mit einem Lösungsmittel
behandelt wird, in dem zwar die Säure löslich ist, nicht aber der Wirkstoff.
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Die Vorbehandlung kann z. B. in der Weise erfolgen, daß das Ausgangsmaterial,
z. B. Serum; mit Aceton auf etwa 6o 0,1o Acetongehaft und mit Ammoniak auf etwa
i °/o Ainmoniakgehalt gebracht wird. Dabei fallen eiweißartige Verunreinigungen
aus, während der Wirkstoff in der wäßrig-acetonischen Lösung bleibt. Nach dein Abdampfen
des Acetons wird die wäßrige Lösung mit einer alkoliol.ischenLösung von Benzoesäuregefällt.
Naturgemäß kann man die Vorreinigung auch in anderer Weise durchführen, z. B. nach
Collip und Anderson in der Weise, daß zunächst die zwischen 6o und go °/o Acetonsättigung
gewonnene Fraktion in Wasser aufgenommen und nunmehr mit der Fällungssäure behandelt
wird.
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Man kann aber auch so vorgehen, daß man durch Behandlung mit den üblichen
eiweißfällenden :Mitteln, wie Wolframsäure, Alkohol, Pikrinsäure u. dgl., zunächst
Eiweißniederschläge erzeugt, die den Wirkstoff mitreißen. Darauf löst man den letzteren
aus dem Niederschlag durch Behandlung mit ammoniakalischem Aceton (10/, Ammoniak,
6o0/9 Aceton) heraus und unterwirft dann die gegebenenfalls durch Eindampfen konzentrierte
Lösung der Fällung mit organischen Säuren. Man kann ferner auch den Wirkstoff den
,Ausgangsstoffen. durch Behandlung finit geeigneten Adsorptionsmitteln, wie Tierkohle
u. dgl., entziehen, das Ad.sorptionsinittel -darauf mit ammoniakalischein Aceton
(i °/o Amrnoniak, 6o'/, Aceton) eluieren und das in Wasser aufgenommene Eluat in
der angegebenen Weise mit Säure fällen.
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Die Nachbehandlung des von der Benzoesäure abgetrennten Wirkstoffes
kann in der Weise erfolgen, daC1 der getrocknete Wirkstoff mit etwa 6o°(pigein Aceton,
das etwa i °l" Ammoniak enthält, extrahiert wird. Dabei geht iiii wesentlichen nur
der wirksame Anteil in Lösung. Nach (lein Eindampfen bis zur Trockne wird der Trockenrückstand
mit Aceton verrieben, filtriert und getrocknet, wobei weitere Verunreinigungen entfernt
werden. An Stelle von Aceton kann man bei der Vor- oder Nachreinigung auch andere
selektive Lösungsmittel verwenden, wie z. B. absoluten Alkohol, Essigester und andere
mehr.
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Der Aimnoniakzusatz zum Lösungsmittel empfiehlt sich aus dem Grunde,
weil die antithyreotrop wirksamen Trockenextrakte erfahrungsgemäß in alkalischen
llediuin gut löslich sind. Statt Ammoniak können aber auch andere basische Stoffe.
wie Amine oder Pvridine usw.. verwendet werden. Die nach diesem Verfahren erhaltenen
Wirkstoffe sind außerordentlich rein und gut haltbar. so daß es möglich ist, ungiftige
und injizierbare Präparate herzustellen Beispiel 1 iooo ccin Hammelserum (aus Mischblut)
«-erden nach Zugabe von i noo ccm Aqua destillata unter Rühren langsam finit einer
Lösung von 30- Benzoesäure in ioo ccm Äthylalkohol versetzt. Nach etwa 12-
bis filzstündigem Stehen im Eisschrank wird der gebildete Niederschlag zentrifugiert
und mit 50o ccm Wasser (d. h. mit 1/4 des Gesamtvolumens) gründlich auf der Zentrifuge
ausgewaschen. Flüssigkeit und Waschwasser «erden verworfen.
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Zur Entfernung der Benzoesäure übergießt man den Rückstand mit 25oo
ccin Aceton und läßt das Gemisch, das mehr als goll/o Aceton enthält, unter häufigem
Umrühren i bis Stunden bei Raumtemperatur stehen. Es ist nicht unbedingt erforderlich,
eine derartig große Menge an Aceton zu verwenden: vielmehr kommt man mit erheblich
geringeren Mengen aus, wenn man den Rückstand in bekannter Weise, z. B. durch vorsichtiges
Trocknen unterhalb 4o°. vom Wasser befreit. Anschließend wird der unlösliche Anteil
filtriert und nach Auswaschen mit 590 ccm Aceton über Phosphorpentoxvd getrocknet.
Erhalten wird ein weiß bis braun gefärbtes, in Wasser wenig lösliches, geschniack-
und geruchloses Pulver (S B). Ausbeute etwa 3o bis 35 g, d. h. 0,36 bis o,.12
g entsprechen 12 ccm Serum. Je nach der Wirksamkeit des Ausgangsserums, die jeweils
festgestellt wird, unterdrückt der Wirkstoff die Wirkung der entsprechendenMeerschweincheneinheiten
(MsE) thyreotropen Hormons. Auswertungsbeispiel 1. 2 Meerschweinchen erhalten an
sechs aufeinanderfolgenden Tagen täglich 2 ccm Ausgangsserum intraperitoneal injiziert.
Am fünften und sechsten Tage werden gleichzeitig mit dem Serum je 5 MsE thyreotropes
Hormon injiziert. Sektion und histologische Untersuchung der Schilddrüsen am siebenten
Tage. Ergebnis: Ruhedrüse.
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2. = Meerschweinchen erhalten an sechs aufeinanderfolgenden Tagen
gleiche Mengen des gewonnenen Niederschlages S B in Kochsalzsuspension intraperitoneal
injiziert. Gesamtmenge für jedes Tier c1,42 g entsprechen
12 ecin
Serum. Gesamtmenge thyreotropes Hormon wie oben ia MsE. Sektion' siebenter Tag.
Ergebnis: Ruhe..drüse.
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Zur weiteren Reinigung werden 9 g des fein pulverisierten Trockengutes
(S B) mit .4oo ccm wäßriger ammoniakalischer Acetonlösung (6o °/o Aceton, 1 °/o
Ammoniak) versetzt und zwei Stunden stark geschüttelt. Nach dem Filtrieren und erneutem
zweistündigen Schütteln des Rückstandes mit Zoo ccm Aceton-Ammoniak-Mischung wird
-das unlöslich gebliebene Anteil abzentrifugiert, mit Acetonammoniak gewaschen und
verworfen.
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Die Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer
Wasserbadtemperatur von 35 bis q.5° bis zur Trockne eingedampft. Zur Entfernung
von gefärbten Produkten wird der Trockenrückstand mit etwa 50o ccm Aceton verrieben,
filtriert und über Phosphorpentoxyd getrocknet. Es hinterbleibt ein gelbes bis braunes
Pulver, das sich in Wasser nicht vollständig löst. Ausbeute etwa 500M9 (SB.). 2o
mg, entsprechend etwa 12 ccm Serum, schützen gegen 5 MsE thyreotropen Hormons.
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Auswertungsbeispiel 2 Meerschweinchen erhalten an sechs aufeinanderfolgenden
Tagen. täglich gleiche Mengen: Trockenextrakt S B. in Kochsalzsuspension intraperitoneal
injiziert. Gesamtmenge für jedes Tier -2o mg, entsprechend 12 ccm Serum. Gleichzeitig
werden wie bei S B insgesamt 5 MsE thyreotropes Hormon verabfolgt. Sektion am siebenten
Tage. Ergebnis: Ruhedrüse.
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Bei Erhöhung der Menge an thyreotropern Hormon auf io MsE werden die
histologischen Veränderungen in der Schilddrüse nicht mehr vollständig unterdrückt.
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Das Verfahren seit schematisch wie folgt dargestellt
| Serum mit alkoholischer Benzoesäure- |
| lösung gefällt und zentrifugiert. |
| i |
| Filtrat (Verunreini- Rückstand mit Aceton behan- |
| gungen (verworfen) delt, filtriert und getrocknet. |
| Filtrat (Benzoesäure Rückstand (SB) mit Aceton- |
| [verworfen) ° Ammoniak extraliiert und filtriert. |
| 1 |
| Rückstand Filtrat zur Trockne eingedampft, |
| (verworfen) mit Aceton verrieben und filtriert. |
| Flüssigkeit Rückstand SB.., wirksam |
| (verworfen) gegen thyreotropes Hormon. |
Beispiel 2 Man kann auch so vorgehen, daß man die nach der Fällung mit Benzoesäure
und der weiteren Reinigung mit ammoniakalischer Acetonlösung erhaltenen Lösungen
nicht, wie in Beispiel i beschrieben, zur Trockne verdampft, sondern nur bis zum
Verjagen des Acetons und Ammoniaks (in dem angegebenen Beispiel bis auf etwa 200
ccm) eindampft und anschließend erneut mit einer Lösung von q. g Benzoesäure in
iz ccm Alkohol versetzt. Nach dem Filtrieren und Waschen des dabei gebildeten Niederschlages
mit
50 ccm Wasser wird der Filterrückstand i bis = Stunden mit
250 ccm Aceton stehen gelassen. zentrifugiert und getrocknet. Das so erhaltene
Produkt weist eine noch höhere Wirksamkeit als das nach Beispiel z gewonnene auf,
nämlich 10 MSEj2o mg. Beispiel 3 7oo ccm Serum werden nach Zugabe von 28 ccm 25°1oiger
Ammoniaklösung unter Rühren langsam mit einer Lösung von 42 ccm 25°/oigem Ammoniak
in io5o ccm Aceton versetzt, so daß die Gesamtmischung etwa 6o°/, Aceton und 1 °1o
Ammoniak enthält. Es bildet sich sofort ein. gelbroter bis weißer Niederschlag,
der zwei Stunden auf der Maschine stark geschüttelt wird. Anschließend wird zentrifugiert
und der Rückstand nochmals mit q.2o ccin des Aceton-Ammoniak-Gemisches zwei Stunden
auf der Schüttelmaschine extrahiert. Nach dem Zentrifugieren und Waschen mit Zoo
ccm der Aceton-Ammoniak-Mischung wird der Rückstand mit reinem Aceton, übergossen,
filtriert und getrocknet. Er stellt ein braunes bis weißes Pulver dar, das keine
bzw. nur geringe antithyreotrope Wirksamkeit besitzt:
Zur Geninnung
des antithyreotropen Wirkstoffes werden die bei der Extraktion erhaltenen Lösungen
vereinigt und bei 3o bis 330 vorsichtig auf etwa ein Fünftel des ursprünglichen
Volumens eingeengt. Die kalte, acetonfreie, nur noch schwach atnmoniakalische Flüssigkeit
wird sodann vorsichtig mit Eisessig neutralisiert und unter Rühren langsam mit einer
Lösung von 2o g Ben.zoesäure in
70 ccm Alkohol versetzt. Nach 12stündigem
Stehen im Eisschrank wird der weiße Niederschlag abzentrifugiert, in 5oo ccrn Aceton
eingetragen und die Mischung unter häufigem Umrühren etwa il;, bis 2 Stunden bei
Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend -wird der weiße Bodensatz filtriert,
mit Aceton gewaschen und über Phosphorpentolyd getrocknet. Dabei fällt ein geruch-
und geschmackloses, weißes, in n/ioo Natronlauge klar lösliches Pulver in einer
Ausbeute von 5,4g an, d. h. o, i g entsprechen 12 ccm Serum. je nach der Wirksamkeit
des Ausgangsserums unterdrücken o,i g Trockensubstanz = 12 ccm Serum die Wirkung
entsprechender Mengen thyreotropen Hormons.
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Wirksame Produkte werden auch erhalten, wenn man die bei der Extraktion
gewonnenen Lösungen bei 30 bis 35° his zur Trockne eindampft und den antithyreotrop
wirksamen Trockenrückstand nach Wiederauflösen einer Fällung mit organischen Säuren
unterwirft. Auswertungsbeispiel 2 Meerschweinchen erhalten an sechs aufeinanderfolgenden
Tagen täglich gleiche Mengen der Trockensubstanz in Kochsalzlösung suspendiert intraperitoneal
injiziert. Gesamtmenge für jedes Tier o,i g entsprechend 12 ccm Serum. Am fünften
und sechsten Tage werden gleichzeitig mit der Trockensubstanz je 5 MSE thyreotropes
Hormon injiziert. Sektion und histologische Untersuchung der Schilddrüsen am siebenten
Tage. Ergebnis: in beiden Fällen Ruliedriise. Beispiel d. #"oo ccm Hammelblut werden
mit Zoo ccm Wasser verdünnt, mit 13g Aktivkohle versetzt und i bis 2 Stunden auf
der Schüttelmaschine stark geschüttelt. Nach Abtrennen der Kohle wird die biologische
Wirksamkeit der Lösung ausgewertet (s. Beispiel). Das Kohleabsorbat wird mit 4O0
ccm einer i °/o Ammoniak und 6o01, Aceton enthaltenden Lösung i Stunde geschüttelt,
.zentrifugiert und die gewonnene kohlefreie Lösung unter vermindertem Druck bei
3o bis ¢o° bis zur Trockne eingedampft. Man: erhält dabei 3,3 g eines grünlichbraun
gefärbten Pulvers, das den Schutzstoff enthält (s. Auswertungsbeispiel). Die wäßrige
Lösung desselben wird dann in der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen
Art und Weise durch Fällung mit Benzoesäure in ein noch reineres Produkt übergeführt.
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Auswertungsbeispiel i. Ausgangsblut: i Meerschweinchen erhält an sechs
aufeinanderfolgenden Tagen täglich 2 ccin Blut interperitoneal und am fünften und
sechsten Tage gleichzeitig je 2,5 Einheiten tliyreoptropes Hormon injiziert. Sektion
und histologische Untersuchung der Schilddrüse am siebenten Tage ergab: -Normale
Drüse.
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2. Prüfung des mit Kohle behandelten Blutes. 2 Meerschweinchen erhalten
wie oben täglich 2 ccm Serum intraperitoneal injiziert. Am fünften und sechsten
Tage erhält ein Tier je 2,5, das andere je ; Einheiten thyreotropes Hormon. Sektion
und histologische Untersuchung der Schilddrüse am siebenten Tage: In beiden Fällen
Basedow-Infizierung.
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3. Prüfung des durch Eluierung der Kohle gewonnenen Trockenrückstandes:
2 Meerschweinchen erhalten an sechs aufeinanderfolgenden Tagen täglich gleiche Mengen
des Pulvers in Kochsalzlösung suspendiert intraperitoneal injiziert. Gesamtmenge
für jedes Tier o,2 g. Am fünften und sechsten Tage werdendem einen Tier täglich
5, dem anderen täglich io Einheiten thyreotropes Hormon injiziert. Sektion und histologische
Untersuchung der Schilddriise am siebenten Tage: In beiden Fällen Ruhedrüse.