CZ281193B6 - Imunoglobulinový konjugát a způsob jeho přípravy a farmaceutický přípravek, který jej obsahuje - Google Patents
Imunoglobulinový konjugát a způsob jeho přípravy a farmaceutický přípravek, který jej obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ281193B6 CZ281193B6 CS881612A CS161288A CZ281193B6 CZ 281193 B6 CZ281193 B6 CZ 281193B6 CS 881612 A CS881612 A CS 881612A CS 161288 A CS161288 A CS 161288A CZ 281193 B6 CZ281193 B6 CZ 281193B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ida
- tumor
- antibody
- fragment
- monoclonal antibody
- Prior art date
Links
- 0 *C*1(*C1)C(OC(C**1)C1*=C)S Chemical compound *C*1(*C1)C(OC(C**1)C1*=C)S 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu přípravy imunoglobulinového konjugátu, která spočívá v tom, že a) monoklonální protilátka nebo její fragment obsahující alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky se smíchá s molárním nadbytkem 14-halogen-idarubicinu, b) směs se nechá zreagovat při teplotě 18 až 37 .sup.o.n.C, c) odstraní se jakákoliv sraženina, d) odstraní se nezreagované výchozí látky gelovou filtrací a e) volný idarubicin se odstraní adsorpční chromatografií nebo chromatografií na ionexu. Imunoglobulinové konjugáty se používají pro léčení lidí nebo zvířat trpících rakovinou nebo jsou užitečné pro vyhlazování podmnožiny T lymfocytů z populace buněk.ŕ
Description
Farmaceutický prostředek k léčení lidských nádorů obsahuje jako účinnou složku imunoglobullnový konjugát.
Tento vynález se týká imunoglobulinového konjugátu, způsobu jeho přípravy a farmaceutického prostředku jej obsahujícího
Je znám obecný koncept cílených protinádorových činidel s použitím monoklonálních protilátek (MoAb). Jeho terapeutický význam je běžně oceňován. Tento přístup zahrnuje přípravu konjugátů protilátky a toxického činidla, schopných selektivně lokalizovat a poškozovat nádorové buňky. Hlavní pozornost je směrována ke konstrukci imunotoxinů z A řetězce rostlinných a bakteriálních toxinů a protilátek, jejichž antigenová vazba a uložení uvnitř buňky vede ke smrti buňky. V praxi se používá mnoha MoAbs, o kterých se předpokládá, že jsou specifické pro nádory, reaktivních také se subpopulací normálních buněk. Z toho plyne, že může být nerealistické využívat takové silné toxiny kvůli jejich potenciálnímu poškozování normálních tkání. Bezpečnější alternativou než rostlinné toxiny je komplex protilátek s konvenčními protirakovinnými látkami (drogami), jako je například doxorubicin, Vindesin, Chlorambucil, Melphalan a Methotrexát. Vzhledem k nespecifickým toxickým účinnostem běžně používaných protinádorových činidel, byly dělány pokusy zvýšit jejich terapeutický index zkomplexováním (kopulováním) s MoAbs na nádorové antigeny.
Pokusy o potlačení snahy vypudit (odmítnout) transplantát T buněk získaných z brzliku často směřovaly ke snížení aktivity T buněk použitím antithymocytového globulinu. Nedávno, vzhledem k vývoji monoklonálních protilátek, bylo možné definovat podmnožinu T buněk podle jejich funkce in vitro a podle přítomnosti specifických povrchových antigenů definovaných MoAb (monoklonální protilátka). To stimulovalo výzkum mechanismu, kterým T buňky regulují odmítání transplantátu, soustředěním se na základní rozdělení na podmnožiny pomocných (rozpoznávacích, helper) buněk/ induktorů (inducer) (mobilizujících buněk) a cytotoxických/supresorových buněk, definovaných myšími antigeny L3T4 a Ly-2. Ačkoliv OKT3 MoAb, činidlo proti všem T-buňkám, prokázala potenci in vivo, v nedávné studii bylo zjištěno, že 20 MoAb neměly u myší na 20 různých myších lymfocytových antigenů in vivo účinek a jsou tedy pro in vivo studie neužitečné. Je proto vhodné studovat prostředky, kterými mohou tyto vysoce specifické MoAb silněji a úplněji odstraňovat své cílové buňky. Jedním takovým přístupem je používání cytotoxických látek (drog) komplexovaných s MoAb.
Klinický potenciál konjugátů droga-MoAb zahrnuje imunochemoterapii rakoviny, zmírněni různých imunoregulačních poruch a snahy těla odmítat transplantát ze stejného druhu (allograft). Mnohé studie prokázaly, že specifická cytotoxicita toxinů a drog na nádorové buňky, pokud jsou zkomplexovány s MoAb, vedla ke zvýšení antigenů asociovaných na nádor. Avšak méně důrazu bylo věnováno in vivo použití konjugátů droga-MoAb k vyhlazování T-buněk, k výzkumu Imunoregulace T buněk při snaze vypudit z těla transplantát, i když konjugáty toxin-protilátka byly intenzivně používány in vitro k vyhlazování T buněk před transplantací kostní dřeně.
Důležitou skupinou protinádorových činidel, která se používají v chemoterapii rakoviny, jsou antracykliny, z nichž doxorubicin a daunorubicin jsou účinné na pevné nádory. Zkomplexováním (kopulací) daunorubicinu a doxorubicinu s protilátkami však má za
-1CZ 281193 B6 výsledek podstatnou ztrátu aktivity drogy, pokud se zkomplexování provádí prostřednictvím aminové skupiny. Nedávno byl daunorubicin zkomplexován s MoAbs atomem uhlíku C-14 za použití bromdaunorubicinu. Tyto konjugáty vykazují účinnost in vitro. Nemají však účinnost ve studiích in vivo [Gallego a spol.: Int. J. Cencer 33, 737 až 744 (1984).]. Dále bylo dokázáno, že konjugáty deunorubicin-MoAb vykazují nespecifickou toxicitu při koncentraci vyšší než 10 μg/ml.
Autoři tohoto vynálezu zjistili, že idarubicin (4-demethoxy-daunorubicin, který zde bude dále označován Ida) se může zkomplexovat s MoAb a že tyto konjugáty mají selektivní a silnou protinádorovou účinnost in vitro i in vivo. Nespecifická toxicita konjugátů Ida-MoAb nebyla zřejmá při in vivo dávkách menších než 8,0 mg/kg. Konjugáty Ida-MoAb mají větší in vitro i in vivo účinnost, než konjugáty deunorubicin-MoAb.
