DE3781366T2

DE3781366T2 - Herstellung und verwendung eines reaktionsprodukts aus ascorbinsaeure mit alpha,beta-ungesaettigtem keton oder vinyl-aliphatischem keton.

Info

Publication number: DE3781366T2
Application number: DE8787903499T
Authority: DE
Inventors: B Fodor; W Veltri
Original assignee: Theracel Corp
Current assignee: Theracel Corp
Priority date: 1986-04-29
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1993-01-07
Anticipated expiration: 2007-04-16
Also published as: DE3781366D1; JPH0637500B2; WO1987006585A1; ATE79881T1; EP0265508A1; EP0265508B1; JPH01500037A; CA1326020C; EP0265508A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Anmeldung betrifft Michael-Additionsprodukte ausgewählter ungesättigter Aldehyde und Ketone mit Ascorbinsäure. Sie schließt sowohl L-Ascorbinsäure als auch ihr Isomer D-Ascorbinsäure ein. L-Ascorbinsäure ist auch als Vitamin C bekannt. Die Anmeldung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Produkte als Hauptwirkstoffe enthalten und Methoden zur Anwendung der Produkte, um die Immunreaktion bei Tieren zu stimulieren.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind als immunomodulierende Wirkstoffe einsetzbar. Sie können mit üblichen pharmazeutischen Trägern für die Verabreichung an Tiere und Menschen formuliert werden. Die Verbindungen und sie enthaltende Zusammensetzungen sind immunomodulatorisch aktiv, insbesondere sind sie immunostimulierend bei sehr geringen Konzentrationen. Sie sind als solche einsetzbar bei der Behandlung zahlreicher Krankheiten von Säugetieren und Menschen, die der Stimulierung des Immunsystems bedürfen. Dies schließt z.B die Stimulierung des Immunsystems nach der Chemotherapie oder Strahlentherapie ein. Die Produkte sind auch geeignet, die Proliferation von Helferzellen zu stimulieren bei Krankheiten wie Masern, durch Retroviren (HLTV-III) verursachte Krankheiten und Lepra, die durch eine unerwünscht hohe Konzentration an Suppressorzellen gekennzeichnet sind. Sie sind ebenfalls einsetzbar im Frühstadium zahlreicher Infektionen, um die Produktion von Interleukinen, Interferonen und anderen natürlichen Lymphokinen zu stimulieren.
Das Immunsystem ist eines der ersten Verteidigungsmittel der höheren Tiere gegen Krankheiten verursachende Mikroben und andere Fremdproteine. Eine Immunreaktion wird durch die Tätigkeit spezifischer Antikörper-Proteine gesteuert, die mit spezifischen Antigenen reagieren. Antigene sind Verbindungen mit einem ziemlich hohen Molekulargewicht, oft Proteinen, die dem Körper eines Individuums fremd sind. Meist befinden sie sich auf der äußeren Oberfläche der Zellen. Potentielle Antigene können beispielsweise auf Pollenkörnern, Transplantationsgewebe, einigen Tumorzelloberflächen, Tierparasiten, Viren und Bakterien gefunden werden.
Beim Menschen passieren viele potentielle Antigene niemals die körpereigenen ersten zwei Verteidigungslinien und können so nicht zur Stimulierung des Immunsystems beitragen. Diese zwei ersten Verteidigungslinien bestehen zuerst aus der Haut, Schleimhaut, Tränenflüssigkeit und Magensäure und zweitens aus spezialisierten weißen Blutkörperchen, Granulo- und Monocyten und Makrophagen, die Pathogene und andere potentielle Antigene durch Phagocytose, also durch Emulgieren und Zerstören des Fremdmaterials, zerstören können. Diese weißen Blutkörperchen und Makrophagen werden Phagocyten genannt. Wenn Pathogene oder andere Fremdstoffe die ersten beiden Verteidigungslinien des Körpers passieren, beginnt die Immunreaktion.
Es gibt zwei prinzipielle Abteilungen des Immunverteidigungssytems, humoral und cellulär, die beide mit Antigenen reagieren. Humorale Immunität beruht auf zirkulierenden Antikörpern, die in der gamma-Globulin-Fraktion der Plasmaproteine gefunden werden. Zentrifugiert man Plasma bei hoher Geschwindigkeit oder fällt man chemisch mit Ethanol nach der Cohn-Methode, trennen sich seine Proteine nach Molekulargewicht oder Ladung in Fraktionen genannte Gebiete. Antikörper finden sich üblicherweise in der gamma-Globulin-Fraktion deren Komponenten eine Sedimentationskonstante von etwa 7 bis 10 S besitzen und die IgG-Fraktion ein Molekulargewicht von annähernd 156000 aufweist. Humorale Immunität verleiht einen Langzeitschutz gegen Bakterien- und Virusinfektionen. Celluläre Immunität beruht teilweise auf direkter Lymphocytenwechselwirkung. Dieser Typ der Immunität ist verantwortlich für verspätete allergische Reaktionen, Abstoßung von fremdem Transplantationsgewebe und Abstoßung von Tumorzellen. Sie ist das Hauptverteidigungsmittel gegen Infektionen, die verursacht sind durch Viren, Pilze, Parasiten und einige Bakterien, wie Tuberkulosebazillen, und spielt eine Rolle bei der Erholung von solchen Infektionen.
