DE60219926T2

DE60219926T2 - Wirkstoff zur entfernung einer unerwünschten proteinpopulation aus dem plasma

Info

Publication number: DE60219926T2
Application number: DE60219926T
Authority: DE
Inventors: Mark B. Pepys
Original assignee: Pentraxin Therapeutics Ltd
Current assignee: Pentraxin Therapeutics Ltd
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2002-07-29
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2022-07-30
Also published as: US7691897B2; EP1418905B1; US20100173969A1; ES2284895T3; DK1418905T3; ATE361068T1; JP2005501071A; JP4472333B2; EP1418905A1; US8173694B2; US20060122124A1; DE60219926D1; WO2003013508A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Wirkstoff zur Abreicherung einer unerwünschten Proteinpopulation aus dem Plasma einer Person und auf ein Verfahren zur Behandlung einer Person mit einem solchen Wirkstoff.
Hintergrund der Erfindung
Proteine im Blutplasma, in der extrazellulären Matrix der Gewebe und in Zellen sind für alle lebensnotwendigen physiologischen Funktionen wesentlich. Viele verschiedene Proteine tragen allerdings auch zu Erkrankungen bei. Die zugrundeliegenden pathogenen Mechanismen umfassen die Überproduktion von normalen Proteinen mit entsprechenden übermäßigen Wirkungen, die Produktion abnormer Proteine mit schädlichen Wirkungen und die zufällige Subversion einer normalen Proteinfunktion, die schädliche Effekte während nebenherlaufender pathologischer Prozesse, wie z.B. einer Entzündung und einer mikrobiellen Infektion, zur Folge hat. Es besteht daher ein Bedarf an einer Entfernung einer Vielzahl normaler oder abnormer Proteine aus dem Körper, um eine Behandlung für zahlreiche Erkrankungen des Menschen bereitzustellen. Plasmaproteine, die zur Entstehung einer Krankheit beitragen, umfassen Zytokine, Lipoproteine, Autoantikörper, Komponenten der Komplement- und Gerinnungswege, amyloidogene Proteine, einschließlich monoklonaler Immunglobulin-Leichtketten, Transthyretin, Lysozym und β₂-Mikroglobulin, Akutphasenproteine, insbesondere Serum-Amyloid-A-Protein (SAA) und Pentraxine, wie z.B. die Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP). All diese verschiedenen Proteine, die von unterschiedlichen Zellen produziert werden, sind bei verschiedenen Erkrankungen potentiell attraktive Ziele für eine therapeutische Eliminierung. Es gibt jedoch wenige effektive Verfahren zur selektiven Absenkung der zirkulierenden Konzentration spezifischer Proteine, und die Ansätze, die verfügbar sind oder versucht wurden, sind kompliziert und schwierig und bereiten viele extrem herausfordernde Probleme.
Zytokine sind Proteinhormone, die von einer Vielzahl verschiedener Zelltypen produziert werden und auf diese einwirken, und sind äußerst wichtige Vermittler einer Wirtsverteidigung und immunologischer und entzündlicher Reaktionen, ihre Überproduktion bei einigen Krankheiten trägt jedoch zu einem ernsten pathologischen Befund, zu Morbidität und Mortalität bei. Antikörper und rekombinante Bindungsproteine wurden in letzter Zeit erfolgreich zum Abzielen auf ein bestimmtes Zytokin, den Tumornekrosefaktor (TNF), verwendet, und die TNF-Blockade ist bei rheumatischer Arthritis und Morbus Crohn therapeutisch günstig, es gibt jedoch wenige effektive Verfahren zur Verringerung schädlich hoher Spiegel anderer Zytokine.
Eine krankheitsauslösende Überproduktion anderer normaler Proteine, wie z.B. von Akutphasen-Plasmaproteinen, kann reduziert werden, indem die Aktivität einer zugrunde-liegenden primären Erkrankung unterdrückt wird, außer im Falle einer behandelbaren chronischen Infektion ist dies jedoch üblicherweise extrem schwierig zu erzielen. Für chronische idiopathische Entzündungskrankheiten, wie z.B. rheumatische Arthritis oder Morbus Crohn, oder für die meisten bösartigen Tumore gibt es kein Heilmittel. Die Behandlung dieser Krankheiten und Unterdrückung von deren Aktivität erfordert Therapien, die hochtoxische entzündungshemmende, zytotoxische und immununterdrückende Arzneimittel und häufig auch chirurgische Eingriffe und/oder Strahlentherapie einschließen.
Eine Produktion abnormer Proteine, egal ob diese ererbt oder als Komplikation einer anderen primären Erkrankung erworben wurde, ist ebenfalls extrem schwierig zu kontrollieren. Die abweichenden Transthyretin- und abweichenden Fibrinogenmoleküle, die für Formen einer angeborenen systemischen Amyloidose verantwortlich sind, können zum Beispiel nur durch eine Lebertransplantation aus dem Plasma entfernt werden. Bei vielen anderen Erbkrankheiten, die durch pathogene Proteinvarianten verursacht werden, ist eine solche Vorgehensweise nicht möglich. Eine erworbene Produktion abnormer und pathogener Proteine, wie bei monoklonalen Gammopathien, kann nur mit starken zytotoxischen Arznei-mitteln oder einer Knochenmarktransplantation behandelt werden. Diese Behandlungs-methoden ziehen eine allgemeine Morbidität und sogar Sterblichkeitsraten von bis zu 50% nach sich, ohne gleichbleibend erfolgreich zu sein.
Ein weiterer Ansatz bestand darin, schädliche Proteine durch extrakorporale Absorption zu entfernen, wobei Blut über mehr oder weniger selektive Festphasenmedien geleitet wird, um das Zielprotein zu entfernen. Bei familiärer Hypercholesterinämie kann dies bei der Entfernung der hohen Konzentrationen an proatherogenem Lipoprotein von geringer Dichte einen nützlichen Beitrag leisten. Ebenso wurde – bisher erfolglos – versucht, zwei verschiedene amyloidogene Proteine zu entfernen: β₂-Mikroglobulin bei Patienten mit chronischer Hämodialyse bei Nierenversagen im Endstadium und abweichendes Transthyretin bei Patienten mit familiärer Amyloidpolyneuropathie.
