DK173792B1 - Immunoglobulinkonjugater, fremgangsmåde til fremstilling af sådanne og farmaceutiske præparater med indhold deraf - Google Patents
Immunoglobulinkonjugater, fremgangsmåde til fremstilling af sådanne og farmaceutiske præparater med indhold deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK173792B1 DK173792B1 DK198801315A DK131588A DK173792B1 DK 173792 B1 DK173792 B1 DK 173792B1 DK 198801315 A DK198801315 A DK 198801315A DK 131588 A DK131588 A DK 131588A DK 173792 B1 DK173792 B1 DK 173792B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- ida
- antibody
- cells
- mice
- tumor
- Prior art date
Links
- 0 *CC(*)C(*)**S[C@](O)OC(N=O)O Chemical compound *CC(*)C(*)**S[C@](O)OC(N=O)O 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Description
i DK 173792 B1
Opfindelsen angår et immunoglobulin-konjugat omfattende en anthracyclinforbindelse konjugeret til et monoklonalt antistof, der er specifikt for en human neoplasme, eller til et fragment af antistoffet om-5 fattende mindst et af antistoffets antigen-bindingssteder. Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et immunoglobulinkonjugat ved konjugering af en anthracyclinforbindelse til et monoklonalt antistof, der er specifikt for en human 10 neoplasme, eller til et fragment af antistoffet omfattende mindst et af antistoffets antigen-bindingssteder, og et farmaceutisk præparat med indhold af et sådant konjugat.
Det generelle princip ved målretning af 15 antineoplastiske midler til tumorer under anvendelse af monoklonale antistoffer (MoAbs) er kendt, og dets terapeutiske betydning er under vurdering.
Generelt indebærer metoden fremstilling af konju-gater af antistof og et toxisk middel, der er i 20 stand til selektivt at lokalisere og beskadige tumorceller. Der har navnlig været interesse for at konstruere immunotoxiner ud fra A-kæder fra plante- og bakterielle toxiner og antistoffer, således at deres antigenbinding og internering 25 fører til celledød. I praksis er mange MoAbs, der menes at være specifikke for tumorer, også reaktive med subpopulationer af normale celler, og det kan derfor være urealistisk at anvende sådanne potente toxiner på grund af deres potentielle beskadigelse 30 af normale væv. Et sikrere alternativ til plante-toxiner har været at koble antistoffer til konventionelle anticancer-lægemidler, såsom doxorubicin, i vindecin, chlorambucil, melphalan og methotrexat.
35 DK 173792 B1 2 På grund af de ikke-specifikke toxiske effekter af de for nærværende anvendte antineoplastiske midler har der været gjort forsøg på at forøge deres terapeutiske indeks ved at koble dem til 5 MoAbs over for tumor-antigener.
Forsøg på at undertrykke thymus-afledt T-celle-transplantrejektion har ofte fokuseret på at nedsætte T-celle-aktivitet ved at anvende anti-thymocyt-globulin. Nyligere er det, med udviklingen 10 af monoklonale antistoffer, blevet muligt at definere T-celle-subgrupper efter deres funktion in vitro og efter tilstedeværelsen af specifikke overfladeantigener defineret af MoAb. Dette har stimuleret efterforskningen efter en mekanisme, ved 15 hvilken T-celler kontrollerer transplantrejektion, idet man koncentrerer sig om hovedinddelingen i hjælper/induktor- og cytotoxisk/suppressor-under-grupper defineret af de murine L3T4- og Ly-2-anti-gener. Selvom 0KT3 MoAb'et, et anti-pan-T-celle-20 reagens, har vist ijn vivo-styrke, har det i en nyere undersøgelse vist sig, at 20 MoAbs over for 20 forskellige murine lymphocyt-antigener var uden in vivo-effekt på mus og derfor er uanvendelige til _in vi vo-under søge Iser. Det har derfor interesse 25 at undersøge midler, hvorved disse højt specifikke MoAbs kan gøres mere virksomme og fuldstændigt fjerne deres målceller. Anvendelsen af cytotoxiske lægemidler koblet til MoAbs er en sådan mulighed.
Det kliniske potentiale for lægemiddel/MoAb-30 konjugater omfatter immunokemoterapi af cancer og lindring af forskellige immunoregulatoriske sygdomme og allotransplantrejektion. Mange undersøgelser har demonstreret den specifikke cytotoxicitet af toxiner og lægemidler på tumorceller, når de 35 var koblet til MoAb frembragt over for tumorassocierede antigener. Der har imidlertid været lagt 3 DK 173792 B1 mindre vægt på i_n vivo-an vende Isen af lægemiddel/MoAb-konjugater til udryddelse af T-celler og til at undersøge T-celle-immunoregulering ved transplantre jektion, selvom toxin/antistof-konjugater i stor udstrækning har været anvendt in vitro til at udrydde T-celler forud for benmarvs-transplantation.
Anthracycliner er en vigtig gruppe af anti-neoplastiske midler anvendt ved kemoterapi af cancer, og blandt disse har doxorubicin og daunorubicin vist effektivitet over for faste tumorer. Kobling 10 af daunorubicin og doxorubicin til antistoffer resulterer imidlertid i et betydeligt tab af lægemiddelaktivitet, når kobling sker via aminogruppen.
Nyligt er daunorubicin blevet koblet til MoAbs via carbonatom 14 under anvendelse af bromodauno-15 rubicin. Disse konjugater viste aktivitet in vitro.
Der er imidlertid ikke rapporteret nogen i_n vivo- undersøgelser (Gallego et al, Int.J.Cancer, 1984, 33, 737-744). Det er endvidere påvist', at dauno- rubicin/MoAb-konjugater viser en ikke-specifik toxicitet ved koncentrationer >10 yg/ml.
Det har nu vist sig, at idarubicin (4-de- methoxy-daunorubicin, Ida) kan kobles til MoAbs, og at konjugaterne har en selektiv og virksom in vitro- og in vivo-antitumor-aktivitet. Ikke-25---- specifik toxicitet af Ida/MoAb-konjugater er ikke observeret irj vivo ved doser <8,0 mg/kg. Ida/MoAb konjugaterne har større iji vitro- og in vivo-effek- tivitet end daunorubicin/MoAb-konjugater.
Endvidere har nærværende opfindere fast-30 lagt Ida/MoAb-konjugaternes evne til specifikt at udrydde celle-populationer ved kobling af Ida til MoAbs, der vides at reagere med forskellige subpopulationer af lymphocyter (L3T4+, Ly-2+ og __ Thy-1+). Det-; har vist sig at være en overraskende j b effektiv metode til at udtynde celler. For eksempel DK 173792 IB1 4 kan anti-Ly-2.1-MoAb, der ikke har nogen målelig effekt _i_n vivo på Ly-2.1+-celler, omdannes til et effektivt cytotoxisk middel ved kobling med det cytotoxiske middel Ida.
5 Ved anvendelse af MoAbs over for Ly-2- og L3T4-antigener er det nu påvist, at Ida-MoAb kan eliminere målceller _in vitro og _in vivo. Der kan tilvejebringes Ida/MoAb-konjugater, som har større potentiale til specifikt at udtynde T-celle-sub-10 grupper, der er ansvarlige for transplantrejektion, end tilfældet er med antilymphocyt-globuliner eller anti-pan-T-celle-reagenser, såsom OKT3 MoAb.
Følgeligt er immunoglobulin-konjugaterne ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at idarubicin (Ida) er 15 konjugeret ved C-14 positionen til det nævnte antistof eller fragmentet deraf.
Ida er beskrevet i US patentpublikation US-A-4.077.988 . Fortrinsvis er fra to til otte Ida-molekyler forbundet kovalent til hvert antistof-20 eller antistoffragment-molekyle, navnlig fra to til seks. Ida-molekylerne er ifølge opfindelsen konjugeret ved 14-stillingen til det monoklonale antistof eller antistoffragmentet. De er fortrinsvis direkte forbundne, men det er muligt at indskyde en inert bærer 25 eller linker. Visse Ida'er kan imidlertid i stedet være bundet til det monoklonale antistof eller antistoffragmentet via aminogruppen. Dette kan opnås ved anvendelse af et nedbrydeligt peptid-afstandselement, en dextran-bærer, et syre-senisbilt afstandselement eller polyglu-30 taminsyre.
Grupper anvendt til binding omfatter carboxyl-syregrupper fra syntetiske polyaminosyrer, såsom poly-L-glutaminsyre og poly-L-asparaginsyre, eller inerte proteiner, såsom humant serumalbumin, eller 35 funktionaliserede dextraner, såsom carboxymethyl-dextran, kan fungere som bærere. Disse bærere kan 5 DK 173792 B1 variere i størrelse fra 10-60 kilodalton.