Die als Lymphocyten bezeichneten spezialisierten weißen Blutkörperchen sind sowohl für die humorale als auch die celluläre Immunität verantwortlich. Die Lymphocytenvorgänger entstehen als hämatopoetisches Gewebe ontogenetisch (vor der Geburt) im Embryo noch vor der Ausbildung der Knochen. Sie sind zuerst als "Blutinseln" im Dottersack feststellbar, als kleine Verdichtungen von hämatopoetischen Zellen in den Dottersackgefäßen. Diese Inseln enthalten die multipotentiellen hämatopoetischen Zellen, die Stammzellen genannt werden. Bei der Entwicklung des Embryos stülpen sich die hämopoetischen Zellen in den Körperstamm und in das mesenchymale Schwammgewebe im vorderen ventralen Teil des Abdomens, der mit dem Körperstiel verbunden ist, ein. Die Leber wandert auf die selbe Seite des Mesenchymkörpers als eine Ausstülpung des Darmepithels, proliferiert und nimmt die Form von Lebersträngen zwischen hämatopoetischen Zellen an. Dabei wird die Leber bis kurz vor der Geburt zum hämatopoetischen Organ. Etwa zur Hälfte der Schwangerschaft beginnen die Knochenhohlräume definiertes hämatopoetisches Gewebe zu zeigen. Wenn die Säuger die Embryonenreife erreichen, läßt die Hämatopoese in der Leber nach, und das Knochenmark wird zum wichtigsten blutbildenden Organ.
Postnatal beherbergen die lymphoiden Organe des Körpers die immunkompetenten Lymphocyten, die das Immunsystem charakterisieren. Das Knochenmark beherbergt die Stammzellen (Vorstufen aller myeloischen und lymphoiden cellulären Elemente). Einige dieser Stammzellen wandern zu einem der primären lymphoiden Organe des Menschen oder anderer Säuger, dem Thymus. Der Thymus ist ein mehrlappiges Organ, das hoch hinter dem Brustbein angeordnet ist. Hier proliferieren und differentieren die Stammzellen zu reifen T-Lymphocyten, die dann in den Kreislauf eintreten und der Keim sekundärer lymphoider Organe, einschließlich Milz, Lymphknoten, Mandeln, Appendix und der Peyerschen Drüsen im Darm, sind. Das Knochenmark ist ebenso der Keim des darmassoziierten lymphoiden Systems, das entlang des Darms verteilt ist, mit Prae-B-Zellen. Diese Zellen proliferieren dann und differzieren sich unter dem Einfluß antigener Stimulation und wandern in die oben beschriebenen sekundären lymphoiden Organe. T- und B-Zellen sind strukturell und funktionell unterscheidbar durch verschiedene biologische, immunologische und biochemische Mittel.
Humorale Immunität wird durch die B-Lymphocyten vermittelt, die Immunoglobulin-Rezeptoren für spezielle Antigene auf ihren Zelloberflächen besitzen. Sie scheinen sehr spezifisch zu sein, und jeder Typ von B-Lymphocyten reagiert nur mit einem Antigen. Gelangen z.B. Bakterien oder Viren in einen Organismus, reagieren B-Lymphocyten mit dem Antigen und verbinden sich mit ihm auf der bakteriellen oder viralen Oberfläche, und der Lymphocyt wird angeregt, sich zu teilen. Seine Tochterzellen differenzieren zu spezialisierten sogenannten Plasmazellen. Diese Zellen produzieren und sekretieren große Mengen Antikörper in den gesamten Kreislauf. Die Antikörper sind für die Antigene spezifisch, die ihre Produktion angeregt haben und reagieren nur mit ihnen. Antikörper, die in Reaktion auf Antigene durch Plasmazellen gebildet wurden, können funktionell unterschieden werden als cytophil, d.h. sie sind zur Kombination mit cellulären Antigenen befähigt und verstärken die Phagocytose durch Monocyten, Makrophagen und polymorphkernige Granulocyten im peripheren Kreislauf. Solche Antikörper können auch cytotoxisch sein und bei der Kombination mit cellulären Antigenen in Gegenwart von Komplementen Lyse verursachen. Andere Antikörper können in Gegenwart spezifischer Antigen-sensibilisierter T-Zellen antikörperabhängige Zellyse von Tumorzellen oder virusinfizierten Zellen verursachen. Antikörper gegen Toxine oder Viren können ihre Toxizität bzw. Infektiosität durch Bindung an die passende kritische Stelle für die biologische Aktivität neutralisieren. Wieder andere Antikörper können auf die idiotypische Determinante eines Antikörpermoleküls (der variable Bereich des Moleküls) gelenkt werden, wobei sie als Anti-Idiotyp oder Anti-Antikörper (Antikörper 2) definiert werden, die geeignet sind, spezifische Antikörpersynthesen oder die Aufrechterhaltung von Antikörperkonzentrationen zu regulieren. In der letztgenannten Kaskade kann der Antikörper zum Anti-Idiotyp umgebildet werden, wobei ein neuer Antikörper (Antikörper 3) mit einer Spezifität auf des ursprüngliche Antigen entsteht. Dieses kann erreicht werden, ohne daß das immunisierte Tier jemals Kontakt mit dem ursprünglichen Antigen hatte. Diese Technologie kann wertvoll sein für die Modifizierung des Verlaufs von Autoimmun- oder Krebserkrankungen.
