NO178954B - Fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulin-konjugat - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulin-konjugat Download PDFInfo
- Publication number
- NO178954B NO178954B NO881105A NO881105A NO178954B NO 178954 B NO178954 B NO 178954B NO 881105 A NO881105 A NO 881105A NO 881105 A NO881105 A NO 881105A NO 178954 B NO178954 B NO 178954B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- ida
- mice
- cells
- tumor
- antibody
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 claims description 17
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 claims description 12
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 claims description 3
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 claims description 3
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 3
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003021 water soluble solvent Substances 0.000 claims description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 81
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 72
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 35
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 25
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 12
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 12
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 10
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 6
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011765 DBA/2 mouse Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241001274237 Caranx latus Species 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 231100000742 Plant toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010031650 Thy-1 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 201000009019 intestinal benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 108010071421 milk fat globule Proteins 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 239000002550 vasoactive agent Substances 0.000 description 1
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 1
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av immunoglobulin-konjugater, deres fremstilling og deres bruk.
Det generelle konseptet for antineoplastiske midler som målsetning når det gjelder svulster ved bruk av monoklonale antistoffer (MoAbs) er kjent og dets terapeutiske signifikans blir på det nåværende tidspunkt evaluert. Fremgangsmåten innebærer generelt fremstilling av konjugater av antistoff og et toksisk middel, som har evnen til selektiv lokalisering og ødelegging av svulstcellene. Hovedmålet er blitt rettet mot fremstilling av immunotoksiner fra A-kjedene til plante og bakterielle toksiner og antistoffer, slik at deres antigen-binding og internalisering fører til celledød. I praksis, så reagerer også mange MoAbs som man trodde var spesifikk for svulster også med subpopulasjoner av normale celler og på grunn av dette kan det være urealistisk å bruke slike potente toksiner på grunn av deres potensielle skade på normalt vev. Et sikrere alternativ til plantetoksiner har vært å koble antistoffer til konvensjonelle anti-kreftmedikamenter såsom doksorubicin, Vindesine, Chlorambucil, Melphalan og Methotre-xate. På grunn av de ikke-spesifikke toksiske effektene til de anti-neoplastiske midlene som på det nåværende tidspunkt blir brukt, er det gjort forsøk for å øke den terapeutiske indeksen ved å koble dem til MoAbs til svulstantigener.
Det kliniske potensialet til medikament-MoAb-konjugatene innbefatter immunokjemoterapi av kreft. Mange studier har demonstrert den spesifikke cytotoksisiteten til toksiner og medikamenter på svulstceller når de er koblet til MoAb ervervet til svulst-assosierte antigener.
Antracykliner er en viktig gruppe av antineoplastiske midler brukt i kjemoterapien når det gjelder kreft, hvorpå doksorubicin og daunorubicin har vist å være effektfulle mot faste svulster. Kobling av daunorubicin og doksorubicin til antistoffer, fører derimot til et vesentlig tap av medikamentaktivitet når koblingen utføres via aminogruppen. Nylig så er daunorubicin blitt koblet til MoAbs via karbonatom 14 ved bruk av bromodaunorubicin. Disse konjugatene demonstrerte in vitro aktivitet. Derimot så er ingen in vivo studier blitt rapportert (Gallego et al, Int. J. Cancer, 1984 33 737-744). Det er videre blitt vist at daunorubicin-MoAb konjugater demonstrerer en ikke-spesifikk toksisitet ved konsentrasjoner
> 10 jjg/ml.
Vi har nå funnet ut at Idarubicin (4-demetoksy-daunorubicin, Ida) kan bli koblet til MoAbs og at konjugatene har en selektiv og potent in vitro og in vivo anti-svulst-aktivitet. Den ikke-spesifikke toksisiteten til Ida-MoAb-konjugater har ikke vært tydelig in vitro ved doser på < 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-konjugatene har høyere in vitro og in vivo virknings-fullhet enn daunorubicin-MoAb-konjugater.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulinkonjugat, kjennetegnet ved å
a) blande et monoklonalt antistoff spesifikt for et humant neoplasma eller et fragment av nevnte antistoff omfattende minst et antigen bindende sete med et 0 til 50 ganger molart overskudd av 14-halo-idarubicin i et vannløselig oppløsningsmiddel, b) omsette blandingen ved fra 18 til 37°C, i fra 1 til 8 timer,
c) fjerne eventuelt bunnfall,
d) fjerne ureagerte utgangsmaterialer ved gelfiltrering, og e) fjerne adsorbert idarubicin ved adsorpsjonskromato-grafi eller ionebyttekromatografi.
Ida er beskrevet i US-A-4077988. Det er foretrukket fra to til åtte Ida-molekyler blir kovalent bundet til hvert antistoff eller antistofffragment-molekyl, mest foretrukket er fra to til seks.
Eksempler på humane neoplasmaer som det er ønskelig å bruke Ida mot og som antistoffet eller antistoff-fragmentet kan være spesifikt overfor er bryst, tarm, lunge, prostata, ovarie, tymus og andre kreftformer, sarkomer og leukemi-former. Et antistoff eller antistoff-fragment som er spesifikt for human transferrin-reseptor (TFR), som er tilstede på delende celler, erytroide forløperceller og celler fra forskjellige svulster, kan også bli benyttet. En egnet anti-TFR monoklonalt antistoff kan være et som er fremskaffet mot transferrin-reseptoren på LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2) celler.
Det monoklonale antistoffet eller antistoff-fragmentet er fortrinnsvis fra samme art som den arten som immunoglobulin-konjugatet skal bli administrert til. Et humant eller muse-monoklonalt antistoff eller antistoff-fragment blir derfor benyttet der hvor man skal administrere konjugater til mennesker.
14-halosubstituenten i 14-halo-Ida anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være fluor, klor, brom eller jod, men er fortrinnsvis brom. 14-Brom-Ida er beskrevet i US-A-4125607.
Reaksjonstemperaturen i fremgangsmåten er ifølge oppfinnelsen vanligvis romtemperatur.
Immunoglobulin-konjugatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli crukt til å behandle et menneske eller andre pattedyr som lider av kreft. En terapeutisk effektiv mengde av konjugatet kan bli administrert. Kreftformen kan innbefatte en fast svulst, en ascites-svulst eller være leukemi. Humane neoplasmaer som kan bli behandlet er nevnt ovenfor. To eller flere konjugater kan bli administrert hvori det monoklonale antistoffet eller antistoff-fragmentet i hvert konjugat har en forskjellige spesifisitet.
Et konjugat kan bli administrert ved injeksjon. Det kan bli gitt parenteralt, for eksempel intravenøst. Det kan bli administrert lokalt eller rett inn i svulsten. Mengden av konjugat som blir administrert til en pasient vil avhenge av forskjellige faktorer såsom svulsten som blir behandlet og tilstanden til pasienten. Vanligvis blir derimot en dose på fra 10 til 200 mg av konjugatet administrert pr. M2 av en pasients kroppsareal. Konjugatene kan bli administrert med andre kjemoterapeutiske midler eller med midler som forster-ker aktiviteten av konjugatene, f.eks. vasoaktive midler eller svulst-nekrose-faktor.
Immunoglobuline konjugater kan bli formulert som farma-søytiske preparater med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. En hvilken som helst hensiktsmessig bærer eller fortynningsmiddel kan bli brukt. Egnede bærere og fortynningsmidler innbefatter fysiologisk saltvannsoppløsning og Ringers dekstroseoppløsning.
Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. I de medfølgende tegningene, vedrører figur 1 til 12 eksempel 1 og figurene 13 til 17 vedrører eksempel 2. Mer spesielt: Figur 1 angir strukturen til antracyklin-derivatene; Figur 2 angir kobling av Idarubicin (Ida) til anti-Ly-2,1 (0,5 mg). Antall mol Ida inkorporert pr. mol anti-Ly-2,1 (•) (venstre ordinat) og proteinutvinning (•) (høyre-ordinat) er vist som en funksjon av antallet nanomol av Ida i reaksjonsblandingen (abscissen); Figur 3 angir antistoff-titere målt som % rosett-dannende celler (ordinat) mot antistoff-fortynning (xlO-<1>) (abscisse) til anti-Ly-2,1 konjugatene på ITT(l) 75 NS E3 målceller. Fortynninger i serie ble utført på en 0,5 mg/ml oppløsning av enten anti-Ly-2,1 (▲) eller anti-Ly-2,1 med 2(») eller 8 (o) Ida/mol antistoff; Figur 4 angir for den inhibitoriske effekten til Ida (fl ) eller Ida-anti-Ly-2,1, 5 mol Ida/mol antistoff, (•) på E3-celler i en 24-timers analyse hvor % inhibering i [^H] tymidin inkorporering (ordinat) blir plottet mot konsentrasjonen til Ida(M) (abscisse); Figur 5 angir den inhibitoriske effekten til Ida (■), Ida-anti-Ly-2,1, 5 mol Ida/mol antistoff (•) eller Ida-anti-TFR, 5mol Ida/mol antistoff (o) på (Ly-2<+>) E3-celler i en 30 min. inhiberingsanalyse hvor % inhibering i [^H] thymidin inkorporering (ordinat) blir plottet mot konsentrasjonen til Ida(M) (abscisse); Figur 6 angir den inhibitoriske effekten til Ida-anti-Ly-2,1, 5mol Ida/mol antistoff (o) og konjugat pluss anti-Ly-2,1 (o) på E3 målceller i en 30 min. spesif isi tetsanalyse hvor # inhibering i [^E] thymidin inkorporering (ordinat) blir plottet mot konsentrasjonen til Ida(M) (abscisse); Figur 7 angir veksten av E3-thymoma i CBFj mus injisert subkutant med 2 x 10^ celler. Grupper bestående av 10 mus ble gitt intravenøs behandling som er betegnet med en pil; PBS (□), Ida (■), anti-Ly-2,1 (A), Ida-anti-TFR (o) eller Ida-anti-Ly-2,1 ( • ). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulstinokulering (abscisse). Avviksområdet står for ± standardavvik til gjennomsnittet; Figur 8 angir individuelle svulstvekstkurver til CBF^-mus som er injisert subkutant med 2,0 x 10^ E3-svulstceller og behandlet intravenøst på dagene 4 og 5 med Ida-anti-Ly-2,1 konjugat. Svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulstinokuleringen (abscisse); Figur 9 angir veksten av E3-thymoma i CBF^ mus injisert subkutant med 3,0 x 10^ celler. Grupper på 10 mus ble gitt intravenøs behandling som er betegnet med en pil; PBS (O ), anti-Ly-2,1 (A), Ida (■) eller Ida-anti-Ly-2,1 konjugat (•). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulstinokulering (abscisse). Avviksområdet står for ± standardavvik til gjennomsnittet; og Figur 10 angir veksten av E3-thymoma i CBF^-mus som er injisert subkutant med 3,0 x 10^ celler. Grupper bestående av 10 mus ble gitt behandling rett i svulsten betegnet ved en pil; PBS (O); anti-Ly-2,1 (A), Ida (•) eller Ida-ant-Ly-2,1 konjugat (•). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulst inokulering (abscisse). Avviksområdet står for ± standardavvik til gj ennomsnittet; Figur 11 angir veksten av COL0 205 human svulst xeno-podning i nakne mus injisert subkutant med 2 x IO<6> celler. Grupper bestående av 10 mus ble gitt følgende intravenøse behandling som er betegnet med en pil; PBS (A), fritt Ida (0), Ida-250-30,6 konjugat (•), blanding bestående av Ida og 250-30,6 «>) og 250-30,6 (A). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulst inokulering (abscisse). Avviksområdet står for ± standardavvik til gjennomsnittlig svulststørrelse; Figur 12 angir individuell svulstvekst-kurver til xeno-podete nakne mus som ble behandlet i. v. (pil) med Ida-250-30,6 konjugat. Den avbrutte linjen står for gjennomsnittlig svulststørrelse i PBS-behandlede mus. Svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulstinokulering (abscisse); Figur 13 viser kobling av Idarubicin (Ida) til anti-L3T4 (0,5 mg). Antall mol Ida inkorporert pr. mol anti-L3T4 (♦) (venstre ordinat) og proteinutbytte (•) (høyre ordinat) er vist som en funksjon av antall nmol Ida i reaksjonsblandingen (abscisse); Figur 14 viser antistof f titer målt som H> rosettdannende celler (ordinat) mot antistoff-fortynning (x 10_<1>) (abscisse) til anti-Thy-1 konjugater på ITT(l) 75NS E3 målceller. Fortynninger i serie ble utført på en 1,0 mg/ml oppløsning av enten anti-Thy-1 ($) eller konjugat med 1 (o), 4 (•) eller 7 (♦) mol Ida/mol anti-Thy-1; Figur 15 viser effekten av Ida-MoAb og MoAb-behandling på antall L3T4<+> og Ly-2<+> celler i milten i Ida-anti-L3T4 behandlet (•—•), anti-L3T4 behandlet (AA ), Ida-anti-Ly-2,1 behandlet (•—-/#), anti-Ly-2,1 behandlet (A"-A) eller ubehandlede (□--•□) mus hvori % rosettdannene celler (ordinat) blir plottet mot tid i dager (abscisse); Figur 16 viser effekten til kombinert Ida-MoAb konjugatbe-handling på overlevelse av en P388D1 svulst-podning ((ved H-2 og ikke H-2 forskjeller) i CBA-mus. Grupper bestående av 10 mus ble injisert subkutant med 8,0 x 10^ P388D1 svulstceller og som mottok en av følgende intravøst (pil): (i) PBS (♦), (ii) anti-L3T4 og anti-Ly-2,1 (o), (iii) Ida-anti-L3T4 (■) , (iv) Ida-anti-Ly-2,1 (•) og (v) Ida-anti-L3T4 og Ida-anti-Ly-2,1 (A). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulst inokulering (abscisse). Avviksområdet står for ± standardavvik til gjennomsnittet; og Figur 17 viser effekten av Ida-anti-Thy-1 konjugat på overlevelse av en P388D1 svulst-podning i CBA-mus. Grupper på 10 mus ble subkutant injisert med 1,0 x 10^ P388D1 svulstceller og mottok intravenøst (pil) en av følgende: (i) PBS (Q), (ii) anti-Thy-1 (•) og (iii) Ida-anti-Thy-1 (A). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulst inokulering (abscisse).. Avviksområdet står for ± standardavvik til gjennomsnittet. Figur 18 viser vekst av COLO 205 (30,6<+>, 17,1<+>) xeno-podning i nakne mus injisert med 8 x 10 celler/mus. Grupper bestående
av 10 mus ble interperitonealt behandlet, som er betegnet med en pil, med PBS (o); 17,1-Ida (o); 30,6-Ida ) eller en blanding av 30,6-Ida og 17,1-Ida (• ). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulst inokulering (abscisse). Avviksområdet står for ± standardavvik til gjennomsnittet. Totaldosen av • Ida var 200pg.
Figur 19 viser vekst av LIM2210 human tarmsvulst xeno-podet i nakne mus implantert med svulstfragment (1-5 mg). Grupper på 10 mus ble intravenøst behandlet, betegnet med en pil, med PBS (D); 17,1-Ida (♦); JGT-13-Ida (▲); 27,1-Ida (#), 30,6-Ida (o). Gjennomsnittlig svulststørrelse (cm<2>) (ordinat) blir plottet mot antall dager etter svulst inokulering (abscisse). Avviksområdet står for ± standardavvik til gjennomsnittet. Totaldosen av Ida var 80jjg.