In Fällen, in denen bestimmte Proteine ihre pathogenen Wirkungen entwickeln, indem sie in vivo an spezifische Ligandenstrukturen binden, besteht ein möglicher Therapieansatz in der Entwicklung von Arzneimitteln zur Hemmung einer solchen Bindung. Der vorliegende Erfinder schlug beispielsweise eine solche Vorgehensweise bei der Behandlung von Amyloidose und der Alzheimer-Krankheit vor, wobei auf die pathogene Bindung der Serum-Amyloid-P-Komponente an Amyloidfibrillen abgezielt wird, und zwar durch Verabreichung von Molekülen von geringer Molekülmasse, die eine solche Bindung blockieren (1-5) ( US 6,126,918 ). Die spezifische Bindung einer SAP an bestimmte Liganden, die anionische Gruppen, einschließlich Carboxylate und Phosphate, enthalten, ist bekannt (6-10). Im Komplex von SAP mit Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP) gibt es ein dAMP-Molekül, und zwar an der kalziumabhängigen Bindungsstelle jedes Protomers im homopentameren SAP-Molekül (10). Infolge einer Basenstapelung, die von der Wasserstoff-bindung zwischen Paaren von dAMP-Molekülen abhängt, fügen sich Paare von SAP-Pentameren, die mit dAMP beladen sind, gegenüberliegend zusammen, um einen dekameren Protein-Ligand-Komplex zu bilden (10).
Die bekannten Liganden von SAP, die eine geringe Molekülmasse haben, wie z.B. Phosphoethanolamin und Methyl-4,6-O-(1-carboxyethyliden)-β-D-galactopyranosid (MOβDG), sind nur mit mäßiger Affinität etwa im Millimolarbereich gebunden. Dies ist schlecht verglichen mit den typischen nanomolaren Affinitäten der meisten Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen und weist darauf hin, dass derartige Verbindungen als Inhibitoren der pathogenen Bindung einer SAP an ihre Liganden in vivo wahrscheinlich nicht effektiv wären. Es besteht weiterhin ein Bedarf an der Bereitstellung eines wirksamen Verfahrens zur gezielten Abreicherung einer unerwünschten Plasmaproteinpopulation.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sorgt in einem ersten Aspekt demgemäß für die Verwendung eines Wirkstoffs zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer Person, die an einer von einem pathogenen Protein verursachten Störung leidet, durch therapeutische Abreicherung des pathogenen Proteins aus dem Plasma der Person, wobei die Behandlung das Verabreichen einer für die therapeutische Abreicherung ausreichenden Dosis des Wirkstoffs an die Person umfasst, wobei der Wirkstoff eine Mehrzahl von Liganden umfasst, die kovalent miteinander verknüpft sind, um in der Gegenwart der Proteine mit einer Mehrzahl davon einen Komplex zu bilden; wobei zumindest zwei der Liganden gleich oder unterschiedlich sind und durch an den Proteinen vorhandene Ligand-Bindungsstellen gebunden werden können; und wobei
das pathogene Protein eine Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP) und der Wirkstoff ein D-Prolin der Formel
ist, wobei R
ist,
die Gruppe
R¹ Wasserstoff oder Halogen;
X -(CH₂)_n-; -CH(R²)(CH₂)_n-; -CH₂O(CH₂)_n-; -CH₂NH-; Benzyl, -C(R²)=CH-; -CH₂CH(OH)-; oder Thiazol-2,5-diyl;
Y -S-S-; -(CH₂)_n-; -O-; -NH-; -N(R²)-; -CH=CH-; -NHC(O)NH-; -N(R²)C(O)N(R²)-; -N[CH₂O₆H₃(OCH₃)₂]-; -N(CH₂C₆H₅)-; -N(CH₂C₆H₅)C(O)N(CH₂C₆H₅)-; -N(Alkoxyalkyl)-; N(Cycloalkylmethyl)-; 2,6-Pyridyl; 2,5-Furanyl; 2,5-Thienyl; 1,2-Cyclohexyl;
1,3-Cyclohexyl; 1,4-Cyclohexyl;
1,2-Naphthyl; 1,4-Naphthyl; 1,5-Naphthyl; 1,6-Naphthyl; Biphenylen; oder 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen und 1,4-Phenylen, wobei die Phenylengruppen gegebenenfalls durch 1-4 Substituenten substituiert sind, die ausgewählt sind aus Halogen, niedrigerem Alkyl, niedrigerem Alkoxy, Hydroxy, Carboxy, -COO-niedrigeres-Alkyl, Nitrilo, 5-Tetrazol, (2-Carbonsäurepyrrolidin-1-yl)-2-oxo-ethoxy, N-Hydroxycarbamimidoyl, 5-Oxo[1,2,4]oxadiazolyl, 2-Oxo[1,2,3,5]oxathiadiazolyl, 5-Thioxo[1,2,4]oxadiazolyl und 5-tert-Butylsulfanyl-[1,2,4]oxadiazolyl;
X' -(CH₂)_n-; -(CH₂)_nCH(R²)-; -(CH₂)_nOCH₂-; -NHCH₂-; Benzyl, -CH=C(R²)-; -CH(OH)CH₂-; oder Thiazol-2,5-diyl;
R² niedrigeres Alkyl, niedrigeres Alkoxy oder Benzyl und
n 0-3 ist,
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder ein pharmazeutisch akzeptabler Mono- oder Diester davon.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Wirkstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung beim Abreichern des Zielproteins aus dem Blutkreislauf in vivo äußerst wirksam sind, indem sie eine rasche Beseitigung desselben bewirken. Die vorliegende Erfindung stellt Arzneimittelmoleküle bereit, die durch einzelne Zielproteine spezifisch gebunden werden und dann die normale, höchst empfindliche Fähigkeit des Körpers in Anspruch nehmen, autologe Proteine, die Veränderungen der Konformation oder des Aufbaus durchgemacht haben, zu erkennen und zu vernichten.
Die normale physiologische Funktion jedes Proteins hängt entscheidend von dessen passender Molekülkonformation und/oder dessen passendem Molekülaufbau ab, und der Körper besitzt mächtige Mechanismen zur Erkennung und Vernichtung von Proteinen, die beschädigt, aggregiert oder falsch gefaltet sind. Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, speziell auf einzelne Proteine abzuzielen und zu bewirken, dass diese von den körpereigenen physiologischen Mechanismen als solche erkannt werden, die eine sofortige Beseitigung und Zerstörung erfordern. Zur Erzielung dieses Effekts werden bei der Erfin dung vorteilhafterweise palindromische Mittel eingesetzt, welche die Proteine als Dimere oder Aggregate einer höheren Ordnung zusammenballen.
Die Affinität jeder einzelnen Wechselwirkung an der Ligand-Protein-Bindungsstelle muss nicht besonders hoch sein, vorausgesetzt, dass der Ligand für jedes Zielprotein spezifisch ist. Eine Dissoziationskonstante von bis zu 10 Millimolar würde möglicherweise genügen. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Dissoziationskonstante nicht mehr als 1 Millimolar, noch bevorzugter weniger als 100 Mikromolar, am meisten bevorzugt weniger als 10 Mikromolar beträgt. Die Affinität liegt vorzugsweise etwa im Mikromolarbereich oder ist höher. Eine mikromolare Affinität erwies sich im Falle einer SAP als ausreichend, obwohl die höchstmögliche Affinität eindeutig erwünscht ist.
