DE69534323T2

DE69534323T2 - Verfahren zur reduzierung ungewünschter zelladhäsion

Info

Publication number: DE69534323T2
Application number: DE69534323T
Authority: DE
Inventors: Anne Margaret BAKER; Mae Betsy OHLSSON-WILHELM
Original assignee: Phanos Technologies Inc Culver City; Phanos Tech Inc
Current assignee: Phanos Technologies Inc Culver City; Phanos Tech Inc
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-04
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2015-10-05
Also published as: US5480901A; DE69534323D1; DK0784430T3; JP2007204484A; EP0784430B1; IL115534A; CA2202030A1; EP0784430A1; AU3950195A; EP0784430A4; IL115534A0; WO1996010912A1; ES2243943T3; ATE299649T1; CA2202030C; JP2000516568A; PT784430E

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Applikation von therapeutischen Mitteln, um ungewünschte Zelladhäsionen zu reduzieren. Ungewünschte Zelladhäsionen können Adhäsionen zwischen Tumorzellen und anderen Tumorzellen, Adhäsionen zwischen Tumorzellen und normalen Zellen und bestimmte Adhäsionen zwischen normalen Zellen und anderen normalen Zellen umfassen, wobei die möglichen Adhäsion aber nicht auf diese Beispiele beschränkt sind.
Tumorzellen treten in zwei unterschiedlichen Arten auf: Als Ascites (frei flotierende Zellen) und als feste Tumore (befestigt/angeheftet an Wirtsgewebe/Organe sowie an andere Tumorzellen). Die Verhinderung einer Tumorzelladhäsion und eines Tumorwachstums ist ein großes klinisches Problem. Die Kontrolle über ein lokales Wiederauftreten des Tumors nach chirurgischer Entfernung von bösartigem Krebsgewebe stellt eine besonders ernsthafte Herausforderung dar. Die Beobachtung, dass ein Tumorwachstum an der Inzisionsstelle auftritt, selbst an den histopathologisch „sauberen" Grenzen, hat zu der Schlussfolgerung geführt, dass lebensfähige Tumorzellen eine höhere Affinität zu geschädigtem Gewebe als zu normalem Gewebe besitzen. Dies ist ein besonders kritischer Aspekt von einem allgemeineren Thema, was die Verhinderung und die Kontrolle von ungewünschten Zelladhäsionen betrifft. Bei einem chirurgischen Eingriff in die Bauchhöhle aufgrund einer entzündlichen Darmerkrankung oder einer Endometriose tritt zum Beispiel oft die Komplikation einer postchirurgischen Anhaftung von normalem Gewebe an die resezierten Bereiche in einer Weise auf, die ähnlich einer Tumorzelladhäsion und Kolonisierung und Invasion der Wunde sind.
Zusätzlich zu den klinischen Beobachtungen haben experimentelle Modelle der Tumorzelladhäsion in ähnlicher Weise gezeigt, dass beschädigte Gewebe eine attraktive Stelle für das Tumorwachstum nach systemischer Injektion von lebensfähigen Tumorzellen ist. Siehe zum Beispiel S. Murthy und E. Scanlon, Hrsg., Injury and Tumor Implantation: Biological Mechanisms and Clinical Implications for Recurrence and Metastasis. R. G. Landes Co., Austin, TX 1993. Es wurde berichtet, dass spezifische Adhäsionsmoleküle und ihre Erkennungsmoleküle (Rezeptoren) eine Rolle zwischen den Tumorzellen und den endothelialen Zellen oder der extrazellulären Matrix spielen. B. Zetter, Seminars in Cancer Biology, 4: 219–229 (1993). Es gibt eine wachsende Liste an Familien von Adhäsionsmolekülen, die von Tumorzellen exprimiert werden und durch verschiedene Umweltbedingungen oder Faktoren, zum Beispiel Cytokinine, stimuliert werden.
Vor kurzem gab es einen Bericht, der belegte, dass die Darstellung von Rezeptoren oder Adhäsionsmolekülen intrazelluläre Komponenten erfordern, wie die bekannten Zytoskelettbestandteile. F. Pavalko und C. Otey, Proc. Society Exp. Biol. Med., 205: 282–293 (1994); D. Tang, et al., Cancer Res. 54: 1119–1129 (1994).
Das Zytoskelett besteht aus Microtubuli und verschiedenen Filamenten von sich selbst aufbauenden Proteinpolymeren, wie Tubulin, Vimentin und Actin. Adhäsionsmoleküle erlauben die Kommunikation zwischen der zytoplasmatischen Domäne und dem Zytoskelett, was eine Reihe von zellulären Funktionen fördert, wie Zell-Zell-Interaktionen, Zellbeweglichkeit und Rezeptor-Ligand-Interaktionen und Rezeptordarstellungen. Siehe F. Pavalko und C. Otey, siehe oben. Mittel, die mit den Microtubuli oder den Microfilamenten interagieren oder deren Zusammensetzung auflösen, können somit die Expression von spezifischen Adhäsionsmolekülen auf den Zellen verhindern oder hemmen, wodurch ihre Erkennung, die Bindung, die Anheftung und die Migration in verwundetes und heilendes oder normales Gewebe blockiert wird.
Colchizin ist ein Mittel, das an Tubulin bindet und die Depolymerisation der Microtubuli bewirkt. Es wurde gezeigt, dass die Behandlung von Tumorzellen mit Colchizin die Fähigkeit der Tumorzellen zur Bindung an das lymphatische Gewebe herabsetzt. Siehe zum Beispiel S. Islam et al., Surgery 113: 676–82 (1993). Die Behandlung von endothelialen Zellen mit Colchizin blockt in ähnlicher Weise die Tumorzellbindung an spezifische Adhäsionsmoleküle, wie dies berichtet wurde von D. Tang, et al., siehe oben. Microtubuli auflösende Mittel, die oft in Kombinationsbehandlungen für die Krebstherapie verwendet werden, können somit nicht nur als zytostatische Mittel wirken, sondern auch als Antiadhäsionsmittel und möglicherweise auch als Antimigrationsmittel, was zu einer Abnahme der Tumorverteilung und metastatischen Ausbreitung führt.
Es wurde vorgeschlagen, das Auftreten der Adhäsionsbildung, die aus chemotherapeutischen Behandlungen resultiert, welche Cisplatin und Bleomycin umfassen, zu reduzieren, indem diese chemotherapeutischen Mittel in Kombination mit einer Vincaalkaloidsubstanz, wie Vindesin, verabreicht werden. R. Molloy et al., Irish J. Med. Sci., 159(6): 175–77 (1990). Es wurde jedoch keine Technik vorgestellt für eine ortsspezifische Abgabe der vorgeschlagenen chemotherapeutischen Kombination.
Ein anderer Ansatz zur Kontrolle von ungewünschten Zelladhäsionen ist die Verwendung von physikalischen Barrieren, einschließlich mechanischen Barrieren und viskose Lösungen. Siehe zum Beispiel das US-Patent Nr. 5,250,516. Solche Barrieren können die Adhäsionsbildung durch eine Beschränkung der Gewebeapposition während den kritischen Stadien der mesothelialen Reparatur verhindern. Obgleich die Verwendung von physikalischen Barrieren für die Verhinderung einer Adhäsionsbildung eine angemessene allgemeine Akzeptanz gefunden hat, bestehen andererseits technische Schwierigkeiten.
In dem US-Patent Nr. 5,667,764, welches gemeinsam mit der vorliegenden Anmeldung besitzt wird, werden verschiedene konjugierte Verbindungen beschrieben, die ein therapeutisches Mittel oder ein Arzneimittel und ein lipohiles Zellbindungsmittel umfassen, wobei die Form der Cyaninfarbstoffe mit relativ langen Kohlenwasserstoff"schwänzen" substituiert sind. Diese konjugierten Verbindungen können stabil an die Lipidregionen der Zellmembranen binden, wodurch eine ortsspezifische Zufuhr von therapeutischen Mitteln möglich wird, entweder via lokaler in vivo Verabreichung, zum Beispiel durch Injektion, oder mittels eines Trägers für die Retention des Krankheitsortes.
WO 93/11120 stellt pharmazeutische Zubereitungen bereit, die Verbindungen für die Bindung von therapeutisch wirksamen Substanzen an lipidhaltige Biopartikel (zum Beispiel Zellen oder Viren) umfassen. Eine bereitgestellte Verbindung hat die Formel, worin das antiproliferative Mittel aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Colchizin, Vincaalkaloiden, Taxol und Derivaten davon besteht. Das chemotherapeutische Mittel kann ein antiproliferatives Mittel, wie Colchizin oder die Vincaalkaloide umfassen.
Der Artikel von Ohlsson-Wilhelm et al (Immunol Res 1994; 13: 82–95) offenbart synthetische, lipidähnliche Moleküle (Zyn-Linker) welche in Zellmembranen inserieren und die Arzneimittelzuführung zu Zellen erhöhen. Ein Colchizinderivat, das mit einem Zyn-Linker konjugiert ist, ist zum Beispiel wirksam gegen Tumore in Tiermodellen.
Die oben genannten, konjugierten Verbindungen besitzen eine Reihe von unterschiedlichen Vorteilen im Vergleich mit den Zusammensetzungen und Verfahren, die gegenwärtig für die Zuführung von therapeutischen Mitteln zu Krankheitsorten verfügbar sind. Die oben erwähnten, konjugierten Verbindungen können zu einem ausgewählten Ort im Körper geführt und dort gehalten werden durch eine stabile Assoziierung mit den Zellstrukturen an dieser Stelle. Bestehende Verfahren zur Zuführung sind entweder nicht in der Lage, ausreichende Dosierungen an den Krankheitsort ohne nachteilige, systemische Nebenwirkungen bereit zu stellen, oder sie ermöglichen keine ausreichende Retention des therapeutischen Mittels an dem Krankheitsort über einen Zeitraum und in einer Menge, die für die Herstellung des gewünschten therapeutischen Effektes ausreichend wäre.
Da ferner die Lipidregionen den größten Teil der äußeren Zellmembran umfassen, ist es möglich größere Mengen an Lipidbindungskonjugaten anzuordnen und somit eine größere Konzentration des therapeutischen Mittels in der Plasmamembran. Da die oben erwähnten, konjugierten Verbindungen stabil in die Membranlipide aufgrund ihrer hydrophoben Schwänze eingelagert werden, werden sie in wirksamer Weise eingefangen und können nicht einfach dissoziieren. Demgemäß wird eine Beschädigung der Zellen minimiert, was ungewünschte, systemische Effekte reduziert.
Weiterführende Forschungen unter Verwendung der oben erwähnten, konjugierten Verbindungen haben zu der Entdeckung der Lösung des Problems für die Reduktion von ungewünschten Zelladhäsionen geführt. Wenn diese konjugierten Verbindungen in geeigneter Weise aufgebaut und verwendet werden, können sie in wirksamer Weise ungewünschte Adhäsionen reduzieren, wie die Adhäsion von Tumorzellen an chirurgische Wunden, von Tumorzellen an normales Gewebe, von Tumorzellen an Tumorzellen, von normalen Zellen an normale Zellen, wie im Fall der chirurgischen Adhäsion.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Reduktion von ungewünschten Zelladhäsionen an einer gefährdeten Stelle bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Behandlung der gefährdeten Stelle mit einer Zusammensetzung, die eine konjugierte Verbindung aus einem Arzneimittel und einem Zellbindungsmittel in einer Menge umfasst, die für die Hemmung einer Anhaftung an diese Stelle von Zellen, die gegenüber einer unerwünschten Adhäsion empfindlich sind, wirksam ist. Die konjugierte Verbindung hat die Formel
worin B ein Arzneimittel mit einem Hemmeffekt auf ungewünschte Zelladhäsionen darstellt, und R und R₁ in dem Zellbindungsmittel Kohlenwasserstoffsubstituenten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen darstellen;
X und X₁ in dem Zellbindungsmittel können gleich oder verschieden sein und O, S, C(CH₃)₂ oder Se darstellen;
Y in dem Zellbindungsmittel ist eine Verbindungsgruppe, die ausgewählt ist aus =CR₈-, =CR₈-CR₈=CR₈-, =CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈- oder =CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈-, worin R₈ ausgewählt ist aus H, CH₃, CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₃ oder CH(CH₃)₂;
Z in dem Zellbindungsmittel einen Substituenten darstellt, der aus der Gruppe ausgewählt ist von H, Alkyl, OH, -O-Alkyl, COOH, CONH₂, SO₃H, SO₂NH₂, SH, S-Alkyl, CONH-Alkyl, CON-(Alkyl)₂, NH-Acyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)₂, NO₂, Halogen, Si(Alkyl)₃, O-Si(Alkyl)₃, Sn(Alkyl)₃ oder -Hg-Halogen, wobei die Alkylgruppen den Z-Substituenten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umfassen;
R₂ stellt eine Verbindungskomponente dar, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfasst und welche das Arzneimittel mit dem Zellbindungsmittel verbindet; und worin
A ein pharmazeutisch akzeptables Anion ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Tumorranddefinition bereitgestellt, welches das Inkontaktbringen der Region des Tumorwachstums mit einer Zusammensetzung umfasst, welche ein Arzneimittel-Zellbindungsmittel- Konjungat mit der obigen Formel I beinhaltet, welches auch entdeckt wurde hinsichtlich der Verbesserungswirkung auf die Tumorranddefinition.
Bei der Durchführung der oben dargestellten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die konjugierte Verbindung in geeigneter Weise an die beabsichtigte Stelle oder den Bereich in Form einer Spülungslösung angewandt.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung stellen einen deutlichen Fortschritt dar hinsichtlich der Anwendungsfreundlichkeit im Vergleich zu den bestehenden Barrierematerialien, zum Beispiel physiologisch kompatible Gitter, Streifen und ähnliches, die verwendet werden, um eine Schutzschicht an den Wundreparaturstellen bereit zu stellen, um so das Auftreten einer Adhäsion zu verhindern.
Zusätzlich zu der Reduktion der Zelladhäsionen können die Zusammensetzungen nach der Erfindung einen zytostatischen oder zytotoxischen Effekt auf die behandelten Zellen besitzen oder sie können ihre Empfindlichkeit gegenüber Röntgenstrahlen erhöhen.
Ferner bindet die Affinität der konjugierten Verbindung für die Zellmembranen an der Stelle der Anwendung in wirksamer Weise diese konjugierte Verbindung an diese Stelle, so dass eine nachteilige, systemische Wirkung minimiert wird.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung in Zusammenhang mit den zugehörigen Zeichnungen dargestellt bzw. werden für Fachleute deutlich werden.
Die 1A ist eine graphische Darstellung und zeigt ein Tumorwachstum (Körpergewichtszunahme) als eine Funktion der Zeit nach Tumortransplantation. Die Testtiere, welche die transplantierten Tumore trugen, wurden nach der Tumortransplantation mit bestimmten, bevorzugten Arzneimittel-Zellbindungsmittel-Konjugaten behandelt und als Vergleich mit dem konjugierten Träger alleine und des nicht-konjugierten Arzneimittels.
Die 1B ist eine graphische Darstellung und zeigt das Tumorwachstum (Körpergewichtszunahme) als eine Funktion der Zeit nach Tumortransplantation. Die Testtiere, welche die transplantierten Tumore trugen, wurden vor der Tumortransplantation mit den gleichen konjugierten Verbindungen, Träger und Arzneimittel, wie in der 1A erläutert, behandelt.
Die 2A ist eine graphische Darstellung und zeigt das Tumorwachstum (Körpergewichtszunahme) als eine Funktion der Zeit nach Tumortransplantation. Die Testtiere, welche die transplantierten Tumore trugen, wurden nach der Tumortransplantation mit den gleichen konjugierten Verbindungen, Träger und Arzneimittel, wie in der 1A erläutert, behandelt.
Die 2B ist eine graphische Darstellung und zeigt das Tumorwachstum (Körpergewichtszunahme) als eine Funktion der Zeit nach Tumortransplantation. Die Testtiere, welche die transplantierten Tumore trugen, wurden vor der Tumortransplantation mit den gleichen konjugierten Verbindungen, Träger und Arzneimittel, wie in der 1A erläutert, sowie mit dem nicht-konjugierten Zellbindungsmittel behandelt.
Der Ausdruck „gefährdete Stelle", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Stelle im menschlichen oder tierischen Körper, an der eine Umgebung existiert, welche ungewünschte Zelladhäsionen fördert. Solch eine Umgebung kann als Ergebnis eines chirurgischen Eingriffs, einer Verletzung, einer Krankheit, einer Chemotherapie, einer Entzündung oder einem anderen Zustand, der die Zelllebensfähigkeit oder die Zellfunktion gefährdet, existieren.
Gefährdete Stellen werden in vorteilhafter Weise mit einer Zusammensetzung nach der Erfindung behandelt, die eine konjugierte Verbindung gemäß der obigen Formel I umfasst, um die Adhäsionsbildung zu reduzieren. Konjugierte Verbindungen der obigen Formel I, die bei der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden, können gemäß den Syntheserouten hergestellt werden, die in dem oben erwähnten US-Patent Nr. 5,667,764 beschrieben sind.
Die konjugierten Verbindungen reduzieren das Auftreten von ungewünschten Zelladhäsionen aufgrund der Wirkung des Arzneimittels, das in den konjugierten Verbindungen vorliegt und das die ungewünschten Zelladhäsionen auf verschiedene Weise hemmen kann. Das Arzneimittel kann somit i) die Anzeige von spezifischen Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche verhindern; ii) die intrazelluläre Signalkette in den Zellen verhindern, welche für eine ungewünschte Adhäsion empfindlich sind, und zwar nach der Bindung der Adhäsionsmoleküle, was zu ihrer weiteren Anhaftung an die extrazelluläre Matrix, Basalmembran oder an normale Gewebezellen führt; iii) die Freisetzung von Mediatoren verhindern, welche die Anzeige der spezifischen Adhäsionsmoleküle auf den Zelloberflächen stimulieren, welche für eine ungewünschte Adhäsion empfindlich sind, wodurch die Adhäsion von Zelle zu Zelle oder Gewebe zu Gewebe in einer unnatürlichen oder ungewünschten Weise erleichtert wird; oder iv) mit der Bindung der Zelladhäsionsmoleküle von einer Zelle an die einer anderen Zelle oder an extrazelluläre Matrixproteine, die in dem Gewebe enthalten sind, durch die Bereitstellung eines falschen oder eines Konkurrenzsubstrates interferieren.
Die Arzneimittelkomponente der konjugierten Verbindung wird vorzugsweise aus der Gruppe der Antimicrotubulimittel ausgewählt, wie Colchizin oder Vincaalkaloide (z. B. Vinblastin oder Vincristin); Antifilamentmittel, wie die Cytochalasine B und D oder Akrylamid oder Cycloheximid; Antisignalstoffmittel, wie die Proteinkinase C Inhibitoren, einschließlich Calphostin, oder Inhibitoren der intrazellulären Calciummobilisierung, einschließlich 1-O-Hexadecyl-2-O-acetyl-SN-glycerin, 8-(Diethylamino)octyl-3,4,5-trimethoxybenzoat-HCl oder EGTA (Ethylenglycol-bis-(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure); Inhibitoren der Freisetzung von stimulierenden Mediatoren oder Antagonisten von diesen Mediatoren, wie Interleukin 1, von transformierten Zellen gebildeter Wachstumsfaktor Beta oder 12-S-Hydroxyeicosatetraensäure, sowie nicht-steoridale, antientzündliche Arzneimittel, einschließlich Ibuprofen und Indomethacin; Lipoxygenaseinhibitoren, wie NDGA (Nordinhydroguajaretsäure) oder Balcalein (5,6,7-Trihydroxyflavon); Antagonisten der Freisetzung von stimulierenden Mediatoren, wie Prostacyclinanalogon PG12 (Iloprost^®); Interleukin-1 Rezeptorantagonist; oder andere Mittel, die wirksam sind hinsichtlich einer Beeinflussung der Bindung der Adhäsionsmoleküle an ihre Liganden, einschließlich der Liganden selbst oder Fragmente davon, wie Fibronectin oder Laminin, oder die Sequenzen, die zu den Bindungsstellen spezifisch sind, welche die Aminosäure Arg-Gly-Glu oder Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg enthalten, oder eine Kombination von solchen Arzneimitteln.
Besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von konjugierten Verbindungen mit den folgenden Formeln erzielt, wie dies aus den unten dargestellten Beispielen deutlich werden wird:
Die oben beschriebenen, konjugierten Verbindungen wirken wie Pro-Arzneimittel, wobei das Arzneimittel mit dem lipophilen Zellbindungsmittel über eine spaltbare Bindung verbunden ist. Das Arzneimittel zeigt seinen therapeutischen Effekt bei Freisetzung aus der konjugierten Verbindung. Es wird angenommen, dass die Spaltung der Verbindungskomponente nach der Bindung erfolgt, wobei dies durch eine Reduktion des pH's beschleunigt wird, was die Trennung der chemischen Bindungen innerhalb der Verbindungskomponente fördert.
Diese konjugierten Verbindungen setzen ein Analogon des Colchizins frei, ein Molekül, das an das Tubulinprotein bindet, und zwar in solch einer Weise, dass die intrazelluläre Wirkung der Microtubuli verhindert wird. Diese Wirkungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Translokation der Zelladhäsionsmoleküle zu der Zellmembran und auch die intrazelluläre Signalübermittlung, welche durch die Bindung an der äußeren Zellmembran von diesen Adhäsionsmolekülen an ihre entsprechenden Liganden gefördert wird.
Wie oben erwähnt bezieht sich der Ausdruck „unerwünschte Zelladhäsionen" auf Adhäsionen zwischen Tumorzellen und anderen Tumorzellen, Adhäsionen zwischen Tumorzellen und normalen Zellen und bestimmte Adhäsionen zwischen normalen Zellen und anderen normalen Zellen. Zellen, die für eine unerwünschte Adhäsion empfindlich sind, umfassen somit alle bösartigen Zellen oder extrazellulären Matrixes, die von diesen bösartigen Zellen erzeugt werden; normale Gewebezellen, einschließlich endotheliale Zellen, endometriale Zellen, mesotheliale Zellen oder epitheliale Zellen, die verletzt werden oder entzündet sind, zum Beispiel als Ergebnis eines chirurgischen Eingriffs; und Signalstoff- oder Mediator-freisetzende Zellen, einschließlich Blutplättchen, Makrophagen, Lymphozyten oder neutrophile Leukozyten. Der Ausdruck „ungewünschte Zelladhäsion" umfasst nicht die Adhäsion von Zellen, die im Verlaufe der Bildung von normalem, gesundem Gewebe auftritt.
Der Ausdruck „gesteigerte Tumorranddefinition", wie er hier verwendet wird, beabsichtigt die Reduktion im Bruchbereich von Tumorzellen oder Tumormassen, die an nicht-neoplastischem Gewebe oder Organen anhaften, oder die Tendenz von bösartigen Zellen normales Gewebe zu befallen, zu kennzeichnen.
Die hier beschriebenen, konjugierten Verbindungen, können in geeigneter Weise als eine Spülungslösung unter Beimischung eines biologisch kompatiblen Trägers formuliert werden, wie Dimethylsulfoxid, Polyoxyethylen (20)-Sorbitanmonooleat (z. B. Tween-80), Polyole, z. B. Propylenglycol, wässrige Dextrose (5%) Lösung, Ringer's Lösung, Salzlösung oder eine Kombination von diesen Trägern. Die Konzentration der konjugierten Verbindung in dem ausgewählten Flüssigträger sollte normalerweise 5 μM bis etwa 5 mM betragen. Wo dies geeignet ist, kann die Wirkung von kontaminierenden Mikroorganismen durch verschiedene antibakterielle oder antipilzliche Mittel verhindert werden, wie Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und ähnliches. Es wird oft vorteilhaft sein isotonische Mittel, zum Beispiel Glucose oder Natriumchlorid, zusammen mit der konjugierten Verbindung zu verwenden.
Wie hier verwendet, umfasst der Ausdruck „biologisch kompatibler Träger" jede und alle Vehikel, Lösungsmittel, Dispersionsmedium, antibakterielle und antipilzliche Mittel, isotonische Mittel und ähnliches. Die Verwendung von solchen Medien und Mitteln mit therapeutisch aktiven Substanzen ist im Stand der Technik bekannt. Mit Ausnahme, wo jedes konventionelle Medium oder Mittel inkompatibel mit den hier beschriebenen, konjugierten Verbindungen ist, ist die Verwendung von jedem konventionellen Mittel oder Medium von dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Bestimmte Adjuvantien, das heißt Mittel, welche die Wirksamkeit der Behandlung zur Reduktion von ungewünschten Zelladhäsionen fördern, können auch in Verbindung mit den oben beschriebenen, konjugierten Verbindungen verwendet werden, falls dies notwendig oder wünschenswert ist. Geeignete Adjuvantien umfassen entzündungshemmende Mittel, zum Beispiel nicht-steoridale, antientzündliche Arzneimittel (NSAIDs), die biologische Reaktion modifizierende Mittel, zum Beispiel IL-1 Antagonisten, oder eine Kombination von diesen Adjuvantien.
Das Verfahren nach der Erfindung kann benutzt werden, um unerwünschte Zelladhäsionen zu reduzieren in Zusammenhang mit chirurgischen Eingriffen bei der Behandlung von Krebs in den verschiedenen Körperhöhlen oder Organen, wo der Krebs vorliegt, wie die Bauchhöhle, die Abdomino-Pelvinhöhle, die Brusthöhle, einschließlich Pleura und Pericardium, die dorsalen Höhlen, einschließlich Schädelhöhle und Spinalhöhle, Gelenkhöhlen, das heißt der Raum zwischen artikulierenden Knochen in einem Gelenk; Lumina, wie das Innere des Magendarmtraktes oder eines Blutgefäßes, oder das weibliche Fortpflanzungssystem. Zusätzlich zu den natürlichen Höhlen liegt es innerhalb der Erwartung der vorliegenden Erfindung, induzierte Höhlen gemäß den hier beschriebenen Verfahren zu behandeln, das heißt solche Höhlen, die durch einen chirurgischen Eingriff geschaffen werden. Das Verfahren kann auch in vorteilhafter Weise angewandt werden, um postchirurgische Adhäsionen von normalem Gewebe an der Wundreparaturstelle zu reduzieren, wie dies auftritt im Zusammenhang mit einem chirurgischen Eingriff bei Zuständen, wie entzündliche Darmerkrankung oder Endometriose.
Die Behandlung der chirurgischen Stelle vor der Anhaftung von Zellen, die für eine ungewünschte Adhäsion empfindlich sind, kann normalerweise durch Anwendung der konjugierten Verbindung vor, während oder sofort nach dem chirurgischen Ereignis erfolgen. Auf diese Weise kann der Zustand des normalen Gewebes in der Nähe der chirurgischen Stelle am besten konserviert werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden vorgestellt, um die Erfindung im Detail zu erläutern. Diese Beispiele erläutern die Erfindung und beschränken sie nicht. Soweit nichts anderes angezeigt ist, wurden alle Reagenzien und Arzneimittel von Sigma, St. Louis, MO, erworben.
Beispiel 1: Vorbehandlung von Mäusen, die menschliche Ovarialkrebszellen empfangen, i.p. mit Thiocolchizin, das an lipophile Zellbindungsmittel konjugiert war
Die Vorbehandlung der Mäuse vor der Einführung des Tumors wurde durchgeführt, um die Veränderung in der Pharmacokinetik des Thiocolchizinanalogons als solches und in konjugierter Form mit den Zellbindungsmitteln gemäß den Formeln II und III, wie oben festgelegt, zu bestimmen. Es wurde experimentell bestimmt, dass 4-Formylthiocolchizin (Produkt von Zynaxis, Inc., Malvern, PA) nur einen geringen oder nur mittelmäßigen Effekt auf das Tumorwachstum besitzt, wenn es nach dem Tumor in die Peritonealhöhle von Mäusen eingeführt wird, die menschliche Ovarialkrebszellen tragen. Die konjugierte Verbindung gemäß Formel II hat einen deutlicheren Effekt.
In diesem frühen Experiment (A) wurden Mäuse, nu/nu, 5 pro Gruppe, mit 5 × 10⁶ A2780 menschlichen Ovarialkrebszellen (i.p.) injiziert und am folgenden Tag mit den Verbindungen, die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt sind, behandelt. Der mittlere Überlebenstag war der Durchschnittstag des Todes des zweiten und dritten Testtieres. Wie aus den Daten der Tabelle 1 zu erkennen ist, betrug die Zunahme der Lebensspanne (% ILS) der Mäuse, die mit 4-Formylthiocolchizin ((S)-N-(5,6,7,9-Tetrahydro-1,2,3-trimethoxy-4-formyl-10-(methylthio)-9-oxobenzo[a]heptalen-7-yl)acetamid; C₂₃H₂₅NO₆S) behandelt waren, 10%, was signifikant verschieden ist von der 10% DMSO behandelten Gruppe (p ≤ 0,05). Beide Gruppen, die mit der konjugierten Verbindung gemäß der Formel II behandelt wurden, zeigten signifikant längere Überlebenszeiten als die der 4-Formylthiocolchizin-Gruppe (p ≤ 0,01). Die Überlebenszeit der Mäuse, die mit der konjugierten Verbindung der Formel II behandelt wurden, war nicht verschieden von der Überlebenszeit der Mäuse, die mit 500 nMol Cisplatin behandelt wurden.
Die in der Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen, einschließlich 4-F-T, zeigten keine beobachtbaren, nachteiligen Effekte bei einer der getesteten Konzentrationen.
Tabelle 1
Frühere pharmacokinetische Studien in anderen Modellen zeigten ein schnelles Verschwinden und/oder Metabolisierung von 4-Formylthiocolchizin. Deshalb wurde das Vorbehandlungsprotokoll so erstellt, um die Langlebigkeit der Wirksamkeit zu bestimmen.
Bei der Durchführung des Protokolls (Experimente B und C) wurde die menschliche Ovariallinie, A2780 (Geschenk von T. C. Hamilton vom Fox Chase Cancer Center, Phila., PA) in Gewebekultur erhalten (RPMI 1640 Bio-Whittaker, Waldersville, MD) und zwar mit 10% fötalem Rinderserum (GIBCO) und mit 0,26 μ/m/Rinderinsulin (GIBCO). Für die Tumorinitiation wurden 5 × 10⁶ Zellen i.p. in NIH: Balb/C nu/nu weibliche Mäuse, 5 Mäuse pro Gruppe, injiziert. Zwei Typen an Behandlungsarten wurden durchgeführt: eine einzelne i.p. Injektion am Tag, bevor die Tumorzellen implantiert wurden, oder eine einzelne i.p. Injektion am Tag, nachdem die Tumorzellen implantiert waren.
Die Synthesen von 4-Formylthiocolchizin und der konjugierten Verbindungen der Formel II und III wurden durchgeführt von Zynaxis, Inc., Malvern, PA, unter Verwendung der Synthesewege, die in dem oben erwähnten US-Patent Nr. 5,667,764 beschrieben sind. Diese Verbindungen zeigten eine Reinheit von mehr als 95% gemäß HPLC und NMR und/oder Massenspektroskopie.
Die Dosiermengen der Verbindungen wurden berechnet als molare Äquivalente, um sicherzustellen, dass die therapeutische Konzentration über die Gruppen einheitlich war. Die Verbindungen wurden zunächst in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und verabreicht in 0,5 ml im Maximum von 10% DMSO in Wasser. Es wurden keine Toxizitätssymptome bei der verabreichten Dosis, die 500 nMol pro Maus betrug, bemerkt.
Die Wirksamkeit wurde erfasst durch die Veränderung in dem mittleren Gruppenkörpergewicht und bewertet als Zunahme der mittleren Überlebenszeit der behandelten Mäuse gegenüber den Kontrollen, die nur den Träger (10% DMSO) erhielten.
Zwei identische Protokolle wurden an zwei unterschiedlichen Standorten durchgeführt. Die Protokolle waren identisch mit der Ausnahme, dass die Quelle für die Mäuse bei dem Experiment B das NCl, Frederick, MD, war, wobei für das Experiment C die Mäuse bereitgestellt wurden von Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME.
Das Experiment C enthielt auch die zusätzliche Kontrollgruppe von Mäusen, die mit dem Zellbindungsmittel als solches behandelt wurden, das heißt frei von jeglichem konjugierten, therapeutischem Mittel. Bei dem Experiment C wurden die Mäuse aus humanen Gründen getötet, wenn die Tumorbelastung mehr als 75% des anfänglichen Körpergewichtes betrug.
Kaplan-Meier-Statistiken wurden berechnet unter Verwendung der Vergleichspaare von Gruppen unter Anwendung des Wilcoxon-Tests.
Die Ergebnisse von diesen zwei Experimenten sind zum Teil wiedergegeben in den 1A, 1B, 2A und 2B, worin die gepunktete Linie (...) die 10% Lösung von DMSO in Wasser darstellt; die gestrichelte Linie (---) entspricht 4-Formylthiocolchizin; die durchgezogene Linie (––) stellt die konjugierte Verbindung der Formel II dar, und die doppelte Linie (==) entspricht der konjugierten Verbindung mit der obigen Formel III.
Der Effekt der Vorbehandlung war die Verhinderung der Zunahme des Körpergewichtes der Mäuse, die mit dem Tumorwachstum assoziiert war, wie dies anhand der Daten in den 1A und 1B zu erkennen ist, wo die Daten von dem Experiment B festgelegt sind. Bei diesem Experiment war die Verzögerung im Tumorwachstum für die Mäuse, die entweder mit der konjugierten Verbindung der Formel II oder mit der konjugierten Verbindung der Formel III vorbehandelt waren, evident. Insbesondere zeigt die 1B, dass die Wirkung der Vorbehandlung darin bestand, eine Zunahme im Körpergewicht der Mäuse, das mit dem Tumorwachstum assoziiert ist, zu verhindern, wie dies in allen Gruppen zu erkennen ist, die am Tag nach Injektion der Tumorzellen behandelt wurden (vergleiche 1A).
Die Ergebnisse des Experimentes C waren ähnlich den Ergebnissen, die im Experiment B hinsichtlich der Verzögerung des Tumorwachstums durch die Vorbehandlung mit den konjugierten Verbindungen der Formel II und III erzielt wurden. Diese Ergebnisse sind in den 2A und 2B gezeigt. Ein geringer oder kein Effekt ist aus der Nachbehandlung mit beiden konjugierten Verbindungen zu erkennen. Auch das nicht-konjugierte, therapeutische Mittel oder das nicht-konjugierte Zellbindungsmittel allein besitzen keinen Effekt auf die Gesamttumorbelastung.
Die Zeit, um 150% des Anfangskörpergewichtes zu erzielen, wurde von den oben beschriebenen Figuren abgeleitet und ist in den Tabellen 2 und 3 gezeigt zusammen mit der mittleren Überlebenszeit oder dem Tag des Abtötens für jede Gruppe. Alle Mäusegruppen, die mit den konjugierten Verbindungen der Formel II und III vorbehandelt waren, zeigten signifikant längere Überlebenszeiten oder Zeiten einer geringen Tumorbelastung im Vergleich zu den Mäusen, die mit nicht-konjugiertem 4-Formylthiocolchizin oder mit nicht-konjugiertem Zellbindungsmittel vor Tumorinjektion oder nach Tumorinjektion behandelt wurden. Wie aus den Daten der Tabellen 2 und 3 zu erkennen ist, zeigte die Nachbehandlung keinen deutlichen Effekt auf die Überlebenszeit der Mäuse, die konjugierte oder nicht-konjugierte Thiocolchizinanaloga erhielten. Im Gegensatz dazu bewirkte die Vorbehandlung mit den konjugierten Verbindungen der Formel II und III eine deutliche Verlängerung der Lebensspanne.
Tabelle 2
Tabelle 3
Obgleich die Überlebenszeiten in den Experimenten B und C unterschiedlich sind, sollte angemerkt werden, dass die Mäuse abgetötet wurden, wenn sie 35 g (175% des Anfangskörpergewichtes) im Experiment C erreichten, das heißt, es wurde nicht gewartet, bis sie der Krebsbelastung erlagen. Die Zeit bis zum Erreichen von 150% des Körpergewichts zeigt jedoch an, dass die Tiere, die mit der konjugierten Verbindung der Formel III im Experiment C vorbehandelt waren, eine bessere Tumorkontrolle besaßen als die Tiere im Experiment B, die auf die gleiche Weise behandelt wurden, da die Zeit von 60 Tagen auf über 80 Tage anstieg.
Zusätzlich zu der Veränderung des Körpergewichts und des Zeitraums bis zum Erreichen von 175% des anfänglichen Körpergewichtes wurden die Tiere im Experiment C nach ihrem Tod begutachtet und eine grobe Pathologie wurde durchgeführt. Es wurde beobachtet, dass die Tumorpathogenese in den Mäusen, die mit der Vehikelkontrolle, mit 4-Formylthiocolchizin oder mit der Zellbindungskomponente der konjugierten Verbindung der Formel III behandelt waren, einen weit verbreiteten Tumor ergab, der alle Oberflächen des Peritoneums, der Organe und oft der unteren Oberfläche des Diaphragmas bedeckte. Mäuse, die mit den konjugierten Verbindungen der Formel II oder III behandelt waren, ob vor oder nach der Tumorinjektion, hatten mehr fokale Läsionen (das heißt, gesteigerte Tumorranddefinition), obgleich große Massen zum Zeitpunkt des Abtötens gebildet waren.
Die Daten, die aus den oben beschriebenen Experimenten abstammen, zeigen, dass die Vorbehandlung der Peritonealhöhle mit den oben beschriebenen, konjugierten Verbindungen eine Wirkung hat, die nicht als einfache Abnahme der Zellzahl im frühen Tumorstadium erklärt werden kann. Der Unterschied zwischen der Tumorzellzahl am Tag Null und am ersten Tag danach wird nicht größer sein als ein Faktor von zwei, der durch die Tumorzellverdoppelungszeit von 22 Stunden gegeben ist. Der beobachtete Effekt kann somit der Veränderung des „Bettes" bezüglich der epithelialen und der endothelialen Zellen und der „Umgebung" der Höhle zugeordnet werden. Damit ist die Balance zwischen dem Cytokin und dem Adhäsionsmolekül an der Steile gemeint, wo die unerwünschten Zellen binden können. Die über 60 verschiedenen Cytokine, die bisher identifiziert wurden, können verschieden kategorisiert werden in Abhängigkeit von ihrer immunomodulatorischen, entzündlichen, chemoanziehenden oder wachstumsregulierenden Wirkung. Die drei ersten Typen können zu einer gesteigerten Adhäsionsmolekülexpression und Aktivierung führen und somit zu einer gesteigerten Zellbindung. Siehe zum Beispiel A. Thompson, The Cytokine Handbook, 2. Ausgabe, Academic Press, 1994, und J. Harlan und D. Liu, Adhesion: Ist role in Inflammatory Disease. W. H. Freeman and Co., New York, 1992.
Die Tatsache, dass die Pathogenese der Krankheit in solch einer Weise verändert wurde, dass eine operable Situation mit gut definierten Rändern erzeugt wird, zeigt den Vorteil der Behandlung der gefährdeten Stelle vor der Anhaftung von Zellen, die für eine unerwünschte Adhäsion empfindlich sind, an. Es wird ferner angenommen, dass die Behandlung der gefährdeten Stellen kurz nach der Anhaftung von Zellen, die für die unerwünschten Adhäsionen empfindlich sind, in ähnlicher Weise wirksam ist.
Obwohl verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben und/oder durch Beispiele belegt worden sind, werden verschiedene andere Ausführungsformen für einen Fachmann anhand der vorliegenden Offenbarung deutlich werden. Zum Beispiel können die hier beschriebenen, konjugierten Verbindungen, zum Beispiel via einer Adsorption, an ein Biomaterial, wie Barrierematerialien, die für den Schutz von Wundreparaturstellen verwendet werden, Nahtmaterialien und ähnliches, vor der Insertion von diesen Biomaterialien in einer Körperhöhle befestigt werden, um so eine gesteigerte Verhinderung einer ungewünschten Zelladhäsion durch das Biomaterial bereitzustellen.

Claims

Verwendung einer konjugierten Verbindung aus einem Arzneimittel und einem Zellbindungsmittel für die Herstellung eines Medikamentes zur Reduktion von ungewünschten Zelladhäsionen an einer gefährdeten Stelle durch ein Verfahren, das die Behandlung der gefährdeten Stelle mit der konjugierten Verbindung umfasst, wobei die konjugierte Verbindung die folgende Formel hat:
worin B ein Arzneimittel mit einem Hemmeffekt auf die Zelladhäsion darstellt; R₂ eine Verbindungskomponente darstellt, die das Arzneimittel mit dem Zellbindungsmittel verbindet; und in dem Zellbindungsmittel: R und R₁ Kohlenwasserstoffsubstituenten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen darstellen; X und X₁, die gleich oder verschieden sein können, jeweils O, S, C(CH₃)₂ oder Se darstellen; Y eine Verbindungsgruppe ist, die ausgewählt ist aus =CR₈-, =CR₈-CR₈=CR₈-, =CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈- oder =CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈-, wobei R₈ aus H, CH₃, CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₃ oder CH(CH₃)₂ ausgewählt ist; Z einen Substituenten darstellt, der ausgewählt ist aus H, Alkyl, OH, -O-Alkyl, COOH, CONH₂, SO₃H, SO₂NH₂, SH, S-Alkyl, CONH-Alkyl, CON-(Alkyl)₂, NH-Acyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)₂, NO₂, Halogen, Si(Alkyl)₃, O-Si(Alkyl)₃, Sn(Alkyl)₃ oder -Hg-Halogen, wobei die Alkylgruppen diesen Z-Substituenten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umfassen; und A^– ein pharmazeutisch akzeptables Anion darstellt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel über eine spaltbare Verbindungskomponente mit dem Zellbindungsmittel konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Stelle durch eine chirurgische Behandlung, Entzündung, Verletzung, Krankheit oder Chemotherapie gefährdet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zellen, die für eine ungewünschte Adhäsion anfällig sind, bösartige Zellen, Entzündungszellen, erkrankte Zellen, chemotherapeutisch behandelte Zellen oder verletzte normale Zellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die gefährdete Stelle die Bauchhöhle, die Brusthöhle, die Pleurahöhle, die Peridardhöhle, eine Gelenkhöhle, wie eine Synovialgelenkhöhle ist oder das weibliche Fortpflanzungssystem ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Medikament ferner einen biologisch kompatiblen Träger umfasst, der zum Beispiel ausgewählt ist aus Dimethylsulfoxid, Polyoxyethylen-Sorbitanmonooleat, Polyole, wässrige Dextroselösung, Ringersche Lösung, Salzlösung oder eine Kombination davon, und/oder ein Adjuvans umfasst, das zum Beispiel ausgewählt ist aus antientzündlichen Mitteln, biologische Reaktionsmodifizierer oder eine Kombination davon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die konjugierte Verbindung die Formel hat

worin A^– jeweils ein pharmazeutisch akzeptables Anion darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin B ein Arzneimittel darstellt, welches die zelluläre Expression von Adhäsionsmolekülen hemmt, und das Medikament zur Anwendung bei einem Verfahren zur Steigerung der Tumorranddefinition bestimmt ist.
Biomaterial zur Anordnung an einer gefährdeten Stelle, um eine Barriere zwischen der Stelle und den Zellen zu bilden, die für eine ungewünschte Adhäsion anfällig sind, dadurch gekennzeichnet, dass auf das Biomaterial eine konjugierte Verbindung aus einem Arzneimittel und einem Zellbindungsmittel appliziert wird, wobei die konjugierte Verbindung die folgende Formel hat:
worin B ein Arzneimittel mit einem Hemmeffekt auf die Zelladhäsion darstellt; R₂ eine Verbindungskomponente darstellt, welche das Arzneimittel mit dem Zellbindungsmittel verbindet; und in dem Zellbindungsmittel: R und R₁ Kohlenwasserstoffsubstituenten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen sind; X und X₁, die gleich oder verschieden sein können, jeweils O, S, C(CH₃)₂ oder Se darstellen; Y eine Verbindungsgruppe ist, die aus =CR₈-, =CR₈-CR₈=CR₈-, =CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈- oder =CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈-CR₈=CR₈-, ausgewählt ist, wobei R₈ ausgewählt ist aus H, CH₃, CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₃ oder CH(CH₃)₂; Z einen Substituenten darstellt, der ausgewählt ist aus H, Alkyl, OH, -O-Alkyl, COOH, CONH₂, SO₃H, SO₂NH₂, SH, S-Alkyl, CONH-Alkyl, CON-(Alkyl)₂, NH-Acyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)₂, NO₂, Halogen, Si(Alkyl)₃, O-Si(Alkyl)₃, Sn(Alkyl)₃ oder -Hg-Halogen, wobei die Alkylgruppen diesen Z-Substituenten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umfassen; und A^– ein pharmazeutisch akzeptables Anion darstellt.
Biomaterial nach Anspruch 9, wobei die konjugierte Verbindung die Formel hat
worin A^– jeweils ein pharmazeutisch akzeptables Anion darstellt.
Verwendung eines Biomaterials nach Anspruch 9 oder 10 für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer gefährdeten Stelle, um eine ungewünschte Zelladhäsion an dieser Stelle zu verhindern.