DE69435088T2

DE69435088T2 - Therapeutische und diagnostische mittel für die amyloidosis

Info

Publication number: DE69435088T2
Application number: DE69435088T
Authority: DE
Inventors: Mark Brian Immuno Pepys; Thomas Lean Blundell
Original assignee: Pentraxin Therapeutics Ltd
Current assignee: Pentraxin Therapeutics Ltd
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2014-08-18
Also published as: EP0714405B1; US6126918A; EP0714405A1; GB9317120D0; AU7389894A; WO1995005394A1; DE69435088D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische und diagnostische Wirkstoffe für Amyloidose.
Amyloidose ist die abnormale Ablagerung von autologen Proteinen als unlösliche Fibrillen in Geweben. Es gibt viele verschiedene Formen, von denen jede mit einem unterschiedlichen Fibrillenprotein assoziiert ist. Obwohl eine mikroskopische Amyloidablagerung ständig in älteren Menschen vorhanden ist und selten klinische Probleme verursacht, ist eine stärkere Amyloidose, vor allem in den lebenswichtigen Organen mit fortschreitenden, nicht behandelbaren und üblicherweise tödlichen Krankheiten assoziiert. Die geläufigsten Krankheiten, die mit Amyloidose assoziiert sind, sind die Alzheimer'sche Krankheit und Alters-Diabetes mellitus. Andere Formen von erworbener und ererbter Amyloidose sind seltener, verursachen jedoch schwere Gesundheitsschäden und sind gewöhnlich tödlich.
Der Serum-Amyloid P-Bestandteil (SAP), ein normales humanes Plasmaprotein, ist ein allgemeiner Bestandteil von Amyloidablagerungen in allen Formen von Amyloidose, einschließlich des cerebralen Amyloids der Alzheimer'schen Krankheit [1] Cohen & Jones 1993 Current Opinion in Rheumatology 5:62, als ein Ergebnis seiner spezifischen kalzium-abhängigen Bindeaffinität für Amyloidfibrillen [2]. Die Rolle, wenn überhaupt, von SAP in der Pathogenese oder im Fortbestehen von Amyloid in vivo ist unbekannt, und Amyloidfibrillen können in vitro aus geeigneten Vorläuferproteinen in Abwesenheit von SAP hergestellt werden. Allerdings ist SAP in Amyloid identisch mit seiner normalen zirkulierenden Form, es wird nicht in den Ablagerungen katabolisiert im Gegensatz zu seiner normalen schnellen Aufnahme aus dem Kreislauf und Katabolismus in Hepatocyten, und es ist an sich hoch resistent gegenüber proteolytischer Degradation.
Der humane Serum-Amyloid P-Bestandteil ist ein decameres Plasma-Glykoprotein, zusammengesetzt aus identischen Untereinheiten, die nicht kovalent in zwei pentameren Ringen, die sich gegenüberliegend Wechselwirken, assoziiert sind. Obwohl SAP für die Amyloid-Fibrillogenese in vitro nicht benötigt wird, kann es die Fibrillen vor Degradation in vivo schützen. [3]. SAP ist außerdem der Haupt DNA- und Chromatin-bindende schließen Fibronectin, C4-bindendes Protein [6] und Glykosaminoglycane [7] ein; SAP ist ebenfalls ein normaler Gewebematrixbestandteil, assoziiert mit elastischen Fasern [8] und der Glomerulum-Basal-Membran [9]. Schließlich ist SAP ein kalzium-abhängiges Lektin, von dem der am besten charakterisierte Ligand das 4,6-zyklische Pyruvatacetal von β-D-Galactose (MOβDG) [10] ist.
Humanes SAP zeigt keine Polymorphismen oder Heterogenität seines Proteins oder seines Glykans [11] und bisher wurden keine individuellen Fehlerhaftigkeiten in SAP beschrieben, was nahe legt, dass das Molekül wichtige Funktionen hat. Darüber hinaus gehören SAP und das C-reaktive Protein (CRP), das klassische Akute-Phase-Protein mit dem es über 50% Sequenzidentität teilt, zu der Pentraxin-Familie von Plasmaproteinen, die im Verlauf der Vertebratenevolution stabil konserviert wurden [12, 13]. Die Struktur und Struktur-Funktions-Beziehungen von SAP sind daher von erheblich grundlegendem Interesse, zusätzlich zu ihrer klinischen Bedeutung, die sich aus der unschätzbaren neuen Information ergibt, bereitgestellt durch die Verwendung von radio-markiertem SAP als einem spezifischen quantitativen in vitro Tracer für Amyloidablagerungen [14]. Die Geschwindigkeit und Spezifität, mit der SAP aus dem Kreislauf Amyloidablagerungen lokalisiert und seine verlängerte Retention dort machen SAP zu einem interessanten Targeting-Wirkstoff. Allerdings war, wie oben angedeutet, die Rolle, wenn überhaupt eine von SAP in der Pathogenese und Beständigkeit von Amyloid in vivo trotz verschiedener Beobachtungen und Spekulationen nicht bekannt.