Předmětem tohoto vynálezu je imunoglobulinový konjugát, obsahující antracyklin, konjugovaný s monoklonální protilátkou nebo s jejím fragmentem, obsahujícím alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky, který se vyznačuje tím, že antracyklin je idarubicin a idarubicin je konjugován v poloze C-14 s monoklonální protilátkou, specifickou pro lidský nádor, nebo s jejím fragmentem.
Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy imunoglobulinového konjugátu, který spočívá v tom, že se
a) smíchá buď monoklonální protilátka, specifická pro lidský nádor nebo její fragment, obsahující alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky s molárnim přebytkem 14-halogen-idarubicinu,
b) nechá reagovat směs při teplotě 18 až 37 °C,
c) odstraní jakákoliv sraženina,
d) odstraní nezreagované výchozí látky gelovou^filtrací a
e) odstraní volný idarubicin adsorpční chromatografií, nebo chromá tograf i í na ionexu.
Dalším předmětem vynálezu je farmaceutický prostředek, obsahující jako účinnou složku imunoglobulinový konjugát.
Ida je popsán v US patentu č. 4 077 988. Je výhodné, jestli-’ že se na každou molekulu protilátky, nebo na každou molekulu fragmentu protilátky kovalentné naváže dvě až osm molekul Ida, výhodněji dvě až šest molekul. Molekuly Ida jsou konjugovány s monoklonální protilátkou nebo s fragmentem monoklonální protilátky v poloze 14 a jsou vázány přímo.
Každá protilátka nebo fragment protilátky je specifický pro antigen na povrchu buněk, proti kterým je cílení Ida zamýšleno. Například protilátka nebo fragment protilátky může být specifický pro žádanou cílovou tkáň, jako je například lidský nádor. Příklady lidských nádorů, proti nimž může být zamýšleno cílit Ida, jsou rakoviny prsu, tračníku, plic, prostaty, vaječníků, brzlíku a ji
-2CZ 281193 B6 né typy rakovin, sarkonů a leukémií. Protilátka nebo fragment protilátky mohou být také specifické na zvířecí nádor. Lze použít protilátku nebo fragment protilátky, specifický na receptor lidského transferinu (TFR), který je přítomen při dělení buněk, v erythroidních prekurzořových buňkách a buňkách různých nádorů. Vhodná anti-TFR monoklonální protilátka se může získat proti transferinovému receptoru na buňky LiCR-LON-HMy-2 (Hmy-2).
Monoklonální protilátka nebo fragment protilátky jsou s výhodou ze stejného druhu, jako je ten, jemuž se imunoglobulinový konjugát podává. Lidská nebo myší monoklonální protilátka nebo fragment protilátky se tedy typicky používá tehdy, jestliže se konjugát má podávat lidem. Výhodné je také to, když protilátka nebo fragment protilátky je IgG třídy. Fragmentem protilátky může být fragment Fab, Fab' nebo F(ab')2. Lze používat také IgM monomer, který lze odvodit od LgM protilátky štěpením proteolytickým enzymem.
Imunoglobulinové konjugáty se podle tohoto vynálezu připravují tak, že se nechá zreagovat 14-halogen-Ida s monoklonální protilátkou nebo s jejím fragmentem. Substituentem v poloze 14 může být atom fluoru, chloru, bromu nebo jodu, s výhodou je jím však atom bromu. 14-Brom-Ida je popsán v USA pat. č. 4 125 607. Konjugace se tedy provede postupem, který sestává z:
a) smíchání monoklonální protilátky, nebo jejich fragmentu s molárním nadbytkem 14-halogen-Ida,
b) zreagovánim směsi při teplotě od 18 do 37 “C,
c) odstraněním sraženiny,
d) odstraněním nezreagovaných výchozích materiálů gelovou filtrací a
e) odstraněním adsorbované drogy (Ida) adsorpčni chromatografií nebo chromatografií na ionexu.
Stupeň (a) se typickým způsobem provádí v organickém rozpouštědle, které je mísitelné s vodou, jako je například N,N-dimethylformamid. Ve stupni (a) se s výhodou používá 14-halogen-Ida v 0 až 50-násobném molárním přebytku. Ve stupni (b) se reakce nechá probíhat po dobu 1 až 8 hodin. Typickou reakční teplotou je teplota místnosti.
Imunoglobulinové konjugáty podle vynálezu se mohou používat pro léčení lidí nebo jiných savců trpících rakovinou. Podává se therapeuticky účinné množství konjugátu. Rakovinou může být pevný nádor, ascity nebo leukemie. Lidské nádory, které lze léčit, jsou uvedeny výše. Mohou se podávat dva nebo více konjugátů, přičemž monoklonální protilátka nebo fragment protilátky v každém konjugátu má jinou specifičnost.
Konjugát se může podávat injekčné. Může se podávat parenterálné, například intravenózně. Může se podávat místné nebo přímo do nádoru. Množství konjugátu, které se pacientovi podává, závisí na různých faktorech, jako je například druh léčeného nádoru a stav pacienta. Typicky se však podává dávka od 10 do 200 mg konjugátu na m2 plochy téla pacienta. Konjugáty se mohou podávat s jinými chemoterapeutickými činidly nebo s činidly, která zvyšují účinnost konjugátů, například s vasoaktivnimi činidly nebo
-3CZ 281193 B6 s nádorovým nekrotickým faktorem.
Imunoglobulinové konjugáty se formulují jako farmaceutické prostředky s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Je možné používat jakýkoliv nosič nebo jakékoliv ředidlo, mezi vhodné nosiče a ředidla patří fyziologický solný roztok a Ringerův roztok dextrózy.
Vynález je ilustrován následujícími příklady. Pokud jde o doprovázející výkresy, obrázky 1 až 12 se týkají příkladu 1, obrázek 13 se týká příkladu 2, a obrázek 14 se týká příkladu 3. Příklad 1 zahrnuje pro srovnávací účely testy s anti-Ly-2,1 MoAb majícím specifičnost Ly-2,1 a s modelovým systémem myšího nádoru z tkáně brzlíku TTT(l) 75 NS. Podrobněji:
Obrázek 1 ukazuje strukturu antracyklinových derivátů.
Obrázek 2 představuje kopulaci Ida (idarubicinu) s anti-Ly-2.1 (0,5 mg). Je uvedena závislost počtu mol Ida na mol anti-Ly-2.1 () (levá svislá osa) a množství proteinu (·) (pravá svislá osa) jako funkce počtu nanomolů Ida v reakční směsi (vodorovná osa) .
Obrázek 3 znamená titr protilátky měřený jako % rosetu tvořících buněk (svislá osa) proti zředění protilátky (.10-1) (vodorovná osa) anti-Ly-2.1 konjugátů na ITT (1) 75NS E3 cílové buňky. Sériová zředění byla dělána s roztokem 0,5 mg/ml bud anti-Ly-2.1 (A) nebo anti-Ly-2.1 s dvěma (·) nebo osmi (o) mol Ida na mol protilátky.