EKSEMPEL 1
Svulstceller
Cellelinjer som ble undersøkt i dette studiet innbefatter (ly-2<+>) murin thymoma ITT(l) 75NS E3 variant (E3) (Smyth et al, J. Nati Cancer Inst. 1986 76 503-510), (Ly-2-, TFR~)lymfoma EL4 (Horowitz et al, Science 1968 160 533-535 ), (TFR<+>) human cellelinje CEM (Foley et al Cancer 1965 18 522-529) og (250-30,6<+>) human cellelinje COLO 205. Cellene ble opprettholdt in vitro i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DME) eller RPMI 1640 medium (Flow Laboratories, Sydney, Australia), supplementert med 10$ varme-uaktivert nyfødt kalveserum (Flow), 2mM glutamin (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australia); 100 jig/ml streptomycin (Glaxo, Melbourne, Australia) og 100 I.U./ml penicillin (Commonwealth Serum Laboratories). E3-svulsten ble opprettholdt in vivo ved påfølgende innføring inn i (C57BL/6 x BALB/c)F1 mus ( CB¥1 mus). Celler fra bukhinnevæsken ble vasket og sentrifugert (400g x 5 min) to ganger i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,3, resuspendert i PBS og injisert subkutant (s.c.) inn i den abdominale veggen til mus; disse utviklet seg til palperbare svulster før behandlingen. Mus ble utsatt for en serie intravenøse (i.v.) eller intrasvulst (i.t.) behandlinger og den påfølgende størrelsen på svulstene ble daglig målt med en skyvelære ved måling langs den vinkelrette aksen til svulstene. Data ble målt som gjennomsnittlig svulststør-relse (produkt til to diametere ± standardavvik).
Mus
CBA og (C57BL/6xBALB/c) mus (CBF^ mus) og nakne mus (nu/nu) ble produsert i patologidepartementet, University of Melbourne. Eksperimentelle grupper bestående av 8-10 mus alle med samme kjønn og alder ble brukt i hvert eksperiment.
Monoklonale antistoffer
MoAbs som ble brukt var: (i) Anti-Ly-2,1 (IgGl) reaktiv med murin Ly-2,1 spesifisitet (Hogarth et al Immunology 1982 46 135-144) og (ii) A3C6 (anti-TFR) (IgGl) reaktiv med den humane transferrin-reseptoren (TFR) (Panaccio et al Immunology and Cell Biology 65,461-472, 1987); og (iii) et antistoff, betegnet 250-30,6, reaktiv mot et antigen som er tilstede på humane tarm-carcinoma-celler.
MoAbs ble isolert fra bukhinne-væske ved presipitasjon med 40$ ammoniumsulfat, oppløsning i PBS og dialyse med den samme bufferen. Disse råpreparatene ble enten absorbert på Protein-A-Sepharose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), nøye vasket med PBS (pH 7,3) og eluert med 0,2 M glycin/HCl (pE 2,8), eller sendt gjennom en Affigel blå kolonne (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney). Etter nøytralisering ble MoAbs dialysert mot PBS, posjonert og lagret ved -70°C. A3C6 ble ervervet ved immunisering av CBA-mus intraperitonealt ved ukentlige intervaller i tre uker med 2xl0<6> Li CR-LON-EMy-2(EMy-2) celler (0KT9<+vo>), fjerning av miltene tre dager etter den siste injiseringen og fusering med P3-NSI-AG4-1(NS-1) celler.
Preparering og kvantltering av konjugater
Intakte anti-Ly-2,1, anti-TFR MoAb, eller 250-30,6 (1-2 mg/ml i boratbuffer pH 8,0) ble blandet med et molart overskudd (1-50) av 14-brom-4-demetoksydaunorubicin (Br-Ida) oppløst i (N.N)-dimetylformamid (DMF) ved 10 mg/ml. Reaksjonen ble opprettholdt ved romtemperatur i 4 timer før sentrifugering (400 g x 5 minutter) for fjerning av et eventuelt bunnfall. Fritt Br-Ida og andre utgangsmaterialer som ikke har reagert ble fjernet ved gelfiltreringskromatografi ved bruk av en Sephadex G-25 kolonne (PD-10; Pharmacia) og konjugatene ble sendt gjennom en kolonne bestående av Porapak Q (Millipore) for fjerning av eventuelt adsorbert medikament (Niederwieser et al, J. Chromatog. 1971 54 215-223). Mengde Ida inkorporert i medikament - MoAb konjugatene ble bestemt ved absorbans-spektrofotometri ved 483 mm (E4gg = 3,4 x 103M_1cm-<1>) og ved proteinbestemmelse (Bradford, Anal. Biochem. 1976 72 248-253).
Antistoff- aktivitet
En rosett-analyse med bruk av saue-antimuse-immunoglobulin (SAMG) ble brukt for bestemmelse av antistoffaktiviteten til Ida-MoAb-konjugatene sammenlignet med fritt MoAb som hadde gjennomgått den samme fremgangsmåten som ble brukt i kob-lingsmetoden (Parish og McKenzie, J. Immunol. Methods 1978 20 173-183).
Medikamentaktivitet
(a) 24 timer inhiberingsanalyse: 100 pl celler (2-5 x 10<6>/ml) ble satt til et flat-bunnet mikrotiterplate og inkubert i 1 time ved 37°C. Fritt Idarubicin (Ida) (oppløst i PBS) og Ida-MoAb-konjugater ble aseptisk filtrert og fortynninger ble utført i sterilt PBS; 50 pl fritt Ida eller konjugat ble satt til cellene ved bruk av duplikate brønner for hver prøve; kontrollbrønner fikk 50 pl PBS og cellene ble dyrket ved 37°C, l1o C02 i 24 timer. (b) 30 minutt inhiberingsanalyse: 200 pl celler (2-5 x 10^/ml) ble samlet i sterile Eppendorf-rør, resuspendert i sterilt medikament eller konjugat og blandet i 30 minutter ved 37°C. Cellene ble deretter sentrifugert (400 g x 5 min), resuspendert i vekstmedium og 100 pl aliquoter ble sådd på en mikrotiterplate ved bruk av duplikate brønner for hver prøve før en inkuberingsperiode på 16-24 timer. Etter inkuberings-perioden ble det i begge disse analysene, tilsatt 50 pl vekstmedium som inneholder 1 pCi [%]-thymidin (spesifikk aktivitet=5 Ci/mmol; Amersham) og platene ble inkubert i 2-4 timer. Cellene ble deretter høstet og tørket, og individuelle prøver ble separert og telt på en beta scintillasjons-teller. Inkorporering av [%]-thymidin ble uttrykt som prosent inhibering i inkorporering av kontrollene. Standardavvik for et hvilket som helst punkt ble dannet ved duplikate bestem-meiser og overskred ikke 5$ for noen av de gitte eksperimen
telle punktene.
Toksisitet
Grupper på 10-20 CBA-mus ble gitt en enkel i.v. injeksjon av forskjellige doser av Ida eller Ida-anti-Ly-2,1 og overlevelse av mus ble målt mot den gitte medikamentdosen i mg/kg. Organene til disse musene ble fjernet og veid før formalin-fiksering og farging med hematoksylin og eosin.
Fremstilling og karakterisering av konjugatene
Br-Ida (Fig. 1) ble kovalent koblet til flere MoAbs: mot humant TFR, mot et antigen tilstede på human tarmsvulst-celler (antistoff 250-30,6), og mot murin Ly-2 alloantigen. Reaksjonsbetingelsene ble oppnådd for konjugeringen ved variering av det molare overskuddet av Br-Ida som ble tilsatt til MoAbs og ved å lage et kompromiss mellom høyere Ida inkorporering og lavere proteinutbytte. Ida-anti-Ly-2,1 (fig.