Die vorliegende Erfindung basiert auf unserer Demonstration, dass das Binden von SAP in vitro an Amyloidfibrillen, an einer spezifischen Bindestelle, diese Fibrillen vor proteolytischer Degradation in Anwesenheit von Proteinasen schützt. Die Ergebnisse, die aus der Amyloid-Entwicklung in vivo erhalten wurden, bestätigen die in vitro-Ergebnisse. Wir glauben daher, dass SAP zur Amyloidgenese benötigt wird, möglicherweise um neu gebildete Fibrillen vor Proteolyse zu schützen. Inhibierung oder Aufhebung der Bindung von SAP an die Fibrillen setzt diese Fibrillen der Zerstörung aus, zum Beispiel durch Makrophagen und/oder freigesetzten Proteinasen. Inhibierung oder Aufhebung der Bindung von SAP an Amyloidfibrillen (entweder neu synthetisierte Fibrillen oder etablierte Fibrillen) kann daher zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose, einschließlich Alzheimer'scher Krankheit verwendet werden.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, zum Testen eines Moleküls zur Verwendung in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose, welches das Inkontaktbringen des Moleküls in vitro mit dem Serum-Amyloid P-Bestandteil und beta-Amyloidfibrillen und Detektieren oder Bestimmen der Inhibierung der Bindung des Serum-Amyloid P-Bestandteils an die beta-Amyloidfibrillen durch das Molekül, umfasst, wobei eine Inhibierung der Bindung ein Molekül anzeigt, das geeignet ist zur Verwendung in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose.
Die Erfindung stellt ebenfalls bereit die Verwendung eines Moleküls, identifizierbar durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Amyloidose.
Die Inhibierung kann kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein, und kann reversibel oder irreversibel sein. Der Mechanismus der Inhibierung kann über direkte Inhibierung mit der Ligandenbindestelle von SAP oder allosterisch erfolgen. Ein Molekül, das die SAP-Bindung an Amyloidfibrillen inhibiert, kann als ein „SAP-Inhibitor" angesehen werden. Der Begriff „Inhibierung der Bindung von SAP an Amyloidfibrillen" wie hierin verwendet, schließt sowohl die Verhinderung einer solchen Bindung als auch die Aufhebung einer Bindung, die bereits stattgefunden hat, ein.
Jedwedes Verfahren zum Detektieren oder Bestimmen der Inhibierung der Bindung eines Moleküls an ein anderes Molekül kann verwendet werden, um ein Molekül zu identifizieren, das die Bindung von SAP an Amyloidfibrillen inhibiert; ein detailliertes Protokoll eines solchen Tests ist in Beispiel 1 gegeben. Weitere Tests schließen die Effekte auf die Inhibierung durch SAP auf den proteolytischen Verdau von Amyloidfibrillen ein, welche ex vivo erhalten wurden oder in vitro aus synthetischen Verbindungen hergestellt wurden, die dafür bekannt sind, solche Bindungen zu inhibieren, zum Beispiel MOβDG und Phosphoethanolamin (PE).
Ein Inhibitor der SAP-Bindung kann zu jeder Klasse von Chemikalien gehören, vorausgesetzt er erreicht den erwünschten Effekt. Zum Beispiel kann ein Inhibitor ein Polypeptid oder Peptid, ein Oligonukleotid, ein Oligosaccharid, oder ein beliebiger Typ von organischen Chemikalien sein. Selbst kleine Moleküle können effektiv sein, vgl. Phosphoethanolamin. Ein Inhibitor der SAP-Bindung kann eine natürlich vorkommende Substanz sein oder aus einer solchen Substanz erhalten werden. Ein Inhibitor kann de novo synthetisiert werden, zum Beispiel durch kombinatorische Chemie oder über molekulares Modelling entworfen werden.
Die vorliegende Erfindung schließt daher ein, das Testen neuer Moleküle auf ihre Inhibierung der Bindung von SAP an Amyloidfibrillen, einschließlich zum Beispiel solcher Moleküle, die durch molekulares Modelling und Synthese erhalten werden, und solcher, die durch kombinatorische Chemie erhalten werden.
Die Erfindung schließt ebenfalls ein die Verwendung von Substanzen, die per se bekannt sind, zum Beispiel für andere Zwecke, in der Prävention, Aufhebung oder Inhibierung der Bindung von SAP an Amyloidfibrillen, und daher in der Behandlung von Amyloidose, insbesondere der Alzheimer'schen Krankheit und Alters-Diabetes mellitus. Die Erfindung stellt weiter bereit, die Verwendung eines Moleküls, das gemäß der vorliegenden Erfindung als ein Inhibitor der SAP-Bindung identifiziert wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention, Aufhebung oder Inhibierung der Bindung von SAP an Amyloidfibrillen und daher für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Amyloidose, insbesondere der Alzheimer'schen Krankheit und Alters-Diabetes mellitus.
Zur Verwendung in der Behandlung oder Diagnose in vivo, muss ein Inhibitormolekül gemäß der vorliegenden Erfindung physiologisch tolerierbar sein. Ein Molekül, das nicht physiologisch tolerierbar ist kann in in vitro-Untersuchungen von Amyloidose und ihrer Behandlung verwendet werden.
Es wird geschätzt werden, dass ein Kandidatenmolekül durch ein Verfahren synthetisiert wird, das für diesen Typ von Molekül geeignet ist, zum Beispiel wird eine organischchemische Verbindung chemisch synthetisiert weden; ein Protein oder Peptid kann über Synthese aus Aminosäuren oder über rekombinante DNA-Technologie erhalten werden.
Wie oben kurz beschrieben, haben wir nun überzeugend dargestellt, dass SAP in der Tat Amyloidfibrillen vor der Verdauung durch Proteinasen schützt und dieses exklusiv durch Binden an diese bewerkstelligt, eher als durch Wirken wie ein Enzyminhibitor. Wir haben ebenfalls gezeigt, dass SAP an die MOβDG-Bindestelle an Amyloidfibrillen bindet.