Obrázek 4 ukazuje inhibiční účinek Ida () nebo Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/ mol protilátky, (·) na E3 buňky ve 24-hodinovém testu; jsou uvedena procenta inhibice inkorporace [3H] thymidinu (svislá osa) proti koncentraci Ida (M) (vodorovná osa).
Obrázek 5 ukazuje inhibiční účinek Ida(·) Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol protilátky (>) nebo Ida-anti-TFR, 5 mol Ida/mol protilátky (o) na (Ly-2+) E3 buňky v testu 30-minutové inhibice; jsou uvedena procenta inhibice inkorporace [3H] thymidinu (svislá osa) proti koncentraci Ida (M) (vodorovná osa).
Obrázek 6 ukazuje inhibiční účinek Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol protilátky (o) a konjugátu plus anti-Ly-2.1 (·) na E3 cílové buňky ve 30-minutovém testu specifičnosti; jsou uvedena procenta inhibice inkorporace [3H] thymidinu (svislá osa) proti koncentraci Ida(M) (vodorovná osa).
Obrázek 7 znamená růst E3 nádoru z tkáně brzlíku (thymus) v CBF·^ myších, kterým bylo podkožně podáno 2.106 buněk. Skupinám po 10 myších byly intravenózně podány prostředky v místě označeném šipkou: PBS (£J) , Ida, (·) , anti-Ly-2.1 (-*) , Ida-anti-TFR (o) nebo Ida-anti-Ly-2,1 (·). Je uvedena průměrná velikost nádoru v cm2 (na svislé ose) proti dnům po inokulaci (vodorovná osa). Svislé čárky znamenají + standardní chybu od průměrné hodnoty.
-4CZ 281193 B6
Obrázek 8 znamená křivku růstu individuálního nádoru u myší CBF^, jímž bylo subkutánně podáno 2,0.106 E3 nádorových buněk a které byly léčeny tak, že jim byl 4. a 5. den podán Ida-anti-Ly-2.1 konjugát. Velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa).
Obrázek 9 ukazuje růst E3 nádoru z tkáně brzlíku (thymus) u CBFj myší, jímž bylo subkutánně podáno 3,0.106 buněk. Skupiny po deseti myších byly léčeny intravenózním podáním (v místě označeném šipkou): PBS (□), anti-Ly-2.1 (·4), Ida (») nebo Ida-anti-Ly-2.1 konjugátu (·). Střední velikost národu (cm2) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci národu (vodorovná osa) .
Obrázek 10 ukazuje růst E3 nádoru z tkáně brzlíku (thymus) £ u CBF-l myší, jimž bylo subkutánně podáno 3,0.10° buněk. Skupiny po deseti myších byly protinádorově léčeny podáním (v místě označeném šipkou): PBS (D), anti-Ly-2.1 (-Λ) , Ida () nebo Ida-anti-Ly-2.1 konjugátu (·). Střední velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa) .
Obrázek 11 ukazuje růst COLO 205 lidského nádoru (štěpu z jiného druhu; xenograft) u holých myší, kterým bylo subkutánně podáno 2.106 buněk. Skupiny po deseti myších byly léčeny intravenósním podáním (v místě označeném šipkou): PBS (Δ), volného Ida (^), konjugátu Ida-250-30.6 (·), směsi Ida a 250-30.6 (0) a 250-30.6 (^) . Průměrná velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uvedena závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa). Svislé čárky znamenají + standardní chybu od průměrné hodnoty.
Obrázek 12 ukazuje individuální křivky růstu nádoru (štěpu z jiného druhu) u holých myší, kterým byl (v místech označených šipkou) intravenózné podán konjugát Ida-250-30.6. Čárkovaná čárka znamená velikost nádoru u myší léčených PBS. Velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uveden v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa).
Obrázek 13 ukazuje růst COLO 205 (30.6+, 17.1+) transplantátu z různého druhu (xerograft) u holých myší, kterým bylo injekčně podáno 8.106 buněk na myš. Skupiny po deseti myších byly léčeny intraperitoneálnim podáním (v místě označeném šipkou) PBS (a), 17.1-Ida (o), 30.6-Ida (ď) nebo směsi 30.6-Ida a 17.1-Ida (·). Průměrná velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa). Svislé čárky znamenají + standardní odchylku od průměrné hodnoty. Celková dávka byla 200 ug.
Obrázek 14 ukazuje růst transplantátu (xerograftu) LIM2210 lidského nádoru tračníku u holých myší, jimž byl implantován fragment nádoru (1 až 5 miligramů). Skupiny po deseti myších byly léčeny intravinózním podáním (v místě označeném šipkou) PBS (π),
-5CZ 281193 B6
17.1-Ida (f), JGT-13-Ida (*), 27.1-Ida («) a 30.6-Ida (o). Průměrná velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa). Svislé čárky znamenají + střední chybu od průměrné hodnoty. Celková dávka Ida byla 80
Příklad 1
Materiály a způsoby práce
Nádorové buňky
Buněčné linie sledované v této studii zahrnují (Ly-2+) myší nádor z tkáně brzlíku (thymus) ITT(l) 75NS E3 variantu (E3) [Smith a spol.: J. Netl. Cancer Inst. 76, 503 až 510 (1986).], (ly-2“, TFR”) lymfon EL4 [Horowitz a spol.: Science 160, 533 až
535 (1968)]., (TFR+) lidskou buněčnou linii CEM [Foley a spol.:
Cencer 18 linii COLO Buňky byly uchovávány in vitro v Eagle' s
Sydney, Austrálie), doplněném 10% teplem (z nově narozených telat ) wealth Sérum Laboratories, mycinu (Glaxo, Melbourn, (Commonwealth Sérum Laboratories). E3 nádor se sériovým pasážovánim v (C57BL/6xBALB/c) F-[_
522 až 529 (1965)] a (250-30.6+) lidskou buněčnou
205 [Semple et al, Cancer Res, 1978 38, 1345-1355]. médiu DME (Dulbecco's Modified medium) nebo v médiu RPMI 1640 (Flow Leboratories, inaktivovaným telecím sérem (Flow), 2 mM glutaminu (CommonSydney, Austrálie), 100 μg/ml steptoAustrálie) a 100 m.j./ml penicilinu uchovává in vivo myších (CBFj^ myši).