Typisk er hvert antistof eller antistoffragment specifikt for et antigen på overfladen af celler, mod hvilke det er ønsket at målrette 5 Ida. For eksempel kan antistoffet eller antistoffragmentet være specifikt for et ønsket målvæv, såsom en human neoplasme. Eksempler på humane neoplasmer, mod hvilke det kan være ønsket at målrette Ida, er bryst-, colon-, lunge-, prostata-10 ovarie-, thymus-cancer og andre cancerformer, sar-comaer og leukæmier. Antistoffet eller antistoffragmentet kan alternativt være specifikt for en dyreneoplasme. Et antistof eller antistoffragment, som er specifikt for human transferrin-receptor 15 {TFR), der findes på delende celler, erythroide precursorceller og celler fra forskellige tumorer, kan anvendes. Et egnet monoklonalt anti-TFR-anti-stof kan være et antistof frembragt over for trans-ferrin-receptoren på LiCR-LON-HMy-2(HMy-2)-celler.
20 Når immunoglobulin-konjugaterne er beregnet til anvendelse ved udtynding af en specifik T-lympho-cyt-population, er antistoffet eller antistoffragmentet specifikt for et celleoverflade-antigen, der selv er specifikt for nævnte T-lymphocyter.
25 Antistoffet eller antistoffragmentet kan derfor være specifikt for en population af hjælper-, suppressor- eller cytotoxiske T-lymphocyter.
Det monoklonale antistof eller antistoffragmentet er fortrinsvis fra samme art som den, hvor-30 til immunoglobulin-konjugatet skal gives. Et monoklonalt humant eller muse-antistof eller antistoffragment anvendes derfor typisk, hvor det er hensigten at give konjugatet til mennesker. Ligeledes foretrækkes det, at antistoffet eller anti-35 stoffragmentet er af IgG-klassen. Antistoffragmentet kan være Fab-, Fab'- eller F(ab1 )2~fragmentet. IgM-monomer, der kan være afledt af IgM-antistof 6 DK 173792 B1 ved proteolytisk enzymdigerering, kan også anvendes.
Immunoglobulin-konjugaterne fremstilles ifølge opfindelsen ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved, at man omsætter et 14-halogen-Ida omsat med det 5 monoklonale antistof eller fragmentet deraf. 14-Sub-stituenten kan være fluor, chlor, brom eller iod, men er fortrinsvis brom. 14-Brom-Ida er beskrevet i US patentpublikation US-A-4.125.607. Konjugering kan derfor opnås ved en fremgangsmåde, der indebærer; 10 (a) blanding af antistoffet eller fragmentet deraf med et molært overskud af 14-halogen-Ida, (b) omsætning af blandingen ved fra 18 til 37°C; (c) fjernelse af ethvert form for bundfald; (d) fjernelse af ikke reageret udgangsmateriale ved 15 gelfiltrering; og (e) fjernelse af adsorberet Ida ved adsorptionschro-matografi eller ionbytterchromatografi.
Trin (a) gennemføres typisk i et vand-blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom N,N-dimethyl-20 formamid. Det molære overskud af 14-halogen-Ida i trin (a) er fortrinsvis fra 0 til 50 fold. I trin (b) gennemføres reaktionen fortrinsvis over en periode fra 1 til 8 timer. Reaktionstemperaturen er typisk rumtemperatur.
25 Andre konjugeringsmetoder kan imidlertid anvendes. Når der ønskes et konjugat med en inert bærer eller linker indskudt mellem Ida og det monoklonale antistof eller antistoffragmentet, bliver bæreren eller linkeren typisk først bundet til 30 C-14-carbonatomet af Ida og derefter forbundet til antistoffet eller antistof fragmentet. Som ovenfor omtalt kan antistoffet eller antistoffragmentet også være bundet til Ida via aminogruppen under anvendelse af et nedbrydeligt peptid-afstandselement, 35 en dextranbærer, et syre-sensibilt afstandselement eller poly-glutaminsyre.
7 DK 173792 B1
Immunoglobulin-konjugaterne ifølge opfindelser kan anvendes til at behandle et menneske eller andet pattedyr, der lider af en cancer. En terapeutisk effektiv mængde af konjugatet kan anvendes.
5 Canceren kan være en fast cancer, en ascitestumor eller en leukæmi. Humane neoplasmer, der kan behandles, er omtalt ovenfor. Der kan anvendes to eller flere konjugater, hvor det monoklonale antistof eller antistoffragmentet i hvert konjugat 10 har en forskellig specificitet.
Et konjugat kan anvendes ved injektion.
Det kan gives parenteralt, for eksempel intravenøst
Det kan anvendes lokalt eller direkte i tumoren.
Den mængde af et konjugat, der gives en patient/ 15 vil afhænge af forskellige faktorer, såsom den tumor, der behandles, og patientens tilstand. Typisk kan imidlertid en dosis på fra 10 til 200 mg kon- 2 gugat gives pr. m af en patients legemsareal.
Konjugaterner kan gives sammen med andre kemote-20 rapeutiske midler eller sammen med midler, der fremmer aktiviteten af konjugaterne, f.eks. vaso-aktive midler eller tumor-nekrosefaktor.
Immunglobulin-konjugaterne kan også anvendes til specifikt at udtynde en subgruppe af T-lympho-25 cyter fra en population af celler. En terapeutisk effektiv mængde af et konjugat, inkorporerende et monoklonalt antistof eller antistoffragment rettet mod et celleoverflade-antigen, der findes på de lymphocyter, som skal udtyndes, kan gives 30 til et menneske eller dyr. Alternativt kan en cellepopulation inkuberes _in vitro sammen med et sådant konjugat.
35 8 DK 173792 B1
En kombination af konjugater rettet mod to eller flere celleoverflade-antigener kan anvendes.
Lymphocyterne, der skal udtyndes, kan være hjælper-suppressor- eller cytotoxiske T-celler.
5 Dette aspekt ved opfindelsen kan anvendes til at hindre rejektion af transplanteret væv i en transplant-recipient. Konjugaterne kan anvendes som immunosuppressive midler. En mængde konjugat, der er effektiv til at hindre transplantrejektion, 10 gives til transplant-recipienten. Det er fortrinsvis cytotoxiske T-celler, der kan udtyndes i dette tilfælde. Et menneske eller dyr med en cancer kan behandles ved udtynding af suppressor-T-celler ved indgift af et passende konjugat. Autoimmune syg-15 domme kan behandles ved anvendelse af et konjugat med det formål at udtynde hjælper-T-celler. I hvert enkelt tilfælde er anvendelsesvejen for og dosen af konjugatet, som ovenfor omtalt.
De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er 20 ejendommelige ved, at de omfatter en farmaceutisk acceptabelt bærer eller fortynder, og som aktiv ingrediens et immunoglobulinkonjugat ifølge opfindelsen eller fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen. Ethvert passende bærestof eller fortyndingsmiddel 25 kan anvendes. Egnede bærestoffer og fortyndingsmidler omfatter fysiologisk saltopløsning og Ringers dextrose-opløsning.
9 DK 173792 B1
Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler. På tegningerne angår Fig. 1 til 12 Eksempel 1, og Fig. 13 til 17 angår Eksempel 2,og de enkelte figurer viser følgende:
Fig. 1 viser strukturen af anthracyclin-5 derivater,
Fig. 2 viser koblingen af idarubicin (Ida) til anti-Ly-2.1 (0,5 mg). Mol af Ida inkorporeret pr. mol anti-Ly-2.1 () (venstre ordinat) og proteinudvinding (*) (højre ordinat) er vist som funktion 10 af antallet af nmol Ida i reaktionsblandingen (abeisse).
Fig. 3 viser antistof-titeren, målt som % rosette-dannende celler (ordinat) versus antistof-fortynding (-1 ) (abscisse), af anti Ly- 15 2.1-konjugater på ITT(1) 75 NS E3-målceller. Række- foryndinger gennemførtes på en 0,5 mg/ml opløsning af enten anti-Ly-2.1 (a) eller anti-Ly-2.1 med (2 (·) eller 8 (o) mol Ida/mol antistof.
Fig. 4 viser den inhibitoriske effekt af 20 Ida {) eller Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol antistof, (·) på E3-celler ved en 24 timers bestemmelse, 3 hvor % inhibition i [ H] thymidin-inkorporering (ordinat) er optegnet mod koncentration af Ida(M) (abscisse).
25 Fig. 5 viser den inhibitoriske effekt af
Ida (·), Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol antistof (·) eller Ida-anti-TFR, 5 mol Ida/mol antistof (o) på (Ly-2+) E3-celler ved en 30 minutters in- 3 hibitionsbestemmelse, hvor % inhibition i ( H] thymidin-inkorporering (ordinat) er optegnet mod koncentration af Ida(M) (abscisse).
Fig. 6 viser den inhibitoriske effekt af Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol Ida/mol antistof (o) og konjugat plus anti-Ly-2. 1 (·) på E3-målceller ved en 35 30 minutters specificitetsbestemmelse, hvor % in- 3 hibition i [ H] thymidin-inkorporering (ordinat) er optegnet mod koncentration af Ida(M) (abscisse).