2), Ida-anti-TFR og Ida-250-30,6 (data ikke vist) inkorporerte 3 til 5 molekyler Ida med proteinutbytter som var høyere enn 50$. Reaksjonen mellom Br-Ida og MoAbs kan føre til to typer bindinger (fig. 1 C og D). For å bestemme hvilken som var tilstede, ble konjugatene utsatt for pH 4,5 eller pH 9,0 i 48 timer, fritt medikament som ble frigjort ble absorbert i Porapak Q og prøvene ble rekvantitert ved spektrofotometri. Femti prosent av bundet medikament ble frigjort ved utsetting for base (pH 9,0), mens ingen frigjøring ved pH 4,5. Dette kan bety at minst 50$ av medikamentet er ester-bundet (fig. ID) da esterbindingen er sensitiv til basiske betingelser mens aminbindingen er stabil.
Antistoff- aktivitet
Titrene til antistoff før og etter konjugering ble målt ved rosett-metoden og ble bestemt når fortynningen hvor 50$ av målcellene demonstrerte rosetter. Ida-anti-Ly-2,1 konjugater som inneholder 2 og 8 molekyler Ida hadde antistoff-titere mot E3-celler på 1:56.000 og 1:33.000 respektivt, mens ikke-konjugert antistoff-titere var 1:80.000 (fig. 3). Ida-250-30,6 konjugater som inneholder 2 og 6 molekyler Ida hadde antistofftitere mot COLO 205-celler på 1:16.000 og 1:11.000 respektivt, mens ikke-konjugert antistoff-titere var på 1:33.000. Det er derfor et lite tap av antistoffaktivitet på grunn av konjugeringsprosedyren; konjugater med mindre enn 6 molekyler Ida-molekyl av MoAb ble brukt i in vitro og in vivo studier. Det ble bemerket at oppløsningen og antistoffaktiviteten til Ida-anti-Ly-2,1 konjugatene sank betraktelig under disse nivåene av Ida-inkorporering (data ikke vist). Maksimum antall Ida-molekyler som blir inkorporert riktig vil variere, avhengig av det individuelle antistoffet.
In vitro aktivitet og Idarubicin og Idarubicin- MoAb konjugat e_ r
In-vitro cytotoksisiteten til Ida og to Ida-MoAb konjugater på murin ITT(1)75NS E3-cellelinje (Ly-2<+>TFR-) og den humane CEM-cellelinje (Ly-2~TFR<+>) ble målt i en 24-timer inhiberingsanalyse og verdiene for I.D50 (50$ inhibering i [<3>H]-thymidin-inkorporering av kontrollene) ble bestemt. Resultatene er vist i fig. 4 og tabell 1. I.D50 for Ida var i et område på 1,0 til 2,5 x 10~<7>M for begge cellelinjer som ble analysert (fig. 4, tabell 1). I.D50 for Ida-anti-Ly-2,1 på E3 var 4 ganger høyere (Fig. 4), og for Ida-anti-TFR på CEM var I.D5Q-verdiene 1-2 ganger høyere enn de til fritt Ida (tabell 1). Fritt Ida var derfor mer cytotoksisk til både E3 og CEM enn Ida-anti-Ly-:}, 1 og Ida-anti-TFR respektivt. Disse Ida-MoAb-konjugatene, demonstrerte derimot en 10-ganger lavere cytotoksisitet til ikke-reaktive cellelinjer (tabell 1), som indikerer at dets cytotoksiske handling var spesifikk og resulterte fra retensjon av antistoffaktivitet (fig. 3).
<1>I.D.5o = 50$ inhibering i [<3>H]-thymidin inkorporering av kontrollene.
<2>= antall preparater analysert.
Ida-250-30,6 konjugater var noe mindre aktive enn fritt Ida. Fritt Ida hadde en I.D.50 på 6xlO~^M mens konjugatet hadde en I.D.50 på 3,5xlO~<7>M på målcellelinje COLO 205.
For å undersøke om konjugatene var reagerte enkeltvis i deres cytotoksiske aksjon for målceller, ble Ida-anti-Ly2,1 og Ida-anti-TFR inkubert i 30 minutter med E3 (Ly-2<+>)-celler, før ikke-bundet konjugat ble vasket bort og måling av cytotoksisiteten. Ida-anti-Ly2,1 konjugatet hadde en I.D.50 på 6,2 x 10_<7>M sammenlignet med en I.D.50P^ 5'2 x 10_<7>M for fritt Ida (figur 5). Som kontrast til dette, hadde den ikke-reaktive Ida-anti-TFR-konjugatet en I.D.50 på 5,0 x 10~<6>M, dvs. 10 ganger høyere enn for fritt Ida, som demonstrerer at antistof f-bindingsaktiviteten til Ida-anti-Ly-2,1 konjugatet resulterte i dets selektive cytotoksisitet. På lignende måte ble Ida-250-30,6 konjugatet og fritt medikament inkubert i 30 minutter med C0LO 205 (250-30,6 +ve) og E3 (250-30,6 -ve) cellelinjer før vasking og utsetting for cytotoksisitetsana-lysen. Begge cellelinjer viste en lignende doserespons til fritt medikament, dvs. 9,2xlO~<7>M for COLO 205 og 9,8xlO~<7>M for E3. Ida-250-30,6 konjugatet var derimot 4 ganger mer toksisk til C0L0 205 enn til antistoff ikke-reaktive E3-cellelinje. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av CEM-cellelinje og Ida-anti-Ly-2,1 som en ikke-reaktiv kontroll (data ikke vist). For å videre forsikre at cytotoksisiteten til Ida-MoAb-konjugatene for målcellene var spesifikk og skjedde ved antistoff-bindingssete, ble det utført studier for å inhibere konjugatcytotoksisitet ved bruk av fritt MoAb. Ved en Ida-konsentrasjon på 4,0 x 10"^M (2 pg anti-Ly-2,1), ble cytotoksisiteten til anti-Ly-2,1-konjugatet på E3-celler redusert med 70$ ved tilsetting av 50 pg (250 jjg/ml) anti-Ly-2,1 (fig. 6), som indikerer at cytotoksisiteten til Ida-anti-Ly-2 , 1-konjugatet er direkte relatert til dets antistoff-bindingsevne. Lignende kontrollresultater ble oppnådd med 250-30,6. Det bør bemerkes at i alle analysene var fri anti-Ly-2,1, anti-TFR og 250-30,6 ikke-cytotoksiske (data ikke vist).
In vitro behandling av murin thymoma ITT( 1) 75NX E3
For å bestemme inhibering av veksten til faste svulster, ble grupper av CBP^-mus (10 pr. gruppe) inokulert s.c. med 2,0 x IO<6> E3-celler i den abdominale regionen behandlet med i.v. injeksjoner med en av følgende: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2,1;
(iii) Ida; (iv) Ida-anti-TFR; eller (v) Ida-anti-Ly-2,1. Mus mottok 20 jjg Ida og/eller 1200 pg anti-Ly-2,1 respektivt på dag 4 og 5 (svulststørrelse = 0,1 cm<2>) etter svulst-inokulering.