Amyloidfibrillen des Typs AA (reaktiv systemisch), AL (monoklonale IgG leichte Kette) und apoAI (Apoprotein AI) wurden aus den Organen von Patienten isoliert, die an Amyloidose gestorben sind und von diesen wurde gezeigt, dass sie während einer Inkubation bei 37°C in vitro mit den proteolytischen Enzymen, zum Beispiel Pronase, Trypsin und Chymotrypsin, verdaut wurden. Die Verdauung wurde überwacht durch Analyse der Inkubationsgemische in reduzierter SDS-PAGE und ebenfalls über Freisetzung von Trichloressigsäure (TCA)-löslicher Radioaktivität, wenn die Fibrillen oxidativ mit ¹²⁵I markiert worden waren. Die Inkubation solcher markierter Fibrillen mit kultivierten aus Monocyten stammenden Makrophagen führte ebenfalls zur Verdauung.
In allen Fällen resultierte die Zugabe von hochaufgereinigtem SAP zu den Inkubationsgemischen, unter Bedingungen, bei denen das SAP an die Fibrillen binden konnte, in stark reduzierter Fibrillenverdauung. Diese Inhibierung war dosis- und zeitabhängig und wurde nicht beobachtet, wenn andere Proteine, das C-reaktive Protein (CRP) und humanes Serumalbumin als Kontrollen, anstelle des SAP, zugegeben wurden. CRP ist eine speziell gute Kontrolle, da seine Struktur extrem ähnlich zu der des SAP ist, und es dieselbe beachtliche Proteinaseresistenz teilt, allerdings bindet es nicht an Amyloidfibrillen und hatte keinen Effekt auf ihre Verdauung. Wenn Albumin als Kontrollprotein verwendet wurde, wurde sowohl es selbst als auch die Fibrillen vollständig durch die Proteinasen verdaut.
Allerdings fanden wir, dass der protektive Effekt von SAP vollständig aufgehoben war, wenn MOβDG in den Inkubationsgemischen enthalten war. Dieser spezifische Ligand von SAP mit geringem Molekulargewicht, inhibiert kompetitiv die Bindung von SAP an Amyloidfibrillen, wie wir zuvor berichtet haben [3, 10]. Die Anwesenheit von SAP in den Inkubationsgemischen hatte daher keinen Effekt auf die Proteolyse der Fibrillen, wenn es an der Bindung an diese durch die Anwesenheit von MOβDG gehindert war.
Da SAP an alle Typen von Amyloidfibrillen in vivo bindet, schlussfolgern wir, dass es wahrscheinlich ist, dass SAP die Fibrillen davor schützt, in vivo durch Zellen, wie beispielsweise Makrophagen und/oder freigesetzte Proteinasen degradiert zu werden. Wirkstoffe, die in der Lage sind, die Bindung von SAP an Amyloidfibrillen in vivo zu inhibieren oder revertieren werden daher die Verdauung und Entfernen der Fibrillen begünstigen und beschleunigen, was zu einer Beseitigung von Amyloidablagerungen und Remission ihrer klinischen und pathologischen Effekte führt.
Wir haben nun ebenfalls dargelegt, dass SAP eine typische kalzium-abhängige Bindung an Amyloidfibrillen, die in vitro aus synthetischen β-Proteinen hergestellt wurden, eingeht. β-Protein ist die Untereinheit der Amyloidfibrillen, die in der Alzheimer'schen Krankheit (AD) im Gehirn und cerebralen Blutgefäßen abgelagert sind. Der Beweis, der β-Protein-Amyloidose im Gehirn mit der Pathogenese von AD verbindet, ist derzeit sehr stark [54]. Wir haben nun gezeigt, dass SAP die β-Protein-Amyloidfibrillen in genau derselben Art vor der Proteolyse schützt, wie es die ex vivo-Fibrillen schützte, und dass der Schutz vollständig durch MOβDG aufgehoben war. Darüber hinaus wurden genau dieselben Ergebnisse erhalten, unter Verwendung von ex vivo-Amyloidfibrillen, die aus dem Gehirn eines Patienten mit der Alzheimer'schen Krankheit isoliert wurden. Ein Medikament, das in der Lage ist, denselben Effekt in vivo, innerhalb des Gehirns auszuüben, wird daher einen großen therapeutischen Beitrag in AD leisten.
In einer anderen Reihe von Untersuchungen haben wir die Fähigkeit von Mäusen getestet, denen SAP entzogen war, AA-Amyloidose in einem beschleunigten Modell von Amyloidgenese zu entwickeln. Amyloid wurde schnell über intravenöse Injektion eines Extraktes von amyloiditischer Milz (sogenannter Amyloid-Verstärkerfaktor), zusammen mit einem einzigen starken Akute-Phase-Stimulus (subkutane Injektion von Silbernitrat) induziert [59]. Alle Kontrolltiere entwickelten eine beträchtliche Milzamyloidose innerhalb von 48 h. Im Gegensatz dazu waren alle Mäuse, in denen zirkulierendes SAP durch Verabreichung von adäquaten Dosen von Schaf-anti-Maus-SAP-Antiserum vollständig entfernt wurde, nicht in der Lage irgendwelche detektierbaren Amyloidablagerungen zu entwickeln. Eine weitere Kontrollgruppe, die Schaf-Antiserum gegen Maus-C3, ein bezugsloses Serumprotein, das nicht in Amyloidose involviert ist, erhalten hatte, entwickelten fast alle Amyloid.
Die Schaf-Antiseren wurden durch Immunisierung mit den entsprechenden isolierten reinen Maus-Proteinen erzeugt [62, 63]. Die IgG-Fraktion, getrennt über DEAE-Sephacel-Ionenaustauschchomatographie, wurde für die Injektion in die Mäuse verwendet.