Sobald ein Pathogen in den Körper eintritt und die Immunreaktion beginnt, werden Antikörper zwischen 10 und 14 Tagen später erzeugt. Diese Anfangsreaktion wird Primärreaktion oder Primärimmunisierung genannt. Während dieser Zeit haben sich jedoch auch die Pathogene geteilt und verschiedene Krankheitssymptome verursacht. Es kann Tage oder Wochen dauern, bevor genug Antikörper gebildet sind, um alle Pathogene zu beseitigen, aber sobald sie verschwunden sind, verschwinden die Krankheitssymptome ebenfalls. Die Lymphocyten, Plasmazellen und Antikörper verbleiben und zirkulieren im Blut, so daß, wenn die selben Pathogene ein zweites Mal in den Körper eindringen, die B-Lymphocyten sofort reagieren und die Antikörperproduktion einsetzt. Die Reaktion der prae-sensibilisierten Lymphocyten wird Zweitreaktion genannt. Die Zweitreaktion führt zur Produktion höherer Antikörper-Konzentrationen als sie bisher im Plasma zirkulierten. Es werden so viele Antikörper so schnell produziert, daß die Mikroben daran gehindert werden, sich einzunisten, zu teilen und unter den genannten Umständen Krankheiten zu verursachen.
Vom IgE-Isotyp des Immunoglobulins erzeugte humorale Immunität hat als eine ihrer efferenten Reaktionen sofortige Hypersensibilität zur Folge, verursacht dadurch, daß ein bereits exponierter Organismus innerhalb von Minuten auf ein Antigen reagieren kann, z.B. im Fall von Heuschnupfen. Ein weiteres Beispiel der Hypersensibilisierung ist der anaphylaktische Schock, eine extreme allergische Reaktion, die gelegentlich auftritt, wenn ein Individuum einem Antigen ausgesetzt ist gegen das es sensibilisiert ist. Manchmal kann diese humorale Antwort auf das Antigen zum Tode führen.
Humorale Immunität kann sowohl natürlich als auch künstlich induziert werden. Im Fall aktiv erworbener natürlicher Immunität setzen die B-Lymphocyten eines Individuums die Zirkulation fort und aktivieren die Produktion von Antikörpern nach einer Infektion. Diese aktiv erworbene natürliche Immunität hält über Jahre an oder sogar für das ganze Leben. Ein Kind erhält in den ersten Tagen nach der Geburt Antikörper über das Kollostrum, von der Mutter sekretierte Milch, die ihm Immunität für sein erstes Lebensjahr verleihen. Dies ist als passive natürliche Immunität bekannt, weil das Kind an der eigentlichen Produktion der Antikörper nicht teilhat. Aktive künstliche Immunität wird durch Injektion toter oder geschwächter Mikroben oder synthetischer Antigene in das Individuum induziert. Diese Antigene können die B-Lymphocyten noch veranlassen, Antikörper gegen das ursächliche Pathogen zu produzieren. Wird das Individuum später virulenten Mikroben ausgesetzt, ist es bereits sensibilisiert und reagiert sofort mit einer massiven zweiten (Gedächtnis-) Produktion der Antikörper. Aktive künstliche Immunität kann viele Jahre andauern oder permanent mit Auffrischungsimpfungen. Es gibt ebenfalls eine Form der passiven künstlichen Immunität, die Schutz für etwa einen Monat verleiht. Diese temporäre Immunität wird erzeugt durch Injektion von Antikörpern einer anderen Person oder eines anderen Tiers in ein Individuum. Sie wird gewöhnlich nur in Krisensituationen und bei Epidemien angewandt. Weil die Lymphocyten umgangen werden, bilden sie weder Antikörper noch "erinnern sie sich" an das Antigen, das verantwortlich für den temporären Effekt dieser Methode ist.
Bei der cellulären Immunität sind im Gegensatz zur humoralen Immunität zirkulierende Antikörper nicht nachweisbar. Die T- Lymphocyten, die diese Art der Immunität vermitteln, werden aktiviert, wenn sie auf Antigene auf Zellen eines anderen Individuums stoßen, wie im Fall von Transplantaten, Tumoren, Bakterien oder Parasiten oder Viren. Wie B-Lymphocyten sind T-Lymphocyten spezifisch, und jeder Typ reagiert nur mit einem Antigen. Die T-Lymphocyten im peripheren Kreislauf werden in Unterpopulationen aufgeteilt mit unterschiedlichen Ausführerfunktionen in der Immunreaktion. Die T-Helfer-Induzierer-Unterpopulation besitzt einen spezifischen Rezeptor für das Antigen und ist verantwortlich für die Produktionssteigerung der für das Antigen spezifischen Antikörper durch die B-Zellen. Der T-Helfer-Induzierer wird beim Menschen durch einen Oberflächenmarker, der als T-4-Antigen bezeichnet wird, identifiziert und kann durch monoklonale Antikörper nachgewiesen werden. Eine andere Schlüsselgruppe der T-Lymphocyten-Unterpopulationen ist der T-Suppressor induzierende Lymphocyt (T-8-Antigen-Oberflächenmarker), der die Vielzahl der Reaktionen gewisser T- und B-Zellen auf spezifische Antigene reguliert. Es gibt auch T-cytotoxische (Killer)zellen, die direkt an Targettumor-, Transplantat- oder virusinfizierte Zellen binden können und zu ihrer Zerstörung führen. Proliferieren T-Zellen in Reaktion auf ein Antigen, produzieren sie zusätzlich Lymphokine, die an der Regulierung der Immunreaktion teilnehmen und an der Beseitigung des fremden Antigens. T-Zellen sind direkt beteiligt an der zellvermittelten Immunität gegen Tumorzellen, virusinfizierte Zellen und andere celluläre Antigene und helfen eindeutig bei der Erholung von solchen Krankheitsabläufen. Auch sind die T-Zellen verantwortlich für Allograft- Abwehr, verspätete, cutane Hypersensibilität (DCH), chemische Sensibilisierung gegen Efeu-, Eichen-, Färberbaumtoxin und gegen gewisse