Obwohl die Liganden durch eine kovalente Bindung direkt miteinander verknüpft sein können, sind die Liganden in den erfindungsgemäßen Wirkstoffen vorzugsweise durch einen Linker kovalent miteinander verknüpft. Dadurch wird ermöglicht, dass die Liganden ausreichend räumlich getrennt sind, wodurch eine Mehrzahl von Zielproteinen an den Wirkstoff gebunden werden kann, ohne dass ein Protein die Bindung des anderen Proteins oder der anderen Proteine behindern würde. Wenn der Wirkstoff zwei Liganden aufweist, ist der Linker typischerweise linear; eine bevorzugte allgemeine Struktur ist Ligand-Linker-Ligand. Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird dies passenderweise als „Palindrom" bezeichnet.
Im Falle einer SAP umfasst eine Klasse von Wirkstoffen die D-Proline der oben-stehend dargelegten Formel, und zwar vorzugsweise (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxohexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder einen pharmazeutisch akzeptablen Mono- oder Diester davon.
Der Wirkstoff kann zum Abreichern unerwünschter Proteinpopulationen aus dem Plasma menschlicher oder tierischer Probanden verwendet werden. Bei passenden Mol-verhältnisses zwischen Wirkstoff und Zielprotein vernetzt der Wirkstoff Paare von Protein-molekülen, um Komplexe hervorzubringen, die im Körper als abnorm erkannt und danach unverzüglich beseitigt und abgebaut werden. Dies führt zu einer beträchtlichen oder vollständigen Abreicherung des Zielproteins und verleiht therapeutischen Nutzen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können formuliert werden, die einen erfindungsgemäßen Wirkstoff umfassen, der gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger, ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch akzeptablen Träger einschließt. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form eines Pro-Pharmakons vorliegen, das den Wirkstoff oder ein Derivat davon umfasst, der bzw. das nur bei Umwandlung durch den Empfänger aktiv wird. Die genaue Beschaffenheit und die Mengen der Komponenten solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen können empirisch bestimmt werden und hängen teilweise vom Verabreichungsweg der Zusammensetzung ab. Verabreichungswege zu den Empfängern umfassen die orale, bukkale, sublinguale Verabreichung, jene durch Inhalation, die topische (einschließlich der ophthalmologischen), rektale, vaginale, nasale und parenterale (einschließlich der intravenösen, intraarteriellen, intramuskulären, subkutanen und intra-artikulären) Verabreichung. Zur einfachen Anwendung werden die Dosierungen gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise oral verabreicht, dies hängt jedoch vom tatsächlichen Arzneimittel und dessen biologischer Verfügbarkeit ab. Eine typische Dosis beträgt 50 bis 500 mg pro Tag, und zwar oral oder durch kontinuierliche intravenöse Infusion oder intermittierende subkutane Injektion, zum Bei spiel von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxohexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird nun rein beispielhaft detaillierter beschrieben, und zwar unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen, wobei:
1 die dreidimensionale Röntgenkristallstruktur einer SAP zeigt, die mit einem erfindungsgemäßen Wirkstoff komplexiert ist;
2A eine detaillierte Ansicht der 1 und 2B eine detaillierte alternative Darstellung eines Teils der 1 zeigt;
3 die in-vivo-Wirkung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs auf SAP bei Mäusen zeigt;
4 die Wirkung einer Infusion eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs auf Plasma-SAP-Werte bei Patienten mit systemischer Amyloidose zeigt;
5 die Wirkung des Wirkstoffs über sechs Stunden bei Anwendung einer ¹²³I-SAP-Szintigraphie zeigt;
6 die Wirkung des Wirkstoffs für bis zu 48 Stunden bei Anwendung einer ¹²³I-SAP-Szintigraphie zeigt;
7 die Plasmakonzentration des Wirkstoffs und dessen Wirkung auf SAP während einer intravenösen Infusion zeigt; und
8 die Wirkung einer subkutanen Injektion des Wirkstoffs bei Patienten mit systemischer Amyloidose zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
BEISPIELE
SERUM-AMYLOID-P-KOMPONENTE UND (R)-1-[6-(R)-2-CARBOXY-PYRROLIDIN-1-YL]-6-OXO-HEXANOYL]PYRROLIDIN-2-CARBONSÄURE
Ein Verfahren zum Screenen und Untersuchen von Hemmstoffen einer Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP), die in vitro an Amyloidfibrillen bindet, wurde in Zusammenarbeit mit F. Hoffmann-La Roche Ltd. entwickelt und verwendet, um ein geeignetes Leitmolekül für die Arzneimittelentwicklung zu identifizieren. Eine Bibliothek von Kandidatenverbindungen wurde dementsprechend gescreent. Das anschließende gemeinschaftliche medizinische Chemieprogramm führte zur Synthese einer Familie von Dicarbonsäure, Pyrrolidonring-enthaltenden Molekülen, wobei (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure die am besten untersuchte ist. Dieses Molekül und verwandte Verbindungen (EP-A-0915088) sind mäßig starke Hemmstoffe einer in-vitro-SAP-Bindung an Amyloidfibrillen, wobei die IC₅₀-Werte etwa 0,5-1,0 μM betragen. Diese sind jedoch allesamt stärkere Hemmstoffe als die ursprüngliche Leitverbindung, bei der es sich um 1-(3-Mercapto-2-methyl-1-oxopropyl)-D-prolin, das nur einen einzigen D-Prolinring und Carboxylat enthält, handelte.
