DE4231675C2

DE4231675C2 - Mittel zur Steigerung der Ausbeute von Antikörpern in der Immunologie

Info

Publication number: DE4231675C2
Application number: DE19924231675
Authority: DE
Original assignee: Gerbu Biotechnik GmbH
Current assignee: Gerbu Biotechnik GmbH
Priority date: 1992-09-22
Filing date: 1992-09-22
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2012-09-23
Also published as: DE4231675A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Herstellung neuartiger Zubereitungen von immunologischen Adjuvantien, welche bei einfacher Anwendung eine große Menge an Antikörpern liefern ohne den zu immunisierenden Organismus zu belasten, basierend auf bisher unbekannten Eigenschaften von Glyco peptiden aus der Kapselsubstanz von Bakterien.

Will man in einem Wirbeltier oder beim Menschen Antikörper erzeugen in dem man auf parenteralem Wege Antigene zuführt, so ist es meist erfor derlich, die Bildung derselben durch gleichzeitige Verabreichung eines Adjuvans zu stimulieren. Im Humanbereich ist dies Adjuvans fast ausschließlich kolloidales Aluminiumhydroxid, bei Tieren nimmt man das von FREUND (vergl. Freund, J. 1956 Advances in Tuberculosis Research 7, 130) eingeführte Adjuvans, eine Paraffinölemulsion kombiniert mit be stimmten abgetöteten Mycobakterien, welche wegen ihrer unvergleichlich guten Wirksamkeit trotz ihrer gravierenden Nachteile auch heute noch fast ausschließlich in Gebrauch ist.

Die Ölemulsion nach Freund erzeugt nämlich hartnäckige Geschwülste an der Stelle des Emulsionsdepots, welche das Allgemeinbefinden der Tiere so stark beeinträchtigen, daß es zu unwirtschaftlichen Ausfällen kommt, abgesehen von den ethischen Bedenken gegen so aggressive Mittel, und nicht zu reden von einer Verwendung am Menschen, die völlig außer Be tracht steht.

Mycobacterien wie die von Freund zur Komplettierung vorgeschlagenen M. tuberculosis oder M. butyricum sind ebensowenig harmlos. Auch sie machen Granulome und Fieber sowie Abszesse an der Einstichstelle: Warren, H.S. & Chedid, L.A. 1988 CRC Critical Reviews in Immunolgy 8, 83-101.

Die Aufgabe, durch Verbesserung der Freundschen Formel ein wirksameres und vor allem ein verträglicheres Adjuvans zu finden ist daher seit 40 Jahren aktuell und wird es immer mehr bei der steigenden Bedeutung immu nologischer Techniken und bei dem zunehmenden Bewußtsein für die Schutzbedürftigkeit der Tiere und entsprechendem Druck der Gesetzgebun gen. Es hat daher nicht an Versuchen in dieser Richtung gefehlt. So sind neuerdings Emulsionen beschrieben worden, welche aus verträg licheren Materialien bestehen, wie etwa Squalan oder Squalen als Öl und Blockpolymeren aus Polyäthylenglykol und Polypropylenglykol als Emulga toren z. B. US Pat 3 749 164, US Pat 5 217 493, Allison, A.A. & Byars, Noelene E. Journal of Immunological Methods 95, 157-168, Hunter, R.L. & Beth, B 1984, J. Immunology 133, 3167-75.

Weiters wurde gezeigt, daß Mycobakterien durch Bausteine aus deren Kap selsubstanz ersetzt werden können, welche größere Körperverträglichkeit aufweisen. Besonders beschrieben und synthetisiert wurde N-Acetylmura myl-L-alanyl-D-isoglutamin (MDP) F.Pat 2 324 311 D PS 2638762, das N-Ac etylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (Thr-MDP), US Pat. 5 217 493. Aus dem Yoghurtbazillus stammt das N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L- alanyl-D-isoglutamin (GMDP), USSR PS 2 543 268, D PS 2847608. Es ist ein Homolog des MDP, welches das Wachstum von Tumoren hemmt und von welchem gesteigerte immunstimulierende Wirkungen zu erwarten ist.

Die DE 26 38 762 A1 beschreibt wasserlösliche mit Polycarbonsäuren modifizierte Adjuvantien, die aus N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure gebildeten Saccharideinheiten und an die Muramylgruppe gebundenen Peptidketten aufgebaut ist. Zum Vergleich werden in dieser Druckschrift auch die entsprechenden unmodifizierten Adjuvantien in hohen Dosierungen untersucht, die als unwirksam beschrieben werden.

Bis jetzt ist jedoch noch keine Lösung gefunden worden, welche in der immunologischen Praxis allgemein akzeptiert würde: Die neuen Emulsio nen werden keineswegs reaktionsfrei vertragen, abgesehen davon, daß sie umständlich zu bereiten sind, und die synthetischen Glykopeptide haben sich bislang den Mycobacterien nicht überlegen gezeigt, auch sind sie viel teurer.

Die Erfindung versucht auf Glykopeptide wie die oben angeführten zu rückzugreifen, weil dies durch chemische Synthese zugängliche, gut definierte, nichtaggressive Substanzen sind. Der erste Teil der breit angelegten Immunisierungsversuche an Mäusen mußte zunächst der und präzisen zahlenmäßigen Erfassung des Istzustandes dienen.

Die Literaturangaben von Autoren verschiedener Jahre und Länder erwie sen sich nämlich nur bedingt miteinander vergleichbar wegen der Verwen dung von einander abweichender Antigene, Tierstämme und Methoden. Die Ergebnisse sind in den Punkten 1 und 2 zusammengefaßt:

1. Im Freundschen Adjuvans zeigt die übliche Dosis des Mycobacteriums von 100 µg/Maus die beste Wirkung. Setzt man die Dosis herab, so wird die Wirkung erwartungsgemäß schwächer. (Tabelle 1, Versuch 3 und 4).
2. Wenn die Glycopeptide MDP und GMD dem Antigen in Dosierungen analog den Mycobacterien zugesetzt werden, also 10-100 µg/Maus, so liefern sie die bekannten, wenig beeindruckenden Ergebnisse. Dabei fiel allerdings auf, daß niedrigere Konzentrationen etwas stärker zu wir ken schienen. (Tabelle 1, Versuche 11, 12; 16, 17).
Die auf dieser Grundlage fortgeführten systematischen Versuche brachten den Kern der vorliegenden Erfindung zu Tage:
3. Setzt man nämlich die Dosis der Glycopeptide weiter herab, so wird deren Wirkung überraschenderweise immer stärker und übertrifft schließlich die von Freunds Adjuvans. Und geht man mit der Dosis weit genug herunter, dann kommt man zu einem Wirkungsoptimum. Unvermutet findet sich weiters, daß bei dieser sehr niedrigen Dosierung die Menge der gebildeten Antikörper mit oder ohne Emulsion praktisch gleich groß ist. Die Emulsion wird überflüssig! (Tabelle 1 Versuche 9-12, 15-17, Abb. 1).
4. Auch bei anderen Tieren findet man Optimaldosierungen. (Tabelle 2).

Tabelle 2

Tabelle 1

Antikörperbildung in Mäusen abhängig vom Adjuvans und dessen Dosierung

Versuchsbedingungen zu Tabelle 1

Tiere: Mäuse, b/alb Swiss. Antigen: DNP-Rinderserumalbumin 10 µg/Tier. Injektion: subcutan, 50 µl pro Injektion. Antikörpernachweis: ELISA. Nach 21 Tagen erfolgte eine zweite Injektion, nach 64 Tagen, zum Zeit punkt des Maximums an Antikörpern wurde an der Schwanzvene Blut für die Bestimmung entnommen. Eine Versuchsgruppe bestand jeweils aus 10 Tie ren, deren Blut zur Analyse vereinigt wurde. Stimulierungsindex = Anti körpertiter mit Adjuvans dividiert durch Antikörpertiter ohne Adjuvans.

Die in Tabelle 1 und 2 zusammengefaßten und in Abb. 1 dargestell ten, an Mäusen erzielten Ergebnisse führen auf folgende Schußfolgerun gen über die Wirkung von MDP und GMDP, welche nunmehr die erfindungsge mäße Herstellung eines neuartigen Adjuvans auf Basis von Glycopeptiden ermöglichen.

1. Die untersuchten Glycopeptide zeigen ein dosisabhängiges Wirkungs optimum.
2. Die Optimaldosierung liegt zwei Größenordnungen tiefer als die für M. butyricum oder M. tuberculosis im Freundschen Adjuvans.
3. Die untersuchten Glycopeptide in der Optimaldosierung sind auch ohne Ölemulsion in rein wäßriger Lösung voll wirksam.
4. Bei Optimaldosierung übertreffen die Glycopeptide in wäßriger Lö sung die Wirkung von Freundsches Adjuvans mit Mycobacterien.

Als Darreichungsform der Glycopeptide wurde die Form eines sterilen Lyophilisates in Serumfläschchen aus Glas mit einer Dosis von 10 µg bzw. 100 µg Substanz gewählt. Hierzu braucht dann nur das in Wasser ge löste Antigen zugefügt werden, worin die Glykopeptide sehr leicht löslich sind. Es hat sich aber gezeigt, daß bei der höchst geringen Menge an Glycopeptid, welche für eine Einzeldarreichung erforderlich ist, eine Adsorption am Glas stattzufinden scheint, so daß sich bei Auflösung mit Antigenlösung nicht die volle Wirkung entfaltet. Von verschiedenen Zusätzen zur Vermeidung dieses Übelstandes haben sich neutrale Aminosäuren wie Glycin, Prolin und Threonin bewährt (Tabelle 3).

Tabelle 3

Biologischer Nachweis der Adsorption und Desorption von GMDP an Glas.

Stimulierungsindex = Antikörpertiter mit Adjuvans im Verhältnis zu Antikörpertiter mit Wasser.

10 µg GMDP In 50 µl Wasser gelöst, wurden in ein 5 ml-Injektionsröhr chen aus Borosilikatglas Stufe 1 einpipettiert und gefriergetrocknet. Bei Gruppe II + III war noch 1 mg Aminosäure zugesetzt.

Lösen des Lyophilisates in 0,5 ml DNP-Albumin in Ringerlösung Impfung 50 µl/Maus Antigenlösung mit rekonstituiertem Adjuvans, subku tan. In Klammern die Zahl der für eine Versuchsgruppe angesetzten Tiere.

Claims

1. Mittel zur Steigerung der Ausbeute von Antikörpern in der Immunologie, dadurch gekennzeichnet, daß Glycopeptide in Abpackungen dargereicht werden, welche eine für das jeweilig zu immunisierende Tier charakteristische Optimaldosis zur Erzielung einer maximalen Antikörperausbeute in solcher Form enthalten, daß sie in der zugefügten wäßrigen Lösung des Antigens einfach aufgelöst werden können.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Glycopeptid N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin ist.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Glycopeptid N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin ist.

4. Mittel nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das in Glasampullen einlyophilisierte Glycopeptid den Zusatz einer leicht was serlöslichen Aminosäure wie L-Prolin enthält, der die vollständige Auf lösung des Glycopeptids in der Antigenlösung bewirkt.

5. Mittel nach Ansprüchen 1-4 für Mäuse mit einer Dosis von 1 µg Gly copeptid/Injektion.

6. Mittel nach Ansprüchen 1-4 für Hühner mit einer Dosis von 5 µg Gl ycopeptid/Injektion.

7. Mittel nach Ansprüchen 1-4 für Kaninchen mit einer Dosis von 25 µg Glykopeptid/Injektion.

8. Mittel nach Ansprüchen 1-4, für Schafe und Ziegen mit einer Dosis von ca. 50 µg Glykopeptid/Injektion.