DE68905994T2 - Koloniestimulierungsfaktor-gelatinkonjugate. - Google Patents

Koloniestimulierungsfaktor-gelatinkonjugate.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Konjungate aus Koloniestimulierfaktor (CSF) und Gelatine, sowie ein Verfahren zur Herstellung und die Verwendung dieser Konjugate. Die Konjugate enthalten vernetzte Gelatine, Mikrokügelchen und wasserlösliches CSF-Gelatine-Konjugat. Beide Konjugate sind als Tumorwachstumshihibitor nützliche Arzneimittel.
  • Die CSFs sind Substanzen, die auf myeloische Leukozytenvorstufenzellen von Säugern wirken, um deren Differenzierung zu Granulozyten oder Makrophagen zu fördern, und die notwendig zur Differenzierung und zum Wachstum von myeloischen Leukozytenvorstufenzellen sind, welche zur Bildung von neutrophilen Granulocyten (nachfolgend mit Granulocyt abgekürzt) oder Monozyten/Makrophagen führen, wenn die Vorstufenzellen nach einem Zwei-Schicht-Agarkultur-Verfahren kultiviert werden (Ichikawa, Y. et al., Proceedings of the National Academy of Science, 56, p488, 1966; Metalcalf, D., Experimental Hematology 1, p185, 1972). Es ist bekannt, daß CSFs sich aus verschiedenartigen Typen mit unterschiedlichen Wirkungen zusammensetzen, Granulocyten-CSF (G-CSF), Makrophagen-CSF (M-CSF), Granulocyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF) und multifunktionellen CSF (Multi CSF oder IL-3). Betrachtet man deren Wirkung hinsichtlich der Differenzierung und hinsichtlich des Wachstums von Leukozyten, sind CSFs vielversprechende Arzneimittel zur Behandlung der durch Anwendung von cytostatischen Mitteln oder Bestrahlung verursachten Leukozytopenie. Insbesondere aktiviert CSF reife Makrophagen derart, daß sie Antitumorwirkung zeigen (Weinberg, J.B. et al., Journal of Immunology, 121. p72, 1978, P. and Nakoing I., Cellular Immunology, 105, p270, 1978), CSFs sind auch vielversprechend für die Behandlung von Krebs und für die Prophylaxe und Therapie von durch Viren, Bakterien und Parasiten verursachte Infektionen wegen ihrer Wirkung als makrophagenaktivierende Faktoren.
  • Jedoch ist die Wirkung der CSFs hinsichtlich der Aktivierung von Makrophagen gering, und sie sind selbst instabil und werden in vivo leicht abgebaut. Es ist deshalb von großer Wichtigkeit, Applikationsformen für CSFs zu entwickeln, die auf eine erweiterte Makrophagenaktivierungswirkung und eine erhöhte Stabilität der CSFs in vivo zielen.
  • Die ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. 59-46215 beschreibt Gelatinemikrokapseln zur in vivo Stabilisierung eines wirksamen Bestandteils und seiner verzögerten Freisetzung.
  • Der mittlere Durchmesser dieser Mikrokapseln liegt im Bereich von 10 bis 500 um und ist zu groß, um durch Makrophagen mittels Phagozytose aufgenommen zu werden. Darüber hinaus ist keine Beschreibung von CSF enthaltenden Mikrokapseln enthalten. Die ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 62-230729 beschreibt ein aus Gelatine zusammengesetztes Arzneimittel zur schrittweisen Freisetzung von CSF. Da diese durch Malen von CSF enthaltenden Gelatineblöcken zu feinen Pulvern hergestellt, werden sind die erhaltenden Pulverteilchen nicht klein genug, um von Makrophagen durch Phagozytose aufgenommen zu werden. Da die Gelatine gemäß diesem Verfahren nicht vernetzt und der in vitro Abbau der Pulver schnell verläuft, werden die durch die erfindungsgemäßen Mikrokugelen erzielten Vorteile durch die Pulver nicht erreicht. Die ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 62-143974 beschreibt Immunverstärker enthaltende Polymermikrokugeln. Die verwendetem Immunverstärker sind wasserlösliche Muramyldipepide (MDP), ihre lipophilen Derivate, Krestin, Nocardia rubra, Interferone, Lipoplysaccaride (LPS) Tumornekrosefaktor, Pyrancopolymere, Lymphokkinine, BCG und ähnliche und enthalten keine CSFs. Darüber hinaus schlägt die Veröffentlichung Nr. 62-143974 keine Kombination von mit CSF vernetzter Gelatine vor und diese Kombination ist erstmalig beschrieben. Y. Tabata et al., Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 79, p636-646,1988 beschreibt Interferone enthaltende Mikrokugeln, schlägt aber nicht die Anwendung der offenbarten Techniken für CSF vor. Im allgemeinen besitzen physiologische, bioaktive Substanzen individuelle physiologische Wirkungen und Wirkmechanismen in lebenden Systemen. Auch wenn es bekannt ist, daß eine physiologisch bioaktive Substanz enthaltende Gelatinemikrokugeln durch Makrophagen mittels Phagozytose aufgenommen werden können, was zum Auftreten ihrer physiologischen Wirkung führt, bedeutet dies nicht ohne weiteres, daß eine andere physiologisch bioaktiv wirksame, in der gleichen Weise verarbeitete Substanz erfolgreich ein gleiches Ergebnis liefern wird. Auch wenn es deshalb bekannt ist, daß Interferon enthaltende Gelatinemikrokapseln ihre Wirkungen mittels Phagozytose durch Makrophagen entfalten, wird dadurch nicht notwendigerweise vorgeschlagen, daß die Anwendung des gleichen Verfahrens bei CSF gleiche Ergebnisse liefert.