Diese in vivo-Studien bestätigen, dass der Wirkungsmechanismus des Anti-Maus-SAP tatsächlich über SAP-Depletion stattfindet, und zeigt dass SAP für die Amyloidgenese benötigt wird. Dies kann die Notwendigkeit wiederspiegeln für SAP, neu gebildete Fibrillen vor der Proteolyse zu schützen, wie durch die Arbeit am obig beschriebenen Schutz von Fibrillen vor Proteolyse angedeutet, oder es kann eine direkte Rolle für SAP in der Amyloidfibrillogenese geben, die vorher nicht vermutet wurde. In jedem Fall richten die Ergebnisse erneut die Aufmerksamkeit auf die Inhibierung der SAP-Bindung an Amyloidfibrillen als ein höchst attraktives Target für den therapeutischen Angriff in allen Formen von Amyloidose. Ein geeigneter inhibitorischer Wirkstoff wird prophylaktisch wirken, um die Entwicklung der üblichen Alters-assoziierten Krankheiten, die durch Amyloidablagerungen verursacht werden, insbesondere AD und Typ II (Alters)-Diabetes mellitus, zu verhindern.
Wir haben kürzlich über die Kristallisation von SAP berichtet unter Bedingungen, die eine reversible Dissoziation des Decamers in eine pentamere Form induzieren [15]. Wir haben nun eine Röntgenstrukturanalyse der Kristalle bei 2Å Auflösung durchgeführt, welche die vollständige dreidimensionale Struktur des Pentamers definieren. Faszinierenderweise hat dieses humane Plasmaprotein eine Tertiärfaltung, die der des Leguminose-C-Typ Lektins, Concanavalin A, und Erbsen-Lektins gleicht. Dort liegen zwei Kalziumstellen vor und für diese wurde gezeigt, dass sie involviert sind in die Bindung von Kohlehydraten und dem synthetischen Liganden Phosphoethanolamin. Allerdings unterscheiden sich die Kalziumstellen in SAP und die Kalzium- und Manganstellen von Concanavalin A in ihrem Verhältnis zur üblichen Topologie. Das SAP-Pentamer zeigt beinahe eine perfekte fünffache Symmetrie und Sequenzvergleiche legen nahe, dass sehr ähnliche Wechselwirkungen in CRP-Pentameren bewahrt sind.
Die Kenntnis der Struktur von SAP, speziell die Bindestellen der Schlüsselliganden, ermöglicht das Entwerfen von therapeutischen und diagnostischen Wirkstoffen.
In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Kandidatenmoleküle getestet hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Bindung des Serum-Amyloid P-Bestandteils an Amyloidfibrillen in vitro zu inhibieren, zum Beispiel unter Verwendung eines wie hierin detailliert in Beispiel 1 beschriebenen Assay-Verfahrens.
Kandidatenmoleküle können erhalten werden über Durchführen von computerunterstütztem molekularem Design unter Verwendung der dreidimensionalen Struktur des Serum-Amyloid P-Bestandteils, besonders der dreidimensionalen Struktur an und/oder um die verschiedenen Bindungsstellen herum, und anschließendem Synthetisieren der so entworfenen Moleküle.
Ein Inhibitor-Molekül gemäß der vorliegenden Erfinung kann eines sein, das die Inhibierung der SAP-Bindung an Amyloidfibrillen verursacht, nicht durch Binden an die Ligandenbindestelle, sondern durch eine allosterische Reaktion, die dazu führt, dass die Bindestelle unfunktional wird. Die Verwendung eines Bindungsinhibierungsassays, zum Beispiel wie unten in Beispiel 1 beschrieben, zeigt solche Moleküle.
Die Verwendung eines Moleküls der vorliegenden Erfindung wird unter anderem zur Entfernung oder Verdrängung von SAP von Amyloidablagerungen führen und sollte es dann dem Körper ermöglichen, die Amyloidfibrillen zu mobilisieren und zu entfernen, ein Prozess von dem gezeigt wurde, dass er stattfindet, wenn die Synthese neuer Amyloidfibrillen unterbrochen wird [21–25].
Ein Bindestellen-Inhibitor der physiologisch tolerierbar ist und die Bindung von SAP an Amyloidfbrillen verhindert oder der SAP von Amyloidfibrillen verdrängt, kann als ein Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Wirkstoffe sind nützlich zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose jeglicher Form, insbesondere üblicher, Alters-assoziierter Krankheit, die durch Amyloidablagerung verursacht wird, zum Beispiel die Alzheimer'sche Krankheit und Typ II (Alters-)Diabetes mellitus.
Ein Inhibitormolekül kann ebenfalls verwendet werden als ein molekulares Liefersystem zum zielgerichteten Transportieren anderer pharmazeutisch aktiver Verbindungen zu den Amyloidfibrillen.
Die Verabreichung eines gemäß der Erfindung identifizierten Inhibitors der SAP-Bindung als ein therapeutischer Wirkstoff oder als ein molekulares Liefersystem kann enteral oder parenteral erfolgen.
Der orale Weg ist im Wesentlichen bevorzugt, vorausgesetzt dass der Wirkstoff nicht im gastrointestinalen Trakt inaktiviert wird. (Der orale Weg ist im Wesentlichen ungeeignet für die Verabreichung von Proteinen und Polypeptiden.) Für diagnostisches Imaging wird ein solcher Wirkstoff, der eine geeignete Imaging-Markierung trägt (siehe unten), generell intravenös oder intrathekal verabreicht.
Zur oralen Verabreichung wird ein Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung in Beimischung oder Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger, vorzugsweise in einheitliche Dosierungsformen gebracht, zum Beispiel als Tabletten, Hartgelatinekapseln oder Softgelatinekapseln. Zur parenteralen Verabreichung, zum Beispiel über den intravenösen oder intrathekalen Weg, kann ein Inhibitor gemäß der Erfindung einem geeigneten Träger beigemischt werden, zum Beispiel einer sterilen isotonischen Lösung, oder in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. Es kann notwendig sein, besonders aufzupassen mit einem Verdünnungsmittel zur Verwendung mit einem lyophilisierten Imaging-Wirkstoff. Verfahren zum Herstellen pharmazeutischer Präparate aller Arten und geeigneter Träger und anderer Ingredienzien zur Verwendung in pharmazeutischen Präparaten sind gut bekannt und beschrieben, zum Besipiel in Martindale's Extra Pharmacopoeia.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge eines physiologisch tolerierbaren Bindestelleninhibitors, identifiziert gemäß der vorliegenden Erfindung an ein Subjekt umfasst, das an Amyloidose leidet oder anfällig dafür ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die in vivo-Diagnose von Amyloidose. Zu diesem Zweck wird ein physiologisch tolerierbarer Bindestelleninhibitor, identifiziert gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem Tracer markiert, der in vivo detektierbar ist. Solche Tracer sind gut bekannt und schließen Radioisotope von Jod, Indium und Technetium, zum Beispiel ¹²³I, ¹³¹I, ¹²⁴I, ¹¹¹In und ⁹⁹⁰Tc ein. Magnetische Resonanztracer sind ebenfalls geeignet. Die markierte Verbindung wird an den Patienten verabreicht, im wesentlichen intravenös oder intrathekal, und der Patient wird dann dem geeigneten Imaging-Prozess unterzogen, und die Markierung, falls vorhanden, von Amyloidablagerungen wird zur Verwendung in der Diagnose notiert.
Besonders geeignet für diagnostische Zwecke sind Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden und daher Amyloidablagerungen im Gehirn zu markieren, und somit die Diagnose der Alzheimer'schen Krankheit zu ermöglichen. Derzeit gibt es hierfür, der vierthäufigsten Todesursache in der westlichen Welt, keinen diagnostischen Test. Polypeptide mit geringem Molekulargewicht oder andere Moleküle mit hoher Affinität und geringem Molekulargewicht können spezifisch dahingehend entworfen werden, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. (Polypeptide mit geringem Molekulargewicht können zum Beispiel 3 bis 50 Aminosäurereste umfassen. Andere Moleküle mit hoher Affinität und geringem Molekulargewicht können eine Masse von beispielsweise bis zu 5000 zu 6000 Daltons haben). Solche Peptide und andere Moleküle sind wesentlich billiger als natürliches SAP und machen all die Probleme, die mit der Isolierung, Sicherheit und Verfügbarkeit des humanen Blutproteins assoziiert sind überflüssig. Solche Probleme haben bisher verhindert, dass SAP als ein kommerzielles Produkt trotz seines unbestreitbaren klinischen Wertes aufgenommen wurde, und die Verwendung von SAP in der Diagnose beschränkt sich aktuell auf Forschungszentren.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1: Effekt von SAP bei Konzentrationen von 0 bis 500 μg/ml auf Pronase-Verdau von Alzheimer's β-Protein Amyloid-Fibrillen.
2: Effekt von SAP bei Konzentrationen von 0 bis 50 μg/ml auf Pronase-Verdau von ¹²⁵I-AA Amyloid-Fibrillen.
3: Effekt von SAP bei Konzentrationen von 0 bis 500 μg/ml auf Pronase-Verdau von ¹²⁵I-AA Amyloid-Fibrillen.
4: Aufhebung des Proteinaseschutzes von SAP durch MOβDG.
Proteinaseresistenz von Pentraxinen und die Behandlung von Amyloidosen
SAP und CRP sind beide bemerkenswert resistent gegen proteolytische Degradation in Anwesenheit von Kalzium. Im Gegensatz dazu, werden beide in der Abwesenheit von Kalzium, durch einige Enzyme, insbesondere α-Chymotrypsin und Pronase, gespalten [40,49]. Obwohl diese Spaltung nicht zur Fragmentierung entweder des gesamten Moleküls oder der einzelnen Untereinheiten unter nicht-denaturierenden Bedingungen führt, verursacht es den Verlust der kalzium-bindenden Aktivität durch die Pentraxine und zerstört ihre Fähigkeit zur kalzium-abhängigen Ligandenbindung. Daher ist es von Interesse, dass die Hauptstelle der Spaltung von SAP zwischen den Resten 144 und 145 liegt, während sie in CRP zwischen den Resten 146–147 (Pronase) oder 145–146 (Nagarse Protease) liegt. Dies ist Teil einer Schleife, die durch Kalziumligation an Ort und Stelle gehalten wird, und die in der kalziumfreien Form lediglich lose mit dem Körper des Proteins assoziiert und daher anfällig für Proteolyse ist. Die meisten Schleifen von SAP werden nah am Körper des Pentamers gehalten und das macht sie weniger leicht zugänglich zu den aktiven Stellen von proteolytischen Enzymen.
Es ist wahrscheinlich, dass die Resistenz gegenüber Proteninaseverdau ein wichtiger Aspekt der normalen Funktion von SAP ist und ebenfalls zur Persistenz von Amyloidablagerungen beitragen kann. Das SAP, normalerweise assoziiert mit der Glumerulum-Basal-Membran und der Oberfläche von elastischen Faser-Mikrofibrillen [8, 9], kann diese extrazellulären Matrixbestandteile vor unangemessener Degradation schützen. Auf der anderen Hand sind Amyloidfibrillen abnormale extrazelluläre Strukturen, die erkannt und degradiert werden sollten, die jedoch nichtsdestotrotz in vivo bestehen. In dieser pathologischen Situation kann die Bindung von SAP an Amyloidfibrillen verantwortlich sein. Der Schutz kann einfach aus dem Ummanteln durch SAP resultieren, welches hinsichtlich seiner normalen zirkulierenden Form [11] vollständig unverändert ist, und von welchem daher nicht erwartet wird, dass es Makrophagenaktivierung oder Phagozytose triggert. Nichtsdestotrotz kann die Proteinaseresistenz von SAP selbst ein signifikanter Faktor sein. Die Verfügbarkeit der vollständigen hoch aufgelösten Struktur von SAP und seiner Ligandenbindestelle bietet nun die Gelegenheit zum direkten Modellieren kompetitiver Inhibitoren der SAP-Bindung und zum Entwickeln von Bindestellenhomologen, von denen jeder als Medikament verwendet werden kann, um SAP von den Amyloidablagerungen in vivo zu verdrängen. Dies eröffnet neue Wege zur Behandlung von Amyloidose, was es dem Körper ermöglicht, die Fibrillen zu mobilisieren und degradieren, die sonst unangemessen durch SAP geschützt wären.
Die folgenden, nicht-abschließenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
BEISPIEL 1
Protokoll zum Testen auf Inhibierung der SAP-Bindung an Amyloidfibrillen
Amyloidfibrillen werden aus den Organen wie beispielsweise der Milz isoliert, die post mortem aus Patienten mit Amyloidose des Typs AA oder AL erhalten wurden, unter Verwendung des Wasser-Extraktionsverfahrens von Pras et al [55]. Dieses Verfahren wird in der Hinsicht modifiziert, dass die ersten salzhaltigen Homogenisierungen durchgeführt werden unter Verwendung von Tris-gepufferter Saline, enthaltend 10 mM EDTA, um die vollständige Dissoziation von allem endogenen SAP sicherzustellen [56]. Der fibrillenreiche Wasserextrakt wird mit Tris-gepufferter Saline, enthaltend Kalziumchlorid, gemischt, um die endgültige Salzkonzentration auf 138 m NaCl, 10 mM Tris, 2 mM CaCl₂ pH 8.0 einzustellen, und dies wird dann zentrifugiert bei 1500 g für 5 Minuten, um die Fibrillen zu sedimentieren. Diese werden dann in Tris-saline Kalzium-Puffer, pH 8.0 in den selben Konzentrationen wie oben (TC Puffer) resuspendiert, um eine geeignete Suspension bereitzustellen, zum Beispiel, A₂₈₀ = 0.255, A₃₂₀ = 0.132 und wird dann bei 4°C aufbewahrt. Hoch aufgereinigtes humanes SAP, isoliert wie zuvor beschrieben [31, 57], wird wie zuvor beschrieben mit ¹²⁵I radioiodiniert [58], auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 0.1 μC/μg und wird unmittelbar vor der Verwendung auf ungefähr 70 μg/ml in TC, enthaltend 4% w/v bovines Serumalbumin, verdünnt. Zu testende Wirkstoffe werden auf eine Konzentration von ungefähr 10 mM in TC oder in 1:10 DMSO in Wasser oder TC gelöst. Wenn sie wirksam im Inhibieren der SAP-Bindung sind, werden sie in einem Bereich von geringeren Konzentrationen getestet, um die minimale inhibitorische Dosis zu bestimmen.
Für den Assay selbst, werden 10 μl von markiertem SAP mit 50 μl amyloider Fibrillensuspension und 40 μl der Testsubstanz vermischt und unter Mischen für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Kontrollen enthalten SAP alleine ohne Fibrillen, SAP und Fibrillen ohne ohne einen potenziellen Inhibitor, SAP und Fibrillen in Anwesenheit von EDTA, um jegliche Bindung von SAP zu verhindern, und SAP plus Inhibitor ohne Fibrillen als Kontrolle für unspezifische Effekte, wie beispielsweise durch Testsubstanzen induzierte Denaturierung. Nach der Inkubation werden die Fibrillen mit gebundenem SAP von ungebundenem SAP entweder über Zentrifugation bei 1500 g für 5 Minuten oder über Filtration in dem Millipore Multiscreen Assay-System unter Verwendung von 0.22 μ Durapore low Protein binding multiwell Filterplatten getrennt. Die Fibrillen werden mit TC, enthaltend 1% w/v BSA gewaschen und das gebundene radioaktive SAP wird gemessen.
Typischerweise sind ungefähr 75% der angebotenen Aktivität in Abwesenheit eines Inhibitors gebunden; keine ist in Anwesenheit von EDTA gebunden, und in Abwesenheit von Fibrillen sedimentiert weniger als 5% der Aktivität alleine.
In Konzentrationen oberhalb ungefähr 2 mM im letztendlichen Inkubationsgemisch, reduziert MoβDG die Bindung auf Hintergrundniveau. Ein Beispiel einer typischen Reihe von Ergebnissen ist in Tabelle 1 unten dargestellt: TABELLE 1 Inhibierung der SAP-Bindung an Amyloidfibrillen durch MOβDG

Typ AA Amyloidfibrillen MOβDG SAP-Bindung

(A₂₈₀) (mM) (%)

0.4 0 82

0.1 0 63

0.025 0 13

0.1 30 2

0.1 20 2

0.1 10 5

0.1 5 17

0.1 1 46
In Anwesenheit von EDTA oder in Abwesenheit von Fibrillen betrug die apparente SAP-Bindung 1%.
BEISPIEL 2
Schutz durch SAP gegen Verdau von Amyloidfibrillen in vitro und Aufhebung dieses Schutzes durch MOβDG
Das verwendete Verfahren ist wie folgt:
Amyloidfibrillen
Jeglicher Typ von Amyloidfibrillen kann in dem folgenden Protokoll verwendet werden, zum Beispiel können Amyloidfibrillen ex vivo erhalten werden oder das β-Protein der Alzheimer'schen Krankheit kann synthetisch hergestellt werden.
Das β-Protein der Alzheimer'schen Krankheit, hergestellt als ein synthetisches Peptid, enthaltend die Reste 1–40, wurde von California Peptid Research bezogen und wurde in purem Wasser zu 4 mg/ml gelöst, was 1 mM entspricht. Einiges davon wurde bei 4°C aufbewahrt („frisch") und manches wurde altern gelassen durch Inkubation bei 37°C für 7 Tage. Es ist bekannt, dass sich Fibrillen im Kalten sehr langsam bilden, dass jedoch „altern" mit ausgeprägter Amyloidfibrillenbildung assoziiert ist, und dieses wurde im vorliegenden Fall über Kongorot-Färbung und durch direkte Elektronenmikroskopie bestätigt.
Verfahren und Ergebnisse

(a) β-Protein-Lösungen, die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden auf 0.2 mg/ml in TC unmittelbar vor der Verwendung verdünnt. Hoch aufgereinigtes humanes SAP in Lösung in 138 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0 (TN) wurde in TN auf 0.1 mg/ml 0.5 mg/ml und 2.5 mg/ml verdünnt. Pronase aus S. griseus wurde wurde von Boehringer Mannheim bezogen, und wurde unmittelbar vor der Verwendung frisch präpariert zu 0.04 und 0.004 mg/ml in TC.

Aliquots, 50 μl, von gealtertem oder frischen β-Protein wurden mit 20 μl Volumen von TN alleine oder SAP in den verschiedenen Konzentrationen, dargestellt in 6, und mit 5 μl von 10 mM CaCl₂ gemischt und dann unter Schütteln bei 37°C für eine Stunde inkubiert. TC alleine oder Pronase in TC bei 0.04 oder 0.004 mg/ml wurden in einem Volumen von 25 μl zugegeben und die Inkubation wurde für eine weitere Stunde bei 37°C fortgesetzt. Der Verdau wurde dann durch Zugabe eines gleichen Volumens an reduzierendem SDS-PAGE-Probenpuffer (20 mM Tris pH 8.0,2 mM EDTA, 5% w/v SDS, 10% w/v 2-Mercaptoethanol, 0.05% w/v Bromphenol blau, 20% w/v Glyzerin) und kochen für 10 Minuten gestoppt. Diese Proben wurden letztendlich in reduzierender, homogener 15%iger SDS-PAGE analysiert, und mit Brilliant blue R350 gefärbt. Der Anteil des β-Proteins, das in jeder Spur vorhanden war, wurde über Scanning Densitometrie unter Bezugnahme auf die Kontrolle ohne Pronase, die als 100% genommen wurde, bestimmt. Der verdaute Anteil wurde über Substraktion berechnet und gegen die SAP-Konzentration geplottet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 1 dargestellt.

(b) AA-Amyloidfibrillen, die ex vivo erhalten wurden, wurden für 6 Stunden bei 37°C mit Trypsin oder Chymotrypsin bei einem Substrat:Enzym-Verhältnis von 10:1 in Anwesenheit oder Abwesenheit von SAP und mit oder ohne MoβDG, gemäß des oben angegebenen allgemeinen Protokolls inkubiert. Die Inkubationsgemische wurden dann über Coomassieblue gefärbte SDS-PAGE analysiert mit Quantifizierung der AA Protein-Banden. Die Intensität dieser Bande nach Inkubation ohne Trypsin wurde als 100% genommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt.

Proteinase	SAP (μg/ml)	MOβDG (mM)	% verbleibendes AA Protein
	-	-	100
Trypsin	-	-	5
Trypsin	10 μg/ml	-	20
Trypsin	50 μg/ml	-	50
Trypsin	50 μg/ml	1 mM	5
Chymotrypsin	-	-	10
Chymotrypsin	10 μg/ml	-	20
Chymotrypsin	50 μg/ml	-	60
Chymotrypsin	50 μg/ml	1 mM	10

(c) In einer weiteren Variante können die Amyloidfibrillen (ex vivo oder synthetisch) mit einem Radioisotop markiert werden, zum Beispiel Radio-Jod, und der Verdau dann durch Messen der Freisetzung von Trichloressigsäure-löslicher Radioaktivität überwacht werden, eher als über SDS-PAGE.

AA-Amyloidfibrillen wurden oxidativ mit ¹²⁵I markiert. Die markierten Fibrillen wurden mit SAP und Pronase dem allgemeinen oben angegebenen Potokoll folgend inkubiert, außer, dass die Inkubation für 1, 4 und 24 Stunden durchgeführt wurde. Das Trichloressigsäure-lösliche freigesetzte ¹²⁵I wurde bestimmt. Die 2 und 3 zeigen die Ergebnisse, die bei verschiedenen SAP-Konzentrationen erhalten wurden.

(d) Aufhebung des Schutzes durch MOβDG: β-Proteinfibrillen zu 100 μg/ml wurden für eine Stunde bei 37°C mit Pronase in einer Konzentration von 1 μg/ml in Anwesenheit oder Abwesenheit von SAP und mit oder ohne verschiedene Konzentrationen an MOβDG inkubiert. Das Ausmaß des Verdaus des β-Proteins wurde dann über SDS-PAGE-Analyse bestimmt.

Die Ergebnisse, die eindeutig die Aufhebung des Schutzes, der durch SAP gegen Proteinaseverdau von amyloiden Fibrillen verliehen wird, zeigen, sind in Tabelle 3 unten und in 4 dargestellt. TABELLE 3 Aufhebung des Schutzes, der gegen Proteinaseverdau von β-Proteinfibrillen der Alzheimer'schen Krankheit durch den Serum-Amyloid P-Bestandteil verliehen wird, durch MOβDG

SAP-Konzentration MOβDG-Konzentration Verdau an β-Protein

(μg/ml) (mM) (%)

0 0 95

10 0 60

10 1.3 75

10 6.7 85

10 33.3 90
BEISPIEL 3
Fähigkeit von Mäusen, denen SAP entzogen wurde, in einem beschleunigten Modell von Amyloidgenese AA-Amyloidose zu entwickeln
Ayloid wurde schnell in Mäuse induziert durch intravenöse Injektion eines Extrakts von amyloidischer Milz (sogenannter Amyloid-Verstärkungsfaktor) zusammen mit einem einzigen starken Akute-Phase-Stimulus (subkutane Injektion von Silbernitrat) [59] am Tag 0. Gruppe 1 hatte keine andere Behandlung; Die Gruppen 2 und 3 erhielten Schaf-Anti-Maus-SAP beziehungsweise Schaf-Anti-Maus-C3-Antikörper am Tag –1, Tag 0 und Tag 1. Alle Tiere wurden am Tag 2 getötet und das Vorhandensein von Amyloidablagerungen histologisch über Kongorot-Färbung gesucht.
Alle Kontrolltiere entwickelten innerhalb von 48 Stunden eine bemerkenswerte Milzamyloidose. Im Gegensatz dazu waren alle Mäuse, in denen zirkulierendes SAP durch Zugabe von adäquaten Dosen Schaf-Anti-Maus-SAP-Antiserum vollständig entfernt war, nicht in der Lage, irgendwelche detektierbaren Amyloidablagerungen zu entwickeln. Eine weitere Kontrollgruppe, welche Schaf-Antiserum gegen Maus-C3 erhielt, ein bezugsloses Serumprotein, welches nicht in Amyloidose involviert ist, entwickelten fast alle Amyloid.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten zusammengestellt. TABELLE 4 Effekt der SAP-Depletion auf die Induktion von AA-Amyloidose in Mäusen

Gruppe Behandlung Anzahl an Tieren Anzahl, die Amyloid entwickeln (%)

1 keine 10 10 100

2 Anti-Maus-SAP-Antikörper 17 0 0

3 Anti-Maus-C3-Antikörper 9 8 89
Diese vorläufigen Studien bestätigen, dass der Wirkungsmechanismus des Anti-Maus-SAP in der Tat über SAP-Depletion erfolgt, und zeigen, dass SAP für die Amyloidgenese notwendig ist. Dies kann die Notwendigkeit widerspiegeln bezüglich SAP, welches neu gebildete Fibrillen vor der Proteolyse schützt, durch die obig beschriebene Arbeit am Schutz von Fibrillen vor Proteolyse angedeutet, oder es kann eine direkte Rolle für SAP in Amyloidfibrillogenese geben, die vorher noch nicht vermutet wurde. In jedem Fall unterstützen die Ergebnisse unsere in vitro-Ergebnisse und richten die Aufmerksamkeit auf die Inhibierung von SAP-Bindung an Amyloidfibrillen als ein höchst attraktives Target für den therapeutischen Angriff in allen Formen von Amyloidose. Ein geeigneter inhibitorischer Wirkstoff wird prophylaktisch wirken, um die Entwicklung der üblichen Alters-assoziierten Krankheiten, die durch Amyloidablagerung verursacht werden, insbesondere AD und Typ 2 (Alters)-Diabetes mellitus, zu verhindern.
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Claims

Verfahren zum Testen eines Moleküls zur Verwendung in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen des Moleküls in vitro mit einem Serum-Amyloid P-Bestandteil und beta-Amyloidfibrillen umfasst, sowie das Detektieren und Bestimmen der Inhibierung der Bindung des Serum-Amyloid P-Bestandteils an die beta-Amyloidfibrillen durch das Molekül, wobei die Inhibierung der Bindung ein Molekül anzeigt, welches zur Verwendung in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose geeignet ist.
Verwendung eines nach einem Verfahren nach Anspruch 1 identifizierbaren Moleküls für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Amyloidose.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Amyloidose um die Alzheimer'sche Krankheit handelt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Amyloidose um Alters-Diabetes mellitus handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Molekül ein anderes ist als 4,6-O-(1-Carboxyethyliden)-β-D-Galactopyranosid (MOβDG) und Phosphoethanolamin (PE).
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das Molekül physiologisch tolerierbar ist.