Innen 24 timer fra den første behandlingen, hadde Ida-anti-Ly2,1 behandlede mus en gjennomsnittlig svulststørrelse på 20% av den hos PBS-behandlede mus (dvs. en 8056 minskning i svulstmasse (fig. 7)); det var klart innlysende at anti-Ly-2,1 alene og Ida kovalent bundet til den ikke-spesifikke anti-TFR MoAb ikke virket inn på E3 svulstvekst. Svulstene til mus som mottok bare Ida ble redusert med opptil 50% ; men 3 av disse musene døde og de andre hadde en reduksjon i kroppsvekt på 25$. Individuelle svulstvekstkurver til mus som mottok Ida anti-Ly-2,1 demonstrerte regresjon av 9 ut av 10 svulster i løpet av behandlingen (fig. 8); 5 av ut av 10 svulster regresserte fullstendig og kom ikke igjen til syne (>200 dager), og de svulstene som fortsatte å vokse ved avslutning av behandlingen (5 ut av 10), vokste med saktere hastigheter enn svulstene til PBS og Ida-anti-TFR behandlede mus. Et annet eksperiment ble utført for å bestemme i. v. behandling av større svulster ved bruk av Ida-anti-Ly-2,1. Grupper av CBF^-mus (10 pr. gruppe) ble inokulert med 3,0 x 10^ E3-celler, og deretter mottok musene 15 jjg og 900 pg Ida og anti-Ly-2,1 respektivt på dag 6 (svulststørrelse = 0,2 cm<2>) og 7 etter svulstinokulering (fig. 9). Ida-anti-Ly-2,1 behandlede mus hadde en gjennomsnittlig svulststørrelse som var 50% av det som PBS-behandlede mus hadde, og 66$ av det som Ida-behandlede mus ved dag 7, denne trenden fortsatte frem til avslutning av studiet (dag 18). Individuelle svulstvekstkurver til 10 CBF^-mus som fikk Ida-anti-Ly-2,1 demonstrerte at det var 4 regresjoner og 1 fullstendig fjerning av svulstmasse (>200 dager; data ikke vist). Derfor var Ida-anti-Ly-2,1 effektiv mot større svulster og i begge eksperimentene var anti-svulst-aktiviteten til Ida markert forbedret når den var koblet til anti-Ly-2,1 MoAb.
In vivo behandling av human tarmsvulst COLO 205
Effekten av Ida-anti-250-30,6 konjugat ble undersøkt i nakne (nu/nu) mus bærende COLO 205 xenopodninger.
Injeksjon av 2xl0<6> celler subkutant inn i den abdominale veggen ga en palberbar klump i løpet av 4 dager (omtrent 0,lcm<2>). Grupper på 10 mus ble deretter behandlet med i.v. injeksjoner av en av følgende: (i) PBS; (ii) 250-30,6 (iii) Ida pluss 250-30,6 (ikke-konjugert); (iv) Ida; (v) Ida-250-30,6 konjugat. Totalt 275 jjg Ida ble i en serie på 5 intrave-nøse injeksjoner på dagene 4, 5, 6, 10 og 12 etter svulstinokulering.
Ingen terapeutisk effekt var tydelig i gruppene av mus som var behandlet med PBS eller med ikke-konjugert 250-30,6. Med bare Ida overlevde 2 ut av 10 mus, mens alle mus i gruppen som mottok ikke-konjugert Ida pluss 250-30,6 var døde innen dag 7, med nylig symptomer på toksisitet såsom tap av vekt. Musene som mottok Ida-250-30,6 konjugat viste en drastisk reduksjon på svulststørrelsen. Disse resultatene er illu-strert i figur 11. I kontrast til dette viste svulstvekstkur-vene for individuelle mus (figur 12), at 5 ut av 10 mus hadde svulster som hadde regressert innen dag 7; disse svulstene fortsatte deretter å vokse, som førte til at 2 ut av 10 mus ikke hadde svulster. Disse musene viste ingen effekt som skyldtes toksisitet.
Intrasvulst- behandling
Instrasvulst-terapi har vist seg å være en nyttig teknikk for immunoterapi på dyr og menneskesvulster. Studier ble derfor utført for å karakterisere anti-svulstaktiviteten til Ida-anti-Ly-2, 1 konjugater når de ble administrert rett inn i faste E3-svulster. Grupper bestående av 10 CBFj^-mus implantert s.c. med 3,0 x IO<6> E3-celler utviklet svulster (0,1-0,2 cm<2>) 5 dager etter svulstinokulering. Behandlingene besto av 2 injeksjoner på dagene 5 og 6 etter svulstimplantering, hvor musene mottok en av følgende behandlinger; (1) PBS; (2) Ida; (3) Anti-Ly-2,1; eller (4) Ida-anti-Ly-2,1 (total Ida=30 pg). Ida-anti-Ly-2,1 demonstrerte den største anti-svulst-aktiviteten, mens fritt Ida og anti-Ly-2,1 alene virket ikke inn på svulstveksten når administrert rett inn i svulsten. Ida-anti-Ly-2, 1 behandlede mus hadde en gjennomsnittlig svulststørr-else som var b0% av det som PBS-behandlede mus hadde på dag 8 og 30% av det som PBS-behandlede mus hadde på dag 13 (figur 10). Individuelle svulstvekstkurver (data ikke vist) av Ida-anti-Ly-2, 1 behandlede mus indikerte 1 fullstendig regresjon mens de gjenværende musene demonstrerte en forsinket reduksjon i svulstvekst 3 dager etter endt behandling.
Toksisitet
Når det gjelder akutte toksisitetseksperimenter ble grupper på 10 CBA (Ly2,l<+>) mus gitt en enkel injeksjon av forskjellige doser bestående av enten Ida, Ida-anti-Ly-,2,1 eller Ida-anti-TFR. Alle mus injisert med Ida viste et opprinnelig vekttap på opp til 25% av den opprinnelige vekten; mens ikke noe vekttap ble observert i mus behandlet med enten hvilken som helst av Ida-MoAb-konjugat. Tabell 2 demonstrerer toksisiteten til Ida og Ida-MoAb-konjugater som er reflektert i LD5Q- og LD^Q-verdiene. Som vist, var LD^g-verdien til Ida-anti-Ly-2, 1 10,0 mg/kg av Ida sammenlignet med bare 0,75 mg/kg for fritt Ida. I tillegg så hadde Ida-anti-TFR konjugat en LD-lq på 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-konjugater ble ikke analysert til en LD5Q-dose. Disse resultatene demonstrerte den større terapeutiske indeksen som Ida-MoAb-konjugatene hadde sammenlignet med fritt Ida.
Histopatologiske resultater
Akutt effekt: Intravenøs administrering av fritt Ida (1,0 mg/kg) resulterte i svinn av den hvite pulp i milten 15 dager etter behandling og sterk vekst av kardiakk-muskelfibre (data ikke vist). Som kontrast så førte ikke en enkelt dose Ida-anti-Ly-2,1 (2,4 mg/kg) til noen ikke-spesifikk vevstoksistet etter 15 og 30 dager selv om det ble observert en viss grad av oppsvulming av hepatocyttene ved dag 15.
EKSEMPEL 2
Mus
(DBA/2 x BALB/c)Fi og CBA-mus ble produsert i patologidepartementet, Universitetet i Melbourne. Eksperimentelle grupper bestående av 10-20 mus, alle av samme kjønn og alder, ble brukt i hvert eksperiment.
Svulstceller
Cellelinjen som ble undersøkt i dette studiet innbefattet (Ly-2<+>) murin thymoma ITT(1)75NS E3-variant (E3), (L3T4<+>) lymfoma EL4 (Horowitx et al, Science 1968 160 533-535), human tarmcarcinoma Colo 205 (Semple et al, Cancer Pes. 1978 38 1345-1355) og (Ly-2-, L3T4~) human T-celle leukemi CEM (Foley et al, Cancer 1965 18 522-529). Cellene ble undersøkt in vitro som beskrevet i eksempel 1. P388Dl-makrofag-cellelinje ble opprettholdt in vivo ved påfølgende innføring inn i (DBA/2 x BALB/c)Fi mus. Celler fra bukhinnevæsken ble vasket og sentrifugert (400g x 5 min) to ganger i fosfat-bufret saltvann (PBS, pH7,3), resuspendert i PBS og injisert s.c. inn i den abdominale veggen til mus hvor de utviklet til palperbare svulstpodninger. Musene ble deretter utsatt for en serie i.v. behandlinger og størrelsene på svulstene ble daglig målt med et skyvelære, som målte langs den vinkelrette aksen svulstene. Data ble målt som gjennomsnittlig svulst-størrelse (produktet av to diametere ± standard avvik).
Monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer til murine celleoverflate antigenene L3T4, Ly-2 og Thy-1, som karakteriserer distinkte subpopulasjoner av lymfocytter, ble brukt som et modellsystem.
MoAbs som ble brukt var: (i) anti-Ly-2,1 (murin IgG2a) reaktiv med murin Ly-2,1 spesifisiteten (Horgarth et al, Immunology 1982 46 135-144), (ii) H129.19 (anti-L3T4) (rotte IgG2b) reaktiv med murin L3T4-spesifisiteten (Pierres et al, J. Immunology 1984 132 2775-2782), og (iii) anti-Thy-1 (rotte IgG2b) reaktiv med murin T-celler (Marshak-Rothstein et al, J. Immunology 1979 122 2491-2497). Antistoffene ble isolert, renset og lagret som beskrevet i eksempel 1. Antistoffaktivitet ble bestemt ved rosett-analyse med sau anti-muse immunoglobulin (SAMG) som beskrevet i eksempel 1.
Fremstilling av Idarubicin- monoklonale antistoffkonjugater En MoAb (1-2 mg/ml) ble blandet med et 5-20 molart overskudd av 14-brom-4-demetoksydaunorubicin (Br-Ida) løst opp i (N,N)-dimetylformamid (10 mg/ml) i 4 timer ved pH 8,0 (0,05M Boratbuffer) og romtemperatur. Reaksjonen fortsatte, og rensing ble utført og mengden av Ida som ble inkorporert i det resulterende konjugatet ble bestemt som beskrevet i eksempel 1.
Medikament- aktivitet
To analyser (24 timer og 30 minutter) ble utført for bestemmelse av medikament-aktiviteten som beskrevet i eksempel 1, ved bruk av celler ved en konsentrasjon på fra (1 til 5 x 10<6>/ml).
Serologi
En rosettdannende fremgangsmåte ble brukt i disse eksperimentene for bestemmelse av antistoff-titere og antall av L3T4<+> og Ly-2<+> celler. Denne fremgangsmåten innbefatter binding av SAMG som også detekterer rotte-immunoglobulin (lg) koblet til røde celler fra sauer (SEC) for å detektere antistoffer på overflaten av lymfoide celler. Ig<+> miltceller hadde ved capping med SAMG (25 pl og 2 ml celler ved 10<7>/pl) fått fjernet overflate-Ig; cellene ble deretter holdt på is i media som inneholder 0,01$ natriumazid for å forhindre resyntesisering av immunoglobulin.
Resultater
Studiet ble utført i separate faser:
(a) in vitro karakterisering av tre forskjellige Ida-MoAb-konjugater, og (b) påfølgende demonstrering av deres evne til å aktivt utrydde T-celle grupper før eller i løpet av forkastelse av en svulstcelle-allopodning.
Fremstilling og karakterisering av konjugater
Br-Ida ble kovalent koblet til MoAb mot murin L3T4, Ly-2 og Thy-1 antigener. Reaksjonsbetingelser ble oppnådd for konjugeringen ved å variere det molare overskuddet av Br-Ida som ble satt til MoAb og ved å canne et kompromiss mellom høyere Ida-inkorporering og lavere proteinutbytte. Ida-anti-L3T4 (figur 13), Ida-anti-Ly-2,1 og Ida-anti-Thy-1 (data ikke vist) inkorporerte 3-6 molekyler Ida, med proteinutbytter som var høyere enn 5056.
Antistoffaktivitet
Titrene til antistoffet før og etter konjugering ble målt ved rosett-fremgangsmåten og ble bestemt som den fortynningen hvorpå 50$ av E3-målcellene demonstrerte rosetter. Ida-anti-Thy-1 konjugatene som inneholdt 1, 4 og 7 molekyler Ida hadde antistofftitere på 1:425.000, 1:170.000 og 1:130.000 respektivt, mens den umodifiserte antistofftiteren var 1:550.000 (figur 14). Det er dermed noe tap av antistoff aktivitet ved konjugering til Ida; derimot, så ble konjugater med mindre enn 4 molekyler av Ida-molekyl til MoAb brukt for in vitro og in vivo studier. På lignende måte så falt antistoffaktiviteten til både Ida-anti-Ly-2,1 og Ida-anti-L3T4 konjugatene (data ikke vist) signifikant med inkorporeringen av mer enn 6 molekyler Ida-molekyl MoAb.
In vitro médikamentaktivitet
Cytotoksisiteten til Ida-MoAb-konjugatene ble testet på forskjellige reaktive målceller ved bruk av en 24-timers analyse og sammenlignet med fritt Ida. Aktiviteten til fritt Ida var 4-10 ganger høyere enn Ida-MoAb-konjugatene, med I.D.50 (50$ inhibering i [<3>H]-thymidin inkorporering til kontrollene) til fritt Ida ved 6,6 - 9,0 x 10"<8>M mot svulstcellene som ble testet. Det framkom at Ida-anti-Ly-2,1 konjugatet var det mest cytotoksiske konjugatet (I.D.50 = 4,3 x 10~<7>M) når den var testet mot ITT(l)75NS E3-cellelinjen, som er en variant av den native cellelinjen anriket for Ly-2 antigen. For å undersøke selektiviteten til konjugatet for målcellene, ble Ida-MoAb-konjugatene inkubert i 3 minutter med målceller, før ubundet konjugat ble vasket bort og måling av cytotoksisiteten. Ved bruk av denne 30 min. analysen, hadde de ikke-reaktive Ida-MoAb-konjugatene en I.D.50 som var 10-50 ganger høyere enn det som fritt Ida hadde, som demonstrerer at antistoff-binding var essensielt for Ida-MoAb-konjugat cytotoksisitet. Det er viktig å merke seg at MoAb som ble brukt i studiet ikke hadde noen cytotoksisk virkning på målcellene in vitro i fravær av komplement. Resultatene er oppsummert i tabell 3.
In vivo potensen til Idarubicin- monoklonale antistoff-kon. iugater
In vivo immunosuppressive potensen til Ida-MoAb-konjugatene ble sammenlignet med MoAb alene ved testing av evnen som konjugatene hadde til selektivt å utrydde L3T4<+> eller Ly-2<+ >celler fra milten. CBA-mus mottok 4 i.v. injeksjoner av anti-Ly-2,1 eller anti-L3T4-konjugat (30 pg Ida/1,5 mg MoAb) på dagene 0, 2, 5 og 10, og antallet Ly-2<+> eller L3T4<+> celler i milten ble målt ved rosettanalysen. For hver behandling ble miltcellene til to behandlede mus undersøkt hver dag, og det ble tatt et gjennomsnitt av resultatene (figur 15). Det var et raskt fall i antall L3T4<+> celler fra omtrent 30% av totale miltceller i normale mus på dag 0 til omtrent 456 i Ida-anti-L3T4 behandlede mus ved dag 20. Disse L3T4<+->cellene forble utryddet i mer enn 60 dager før en gradvis økning ble observert. Utrydding etter in vivo behandling med bare anti-L3T4 førte også til en skarp nedgang i L3T4<+->celleantallet (3056 til 556).