10 DK 173792 B1
Fig. 7 viser væksten af E3 thymoma i CBF.- g ' mus injiceret subcutant med 2 x 10 celler. Grupper på 10 mus fik intravenøse behandlinger angivet ved en pil; PBS (□), Ida {), anti-Ly-2.1 (*),
Ida-anti-TFR ( o' eller Ida-anti-Ly-2.1 (·). Gennem- 5 smtlig tumorstørrelse (cm ) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor-inokulation (abscisse). Fejlgrænser repræsenterer + standardfejl for gennemsnittet .
Fig. 8 viser individuelle tumorvækstkur-10 ver for CBF.-mus injiceret subcutant med 2,0 x
g I
10 E3 tumorceller og behandlet intravenøst på dag 4 og 5 med Ida-anti-Ly-2.1-konjugat, Tumor-2 størrelse (cm )(ordinat) er optegnet mod dage efter tumorinokulation (abscisse).
15 Fig. 9 viser vækst af E3 thymoma i CBF.- g mus injiceret subcutant med 3,0 x 10 celler. Grupper på 10 mus fik intravenøse behandlinger angivet ved en pil; PBS (□), anti-Ly-2.1 (*), Ida (B) eller Ida-anti-Ly-2,1-konjugat (·). Gennemsnitlig tumor- 3 20 størrelse (cm ) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor-inokulation (abscisse). Fejlgrænser repræsenterer +· standard-fejl for gennemsnittet.
Fig. 10 viser vækst af E3 thymoma i CBF. - g * mus injiceret subcutant med 3,0 x 10 celler. Gru- 25 per på 10 mus fik intratumor-behandlinger angivet ved en pil; PBS(D), anti-Ly-2.1 (a), Ida () eller
Ida-anti-Ly-2.1-konjugat (·). Gennemsnitlig tumor-2 størrelse (cm ) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor-inokulation (abscisse). Fejlgrænser 30 repræsenterer + standardfejl for gennemsnittet.
Fig. 11 viser vækst af det humane COLO 205 tumor-xenotransplant i nøgne mus injiceret subcutant med 2 x 10^ celler. Grupper på 10 mus fik følgende behandlinger intravenøst angivet ved en 35 pil: PBS (a.), frit Ida (^) , Ida-250-30.6-kon jugat (·), blanding af Ida og 250-30.6 (Φ ) og 250.30.6 2 (*) , Gennemsnitlig tumorstørrelse (cm ) (ordinat) 11 DK 173792 B1 er optegnet mod dage efter tumor-inokulation (abscisse). Fejlgrænser repræsenterer + standardfejl for den gennemsnitlige tumorstørrelse.
Fig. 12 viser individuelle tumorvækstkurver for xenotransplantarede nøgne mus, der blev behand- 5 let i.v. (pil) med Ida-250-30.6-konjugat. Den brudte linie repræsenterer den gennemsnitlige tumorstør- 2 relse i PBS-behandlede mus. Tumorstørrelse (cm ) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor-inokulation (abscisse).
10 Fig. 13 viser koblingen af Idarubicin (Ida) til anti-L3T4 (0,5 mg). Mol af Ida inkorporeret pr. mol af anti-L3T4 (^) (venstre ordinat) og proteinudvinding (·) (højre ordinat) er vist som funktion af antallet af nmol af Ida i reaktionsbland-ingen (abscisse).
Fig. 14 viser antistoftiter målt som % roset-te-dannende celler (ordinat) versus antistoffortynding (x 10_1) (abscisse) af anti-Thy-1-konju-gater på ITT(1) 75NS E3-målceller. Rækkefortyndinger 20 gennemførtes på en 1,0 mg/ml opløsning af enten anti-Thy-1 (^) eller konjugat med 1 (o), 4 (·) eller 7 (φ) mol Ida/mol anti-Thy-1.
Fig.15 viser effekten af Ida-MoAb- og MoAb-behandling på antallet af L3T4+- og Ly-2+-celler 25 i milten i Ida-anti-L3T4-behandlede (·-·), anti-L3T4-behandlede {*-*.), Ida-anti-Ly-2. 1 -behandlede (·- - -·), anti-Ly-2. 1-behandlede (*- - -*) eller ubehandlede (□- - -□) mus, hvor % rosette-dannende celler (ordinat) er optegnet mod tid i dage (abscis-30 se).
Fig.16 viser effekten af kombineret Ida-MoAb-konjugat-behandling på overleven af et P3888D1-tumortransplant (tværs over H-2- og ikke-H-2-diffe-rencer) i CBA-mus. Grupper på 10-15 mus fik subcu-35 tan injektion med 8,0 x 10^ P388D1-tumorceller og fik én af følgende intravenøst (pil): (i) PBS (t ), ( i i) anti-L3T4 og anti-Ly-2.1 (o), (iii) Ida- 12 DK 173792 B1 anti-L3T4 (), (iv) Ida-anti-Ly-2. 1 (·) og (v)
Ida-anti-L3T4 og Ida-anti-Ly-2.1 (*). Gennemsnitlig 2 tumorstørrelse (cm ) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor-inokulation (abscisse). Fejlgrænser repræsenterer + standardfejl for gennemsnittet.
5 Fig.17 viser effektion af Ida-anti-Thy-1 - konjugat på overleven af et P388D1-tumortransplant i CBA-mus. Grupper på 10 mus fik subcutant injiceret 1,0 x 107 P388D1-tumorceller og fik intravenøst (pil) én af følgende: (i) PBS (□), (ii) anti-Thy- ^ 1 (·) og (iii) Ida-anti-Thy-1 (*). Gennemsnitlig 2 tumorstørrelse (cm ) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor-inokulation (abscisse). Fejlgra;nser repræsenterer _+ standardfejl for gennemsnittet.
Fig.18 viser vækst af COLO 205 ( 30.6+, 1 7.1+) — 15 xenotransplant i nøgne mus injiceret med 8 x 10f> celler/mus. Grupper på 10 mus blev behandlet intra-peritonealt, angivet ved en pil, med PBS (□), 17.1-Ida (o), 30.6-Ida (δ) eller en blanding af 30.6-Ida og 17.1-Ida (·). Gennemsnitlig tumorstørrelse 20 (cm^) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor- inokulation (abscisse). Fejlgrænser repræsenterer _+standardfejl for gennemsnittet. Den totale dosis af Ida var 200 yg.
Fig.19 viser vækst af humant LIM2210 colon-25 tumor-xenotransplant i nøgne mus implanteret med tumorfragment (1-5 mg). Grupper på 10 mus blev behandlet intravenøst, angivet ved en pil, med PBS {□), 17.1-Ida (φ), JGT-13-Ida (a), 27.1-Ida (·), 30.6-Ida (o). Gennemsnitlig tumorstørrelse 20 (cm^) (ordinat) er optegnet mod dage efter tumor- inokulation (abscisse). Fejlgrænser repræsenterer +standard-fejl for gennemsnittet. Den totale dosis Ida var 80 yg.
35 13 DK 173792 B1
Eksempel 1
Materialer og metoder.
Tumorceller 5 De i denne undersøgelse undersøgte cellelinier omfattede den murine (Ly-2+) thymoma ITT(1) 75 NS E3-variant (E3) (Smyth et al, J.Natl.Cancer Inst. 1986, 76, 503-510) , (Ly-2~, TFR-) lynphoma EL4 (Horowits et al, Science 1968, 160, 533-535), ^0 den humane (TFR+) cellelinie CEM (Foley et al,
Cancer 1965, J_8, 522-529) og den humane (250-30.6+)-cellelinie COLO 205. Celler holdtes iji vitro i Dul-becco's Modified Eagle's -medium (DME) eller RPMI 1640-medium (Flow Laboratories, Sydney, Australien), 15 suppleret med 10% varme-inaktiveret serum fra nyfødt kalv (Flow), 2mM glutamin (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australien), 100 pg/ml streptomycin (Glaxo, Melbourne, Australien) og 100 I.U./ml penicillin (Commonwealth Serum Laboratories). E^-20 Tumoren holdtes jjn vivo ved seriel passage i (C57BL/6 x BALB/c)F.|-mus (CBF^-mus). Celler fra ascitesvæsken blev vasket og centrifugeret (400 g x 5 min) to gange i phosphatpufret saltopløsning (PBS), pH 7,3, gensuspenderet i PBS og injiceret 25 subcutant (s.c.) i den abdominale væg hos mus.
Disse udvikledes til tydelige tumorer før behandling.
Mus blev underkastet en række intravenøse (i.v) eller intratumor- (i.t.) behandlinger, og den efterfølgende størrelse af tumorer blev målt dagligt 20 med en kalibermåler, idet der måltes langs de per-pendiculære akser af tumorerne. Data blev registreret som gennemsnitlig tumorstørrelse (produkt af to diametre +standardfejl).