Buňky z ascitické kapaliny se promyji a centrifugují (400 G x 5 minut) dvakrát ve fosforečnanovém pufru (PBS), pH = 7,3, resuspendují se v PBS a subkutánní injekci (s.c) se podají do abdominální (břišní) stěny myší. Před použitím se z nich vyvinou hmatatelné nádory. Myši se pak podrobí sériím intravenózních (i.v) nebo intranádorových léčeni (i.t.). Velikost nádorů se měří denně posuvným měřítkem. Měří se podél kolmých os nádoru. Získaná data se zaznamenají - znamenají střední velikost nádoru (což je výsledkem ze dvou průměrů + průměrná chyba).
Myši
Pro práci se používaly CBA a (C57BL/6xBALB/c) myši (CBFmyši) a holé myši (nu/nu), které byly získány z Department of Pathology, University of Melbourne. V každém pokusu byly používány pokusné skupiny s 8 až 10 jedinci, všechny stejného pohlaví a stáří.
Monoklonální protilátky
Jako monoklonální protilátky byly používány (MoAb):
i) Anti-Ly-2.1 (IgGl) reaktivní s myší Ly-2.1 specificitou [Hogarth a spol: Immunology 46. 135 až 144 (1982).], ii) A3C6 (anti-TFR)/IgGl) reaktivní s lidským transferinovým receptorem (TFR) [Panaccio a spol.: Immunology and Cell 65, 461 až 472 (1987)]. a iii) protilátka označená 250 -30.6, reaktivní na anti
-6CZ 281193 B6 gen, přítomný v lidských karcinomových buňkách tračníku.
MoAb se izolují z ascitické kapaliny vysrážením 40% síranem amonným rozpuštěným v PBS a dialýzou stejným pufrem. Tyto surové preparáty se bud absorbuji na Protein-A-Sepharose (Pharmacia lne., Piscataway, New Jersey), intenzivně se promyji PBS (pH 7,3) a eluují se 0,2M glycinem/HCl (pH 2,8) nebo se nechají projít kolonou Affigel blue (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney). Po neutralizaci se monoklonální protilátky dialyzují proti PBS, rozdělí se na jednotlivé podíly a skladují se při teplotě -70 °C. A3C6 se získávají imunizací CBA myší intraperitoneálné v týdenních intervalech po dobu 3 týdnů 2.106 LiCR—LON—HMy—2-(HMy-2) buněk (OKT9+V·), odstraněním slezin třetí den po poslední injekci a spojením s P3-NSI-AG4-1(NO-1) buňkami.
Příprava a stanovení konjugátů
Neporušený anti-Ly-2.1, anti-TFR MoAb nebo 250-30.6 (1 až na mililitr v boritanovém pufru, pH = 8,0) se smíchá nadbytkem (1 až 50) 14-brom-4-demethoxydaunorubicinu který je
Reakce se udržuje se odstraní miligramy s molárním (br.Ida), (10 mg/ml). Sraženina
Volný Br-Ida a další nezreagované výchozí materiály se odstraní gelovou filtrací chromatografii na koloně Sephadexu G-25 (FD-10, Pharmacia). Konjugáty se pak nechají projít kolonou s náplní Porapak Q (Millipore), aby se odstranila adsorbovaná droga [Niederwieser a spol.: J. Chromatogr. 54, 215 až 223 (1971).] Množství Ida, která je zahrnuta v kojugátech droga-MoAb, se rozpuštěn v N,N4 hodiny za odstředováním (400G, dimethylformamidu teploty místnosti, po dobu 5 minut).
stanovuje absorpční spektrofotometrii při 483 mm (E4g8 = 3,4.103 M”1cm”1) a odhadem proteinů [Bradford: Anal. Biochin 72, 248 až 253 (1972).].
Aktivita protilátky
Pro stanovení účinnosti protilátky Ida-MoAb konjugátů a srovnání s volnou MoAb (která byla podrobena stejným postupům, které se používají při konjugaci) se používá test rosety s ovčím anti-myším imunoglobulinem (SAMG) [Paris a Mckenzie: J. Immunol. Methods 20, 173 až 183 (1978).].
Aktivita drog
Pro stanovení účinnosti drogy se používají následující testy:
a) Test 24-hodinové inhibice: 100 μΐ buněk (2 až 5.106/ml) se dá na mikrotitrovací destičku s plochým dnem a inkubuje se jednu hodinu při teplotě 37 °C . Volný idarubicin (Ida) (rozpuštěný v PBS) a Ida-MoAb konjugáty se asepticky zfiltrují. Připraví se jejich roztoky ve sterilním PBS. K buňkám se přidá 50 μΐ volného Ida nebo konjugátu. Každý vzorek se zopakuje ve dvou jamkách. Do kontrolních jamek se přidá 50 μΐ PBS a buňky se kultivují při teplotě 37 ’C, při 7 % C02 24 hodin.
-7CZ 281193 B6
b) Test 30-minutové inhibice: Do sterilních Eppendorfových zkumavek se dá 200 μΐ buněk (2 až 5.10®/ml). Buňky se resuspendují ve sterilní droze nebo konjugátu a vše se smíchá a míchá třicet minut při 37 ’C. Buňky se pak odstřeďují (400 g, pět minut) a resuspendují v růstovém médiu. Odebírají se 100 μΐ podíly, které se nanesou na mikrotitrovací destičku. Vzorky se inkubují 16 až 24 hodin. Každý vzorek se testuje duplicitně, tj. současné ve 2 jamkách.
Po inkubační době (u obou těchto testů) se přidá 50 μΐ růstového média, které obsahuje 1 μϋί [3H]-thymidinu (specifická aktivita 6 Ci/mmol, Amersham). Destičky se inkubují dvě až čtyři hodiny. Buňky se izolují, vysuší, jednotlivé vzorky se oddělí a spočítají se na β-scintilačním počítači. Obsah [3H]/thymidinu se vyjádří jako procento inhibice ve vztahu k procentům kontroly. Standardní chyba pro kterýkoliv bod byla stanovována na základě duplicitního měřeni. Tato chyba pro kterýkoliv experimentální bod nepřevyšovala pět procent.
Toxicita
Skupinám po deseti až dvaceti CBA myších byly jednou intravenózní injekci podávány různé dávky Ida nebo Ida-anti-Ly-2.1. Zaznamenává se přežití myší proti dávce drogy, které se podá (v mg/kg). Orgány těchto myší se odstraní a zjistí se jejich hmotnost. Potom se fixují formalinem a obarví se hematoxylinem a eosinem.