SAP ist ein Pentamer mit 5 identischen, nicht kovalent verbundenen Protomeren, wobei jedes eine einzige kalziumabhängige Ligand-Bindungsstelle an einer ebenen Fläche, der Bindungs(B)-Fläche, des Moleküls trägt (9). Bei Fehlen von Kalzium bildet eine menschliche SAP wahrscheinlich über Interaktionen von A-Fläche zu A-Fläche stabile dekamere Dimere (11). Bei Vorhandensein von Kalzium verklumpt eine isolierte menschliche SAP rasch und setzt sich ab, und zwar infolge einer Molekülgitterbildung aufgrund der Bindung des freigelegten Carboxylats des Glu167-Rests an ein SAP-Molekül durch die kalziumabhängige Ligand-Bindungsstelle eines anderen SAP-Moleküls (12, 13). Diese Autoaggregation einer SAP wird durch andere Liganden, an welche die SAP bindet, gehemmt, und alle vorhandenen Hemmstoffe einer SAP-Bindung an Amyloidfibrillen waren diesbezüglich aktiv. Wir zeigen hier jedoch, dass die größere Wir kungsstärke von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxohexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure und verwandten Verbindungen als Hemmstoffe einer in-vitro-SAP-Bindung an Amyloidfibrillen aus deren Fähigkeit resultiert, Paare von SAP-Molekülen zu vernetzen. Die palindromische Struktur von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure ermöglicht nicht nur, dass diese die Ligand-Bindungsstellen an einzelnen SAP-Protomeren blockiert, sondern konnte auch Paare von pentameren SAP-Molekülen vernetzen, um dekamere Dimere mit B-Fläche an B-Fläche zu bilden. Eine Gelfiltrationsanalyse von Mischungen aus isolierter SAP mit (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure, und zwar in Verhältnissen, die zwischen äquimolar und einem 100-fachen molaren Überschuss des Arzneimittels (Molekülmasse 340 Da) gegenüber den SAP-Protomeren (25.462 Da) liegen, zeigt, dass die gesamte SAP dekamer ist (Tabelle 1). Bei einem 128-fachen oder größeren molaren Überschuss des Arzneimittels eluiert die gesamte SAP jedoch in einem Volumen, das ihrer einfachen pentameren Form entspricht, da jede Bindungsstelle dann von einem anderen einzelnen (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäuremolekül eingenommen wird, wodurch eine Vernetzung und Dimerisation verhindert wird. Tabelle 1. Molekülaufbau einer isolierten reinen SAP in Gegenwart von (R)-1-16-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxohexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure in vitro
C-reaktives Protein (CRP) ist ein Pentraxin, das mit SAP nahe verwandt ist. Proben einer isolierten reinen menschlichen SAP oder von CRP wurden mit (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure in den gezeigten Molverhältnissen bezüglich des Pentraxinprotomers in Trisgepufferter Salzlösung mit physiologischer Innenstärke und einem pH-Wert von 8,0 vermischt und durch eine Größenausschlusschromatographie genau analysiert, wie zuvor beschrieben wurde (14). Die Mischungen und die Säuleneluenten enthielten entweder keine Kalziumionen oder 2 mM Kalzium sowie die Arzneimittelkonzentrationen, die zum Bewahren der obenstehend angegebenen Molverhältnisse ausreichend waren. Bei Fehlen eines spezifischen Liganden, an den sie binden kann, ist eine gereinigte menschliche SAP in Gegenwart von Kalzium unlöslich und eluiert als Aggregate von hoher Molekülmasse im Hohlraumvolumen der Säule (14). Bei Fehlen von Kalzium und eines Liganden bildet eine isolierte SAP alleine jedoch stabile Dekamere und liefert dabei einen ausgezeichneten Marker für das Elutions-volumen dieses Molekülaufbaus (14). Menschliches CRP ist entweder bei Vorhandensein oder Fehlen von Kalzium ein stabiles Pentamer und liefert somit einen robusten Marker für die Elutionsposition dieser Molekülform (14).
Das Molekülmodell zweier nativer pentamerer SAP-Moleküle, die durch die dazwischenliegende Bindung des palindromischen (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäuremoleküls vernetzt sind, wird durch die drei-dimensionale Röntgenkristallstruktur des Komplexes einer SAP mit dem Arzneimittel bei Vorhandensein von Kalzium bestätigt, wie in den nachstehenden repräsentativen Ansichten gezeigt wird (1 & 2). Diese Erkenntnisse stimmen mit den veröffentlichten Beobachtungen hinsichtlich des SAP-dAMP-Komplexes (10) und der chromatografischen Analyse überein (Tabelle 1).
Experimentelle in-vivo-Untersuchungen der (R)-1-(6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure
In-vivo-Untersuchungen von 1-(3-Mercapto-2-methyl-1-oxopropyl)-D-prolin, der ursprünglichen Leitverbindung, zeigen, dass diese sowohl die Bindung von SAP an experimentell induzierte Amyloidablagerungen in Mäusen hemmt als auch eine SAP, die bereits in den Ablagerungen gebunden ist, dissoziiert. Untersuchungen an (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure bestätigten, dass diese in dieser Hinsicht aktiver als 1-(3-Mercapto-2-methyl-1-oxopropyl)-D-prolin ist. Anfangs wurde angenommen, dass die Wirkungsstärke von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure in vivo mit deren niedrigerem IC₅₀-Wert in vitro übereinstimmt. Der dekamere Aufbau von pentameren SAP-Molekülen, der durch die Vernetzungsfähigkeit des palidromischen Arzneimittels hervorgerufen wird, ist jedoch eine abnorme Molekülkonfiguration, die erfindungsgemäß in vivo erkannt und unverzüglich aus dem Blutkreislauf besei tigt wird. Diese Wirkung des Arzneimittels, die zu einer massiven Abreicherung von SAP aus dem Plasma führt, leistet einen entscheidenden Beitrag zur Entfernung von SAP aus den Amyloidablagerungen, da die SAP in Amyloid vom Plasma-SAP-Pool abgeleitet und mit diesem im Gleichgewicht ist.
(R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure wurde bei Mäusen nicht umgesetzt und sehr rasch ausgeschieden, und zwar vorwiegend im Urin und in geringer Menge in der Gallenflüssigkeit. Jedoch hemmte sogar eine inter-mittierende intraperitoneale oder subkutane Injektion von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure die Aufnahme eines radio-markierten menschlichen SAP-Tracers in experimentell induzierte Maus-AA-Amyloid-ablagerungen. Wenn (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure durch eine 5-tägige kontinuierliche Infusion über eine Dauer-Osmosepumpe verabreicht wurde, dissoziierte sie sowohl den radiomarkierten menschlichen SAP-Tracer, mit dem die Amyloidablagerungen zuvor beladen wurden, als auch die gesamte endogene Maus-SAP in den Ablagerungen (3). Auch 50 μg/kg/Tag (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure lösten eine menschliche SAP in erheblichem Maße aus den (nicht dargestellten) Ablagerungen, 1,5 mg/kg/Tag waren jedoch erforderlich, um jedwede endogene Maus-SAP in erheblichem Maße abzutrennen, und bei bis zu 15 mg/kg/Tag bestand eine deutliche Dosis-Effekt-Wirkung, welche die gesamte Maus-SAP entfernte (3). Eine einzige intraperitoneale Injektion von 5 mg (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure beschleunigte die Plasmaclearance eines radiomarkierten menschlichen SAP-Tracers bei normalen Mäusen, hatte jedoch keine wesentliche Auswirkung auf die Clearance einer radiomarkierten Maus-SAP (3). Wenn jedoch eine radiomarkierte Maus-SAP oder menschliche SAP vor der intravenösen Injektion in normale Mäuse mit (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure in vitro präinkubiert wurde, wurden beide Tracer äußerst rasch beseitigt (3). Der SAP-(R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäurekomplex wird in vivo offenbar als abnorm erkannt und rasch aus dem Blutkreislauf entfernt, wird jedoch bei Maus-SAP verglichen mit menschlicher SAP in vivo offensichtlich weniger effizient gebildet und/oder beseitigt. Trotz einer sehr eingeschränkten oralen biologischen Verfügbarkeit wurde bei Verabreichung von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure im Trinkwasser an transgene Mäuse mit menschlicher SAP, die mittlere Plasmawerte von etwa 80 mg/l menschlicher SAP haben, deren zirkulierende menschliche SAP bemerkenswerterweise rasch abgereichert (3). Die transgenen Tiere mit menschlicher SAP haben keine zirkulierende Maus-SAP, jedoch bewirkten weder eine orale Verabreichung noch eine intermittierende Injektion oder kontinuierliche Infusion von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure an normale Wildtypmäuse eine Abreicherung von deren zirkulierender SAP.
Klinische Untersuchungen von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure bei menschlicher Amyloidose
(R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure wurde 48 h lang durch intravenöse Infusion an 8 Patienten mit systemischer Amyloidose (7 mit AL und einer mit dem AA-Typ) verabreicht, wobei ein Patient eine schwache lokalisierte AL-Amyloidose hatte und ein Patient Träger der amyloidogenen Ala60-Transthyretin-Variante war, jedoch keine klinische Amyloidose aufwies. Bei allen Per sonen kam es zu einer drastischen, raschen und bleibenden Abreicherung der zirkulierenden SAP. In anfänglichen Untersuchungen mit einer langsamen kontinuierlichen Infusion begann die SAP-Konzentration zu fallen, wenn etwa 2 mg (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure verabreicht wurden, und in anschließenden Untersuchungen wurde diese Menge daher am Beginn als Bolus injiziert, gefolgt von einer Infusion in den dargestellten Geschwindigkeiten (4). Bei einer Infusionsgeschwindigkeit von 0,1 mg/kg/Tag war die SAP-Abreicherung langsamer und weniger vollständig, bei 0,25 mg/kg/Tag und allen höheren Geschwindigkeiten bis zu einem Maximum von 6 mg/kg/Tag war die SAP jedoch am Ende der Infusion beinahe vollständig aus dem Plasma beseitigt, und zwar ungeachtet der Amyloidbelastung (4). Nachdem die Arzneimittelinfusion beendet war, kehrte die Plasma-SAP-Konzentration bei Individuen mit wenig oder ohne Amyloid jedoch rasch wieder zum Normalwert zurück, wohingegen diese Wiederherstellung bei Personen mit erheblicher Amyloidose deutlich verzögert war. Bei dem einen Patienten mit sehr schwerer Amyloidbelastung blieb die Plasma-SAP-Konzentration 20 Tage nach der Infusion bei unter 25% ihres Anfangswerts. Der Großteil der täglichen SAP-Produktion, die etwa 50-100 mg pro Tag beträgt (15), wurde offenbar vor dem Verfügbarwerden zur Übersättigung des Plasmapools in den Amyloidablagerungen verteilt. Dies ist ein sehr starker indirekter Beweis, dass sogar eine derart kurze Infusion von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure die Amyloid-assoziierte SAP beträchtlich abgereichert hatte.
Ein direkter Beweis für die Abreicherung von SAP aus Amyloid in den Organen und für den Wirkmechanismus von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure wurde mittels einer quantitativen Ganzkörperszintigraphie erbracht, wobei ¹²³I-SAP als Tracer verwendet wurde.
Jeder Patient erhielt eine Standard-dosis von ¹²³I-SAP 24 Stunden vor Beginn der (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure-Infusion und wurde unmittelbar vor der Behandlung gescannt, um ein Bezugslinienbild und Werte für die Lokalisierung des Tracers zu den Amyloidablagerungen zu liefern. Danach wurden sie bis zum Ende der 48-stündigen Infusion in Intervallen gescannt. (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure bewirkte eine drastische Clearance des Tracers aus dem Plasma, die sowohl in den szintigrafischen Bildern als auch beim Zählen der Blutproben genau übereinstimmte, wobei die SAP-Abreicherung durch einen Immunoassay des Serums überwacht wurde. 6 Stunden nach Beginn der Behandlung – und danach andauernd – verschwand das Blutpoolsignal nahezu (5, 6), und in der Leber kam es zu einer auffälligen Ansammlung des Tracers, wodurch dieses Organ als jene Stelle identifiziert wurde, an der (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure eine Clearance der zirkulierenden SAP bewirkte. Gleichzeitig kam es zu einer deutlichen Abnahme der Retention von Tracer in Amyloidablagerungen an anderer Stelle, wie durch die Milz und die Nieren verdeutlicht wurde, und zwar im Gegensatz zur üblichen Situation beim Überwachen von unbehandelten Amyloidosepatienten (Tabelle 2; 6). Tabelle 2. (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure befördert zirkulierende SAP rasch zur Leber und reichert SAP aus viszeralen Amyloidablagerungen ab
Alle Patienten hatten systemische AL-Amyloidose und erhielten zum Zeitpunkt Null eine intravenöse Standard-Tracerdosis von ¹²³I-SAP. Nach einer quantitativen szintigrafischen Ganzkörperabbildung, die nach 24 h erfolgte, wurde die Aufnahme in Leber und Milz bei jedem Individuum als 100%ig angenommen. Dann wurde eine intravenöse Infusion des Arzneimittels (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure begonnen und nach 48 h wurde die Szintigraphie mit Organzählung wiederholt. Die Kontrollen erhielten keine Behandlung. Die Bedeutung der Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurde durch einen t-Test ermittelt.
Zuvor wurde bei Mäusen nachgewiesen, dass die Leber und speziell die Leberzelle die einzige bedeutende in-vivo-Clearance- und Abbaustelle sowohl von Maus-SAP als auch von menschlicher SAP ist (16). Weiters wird beim Menschen asialomenschliche SAP sofort durch die Leber beseitigt, und zwar über den Leberzellen-Asialoglykoprotein-Rezeptor, und dieser Vorgang wurde mittels ¹²³I-asialo-SAP abgebildet (17). (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure löst offenbar in vivo eine ähnlich rasche hepatische Aufnahme von SAP aus, was zu einer nahezu vollständigen Abreicherung von zirkulierender SAP führt. Dies fördert die Neuverteilung von SAP aus den Geweben in das Plasma und er gänzt die Wirkung von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure als konkurrierendem Hemmstoff einer SAP-Bindung an Amyloidfibrillen, was somit eine höchst effiziente Entfernung von SAP aus Amyloidablagerungen zur Folge hat.
Die Wirkungsstärke von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure beim Abreichern von zirkulierender SAP war bemerkenswert, wobei die SAP-Werte fielen, wenn das Konzentrationsverhältnis von Arzneimittel zu SAP-Pentamer im Plasma sich dem äquimolaren Bereich annäherte (7). In-vitro-Gelfiltrationsuntersuchungen zeigten, dass sogar diese sehr geringe Arzneimittel-konzentration ausreicht, um einige SAP-Dimere zu erzeugen (Tabelle 3), das heißt, Paare von pentameren SAP-Molekülen, die durch (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäuremoleküle vernetzt sind, um die dekamere Gruppe zu bilden, die in der Kristallstruktur zu sehen ist (1, 2). Dies ist offensichtlich jene Spezies, die als abnorm erkannt und unverzüglich durch die Leber beseitigt wird. Tabelle 3. Molekülaufbau von SAP in menschlichem Vollserum in Gegenwart von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure in vitro
Aliquote eines einzelnen Pools von normalem menschlichem Vollserum, das SAP und CRP enthielt, wurden mit (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure in den gezeigten Molverhältnissen bezüglich des Pentraxin-protomers vermischt und durch eine Größenausschlusschromatographie genau analysiert, wie zuvor beschrieben wurde (14). Die Mischungen und die Säuleneluenten enthielten entweder keine Kalziumionen oder 2 mM Kalzium sowie die Arzneimittelkonzentrationen, die zum Bewahren der obenstehend angegebenen Molverhältnisse ausreichend waren. SAP in Vollserum ist eine stabile lösliche pentamere Ansammlung von Protomeren, die durch das Vorhandensein der normalen hohen Konzentration an Serumalbumin stabilisiert wird. Da SAP jedoch während einer Gelfiltration mit einem kalziumhaltigen Elutionsmittel von Serumalbumin getrennt wird, erfährt die SAP eine Autoaggregation und eluiert vollständig als Polymere von hoher Molekülmasse im Hohlraumvolumen der Säule. Dies liegt daran, dass isolierte menschliche SAP bei Fehlen eines spezifischen Liganden, an den sie binden kann, in Gegenwart von Kalzium unlöslich ist (14). Bei Fehlen von Kalzium, wenn keine Ligandenbindung oder Autoaggregation stattfinden kann, bildet SAP jedoch stabile Dekamere und liefert dabei einen ausgezeichneten Marker für das Elutionsvolumen dieses Molekülaufbaus (14). Menschliches CRP ist entweder bei Vorhandensein oder Fehlen von Kalzium ein stabiles Pentamer und liefert somit einen robusten Marker für die Elutions-position dieser Molekülform (14). Sogar bei einer äquimolaren Konzentration des Arzneimittels wurde etwas von der SAP als stabile Arzneimittel-Dekamer-Komplexe solubilisiert, und bei einem 100-fachen molaren Überschuss an Arzneimittel lag die gesamte SAP in dieser Form vor.
Die Wirkungsstärke von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass eine subkutane Injektion von gerade 0,25 mg/kg/Tag, die 12-stündlich in getrennten Dosierungen verabreicht wurde, dieselbe Wirkung auf Plasma-SAP hatte (8) wie eine intravenöse Infusion des Arzneimittels.
Schlussfolgerung
(R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure zielt durch die spezifische Ligandenbindungsfähigkeit von SAP in vivo speziell auf SAP ab, bewirkt jedoch infolge der palindromischen Struktur des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich eine Verklumpung von nativen pentameren SAP-Molekülen zu dekameren Arzneimittel-SAP-Komplexen, die dann unverzüglich durch die Leber beseitigt werden. Diese neuartige Wirkung war bei der Entwicklung von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure als Hemmstoff einer SAP-Bindung an Amyloidfibrillen nicht beabsichtigt und wurde weder gesucht noch erwartet. Sie repräsentiert ein gut dokumentiertes Beispiel der vorliegenden Erfindung und verstärkt dras tisch die Dissoziation von SAP von Amyloidablagerungen, was bei Amyloidose das therapeutische Ziel ist. Eine solche gezielte pharmakologische Abreicherung eines zirkulierenden Plasmaproteins stellt einen neuartigen, zuvor unbeschriebenen Mechanismus einer Arzneimittelwirkung mit breiter Anwendbarkeit auf viele verschiedene Proteine und Erkrankungsprozesse dar.
Erklärungen zu den Figuren
1. Dreidimensionale Röntgenkristallstruktur einer SAP, die mit (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure einen Komplex bildet. Die Seitenansicht zeigt zwei pentamere scheibenartige SAP-Moleküle (9, 10) Kante an Kante, die durch fünf (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäuremoleküle vernetzt sind, wobei die terminalen D-Prolinreste eines jeden in der kalziumabhängigen Ligandenbindungstasche der aneinanderliegenden Protomeren liegen.
2. Dreidimensionale Röntgenkristallstruktur einer SAP, die mit (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure einen Komplex bildet. Detaillierte Ansichten zeigen zwei verschiedene Darstellungen der Ligandenbindungsreste in den kalziumabhängigen Ligandenbindungstaschen zweier aneinanderliegender Protomeren von verschiedenen SAP-Molekülen sowie die Elektronendichte und/oder die Molekül-struktur einer (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure, die zwischen diesen liegt.
3. In-vivo-Wirkungen von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure auf SAP bei Mäusen. Oberes Feld: Gruppen von 10 alters-, geschlechts- und gewichtsmäßig übereinstimmenden Mäusen mit experimentell induzierter reaktiver systemischer AA-Amyloidose wurde am Tag -1 eine einzige Belastungsdosis von ¹²⁵I-markierter menschlicher SAP verabreicht, und sie erhielten implantierte osmotische Minipumpen, welche die gezeigten Dosierungen von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure abgaben (in den Figuren der Einfachheit halber als „Desapin" bezeichnet). Die Clearance aus den Amyloidablagerungen, der Katabolismus und die Ausscheidung des menschlichen SAP-Tracers wurden durch eine Ganzkörper-zählung der Mäuse umfassend überwacht (links), und die Gesamtmenge an Maus-SAP in den amyloidotischen Organen wurde nach dem Töten der Tiere am Tag 5 bestimmt (rechts). Mittleres Feld, links: 4 Gruppen von jeweils 10 alters-, geschlechts- und gewichtsmäßig übereinstimmenden Mäusen mit experimentell induzierter reaktiver systemischer AA-Amyloidose erhielten zum Zeitpunkt Null eine intravenöse Injektion von ¹²⁵I-markierter reiner menschlicher oder Maus-SAP und es wurde ihnen dann nach 15 Minuten und zu den anderen gezeigten Zeitpunkten eine Blutprobe entnommen. Unmittelbar nach dem 15-minütigen Ausbluten erhielten zwei Gruppen, wobei die eine menschliche SAP und die andere Maus-SAP erhalten hatte, eine einzige intraperitoneale Injektion von 5 mg (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure (Desapin). Im Blutkreislauf verbleibender Tracer wird bei jeder Gruppe als der mittlere (Standard-abweichungs)-Prozentsatz der Menge zum 15-Minuten-Zeitpunkt ausgedrückt. Mittleres Feld, rechts: Gruppen von jeweils 10 alters-, geschlechts- und gewichtsmäßig übereinstimmenden Mäusen mit experimentell induzierter reaktiver systemischer AA-Amyloidose erhielten zum Zeitpunkt Null eine intravenöse Injektion von ¹²⁵I-markierter reiner menschlicher oder Maus-SAP und es wurde ihnen dann nach 15 Minuten und zu den anderen gezeigten Zeitpunkten Blut entnommen. Jeweils bei einem der Gruppenpaare, die Maus- bzw. menschliche SAP erhielten, war der Tracer mit (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure (Desapin) vermischt und vor der Injektion in die Tiere in vitro inkubiert worden. Im Blutkreislauf verbleibender Tracer wird bei jeder Gruppe als die mittlere (Standardabweichungs)-Gesamtradioaktivität pro Gramm Blut ausgedrückt. Unteres Feld: Auswirkung der Verabreichung von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure (Desapin) im Trinkwasser in den gezeigten Konzentrationen auf Werte der zirkulierenden menschlichen SAP bei transgenen Mäusen mit menschlicher SAP. Mäuse mit einem Körpergewicht von ungefähr 20 g verbrauchen pro Tag etwa 3 ml Wasser.