Metalle. Diese DCH-Reaktion wird so bezeichnet, weil sie 24 bis 48 Stunden braucht, um sich zu entwickeln, nachdem man dem Antigen ausgesetzt war. Celluläre Immunität gegen neue Antigene tritt gewöhnlich einige Tage eher auf als die Primärantikörperreaktion (IgM) im Säuger stattfindet, und es gibt Memory- T-Zellen, die für die Langzeitimmunität verantwortlich sind. Eine andere T-Lymphocyten-Unterpopulation besteht aus den "natural killer-" (NK) T-Zellen (großen granulären Lymphocyten), und diese Zellen werden ohne vorherige Antigenprovokation in Aktion gerufen. Diese NK-Zellen sind gegen Tumor- oder virusinfizierte Zellen aktiv und können durch Interferon zu größerer Aktivität (Proliferation) stimuliert werden. Diesen Zellen wird eine Schlüsselrolle bei der "Immunüberwachung" von Krebs nachgesagt. Wie oben erwähnt, sekretieren T-Zellen Lymphokine, eine vielfältige und potente Gruppe biologisch aktiver Moleküle mit einer Vielzahl von Wirkungen. Einige ausgewählte Beispiele dieser T-Zellen-Lymphokine schließen Interleukin 2 (T-Zellen-Wachstumsfaktor), B-Zellen-Wachstumsfaktor, Interferon (gamma) und Makrophagen-produzierte Interleukine (IL-1) ein. Diese Lymphokine haben zumindest zwei Aufgaben in der Immunreaktion. Eine ist die Immunregulation und die andere die direkte Cytotoxizität (Zerstörung) gegen Tumorzellen oder virusinfizierte Zellen.
Immunomodulierende Zellen aktivieren oder inhibieren den Prozeß der Lymphocytenproliferation. Die normale Lymphocytenproliferation wird durch verschiedene Wechselwirkungen zwischen Antigenen, Makrophagen, T- und B-Lymphocyten verursacht. Zusätzlich können gewisse B-Lymphocyten durch T-Lymphocyten aktiviert werden, während andere unabhängig von den T-Lymphocyten sind und nur durch Antigene direkt aktiviert werden. Aktivierte T-Lymphocyten können Makrophagen veranlassen, ein Molekül, das als Interleukin 2 (IL-2) bekannt ist, zu produzieren, das seinerseits T-Zellen aktiviert, die dann andere T- und B-Lymphocyten stimulieren. Aktivierte Makrophagen können ein als Interleukin 1 (IL-1) bekanntes Molekül produzieren, das weiter T-Lymphocyten-Aktivierung induziert. Mitogene genannte Chemikalien können die DNA-Synthese und Mitose auslösen, was Anzeichen der Aktivität in den T- und B-Zellen sind. Einige Mitogene beeinflussen nur einen Typ von Lymphocyten, während andere mehrere Typrn beeinflussen. Immunomodulierende Stoffe unterschiedlicher Art und unterschiedlicher Menge beeinflussen die komplexe Wechselwirkung zwischen den Komponenten des Immunsystems. Die Verbindungen und Zusammensetzungen dieser Erfindung wirken als Immunostimulatoren und beeinflussen sowohl T- als auch B-Lymphocyten.
Das Immunsystem ist mit einigen Aspekten des Alterns in Verbindung gebracht worden und kann als Schutz gegen Krebs eine Rolle spielen. Das System ist nötig bei der Erkennung alternder oder sich verändernder Zellen, wie verbrauchter roter Blutkörperchen, und ihrer anschließenden Zerstörung, und aus diesem Grund ist es lebenswichtig für eine normale Körperfunktion. Eine Theorie über Krebs besagt, daß die Zelltransformation zur Malignität relativ häufig vorkommen kann, diese veränderten Zellen jedoch als "nicht körpereigen" erkannt und zerstört werden. Manche Cancerogene wirken möglicherweise eher durch Unterdrückung des Immunsystems als daß sie selbst Zellen zur Malignität transformieren. Dies würde bedeuten, daß der Körper die spontan transformierten Zellen nicht länger zerstört und das cancerogene Wachstum unkontrollierbar wird, so daß ein Tumor entsteht. Immunstimulierung könnte bei der Behandlung solcher Art Krebs sinnvoll sein.
Auch produzieren gewisse sich im Menschen entwickelnde Tumoren als Folge ihres Wachstums einen immunodepressiven Zustand in ihrem Wirt (d.h. Leukämie, Lymphome, Atemwegskrebs und HTLV- induzierte Tumoren).
Einige der Behandlungsmethoden für Krebs, wie Operation, cytotoxische Chemotherapie und Bestrahlung, können zur Suppression oder drastischen Veränderung der normalen Immunsystemfunktionen führen. Immunstimulierende Arzneimittel wie die Verbindungen und Zusammensetzungen dieser Erfindung können bei der Bekämpfung und/oder Vorbeugung zahlreicher Infektionen, die durch ein unterdrücktes Immunsystem verursacht sein können, sehr wirksam sein.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, Verbindungen bereitzustellen, die immunomodulatorische Wirkung, insbesondere immunstimulierende Wirkung, besitzen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Methoden zur Herstellung dieser Verbindungen, von denen einige neu sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, neue Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Störungen des Immunsystems wirksam sind, bereitzustellen, insbesondere für solche Störungen, die eine Stimulierung des Immunsystems erfordern.
Andere Aufgaben, Vorteile und neue Merkmale gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung hervor.