Výsledky. Příprava a charakterizace konjugátů
Br-Ida (obrázek 1) se kovalentně zkomplexuje (zkopuluje) s několika monoklonálními protilátkami (moAb): proti lidskému TFR, proti antigenu přítomnému na lidských buňkách rakoviny trakčníku (protilátka 250-30.6) a proti myšímu Ly-2 alloantigenu. Reakční podmínky pro konjugaci se stanoví tak, že se mění molární nadbytek Br-Ida přidávaný k MoAb. Udělá se tak kompromis mezi vyšší inkorporaci Ida a nižším výtěžkem proteinu. Ida-anti-Ly-2.1 (obrázek 2), Ida-anti-TFR a Ida-250-30.6 (data nejsou uvedena) inkorporovaly 3 až 5 molekul Ida s výtěžkem proteinu větším než 50 %, reakce Br-Ida s MoAb může poskytovat dva typy vazeb (obr. 1C a ID). Pro zjištění toho, který typ je přítomen, se konjugáty vystaví po dobu 48 hodin působeni pH 4,5 nebo pH 9,0. Uvolněná volná droga se absorbuje do Porapaku Q a vzorky se spektrofotometricky vyhodnotí. Působením báze se uvolní 50 % vázané drogy (pH 9,0), zatímco při pH 4,5 nebyla zřejmá žádná ztráta. Z toho lze usuzovat, že alespoň 50 % drogy je vázáno esterovou vazbou (obrázek ID), jelikož esterová vazba je citlivá na bázické prostředí, zatímco aminová vazba je za těchto podmínek stálá.
Aktivita protilátky
Titry protilátky před a po konjugaci byly měřeny metodou rosety a byly stanovovány jako zředění, při kterém 50 % cílových buněk vykazuje rosety. Ida-anti-Ly-2.1 konjugáty, které obsahují 2 a 8 molekul Ida, mají titry protilátky na E3 buňky 1 : 56 000 a 1 : 33 000, zatímco titr nekonjugované protilátky je 1 :
-8CZ 281193 B6
000 (obrázek 3). Ida-250-30.6 konjugáty, které obsahují 2 a 6 molekul Ida, mají titry protilátky na buňky COLO 205 1 : 16 000 a 1 : 11 000, zatímco titry nekonjugované protilátky, jsou 1 : 33 000. To znamená, že konjugačním postupem došlo k jistým ztrátám aktivity protilátky. Konjugáty, které obsahují méně než šest molekul Ida na molekulu MoAb, byly použity pro studie in vitro a in vivo. Je třeba poznamenat, že rozpustnost a účinnost protilátky Ida-anti-Ly-2.1 konjugátů podstatně poklesla pod tyto hladiny inkorporace Ida (data nejsou uvedena). Maximální počet molekul, které mohou být užitečně inkorporovány, se liší podle individuální protilátky.
Aktivita in vitro idarubicinu a konjugátů idarubicin-MoAb
In vitro cytotoxicita Ida a dvou Ida-MoAb konjugátů myší ITT(1)75NS E3 buněčné linie (Ly-2+TFR-) a lidské CEM buněčné linie (Ly-2-TFR+) byla měřena testem 24-hodinové inhibice. Byly stanoveny hodnoty ID50 (50¾ inhibice inkorporace [3H]-thymidinu vzhledem ke kontrole. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4 a v tabulce 1. Hodnota ID5Q pro Ida je v oblasti 1,0 až 2,0.10-7 M pro obě testované buněčné linie (obrázek 4, tabulka 1). Hodnota ID50 pro Ida-anti-Ly-2.1 na E3 byla čtyřikrát větší (obrázek 4) a pro Ida-anti-TFR na CEM 1 až 2krát větší než byly tyto hodnoty pro volný Ida (Tabulka 1). Volný Ida je tedy toxičtější jak na E3 tak na CEM než Ida-anti-Ly-2.1 a Ida-anti-TFR. Tyto Ida-MoAb konjugáty však znamenají desetinásobně nižší toxicitu než nereaktivní buněčné linie (tabulka 1). To znamená, že jejich cytotoxické působení je specifické a je důsledkem retence jejich protilátkové aktivity (obrázek 3)
Tabulka 1
Účinek konjugátů idarubicin-monoklonální protilátka na nádorové buňky1
| nádorová buněčná linie | průměrné hodnoty ID50 stanovené pro | ||
| Ida | Ida-anti-Ly-2.1 | Ida-anti-TFR | |
| E3 | 1,2.10-7 | 4,3.10-7 | 2,3.10-6 |
| (5)2 | (3) | (2) | |
| CEM | 2,2.10-7 | 2,0.10-6 | 3,0.10-7 |
| (5) | (2) | (3) |
-9CZ 281193 B6 1 id50 znamená 50% inhibici inkorporace [3H-thymidinu] vzhledem ke kontrole 2 počet testovaných prostředků
Konjugáty Ida-250-30.6 byly nepatrné méně účinné než volný Ida. Volný Ida měl ID5Q 6.10-8 M, konjugát měl hodnotu ID50 3,5.10-7 M (na cílovou buněčnou linii COLO 205).
Aby se zjistilo, zda cytotoxický účinek konjugátů na cílové buňky je selektivní, byly Ida-anti-Ly-2.1 a Ida-anti-TFR po dobu třiceti minut inkubovány s E3 (Ly-2+) buňkami (před tím, než byl nenavázaný konjugát vymyt a než byla měřena cytotoxicita). Konjugát Ida-anti-Ly-2.1 měl hodnotu ID5Q 6,2.10-7 M, ID50 volného Ida byl 5,2.10-7 M (obrázek 5). Naproti tomu nereaktivni konjugát Ida-anti-TFR mél ID^q 5,0.10-6 M, tj. desetkrát větší než volný Ida. To znamená, že vazebná aktivita na protilátku konjugátu Ida-anti-Ly-2.1 vede k jeho selektivní toxicitě. Podobně se (před promytím a před testem cytotoxicity) inkubuje konjugát Ida-250-30.6 a volná droga a to po dobu třiceti minut s buněčnými liniemi COLO 205 (250-30.6 +ve) a E3 (250-30.6 -ve). Obé buněčné linie vykazovaly podobnou odpověď na volnou drogu, tj. 9,2.10-7 pro COLO 205 a 9,8.10-7 M pro E3. Avšak konjugát Ida-250-30.6 byl čtyřnásobně toxičtější na buněčnou linii COLO 205 než na protilátku nereaktivni buněčné linie E3. Podobné výsledky byly získány pro buněčnou linii CEM a Ida-anti-Ly-2.1 jako nereaktivni kontrolu (data neuvedena). Abychom si byli jisti, že cytotoxicita ida-MoAb konjugátů je specifická na cílové buňky a vyskytuje se na místě vazby antigenu, provedli jsme studie inhibice cytotoxicity konjugátu s použitím volné MoAb. Při koncentraci Ida 4,0.10-6 M (2 μg anti-Ly-2.1) byla cytotoxicita konjugátu anti-Ly-2.1 na buňky E3 po přidání 50 μg (250 μg/ml) anti-Ly-2.1 snížena o 70 % (obrázek 6). To znamená, že cytotoxicita konjugátu >Ida-anti-Ly-2.1 je přímo svázána s jeho schopností vázat protilátku. Podobné kontrolní výsledky byly získány s 250-30.6. Je třeba poznamenat, že anti-Ly-2.1, anti-TFR a 250.30.6 byly ve všech testech netoxické (data nejsou uvedena).