4. Auswirkung einer intravenösen Infusion von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure auf Plasma-SAP-Werte bei Patienten mit systemischer Amyloidose. Patienten mit verschiedenen Formen einer systemischen Amyloidose und mit variierenden Amyloidbelastungen erhielten die für einen Zeitraum von 48 h gezeigten Dosierungen des Arzneimittels. Die zirkulierenden SAP-Werte wurden in Proben, die während und nach der Infusion entnommen wurden, durch einen Elektro-immunoassay (18) zu den gezeigten Zeitpunkten gemessen. Jede Linie repräsentiert einen anderen individuellen Patienten.
5. Ganzkörper-¹²³I-SAP-Szintigraphie vor und 6 Stunden nach Beginn einer Infusion von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure. Dieser Patient mit einer mäßigen Belastung von AL-Amyloid in der Milz und in den Nieren wies vor der Verabreichung des Arzneimittels einen beträchtlichen Blutpoolhintergrund von Tracer im Herz und im Blutkreislauf auf. Nach 6 Stunden fehlt der Blutpoolhintergrund vollständig, und die Leber, welche die einzige Stelle eines in-vivo-Katabolismus von SAP ist (16, 17), hat den Tracer aufgenommen, während die Intensität eines SAP-Signals von der amyloidotischen Milz und den amyloidotischen Nieren erheblich reduziert ist (Organzahlen werden nicht gezeigt).
6. Ganzkörper-¹²³I-SAP-Szintigraphie vor und 24 bzw. 48 Stunden nach Beginn einer Infusion von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure. Dieser Patient mit einer mäßigen Belastung von AL-Amyloid in der Milz und in den Nieren wies vor der Verabreichung des Arzneimittels einen beträchtlichen Blutpoolhintergrund von Tracer im Herz und im Blutkreislauf auf. Nach 24 bzw. nach 48 Stunden fehlt der Blutpoolhintergrund vollständig, und die Leber, welche die einzige Stelle eines in-vivo-Katabolismus von SAP ist (16, 17), hat den Tracer aufgenommen und Abbauprodukte werden im Urin ausgeschieden, wie durch das Blasensignal gezeigt wird. Die Intensität eines SAP-Signals von der amyloidotischen Milz und den amyloidotischen Nieren ist erheblich reduziert: nach 24 h betragen die Milzzahlen 85% vom Zeitpunkt 0, die Nieren 77%, nach 48 h: Milz 54%, Nieren 50%.
7. Plasmakonzentration von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure und von SAP während einer 48-stündigen Infusion.
Zwei individuelle Patienten mit systemischer Amyloidose und mäßigen Amyloidbelastungen erhielten (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure (Desapin) durch eine intravenöse Infusion in den dargestellten konstanten Geschwindig-keiten. Die Konzentrationen der zirkulierenden SAP begannen beinahe unverzüglich zu fallen und hat ten sich halbiert, als die Arzneimittel- und SAP-Protomer-Konzentrationen äquimolar waren.
8. Auswirkung der Verabreichung von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure durch eine subkutane Injektion auf die Werte der zirkulierenden SAP und die viszerale Organretention von 123_I- SAP-Tracer.
Die gezeigten Dosierungen von (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure (Desapin) wurden durch subkutane Injektionen 12-stündlich an zwei individuelle Patienten mit systemischer Amyloidose und geringen bzw. mäßigen Amyloidbelastungen verabreicht. Das Verschwinden der zirkulierenden SAP war praktisch dasselbe wie bei einer intravenösen Infusion des Arzneimittels, und bei dem im rechten Feld dargestellten Patienten, der eine Tracer-Dosis von ¹²³I-SAP erhalten hatte, kam es zu einer Anhäufung von SAP in der Leber und zu einer beschleunigten Clearance aus der Milz.
LITERATURHINWEISE

1. Hind, C.R.K., Collins, P.M., Caspi, D., Baltz, M.L. and Pepys, M.B. (1984) Specific chemical dissociation of fibrillar and non-fibrillar components of amyloid deposits. Lancet, ü: 376-378.
2. Tennent, G.A., Lovat, L.B. and Pepys, M.B. (1995) Serum amyloid P component prevents proteolysis of the amyloid fibrils of Alzheimer's disease and systemic amyloidosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4299-4303.
3. Pepys, M.B., Tennent, G.A., Booth, D.R., Bellotti, V., Lovat, L.B., Tan, S.Y., Persey, M.R., Hutchinson, W.L., Booth, S.E., Madhoo, S., Soutar, A.K., Hawkins, P.N., Van Zyl-Smit, R., Campistol, J.M., Fraser, P.E., Radford, S.E., Robinson, C.V., Sunde, M., Serpell, L.C. and Blake, C.C.F. (1996) Molecular mechanisms of fibrillogenesis and the protective role of amyloid P component: two possible avenues for therapy. In: The nature and origin of amyloid fibrils, (Bock, G.R. and Goode, J.A., eds.), Wiley, Chichester (Ciba Foundation Symposium 199), pp. 73-89.
4. Pepys, M.B., Booth, D.R., Hutchinson, W.L., Gallimore, J.R., Collins, P.M. and Hohenester, E. (1997) Amyloid P component. A critical review. Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest., 4: 274-295.
5. Pepys, M.B. (1999) The Lumleian Lecture. C-reactive protein and amyloidosis: from proteins to drugs? In: Horizons in Medicine, Vol. 10 (Williams, G., eds.), Royal College of Physicians, London, pp. 397-414.
6. Pepys, M.B., Dash, A.C., Munn, E.A., Feinstein, A., Skinner, M., Cohen, A.S., Gewurz, H., Osmand, A.P. and Painter, R.H. (1977) Isolation of amyloid P component (protein AP) from normal serum as a calcium-dependent binding protein. Lancet, i: 1029-1031.