25 Mus CBA- og (C57 BL/6xBALB/c) -mus (CBF^mus) og nøgne (nu/nu) mus blev frembragt i the Depart- DK 173792 131 14 ment of Pathology, University of Melbourne. Forsøgsgrupper på 8-10 mus, alle af samme køn og alder, anvendtes ved hvert forsøg.
Monoklonale antistoffer 5 Anvendte MoAbs var: (i) Anti-Ly-2.1 (IgGl) reaktiv med den murine Ly-2.1-specificitet (Hogarth et al, Immunology 1 982 ,£6^, 1 35- 1 44) og (ii) A3C6 (anti-TR) (IgGl) reaktiv med den humane transferrin-receptor (TFR) (Panaccio et al, Immunology and 10 Cell Biology, 65, 461-472, 1987), og (iii) et antistof, betegnet 250-30.6, reaktivt over for et antigen, der findes på humane coloncarcinomaceller.
Nævnte MoAbs blev isoleret fra ascitesvæske ved fældning med 40% ammoniumsulfat, opløsning 15 i PBS og dialyse med den samme puffer. Disse rå præparater blev enten absorberet på Protein-A-Sepha-rose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), vasket grundigt med PBS (pH 7,3) og elueret med 0,2 M glycin/HCl (pH 2,8), eller ledt gennem en 20 Affigel Blue-søjle (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd.,
Sydney). Efter neutralisation blev MoAbs derefter dialyseret mod PBS, opdelt i aliquoter og lagret ved -70°C. A3C6 vandtes ved at immunisere CBA-mus intraperitonealt med ugentlige intervaller i tre uger med 2x10^ LiCR-LON-HMy-2(HMy-2)-celler (OKT9+v*), idet miltene blev fjernet tre dage efter den sidste injektion og fusioneret med P3-NSI-AG4-1 (NS-1)-celler.
30 Fremstilling og kvantitetsbestemmelse af konjuqater Intakt anti-Ly-2.1, anti-TFR MoAb eller 250-30.6 (1-2 mg/ml i boratpuffer pH 8,0) blev blandet med et molært overskud (1-50) af 14-brom- 4-demethoxydaunorubicin (Br-Ida) opløst i {N,N)-35 dimethylformamid (DMF) ved 10 mg/ml. Reaktionen holdtes ved rumtemperatur i 4 timer før centrifugering (400 g x 5 minutter) for at fjerne ethvert 15 DK 173792 B1 bundfald. Frit Br-Ida og andre ikke-omsatte udgangsmaterialer blev fjernet ved gelfiltrerings-chroma-tografi under anvendelse af en Sephadex G-25-søjle (PD-10, Pharmacia), og konjugaterne blev derefter ledt gennem en søjle af Porapak Q (Millipore) for 5 at fjerne ethvert absorberet lægemiddel (Niedervie-ser et al, J. Ch romat og. 1971 , _54_, 215-223). Den mængde Ida, der var inkorporeret i lægemiddel-MoAb-konjugaterne, blev bestemt ved absorptionsevne-spektrofotometri ved 483 mm (E^gg = 3,4 x 10^M 'em 10 og ved proteinvurdering (Bradford, Anal.Biochem.
1976,22, 248-253).
Antistof-aktivitet
En bestemmelse af rosettedannelse, under 15 brug af fåre-(anti-mus)-immunoglobulin (SAMG), anvendtes til at bestemme antistof-aktiviteten af Ida-MoAb-konjugaterne sammenlignet med frit MoAb, der havde været underkastet de samme, ved koblingsmetoden anvendte processer (Parish og McKenzie, 20 J.Immunol.Methods 1978, 20,173-183).
Lægemiddel-aktivitet (a) 24 Timers inhibitionsbestemmelse: 100 μΐ celler (2-5 x 10^/ml) blev sat til en fladbundet 25 mikrotiterplade og inkuberet i 1 time ved 37°C.
Frit idarubicin (Ida) (opløst i PBS) og Ida-MoAb-konjugater blev filtreret aseptisk, og der blev lavet fortyndinger i steril PBS. 50 μΐ Frit Ida eller konjugat blev sat til cellerne under anvend-30 else af duplikat-rum . til hver prøve. Kontrol beholderne fik 50 μΐ PBS, og cellerne blev dyrket ved 37°C, 7% COj i 24 timer.
(b) 30 minutters inhibitions-bestemmelse: 200 μΐ af celler (2-5 x 10^/ml) blev indsamlet i sterile 55 Eppendorf-rør, gensuspenderet i sterilt lægemiddel eller konjugat og blandet i 30 minutter ved 37°.
Celler blev derefter centrifugeret (400 g x 5 minut- 16 DK 173792 B1 ter), gensuspenderet i vækstmedium, og 100 yl's aliquoter blev podet ind i en mikrotiterplade under anvendelse af duplikat-rum . til hver prøve, før en inkubationsperiode på 16-24 timer. Efter inkubationsperioden ved begge disse bestemmelser 5 blev 50 μΐ vækstmedium indeholdende 1 yCi af [ ] — thymidin (specifik aktivitet = 5 Ci/mmol, Amersham) tilsat, og pladerne blev inkuberet i 2-4 timer.
Celler blev derefter indhøstet og tørret og individuelle prøver blev adskilt og talt på en beta-10 scintillationstæller. Inkorporering af [^H]-thymi-din blev udtrykt som en procentuel inkorporeringsinhibition sammenlignet med kontrolbetemmelser.
Standardfejl for ethvert trin blev tilvejebragt ved duplikat-bestemmelser og oversteg ikke 5% for 15 noget forsøgstrin.
Toxicitet
Grupper på 10-20 CBA-mus fik en enkelt i.v.-injektion af forskellige doser af Ida eller Ida-20 anti-Ly-2.1, og musenes overleven blev registreret overfor den givne lægemiddeldosis i mg/kg. Organerne fra disse mus blev fjernet og vejet forud for formalinfiksering og farvning med haematoxylin og eosin.
25
Resultater
Fremstilling og karakterisering af konjugater Br-Ida (Fig.1) blev koblet kovalent til flere MoAbs: overfor det humane TFR, overfor et 20 antigen tilstede på humane coloncancerceller (antistof 250-30.6) og overfor det murine Ly-2-allo-antigen. Reaktionsbetingelser for konjugering blev etableret ved at variere det molære overskud af Br-Ida sat til MoABs og gøre et kompromis mellem 25 højere Ida-inkorporering og lavere protein-udvindinger. Ida-anti-Ly-2.1 (Fig.2), Ida-anti-TFR og Ida-250-30.6 (data ikke vist) inkorporerede 3 til 17 DK 173792 B1 5 molekyler Ida med proteinudvindinger større end 50%. Reaktion af Br-Ida med MoAbs kunne give anledning til to typer af bindinger {Fig. IC og D).
For at afgøre, hvilken der forelå, blev konjugater udsat for pH 4,5 eller pH 9,0 i 48 timer, frigjort 5 frit lægemiddel blev absorberet ind i Porapak Q, og prøverne blev igen kvantitetsbestemt ved spek-trofotometri. 50% af det bundne lægemiddel blev frigjort ved udsættelse for base (pH 9,0), mens intet tab blev observeret ved pH 4,5. Dette lader 10 formode, at mindst 50% af lægemidlet er esterbundet (Fig.lD), da esterbindingen er sensibil over for basiske betingelser, mens aminbindingen er stabil.
Antistof-aktivitet 15 Antistof-titrene før og efter konjugering måltes ved rosettedannelsesmetoden og blev bestemt som den fortynding, ved hvilken 50% af målcellerne viste rosetter. Ida-anti-Ly-2.1-konjugater indeholdende 2 og 8 molekyler af Ida havde antistof-20 titre overfor E3-celler på henholdsvis 1:56.000 og 1:33.000, mens titeren for ikke-konjugeret antistof var 1:80.000 (Fig.3). Ida-250-30.6-konjugater indeholdende 2 og 6 molekyler af Ida havde antistof-titre over for COLO 205-celler på henholdsvis 1:16.000 25 og 1:11.000, mens titeren for ikke-konjugeret antistof var 1:33.000. Der er således et vist tab af antistof-aktivitet som følge af konjugeringspro-cessen. Konjugater med mindre end 6 molekyler Ida pr. molekyle MoAb anvendtes til ijn vitro- og i^n 30 vivo-undersøgelser. Det blev bemærket, at opløseligheden og antistof-aktiviteten af Ida-anti-Ly- 2.1-konjugater faldt betydeligt under disse niveauer for Ida-inkorporering (data ikke vist). Det maksimale antal af Ida-molekyler, der med fordel 35 kan inkorporeres, vil variere med det individuelle antistof.