Beschreibung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß Produkte einer säurekatalysierten Michael-Addition von D- oder L-Ascorbinsäure und gewissen ausgewählten Ketonen als Immunomodulatoren einsetzbar sind. Genauer sind die brauchbaren Reaktionsprodukte der Erfindung solche, die erhalten wurden durch Reaktion von Ascorbinsäure mit α,β-ungesättigten alicyclischen Ketonen, die 4 bis 7 Kohlenstoffatome enthalten, oder mit vinylaliphatischen Ketonen, in denen die gesättigte Einheit der aliphatischen Einheit mit Substituenten substituiert sein kann wie Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder ähnlichen Halogenalkylgruppen, insbesondere Fluoralkylgruppen, wie Trifluormethyl.
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung können durch die folgenden Formeln wiedergegeben werden:
worin R¹ Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder eine (C&sub1;-C&sub4;)-Halogenalkylgruppe, insbesondere eine (C&sub1;-C&sub4;)-Fluoralkylgruppe, bedeutet, mit der Vorgabe, daß R¹ sich weder am α- noch am β-Kohlenstoffatom befinden kann und die gepunktete Linie die CH&sub2;-Einheiten bezeichnet, die nötig sind, um den alicyclischen Ring auf 4 bis 7 Kohlenstoffatome zu vervollständigen, und R eine Alkylgruppe bedeutet, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält.
Typische Verbindungen innerhalb des Umfangs der Erfindung schließen die Reaktionsprodukte von Methylvinylketon und L-Ascorbinsäure oder 2-Cyclohexenon und L-Ascorbinsäure ein. Die Strukturen dieser Verbindungen können durch die folgenden Formeln wiedergegeben werden:
Die chemischen Bezeichnungen für diese Verbindungen lauten:
2-(3-Ketobutyl)-2-hydroxy-3-keto-4-dihydroxyethyl-butyrolacton- < 3,6> cyclohemiketal (KBBL) bzw.
2-(3-Ketocyclohexyl)-2-hydroxy-3-keto-4-dihydroxyethyl-butyrolacton-< 3,6> cyclohemiketal (KCBL).
Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung sind solche, in denen der alicylische Ring des Ketons unsubstituiert ist und 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält und solche, in denen R 1 oder 2 Kohlenstoffatome enthält. Diese werden wegen ihrer Aktivität bevorzugt und weil ihre Ausgangsverbindungen leicht und kostengünstig verfügbar sind.
3-Methyl-2-cyclohexenon reagiert unter den selben Bedingungen mit Ascorbinsäure nicht. 2-Cycloheptenon reagiert, aber sehr langsam.
Die Reaktion wird im wäßrigen Medium bei Raumtemperatur in Gegenwart einer katalytischen Menge einer starken Säure durchgeführt, zweckmäßig einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure oder einer Halogensäure, vorzugsweise Salzsäure. Vorzugsweise wird die Reaktion in einer inerten Atmosphäre, wie Stickstoff oder Helium, durchgeführt.
Das bevorzugte Reaktionsmedium ist Wasser, obwohl auch andere Lösungsmittel zugesetzt werden können, besonders wassermischbare Lösungsmittel, wie niedere Alkohole, typischerweise Methanol, Ethanol, oder Ether, wie Tetrahydrofuran, oder Ketone, besonders Aceton. Diese unterstützen das Auflösen einiger hochmolekularer oder hydrophober Reaktanden.
Die Reaktion wird bei einer Temperatur von etwa 20 bis 45 ºC für eine Dauer von etwa 2 bis 24 Stunden durchgeführt. Die Reaktionsdauer ist nicht kritisch. Sie hängt prinzipiell von der Menge der Reaktanden ab. Die Reaktion kann leicht mit konventionellen Analysemethoden verfolgt werden, um festzustellen, wann die Reaktion zuende ist, oder wenn bei Fortsetzung der Reaktion kein Anstieg der Ausbeute mehr zu erwarten ist. Hochdruckflüssigchromatographie ist ein bequemes Hilfsmittel.
Generell werden äquimolare Mengen der Reaktanden eingesetzt. Unter gewissen Umständen kann es jedoch wünschenswert sein, einen molaren Überschuß zu verwenden, z.B. bis zu etwa 10 % molaren Überschuß eines der Reaktanden, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu gewährleisten.
Wie bereits gesagt, kann jede einer Vielzahl starker Säuren zur Katalyse der Reaktion eingesetzt werden. Typischerweise werden 0.1 bis 1.5 Gew.-% der Säure, bezogen auf das Gesamtgewicht der Reaktanden, eingesetzt. In einem wäßrigen Medium ist Salzsäure bevorzugt, da sie durch Ausfällen als Chloridsalz leicht entfernt werden kann. Jedoch können auch stärkere Carbonsäuren, wie Trichloressigsäure oder Trifluoressigsäure, verwendet werden.
Es ist überraschend zu finden, daß eine Michael-Addition durch Säure katalysiert werden kann. Gewöhnlich wird diese Art Reaktion, die eine Addition einer aktiven Methylenverbindung an ein aktiviertes ungesättigtes System ist, durch Base katalysiert.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die auf alicyclischen Ketonen basieren, sind neu. Einige solche auf der Basis aliphatischer Ketone sind beschrieben worden. Z.B. beschrieben Fodor et al. in Tetrahedron 39 Nr. 13, Seiten 2137 bis 2145 (1983) das Reaktionsprodukt von Methylvinylketon und Ascorbinsäure. Die in dieser Veröffentlichung beschriebene Reaktion ist nicht säurekatalysiert und viel weniger schnell als die hier beschriebene Reaktion. Zudem ist die in der Veröffentlichung beschriebene Reaktion viel zu langsam, um praktisch für die Herstellung von Reaktionsprodukten aus cyclischen Ketonen im großen Maßstab von Nutzen zu sein.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Immunreaktion zu stimulieren, wurde durch eine Anzahl in der Fachwelt geläufiger Tests bestätigt.
Einer dieser Tests ist der Lymphocyten-Blastogenese-Test, der die Fähigkeit der Testverbindung mißt, DNA-Synthese und Mitose von T- und B-Lymphocyten aus Mäusemilz zu beeinflussen.
Mitogene sind Verbindungen, die die DNA-Synthese und Mitose stimulieren. Die in diesen Tests vewendeten Mitogene waren Phytohämagglutinin (PHA), das aus Roter Feuerbohne isoliert wurde, und Concanavalin-A (Con-A), das aus Schwertbohnen (Jack-Bohnen) isoliert wurde. Con-A bindet an spezifische Rezeptoren (Glykoproteine), die Mannose- und Glukoseeinheiten enthalten, und stimuliert alle murinen T-Zellen, DNA zu synthetisieren, sich zu teilen und Lymphokine freizusetzen. Con-A in löslicher Form erlaubt eine Unterscheidung zwischen T- und B-Zellen der Maus, denn obwohl sowohl T- als auch B-Zellen 10&sup6; Moleküle Con-A pro Zelle binden können, werden nur T-Zellen stimuliert, wenn dieses Lektin in löslicher Form vorgelegt wird. PHA stimuliert nur Unterpopulationen von Mäuse-T-Zellen, nämlich T-2-Zellen. Beim Menschen werden wahrscheinlich sowohl T- als auch B-Zellen stimuliert.
Die Aktivierung von B-Zellen durch PHA kann indirekt und durch die Freisetzung von löslichen Mediatoren aus PHA-aktivierten T- Zellen vermittelt sein.
Der Lymphocyten-Blastogenese-Test ist eine Methode, um die Fähigkeit von immunokompetenten T- oder B-Zellen festzustellen, auf ein polyklonales Mitogen (d.h. PHA oder Con-A) oder ein spezifisches Antigen zu reagieren. Er kann mit Lymphocyten von Mäusen, die in vivo mit Immunostimulatoren behandelt wurden, durchgeführt werden, oder der ganze Test kann in vitro durchgeführt werden. Der unten beschriebene Test verwendet minimale Dosen polyklonaler Mitogene zum Induzieren der Blastogenese (Proliferation, gemessen durch DNA-Synthese), um das Vergrößerungsphänomen feststellen zu können. Das Verfahren ist also angelegt, die Fähigkeit potentieller Immunomodulatoren zu testen, die normalen immunologischen Parameter wiederherzustellen.
Der Lymphocyten-Blastogenese-Test wird wie folgt durchgeführt:
1. Töte zwei Mäuse/experimentelle Gruppe durch Genickbruch.
2. Tauche die Mäuse in eine milde Desinfektionsmittellösung (Povadyne).
3. Entferne die Milz und lege sie auf eine Platte mit 6 Mulden, die 5 ml RPMI-1640 pro Mulde enthalten.
4. Stelle eine Einzelzellösung her durch Zerhacken mit einem sterilen, gezahnten Forzeps.
5. Fülle die Zellösung in ein steriles Zentrifugenglas und lasse große Klumpen 10 Minuten lang absitzen.
6. Entferne die Einzelzellösung durch Abpipettieren des Überstands in ein anderes Zentrifugenglas.
7. Zentrifugiere die Zellsuspension 10 Min. lang bei 1100 UpM in GLC-2B.
8. Überstand aseptisch entfernen und verwerfen.
9. Zellklumpen in 5 ml RPMI-1640 resuspendieren und zentrifugieren. Zellen auf diese Weise noch zweimal waschen.
10. Resuspendiere die Zellen in 5 ml RPMI-1640, das 10 bis 15% hitzeinaktiviertes Human-AB (Pel-Freeze, Rogers, AR oder BioBee, Bosten,MA) enthält.
11. Zähle die lebensfähigen Zellen unter Benutzung von 0.25% in isotonischer Salzlösung hergestelltem Trypanblau-Kennzeichnungsfarbstoff. Nicht lebensfähige Zellen färben sich blau.
12. Stelle die Konzentration der lebensfähigen Zellen auf 5.0 10&sup6; Zellen/ml in Human-AB-Serum enthaltendem RPMI-1640 ein.
13. Bringe je 6 0.1 ml-Aliquots der verschiedenen Zellsuspensionen auf eine 96 Mulden enthaltende sterile runde Gewebekulturplatte auf.
14. Gib zu den obigen Sechsergruppen der Replikaellen 2.5, 5.0 oder 7.5 ug/ml Con-A und zum Replikat nochmals 10, 15 oder 20 ug/ml PHA.
15. Führe das Experiment ebenfalls mit einer Testplatte durch, die statt des Mitogens nur 0.1 ml Medium erhält.
16. Befeuchte die Platte durch Auffüllen der äußeren Mulden mit Medium.
17. Inkubiere die Platten bei 3 ºC 48 Studen lang mit 5% CO&sub2;.
18. Nach 48 Stunden erhalten alle Mulden 0.025 ml einer 0.4 Microcurie/ml-Lösung von C-14-Methylthymidin, und man inkubiere bei 37 ºC, 5% CO&sub2; 18 Stunden lang.
19. Die Zellen werden mit einem Brandel M-12 Cell Harvester (Brandel, Rockfille, MD) auf ein Rundfilterpapier unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung physiologischer Osmolarität (285-320 mos) gesammelt.
20. Die Rundfilterpapiere werden in Packard-Miniscintillationsgefäße plaziert und 18 Stunden trocknen gelassen.
21. Nach dem Trocknen werden die Gefäße mit 2 ml eines Scintillationscoctails, der 4 Liter Toluol zur Scintillation, 16.0 g 2,5-Diphenyloxazol (PPO) und 0.4 g 1,4-Bis-2-(5-Phenyloxazolyl)benzol (POPOP) enthält, gefüllt.
22. Die Gefäße werden in einem LKB 1212-Rackbeta-Flüssigscintillationszähler (LKB Instruments, Gaithersburg, MD) 2 Minuten pro Gefäß ausgezählt.
Tabelle I und II zeigen die Ergebnisse des Lymphocyten-Blastogenese-Tests mit zwei Isomeren von KCBL. Wie festzustellen, ergeben beide Isomere statistisch signifikante Erhöhungen der Zählergebnisse pro Minute basierend auf dem Einbau von C-14- Thymidin in DNA. TABELLE I WIRKUNG VON KCBL-A AUF DEN LYMPHOCYTEN-BLASTOGENESE-TEST Arzneimitteldosis, mg/kg RPMI-Kontrolle % Zunahme * bezeichnet einen signifikanten Anstieg über die Kontrolle (p 0.05) +/- bezieht sich auf die Standardabweichung TABELLE II WIRKUNG VON KCBL-B AUF DEN LYMPHOCYTEN-BLASTOGENESE-TEST Arzneimittel mg/kg % Zunahme Mittelwert Standardabweichung * bezeichnet einen signifikanten Anstieg über die Kontrolle (p 0.05) +/- bezieht sich auf die Standardabweichung
RPMI ist ein halbsynthetisches Zellwachstumsmedium, erhältlich von Hazelton Labs, Inc., Denver, PA, und umfaßt alle essentiellen Aminosäuren, Vitamine, Puffer und Salze, die für das Zellwachstum von Säugern nötig sind, außer den Serumwachstumsfaktoren, die unter Verwendung einer tierischen Quelle (Ochse) bereitgestellt wurden.
Tabelle III zeigt die Ergebnisse des Lymphocyten-Blastogenese- Tests mit KBBL, dem Michaeladditionsprodukt von L-Ascorbinsäure mit Methylvinylketon. Wie bemerkbar, ist die Verbindung stimulierend für alle getesteten PHA- und Con-A-Dosierungen und ebenso für alle Dosen des Arzneimittels, die benutzt wurden, um die Mäuse vor dem Test zu behandeln. TABELLE III WIRKUNG VON KBBL AUF DEN LYMPHOCYTEN-BLASTOGENESE-TEST Arzneimittel mg/kg RPMI Kontr * bezeichnet statistische Signifikanz bei p < 0.05; +/- bezieht sich auf die Standardabweichung
Der hämolytische Plaque-Test nach Jerne ist ein Testverfahren, das die IgM- oder IgG-Isotypen spezifischer Antikörper mißt, die durch Antigen, das zum Immunisieren von Mäusen verwendet wurde, produziert wurden. Das Verfahren zeigt die Antikörperproduktion auf T-Zellen-abhängige Antigene durch einzelne B-Lymphocyten. Der direkte Test detektiert IgM- und der indirekte Test IgG- spezifische Antikörper.
Das Verfahren läuft wie folgt:
Gewaschene Milzzellen werden zu einer Agarose-Präparation (FMC, Rockland, ME), die rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) und Meerschweinchen-Komplemente enthält. Ein Tropfen dieser Mischung wird auf eine kleine Petrischale überführt; eine Abdeckscheibe wird dann über den Tropfen gelegt, um ihn zu ebnen. Die Agarose- Präparation läßt man verfestigen. Dann werden die Schalen über Nacht in eine kleine befeuchtete Kammer in einem Kohlendioxidinkubator gestellt.
Kleine nadelkopfgroße klare Zonen (Plaques) sind unter der Abdeckung bemerkbar. Die klaren Zonen werden durch Antikörper verursacht, die auf SRBC's spezifisch sind und durch stimulierte Milzzellen freigesetzt wurden und in Verbindung mit dem Komplement die umgebenden SRBC's lysieren. Diese plaquebildenden Zellen (PFC's) werden gezählt, und Berechnungen werden durchgeführt, um die PFC's pro 1 10&sup6; Milzzellen zu erhalten.

Reagenzien:

Rote Blutkörperchen von Schafen
Sea-Plague-Agarose
RPMI-1640
Meerschweinchenkomplement
30 mm-Petrischalen
22 22 1½ Abdeckscheiben

Methoden:

1. Milz von Mäusen wird nach Standardmethoden gesammelt und auf eine Endkonzentration von 20 % in RPMI-1640 eingestellt.
2. SRBC's werden auf eine Endkonzentration von 20 % in RPMI-1640 eingestellt.
3. Rekonstituiere Meerschweinchenkomplemente (GPC) (Hazelton-Dutchland Inc., Denver, PA) durch Zugabe von gepuffertem Verdünnungsmittel direkt zu lyophilisiertem GPC. Verdünne 1:7 mit RPMI-1640 durch Zugabe von 3 ml RPMI-Medium zu 0.5 ml Komplement.
4. Stelle 0.7 %-Sea Plaque-Agarose (FMC, Rockland, ME) in 25 ml RPMI-1640 her, gib 0.175 g der Agarose in einen sterilen 50 ml-Kolben. Erwärme bei mittlerer Hitze und rühre vorsichtig bei geringstmöglicher Geschwindigkeit mit einem Magnetrührstäbchen. Vor dem Sieden Kolben entfernen. Sofort in ein 37 ºC warmes Wasserbad stellen.
5. Alle Reagenzien (SRBC's, GPC und Milzzellenpräparate) im Wasserbad bei 37 ºC 15 Min temperieren.
6. Für jede zu testende Präparation wird ein 12 75 mm- Glasröhrchen in ein Gestell in ein 37 ºC warmes Wasserbad plaziert. Gib 0.7 ml der Agarose in jedes 12 75 mm-Röhrchen.
7. Stelle drei verschiedene Rannin-Pipetten (Gilson, Middelton, WI) auf 0.05, 0.1 und 0.2 ml ein.
8. Zu den ersten Agarose enthaltenden 12 75 mm-Röhrchen gib 0.2 ml der ersten Milzzellenpräparation. Dann gib 0.05 ml Komplement zu. Füge 0.05 ml SRBC's zu. Sehr gründlich durchmischen, bis eine einheitliche Suspension der SRBC's vorliegt.
9. Beschrifte sowohl Deckel als auch Boden der Petrischalen entsprechend der Zellgruppe.
10. Unter Verwendung der 0.1 ml-Pipette entferne 0.1 ml der Agarose/Zell-Präparation und verteile sie in der Mitte des Petrischalendeckels. Wiederhole diesen Vorgang sofort für den Petrischalenboden.
11. Vorsichtig eine 22 22 mm-Abdeckscheibe auf den Tropfen setzen (fallenlassen). Gefäße nicht vor dem Absetzen und Aushärten der Agarose bewegen.
12. Schritte 6-11 für alle verbleibenden Zellpräparationen wiederholen.
13. Nach dem Verfestigen der Agarose in kleine befeuchtete Plastikkammern umsetzen. In einen Inkubator stellen und über Nacht bei 37 ºC inkubieren lassen. Ergebnisse am folgenden Morgen feststellen.
14. Anzahl der hämolytischen Plaques pro Platte ermitteln und festhalten. Mittelwert der Plaquezahlen für jeden doppelten Satz ermitteln. Multipliziere den Mittelwert der Plaques pro Gruppe mit 2.5, um die Anzahl der plaquebildenden Zellen pro Million Milzzellen zu erhalten.
Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse des Jerne-Tests für die zwei Isomere von KCBL (A und B) bzw. für KBBL. Alle drei Arzneimittel zeigten eine dosisabhängige Steigerung verglichen mit der Kontrolle. TABELLE IV EINFLUß VON KCBL A UND B AUF DEN JERNE-TEST KCBL-A KCBL-B Arzneimittelbehandlung PFC/1 Mio Zellen % Steigerung Trägersubstanzkontrolle SRBC-KONTROLLE TABELLE V EINFLUß VON KBBL AUF DEN JERNE-TEST Behandlungsgruppe PFC/1 Mio Zellen % Steigerung Trägersubstanz-Kontrolle 0.5 SRBC-Kontrolle
Die biologisch aktiven Verbindungen dieser Erfindung können als solche oder in Kombination mit annehmbaren pharmazeutischen Trägern, die sich nach der bevorzugten Art der Verabreichung, der Löslichkeit der Verbindungen und der standardmäßigen pharmazeutischen Praxis richten, verabreicht werden. Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen in Tablettenform mit Zusätzen, wie Puffern, Stärke oder Milchzucker, verabreicht werden. Wäßrige Lösungen und Elixiere, die gepuffert und gesüßt oder aromatisiert sein können, sind ebenfalls anwendbar. Für intraarterielle Injektionen können wäßrige Lösungen benutzt werden. In diesem Fall können der Zusammensetzung verschiedene suspendierende oder befeuchtende Mittel zugesetzt sein, um eine Suspension zu erhalten, die nicht zum leichten Absetzen oder Verdichten am Boden des Lagerbehältnisses neigt. Intramuskuläre und subkutane Dosierungsformen können ebenfalls nach gängiger pharmazeutischer Praxis hergestellt werden.
Die Verbindungen können in Verbindung mit anderen therapeutischen Mitteln, einschließlich z.B. Antibiotika oder antiviralen Mitteln, verwendet werden. Es kann auch nützlich sein, die synthetischen Immunostimulatoren in Verbindung mit natürlichen Immunostimulatoren, wie Interleukin 1 und 2 oder Interferon oder dessen sythetischen Induktoren (d.h. Poly-IC-LC usw.), B-Zellen- Wachstumsfaktor oder Tumornekrosefaktor, anzuwenden. Sie können auf jede der gewöhnlichen Verabreichungsrouten intramuskulär oder intravenös verabreicht werden.
Der begleitende Arzt oder Tierarzt wird die optimale Dosierung unter Berücksichtigung von Faktoren, wie Alter, Gewicht und Allgemeinzustand des Patienten, bestimmen. Eine zur Stimulierung der immunomodulatorischen Reaktion geeignete Dosis wird in der Regel etwa 100 bis 50 mg/kg Körpergewicht betragen, obwohl breite Variationen möglich sind. Die Dosis kann in einem oder mehreren Behandlungsschritten innerhalb eines bestimmten Zeitraums verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Dosierungsformen mit typischerweise 2 bis 1 aktiven Bestandteil pro Dosiseinheit zur Verfügung gestellt werden.

BEISPIEL 1

2-(3-Ketobutyl)-2-hydroxy-3-keto-4-dihydroxyethyl-butyrolacton- < 3,6> cyclohemiketal (KBBL)

L-Ascorbinsäure (22.0 g, 0.125 mol) wurde 88 ml Wasser zugesetzt, das 1 h lang mit Stickstoff entgast worden war. Methylvinylketon (8.75 g, 0.125 mol) wurde zur resultierenden Lösung zugetropft, worauf 0.3 ml konz. Salzsäure zugetropft wurden. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 24 h gerührt, bis die HPLC-Analyse den vollständigen Verbrauch des Methylvinylketons anzeigte. Der HCl-Katalysator wurde durch Zugabe von 2.0 g Silbercarbonat entfernt. Nach dem Zentrifugieren wurde das Filtrat abgekühlt und gefriergetrocknet, um 28.80 g (94 %) Rohprodukt zu ergeben. Der Feststoff wurde in 550 ml siedendem Ethylacetat gelöst und Kühlen ergab 13.74 g eines weißen, kristallinen Feststoffs. Die Konzentrierung des Filtrats ergab weitere 3.35 g kristallinen Feststoff. Beide Fraktionen wurden vereinigt und aus 450 ml heißem Ethylacetat umkristallisiert, worauf man 13.30 g (43.3 %) reines Produkt erhielt; Smp. 124-135 ºC, [α]D²&sup5; = +23.1 º (c = 1.02, Methanol).
Das entsprechende Ethylvinylketon-Produkt wurde analog hergestellt. Sein Schmelzpunkt betrug 65-67 ºC.

BEISPIEL 2

Herstellung der beiden Diastereomere von KCBL

704 ml destilliertes Wasser wurden 1 h lang mit Stickstoff gespült, und L-Ascorbinsäure (Mallinckrodt, USP-Qualität) (176.0 g, 1.0 mol) wurde zugesetzt. Zur resultierenden Lösung tropfte man unter Rühren 2-Cyclohexenon (Aldrich Chemical) (96.0 g, 1.0 mol). Eine halbe Stunde nach der Zugabe des 2-Cyclohexenons wurde konz. Salzsäure (2.4 ml) zugesetzt. Man ließ die Lösung ungestört 24 h lang bei Raumtemperatur stehen, bis die Bildung eines kristallinen Feststoffs zu bemerken war. Die Mischung wurde in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt und abgesaugt, wobei 88.95 g (33 %) eines ersten Rohprodukts anfielen. Das Filtrat wurde in einer Kühltruhe über Nacht gekühlt, worauf weiterer Feststoff ausfiel, der abgesaugt wurde und 92.72 g (34 %) eines zweiten Rohprodukts ergab. Die Hochdruckflüssig-Chromatographie (HPLC)- Analyse (Säule: MCH 10, Laufmittel: 80 % Wasser/Methanol, Fließgeschw.: 1.0 ml/Min) zeigte, daß das erste Rohprodukt zu etwa 90 % aus Isomer 1 (Retentionszeit 4.5 Min) und das zweite Rohprodukt zu etwa 55 % aus Isomer 2 (Retentionszeit 4.2 Min) bestand.
Das erste Rohprodukt wurde aus heißem Wasser (180 ml) umkristallisiert. Ausbeute: 58.90 g (22 %) reines Isomer 1 (HPLC), Smp. 155-156 ºC, [α]¹&sup9; = +7.1º (c = 2.06, Methanol), [α]¹&sup9; = -2.7 º (c = 1.0, Aceton).
Das zweite Rohprodukt wurde dreimal aus heißem Wasser (147 ml, 140 ml und 100 ml) umkristallisiert, wobei 28.75 g (11 %) reines Isomer 2 (HPLC) erhalten wurden; Smp. 170-171 ºC, [α]²² = +24.2º (c = 2.0, Methanol), [α]²² = 6.5 (c = 0.8, Aceton).

BEISPIEL 3

Tablettenformulierung

Vorgehen: -- Mische KBBL, Zitronensäure, Pluronic F-68, Natriumlaurylsulfat, Laktose und Dicalciumphosphat. Passiere durch ein Nr. 60 Mesh-Sieb. Granuliere die passierte Mischung mit einer Alkohollösung, die Polyvinylpyrrolidon, Carbowax 1500 und 6000 enthält. Füge, wenn erforderlich, weiteren Alkohol hinzu, bis die pulverige Mischung eine pastöse Masse ist. Gib Maisstärke zu und setze das Mischen fort, bis einheitliche feuchte Körner entstanden sind. Passiere das feuchte gekörnte Material durch ein Sieb Nr. 10 und trockne in einem Ofen 12 bis 14 Stunden lang bei 100 ºC. Siebe das getrocknete gekörnte Material durch ein Sieb Nr. 16, füge Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat hinzu, durchmische und presse in einer Tablettiermaschine zur Darreichungsform.

BEISPIEL 4

Kapselformulierung

Vorgehen: -- Mische KCBL, Zitronensaure, Pluronic F-68, Natriumlaurylsulfat und Laktose. Passiere durch ein Sieb Nr. 80. Füge das Magnesiumstearat zu, mische und schließe das Material in einer zweigeteilten Gelatinekapsel passender Größe ein.

BEISPIEL 5

Parenterale Formulierung

Vorgehen: -- Löse die Parabene in etwa 8.5 ml Wasser bei 60 bis 70 ºC. Kühle die Lösung auf 40 ºC und gib Benzylalkohol zu. Kühle die resultierende Lösung auf Raumtemperatur und füge KCBL zu. Überführe die Suspension in ein steriles Behältnis. Fülle geeignet große Ampullen, verschließe locker und autoklaviere eine halbe Stunde lang bei 110 ºC (15 psig). Jeder Milliliter dieser Formulierung liefert 20 mg aktive Verbindung.

Claims

1. Verbindung der Formel I

worin R¹= Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder eine (C&sub1;-C&sub4;)-Halogenalkylgruppe ist, unter der Voraussetzung, daß R¹ weder am α- noch am β- Kohlenstoffatom sein kann und daß die gepunktete Linie die CH&sub2;-Einheiten darstellt, die notwendig sind, um den alicyclischen Ring auf 4 bis 7 Kohlenstoffatome zu vervollständigen und der Ascorbinsäurerest entweder D- oder L- Struktur hat.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin das alicyclische Keton 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin die (C&sub1;-C&sub4;)-Halogenalkylgruppe eine (C&sub1;-C&sub4;)-Fluoralkylgruppe ist.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche bis 3, worin die Ascorbinsäure L-Ascorbinsäure ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch geeigneten Träger zusammen mit einer Verbindung nach Anspruch 1 enthält

oder zusammen mit einer Verbindung der Formel II

worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeutet und der Ascorbinsäurerest entweder D- oder L- Struktur hat.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das alicyclische Keton 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält.

7. Zusammensetzung nach einem oder beiden der Ansprüche 5 bis 6, worin die Ascorbinsäure L-Ascorbinsäure ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin R 1 oder 2 Kohlenstoffatome enthält.