Ida-anti-Ly-2,1-konjugatet senket milt Ly-2<+> celleantallet fra 2556 til 556 ved dag 10; men antallet Ly-2<+->celler begynte å øke ved dag 15, og var igjen i et normalt antall ved dag 40-50. Det var interessant at anti-Ly-2,1 MoAb alene ikke kunne utrydde Ly-2<+->celler i noen betydelig grad; variasjoner i antall av Ly-2<+> og L3T4<+->celler i ubehandlede kontrollmus var antatt å skyldes naturlig variasjoner mellom mus. Det var dermed klart at både Ida-anti-L3T4 og Ida-anti-Ly-2,1 kunne utrydde L3T4<+> og Ly-2<+->celler respektivt fra miltene til behandlede mus mye mer effektivt enn det MoAb alene kunne. Effekten til Ida-anti-Ly-2,1-konjugatet er viktig, da anti-Ly-2,1 MoAb er fullstendig uten effekt når det blir brukt alene, men kan bli omdannet til et potent immunosuppressivt middel når det blir koblet til Ida. Utrydding opprettholdt av medikament-MoAb-konjugatene var derfor egnet for undersøkelse av rollen til Ly-2<+> og L3T4<+->celler in vivo i podning-f orkastelsesresponsen.
Effekten av Ida- anti- L3T4. Ida- anti- Ly- 2. 1 og Ida- anti- Thy- 1 på svulstpodnings- overlevelse
I disse eksperimentene, ble Ida-anti-L3T4, Ida-anti-Ly-2,1 og Ida-anti-Thy-l-konjugatene brukt til å øke overlevelsestiden til P388D1 svulstpodninger i CBA-mus, hvor allopodningene var i H-2 (klasse I og II) og ikke-H-2-barrierene.
(a) Kombinert kon. lugat- behandling
Grupper bestående av 10-15 CBA-mus ble s.c. injisert med 8,0 xlO<6> P388D1 svulstceller og mottok i.v. på dagene -1, 0 (=dag av svulstinokulering), 3, 5 og 10, en av følgende: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 og anti-Ly-2,1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti-Ly-2,1 og (v) Ida-anti-L3T4 og Ida-anti-Ly-2,1. Total mengde Ida og MoAb som ble mottatt var 125 jjg og 5,75 mg respektivt. Svulstpodningene til både PBS og MoAb-behandlede mus overlevde i 14-17 dager med en maksimum gjennomsnittlig svulststørrelse på 0,31 cm<2>, som demonstrerer at begge ukonjugerte MoAb sammen ikke kunne utrydde L3T4<+> og Ly-2<+->celler effektivt slik at svulstpodninger kunne overleve (figur 16). I tillegg så kunne Ida-anti-Ly-2,1 eller Ida-anti-L3T4 alene bare forlenge podningsoverlevelsen (dag 20-28) med maksimal gjennomsnittlig svulststørrelse på 0,40 cm<2 >til 0,50 cm<2>. Det er sannsynlig at Ida-anti-Ly-2,1 eller Ida-anti-L3T4 alene ikke fjernet alle T-cellene, og at en sterk antigen utfordring (som ble sett med hele MHC-forskjeller) kunne stimulere de gjenværende Ly-2<+> og L3T4<+->celler til å proliferere og tenne en forkastelserespons. I kontrast med dette så muliggjorde en kombinasjon av både Ida-anti-Ly-2,1 og Ida-anti-L3T4 konjugater å unngå at 14/15 P388Dl-svulstpodninger unngikk forkastelse, og økning i størrelse helt til musen ble ofret (dag 50-2,00 cm<2>). Det ble observert at noen av disse konjugat-behandlede P388Dl-svulstene demonstrerte noe regresjon i størrelse fra dagene 8 til 16; kontinuerlig utrydding av L3T4<+> og Ly-2<+->celler (dag 10) muliggjorde derimot at P388Dl-svulstpodninger etablerte homogen svulstvekst .
(b ) Ida- anti- Thy- l- kon. iugat
Grupper bestående av 10 CBA-mus ble s.c. injisert med 10<7 >P388Dl-svulstceller og mottok en av følgende i.v. på dagene-1, 0, 5 og 6: (i) PBS, (ii) anti-Thy-1 og (iii) Ida-anti-Thy-1. Total mengde Ida og anti-Thy-1 som ble mottatt var 130 jig og 5,4 mg respektivt, og svulstpodningene til PBS-behandlede mus overlevde i 15 dager. Anti-Thy-1 MoAb alene opprettholdt svulstpodningsoverlevelse i 28-32 dager, med en maksimal gjennomsnittlig svulststørrelse på 0,58 cm<2> (dag 6) (figur 17). Når det gjelder Ida-anti-Thy-1 behandlede mus, ble 30% av svulstpodningene forkastet fullstendig innen dag 40, mens de gjenværende 7056 fortsatte å vokse, som deretter (dag 32) muliggjorde at gjennomsnittlig svulststørrelse til gruppen økte. Ida-anti-Thy-1 muliggjorde derfor, som ved kombinasjo-nen av Ida-anti-Ly-2,1 og Ida-anti-L3T4, utrydding av Ly-2<+ >og L3T4<+->celler slik at flesteparten av P388D1 svulstpodningene overlevde i CBA-mus i fravær av en normal rask forkastel-sesrespons.
EKSEMPEL 3
Konjugater ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 mellom Ida og det monoklonale antistoffet 17,1 (Thompson et al, Proe Nati. Cancer Inst 70, 409-419, 1983; Murine 166 2A) og mellom Ida og det monoklonale antistoffet 30,6 (Thompson et al, Br J Cancer 47, 595-605, 1983; Murine 166 2B). Human tarm-carcinoma Colo 205-celler (30,6<+>, 17,1<+>) ble inokulert s.c. inn i nakne mus ved 8xl0<6 >eller/mus som beskrevet i eksempel 2. De inokulerte musene ble deretter utsatt for en serie av i.p.-behandlinger. Størrelsen av svulstene ble målt med skyvelær, med målings langs den vinkelrette aksen til svulstene. Dataene ble benevnt som gjennomsnittlig svulststørrelse (produktet av to diametere ± standardavvik). Resultatene er vist i figur 18.
EKSEMPEL 4
Konjugater ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 mellom Ida og det monoklonale antistoffet 17,1, mellom Ida og det monoklonale antistoffet JGT-13 (muse IGG1, reaktiv med carcino-embryonisk antigen på tarm-carcinoma men ikke med normale vev), mellom Ida og det monoklonale antistoffet 27,1 (muse-IGGl, reaktiv med humant melkefett globul-antigen på flere tarmsvulster) og mellom Ida og det monoklonale antistoffet 30,6. Et LIM2210 humant tarmtumor xenopodning (1-5 mg) ble SC-implantert i nakne mus. Den implanterte musen ble deretter utsatt for en serie i.v. behandlinger. Størrelsen på svulstene ble målt med et skyvelær, hvor målingen ble utført langs den vinkelrette aksen til svulstene. Data ble målt som gjennomsnittlig svulststørrelse (produktet til to diametere ± standardavvik). Resultatene er vist i figur 19.
Claims (5)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulinkonjugat, karakterisert ved å a) blande et monoklonalt antistoff spesifikt for et humant neoplasma eller et fragment av nevnte antistoff omfattende minst et antigen bindende sete med et 0 til 50 ganger molart overskudd av 14-halo-idarubicin i et vannløselig oppløsningsmiddel, b) omsette blandingen ved fra 18 til 37°C, i fra 1 til 8 timer, c) fjerne eventuelt bunnfall, d) fjerne ureagerte utgangsmaterialer ved gelfiltrering, og e) fjerne adsorbert idarubicin ved adsorpsjonskromato-grafi eller ionebyttekromatografi.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at 14-brom-idarubicin blandes med nevnte antistoff eller fragment derav i trinn (a).
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at et antistoff eller fragment derav som er spesifikt for human transferrinreseptor blandes med 14-halo-idarubicin i trinn (a).
