DE2748132C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Zucker, von Glycerophosphat oder Glutaminat zur Stabilisierung von Meningokokkenpolysacchariden.

Im besonderen betrifft die Erfindung die Stabilisierung Meningokokkenkapselpolysaccharide der Gruppe A.

Die bekannten Impfstoffe gegen die von Meningokokken verursachten Meningitis enthalten als wesentliche Wirkkomponenten gruppenspezifische Polysaccharide, die aus Meningokokken der serologischen Gruppen A und C isoliert werden können. Die Polysaccharide werden aus Meningokokkenkulturen hergestellt und durch verschiedene Fällungs- und Extraktionsschritte gereinigt (vgl. E. C. Gotschlich et al., Progr. immunbiol. Standard., Vol. 5, pp. 485-491, Karger, Basel, 1972 und WHO Technical Report Ser. No. 594, S. 66/67, 1976).

Meningokokkenpolysaccharide und die daraus hergestellten Impfstoffe zeigen häufig keine befriedigende Lagerstabilität, wodurch die immunisierende Wirksamkeit der Wirkstoffe leidet. Sogar im trockenen, d. h. lyophilisierten Zustand weisen die Meningokokken-Vaccinen eine ungewöhnliche Instabilität auf. Selbst bei einem Wassergehalt von weniger als 1% in der Trockenmasse hydrolysiert das Material bei Lagerung um etwa 4°C im Laufe einiger Monate nachweisbar, bei höheren Temperaturen bereits innerhalb einer Woche. Meningokokkenpolysaccharide werden deshalb in der Regel tiefgefroren aufbewahrt.

Die Hydrolyse der Meningokokkenpolysaccharide führt zu einer Depolymerisierung und damit zu einer nicht erwünschten Herabsetzung der Immunogenität des sie enthaltenden Impfstoffs. Die Depolymerisierung kann durch Bestimmung der veränderten Molekulargewichte mittels Chromatographie verfolgt werden.

In "Freeze Drying and Advanced Food Technology, Academic Press 1975, Seiten 95, 96, 463 Abs. 1 und Seiten 467 bis 469" sind Glucose, Saccharose, Lactose sowie Gemische von Saccharose und Glutaminat als Stabilisierungsmittel beim Lyophilisieren von Impfstoffen genannt.

Durch Untersuchungen des Rÿks Institut voor de Volksgezondheid, Bilthoven, Bull. Wld. Hlth. Org., 55, 43-98, 1977, ist bekannt, daß Lactose eine erhebliche Steigerung der Lagerstabilität der Meningokokkenpolysaccharide bewirkt.

Eine Erklärung für die Erhöhung der Stabilität durch Lactose gegenüber dem bis dahin verwendeten, jedoch nicht befriedigenden Mannit konnte nicht gegeben werden.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß hydratbildende Verbindungen, die unter den Bedingungen der Gefriertrocknung entwässert werden und anschließend reversibel hydratisieren, Meningokokkenpolysaccharide zu stabilisieren vermögen.

Insbesondere sind dies Saccharose, Raffinose, Glucose, Trehalose, Glycerophosphat und Glutaminat sowie schließlich Lactose. Bevorzugt sind Saccharose und Raffinose, allein oder in Mischungen mit einer der anderen genannten Verbindungen. Mit Ausnahme von Lactose allein bilden sie als Stabilisatoren für Meningokokkenpolysaccharide den Gegenstand der Erfindung.

Zur Stabilisierung wird auf etwa 100 µg Meningokokkenpolysaccharid in wäßriger Lösung mindestens 0,3 mg, vorzugsweise 1 bis 100 mg der Verbindungen zugesetzt. Die genannten Gewichtsmengen befinden sich etwa in 1 ml einer wäßrigen Lösung, die als Impfstoff geeignet ist.

Gegenstand der Erfindung ist demnach die Verwendung von Saccharose, Raffinose, Glucose, Trehalose, Glycerophosphat oder Glutaminat, gegebenenfalls im Gemisch mit der dafür bekannten Lactose, als Stabilisator für Meningokokkenpolysaccharide.

Zu diesem Zweck wird zu einer wäßrigen Lösung von Meningokokkenpolysaccharid statt Lactose auf etwa 100 µg Polysaccharid mindestens 0,3 mg einer anderen, unter den Bedingungen der Gefriertrocknung reversibel zu entwässernden, Hydrat bildende Verbindung zugesetzt, wonach die Mischung getrocknet, vorzugsweise gefriergetrocknet wird. Die zu stabilisierende wäßrige Lösung des Meningokokkenpolysaccharids kann sowohl ein Zwischenprodukt für die Impfstoffherstellung als auch bereits eine für die parenterale Applikation geeignete Impfstoffzubereitung darstellen.

In einer weiteren Ausführungsform wird mindestens eine der stabilisierenden Verbindungen in einer Konzentration von 5 bis 20 mg/ml der zu applizierenden Impfstofflösung verwendet. Bei einem zu hohen Gehalt an Stabilisator, z. B. bei Saccharose über 100 mg pro ml, ergeben sich hypertonische Lösungen, so daß es für die parenterale Applikation einer entsprechenden Polysaccharidvaccine nicht zweckmäßig erscheint, diese Konzentration zu überschreiten.

Obwohl die erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen nach einer folgenden Lyophilisation der Lösung dem Meningokokkenpolysaccharid eine ausgezeichnete Stabilität verleihen, kann es manchmal zweckmäßig sein, die Stabilisatoren nicht allein, sondern zusammen mit anderen Verbindungen zur Stabilisierung der Meningokokkenpolysaccharide einzusetzen. Derartige Mischungen zeigen gelegentlich auch einen synergistischen Effekt und führen zu einer weiteren Erhöhung der Lagerstabilität der Meningokokkenpolysaccharide. Ein derartiger Synergismus wird insbesondere bei Mischungen von zwei der genannten Stabilisatoren im Molverhältnis von 1 : 2 bis 2 : 1 gesehen.

Für die Herstellung des Meningokokkenpolysaccharids geht man zweckmäßig nach WHO Technical Report Ser. Nr. 594, S. 66/67, 1967, wie folgt vor:

Eine Meningokokkenkultur oder deren Kulturüberstand wird mit 0,1-0,3% Cetyltrimethylammoniumbromid (= Cetavlon) versetzt und die Fällung nach 2-24 Stunden durch Sedimentation oder Zentrifugation gewonnen. Anschließend wird das Sediment mit einer 0,8-2 molaren, vorzugsweise 1 molaren wäßrigen Lösung von Calciumchlorid extrahiert, mit Äthanol bis zu 20-30%, vorzugsweise 25% (v/v) versetzt und der Überstand durch Zentrifugation gewonnen. Das Zwischenprodukt wird durch weitere Zugabe von Äthanol bis zu 70-85%, vorzugsweise 80% (v/v) ausgefällt und durch Zentrifugation gewonnen.

Das Zwischenprodukt wird sodann in einem neutralen bis schwach basischen wäßrigen Medium aufgenommen, z. B. in einer 0,1-0,4 M Natriumacetatlösung und danach mit Phenol extrahiert. Es wird eine Puffer-gesättigte Phenollösung verwendet (Zusammensetzung: 100 g Phenol + 40 ml Puffer). Die wäßrige Phase wird gegen 0,1 M Calciumchloridlösung dialysiert und einer Ultrazentrifugation unterworfen. Schließlich wird das Polysaccharid mit Hilfe eines Alkohols, vorzugsweise Äthanol, ausgefällt und getrocknet. Dieses Material wird bei -20°C gelagert.

Das wieder aufgelöste Meningokokkenpolysaccharid wird wie oben beschrieben mit mindestens einer stabilisierenden Verbindung, gegebenenfalls mit weiteren Zusätzen, versetzt und lyophilisiert.

Eine entsprechende Vaccine hat beispielsweise folgende Zusammensetzung.

1. N. meningitidis Gruppe A Polysaccharid|2,5 mg
Saccharose	250 mg

Das lyophilisierte Produkt zeigt während 3monatiger Lagerung bei 37°C praktisch keine Abnahme des Polymerisationsgrades. Der K _d -Wert, der zu Beginn der Lagerung 0,26 betrug, stieg auf 0,29 an. Demgegenüber zeigte eine unter gleichen Bedingungen mit Lactose stabilisierte Probe einen Anstieg des K _d -Wertes von 0,26 auf 0,35.

Für die Applikation als Vaccine wird das Lyophilisat mit 25 ml eines physiologisch verträglichen Lösungsmittels aufgelöst. Hierfür wird verwendet eine Lösung die enthält:
7 mg NaCl/ml, 0,015 mol/l Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, 0,05 mg Natriumtimerfonat/ml.

2. N. meningitidis Gruppe A Polysaccharid|2,5 mg
Lactose	125 mg
Saccharose	125 mg

Während der Lagerung des lyophilisierten Materials bei 56°C nimmt der K _d -Wert des Polysaccharids innerhalb von 2 Monaten von 0,26 auf 0,48 zu. Parallel mit 250 mg Lactose oder 250 mg Saccharose versetzte Produkte zeigen nach dem gleichen Zeitraum K _d -Werte größer 0,7.

K _d wird durch Chromatographie auf Sepharose® 4B ermittelt und ist durch folgende Gleichung definiert:

V _e = Das Volumen des Eluats ab Start der Chromatographie bis Elutionsmaximum der Hauptkomponente des Polysaccharidantigens.
V _o = Das Elutionsvolumen einer total exkludierten Substanz, z. B. hochmolekularem Blue Dextran.
V _T = Das Elutionsvolumen einer total inkludierten Substanz, z. B. radioaktiv markiertem Wasser.

Die Definition bedeutet, daß 0 K _d 1. Die Grenzwerte werden bei einer vollständig exkludierten Substanz (K _d = 0) oder bei einer vollständig inkludierten Substanz (K _d = 1) erreicht. Bei einem höheren K _d -Wert ist die Molekülgröße vermindert. In dem hier vorliegenden Fall zeigt ein steigender K _d -Wert an, daß das Meningokokkenpolysaccharid depolymerisiert.

Die Vorteilhaftigkeit einer Stabilisierung von Meningokokkenpolysaccharid in der erfindungsgemäßen Weise geht aus der folgenden Tabelle hervor.

Stabilisierung von Meningokokkenpolysaccharid Gruppe A

Lösungen mit Meningokokkenpolysaccharid Gruppe A wurden mit Stabilisatoren versetzt und lyophilisiert. Nach Lagerung wurden die K _d -Werte als Maß für die Stabilität des Polysaccharids bestimmt.

Claims (1)

1. Verwendung von Saccharose, Raffinose, Glucose, Trehalose, Glycerophosphat oder Glutaminat, gegebenenfalls im Gemisch mit der dafür bekannten Lactose, als Stabilisator für Meningokokkenpolysaccharide.