  • Die vorliegende Erfindung liefert CSF-Gelatine-Konjugate als neue Arzneiform zur Erhöhung der Makrophagenaktivierungswirkung und eine verbesserte in vivo Stabilität von CSF. Die CSF-Gelatine-Konjugate enthalten vernetzte CSF enthaltende Gelatine-Mikrokugeln und wasserlösliche CSF-Gelatine-Konjugate.
  • Durch die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung von vernetzen CSF enthaltenden Mikrokugeln bereitgestellt, das gekennzeichnet ist durch die Stufenhomogenisierung eines Gelatine und CSF enthaltenden wäßrigen Mediums mit einer organischen Lösung zur Bildung einer Emulsion und anschließendem Vernetzen der Emulsion mit einem Vernetzungsmittel und ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichem CSF-Gelatine-Konjugat, das durch die Stufen der Verknüpfung von CSF mit Gelatine in einem wäßrigen Medium mit einem wasserlöslichen Carbodiimid zur Bildung eines wasserlöslichen Konjugats gekennzeichnet ist.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch vernetzte CSF enthaltende Mikrokugeln und das wasserlösliche CSF-Gelatine-Konjugat als pharmazeutische Zubereitung zur Inhibierung von Tumorzellenwachstum.
  • Fig. 1 zeigt eine Raster-Elektronenmikroskopaufnahme eines Thioglycollat-induzierten peritonealen Mausmakrophagen 8 Stunden nach Inkubation mit Maus-CSF enthaltenden Gelatinemikrokugeln.
  • Fig. 2 ist eine Raster-Elektronenmikroskopaufnahme eines Thioglycolat induzierten peritonealen Mausmakrophagen vor der Phagocytose der Maus-CSF enthaltenden Gelatinemikrokugeln.
  • Fig. 3 zeigt die in vitro Wachstumshemmung von Makrophagen, die mit verschiedene Dosierungen von CSF enthaltenden vernetzten Gelatinemikrokugeln vorbehandelt waren. In dieser Figur bedeutet das Symbol -.- das Ergebnis des reinen CSF, -o- das Ergebnis der vernetzten CSF enthaltenden Mikrokugeln der vorliegenden Erfindung und - - das Ergebnis einer Mischung von nativem CSF und Gelatinemikrokugeln ohne CSF.
  • Fig. 4 zeigt das Abklingen des aktiven Zustandes von Makrophagen, die mit nativem CSF und vernetzten CSF enthaltenden Gelatinemikrokugeln vorbehandelt wurden. In dieser Figur bedeutet das Symbol -.- das Ergebnis von von 1.000 Einheiten nativen CSF, -o- das Ergebnis der erfindungsgmäßen 440 Einheiten CSF (G-I) enthaltenden Gelatinemikrokugeln und - - das Ergebnis der erfindungsgemäßen 440 Einheiten CSF (G-II) enthaltenden (Gelatinemikrokugeln.
  • Fig. 5 zeigt die in vitro Wachstumshemmung von Makrophagen, die mit vernetzten verschiedene Dosen von CSF aus menschlichem Harn enthaltenden Gelatinemikrokugeln vorbehandelt wurden. Das Symbol -.- bedeutet das Ergebnis des nativen CSF und -o- das Ergebnis von vernetzten CSF enthaltenden Gelatinemikrokugeln der vorliegenden Erfindung.
  • Fig. 6 zeigt die in vitro Wachstumshemmung von Makrophagen, die mit CSF- Gelatine-Konjugaten, welchen verschiedene Dosen von CSF enthielten, behandelt wurden. In dieser Figur bedeutet das Symbol -.- das Ergebnis des nativen CSF, -o- das Ergebnis des CSF-Gelatine-Konjugates und - - das Ergebnis einer Mischung von nativen CSF und CSF-freier Gelatine.
  • Fig. 7 zeigt den Zeitverlauf der in vitro Hemmung von mit CSF-Gelatine- Konjugaten vorbehandelten Makrophagen. In dieser Figur bedeutet das Symbol -.- ein Ergebnis für 1.000 Einheiten nativen CSF und -o- das Ergebnis eines 586 Einheiten enthaltenden CSF-Gelatine-Konjugates.
  • Vernetzte CSF enthaltende Gelatinemikrokugeln können beispielsweise nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
  • Eine wäßrige Gelatine und CSF enthaltende Lösung wird zu einem organischen Lösungsmittel wie Toluol, Chloroform, Cyclohexan oder einer Mischung davon, die ein Tensid enthält, gegeben und anschließend die erhaltene Mischung emulgiert. Die Emulsion wird schnell in ein vorgekühtes organsiches Lösungsmittel gegossen, das ein Tensid zur Bildung von CSF enthaltenden Gelatinemikrokugeln enthält. Anschließend wird die Gelatine in der Emulsion mit einem Vernetzungsmittel vernetzt und die Emulsion durch Zentrifugieren gesammelt. Die Sedimente, welche die Mikrokugeln enthalten, werden nacheinander mit geeigneten organischen Lösungsmitteln und einer wäßrigen Pufferlösung mittels Zentrifugation gewaschen, um die gewaschenen vernetzten CSF enthaltenden Gelatinemikrokugeln zu erhalten. Das in der folgenden Erfindung verwendete CSF ist beispielsweise M-CSF, GM-CSF, G-CSF oder Multi-CSF oder eine Mischung davon. Andere Arten von CSF, die durch Kultivierung von Zellen oder Extraktion aus biologischen Bestandteilen wie Urin, Ascites und durch Genrekombination erhalten werden, können in diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Insbesondere M-CSF, wie das aus menschlichem Urin beschriebene M-CSF, das in der ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 61.258163 beschrieben ist, oder das hochgereinigte M-CSF aus einem Kulturüberstand, beschrieben in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 1-135800, werden vorzugsweise verwendet, da sie im wesentlichen keine Verunreinigungen enthalten. Alle Arten von Gelatine können für die vorliegende Erfindung verwendet werden, vorzugsweise werden jedoch durch Heißwasserextraktion von Rohcollagen gereinigte Materialien eingesetzt, welche durch Säure- oder Alkaliebehandlung von Tierknochen oder Tierhaut hergestellt werden. Das Mischungsverhältnis von Gelatine und CSF ist nicht kritisch, jedoch werden CSF-Einheiten im Bereich von 10² bis 10&sup9; (1 ng bis 10 mg) je mg Gelatine bevorzugt. Dialdehydverbindungen wie Glutaraldehyd, haben eine hervorragende Reaktivität bei Raumtemperatur und werden bevorzugt verwendet, obwohl jede Art anderer bifunktioneller Verbindungen, die zur Reaktion mit Proteinen fähig ist, als Vernetzungsmittel eingesetzt werden kann. Die bevorzugt eingesetzte Menge Glutaraldealdehyd beträgt 0,01 bis 2 mg und in noch bevorzugterer Weise 0,05 bis 1 mg je mg Gesamtprotein einschließlich CSF, Gelatine und Zusätze.
  • Das in diesem Verfahren eingesetzte Tensid ist ein nichtionisches Tensid wie Sorbitanmonooleat (Span 80), Sorbitantrioleat (Span 85) oder ähnliches.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das CSF-Gelatin-Konjugat ein wasserlösliches CSF-Gelatin-Konjugat, welches durch Vernetzung von CSF mit Gelatine in der Gegenwart eines Kondensierungs mittels hergestellt wird. Das wasserlösliche CSF-Gelatin-Konjugat wird beispielsweise durch das folgende Verfahren hergestellt. Gelatine wird in einer wäßrigen Pufferlösung gelöst und dann der Gelatinelösung CSF und anschließend ein Kondensierungsmittel wie ein wasserlösliches Carbodiimid hinzugefügt. Die Kupplungsreaktion wird bei einer niedrigen Temperatur beispielsweise 4º C fünf bis 30 Stunden lang durchgeführt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung dialysiert oder gelfiltriert, um nicht umgesetztes CSF und Gelatine abzutrennen, und das erhaltene CSF-Gelatin-Konjugat anschließend durch Mikrofiltration sterilisiert.
  • Das verwendete Kondensierungsmittel ist wasserlösliches Carbodiimid, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, 1-Cyclohexyl-3- (-morpholinoethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat und 1-Benzyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Von diesen ist das am meisten bevorzugte Mittel 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid. Die bevorzugte Reaktion wird bei einem pH-Wert von 7 oder niedriger als 7 durchgeführt.
  • Es wird angenommen, daß der Aktivierungsmechanismus der Makrophagen durch ein Makrophage aktivierendes Mittel aus der Wechselwirkung zwischen dem Makrophagen aktivierenden Mittel und seinem spezifischen auf der Makrophagenoberfläche vorliegenden Rezeptor herrührt. Der Mechanismus der Makrophagenaktivierung der CSF enthaltenden Gelatinemikrokugeln ist von dem des nativen CSF veschieden und von der Makrophagenaktivierung durch CSF enthaltende Mikrokugeln kann angenommen werden, daß sie durch das schrittweise aus den phagocytierten Mikrokugeln in der Makrophagenzelle freigesetzte CSF verursacht wird. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, daß die CSF enthaltenden Mikrokugeln eine Größe aufweisen, die der Phagocytose der Mikrokugeln durch Makrophagen zugänglich ist, d. h. weniger als 5 um in einem Durchmesser. Die Mikrokugelngröße kann eingestellt werden durch Wechsel der Homogenisierungsbedingungen. Die Homogenisierungsverfahren umfassen die Homogenisierung durch Schall und Hochdruck.
  • Die CSF-Gelatine-Konjugate, vernetzte CSF enthaltende Mikrokugeln und wasserlösliche CSF-Gelatine-Konjugate können einfach für Versuche und zur Therapierung in einer Dispersion oder zum Auflösen in einer Pufferlösung, physiologischen Salzlösung und Injektionsmedium verwendet werden. Zusätzlich kann das Konjugat zur Lagerung bis zur Verwendung getrocknet werden.
  • Die CSF-Gelatine-Konjugate der vorliegenden Erfindung haben die folgenden Eigenschaften, die denen des nativen CSF überlegen sind:
  • (1) Sie erhöhen die Antitumorwirkung von Makrophagen viel effizienter als das entsprechende native CSF, bezogen auf die CSF-Menge und die für die Makrophagenaktivierung erforderliche Zeit und
  • (2) ihre Lagerungsstabilität ist hoch und durch CSF-Gelatine-Konjugate aktivierte Makrophagen halten ihren Aktivierungszustand länger aufrecht als solche, die durch entsprechendes natives CSF aktiviert wurden.
  • Folglich können die erfindungsgemäßen CSF-Gelatine-Konjugate als Antitumormittel verwendet werden wegen ihrer Fähigkeit, in wirksamer Weise Makrohagen zu aktivieren, um die Antitumorfunktion zu erwerben. Zusätzlich kann von den Konjugaten erwartet werden, daß sie als prophylaktische und therapeutische Mittel für ansteckende Krankheiten eingesetzt werden.
    • Beispiele
  • Die Erfindung wird anschließend durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
    • Beispiel 1:
  • Zunächst wurden 0,25 g Sorbitanmonooleat (Span 80) in einer Mischung aus 2,5 ml Toluol und 2,5 ml Chloroform gelöst und zu dieser organischen Lösung 0,2 ml einer wäßrigen, 20 mg Gelatine (alkalischer Typ, pI 4,9, Nitta- Gelatine, Japan) enthaltenden Lösung gegeben und 1,38 x 10&sup5; Einheiten M-CSF (abgekürzt als HK-CSF), die aus Maus-HK-Zellen in Vergleichsbeispiel 1 abgeleitet sind, wurden hinzugefügt und die Mischung durch Ultraschall homogenisiert (10 W, 10 sec.). Die erhaltene Emulsion wurde schnell in 40 ml vorgekühltes Chloroform/Toluol (25 % : 75 %) gegossen, welches 2 g Span&sup8;&sup0; enthielt. Anschließend wurde ein 5 ml Aliquot mit Glutaraldehyd gesättigtem Toluol zu der Gelatine-Emulsion hinzugegeben und die Mischung kontinuierlich bei 0º C sechs Stunden gerührt. Das mit Glutaraldehyd gesättigte Toluol wurde hergestellt durch kräfiges Mischen von 10 ml einer 25 %igen wäßrigen Glutaraldehyddurch kräftiges Mischen von 10 ml einer 25 %igen wäßrigen GluLösung mit 10 ml Toluol. Die Konzentration von Glutaraldehyd in Toluol wurde mit 1,12 mg/ml mittels dem Verfahren von Sawicki, E., Analytical Chemistry, 33, 93-96, 1961 unter Verwendung von 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon bestimmt. Obige Emulsion wurde bei 4.000 Upm 5 Minuten zentrifugiert, um die erhaltenen CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln zu sammeln. Die Mikrokugeln wurden nacheinander mit 25 %igem Chloroform in Toluol, Isopropanol und phosphatgepuffter Salzlösung (PBS) durch Zentrifugieren gewaschen und dies viermal wiederholt. Schließlich wurden die gewaschenen CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln in PBS suspendiert. Die in den Mikrokugeln enthaltende CSF-Menge wurde mit 6.840 Einheiten je mg Gelatine-Mikrokugeln unter Verwendung von ¹²&sup5; I-markiertem HK-CSF bestimmt.
  • Gelatine-Mikrokugeln ohne CSF wurden durch das gleiche Verfahren hergestellt und die Menge an Glutaraldehyd je Protein betrug 0,28 mg/mg Protein.
    • Beispiel 2:
  • Die hemmende Wirkung von Makrophagen, die mit GSF enthaltenden Gelatine- Mikrokugeln, hergestellt nach Beispiel 1, auf das Wachstum von Zielzellen P815 Mastocytomazellen, wurde wie folgt bestimmt. 5 x 10&sup5; Mausperitoneal- Makrophagen, welche an peritoneale Exsudatzellen angewachsen sind und aus Mäusen gesammelt wurden, denen 4 Tage vor der Zellernte intraperitoneal Thioglycolat injiziert wurde, wurden in 1 ml RPMI-1640 Medium suspendiert, das 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthielt und Aliquots von 1 ml der Zellsuspension wurden auf 16 mm Schalen von 24 Mehrfachschalen-Kultivierungsplatten ausgesät. Die CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln, CSF-freie Gelatine-Kugeln, und native CSF wurden zu der Makrophagen-Monoschicht hinzugegeben, und in 5 % CO&sub2;/95 % Luft bei 37º C zwei Tage lang zur Aktivierung der Makrophagen inkubiert. Dann wurden die Makrophagenkulturen vorsichtig mit RPMI-1640 Medium gespült, um natives CSF und nicht-phagozytierte CSF enthaltende Gelatine- Mikrokugeln vor der Zugabe der Zielzellen zu entfernen. P815 Mastocytoma- Zellen, 2,5 x 10&sup4; in 1 ml RPMI-FCS, wurden zu den Makrophagen-Monoschichten gegeben. Die Anzahl lebenfähiger P815 Mastocytoma-Zellen wurde nach 48-stünger Kultivierung bei 37º C gezählt. Die Wachstumshemmung von Makrophagen gegenüber P815 Mastocytoma-Zellen wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:
  • %-Wachstumshemmung = Anzahl von Zielzellen, kultiviert mit unbehandelten Makrophagen - Anzahl von Zielzellen, kultiviert mit aktivierten Makrophagen/Anzahl von Zielzellen kultiviert mit unbehandelten Makrophagen x 100
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Makrophagenvorbehandlung in 1 ml Medium, enthaltend Wachstumshemmung % nichts CSF enthaltende Gelatine-Mikrokugeln 440 U (64,3 ug)/ml CSF-freie Gelatine-Mikrokugeln (64,3 µg/ml) natives CSF (1000 U/ml) natives CSF (440 U/ml) + CSF-freie Gelatine-Mikrokugeln (64,3 ug/ml)
  • Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, aktivieren die CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln die Makrophagen zu einer sehr viel höheren Wachstumshemmung auf das Tumorzellwachstum im Gegensatz zu nativem CSF, CSF-freien Gelatine- Mikrokugeln und einer Mischung davon.
    • Beispiel 3
  • Das Testverfahren für die Makrophagenaktivierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde verwendet, um die Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der zur Aktivierung der Makrophagen erforderlichen Menge CSF und der resultierenden Antitumorwirksamkeit zu bestimmen. Verschiedene Mengen an CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln wurden gemäß Beispiel 1 hergestellt. Das angewendete CSF wurde gemäß dem Vergleichsbeispiel 1 hergestellt. Die Dosiswirkungen der Makrophagenaktivierung sind in Fig. 3 gezeigt.
  • Wie aus Fig. 3 ersichtlich, ist die Gesamtmenge an GSF in den Kulturen, die zur Makrophagenaktivierung durch die erfindungsgemäßen CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln erforderlich ist, etwa 10.000-fach niedriger als bei nativem CSF oder bei einer Mischung von nativem CSF und CSF-freien Gelatine- Mikrokugeln. Darüber hinhaus hatte die Zugabe von CSF-freien Mikrokugeln keine Wirkung auf die durch natives CSF induzierte Aktivierung. Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß die erfindungsgemäßen CSF enthaltenden Mikrokugeln Makrophagen befähigen, eine hemmende Wirkung auf das Tumorzellenwachstum auszuüben, die weit effizienter als die nativen CSFs ist.
    • Beispiel 4
  • Das gleiche wie in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde verwendet, um CSF enthaltende Gelatine-Mikrokugeln herzustellen, mit der Ausnahme, daß 1 ml mit Glutaraldehyd gesättigte Toluol-Lösung (enthaltend Glutaraldehyd in einer Menge von 0,05 mg/mg Gesamtprotein) verwendet wurde. Die Menge von K-CSF, die in 1 mg der erhaltenen Gelatine-Mikrokugeln enthalten war, war äquivalent zu der in Beispiel 1 beschriebenen.
    • Beispiel 5
  • Die Makrophagen wurden 3 Tage mit 440 Einheiten HK-CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln, hergestellt wie in Beispiel 1 (G-I), vorbehandelt und die 440 Einheiten HK-CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln, hergestellt wie in Beispiel 4 (G-II), wie auch 1.000 Einheiten nativen HK-CSF anschließend vorsichtig gewaschen und in frischem Medium kultiviert. P815 Mastocytoma- Zellen wurden zu den aktivierten Makrophagen 1 bis 8 Tage später hinzugegeben, um die Dauer des aktivierten Zustands der Makrophagen zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Obwohl die Antitumoraktivität der mit nativem CSF vorbehandelten Makrophagen vollständig nach einem Tag, wie aus Fig. 4 ersichtlich, verschwand, blieb diejenige der mit CSF enthaltenden Gelatine- Mikrokugeln behandelten Makrophagen mehr als 2 Tage lang bestehen. Mehr noch kann die Retentionsdauer der Aktivierung durch Anderung des Ausmaßes der Vernetzung der Gelatine-Mikrokugeln mit Glutaraldehyd reguliert und durch eine Erhöhung der Vernetzung verlängert werden.
    • Beispiel 6
  • Zuerst wurden 0,28 g Sorbitanmonooleat (Span 80) in einer Mischung von 2,5 ml Toluol und 2,5 ml Chloroform gelöst und zu dieser organischen Lösung 0,2 ml einer wäßrigen 20 mg Gelatine und 1,38 x 10&sup5; Einheiten M-CSF (abgekürzt als Hu-CSF), isoliert aus menschlichem Urin gemäß Vergleichsbeispiel 2, enthaltenden Lösung hinzugefügt und die Mischung durch Ultraschall bei 10 W 10 sek. lang homogenisiert. Die erhaltene Emulsion wurde schnell zu 40 ml einer vorgekühlten Lösung aus Chloroform/Toluol (25 %/75 %) gegossen, die 2 g Span 80 enthielt. Anschließend wurden der Gelatine-Emulsion 5 ml eines Alequots von Glutaraldehyd-gesättigten Toluol, hergestellt gemäß Beispiel 1, hinzugefügt und die Mischung kontinuierlich 6 Stunden lang gerührt. Die Emulsion wurde bei 4.000 Upm 5 Minuten zentrifugiert, um die erhaltenen CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln zu sammeln. Die Mikrokugeln wurden nachfolgend mit einer Mischung aus Chloroform/Toluol (25 %/75 %), Isopropanol und PBS gewaschen. Der Waschvorgang wurde viermal wiederholt und schließlich die gewaschenen CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln in PBS suspendiert. Die Menge and CSF in den Mikrokugeln beträgt 6.840 Einheiten an Hu-CSF je 1 mg Gelatine- Mikrokugeln.
    • Beispiel 7
  • Das gleiche, wie in Beispiel 2 beschriebene Experiment, wurde unter Verwendung von CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln, hergestellt nach Beispiel 6, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Makrophagenvorbehandlung in 1 ml Medium, enthaltend Wachstumshemmung % nichts CSF enthaltende Gelatine-Mikrokugeln 440 U (64,3 ug) /ml CSF-freies Gelatine-Mikrokugeln (64,3 ug/ml) natives CSF (1000 U/ml) natives CSF (440 U/ml) + CSF-freie Gelatine-Mikrokugeln (64,3 ug/ml
  • Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, zeigen die durch HU-CSF enthaltende Gelatine-Mikrokugeln aktivierten Makrophagen eine sehr viel höher Wachstumshemmung auf das Tumorzellwachstum im Vergleich mit nativem Hu-CSF, CSF-freien Gelatine-Mikrokugeln und einer Mischung davon.
    • Beispiel 8
  • Das in Beispiel 2 beschriebene Bestimmungsverfahren wurde durchgeführt um die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der zur Aktivierung der Makrophagen erforderlichen Hu-CSF-Menge und der daraus resultierenden Antitumorwirkung zu bestimmen. Verschiedene Mengen Hu-CSF, hergestellt nach Vergleichsbeispiel 2, enthaltende Gelatine-Mikrokugeln, wurden nach Beispiel 6 hergestellt. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung der Makrophagenaktivierung ist in Fig. 5 gezeigt.
  • Wie aus Fig. 5 ersichtlich konnten die erfindungsgemäßen CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln Makrophagen aktivieren, das Tumorzellwachstum in einem ähnlichen Ausmaß zu hemmen, wie durch native CSF-induzierte Makrophagenaktivierung, wobei die CSF-Konzentration etwa 5.000-fach niedriger als beim nativen CSF war. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß die erfindungsgemäßen Mikrokugeln Makrophagen befähigen, Tumorzellenwachstum im Gegensatz zu nativem CSF zu hemmen.
    • Beispiel 9
  • Zuerst wurden 10 mg Gelatine (alkalische Form, pI 4,9, Nitta Gelatine, Japan) in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 4,7) gelöst und zu dieser Lösung HK-CSF, hergestellt gemäß Vergleichsbeispiel 1, oder Hu-CSF, hergestellt gemäß Vergeleichsbeispiel 2, in einer Menge von 6,9 x 10&sup5; Einheiten hinzugefügt und die Mischung 10 Minuten bei 4º C gerührt. Anschließend wurden 10 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids, d. h. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (Makkarai Tesque) zu der Mischung hinzugegeben und die Umsetzung weiter bei 4º C 19 Stunden lang fortgeführt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung dialysiert und mittels Filtration durch einen 0,22 um Millex -G9 Millipore Filter sterilisiert, um ein wasserlösliches CSF-Gelatinekonjugat zu erhalten. Wenn das gleiche Verfahren unter Verwendung ¹²&sup5;I-CSF durchgeführt wurde, betrug die Ausbeute an CSF enthaltenden Gelatine-Mikrokugeln 42,5 % und die Menge CSF in den wasserlöslichen CSF-Gelatinekonjugaten 68.940 Einheiten an CSF je mg Gelatine-Mikrokugeln sowohl für HK-CSF als auch für Hu-CSF.
    • Beispiel 10
  • Die hemmende Wirkung von mit wasserlöslichem CSF (HK-CSF)-Gelatinekonjugaten vorbehandelten Makrophagen, hergestellt nach Beispiel 9, auf das Wachstum von Zielzellen, P815 Mastocytomzellen, wurde wie folgt bewertet. Die wasserlöslichen CSF (HK-CSF) Gelatinekonjugate, Gelatine und/oder natives CSF (HK-CSF) wurden den Makrophagenmonoschichten, hergestellt gemäß Beispiel 2, hinzugefügt und zwei oder drei Tage zur Aktivierung der Makrophagen in 5 % C0&sub2;/95 % Luft bei 37º C inkubiert. Anschließend wurden die Makrophagenkulturen vorsichtig mit RPMI-1640 Medium gespült, um den hinzugefügten Makrophagenaktivator zu entfernen. 2,5 x 10&sup4; P 815 Mastocytomazellen in 1 ml RPMI-FCS wurden zu den Makrophagenmonoschichten hinzugegeben. Die Anzahl lebensfähiger P814 Mastocytomazellen wurde nach 48-stündiger Kultivierung bei 37º C gezählt. Das Ausmaß der Wachstumshemmung wurde bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Wachstumshemmung % Makrophagenvorbehandlung in 1 ml Medium, enthaltend zweitägige Vorbehandlung dreitägige Vorbehandlung nichts natives HK-CSF (1.000 U/ml) HK-CSF (586 u)-Gelatine-konjugate (8,5 ug/ml) CSF-freie Gelatine (8,5 ug/ml) CSF-freie Gelatine (8,5 ug/ml) + native HK-CSF (586 u/ml) a) Vorbehandlung in Gegenwart 10 ng/ml Polyliposaccarid (LPS).
  • Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, zeigen die durch die erfindungsgemäßen wasserlöslichen CSF-Gelatine-Konjugate aktivierten Makrophagen eine sehr große wachstumshemmende Wirkung auf das Tumorzellwachstum im Gegensatz zu nativen CSF und CSF-freier Gelatine. Das Vermischen von CSF mit Gelatine induzierte keine Makrophagenaktivierung.
    • Beispiel 11
  • Das gleiche wie in Beispiel 10 beschriebene Verfahren wurde durchgeführt, um die Fähigkeit der wasserlöslichen CSF (HK-CSF)-Gelatine-Konjugate hinsichtlich der Aktivierung von Makrophagen zu bstimmen, wenn R1-Fibrosarcomazellen als Zielzellen anstelle von P815 Mastocytomazellen verwendet wurden. Die Antitumorwirkung der Makrophagen nach zweitägiger Vorbehandlung ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Wachstumshemmung % Makrophagenvorbehandlung in 1 ml Medium, enthaltend nichts natives HK-CSF (1.000 U/ml) HK-CSF (586 U)-Gelatine-konjugate (8,5 ug/ml) CSF-freie Gelatine (8,5 ug/ml) CSF-freie Gelatine (8,5 ug/ml)+native HK-CSF (586 U/ml) a) Vorbehandlung in Gegenwart von 10 ng/ml LPS.
    • Beispiel 12
  • Die hemmende Wirkung der mit CSF (Hu-CSF)-Gelatine-Konjugaten, hergestellt nach Beispiel 9, vorbehandelten Makrophagen auf das Wachstum von P815 Mastocytoma oder R1 Fibrosarcomazellen wurde wie folgt bestimmt. Die gemäß dem Verfahren in Beispiel 2 hergestellten Makrophagen wurden mit wasserlöslichen CSF (Hu-CSF)-Gelatine-Konjugaten, nativem CSF (HU-CSF) und/oder CSF- freier Gelatine in 5%-CO&sub2;/95 % Luft bei 37º C zwei Tage lang zur Aktivierung inkubiert. Anschließend wurden die Makrophagenkulturen vorsichtig mit RPMI- 1640 Medium gespült, um den hinzugefügten Makrophagenaktivator vollständig zu entfernen. 2,5 x 10&sup4; P815 Mastocatomazellen in 1 ml RPMI-FCS wurden zu den Maktrophagenmonoschichten hinzugegeben. Die hemmende Wirkung der Makrophagen auf das Wachstum P815 Mastocytoma oder R1 Fibrosarcomazellen wurde wie, in Beispiel 2 beschrieben, bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Wachstumshemmung % Makrophagenvorbehandlung in 1 ml Medium, enthaltend P815 Mastocytoma R1 Fibrosarcoma nichts natives Hu-CSF Hu-CSF (586 U)-Gelatine-Konjugate (8,5 ug/ml) CSF-freie Gelatine (8,5 ug/ml) CSF-freie Gelatine (8,5 ug/ml) + native Hu-CSF (586 U/ml) a) Vorbehandlung in Gegenwart von 10 ng/ml LPS.
    • Beispiel 13
  • Das Bestimmungsverfahren zur Makrophagenaktivierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde verwendet, um die Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der zur Aktivierung von Makrophagen erforderlichen Menge CSF und der erhaltenen Antitumorwirkung zu bestimmen. Ein verschiedene Mengen an Hk-CSF, welches gemäß dem Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden war, enthaltendes CSF (HK-CSF)- Gelatine-Konjugat wurde gemäß Beispiel 9 hergestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt.
  • Wie aus Fig. 6 ersichtlich, ist die Gesamtmenge von CSF in den Kulturen, die zur Makrophagenaktivierung durch die erfindungsgemäßen CSF-Gelatine-Konjugate erforderlich ist, etwa 2.000-fach niedriger als bei nativem CSF oder einer Mischung von nativem CSF und CSF-freier Gelatine. Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß das erfindungsgemäße wasserlösliche CSF (HK-CSF)-Gelatine-Konjugat hinsichtlich der Aktivierung der Makrophagen wirksamer ist als die native CSF (HK-CSF)-Kontrolle und eine Mischung von nativem CSF (HK-CSF) und Gelatine.
    • Beispiel 14
  • Zur Untersuchung des Zeitverlaufs der Makrophagenaktivierung wurden Makrophagen verschieden lang bis zu 3 Tage mit einem wasserlöslichen CSF (HK- CSF)-Gelatine-Konjugat, hergestellt nach Beispiel 9, oder nativem CSF (HK-CSF) vorbehandelt. Die zellhemmende Wirkung der Makrophagen auf das Wachstum von P815 Mastocytomazellen ist in Fig. 7 gezeigt. Eine hohe Wirksamkeit des erfindungsgemäßen wasserlöslichen CSF (HK-CSF)-Gelatine-Konjugats hinsichtlich der Makrophagenaktivierung zeigt sich bei der kurzen Vorbehandlungszeit der Makrophagen im Vergleich mit nativem CSF.
    • Vergleichsbeispiel 1. Herstellung von HK-CSF
  • Zuerst wurde eine Rollflasche mit 3 x 10&sup8; HK-CSF-Zellen, die sich von Mausfibroblasten ableiten, in 1 mM Lithiumchlorid und 0,1 % Natriumbicarbonat enthaltendem DM-160 Medium 3 Tage lang bei 37º C kultiviert, um einen Kulturüberstand zu erhalten. Der Überstand enthielt 3.500 Einheiten CSF. Die CSF- Aktivität wurde durch ein in-vitro-Mausknochenmark-Kulturverfahren bestimmt (Shikita, M. et al., Journal of Cellular Physiology, 109, 161-169, 1981). Eine CSF-Einheit ist definiert als die zur Bildung einer Kolonie erforderlichen Aktivität. Der Überstand wurde auf einen pH-Wert von 4,5 mittels Phosphorsäure (10 %) eingestellt und das erhaltene Präzipitat verworfen. Der Überstand wurde durch EDTA-Cellulosechromatographie, Phenylsepharosechromatographie, Sephacryl, S-300 und Superose 12-Säulenchromatographie gereinigt, um M-CSF zu erhalten. Das so erhaltene M-CSF besaß ein Molekulargewicht von 100.000 ± 1.000 und wurde durch SDS-Gelelektrophorese bestimmt, eine spezifische Aktivität von 1,8 x 10&sup8; U/mg Protein wurde festgestellt, wobei die Proteinmenge unter Verwendung des BCA-Proteinassay-Reagenz ermittelt wurde (Pierce Chemical Company) (Smith, P.K. et al., Analytical Biochemistry 150, 76-85, 1985), und es besaß die Fähigkeit, Makrophagenkolonien nur in in- vitro-Mausknochenmark-Kulturverfahren zu bilden.
    • Vergleichsbeispiel 2. Herstellung von Hu-CSF
  • Zuerst wurden 10.000 l Harn von erwachsenen Männern mit 20 kg körniger wasserhaltiger Kieselsäure (Handelsname "White Carbon" (Tokuyama Soda, Tokyo)) behandelt, um die Proteine im Urin an Kieselsäure zu binden. Die Proteine wurden mit 1 %-wäßrigem Ammoniak extrahiert und durch eine 80 %ige Sättigung mit Ammoniumsulfat gefällt. Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst, die Lösung auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und 10 Stunden lang auf 60º C erwärmt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren eliminiert und der Überstand entsalzt, um eine Roh-CSF-Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde mittels DEAE-Cellulose-, Phenylsepharosechromatographie, Sepharcryl S-300-Chromatograghie, Superose 12-Chromatographie und u-Bondapak C18-Säulen (Waters)-Chromatographie gereinigt, um M-CSF mit einem Molekulargewicht von 82.000 + 6.000, bestimmt durch SDS-Elektrophorese mit einer spezifischen Aktivität von 1,3 x 10&sup8; U/mg Protein und der Fähigkeit, nur Makrophagen-Kolonien im in-vitro-Mausknochenmark-Kulturverfahren zu erhalten.

Claims (7)

1. Ein Konjugat enthaltend einen Koloniestimulierungsfaktor (CSF) und Gelatine, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat Mikrosphären aus vernetzter Gelatine sind, die CSF enthalten und einen Durchmesser von 5 um oder kleiner haben.
2. Ein Konjugat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das CSF makrophages CSF ist.
3. Ein Konjugat, enthaltend CSF und Gelatine, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat ein wasserlösliches CSF-Gelatine-Konjugat ist.
4. Ein Konjugat gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das CSF makrophages CSF ist.
5. Verfahren zur Herstellung von vernetzten, CSF enthaltenden Mikrosphären gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Homogenisierung eines wässrigen, Gelatine und CSF enthaltenden Mediums in einer organischen Lösung unter Bildung einer Emulsion und nachfolgende Vernetzung der Emulsion mit einem Vernetzungsmittel.
6. Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen, CSF und Gelatine enthaltenden Konjugats gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet durch Kupplung von CSF an Gelatine in einem wässrigen Medium mit einem wasserlöslichen Carbodiimide unter Bildung des wasserlöslichen Konjugats.
7. Eine pharmazeutische Zubereitung zur Verhinderung von Tumor-Zellwachstum, enthaltend ein CSF-Gelatine- Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3.
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