4 .
Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at et antistoff eller fragment derav spesifikt for en neoplasma fra bryst, tarm, lunge, prostata eller ovarie blandes med 14-halo-idarubicin i trinn (a).
5 .
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at immunoglu-bulinkonjugatet oppnådd på denne måten blir formulert med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel for derved å danne en farmasøytisk sammensetning.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI080387 | 1987-03-11 | ||
| AUPI295587 | 1987-07-07 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO881105D0 NO881105D0 (no) | 1988-03-11 |
| NO881105L NO881105L (no) | 1988-09-12 |
| NO178954B true NO178954B (no) | 1996-04-01 |
| NO178954C NO178954C (no) | 1996-07-10 |
Family
ID=25643244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO881105A NO178954C (no) | 1987-03-11 | 1988-03-11 | Fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulin-konjugat |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5798097A (no) |
| JP (1) | JP2736255B2 (no) |
| KR (1) | KR0130906B1 (no) |
| CN (1) | CN1045621C (no) |
| AT (1) | AT395375B (no) |
| AU (1) | AU622105B2 (no) |
| BE (1) | BE1001051A4 (no) |
| CA (1) | CA1329156C (no) |
| CH (1) | CH678815A5 (no) |
| CZ (1) | CZ161288A3 (no) |
| DE (1) | DE3808166C2 (no) |
| DK (1) | DK173792B1 (no) |
| ES (1) | ES2006109A6 (no) |
| FI (1) | FI98706C (no) |
| FR (1) | FR2612074B1 (no) |
| GB (1) | GB2203154B (no) |
| GR (1) | GR1000059B (no) |
| HU (1) | HU205266B (no) |
| IE (1) | IE64781B1 (no) |
| IL (1) | IL85688A0 (no) |
| IT (1) | IT8819746A0 (no) |
| MY (1) | MY103231A (no) |
| NL (1) | NL8800610A (no) |
| NO (1) | NO178954C (no) |
| NZ (1) | NZ223834A (no) |
| PT (1) | PT86960B (no) |
| RU (1) | RU2106147C1 (no) |
| SE (1) | SE503402C2 (no) |
| YU (1) | YU46858B (no) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6824777B1 (en) * | 1992-10-09 | 2004-11-30 | Licentia Ltd. | Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| CN100340291C (zh) * | 1998-10-09 | 2007-10-03 | 路德维格癌症研究院 | F1t4(VEGFR－3)作为肿瘤显像和抗肿瘤治疗的靶 |
| AU2002216864A1 (en) * | 2000-12-21 | 2002-07-01 | Mcgill University | Conjugates of antibodies and anticancer drugs |
| AU2002248372B8 (en) | 2001-01-19 | 2008-03-20 | Vegenics Limited | FLT4(VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| CA2522700A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Cytovia, Inc. | Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays |
| GB0511266D0 (en) * | 2005-06-02 | 2005-07-13 | Trust | Chemical compounds |
| US20080108138A1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-05-08 | Vermette Patrick | Bioactive compositions and their use in cell patterning |
| PT2646470T (pt) | 2010-11-30 | 2017-05-03 | Hoffmann La Roche | Anticorpos anti-recetor da transferrina de baixa afinidade e a sua utilização na transferência de scfv terapêuticos através da barreira hematoencefálica |
| CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT346838B (de) * | 1975-01-22 | 1978-11-27 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| GB1500421A (en) * | 1975-01-22 | 1978-02-08 | Farmaceutici Italia | Optically active anthracyclinones |
| AT343812B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven daunosaminylderivaten von anthracyclinonen |
| AT343811B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| GB1511680A (en) | 1975-11-18 | 1978-05-24 | Farmaceutici Italia | Daunosaminyl anthracyclinones |
| GB1541436A (en) * | 1976-02-02 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| US4867973A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-19 | Cytogen Corporation | Antibody-therapeutic agent conjugates |
| US5162512A (en) * | 1982-03-09 | 1992-11-10 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibodies |
| US4950738A (en) * | 1984-09-13 | 1990-08-21 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibiotics |
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
| US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| GB8413464D0 (en) * | 1984-05-25 | 1984-07-04 | Erba Farmitalia | Anthracycline-anionic polymer conjugates |
| JPS61155334A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Teijin Ltd | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
| FR2584293B1 (fr) * | 1985-07-04 | 1989-03-17 | Ire Celltarg Sa | Anticorps utiles comme agents de pilotage et conjugues les incorporant |
-
1988
- 1988-03-10 CA CA000561042A patent/CA1329156C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 NZ NZ223834A patent/NZ223834A/xx unknown
- 1988-03-10 BE BE8800268A patent/BE1001051A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 YU YU48288A patent/YU46858B/sh unknown
- 1988-03-10 HU HU881160A patent/HU205266B/hu unknown
- 1988-03-10 MY MYPI88000250A patent/MY103231A/en unknown
- 1988-03-10 JP JP63055074A patent/JP2736255B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 IE IE70188A patent/IE64781B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 KR KR1019880002464A patent/KR0130906B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 AU AU12881/88A patent/AU622105B2/en not_active Expired
- 1988-03-10 IL IL85688A patent/IL85688A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 ES ES8800719A patent/ES2006109A6/es not_active Expired
- 1988-03-11 GR GR880100148A patent/GR1000059B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CN CN88101810A patent/CN1045621C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 DK DK198801315A patent/DK173792B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CZ CS881612A patent/CZ161288A3/cs not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CH CH936/88A patent/CH678815A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 NO NO881105A patent/NO178954C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 FI FI881158A patent/FI98706C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 IT IT8819746A patent/IT8819746A0/it unknown
- 1988-03-11 FR FR888803233A patent/FR2612074B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 DE DE3808166A patent/DE3808166C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 SE SE8800886A patent/SE503402C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 GB GB8805865A patent/GB2203154B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 AT AT0067488A patent/AT395375B/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 NL NL8800610A patent/NL8800610A/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 PT PT86960A patent/PT86960B/pt not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-15 RU SU5052164A patent/RU2106147C1/ru active
-
1995
- 1995-04-11 US US08/420,712 patent/US5798097A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bourrie et al. | Study of the plasma clearance of antibody–ricin‐A‐chain immunotoxins: Evidence for specific recognition sites on the A chain that mediate rapid clearance of the immunotoxin | |
| EP0428188A2 (en) | Novel immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy | |
| CA1222694A (en) | Immunochemotherapy for malignant tumors, particularly pancreatic cancer | |
| Pietersz et al. | Immunochemotherapy of a murine thymoma with the use of idarubicin monoclonal antibody conjugates | |
| NO178954B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et immunoglobulin-konjugat | |
| EP0248040B1 (en) | Ricin-antibody conjugates | |
| EP2185204A2 (en) | Conjugate comprising a selective estrogen receptor modulator and a ribosome inactivating toxin | |
| WO1987004154A1 (en) | Melphalan derivatives | |
| Lin et al. | Lectin derivatives of methotrexate and chlorambucil as chemotherapeutic agents | |
| RU2009500C1 (ru) | Способ получения цитотоксического коньюгата | |
| Smyth et al. | The in vitro and in vivo anti-tumour activity of N-AcMEL-(Fab') 2 conjugates | |
| US20080095802A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients iwth transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in paients undergoing radiation therapy, and C) in vitaminpbinding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| US6613330B1 (en) | Methods and compositions for preventing anti-Gal production in xenograft recipients | |
| CA2414401A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs a) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, b) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and c) in vitamin-binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| AU2007201744A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and C) in vitamin binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| WO1998056823A1 (en) | Induction of immune tolerance by immunotoxin | |
| BOURRIE et al. | achieve zyxwvutsrqponmlkjihgf |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |