-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Amyloidose
bezieht sich auf einen pathologischen Zustand, der durch das Vorliegen
von Amyloid gekennzeichnet ist. Amyloid ist ein generischer Begriff,
der sich auf eine Gruppe diverser aber spezifisch extrazellulärer Proteinablagerungen
bezieht, die in einer Anzahl verschiedener Krankheiten beobachtet
werden. Obwohl verschiedenartig in ihrem Auftreten, weisen alle
Amyloidablagerungen gemeinsame morphologische Eigenschaften auf,
Färbung
mit spezifischen Farbstoffen (z.B. Kongorot) und haben eine charakteristische rot-grüne Doppelbrechungserscheinung
in polarisiertem Licht nach dem Färben. Sie weisen überdies
gemeinsame ultrastrukturelle Merkmale und gemeinsame Röntgenbeugungen
und Infrarotspektren auf.
-
Amyloidose
kann klinisch als primär,
sekundär
und familiär
und/oder isoliert klassifiziert werden. Primäre Amyloidose tritt de novo
ohne irgendwelche vorhergehende Störung auf. Sekundäres Amyloid
ist die Form, die als Komplikation bei einer vorher bestehenden
Störung
auftritt. Familiäres
Amyloid ist eine genetisch vererbte Form, die in besonderen geographischen
Populationen gefunden wird. Isolierte Formen von Amyloid, sind jene,
die dazu neigen ein einziges Organsystem zu betreffen. Verschiedene
Amyloide werden auch durch die Art des in der Ablagerung vorliegenden
Proteins charakterisiert. Beispielsweise werden neurodegenerative Krankheiten,
wie etwa Traberkrankheit, bovine spongiforme Enzephalitis [Rinderwahnsinn],
Creutzfeldt-Jakob-Syndrom und dergl. durch das Auftreten und die
Akkumulierung einer Protease-resistenten Form eines Prionenproteins
(bezeichnet mit Ascr oder PrP-27) im zentralen Nervensystem gekennzeichnet.
Gleichermaßen
wird Alzheimer, eine weitere neurogenerative Störung, durch kongophile Angiopathie,
neuritische Plaques und neurofibrilläre Knäuel, die alle die Eigenschaften
von Amyloiden aufweisen, gekennzeichnet. In diesem Fall werden die
Plaques und Blutgefäßamyloide
durch das beta-Protein gebildet. Andere systemische Krankheiten,
wie etwa Erwachsenendiabetes, Komplikationen bei Langzeithämodialyse
und Folgeerscheinungen von langandauernden Entzündungen oder Plasmazellendyskrasien
werden durch die systemische Akkumulierung von Amyloiden gekennzeichnet.
In jedem dieser Fälle
ist ein anderes amyloidogenes Protein in die Amyloidablagerung involviert.
-
Nachdem
sich diese Amyloide gebildet haben, gibt es keine bekannte Therapie
oder Behandlung, um die Ablagerungen in situ aufzulösen. Mit
Ausnahme des familiären
mediterranen Fiebers, bei dem Colchicin prophylaktisch eingesetzt
wird, existiert keine Therapie für
irgendeine Form der Amyloidose. Es besteht daher ein dringendes
Bedürfnis
für therapeutische
Mittel, die entweder die Bildung oder das Wachstum von Amyloiden
inhibieren können
oder Amyloidablagerungen nach deren Bildung aufzulösen vermögen.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Diese
Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen, die
geeignet sind für
die Behandlung von Amyloidose. Die Verfahren der Erfindung beinhalten
die Verabreichung einer Amyloidablagerung-inhibierenden Verbindung
an ein Subjekt. Entsprechend sind die Zusammensetzungen der Erfindung
geeignet zur Inhibierung von Amyloidose in Störungen, bei denen Amyloidablagerungen
auftreten. Die Zusammensetzungen der Erfindung können therapeutisch eingesetzt
werden, um Amyloidose zu behandeln oder sie können prophylaktisch verwendet
werden in einem für
Amyloidose anfälligen
Subjekt. Die Erfindung basiert zumindest zum Teil auf der Inhibierung
einer Wechselwirkung zwischen einem amyloidogenen Protein und einem
Bestandteil der Basalmembran unter Inhibierung der Amyloidablagerung.
Der Bestandteil der Basalmembran ist ein Glycoprotein oder Proteoglycan,
vorzugsweise Heparansulfatproteoglycan. Eine therapeutische Verbindung
zur Verwendung in der Erfindung kann mit der Bindung des Basalmembranbestandteils
an einen Zielbindungsort auf einem amyloidogenen Protein interferieren,
unter Inhibierung der Amyloidablagerung.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die folgenden Ausführungsformen:
- 1. Die Verwendung einer Verbindung bei der
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention
von Amyloidose oder einer Krankheit, bei der Amyloidablagerung auftritt
in einem hierfür
bedürftigen Subjekt,
worin besagte Verbindung ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Propan-1,3-disulfonsäure und
pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.
- 2. Die Verwendung gemäß Absatz
1, worin die Verbindung das Natriumsalz von Propan-1,3-disulfonsäure ist.
- 3. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin besagte Amyloidose oder Krankheit, bei der Amyloidablagerung
auftritt, assoziiert ist mit einem Protein ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Amyloid A, Amyloid κ L-Kette, Amyloid λ L-Kette,
ATTR, atrialem natriuretischem Faktor, Procalcitonin, Gelsolin,
Cystatin C, AApoA-I, AApoA-II, Fibrinogen, Lysozym, AScr und PrP-27.
- 4. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin die Amyloidose oder Krankheit, bei der Amyloidablagerung auftritt,
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus reaktiver [sekundärer] Amyloidose,
familiärem
mediterranem Fieber, familiärer
Amyloidnephropatie mit Urticaria und Taubheit [Muckle-Wells-Syndrom],
idiopatisch [primär],
Myelom-assoziiert,
Makroglobulinämie-assoziiert,
familiärer Amyloidpolyneuropathie
[portugiesisch, japanisch, schwedisch], familiäre Amyloidkardiomyopathie [dänisch],
isolierte Kardioamyloidose, systemische senile Amyloidose, isolierte
atriale Amyloidose, medullärem
Thyroidkarzinom, familiäre
Amyloidose [finnisch], erbliche zerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose [isländisch],
familiäre
amyloidotische Polyneuropathie [Iowa], beschleunigte Seneszenz in
Mäusen,
Fibrinogen-assoziierte Amyloidose, Lysozym-assoziierte Amyloidose,
Traberkrankheit, Creutzfeldt-Jacob-Syndrom, Gerstmann-Straussler-Scheinker-Syndrom und bovine
spongiforme Enzephalitis [Rinderwahnsinn].
- 5. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin besagte Verbindung Amyloidablagerung inhibiert.
- 6. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin die Verbindung Amyloidablagerungen in einem Subjekt mit fortschreitender
Amyloidose reduziert.
- 7. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin besagte Verbindung eine Wechselwirkung eines amyloidogenen
Proteins mit einem Bestandteil der Basalmembran inhibiert.
- 8. Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der vorstehenden
Absätze
bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Amyloidose
oder einer Krankheit, bei der Amyloidablagerung auftritt in einem
hierfür
bedürftigen
Subjekt, worin besagte Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Propan-1,3-disulfonsäure
und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.
- 9. Die Verwendung gemäß Absatz
8, worin besagte Verbindung das Natriumsalz von Propan-1,3-disulfonsäure ist.
- 10. Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Absätze 1 bis
7 bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention von Amyloidose oder
einer Krankheit, bei der Amyloidablagerung in einem Subjekt auftritt,
worin besagte Verbindung ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Propan-1,3-disulfonsäure und
pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.
- 11. Die Verwendung gemäß Absatz
10, worin besagte Verbindung das Natriumsalz von Propan-1,3-disulfonsäure ist.
- 12. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin besagte Verbindung zur oralen Verabreichung adaptiert ist.
- 13. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin besagtes Medikament zur oralen Verabreichung adaptiert ist.
- 14. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin besagtes Medikament zur intravenösen Verabreichung adaptiert
ist.
- 15. Die Verwendung gemäß irgendeinem
der vorstehenden Absätze,
worin besagtes Medikament weiterhin einen pharmazeutisch akzeptablen
Träger
umfasst.
-
Die
therapeutischen Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung können einem
Subjekt verabreicht werden auf eine Weise, die zur Inhibierung der
Amyloidablagerung wirksam ist. Geeignete Routen der Verabreichung
beinhalten subkutane, intravenöse
und intraperitoneale Injektionen. Es wurde gefunden, dass die therapeutischen
Verbindungen der Erfindung bei oraler Verabreichung wirksam sind.
Entsprechend ist die orale Verabreichung ein bevorzugter Weg der
Verabreichung. Die therapeutischen Verbindungen können mit einem
pharmazeutisch akzeptablen Träger
verabreicht werden.
-
Die
Erfindung stellt überdies
pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Amyloidose bereit.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen beinhalten eine therapeutische
Verbindung der Erfindung in einer zur Inhibierung der Amyloidablagerung
wirksamen Menge und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
-
1 ist
ein Balkendiagramm, welches die Wirkung der Vergleichsverbindung
Poly(vinylsulfonsäurenatriumsalz)
bei intraperitonealer Verabreichung auf die in vivo AA-Amyloidablagerung
in der Milz der Maus darstellt.
-
2 ist
ein Diagramm, welches die Wirkung der Vergleichsverbindung Poly(vinylsulfonsäurenatriumsalz)
auf die Heparansulfatproteoglycanbindung von β-APP in Tris-gepufferte Salzlösung (TBS)
darstellt.
-
3 ist
ein Diagramm, welches die Wirkung der Vergleichsverbindung Poly(vinylsulfonsäurenatriumsalz)
auf die Bindung von Heperansulfatproteoglycan an β-APP in Phosphat-gepufferter
Salzlösung
(PBS) darstellt.
-
4 ist
ein Balkendiagramm, welches die Wirkung der Vergleichsverbindung
Poly(vinylsulfonat) bei oraler Verabreichung auf die in vivo AA-Amyloidablagerung
in der Milz der Maus darstellt.
-
5 ist
ein Diagramm, welches den Blutspiegel des Amyloidvorläufers, SAA,
im Zeitverlauf für
Tiere darstellt, die die Vergleichsverbindung Poly(vinylsulfonsäurenatriumsalz)
erhielten (offen Kreise) und für
Vergleichstiere (Dreiecke) darstellt.
-
6 ist
ein Diagramm, welches die Wirkung oral verabreichter Vergleichsverbindung
Poly(vinylsulfonsäurenatriumsalz)
auf den Verlauf den AA-Amyloidablagerung in der Milz der Maus darstellt,
wobei Amyloidablagerungen bereits vor der Behandlung der Tiere vorlagen.
Die Dreiecke stellen die Vergleichstiere und die offenen Kreise
stellen die behandelten Tiere dar.
-
7 ist
ein Diagramm, welches die Wirkung von oral verabreichter Vergleichsverbindung
Poly(vinylsulfonsäurenatriumsalz)
auf die Amyloidablagerung in der Milz darstellt, wenn ein Entzündungsherd
während der
Verlaufes des Experiments aufrechterhalten wird. Die Dreiecke stellen
die Vergleichstiere dar, während
die offenen Kreise die behandelten Tiere darstellen.
-
8 ist
ein Diagramm, welches die Wirkung von oral verabreichter Vergleichsverbindung
Ethanmonosulfonat, Natriumsalz (EMS) auf die in vivo AA-Amyloidablagerung
in der Milz darstellt. Die Dreiecke stellen die Vergleichstiere,
die offenen Kreise stellen Tiere dar, die 2,5 mg/ml EMS in ihrem
Trinkwasser erhielten und die offenen Quadrate stellen Tiere da,
die 6 mg/ml EMS in ihrem Trinkwasser erhielten.
-
AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Diese
Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, die geeignet sind
zur Behandlung von Amyloidose. Die Methoden der Erfindung beinhalten
die Verabreichung einer therapeutischen Verbindung, die Amyloidablagerungen
inhibiert, an eine Subjekt. "Inhibierung
von Amyloidablagerung" soll
die Prävention
der Amyloidbildung, die Inhibierung weiterer Amyloidablagerung in
einem Subjekt mit fortschreitender Amyloidose und die Reduzierung
von Amyloidablagerungen in einem Subjekt mit fortschreitender Amyloidose
umfassen. Die Inhibierung von Amyloidablagerungen wird im Vergleich
zu einem unbehandelten Subjekt oder im Vergleich zu einem behandelten
Subjekt vor der Behandlung bestimmt. Die Amyloidablagerung wird
inhibiert durch die Inhibierung einer Wechselwirkung mit einem amyloidogenen
Protein und einem Bestandteil der Basalmembran. "Basalmembran" bezieht sich auf eine extrazelluläre Matrix,
umfassend Glycoproteine und Proteoglycane, einschließlich Laminin,
Kollagen Typ IV, Fibronectin und Heparansulfatproteoglycan (HSPG).
In einer Ausführungsform
wird die Amyloidablagerung inhibiert durch Störung der Wechselwirkung zwischen
einem amyloidogenen Protein und einem sulfatierten Glycosaminoglycan,
wie etwa HSPG. Es ist bekannt, dass sulfatierte Glycosaminoglycane
in allen Arten von Amyloiden vorliegen (siehe Snow, A.D. et al.
(1987) Lab. Invest. 56:120–123)
und Amyloidablagerung und HSPG-Ablagerung treten in vier Modellen
der Amyloidose gleichzeitig auf (siehe Snow, A.D. et al., (1987)
Lab. Invest. 56:665–675).
In der Erfindung werden Moleküle
verwendet, die eine den sulfatierten Glucosaminoglycanen ähnliche
Struktur aufweisen, um eine Wechselwirkung zwischen einem amyloidogenen
Protein und einem Bestandteil der Basalmembran zu inhibieren. Insbesondere umfassen
die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Verbindungen zwei
Sulfonatgruppen, die mit einem Trägermolekül verknüpft sind. Zusätzlich zu
der Funktion als Träger
für die
anionische funktionelle Gruppe kann das Trägermolekül die Verbindung in die Lage
versetzen, biologische Membranen zu überqueren und ohne exzessive
oder verfrühte
Metabolisierung bioverteilt zu werden. Überdies dient, da mehrere anionische funktionelle
Gruppen an dem Trägermolekül vorliegen,
das Trägermolekül dazu,
die anionischen Gruppen in einer korrekten geometrischen Anordnung
voneinander zu Separieren.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung einer therapeutischen Verbindung,
die geeignet ist zur Inhibierung einer Wechselwirkung zwischen einem
amyloidogenen Protein und einem Glycoprotein oder Proteoglycan Bestandteil
einer Basalmembran und somit die Amyloidablagerung zu inhibieren.
Die therapeutische Verbindung wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Propan-1,3-disulfonsäure
und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.
-
Die
Eignung einer therapeutischen Verbindung der Erfindung eine Wechselwirkung
zwischen einem amyloidogenen Protein und einem Glycoprotein oder
Proteoglycan Bestandteil einer Basalmembran zu inhibieren, kann
durch einen in vitro Bindungs-Assay beurteilt werden, wie etwa jenem,
der in den Beispielen oder im US-Patent Nr. 5,164,295 von Kisilevsky
et al. beschrieben ist. Kurz gesagt, ein fester Träger, wie
etwa eine Polystyrolmikrotiterplatte wird mit einem amyloidogenen
Protein (z.B. Serumamyloid A-Protein oder β-Amyloid-Vorläuferprotein
(β-APP))
beschichtet und sämtliche
verbleiden hydrophoben Oberflächen
werden blockiert. Der beschichtete feste Träger wird mit verschiedenen
Konzentrationen eines Bestandteils der Basalmembran, vorzugsweise
HSPG, inkubiert, entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit einer
zu testenden Verbindung. Der feste Träger wird extensiv gewaschen,
um ungebundenes Material zu entfernen. Die Bindung des Basalmembran-Bestandteil
(z.B. HSPG) an das amyloidogene Protein (z.B. β-APP) wird anschließend gemessen unter
Verwendung eines gegen den Basalmembran-Bestandteil gerichteten
Antikörpers,
der an eine detektierbare Substanz (z.B. ein Enzym, wie etwa alkalische
Phosphatase) konjugiert ist, unter Detektierung der detektierbaren
Substanz. Eine Verbindung, die eine Wechselwirkung zwischen einem
amyloidogenen Protein und einem Glycoprotein oder Proteoglycan Bestandteil einer
Basalmembran inhibiert wird die Menge an detektierter Substanz verringern
(z.B. wird sie das Ausmaß an
detektierter Enzymaktivität
inhibieren).
-
Vorzugsweise
wechselwirkt eine in der Erfindung zu verwendende therapeutische
Verbindung mit einem Bindungsort für ein Basalmembran Glycoprotein
oder Proteoglycan in einem amyloidogenen Protein und inhibiert dadurch
die Bindung des amyloidogenen Proteins an den Basalmembran-Bestandteil.
Basalmembran-Glycoproteine und -Proteoglycane beinhalten Laminin,
Kollagen Typ IV, Fibronectin und Heparansulfatproteoglycan (HSPG).
In einer bevorzugten Ausführungsform
inhibiert die therapeutische Verbindung eine Wechselwirkung zwischen
einem amyloidogenen Protein und HSPG. Konsensusbindungsmotive der
Bindungsstellen für
HSPG in amyloidogenen Proteinen wurden beschrieben (siehe z.B. Cardin
und Weintraub (1989) Arteriosclerosis 9:21-32). Beispielsweise kann ein HSPG Konsensusbindungsmotiv
von der allgemeinen Formel X1-X2-Y-X3 sein, worin X1, X2 und X3
basische Aminosäuren
(z.B. Lysin oder Arginin) sind und Y ist irgendeine Aminosäure. Modeling
der Geometrie dieser Bindungsstelle führte zur Bestimmung der nachfolgenden
Abstände
zwischen den basischen Aminosäureresten
(Carboxylat bis Carboxylat, in Angstrom):
X1–X2 | 5,3 ± 1,5 Å |
X1–X3 | 7,1 ± 1,5 Å |
X2–X3 | 7,6 ± 1,5 Å |
-
Diese
Werte wurden bestimmt unter Verwendung einer Kombination von molekular-mechanischen
Berechnungen und semi-empirischen quantenmechanischen Berechnungen.
Die Molekularmechanikberechnungen wurden durchgeführt unter
Verwendung des MM2 Kraftfelds. Semi-empirische Molekülorbital-Berechnungen
wurden auf dem AM1-Niveau durchgeführt. Der Konformationsraum
der Bindungsstelle wurde unter Verwendung einer Kombination von
Moleküldynamik
(sowohl hohe als auch niedrige Temperatur) und Monte Carlo-Simulationen
gesampled.
-
Entsprechend
ist bei den therapeutischen Verbindungen der Erfindung, da mehrere
anionische Gruppen an das Trägermolekül gebunden
sind, der relative Abstand der anionischen Gruppen so gewählt, dass
die anionischen Gruppen (Sulfonate) optimal mit den basischen Resten
innerhalb der HSPG-Bindungsstelle wechselwirken (unter Inhibierung
der Wechselwirkung von HSPG mit der Bindungsstelle). D.h., anionische
Gruppen sind ungefähr
5,3 ± 1,5 Å voneinander
entfernt, so dass der relative Abstand der anionischen Gruppen optimale
Wechselwirkung mit einer Bindungsstelle für einen Basalmembranbestandteil
(z.B. HSPG) in einem amyloidogenen Protein ermöglicht.
-
Eine
therapeutische Verbindung der Erfindung umfasst weiterhin typischerweise
ein Gegenkation. Kationische Gruppen beinhalten positiv geladene
Atome und Einheiten. Wenn die kationische Gruppe Wasserstoff, H+, ist, dann kann die Verbindung als Säure angesehen
werden. Wenn ein Wasserstoff durch ein Metall oder dessen Äquivalent
ersetzt wird, ist die Verbindung ein Salz der Säure. Pharmazeutisch akzeptable
Salze der therapeutischen Verbindung sind innerhalb des Umfangs
der Erfindung. Beispielsweise kann die kationische Gruppe ein pharmazeutisch
akzeptables Alkalimetall, Erdalkali, Kation mit höherer Valenz
(z.B. Aluminiumsalz), polykationisches Gegenion oder Ammonium sein.
Ein bevorzugtes pharmazeutisch akzeptables Salz ist Natriumsalz,
aber andere Salze werden im Rahmen des pharmazeutisch akzeptablen
Bereiches ebenso in Betracht gezogen.
-
Der
in diesem Zusammenhang verwendete Begriff "Kohlenhydrat" soll substituierte und unsubstituierte
Mono-, Oligo- und Polysaccharide enthalten. Monosaccharide sind
einfache Zucker, die üblicherweise
die Formel C6H12O6 aufweisen und die kombiniert werden können unter
Bildung von Oligosacchariden oder Polysacchariden. Monosaccharide
beinhalten Enantiomere und sowohl die D- als auch die L-Stereoisomeren
von Monosacchariden.
-
Der
hier verwendete Begriff "Polymer" soll Moleküle beinhalten,
die gebildet werden, durch die chemische Vereinigung von zwei oder
mehreren als Monomeren bezeichneten Untereinheiten. Monomere sind
Moleküle
oder Verbindungen, die üblicherweise
Kohlenstoff enthalten und von relativ niedrigem Molekulargewicht und
einfacher Struktur sind. Ein Monomer kann in ein Polymer überführt werden,
indem es mit sich selbst oder mit anderen ähnlichen Molekülen oder
Verbindungen kombiniert wird. Ein Polymer kann aus einer einzigen identischen
Wiederholdungseinheit oder aus multiplen verschiedenen Wiederholungseinheiten
(Copolymere) gebildet werden. Polymere beinhalten substituierte
und unsubstituierte Vinyl-, Acryl-, Styrol- und Kohlenhydratbasierende
Polymere und Copolymere und Salze davon. In einer Ausführungsform
hat das Polymer ein Molekulargewicht von ungefähr 800 bis 1.000 Dalton.
-
Der
Begriff "Peptid" beinhaltet zwei
oder mehr Aminosäuren,
die durch eine Peptidbindung kovalent verbunden sind. Aminosäuren beinhalten
die natürlich
auftretenden Aminosäuren,
die in Proteinen gefunden werden, wie etwa Glycin, Alanin, Valin,
Cystein, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Methionin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutamin,
Asparagin, Lysin, Arginin, Prolin, Histidin, Phenylalanin, Tyrosin
und Tryptophan. Der Begriff Aminosäure beinhaltet weiterhin Analoge,
Derivate und Verwandte der natürlich
auftretenden Aminosäuren,
von denen eins oder mehrere in einem Peptid derivat vorliegen kann.
Beispielsweise können
Aminsäureanaloga
verlängerte
oder verkürzte
Seitenketten oder Varianten der Seitenketten mit geeigneten funktionellen
Gruppen aufweisen. Ebenso sind D- und L-Stereoisomere einer Aminosäure beihaltet,
wenn die Struktur der Aminosäure
stereoisomere Formen zulässt.
Der Begriff "Peptidderivat" beinhaltet weiterhin
Verbindungen, welche Moleküle
enthalten, die ein Peptidrückgrat
nachahmen, aber keine Aminosäuren
sind (sogenannte Peptidomimetika), wie etwa Benzodiazepinmoleküle (siehe
z.B. James, G. L. et al. (1993) Science 260:1937–1942).