7. Pontet, M., Engler, R. and Jayle, M.F. (1978) One step preparation of both human C-reactive protein and Clt. Fed. Eur. Biol. Soc. Lett., 88: 172-178.
8. Hind, C.R.K., Collins, P.M., Renn, D., Cook, R.B., Caspi, D., Baltz, M.L. and Pepys, M.B. (1984) Binding specificity of serum amyloid P component for the pyruvate acetal of galactose. J. Exp. Med., 159: 1058-1069.
9. Emsley, J., White, H.E., O'Hara, B.P., Oliva, G.; Srinivasan, N., Tickle, I.J., Blundell, T.L., Pepys, M.B. and Wood, S.P. (1994) Structure of pentameric human serum amyloid P component. Nature, 367: 338-345.
10. Hohenester, E., Hutchinson, W.L., Pepys, M.B. and Wood, S.P. (1997) Crystal structure of a decarneric complex of human serum amyloid P component with bound dAMP. J. Mol. Biol., 269: 570-578.
11. Ashton, A.W., Boehm, M.K., Gallimore, J.R., Pepys, M.B. and Perkins, S.J. (1997) Pentameric and decameric structures in solution of serum amyloid P component by X-ray and neutron scattering and molecular modelling analyses. J. Mol. Biol., 272: 408-422.
12. Baltz, M.L., de Beer, F.C., Feinstein, A. and Pepys, M.B. (1982) Calcium-dependent aggregation of human serum amyloid P component. Biochim. Biophys. Acta, 701: 229-236.
13. Booth, D.R., Gallimore, J.R. Hutchinson, W.L., Hohenester, E., Thompson, D., Wood, S. and Pepys, M.B. (1999) Analysis of autoaggregation and ligand binding sites of serum amyloid P component by in vitro mutagenesis, In: Amyloid and Amyloidosis 1998, (Kyle, R.A. and Gertz, M.A., eds.), Parthenon Publishing, Pearl River, New York, pp. 23-25.
14. Hutchinson, W.L., Hohenester, E. and Pepys, M.B. (2000) Human serum amyloid P component is a single uncomplexed pentamer in whole serum. Mol. Med., 6: 482-493.
15. Hawkins, P.N., Wootton, R. and Pepys, M.B. (1990) Metabolic studies of radioiodinated serum amyloid P component in normal subjects and patients with systemic amyloidosis. J. Clin. Invest., 86: 1862-1869.
16. Hutchinson, W.L., Noble, G.E., Hawkins, P.N. and Pepys, M.B. (1994) The pentraxins, C-reactive protein and serum amyloid P component, are cleared and catabolized by hepatocytes in vivo, J. Clin. Invest., 94: 1390-1396.
17. Pepys, M.B., Rademacher, T.W., Amatayakul-Chantler, S., Williams, P., Noble, G.E., Hutchinson, W.L., Hawkins, P.N., Nelson, S.R., Gallimore, J.R., Herbert, J., Hutton, T. and Dwek, R.A. (1994) Human serum amyloid P component is an invariant constituent of amyloid deposits and has a uniquely homogeneous glycostructure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5602-5606.
18. Nelson, S.R., Tennent, G.A., Sethi, D., Gower, P.E., Ballardie, F.W., Amatayakul-Chantler, S. and Pepys, M.B. (1991) Serum amyloid P component in chronic renal failure and dialysis. Clin. Chtm. Acta, 200: 191-200.

Claims

Verwendung eines Wirkstoffs zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer Person, die an einer von einem pathogenen Protein verursachten Störung leidet, durch therapeutische Abreicherung des pathogenen Proteins aus dem Plasma der Person, wobei die Behandlung das Verabreichen einer für die therapeutische Abreicherung ausreichenden Dosis des Wirkstoffs an die Person umfasst, wobei der Wirkstoff eine Mehrzahl von Liganden umfasst, die kovalent miteinander verknüpft sind, um in der Gegenwart der Proteine mit einer Mehrzahl davon einen Komplex zu bilden; wobei zumindest zwei der Liganden gleich oder unterschiedlich sind und durch an den Proteinen vorhandene Ligand-Bindungsstellen gebunden werden können; und wobei das pathogene Protein eine Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP) und der Wirkstoff ein D-Prolin der Formel
ist, wobei R
ist, die Gruppe R¹ Wasserstoff oder Halogen; X -(CH₂)_n-; -CH(R²)(CH₂)_n-; -CH₂O(CH₂)_n-; -CH₂NH-; Benzyl, -C(R²)=CH-; -CH₂CH(OH)-; oder Thiazol-2,5-diyl; Y -S-S-; -(CH₂)_n-; -O-; -NH-; -N(R²)-; -CH=CH-; -NHC(O)NH-; -N(R²)C(O)N(R²)-; -N[CH₂C₆H₃(OCH₃)₂]-; -N(CH₂C₆H₅)-; -N(CH₂C₆H₅)C(O)N(CH₂C₆H₅)-; -N(Alkoxyalkyl)-; N(Cycloalkylmethyl)-; 2,6-Pyridyl; 2,5-Furanyl; 2,5-Thienyl; 1,2-Cyclohexyl; 1,3-Cyclohexyl; 1,4-Cyclohexyl; 1,2-Naphthyl; 1,4-Naphthyl; 1,5-Naphthyl; 1,6-Naphthyl; Biphenylen; oder 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen und 1,4-Phenylen, wobei die Phenylengruppen gegebenenfalls durch 1-4 Substituenten substituiert sind, die ausgewählt sind aus Halogen, niedrigerem Alkyl, niedrigerem Alkoxy, Hydroxy, Carboxy, -COO-niedrigeres-Alkyl, Nitrilo, 5-Tetrazol, (2-Carbonsäurepyrrolidin-1-yl)-2-oxo-ethoxy, N-Hydroxycarbamimidoyl, 5-Oxo[1,2,4]oxadiazolyl, 2-Oxo-[1,2,3,5]oxathiadiazolyl, 5-Thioxo[1,2,4]oxadiazolyl und 5-tert-Butylsulfanyl-[1,2,4]oxadiazolyl; X' -(CH₂)_n-; -(CH₂)_nCH(R²)-; -(CH₂)_nOCH₂-; -NHCH₂-; Benzyl, -CH=C(R²)-; -CH(OH)CH₂-; oder Thiazol-2,5-diyl; R² niedrigeres Alkyl, niedrigeres Alkoxy oder Benzyl und n 0-3 ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder ein pharmazeutisch akzeptabler Mono- oder Diester davon.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei jeder Ligand so ausgewählt wird, um durch das Protein mit einer Dissoziationskonstante, die nicht mehr als 1 Millimolar beträgt, gebunden zu werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das D-Prolin (R)-1-[6-(R)-2-Carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidin-2-carbonsäure oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder ein pharmazeutisch akzeptabler Mono- oder Diester davon ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Dosis im Bereich von 0,1 bis 6 mg/kg pro Person/Tag liegt.