Aplikace myšího thymu (nádoru z tkáně brzlíku) ITT(1)75NS E3 in vivo
Při stanovování inhibice růstu pevných nádorů byly skupiny CBF^ myší (10 myší ve skupině), jimž bylo do břišní dutiny subkutánně (s.c) naočkováno 2,0.106 buněk E3, léčeny intravenózními (i.v) injekcemi jednou z následujících látek: i) PBS, ii) anti-Ly-2.1, iii) Ida, iv) Ida-anti-TFR nebo v) Ida-anti-Ly-2.1. Myším bylo podáno 20 ug Ida a/nebo 1 200 μg anti-Ly-2.1 čtvrtý a pátý den po naočkování nádoru (velikost nádoru 0,1 cm2).
Během 24 hodin po prvé aplikaci byla průměrná velikost nádoru u myší, jimž byl podán Ida-anti-Ly-2.1, 20 % ve srovnání s průměrnou velikostí nádoru u myší, jimž byl podán PBS (tj.
-10CZ 281193 B6 došlo k 80% poklesu hmotnosti nádoru) (obrázek 7). Je zřejmé, že anti-Ly-2.1 samotný a Ida, kovalentně vázaný na nespecifickou anti-TFR MoAB, neovlivňuje růst nádoru E3. Nádory myší, které obdržely samotný Ida, byly sníženy až na 50 %. Avšak tři z těchto myší zemřely a další měly o 25 % sníženou tělesnou hmotnost. Křivky růstu nádorů jednotlivých myší, kterým byl podán Ida-anti-Ly-2.1, vykazují během doby léčení u 9 z 10 regresi nádoru (obrázek 8). U 5 z 10 nádorů došlo k úplné regresi a tyto nádory se neobjevily po dobu delší než 200 dnů. Ty nádory, které pokračovaly v růstu po ukončení léčení (5 z 10), rostly pomaleji než nádory u myší, který byly podány PBS a Ida-anti-TFR. Další pokus byl proveden proto, aby bylo možno zjistit i.v. léčení větších nádorů za použití Ida-anti-Ly-2.1. Skupinám CBF-^ myší (deset myší v každé skupině) se naočkuje 3,0.106 buněk E3. Myším se pak podá 15 μ-g Ida a 900 μg anti-Ly-2.1 šestý den (velikost nádoru = 0,2 cm2) a sedmý den po naočkování nádoru u myší, které byly léčeny Ida-anti-Ly-2.1, byla 50 % ve srovnání s myšmi, které které byly léčeny PBS, a 66 % ve srovnání s myšmi, které byly léčeny Ida (sedmý den). Tento trend pokračoval až do ukončeni studií (osmnáctý den). Křivky růstu jednotlivých nádorů deseti CBFq myší, které obdržely Ida-anti-Ly-2.1, ukázaly, že došlo ke 4 případům regrese a k 1 úplnému odstraněni hmoty nádoru (po dobu delší než 200 dnů; data nejsou uvedena). Ida-anti-Ly-2.1 byl tedy účinný proti velkým nádorům. Protinádorová účinnost Ida v obou pokusech byla značné lepší, pokud Ida byl zkomplexován s anti-Ly-2.1 MoAb.
Léčení nádoru lidského tračníku COLO 205 in vitro
Účinnost konjugátu Ida-anti-250-30.6 byla stanovována u holých myší (nu/nu), které nesly transplantáty (z jiného druhu; xenografty) COLO 205.
Podkožní injekci 2.106 buněk do břišní stěny se během čtyř dnů získá hmatatelná hrudka o velikosti přibližné 0,1 cm2. Skupiny po 10 myších se pak léčí intravenózními injekcemi jedné z následujících látek: i) PBS, ii) 250-30.6, iii) Ida plus 250-30.6 (nekonjugovaný), iv) Ida, v) konjugát Ida-250-30.6. Celkově bylo podáno 275 ^g Ida v sériích pěti intravenózních injekcí čtvrtý, pátý, šestý, desátý a dvanáctý den po naočkování nádoru.
Ve skupinách myší, které byly léčeny podáváním PBS nebo nekonjugovaného 250-30.6, nebyl pozorován terapeutický efekt. Při podání samotného Ida přežily 2 z 10 myši, avšak ve skupině, které byl podán nekonjugovaný Ida plus 250-30.6, byly všechny myši mrtvé během 7 dnů, když před tím vykazovaly symptony otravy, jako je například ztráta hmotnosti. U myší, kterým byl podán konjugát Ida-250-30.6, bylo pozorováno značné snížení velikosti nádoru. Tyto výsledky jsou ilustrovány na obrázku 11. Křivky růstu nádorů jednotlivých myší (obrázek 12) ukázaly, že 5 z 10 myši mělo nádory, u nichž po sedmi dnech byla pozorována regrese. Tyto nádory pak pokračovaly v růstu, přičemž 2 z 10 myši zůstaly bez nádorů. Tyto myši nevykazovaly žádné účinky toxicity.
-11CZ 281193 B6
Protinádorová léčení
Protinádorová terapie je užitečnou technikou imunoterapie nádorů zvířat a lidí. Byly proto provedeny studie, které by charakterizovaly protinádorovou účinnost konjugátů Ida-anti-Ly-2.1 při přímém podávání do pevného nádoru E3. Skupinám po deseti CBF^ myších se spontánně implantuje 3,0.106 buněk E3. Pátý den po naočkování nádoru se vyvinou nádory o velikosti 0,1 až 0,2 cm2. Léčení sestává ze dvou injekcí, které se podávají pátý a šestý den po implantaci nádoru. Při léčeni se myším podávají následující látky: 1) PBS, 2) Ida, 3) Anti-Ly-2.1 nebo 4) Ida-anti-Ly-2.1 (celkem Ida=30 |ig). Největší protinádorovou účinnost vykazoval Ida-anti-Ly-2.1. Volný Ida a anti-Ly-2.1 neovlivňovaly růst nádoru, pokud byly podávány přímo do nádoru. Myši, které byly léčeny podáváním Ida-anti-Ly-2.1, měly střední velikost nádoru 60 % ve srovnání s myšmi, které byly léčeny podáváním PBS (osmý den) a 30 % ve srovnání s myšmi, kterým byl podáván PBS (13, den) (obrázek 10). Křivky růstu nádorů (data nejsou uvedena) jednotlivých myší, které byly léčeny podáváním Ida-anti-Ly-2.1, ukazují, že v jednom případě došlo k úplné regresi, zatímco u zbývajících myší došlo ke zpožděné redukci růstu nádoru třetí den po ukončení léčení.