-
Der
Begriff "aliphatische
Gruppe" soll organische
Verbindungen beinhalten, die durch geradkettige oder verzweigte
Ketten mit typischerweise zwischen 1 und 22 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet
sind. Aliphatische Gruppen beinhalten Alkylgruppen, Alkenylgruppen
und Alkynylgruppen. In komplexen Strukturen können die Ketten die Ketten
verzweigt oder kreuzvernetzt sein. Alkylgruppen beinhalten gesättigte Kohlenwasserstoffe
mit ein oder mehreren Kohlenstoffatomen, einschließlich geradkettigen
Alkylgruppen und verzweigten Alkylgruppen. Derartige Kohlenwasserstoffgruppen
können
an einem oder mehren Kohlenstoffen substituiert sein, beispielsweise
mit einer Halogen-, einer Hydroxyl-, einer Thiol-, einer Amino-,
einer Alkoxy-, einer Alkylcarboxy-, einer Alkylthio- oder einer
Nitrogruppe. Sofern die Anzahl an Kohlenstoffen nicht besonders
angegeben ist, bezieht sich "niederaliphatisch" wie hierin verwendet,
auf die oben definierte aliphatische Gruppe, (z.B. Niederalkyl,
Niederalkenyl, Niederalkynyl), jedoch mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Repräsentanten
derartiger nieder-aliphatischer Gruppen, z.B. Niederalkylgruppen,
sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, 2-Chlorpropyl, n-Butyl, Sec-Butyl, 2-Aminobutyl,
Isobutyl, tert-Butyl, 3-Thiopentyl und dergl. Der hier verwendet
Begriff "Amino" bedeutet -NH2; der Begriff "Nitro" bedeutet -NO2;
der Begriff "Halogen" bezeichnet -F, -Cl,
-Br oder -I; der Begriff "Thiol" bedeutet SH2; und der Begriff "Hydroxyl" bedeutet -OH. Somit bedeutet der hier
verwendete Begriff "Alkylamino" eine Alkylgruppe,
wie oben definiert, mit einer daran gebundenen Aminogruppe. Der
Begriff "Alkylthio" bezieht sich auf
eine wie oben definierte Alkylgruppe an die eine Sulphydrylgruppe
gebunden ist. Der hier verwendete Begriff "Alkylcarboxyl" bedeutet eine wie oben definierte Alkylgruppe
mit einer daran gebundenen Carboxylgruppe. Der hier verwendete Begriff "Alkoxy" bedeutet eine wie
oben definierte Alkylgruppe mit einem daran gebundenen Sauerstoffatom.
Repräsentative
Alkoxygruppen beinhalten Methoxy, Ethoxy, Propoxy, tert-Butoxy und
dergl.
-
Die
Begriffe "Alkenyl" und "Alkynyl" beziehen sich auf
ungesättigte
aliphatische Gruppen, die den Alkylgruppen analog sind, aber die
zumindest eine Doppel- oder Dreifachbindung enthalten.
-
Der
Begriff "alicyclische
Gruppe" soll geschlossene
Ringstrukturen von drei oder mehr Kohlenstoffatomen beinhalten.
Alicyclische Gruppen beinhalten Cycloparaffine oder Naphthaline,
die gesättigte
cyclische Kohlenwasserstoffe sind, Cycloolefine, die mit zwei oder
mehreren Doppelbindungen ungesättigt
sind, und Cycloacetylene, die eine Dreifachbindung aufweisen. Sie
umfassen nicht aromatische Gruppen. Beispiele von Cycloparaffinen
beinhalten Cyclopropan, Cyclohexan und Cyclopentan. Beispiele von
Cycloolefinen beinhalten Cyclopentadien und Cyclooctatetraen. Alicyclische
Gruppen beinhalten auch anellierte Ringstrukturen und substituierte
alicyclische Gruppen, wie etwa Alkyl-substituierte alicyclische
Gruppen. Im Falle der alicyclischen Gruppen können derartige Substituenten
weiterhin ein Niederalkyl, Niederalkenyl, Niederalkoxy, Niederalkylthio,
Niederalkylamin, Niederalkylcarboxyl, Nitro, Hydroxyl, -CF3, -CN oder dergl. umfassen.
-
Der
Begriff "heterocyclische
Gruppe" soll geschlossene
Ringstrukturen beinhalten, in denen ein oder mehrere der Atome im
Ring ein von Kohlenstoff verschiedenes Element ist, beispielsweise
Stickstoff oder Sauerstoff. Heterocyclische Gruppen können gesättigt oder
ungesättigt
sein und heterocyclische Gruppen, wie etwa Pyrrol und Furan können aromatischen
Charakter aufweisen. Sie beinhalten anilierte Ringstrukturen, wie etwa
Chinolin und Isochinolin. Andere Beispiele heterocyclischer Gruppen
beinhalten Pyridin und Purin. Heterocyclische Gruppen können ebenso
an einem oder mehreren konstituierenden Atomen substituiert sein
mit beispielsweise einem Halogen, einem Niederalkyl, Niederalkenyl,
Niederalkoxy, Niederalkylthio, Niederalkylamin, Niederalkylcarboxyl,
Nitro, Hydroxyl, -CF3, -CN oder dergl.
-
Der
Begriff "aromatische
Gruppe" soll ungesättigte cyclische
Kohlenwasserstoffe, die einen oder mehrere Ringe beinhalten, umfassen.
Aromatische Gruppen beinhalten 5- und 6-gliedrige einfache Ringstrukturen, die
0 bis 4 Heteroatome enthalten können,
beispielsweise Benzol, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol,
Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin und
dergl. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren der Ringpositionen
mit beispielsweise einem Halogen, einem Niederalkyl, Niederalkenyl, Niederalkoxy,
Niederalkylthio, Niederalkylamin, Niederalkylcarboxyl, Nitro, Hydroxyl,
-CF3, -CN oder dergl. substituiert sein.
-
Die
therapeutische Verbindung der Erfindung kann in einem pharmazeutisch
akzeptablen Träger
verabreicht werden. Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch akzeptabler Träger" beinhaltet jegliche
und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und Antipilzmittel,
isotonische und absorptionsverzögernde
Mittel, und dergl., die mit der Aktivität der Verbindung kompatibel
sind und für
das Subjekt physiologisch akzeptabel sind. Ein Beispiel eines pharmazeutisch
akzeptablen Trägers
ist gepufferte normale Salzlösung
(0,15 molare NaCl). Die Verwendung derartiger Medien und Mittel
für pharmazeutisch
akzeptable Substanzen ist auf diesem Gebiet wohl bekannt. Abgesehen
von dem Fall, dass irgendwelche konventionellen Medien oder Mittel
mit der therapeutischen Verbindung inkompatibel sind, wird die Verwendung
davon in den für
die pharmazeutische Verabreichung geeigneten Zusammensetzungen in
Betracht gezogen. Zusätzliche aktive
Verbindungen können
in die Zusammensetzungen ebenso eingearbeitet werden.
-
Ein
sulfoniertes Polymer ist Poly(vinylsulfonsäure) (PVS). PVS kann ein Molekülgewicht
von ungefähr 800
bis 1.000 Dalton aufweisen.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Propan-1,3-disulfonsäure, und
pharmazeutisch akzeptable Salzen davon.
-
Erfindungsgemäß kann die
Amyloidablagerung in einem Subjekt durch Verabreichung einer therapeutischen
Verbindung der Erfindung an das Subjekt inhibiert werden. Der Begriff
Subjekt soll lebende Organismen, in denen Amyloidose auftreten kann,
umfassen. Beispiele von Subjekten beinhalten Menschen, Affen, Kühe, Schafe,
Ziegen, Hunde, Katzen, Mäuse,
Ratten und transgene Arten davon. Verabreichung von Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung an ein zu behandelndes Subjekt kann unter
Verwendung bekannter Verfahren durchgeführt werden mit Dosierungen
und über
Zeitdauern, die zur Inhibierung der Amyloidablagerung in dem Subjekt
wirksam sind. Eine wirksame Menge der therapeutischen Verbindung,
die zur Erzielung der therapeutischen Wirkung erforderlich ist,
kann in Abhängigkeit
von Faktoren wie etwa der bereits abgelagerten Menge an Amyloid
am klinischen Ort im Subjekt, dem Alter, Geschlecht und Gewicht
des Subjekts, und der Eignung der therapeutischen Verbindung zur
Inhibierung der Amyloidablagerung im Subjekt variieren. Dosierungsschemata
können
für die
Erzielung einer optimalen therapeutischen Antwort angepasst werden.
Beispielsweise können
mehrere aufgeteilte Dosen täglich
verabreicht werden oder es kann die Dosis proportional gemäß den Anforderungen
der therapeutischen Situation reduziert werden. Ein nicht-beschränkendes
Beispiel eines effektiven Dosierungsbereiches für eine therapeutische Verbindung
der Erfindung (z.B. Poly(vinylsulfonatnatriumsalz)) liegt zwischen
5 und 500 mg/kg an Körpergewicht/Tag.
-
Wie
durch die Beispiele gezeigt, sind die therapeutischen Verbindungen
der Erfindung bei oraler Verabreichung wirksam. Entsprechend ist
die orale Verabreichung eine bevorzugte Verabreichungsroute. Alternativ
kann die aktive Verbindung (d.h., die therapeutische Verbindung,
die Amyloidablagerung inhibieren kann) durch andere geeignete Routen,
wie etwa subkutan, intravenös,
intraperitoneal, etc. verabreicht werden (z.B. durch Injektionen).
Abhängig
von der Verabreichungsroute kann die aktive Verbindung durch ein
Material beschichtet sein, um die Verbindung vor der Wirkung von
Säuren
und anderen natürlichen
Bedingungen, die die Verbindung inaktivieren können, zu schützen.
-
Zur
Verabreichung der therapeutischen Verbindung durch von der parenteralen
Verabreichung verschiedene Wege kann es erforderlich werden, die
Verbindung mit einem Material zur Verhinderung von dessen Deaktivierung
zu beschichten oder damit gemeinsam zu verabreichen. Beispielsweise
kann die therapeutische Verbindung an ein Subjekt in einem geeigneten
Träger,
beispielsweise Liposomen oder einem Verdünnungsmittel, verabreicht werden.
Pharmazeutisch akzeptable Verdünnungsmittel
beinhalten Salzlösung
und wässrige
Pufferlösungen.
Liposomen beinhalten Wasser-in-Öl-in-Wasser
CGF Emulsionen, wie auch konventionelle Liposomen (Strejan et al.,
(1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
-
Die
therapeutische Verbindung kann auch parenteral oder intraperitoneal
verabreicht werden. Dispersionen können in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycolen,
Mischungen davon und in Ölen
hergestellt werden. Unter normalen Bedingungen der Lagerung und
Verwendung können
diese Präparate
ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen
zu verhindern.
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die geeignet sind zur Verwendung durch Injektion,
beinhalten sterile wässrige
Lösungen
(soweit wasserlöslich)
oder Dispersionen und sterile Pulver zur extemporierten Herstellung
steriler injizierbarer Lösungen
oder Dispersionen. In allen Fällen
muss die Zusammensetzung steril und flüssig sein in dem Maße, dass
einfache Spritzbarkeit vorliegt. Sie muss unter den Bedingungen
der Herstellung und Lagerung stabil sein und gegen die kontaminierende
Wirkung von Mikroorganismen, wie etwa Bakterien und Pilzen, geschützt sein.
Der Träger
kann ein Lösungsmittel
oder ein Dispersionsmedium sein, enthaltend beispielsweise Wasser,
Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol
und dergl.), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle. Die
geeignete Fluidität
kann aufrechterhalten werden beispielsweise durch Verwendung einer
Beschichtung, wie etwa Lecithin, durch die Aufrechterhal tung einer
erforderlichen Partikelgröße im Falle
einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden. Die Verhinderung
der Wirkung von Mikroorganismen kann erzielt werden durch verschiedene
antibakterielle Mittel und Antipilzmittel, beispielsweise Parabene,
Chlorobutanol, Phenol, Ascorbinsäure,
Thimerosal und dergl. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein,
isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid oder Polyalkohole,
wie etwa Mannitol und Sorbitol, in der Zusammensetzung zu beinhalten.
Verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erzielt werden
durch Beinhalten in der Zusammensetzung eines Mittels, welches die
Absorption verzögert,
beispielsweise Aluminiummonostearat oder Gelatine.
-
Steril
injizierbare Lösungen
können
hergestellt werden durch Einarbeiten der therapeutischen Verbindung
in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder
einer Kombination von oben aufgezählten Bestandteilen, nach Bedarf,
gefolgt von Sterilisation durch Filtration. Im allgemeinen werden
Dispersionen hergestellt durch Einarbeiten der therapeutischen Verbindung
in einen sterilen Träger,
enthaltend ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen
anderen aus den oben aufgezählten
Bestandteilen. Im Falle steriler Pulver zur Herstellung steriler
injizierbaren Lösungen
sind die bevorzugten Verfahren der Herstellung Vakuumtrocknen und
Gefriertrocknung, das ein Pulver des aktiven Bestandteils (d.h.,
der therapeutischen Verbindung) plus jeglicher zusätzlicher
gewünschter
Bestandteile ergibt, ausgehend von einer vorher steril-gefilterten
Lösung
davon.
-
Die
therapeutische Verbindung kann oral verabreicht werden, beispielsweise
mit einem inerten Verdünnungsmittel
oder einem assimilierbaren essbaren Träger. Die therapeutische Verbindung
und andere Bestandteile können
auch in einer Gelatinekapsel mit harter oder weicher Schale eingeschlossen
sein, in Tablettenform gepresst sein oder direkt in die Nahrung
des Subjekts eingearbeitet werden. Zur oralen therapeutischen Verabreichung
kann die therapeutische Verbindung mit Auszugsmitteln eingearbeitet
und verwendet werden in Form von essbaren Tabletten, Lutschtabletten,
Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Plättchen und
dergl. Der Prozentsatz der therapeutischen Verbindung in den Zusammensetzungen
und Präparaten
kann natürlich
variiert werden. Die Menge an therapeutischer Verbindung in derartigen
therapeutisch geeigneten Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete
Dosierung erhalten wird.
-
Es
ist besonders vorteilhaft, die parenteralen Zusammensetzungen in
Form von Dosiereinheiten zur einfachen Verabreichung und Gleichförmigkeit
der Dosierung zu formulieren. Die hier verwendet Form von Dosiereinheiten bezieht
sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosiereinheiten
für die
zu behandelnden Subjekte geeignet sind; jede Einheit, enthaltend
eine vorbestimmte Menge an therapeutischer Verbindung, die berechnet
wurde zur Erzielung des gewünschten
therapeutischen Effekts, zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen
Träger.
Die Spezifizierung der Form der Dosiereinheiten der Erfindung wird
bestimmt durch und ist direkt abhängig von (a) den speziellen
Eigenschaften der therapeutischen Verbindung und der besonderen
zu erzielenden therapeutischen Wirkung, und (b) den auf diesem Gebiet
der Einarbeitung derartiger therapeutischer Verbindungen zur Behandlung
von Amyloidablagerungen in Subjekten inhärenten Limitierungen.
-
Die
Zusammensetzung der Erfindung ist geeignet zur Behandlung von Amyloidose,
die mit jeglicher Krankheit, bei der Amyloidablagerung auftritt,
assoziiert ist. Klinisch kann Amyloidose primär, sekundär, familiär oder isoliert sein. Amyloidose
kann durch die Art des im Amyloid enthaltenen amyloidogenen Proteins
kategorisiert werden. Nicht-beschränkende Beispiele von Amyloiden,
die inhibiert werden können,
sind gemäß Identifizierung
durch deren amyloidogenes Protein, wie folgt (mit der damit zusammenhängenden
Krankheit in Klammern nach dem amyloidogenen Protein): β-Amyloid
(Alzheimer, Down-Syndrom, erbliche cerebrale Hämmorrage mit Amyloidose [niederländisch]);
Amyloid A (reaktive [sekundäre]
Amyloidose, familiäres
mediterranes Fieber, familiäres
Amyloidnephrophathie mit Urticaria und Taubheit [Muckle-Wells-Syndrom]);
Amyloid-κ-L-Kette
oder Amyloid-λ-L-Kette
(idiopathisch [primär],
Myelom- oder Macroglobulinämie-assoziiert);
Aβ2M (chronische
Hämodialyse);
ATTR (familiäre
Amyloid-Polyneuropathie [portogisisch, japanisch, schwedisch], familiäre Amyloidkardiomyopathie
[dänisch},
isolierte Cardioamyloidose, systemische senile Amyloidose); AIAPP
oder Amylin (im Erwachsenenalter auftretende Diabetes, Insulinome);
atrialer naturetischer Faktor (isoliertes atriales Amyloid); Procalcitonin
(medullares Thyroidkarzinom); Gelsolin (familiäre Amyloidose [finnisch]);
Cystatin C (erbliche cerebrale Hämorrhagie
mit Amyloidose [isländisch]);
AApoA-I (familiäre
amyloidotische Polyneurophatie [Iowa]); AApoA-II (beschleunigte
Seneszenz in Mäusen);
Fibrinogen-assoziiertes Amyloid; Lysozym-assoziiertes Amyloid und
AScr oder PrP-27 (Traberkrankheit (Scrapie), Creutzfeld-Jacob-Syndrom, Gerstmann-Straussler-Scheinker-Syndrom,
bovine spongiforme Encephalitis (Rinderwahnsinn)).
-
In
der Erfindung ist Kongorot von den in der Erfindung eingesetzten
sulfonierten Verbindungen ausgeschlossen.
-
In
der Erfindung sind die folgenden sulfatierten Verbindungen von der
Verwendung in der Erfindung ausgeschlossen: Dextransulfat 500, ι-Carrageen, λ-Carrageen,
Dextransulfat 8, κ-Carrageen,
Pentosanpolysulfat und/oder Heparan.
-
In
gewissen Ausführungsformen
der Erfindung können
die Zusammensetzungen der Erfindung zur Inhibierung von Amyloidablagerungen
bei Amyloidose verwendet werden, worin das amyloidogene Protein
nicht die Protease-resistente Form eines Prionenproteins, AScr (ebenso
bekannt als PrP-27) ist.
-
Die
Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele erläutert, die
nicht als den Gegenstand der Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollten.
-
BEISPIELE
-
In
den folgenden Beispielen wurde ein gut charakterisiertes Mausmodell
der Amyloidose eingesetzt. In diesem in vivo System erhalten die
Tiere einen Entzündungs-Stimulus
und einen Amyloid-verstärkenden Faktor.
Für akute
Amyloidose (d.h., kurzzeitige Amyloidablagerung) ist der Entzündungs-Stimulus AgNO3. Für chronische
Amyloidose (fortschreitende Amyloidablagerung) ist der Entzündungs-Stimulus
Lipopolysaccharid (LPS). Amyloidablagerung (AA Amyloid) in der Milz
von Mäusen
wurde mit und ohne therapeutische Behandlung gemessen.
-
EXPERIMENT 1 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
TIERE
-
Alle
Mäuse waren
vom CD-Stamm (Charles Rivers, Montreal, Quebec) und wogen 25 bis
30 g.
-
TIERBEHANDLUNG
-
Alle
Tiere erhielten AgNO3 (0,5 ml, 2%ige Lösung) subkutan
in den Rücken
sowie Amyloid-verstärkenden
Faktor (AEF) 100 μg
intravenös.
Die Herstellung des Amyloid-verstärkenden Faktors wurde bereits
früher in
Axelrad, M.A. et al. ("Further
Characterization of Amyloid Enhancing Factor" Lab. Invest. 47:139–146 (1982)) beschrieben. Die
Tiere wurden in verschiedene Gruppen aufgeteilt, von denen eines
eine unbehandelte Kontrollgruppe war, die 6 Tage später geopfert
wurde. Die verbleibenden Tiere wurden in jene aufgeteilt, die 50 mg,
40 mg, 20 mg oder 10 mg Poly(vinylsulfonsäurenatriumsalz) (PVS) durch
intraperitoneale Injektion alle 12 Stunden oder 73 mg oder 36,5
mg Sucroseoctasulfatammoniumsalz (SOA) alle 8 Stunden durch IP-Injektion erhielten. Überlebende
Tiere wurden am 5. Tag der Behandlung geopfert. In alle Fällen war
PVS oder SOA in einem sterilen wässrigen
Träger
gelöst.
-
GEWEBEPRÄPARATION
-
Am
Ende der Experimente wurden die Tiere durch Halswirbeldislokation
geopfert und die Milz, Leber und Niere wurden in 96 % Ethanol, 1
% Eisessig und 3 % Wasser fixiert, wie in Lyon, A.W. et al. ("Co-deposition of
Basement Membrane Components During the Induction of Murine Splenic
AA Amyloid" Lab.
Invest. 64:785–790
(1991)) beschrieben. Nach der Fixierung wurden die Gewebe in Paraffin
eingebettet, 8 bis 20 μm-Sektionen
wurden geschnitten und mit Kongorot ohne Gegenfärbung gefärbt, wie in Puchtler, H. et
al. ("Application
of Thiazole Dyes to Amyloid Under Conditions of Direct Cotton Dyeing:
Correlation of Histochemical and Chemical Data" Histochemistry 77:431–445 (1983))
beschrieben. Die histologischen Schnitte wurden unter polarisiertem
Licht betrachtet und mittels Bildanalyse hinsichtlich des durch
Amyloid besetzten Prozentsatzes an Milz beurteilt. Im Falle der
Experimente mit Sucroseoctasulfat wurden die Gewebe immunogefärbt mit einem
Antikörper
auf das SAA-Protein (beschrieben in Lyon A.W. et al. Lab. Invest.
64:785–790
(1991)) und die immungefärbten
Sektionen wurden beurteilt durch Bildanalyse hinsichtlich des Prozentsatzes
an von dem Amyloid eingenommenen Gewebebereich.
-
LEBENSFÄHIGKEIT
DER TIERE
-
Alle
Kontrolletiere überlebten
das Experiment ohne Vorkommnisse. Im Falle der eine Therapie erhaltenden
Tiere erlagen alle 73 mg/Injektion an Sucroseoctasulfat erhaltenden
Tiere vor Ende des Experiments der Therapie. Alle der 36,5 mg an
Sucroseoctasulfat/Injektion erhaltenden Tiere überlebten. Von den PVS (Molekulargeweicht
900 bis 1.000) erhaltenden Tieren in jeder Dosierungsgruppe, erlagen
etwa die Hälfte
bis ein Drittel aller Tiere vor Ende des Experiments der Therapie.
In allen Fällen
des Sterbens von Tieren vor dem Ende des Experiments war die Todesursache
unkontrollierte intraperitoneale Hämorrhagie.
-
WIRKUNGEN VON MITTELN
AUF DIE AMYLOIDABLAGERUNG
-
Die
Wirkung von Sucroseoctasulfat bei 36,5 mg/Injektion ist nachfolgend
in Tabelle 1 dargestellt. Die mittlere durch Amyloid eingenommene
Fläche
der Milz in den Kontrolltieren betrug 7,8 % ± 1,5 % S.E.M. In den die
therapeutischen Mittel erhaltenden Tieren betrug die mittlere Fläche 3,2
% ± 0,5
% S.E.M. Der Unterschied ist bei p ≤ 0,02 signifikant.
-
TABELLE
1 WIRKUNG
VON SUCROSEOCTASULFATAMMONIUMSALZ AUF AA AMYLOIDABLAGERUNG IN DER MILZ
DER MAUS
-
Im
Falle von PVS sind die Daten in 1 dargestellt.
Es gab eine tiefgreifende Inhibierung der Amyloidablagerung bei
allen Dosierungen mit einem Hinweis auf einen Dosis-abhängigen Effekt.
Ein wirksamer Dosierungsbereich liegt zwischen 5 und 500 mg/kg an
Körpergewicht/Tag.
-
Vorläufige Beurteilung
des Plasmaspiegels des Vorläufers
von Entzündungs-assoziierter
Amyloidose, SAA, hat gezeigt, dass kein Unterschied besteht zwischen
den PVS behandelten Tieren und den unbehandelten Tieren.
-
Es
wird angenommen, dass das Verfahren der Verabreichung der Mittel
der vorliegenden Erfindung eine Wirkung auf die Sterblichkeitsrate
der Tiere hatte. Intraperitoneale Injektion wurde ausgewählt, da
sie eine große
Membranoberfläche
bietet für
einen leichten Zugang zum Kreislaufsystem. Wie Heparan zeigen die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung jedoch Anti-Koagulanzeigenschaften.
Wiederholte Injektionen durch das Bauchfell induzierten ernste Hämorrhagien
und führten
schlussendlich zu dem Füllen
der Bauchhöhle,
wobei der Blutverlust den Tod verursachte. Während subkutane Injektion zu
niedrigerer Absorption der aktiven Verbindung führen würde, ist es weniger wahrscheinlich,
dass diese Route in so einem Ausmaß zu Hämorrhagien führen würde, dass
dies den Tod verursachen würde.
Orale Verabreichung der Verbindungen wurde in den nachfolgenden
Experimenten durchgeführt
(siehe unten).
-
EXPERIMENT 2 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
Schweizer
weiße
Mäuse mit
einem Gewicht von 25 bis 30 g wurden Amyloid-verstärkender
Faktor (AEF) und AgNO3, wie früher beschrieben
(Kisilevsky, R. und Boudreau, L. (1983) "The kinetics of amyloid deosition: I.
The effect of amyloid enhancing factor and splenectomy" Lab. Invest., 48,
53–59)
beschrieben, verabreicht, um Amyloidose zu induzieren. Vierundzwanzig
(24) Stunden später
wurden sie in drei Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe diente als Kontrolle
und wurde mit einem Standardlabormäusefutter und Leitungswasser zur
freien Verfügung
gehalten. Eine zweite Gruppe erhielt das Standardfutter, aber deren
Wasser enthielt 20 mg/ml Poly(vinylsulfonat)natriumsalz (PVS). Die
dritte Gruppe hatte 50 mg/ml an PVS in ihrem Trinkwasser. Die Flüssigkeitsaufnahme
in beiden Gruppen war dieselbe. Alle Tiere wurden am Tage sechs
(6) des Experiments geopfert, ihre Milz wurde gesammelt, zum Schneiden
präpariert,
Milzsektionen wurden gefärbt
mit Kongorot (Puchtler, H., et al. (1983) "Application of Thiazole Dyes to Amyloid
under Conditions of Direct Cotton Dyeing: Correlation of Histochemical
and Chemical Data" Histochemistry,
77, 431–445),
und die prozentuale Fläche,
die durch Amyloid eingenommen wurde, wurde mit Hilfe eines Bildanalyseapparats
und -programmes (MCID M2, Imaging Research Inc., Brock University,
St. Catherines, Ontario, Canada) beurteilt. Wie in 4 dargestellt,
greift die orale Verabreichung von PVS in die Amyloidablagerung
in einer dosisabhängigen
Weise ein.
-
EXPERIMENT 3 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
Da
es möglich
war, dass PVS die hepatische Synthese des Amyloidvorläufers inhibierte
und somit die Abwesenheit der Ablagerung von Amyloid durch die Abwesenheit
des Vorläufer-Pools
verursacht wurde, wurde die Wirkung von PVS auf den Blutspiegel
des Amyloidvorläufers
(SAA) während
des Verlaufs des Experiments bestimmt. Die Tiere erhielten AEF +
AgNO3, wie oben beschrieben, und wurden
in zwei Gruppen aufgeteilt. Gruppe 1 erhielt keine weitere Behandlung.
24 Stunden später
erhielt Gruppe 2 50 mg an PVS durch intraperitoneale Injektion alle
12 Stunden über
eine Zeitdauer von 5 Tagen. Um den Spiegel an SAA während dieses
Verfahrens darzustellen, wurde jedem Tier (Kontrolltiere und Versuchstiere)
täglich
Blut aus dem Schwanz (≈25 μl) abgenommen.
Die SAA-Spiegel in diesen Proben wurden durch eine Festphasen-ELISA-Prozedur
(beschrieben in Brissette, L., et al. (1989) J. Biol. Chem., 264,
19327–19332)
bestimmt. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Die offenen Kreise stellen die Daten der PVS-behandelten Mäuse dar,
während
die Dreiecke die Daten der nicht-behandelten Tiere darstellen. Die
SAA-Spiegel waren in behandelten und unbehandelten Tieren äquivalent,
was zeigte, dass PVS seine Wirkung nicht durch eine Prävention
der Synthese von SAA erzielt.
-
EXPERIMENT 4 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
In
den oben beschriebenen Experimenten wurde die Therapie mit PVS bei
24 Stunden im Laufe des Amyloid-Induzierungsprotokolls begonnen.
Dies ahmt nicht eine klinische Situation nach, bei der der Patient üblicherweise
wohl ausgebildetes Amyloid aufweist. Um eine realistischere klinische
Situation nachzustellen, wurde ein separater Satz an Experimenten
durchgeführt,
bei denen die PVS-Behandlung begonnen wurde, nachdem die Amyloidablagerung
bereits begonnen hatte. Die Tiere erhielten AEF + AgNO3,
wie oben beschrieben, blieben auf Leitungswasser über 7 Tage,
nachdem sie in zwei Gruppen aufgeteilt wurden. Gruppe 1 blieb auf
Standardnahrung und Leitungswasser. Gruppe 2 blieb auf Standardnahrung,
aber hatte 50 mg/ml an PVS, das ihrem Trinkwasser zugegeben wurde.
Zur Beurteilung der Wirkung von PVS auf den Verlauf der Amyloidablagerung
nach bereits vorliegendem Amyloid wurden 5 Tiere in jeder Gruppe
an den Tagen 7, 10, 14 und 17 geopfert. Die Milz wurde bearbeitet
und ausgewertet wie oben beschrieben. Die Daten sind in 6 dargestellt.
Vergleichstiere (Dreiecke) fuhren fort in der Amyloid ablagerung über 14 Tage,
nach denen die Menge an Amyloids abzunehmen begann. Diese spätere Abnahme
ist höchstwahrscheinlich
bedingt durch die Tatsache, dass lediglich eine Injektion von AgNO3, dem Entzündungs-Stimulus, verabreicht
wurde und nach 14 Tagen der SAA-Spiegel bekannterweise abnimmt (Kisilevsky,
R., Boudreau, L. und Foster, D. (1983) "Kinetics of amyloid deposition. II.
The effects of dimethylsulfoxide and colchicin therapy" Lab. Invest., 48,
60–67).
In der Abwesenheit von Vorläufer
kann kein weiteres Amyloid abgelagert werden und existierende Ablagerungen
werden mobilisiert (Kisilevsky, R. und Boudreau, L. (1983) "The kinetics of amyloid
deposition: I. The effect of amyloid enhancing factor and splenectomy" Lab. Invest., 48,
53–59).
Im Gegensatz hierzu hörte
die Amyloidablagerung in der Gruppe der behandelten Tiere innerhalb
von 3 Tagen nach der Verabreichung von PVS auf. Dies zeigt, dass
PVS zur Inhibierung fortschreitender Ablagerung von Amyloid wirksam
ist.
-
EXPERIMENT 5 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
Um
die Entzündung
und den Blut-SAA-Spiegel aufrechtzuerhalten und eine kontinuierliche
Ablagerung von Amyloid über
die Dauer eines längeren
Experiments zu gewährleisten,
wurde die Art des Entzündungsstimulus
geändert.
Um die Entzündung
aufrechtzuerhalten erhielten die Tiere Lipopolysaccharid (LPS, 20 μg) + AEF
am Tag 0 und LPS wurde durch intraperitoneale Injektion an jedem
2. Tag verabreicht. Am Tag sieben (7) wurden die Tiere in zwei Gruppen
aufgeteilt, wie in Experiment 4 beschrieben. Die Auswertung von Amyloid über den
Verlauf des Experiments erfolgte wie im Experiment 4 beschrieben.
Die Daten sind in 7 dargestellt. Die Kontrollgruppe
(Dreiecke) zeigte kontinuierliche Amyloidablagerung über die
gesamte 17-tägige
Zeitdauer. Jene, die PVS erhielten, stoppten die Amyloidablagerung
offenbar am Tag 14 (offene Kreise und gestrichelte Linie). Die Daten
am Tag 17 repräsentieren
4 Tiere pro Gruppe, da ein Tier aus dieser Zeitperiode weggelassen
wurde. Die Menge an Amyloid in diesem besonderen Individuum war
so weit von allen anderen Datenpunkten entfernt (behandelt oder
unbehandelt betrug sie 21 %), dass angenommen wird, dass dies eine statistisch
richtige Prozedur war. Falls dieses Individuum mit einbezogen wird,
ist die Kurve durch die gestrichelte Linie und den verbleibenden
offenen Kreis repräsentiert.
Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die PVS-erhaltenen Tiere
begonnen, eine ausgeprägte
Diarrhö im
Verlaufe des Experiments zu entwickeln.
-
EXPERIMENTE 6 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
In
diesem Experiment wurde eine andere sulfonierte Verbindung, Ethanmonosulfonat,
zur Inhibierung der Amyloidose eingesetzt. Ethanmonosulfonat, Natriumsalz,
(EMS) ist strukturell die Monomereinheit von PVS. Den Tieren wurde
wie in Beispiel 5 LPS + AEF verabreicht, aber am Tag 7 EMS als therapeutisches
Mittel im Trinkwasser eingesetzt. Am Tag 7 wurden die Tiere in drei
Gruppen aufgeteilt. In Gruppe 1 war die unbehandelte Gruppe. Gruppe
2 erhielt 2,5 mg/ml EMS in ihr Trinkwasser. Gruppe 3 erhielt 6 mg/ml
in ihr Trinkwasser. Die Tiere wurden an den Tagen 7, 10, 14 und
17 geopfert. Diese Tiere entwickelten keine gastrointestinalen Probleme.
Diese Daten sind in 8 dargestellt. Die 6 mg/ml EMS
in ihrem Trinkwasser erhaltenden Tiere (offene Quadrate) hörten auf
Amyloid nach dem Tag 14 abzulagern. Jene, die 2,5 mg/ml EMS erhielten
(offene Kreise) schienen einen unvollkommenen therapeutischen Effekt
aufzuweisen, mit einer kleinen Verringerung in der Rate der Amyloidablagerung
am Tag 14, die nicht bis zum Tag 17 aufrechterhalten wurde.
-
EXPERIMENTE 7 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
Die Wirkung von PVS auf
die Bindung von HSPG an das Alzheimer Amyloid-Vorläufer-Protein
(Beta-APP)
-
Die
Bindung von Heparansulfatproteoglycan an beta-APP wurde beurteilt
unter Verwendung einer enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay-Technik,
wie in Narindrasorasak, S. et al. ("High Affinity Interactions Between the
Alzheimer's Beta-Amyloid
Precursor Proteins and the Basement Membrane From of Heparan Sulfate
proteoglycan" J.
Biol. Chem. 266:12878–12883
(1991)) beschrieben. Polystyrol-Mikrotiterplatten (Linbro, Flow
Laboratories) wurden mit einer 100 μl-Lösung, 1 μg/ml an β-APP, in 20 mM NaHCO3-Puffer, pH 9,6 beschichtet. Nach der Inkubierung über Nacht
bei 4°C
wurden die Platten mit 0,15 M NaCl, 20 mM Tris-Cl, pH 7,5 (TBS)
gewaschen. Die Platten wurden anschließend mit 150 μl an 1 %
Bovine-Serum-Albumin (BSA) in TBS über 2 Stunden bei 37°C inkubiert
unter Blockierung der verbleibenden hydrophoben Oberfläche der
Mulden. Nach Waschen mit TBS, enthaltend 0,05 % (w/v) an Tween 20
(TBS-Tween), 100 μl
an verschiedenen Konzentrationen von HSPG in TBS-Tween wurden einzeln
oder mit 500 μg/ml
an PVS zugegeben, entweder in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS)
oder Phosphat-gepufferter Salzlösung
(PBS), wurde in den Bindungsassay aufgenommen zur Beurteilung der
Wirkung von PVS auf die HSPG-Bindung an β-APP. Die Platten wurden über Nacht
bei 4°C
gelassen, um maximale Bindung von HSPG an β-APP zu gestatten. Die Platten
wurden anschließend
extensiv gewaschen und über
2 Stunden bei 37°C
mit 100 μl
Anti-HSPG, verdünnt
in TBS-Tween, enthaltend 0,5 % BSA, inkubiert. Die Platten wurden
wiederum gewaschen und über
weitere 2 Stunden mit 100 μl
Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase
(1:2.000 Verdünnung) in
TBS-Tween, enthaltend BSA, wie oben, inkubiert. Schließlich, nach
weiterem Waschen, wurden die gebundenen Antikörper durch Zugabe einer alkalischen
Phosphatasesubstratlösung
(100 μl),
enthaltend 2 mg/ml p-Nitrophenylphosphat,
0,1 mM ZnCl2, 1 mM MgCl2 und
100 mM Glycin, pH 10 detektiert. Die Platten wurden über 15 bis
120 Minuten bei Raumtemperatur gelassen. Die Enzymreaktion wurde
durch Zugabe von 50 μl
an 2 M NaOH gestoppt. Die Absorption des freigesetzten p-Nitrophenyls
wurde bei 405 nm mit einem Titertek Multiscan/MCC 340 (Flow Laboratories)
gemessen. Die Mengen an gebundenem HSPG wurden durch die Nettoabsorption
A405 nach Subtraktion der Absorption von
Vergleichsmulden, bei denen der HSPG-Inkubierungsschritt ausgelassen
wurde, bestimmt. Die Wirkung von PVS auf HSPG: beta-APP-Bindung ist in 2 (in
TBS) und in 3 (in PBS) dargestellt. Etwa
30 bis 50 % Inhibierung der Bindung wird mit dieser Verbindung gezeigt.
-
EXPERIMENT 8 (VERGLEICHSBEISPIEL)
-
Akute
Amyloidose wurde in Mäusen
mit AgNO3 und Amyloid-verstärkendem
Faktor, wie in Experiment 2 beschrieben, erzeugt. Vierundzwanzig
Stunden später
wurden die Tiere in eine Kontrollgruppe und sechs Testgruppen aufgeteilt.
Die Kontrollgruppe wurde auf Standardlabormausfutter und Trinkwasser
zur freien Verfügung
gehalten. Die Testgruppen erhielten Standardfutter, aber ihr Trinkwasser
enthielt 50 μM
von einer der folgenden sechs Verbindungen: Ethansulfonsäurenatriumsalz,
2-Amino-ethansulfonsäurenatriumsalz
(Taurin), Propan-1-sulfonsäurenatriumsalz,
Ethan-1,2-disulfonsäurenatriumsalz,
Propan-1,3-disulfonsäurenatriumsalz oder
Butan-1,4-disulfonsäurenatriumsalz.
Die Wasseraufnahme war für
alle Gruppen ungefähr
gleich. Nach sechs Tagen wurden die Tiere geopfert und ihre Milz
wurde, wie in Experiment 2 beschrieben, verarbeitet. Für eine vorläufige Analyse
wurden die Milzschnitte visuell unter einem Mikroskop examiniert
hinsichtlich Differenzen in der Amyloidablagerung in den behandelten
Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren.
-
Die
Ergebnisse zeigten, dass die mit Propan-1-sulfonsäurenatriumsalz,
Ethan-1,2-disulfonsäurenatriumsalz
oder Propan-1,3-disulfonsäurenatriumsalz
behandelten Tiere weniger Amyloidablagerung aufwiesen als die Vergleichstiere.
Unter diesen akuten Amyloidosebedingungen konnte bei den mit Ethansulfonsäurenatriumsalz,
Taurinnatriumsalz oder Butan-1,4-disulfonsäurenatriumsalz behandelten
Tieren nicht beobachtet werden, dass sie weniger Amyloidablagerung
aufwiesen als die Kontrolltiere. Diese Verbindungen können jedoch
unter anderen Bedingungen Wirksamkeit aufweisen, beispielsweise
wurde beobachtet, dass Ethansulfonsäurenatriumsalz chronische Amyloidablagerungen
inhibiert (siehe Experiment 6).
-
Dieses
Experiment deutet darauf hin, dass die orale Verabreichung von sulfonierten
niederen Aliphaten, wie etwa Propan-1-sulfonsäurenatriumsalz, Ethan-1,2-disulfonsäurenatriumsalz
und Propan-1,3-disulfonsäurenatriumsalz
in einem akuten amyloidogenen System die Amyloidablagerung inhibieren
kann.
-
ÄQUIVALENTE
-
Der
Fachmann wird zu den hier beschriebenen spezifischen Prozeduren
eine Vielzahl von Äquivalenten
erkennen oder unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten
feststellen. Derartige Äquivalente
werden als im Rahmen der Erfindung gemäß den nachfolgenden Ansprüchen angesehen.