Toxicita
Pokusy stanovení toxicity byly prováděny na skupinách deseti CBA myší (Ly 2.1+), kterým byly podávány po jediné injekci různých dávek buď Ida-anti-Ly-2.1 nebo Ida-anti-TFR. Všechny myši, kterým byl injekčné podán Ida, vykazovaly ztráty hmotnosti až na 25 % původní hmotnosti. Žádná ztráta hmotnosti však nebyla pozorována u myší, které byly léčeny jakýmkoliv Ida-MoAb konjugátem. V tabulce 2 jsou uvedeny toxicity Ida a konjugátů Ida-MoAb jako hodnoty LD50 a LD1Q. Jak je vidět z tabulky, hodnota LD10 pro Ida-anti-Ly-2,1 je 10,0 mg/kg (Ida), pro volný Ida pouze 0,75 mg/kg. Hodnota LD]_q pro konjugát Ida-anti-TFR je 8,0 mg/kg. Konjugáty Ida-MoAb nebyly testovány na hodnotu LD5Q. Tyto výsledky demonstrují větší terapeutický index konjugátů Ida-MoAb ve srovnání s volným Ida.
Tabulka 2
Účinek konjugátů Idarubicin-monoklonálni protilátka na myši CBA
| Ida (mg/kg) | ||
| LD10 | LD50 | |
| Ida | 0,75 | 3,00 |
| Ida-anti-Ly-2.1 | 10,00 | N.T. |
| Ida-anti-TFR | 15,00 | N.T. |
N.T. znamená netestováno.
-12CZ 281193 B6
Histopatologické výsledky
Akutní účinek: Intravenózní podávání volného Ida (1,0 mg/kg) vedlo k atrofii bílé dřené sleziny 15 dnů po podávání a k jisté hypertrofii vláken srdečního svalu (data nejsou uvedena). Naproti tomu jednotlivá dávka Ida-anti-Ly-2.1 (2,4 mg/kg) nezpůsobila jakoukoliv nespecifickou tkáňovou toxicitu po 15 a po 30 dnech, i když 15. den lze pozorovat jisté bobtnání hepatocytů.
Příklad 2
Konjugáty se připravují podle postupu, popsaného v příkladu 1 [Ida a monoklonální protilátka 17.1 (Thompson a spol: Proč. Nati. Cancer Int. 70, 409 až 419 (1983).), vyšší IgG2a] a Ida a monoklonální protilátka 30.6 [Thompson a spol: Brit. J. Cancer 47. 595 až 605 (1983), myší IgG2b]. Buňky Colo 205 kařcinonu lidského tračníku (30.6+, 17.1+) se subkutánně naočkují holým myším v dávce 8.106 buněk na myš. Naočkované myši se pak podrobí sériím intraperitoneálních léčeni. Velikost nádorů se měří posuvným měřítkem, měří se podle navzájem kolmých os. Data se uvádějí jako průměrná velikost nádoru (což je produkt dvou změřených průměrů + standardní chyba). Výsledky jsou uvedeny na obrázku 13.
Příklad 3
Konjugáty se připravují podle postupu, popsaného v příkladu 1 [Ida a monoklonální protilátka 17.1, Ida a monoklonální protilátka JGT-13 (myší IgGl, reaktivní a karcinoembryonním antigenem na karcinom tračníku, ale nikoliv s normálními tkáněmi), Ida a monoklonální protilátka 27.1 (myši IgGl, reaktivní s antigenem mléčné tukové globule na početných nádorech tračníku) a Ida a monoklonální protilátka 30.6]. Transplantát (z jiného druhu, tj. xenograft) nádoru lidského tračníku LIM2210 (1 až 5 mg) se subkutánné implantuje holým myším. Tyto implantované myši se pak podrobí sériím intravenóznich léčení. Velikost nádorů se měří posuvným měřítkem, měří se podle navzájem kolmých os. Data se uvádějí jako průměrná velikost nádoru (což je produkt dvou změřených průměrů + standardní chyba). Výsledky jsou uvedeny na obrázku 14 .
Claims (10)
1. Imunoglobulinový konjugát, obsahující antracyklin konjugovaný s monoklonální protilátkou nebo s jejím fragmentem, obsahujícím alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky, ve kterém je antracyklinem idarubicin a idarubicin je konjugován v poloze C-14 s monoklonální protilátkou, specifickou pro lidský nádor, nebo s jejím fragmentem.
2. Imunoglobulinový konjugát podle nároku 1, kde 2 až 8 molekul idarubicinu je kovalentně vázáno ke každé molekule protilátky.
3. Imunoglobulinový konjugát podle nároku 1 nebo 2, kde monoklonální protilátka nebo její fragment jsou specifické pro receptor lidského transferinu.
4. Imunoglobulinový konjugát podle nároku 1 nebo 2, kde monoklonální protilátka nebo její fragment jsou specifické pro lidský nádor prsu, tračníku, plic, prostaty nebo vaječníků.
5. Způsob přípravy imunoglobulinového konjugátu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se
a) smíchá bud monoklonální protilátka, specifická pro lidský nádor nebo její fragment, obsahující alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky, s molárním nadbytkem 14-halogen-idarubicinu.
b) nechá reagovat směs při teplotě 18 až 37 ’C,
c) odstraní jakákoliv sraženina,
d) odstraní nezreagované výchozí látky, gelovou filtrací a
e) odstraní volný idarubicin adsorpční chromatografií nebo chromatografií na ionexu.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se jako monoklonální protilátka nebo její fragment použije monoklonální protilátka nebo její fragment, specifický pro receptor lidského transferinu.
7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že monoklonální protilátka nebo její fragment jsou specifické pro lidský nádor prsu, tračníku, plic, prostaty nebo vaječníků.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že se jako 14-halogen-idarubicin pou- žije 14-brom-idarubicin.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8, vyznačující se tím, že se stupeň b) provádí při teplotě místnosti.
-14CZ 281193 B6
10.Farmaceutický prostředek k léčení lidských nádorů, obsahující farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo, vyznačující se tím, že dále obsahuje imunoglobulinový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 jako účinnou složku.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI080387 | 1987-03-11 | ||
| AUPI295587 | 1987-07-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ281193B6 true CZ281193B6 (cs) | 1996-07-17 |
| CZ161288A3 CZ161288A3 (en) | 1996-07-17 |
Family
ID=25643244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS881612A CZ161288A3 (en) | 1987-03-11 | 1988-03-11 | Immunoglobulin conjugate, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5798097A (cs) |
| JP (1) | JP2736255B2 (cs) |
| KR (1) | KR0130906B1 (cs) |
| CN (1) | CN1045621C (cs) |
| AT (1) | AT395375B (cs) |
| AU (1) | AU622105B2 (cs) |
| BE (1) | BE1001051A4 (cs) |
| CA (1) | CA1329156C (cs) |
| CH (1) | CH678815A5 (cs) |
| CZ (1) | CZ161288A3 (cs) |
| DE (1) | DE3808166C2 (cs) |
| DK (1) | DK173792B1 (cs) |
| ES (1) | ES2006109A6 (cs) |
| FI (1) | FI98706C (cs) |
| FR (1) | FR2612074B1 (cs) |
| GB (1) | GB2203154B (cs) |
| GR (1) | GR1000059B (cs) |
| HU (1) | HU205266B (cs) |
| IE (1) | IE64781B1 (cs) |
| IL (1) | IL85688A0 (cs) |
| IT (1) | IT8819746A0 (cs) |
| MY (1) | MY103231A (cs) |
| NL (1) | NL8800610A (cs) |
| NO (1) | NO178954C (cs) |
| NZ (1) | NZ223834A (cs) |
| PT (1) | PT86960B (cs) |
| RU (1) | RU2106147C1 (cs) |
| SE (1) | SE503402C2 (cs) |
| YU (1) | YU46858B (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6824777B1 (en) * | 1992-10-09 | 2004-11-30 | Licentia Ltd. | Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| CN100340291C (zh) * | 1998-10-09 | 2007-10-03 | 路德维格癌症研究院 | F1t4(VEGFR－3)作为肿瘤显像和抗肿瘤治疗的靶 |
| AU2002216864A1 (en) * | 2000-12-21 | 2002-07-01 | Mcgill University | Conjugates of antibodies and anticancer drugs |
| AU2002248372B8 (en) | 2001-01-19 | 2008-03-20 | Vegenics Limited | FLT4(VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| CA2522700A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Cytovia, Inc. | Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays |
| GB0511266D0 (en) * | 2005-06-02 | 2005-07-13 | Trust | Chemical compounds |
| US20080108138A1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-05-08 | Vermette Patrick | Bioactive compositions and their use in cell patterning |
| PT2646470T (pt) | 2010-11-30 | 2017-05-03 | Hoffmann La Roche | Anticorpos anti-recetor da transferrina de baixa afinidade e a sua utilização na transferência de scfv terapêuticos através da barreira hematoencefálica |
| CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT346838B (de) * | 1975-01-22 | 1978-11-27 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| GB1500421A (en) * | 1975-01-22 | 1978-02-08 | Farmaceutici Italia | Optically active anthracyclinones |
| AT343812B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven daunosaminylderivaten von anthracyclinonen |
| AT343811B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| GB1511680A (en) | 1975-11-18 | 1978-05-24 | Farmaceutici Italia | Daunosaminyl anthracyclinones |
| GB1541436A (en) * | 1976-02-02 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| US4867973A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-19 | Cytogen Corporation | Antibody-therapeutic agent conjugates |
| US5162512A (en) * | 1982-03-09 | 1992-11-10 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibodies |
| US4950738A (en) * | 1984-09-13 | 1990-08-21 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibiotics |
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
| US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| GB8413464D0 (en) * | 1984-05-25 | 1984-07-04 | Erba Farmitalia | Anthracycline-anionic polymer conjugates |
| JPS61155334A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Teijin Ltd | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
| FR2584293B1 (fr) * | 1985-07-04 | 1989-03-17 | Ire Celltarg Sa | Anticorps utiles comme agents de pilotage et conjugues les incorporant |
-
1988
- 1988-03-10 CA CA000561042A patent/CA1329156C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 NZ NZ223834A patent/NZ223834A/xx unknown
- 1988-03-10 BE BE8800268A patent/BE1001051A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 YU YU48288A patent/YU46858B/sh unknown
- 1988-03-10 HU HU881160A patent/HU205266B/hu unknown
- 1988-03-10 MY MYPI88000250A patent/MY103231A/en unknown
- 1988-03-10 JP JP63055074A patent/JP2736255B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 IE IE70188A patent/IE64781B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 KR KR1019880002464A patent/KR0130906B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 AU AU12881/88A patent/AU622105B2/en not_active Expired
- 1988-03-10 IL IL85688A patent/IL85688A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 ES ES8800719A patent/ES2006109A6/es not_active Expired
- 1988-03-11 GR GR880100148A patent/GR1000059B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CN CN88101810A patent/CN1045621C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 DK DK198801315A patent/DK173792B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CZ CS881612A patent/CZ161288A3/cs not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CH CH936/88A patent/CH678815A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 NO NO881105A patent/NO178954C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 FI FI881158A patent/FI98706C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 IT IT8819746A patent/IT8819746A0/it unknown
- 1988-03-11 FR FR888803233A patent/FR2612074B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 DE DE3808166A patent/DE3808166C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 SE SE8800886A patent/SE503402C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 GB GB8805865A patent/GB2203154B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 AT AT0067488A patent/AT395375B/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 NL NL8800610A patent/NL8800610A/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 PT PT86960A patent/PT86960B/pt not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-15 RU SU5052164A patent/RU2106147C1/ru active
-
1995
- 1995-04-11 US US08/420,712 patent/US5798097A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0354729B1 (en) | Cytotoxic drug conjugates | |
| US4485093A (en) | Immunotoxin conjugate which comprises arsanilic acid, useful for treating malignant tumors, particularly pancreatic cancer | |
| BG63492B1 (bg) | Методи за получаване на мономерни конюгати калихеамициново производно/носител | |
| JPS6330289B2 (cs) | ||
| Pietersz et al. | Immunochemotherapy of a murine thymoma with the use of idarubicin monoclonal antibody conjugates | |
| CZ281193B6 (cs) | Imunoglobulinový konjugát a způsob jeho přípravy a farmaceutický přípravek, který jej obsahuje | |
| US5144012A (en) | Cytotoxic drug conjugates | |
| US5151266A (en) | Use of anionic detergents with conjugates of monoclonal or polyclonal antibodies | |
| RU2009500C1 (ru) | Способ получения цитотоксического коньюгата | |
| Arnon | Antibodies and dextran as anti-tumour drug carriers | |
| US20080095802A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients iwth transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in paients undergoing radiation therapy, and C) in vitaminpbinding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| CA2414401A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs a) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, b) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and c) in vitamin-binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| Arnon | Novel Application for Antibodies | |
| Mottram et al. | New anti-CD3 agents for transplantation tolerance | |
| AU2007201744A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and C) in vitamin binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| JPS62142124A (ja) | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 | |
| JPH0653682B2 (ja) | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20080311 |