18 DK 173792 B1
In vitro-aktivitet af idarubicin og idarubicin-MoAb-konjugater
In vitro-cytotoxiciteten af Ida og to Ida-MoAb-konjugater på den murine ITT(1)75NS El-cellelinie (Ly-2+TFR~) og den humane CEM-cellelinie 5 (Ly-2 TFR+) blev målt ved en 24 timers inhibitions- bestemmelse, og værdier for ID,_q (50% inhibition ved [^H]-thymidin-inkorporering sammenlignet med kontrolbestemmelser) blev bestemt. Resultater er vist i Fig.4 og Tabel I. ID,-q for Ida lå i området 10 fra 1,0 til 2,5 x 10 7M for begge testede cellelinier (Fig.4, Tabel I). ID^g for Ida-anti-Ly-2.1 på E3 var 4 gange større (Fig.4), og for Ida-anti-TFR på CEM var ID^Q-værdierne 1-2 gange større end værdierne for frit Ida (Tabel I). Frit Ida 15 var derfor mere cytotoxisk over for både E3 og CEM end Ida-anti-Ly-2.1 og Ida-anti-TFR. Disse Ida-MoAb-konjugater viser imidlertid en 10 fold lavere cytotoxicitet over for ikke-reaktive cellelinier (Tabel I), hvilket viser, at deres cytotoxiske 20 aktivitet var specifik og stammede fra deres retention af antistof-aktivitet (Fig.3.).
Tabel I
Effekt af idarubicin-(monoklonalt anti-25 stof)-konjugater på tumorceller1.
Gennemsnitlige ID^Q-værdier bestemt for Tumor- ' Ida Ida-anti-Ly-2.1 Ida-anti-TFR
cellelinie 30___ E3 1,2 x 10"7 4,3 x 10-7 2,3 x 10_i (5)7 (3) (2) CEM 2,2 x 10"7 2,0 x 10'* 3,0 x 10"7 35 (5) (2) (3) 19 DK 173792 B1 11D50 = 50% inhibition ved []-thymidin-inkorporering, 2 = antal testede præparater.
Ida-250-30.6-konjugaterne var lidt mindre aktive end frit Ida. Frit Ida havde en ID^q på 5 6x10~®M, mens konjugatet havde en ID^q på 3,5 x 10-7M på målcellelinien COLO 205.
For at undersøge, om konjugaterne var selektive i deres cytotoxiske aktivitet over for målcellerne, blev Ida-anti-Ly-2.1 og Ida-anti-TFR 10 inkuberet i 30 minutter med E3 (Ly-2+)-celler forud for bortvask af ikke-bundet konjugat og måling af cytotoxiciteten. Ida-anti-Ly-2.1-konjugatet havde en ID^q på 6,2 x 10 7M sammenlignet med en ID^q på 5,2 x 10 7M for frit Ida (Fig.5). I mod-15 sætning hertil havde det ikke-reaktive Ida-anti- TFR-konjugat en ID^q på 5,0 x 10_^M, dvs. 10 gange større end værdien for frit Ida, hvilket viser, at den antistof-bindende aktivitet af Ida-anti-Ly-2.1-konjugatet resulterede i dets selektive 20 cytotoxicitet. Tilsvarende blev Ida-250-30.6-konjugatet og frit lægemiddel inkuberet i 30 minutter med COLO 205 (250-30.6 +ve )-og E3 ( 250-30.6 -vejcellelinier forud for vask og gennemførelse af cytotoxicitetsbestemmelsen. Begge cellelinier viste 25 en dosis-respons svarende til frit lægemiddel, dvs. 9,2 x 10~7M for COLO 205 og 9,8 x 10"*7M for E3. Imidlertid var Ida-250-30.6-konjugatet 4 gange mere toxisk over for COLO 205 end over for den antistof-ikke-reaktive E3-cellelinie. Tilsvarende 30 resultater blev opnået ved anvendelse af CEM-celle- linien og Ida-anti-Ly-2.1 som en ikke-reaktiv kontrol (data ikke vist). For endvidere at sikre, at cyto-toxiciteten af Ida-MoAb-konjugater over for målceller var specifik og forekom ved antistof-bindings-35 stedet, blev der gennemført undersøgelser med henblik på at inhibere konjugat-cytotoxicitet under anvendelse af frit MoAb. Ved en Ida-koncentration 20 DK 173792 B1 på 4,0 x 10 6M (2 ug anti-Ly-2.1) blev cytotoxiciteten af anti-Ly-2.1-konjugatet på E3-celler reduceret med 70% ved tilsætning af 50 ug (250 yg/ml) af anti-Ly-2.1 (Fig.6), hvilket viser, at cytotoxi-citeten af Ida-anti-Ly-2.1-konjugatet har direkte 5 relation til dets antistof-bindende aktivitet.
Tilsvarende kontrolresultater blev opnået med 250-30.6. Det skal bemærkes, at ved alle bestemmelser var frit anti-Ly-2.1, anti-TFR og 250-30.6 ikke-cytotoxiske (data ikke vist).
10
In vitro-behandling af den murine thymoma ITT(1) 75NS E3
For at bestemme vækstinhibitionen af faste tumorer blev grupper af CBF^mus (10 pr. gruppe), der var inokuleret s.c. med 2,0 x 106 E3-celler i den abdominale region, behandlet med i.v.-injektioner af én af følgende: (i) PBS, (ii) anti-Ly-2.1, (iii) Ida, (iv) Ida-anti-TFR eller (v) Ida-anti-Ly-2. 1. Mus fik henholdsvis 20 ug af Ida og/el- 20 ler 1200 ug af anti-Ly-2.1 på dag 4 og 5 (tumor- 2 størrelse = 0,1 cm ) efter tumorinokulation.
I løbet af 24 timer efter den første behandling havde de Ida-anti-Ly-2.1-behandlede mus en gennemsnitlig tumorstørrelse på 20% af PBS-behand-lede mus (dvs. en 80% reduktion af tumormasse (Fig.7)).
Det var klart, at anti-Ly-2.1 alene og Ida covalent bundet til det ikke-specifikke anti-TFR-MoAb ikke påvirkede E3-tumorvækst. Tumorerne hos mus, der fik Ida alene, blev reduceret med op til 50%, men 30 3 af disse mus døde, og de andre havde en legems vægtreduktion på 25%. Individuelle tumorvækstkurver for mus, der fik Ida-anti-Ly-2.1, viste regression for 9 ud af 10 tumorer under behandlingsforløbet (Fig.8). Ud af 10 tumorer var 5 fuldstændigt re-•*5 gresseret og viste sig ikke igen (>200 dage), og de tumorer, der fortsatte med at vokse ved behandlingens afslutning (5 ud af 10), voksede langsommere 21 DK 173792 B1 end tumorerne hos PBS- og Ida-anti-TFR-behandlede mus. Et yderligere forsøg gennemførtes for at undersøge i.v.-behandling af større tumorer under anvendelse af Ida-anti-Ly-2.1. Grupper af CBF.-mus (10 * g pr. gruppe) blev inokuleret med 3,0 x 10 E3-celler, 5 og mus fik derefter henholdvis 15 ug og 900 pg
Ida og anti-Ly-2.1 på dag 6 (tumorstørrelse = 0,2 o cm ) og dag 7 efter tumorinokulation (Fig.9). Ida-ant i-Ly-2 . 1 -behandlede mus havde en gennemsnitlig tumorstørrelse på 50% af størrelsen hos PBS-behand-lede mus, og på 66% af størrelsen hos Ida-behand-lede mus på dag 7, og denne tendens fortsatte til undersøgelsens afslutning (dag 18). Individuelle tumorvæsktkurver for de 10 CBF^-mus, der fik Ida-anti-Ly-2.1, viste, at der var 4 regressioner og 15 1 fuldstændig fjernelse af tumormasse (>200 dage, data ikke vist). Ida-anti-Ly-2.1 var derfor effektivt over for større tumorer, og ved begge forsøg var anti-tumor-aktiviteten af Ida betydeligt forbedret ved kobling til anti-Ly-2.1-MoAb.
20
In vivo-behandling af den humane colontumor COLO 205
Effekten af Ida-anti-250-30.6-konjugat blev bestemt på nøgne (nu/nu) mus bærende COLO 205-xeno-25 transplanter.
Injektion af 2x106 celler subcutant i den abdominale væg gav en tydelig klump i løbet af 4 dage (ca. 0,1 cm ). Grupper på 10 mus blev derefter behandlet med i.v.-injektioner af én af følgende: 50 (i) PBS, (ii) 250-30.6, (iii) Ida plus 250-30.6 (ikke-konjugeret), (iv) Ida, (v) Ida-250-30.6-kon-jugat. Ialt 275 yg Ida blev givet i en række på 5 intravenøse injektioner på dag 4, 5, 6, 10 og 12 efter tumorinokulation.
55 Ingen terapeutisk effekt var synlig hos de grupper af mus, der var behandlet med PBS eller med ikke-konjugeret 250-30.6. Med Ida alene overlevede 22 DK 173792 B1 2 ud af 10 mus, mens alle musene i den gruppe, der fik ikke-konjugeret Ida plus 250-30.6, var døde på dag 7 med forudgående symptomer på toxicitet, såsom vægttab.. De mus, der fik Ida-250-30.6-kon-jugatet, viste en dramatisk reduktion i tumorstør-5 relse. Disse resultater er vist i Fig.11. I mod sætning hertil viste tumorvækstkurver for individuelle mus (Fig.12), at 5 ud af de 10 mus havde tumorer, der var regresseret på dag 7. Disse tumorer fortsatte derefter med at vokse efterladende 2 ^ ud ag 10 mus uden tumorer. Disse mus viste ingen effekter som følge af toxicitet.
Intratumorbehandling
Intratumorterapi har vist sig at være en 15 nyttig teknik til immunoterapi af tumorer hos dyr og mennesker. Der blev derfor gennemført undersøgelser for at karakterisere anti-tumor-aktiviteten af Ida-anti-Ly-2.1-konjugater, når disse blev indgivet direkte i den faste E3-tumor. Grupper på 10 CBF.- o Λ 6 u mus implanteret s.c. med 3.0x10 E3-celler udviklede 2 tumorer (0,1-0,2 cm ) 5 dage efter tumorinokulation. Behandlingerne bestod i 2 injektioner på dag 5 og 6 efter tumorimplantation, idet mus fik én af følgende behandlinger: (1) PBS, (2) Ida, (3) Anti- ^ Ly-2.1 eller (4) Ida-anti-Ly-2.1 (totalt Ida = 30 ug),Ida-anti-Ly-2.1 viste den største antitumoraktivitet, mens frit Ida og anti-Ly-2.1 alene ikke påvirkede tumorvækst ved direkte indgift i tumoren. Ida-anti-Ly-2.1-behandlede mus havde en gennem-snitlig tumorstørrelse på 60% af størrelsen hos PBS-behandlede mus på dag 8 og 30% af størrelsen hos PBS-behandlede mus på dag 13 (Fig.10). Individuelle tumorvækstkurver (data ikke vist) for Ida-anti-Ly-2 .1-behandlede mus viste 1 fuldstændig 35 regression, mens de øvrige mus viste en forhalet reduktion i tumorvækst 3 dage efter behandlingens afslutning.
23 DK 173792 B1
Toxicitet
Til forsøg vedrørende akut toxicitet fik grupper på 10 CBA (Ly-2.1+)-mus en enkelt injektion af forskellige doser af enten Ida, Ida-anti-Ly- 2.1 eller Ida-anti-TFR. Alle mus, der havde fået injektion med Ida, viste et indledende vægttab på op til 25% af den oprindelige vægt. Ingen vægttab blev imidlertid observeret hos mus, der var behandlet med hvert Ida-MoAb-konjugat. Tabel II viser toxiciteten af Ida og Ida-MoAb-konjugater ^ udtrykt som LD,.q- og LD^^-værdier. Som vist var LDjq af Ida-anti-Ly-2.1 10,0 mg/kg af Ida sammenlignet med kun 0,75 mg/kg for frit Ida. Endvidere havde Ida-anti-TFR-konjugatet en LD.^ på 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-konjugater blev ikke testet for en LD^q-^ dosis. Disse resultater viser det større terapeutiske indeks for Ida-MoAb-konjugater sammenlignet med frit Ida.
Tabel II
Effekten af idarubicin-(monoklonalt antistofikon jugater på CBA-mus.
Ida (mg/kg) 25
Ida 0/75 3,00
Ida-anti-Ly-2.1 10,00 N.T.
Ida-anti-TFR 15,00 N.T.
30 N.T. = ikke testet 35 DK 173792 B1 ih H i stopatolog i ske resultater
Akut effekt: Den intravenøse indgift af frit Ida (1,0 mg/kg) resulterede i atrofi af den hvide pulp i milten 15 dage efter behandling og nogen hypertrofi af hjertemuskelfibre (data ikke 5 vist). I modsætning hertil medførte en enkelt dosis af Ida-anti-Ly-2.1 (2,4 mg/kg) ingen specifik vævs-toxicitet efter 15 og 30 dage, omend der på dag 15 blev observeret nogen opsvulmning af hepato-cyter.
10
Eksempel 2
Materialer og metoder Mus (DBA/2 x BALB/c)F^- og CBA-mus blev frem-15 bragt i the Department of Pathology, University of Melbourne. Forsøgsgrupper på 10-20 mus, alle af samme køn og alder, anvendtes ved hvert forsøg.
Tumorceller
De cellelinier, der undersøgtes ved denne undersøgelse, omfattede den murine (Ly-2+)thymoma (ITT(1)75NS E^-variant (E^), (L3T4+)-lymphomaen EL4 (Horowitz et al, Science 1968, 160, 533-535), den humane colon-carcinoma Colo 205 (Semple et 25 al, Cancer Res. 1978, _38, 1345-1 355) og den humane (Ly-2 , L3T4 ) T-celle-leukæmi CEM (Foley et al,
Cancer 1965, J_8, 522-529). Celler holdtes i_n vit.ro, som beskrevet i Eksempel 1. P388D1-makrophagcelle-linien holdtes J^n vivo ved seriel passage i (DBA/2 x BALB/c)-mus. Celler fra ascitesvæsken blev vasket og centrifugeret (400 g x 5 min) to gange; i phosphat-pufret saltopløsning (PBS, pH 7,3), gensuspenderet i PBS og injiceret s.c. i den ab-dominale væg på mus, hvor de udviklede tydelige tumor-transplanter. Mus blev derefter underkastet en række i.v. behandlinger, og størrelsen af tumorerne blev mål dagligt med en kalibermåler, idet der 25 DK 173792 B1 måltes langs de perpendikulaere akser af tumorerne.
Data blev registreret som gennemsnitlig tumorstørrelse (produkt af to diametre + standardfejl).
Monoklonale antistoffer 5 Monoklonale antistoffer over for de murine celleoverflade-antigener L3T4, Ly-2 og Thy-I, der karakteriserer forskellige subpopulationer af lym-phocytter, anvendtes som modelsystem.
Anvendte MoAbs var: (i) anti-Ly-2.1 (murin IgG2a) reaktiv med den murine Ly-2.1-specificitet (Horgarth et al, Immunology 1982, ^6, 135-144): (ii) H129.19 (anti-L3T4) (rotte IgG2b) reaktiv med den murine L3T4-specificitet (Pierres et al, J.Immunology 1984, 132, 2775-2782), og (iii) anti-15 Thy-1 (rotte igG2b) reaktiv med murine T-celler (Marshak-Rothstein et al, J.Immunology 1979, 122, 2491-2497). Antistofferne blev isoleret, renset og lagret, som beskrevet i Eksempel 1. Antistof-aktivitetet blev bestemt ved rosettedannelse-bestem-20 melse med fåre-(anti-mus)-immunoglobulin (SAMG), som beskrevet i Eksempel 1.
Fremstilling af idarubicin-(monoklonalt antistof)-konjugater.
25 Et MoAb (1-2 mg/ml) blev blandet med et 5-20 molært overskud af 14-brom-4-demethoxydau-norubicin (Br-Ida), der var opløst i (N,N)-dimethyl-formamid (10 mg/ml), i 4 timer ved pH 8,0 (0,05 M boratpuffer) og rumtemperatur. Reaktion forløb, 50 rensning gennemførtes, og mængden af Ida inkorporeret i det resulterende konjugat blev bestemt, som beskrevet i Eksempel 1.
Lægemiddel-aktivitet 35 To bestemmelser (24 timer og 30 minutter) gennemførtes for at bestemme lægemiddel-aktivitet, som beskrevet i Eksempel 1, under anvendelse af 26 DK 173792 B1 celler ved en koncentration på fra 1 til 5 x lO^/ml.
Serologi
En rosettedannelsesmetode anvendtes ved alle disse forsøg til at bestemme antistof-titer 5 og antal af L3T4+- og Ly-2+-celler. Denne metode indebar binding af SAMG, der også påviser rotte-immunoglobulin (Ig) koblet til røde fåre-blodlegemer (SRC), med henblik på at påvise antistoffer på overfladen af lymphoide celler. Ig+-miltceller 10 fik overflade-Ig'et fjernet ved dækning med SAMG (25 pi og 2 ml. celler ved lo'Vpl). Celler holdtes derefter på is i medium indeholdende 0,01% natrium-azid for at forhindre resyntese af immunoglobulin.
15 Resultater
Undersøgelsen gennemførtes i separate faser: (a) _i_n vitro-karakteriserinq af tre forskellige Ida-MoAb-konjugater og (b) efterfølgende påvisning af deres anvend-20 else ved aktiv udtynding af T-celle-subgrupper før eller under rejektion af et tumorcelle-allo-transplant.
Fremstilling og karakterisering af konjugater 25 Br-Ida blev koblet kovalent til MoAb over for de murine L3T4-, Ly-2- og Thy-1-antigener. Reaktionsbetingelser for konjugeringen blev etableret ved at variere det molære overskud af Br-Ida, der blev sat til MoAb, og gøre et kompromis; 30 mellem højere Ida-koncentration og lavere proteinudvindinger. Ida-anti-L3T4 (Fig.13), Ida-anti-Ly- 2.1 og Ida-anti-Thy-1 (data ikke vist) inkorporerede 3-6 molekyler Ida, med protein-udvindinger større end 50%.
35 27 DK 173792 B1
Anti stof-aktivitet
Antistof-titrene før og efter konjugering blev målt ved rosettedannelsesmetoden og blev bestemt som den fortynding, ved hvilken 50% af Elmålcellerne viste rosetter. Ida-anti-Thy-1-konju-5 gater indeholdende 1, 4 og 7 molekyler Ida havde antistof-titre på henholdsvis 1:425.000, 1:170.000 og 1:130.000, mens titeteren for det ikke-modi-ficerede antistof var 1:550.000 (Fig.14). Der er således noget tab i antistof-aktivitet ved kon-10 jugering til Ida. Konjugater med mindre end 4 molekyler Ida pr. molekyle MoAb anvendtes imidlertid til Jjn vitro- og _i£ vivo-undersøgelser. Tilsvarende faldt antistof-aktiviteten af både Ida-anti-Ly- 2.1- og Ida-anti-L3T4-konjugat (data ikke vist) 15 betydeligt ved inkorporering af mere end 6 mol Ida pr. molekyle MoAb.
In vitro-lægemiddelaktivitet
Cytotoxiciteten af Ida-MoAb-konjugaterne 20 blev testet på forskellige reaktive målceller under anvendelse af en 24 timers bestemmelse og sammenlignet med cytotoxiciteten af frit Ida. Aktiviteten af frit Ida var 4-10 gange større end aktiviteten af Ida-MoAb-konjugaterne, med ID5Q (50% inhibition 25 ved [3H]-thymidin-inkorporering sammenlignet med kontrolbestemmelser) for frit Ida beliggende ved — 8 6,6-9,0 x 10 M over for de testede tumor-cellelinier. Det var klart, at Ida-anti-Ly-2.1-konjugatet var det mest cytotoxiske konjugat (ID,-q = 4,3 x 30 10~^M), testet over for ITT(1)75NS E3-cellelinien, der er en varient af den native cellelinie beriget for Ly-2-antigenet. For at undersøge selektiviteten af konjugataktivitet over for målceller blev Ida-MoAb-kon jugater inkuberet i 3 minutter med målceller 35 forud for bortvask af ikke-bundet konjugat og måling af cytotoxicitet. Ved anvendelse af denne 30 minutters bestemmelse havde de ikke-reaktive ida-MoAb- 28 DK 173792 B1 konjugater en ID5Q 10-50 gange større end ID5Q for frit Ida, hvilket viser, at antistofbinding var afgørende for Ida-MoAb-konjugat-cytotoxicitet.
Det skal bemærkes, at intet af det ved undersøgelsen anvendte MoAb havde en cytotoxisk aktivitet på 5 målceller i_n vitro ved fravær af komplement. Resultater er samlet i Tabel III.
10
Tabel III
Effekten af idarubicin-(monoklonalt antistof)-kongugater
Gennemsnitlig på tumorceller^ .. Gennemsnitlige IDcri-værdier (Ida (M)) bestemt for
Tumor cel le- Bestem- ^ 50 ^ linie_melse Ida Ida-anti-Ly-2,1 Ida-anti-L3T4 Ida-anti-lhy-1 E3 24hr2 7,8x10"8 4,3x10-7 N.T. 9,0x10-7 30min3 1,8x10~7 4,3x10~7 N.T. I,2x10~6 EL4 24hr 6,6x10~8 N.T. 6,0x10-7 N.T.
30min 1,6x10~7 N.T. 6,2x10-7 N.T.
2Q CEM 24hr 9,0x10~8 N.T. N.T. N.T.
30min 2,2x10-7 6,0x10~6 N.T. N.T.
Colo 205 24hr 8,0x10_8 N.T. N.T. NiT.
30min 1,2x10~7 N.T. 4,0x10_6 5,8χ1θ“6 1 ID50 = 50% inhibition ved [3H]-thymidin-inkorporering sarmen- 25 lignet med kontrolbesterrmelser 2 anvendelse af en 24 timers cytotoxicitetsbestenmelse 3 anvendelse af en 30 minutters bestemnelse N.T = ikke testet.
30 35 29 DK 173792 B1
In vivo-styrke af idarubicin-(monoklonalt antistof)-konjugater
Den immunosuppressive i_n vivo-styrke af Ida-MoAb-konjugaterne blev sammenlignet med styrken af MoAb alene ved at teste, konjugaternes evne til 5 selektivt at udtynde L3T4+- eller Ly-2+-celler fra milten. CBA-mus fik i.v.-injektioner af anti-Ly-2.1- eller anti-L3T4-konjugat (30 ug Ida/1,5 -f- mg MoAb) på dag 0, 2 og 10, og antallet af Ly-2 -eller L3T4+-celler i milten fulgtes ved rosette-10 dannelsesbestemmelsen. For hver behandling blev miltcellerne fra to behandlede mus undersøgt på hver dag, og gennemsnittet af resultaterne fandtes (Fig.15). Der var et hurtigt fald af antallet af L3T4+-celler fra omtrent 30% af alle miltceller 15 hos normale mus på dag 0 til omtrent 4% i Ida-anti-L3T4-behandlede mus på dag 20. Disse L3T4+-celler forblev udtyndede i mere end 60 dage, før en gradvis stigning blev observeret. Udtyndingen efter in vivo-behandlina med anti-L3T4 alene førte også 20 til skarpt fald i L3T4+-celleantal (30% til 5%).
Ida-anti-Ly-2.1-konjugatet sænkede Ly-2+-miltcelleantallet fra 25% til 5% på dag 10. Antallet af Ly-2+-celler begyndte imidlertid at stige på dag 15 og vendte tilbage til det normale på dag 25 40-50. Det var af interesse, at anti-Ly-2.1-MoAb alene var ude af stand til at udtynde Ly-2+-celler signifikant. Variation i antallet af Ly-2+- og L3T4 -celler hos ubehandlede kontrolmus mentes at skyldes naturlig variation mellem mus. Det var 30 således klart, at både Ida-anti-L3T4 og Ida-anti-Ly-2.1 kunne udtynde henholdsvis L3T4 - eller Ly-2 -celler fra miltene hos behandlede mus langt mere effektivt end MoAb alene. Effekten af Ida-anti-Ly-2 .1-konjugatet er vigtig, da anti-Ly-2.1-35 MoAb er fuldstændigt uden effekt anvendt alene, men kan omdannes til et virksomt immunosuppressivt middel ved kobling til Ida. Udtynding understøttet 30 DK 173792 B1 af lægemiddel-MoAb-konjugaterne var derfor egnet til undersøgelse af rollen af Ly-2+- og L3T4-celler in vivo ved transplantrejektionsresponsen.
Effekt af Ida-anti-L3T4, Ida-anti-2.1 og Ida-anti-^ Thy-1 på tumortransplant-overleven
Ved disse forsøg anvendtes Ida-anti-L3T4-, Ida-anti-Ly-2.1 - og Ida-anti-Thy-1-konjugater til at forøge overlevelsestiden for P388D1-tumortrans-planter i CBA-mus, idet allotransplanterne var tværs over H-2-(klasse I og II) og ikke-H-2-barri-erer.
a) Kombineret konjugatbehandling
Grupper på 10-15 CBA-mus fik s.c.-injektion 15 med 8,0x10^ P388D1-tumorceller og fik i.v., på dag -1, 0(=dag for tumorinokulation), 3, 5 og 10 én af følgende:: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 og anti-
Ly-2.1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti-Ly-2.1 og (v) Ida-anti-L3T4 og Ida-anti-Ly-2.1. Den totale 20 mængde Ida og MoAb modtaget var henholdsvis 125 ug og 5,75 mg. Tumor-transplanterne hos både PBS- og MoAb-behandlede mus overlevede 14-17 dage med en maksimal gennemsnitlig tumorstørrelse på 0,31 2 cm , hvilket viser, at begge ikke-konjugerede MoAb 25 sammen var ude af stand til effektivt at udtynde L3T4 - og Ly-2 -celler, således at tumor-transplantet kunne overleve (Fig.16). Endvidere var Ida-anti-
Ly-2. 1 eller Ida-anti-L3T4 alene kun i stand til at forlænge transplant-overleven (dag 20-28) med 30 maksimale gennemsnitlige tumorstørrelser på 0,40 2 2 cm til 0,50 cm . Det er sandsynligt, at Ida-anti-Ly-2. 1 eller Ida-anti-L3T4 alene ikke fjernede alle T-celler, og en stærk antigenisk udfordring (som set med hele MHC-differencer) var i stand 35 til at stimulere de tilbageværende Ly-2+- og L3T4-celle til at formeres og fremkalde en rejektions-respons. I modsætning hertil gjorde en kombination 31 DK 173792 B1 af de to Ida-anti-Ly-2.1 - og Ida-anti-L3T4-konju-gater det muligt for 14/15 P388D1-tumortransplanter at undgå rejektion og forøges i størrelse, indtil mus blev dræbt (dag 50 - 2,00 cm ). Det blev observeret, at nogle få af disse konjugat-behandlede P388D1-tumorer viste nogen regression i størrelse fra dag 8 til dag 16. Fortsat udtynding af L3T4+-og Ly-2+-celler (dag 10) gjorde det imidlertid muligt for P388D1-tumortransplanterne at etablere vedvarende tumorvækst.
10 (b) Ida-anti-Thy-1-konjugat
Grupper på 10 CBA-mus fik s.c.-injektion med 107 P388D1 -tumorceller og fik én af følgende i.v. på dag -1, 0, 5 og 6: (i) PBS, (ii) anti-Thy-^ 1 og (iii) Ida-anti-Thy-1. Den totale mængde af
Ida og anti-Thy-1 modtaget var henholdsvis 130 ug og 5,4 mg, og tumortransplanterne hos PBS-behandlede mus overlevede i 15 dage. Anti-Thy-1-MoAb'et alene opretholdt tumortransplant-overleven i 28-32 dage, 20 med en maksimal gennemsnitlig tumorstørrelse på 0,58 cm2 (dag 6) (Fig.17). Blandt Ida-anti-Thy- 1-behandlede mus var 30% af tumor-transplanterne udstødt fuldstændigt på dag 40, mens de resterende 70% fortsatte at vokse, og til slut (dag 32) gjorde 25 det muligt for gruppens gennemsnitlige tumorstørrelse at stige. Derfor var Ida-anti-Thy-1, ligesom kombinationen af Ida-anti-Ly-2.1 og Ida-anti-L3T4, i stand til at udtynde Ly-2+- og L3T4+-celler, således at en hovedpart af P388D1-tumortransplanter 30 overlevede i CBA-mus med fravær af en normalt hurtig rejektions-respons.
Eksempel 3
Konjugater blev fremstillet ved fremgangs-35 måden beskrevet i Eksempel 1, mellem Ida og det monoklonale antistof 17.1 (Thompson et al, Proc.Natl.
Cancer Inst.7j), 409-419, 1983; Murint IGG2A), og 32 DK 173792 B1 mellem Ida og det monoklonale antistof 30.6 (Thompson et al, Br.J.Cancer 4_7, 495-605, 1 983; Murint IGG2B).
Humane coloncarcinoma Colo 205-celler (30.6, 17.1) blev inokuleret s.c. i nøgne mus ved 8x10^ celler/mus, som beskrevet i Eksempel 2. De inokulerede mus 5 blev derefter underkastet en række i.p.-behandlinger. Størrelsen af tumorerne blev målt med en kalibermåler, idet der måltes langs de perpendiku-lære akser af tumorerne. Data blev registreret som gennemsnitlig tumorstørrelse (produkt af to 10 diametre +_ standardfejl). Resultaterne er vist i Fig.18.
Eksempel 4
Konjugater blev fremstillet ved fremgangsmåden 15 beskrevet i Eksempel 1 mellem Ida og det monoklonale antistof 17.1, mellem Ida og det monoklonale antistof JGT-13 (muse-IGG1, reaktivt med carcinomaem-bryonisk antigen på coloncarcinoma, men ikke med normale væv), mellem Ida og det monoklonale antistof 20 27.1 (muse-IGGl, reaktivt med humant mælkefedtglo- bul-antigen på en række colon-tumorer), og mellem Ida og det monoklonale antistof 30.6. Et humant LIM221O-colontumorxenotransplant (1-5 mg) blev implanteret (s.c.) i nøgne mus. De implanterede 25 mus blev derefter underkastet en række i.v.-behandlinger. Størrelsen af tumorerne blev målt med kalibermåler, idet der måltes langs perpendikulære akser af tumorerne. Data blev registreret som gennemsnitlig tumorstørrelse (produkt af to diametre 50 + standardfejl·). Resultaterne er vist i Fig.19.
35
Claims (10)
1. Immunoglobulin-konjugat, omfattende en anthra-cyclinforbindelse konjugeret til et monoklonalt antistof, der er specifikt for en human neoplasme, eller 5 til et fragment af antistoffet omfattende mindst et af antistoffets antigen-bindingssteder, kendetegnet ved, at idarubicin (Ida) er konjugeret ved C-14 positionen til det nævnte antistof eller fragmentet deraf.
2. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fra to til otte Ida-molekyler er bundet kova lent til hvert antistof-molekyle.
3. Konjugat ifølge krav 1 eller 2, kende tegnet ved, at antistoffet eller fragmentet deraf 15 er specifikt for human transferrin-receptor.
4. Konjugat ifølge krav 1 eller 2, kende tegnet ved, at antistoffet eller fragmentet deraf er specifikt for en neoplasme i bryst, colon, lunge, prostata eller ovarie.
5. Fremgangsmåde til fremstilling af et immuno globulin-konjugat ved konjugering af en anthracyclin-forbindelse til et monoklonalt antistof, der er specifikt for en human neoplasme, eller til et fragment af antistoffet omfattende mindst et af antistoffets anti- 25 gen-bindingssteder, kendetegnet ved, at man omsætter et 14-halogen-Ida med antistoffet eller fragmentet deraf.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegne t ved, at nævnte 14-halogen-Ida er 14-brom-Ida. 30 35 DK 173792 B1
7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at den omfatter: (a) blanding af antistoffet eller fragmentet deraf med et molært overskud af 14-halogen-Ida, 5 (b) omsætning af blandingen ved fra 18 til 37°C; (c) fjernelse af ethvert form for bundfald? (d) fjernelse af ikke reageret udgangsmateriale ved gelfiltrering; og (e) fjernelse af adsorberet Ida ved adsorptionschro- 10 matografi eller ionbytterchromatografi.
8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 5-7, kendetegnet ved, at antistoffet eller fragmentet deraf er specifikt for human transferrin-receptor .
9. Konjugat ifølge et vilkårligt af kravene 5-7, kendetegnet ved, at antistoffet eller fragmentet deraf er specifikt for en neoplasme i bryst, colon, lunge, prostata eller ovarie.
10. Farmaceutisk præparat, kendetegnet 20 ved, at det omfatter en farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder og som aktiv ingrediens et immunoglobu-lin-konjugat ifølge et vilkårligt af kravene 1-4 eller fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 5-9. 25
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI080387 | 1987-03-11 | ||
| AUPI080387 | 1987-03-11 | ||
| AUPI295587 | 1987-07-07 | ||
| AUPI295587 | 1987-07-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK131588D0 DK131588D0 (da) | 1988-03-11 |
| DK131588A DK131588A (da) | 1988-09-12 |
| DK173792B1 true DK173792B1 (da) | 2001-11-05 |
Family
ID=25643244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198801315A DK173792B1 (da) | 1987-03-11 | 1988-03-11 | Immunoglobulinkonjugater, fremgangsmåde til fremstilling af sådanne og farmaceutiske præparater med indhold deraf |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5798097A (da) |
| JP (1) | JP2736255B2 (da) |
| KR (1) | KR0130906B1 (da) |
| CN (1) | CN1045621C (da) |
| AT (1) | AT395375B (da) |
| AU (1) | AU622105B2 (da) |
| BE (1) | BE1001051A4 (da) |
| CA (1) | CA1329156C (da) |
| CH (1) | CH678815A5 (da) |
| CZ (1) | CZ281193B6 (da) |
| DE (1) | DE3808166C2 (da) |
| DK (1) | DK173792B1 (da) |
| ES (1) | ES2006109A6 (da) |
| FI (1) | FI98706C (da) |
| FR (1) | FR2612074B1 (da) |
| GB (1) | GB2203154B (da) |
| GR (1) | GR1000059B (da) |
| HU (1) | HU205266B (da) |
| IE (1) | IE64781B1 (da) |
| IL (1) | IL85688A0 (da) |
| IT (1) | IT8819746A0 (da) |
| MY (1) | MY103231A (da) |
| NL (1) | NL8800610A (da) |
| NO (1) | NO178954C (da) |
| NZ (1) | NZ223834A (da) |
| PT (1) | PT86960B (da) |
| RU (1) | RU2106147C1 (da) |
| SE (1) | SE503402C2 (da) |
| YU (1) | YU46858B (da) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6824777B1 (en) | 1992-10-09 | 2004-11-30 | Licentia Ltd. | Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| EP1353952B1 (en) | 1994-11-14 | 2007-04-11 | Ludwig Institute For Cancer Research | Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| WO2000021560A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Flt4 (VEGFR-3) AS A TARGET FOR TUMOR IMAGING AND ANTI-TUMOR THERAPY |
| EP1343531A2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-09-17 | McGILL UNIVERSITY | Conjugates of antibodies and anticancer drugs |
| CA2522700A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Cytovia, Inc. | Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays |
| GB0511266D0 (en) * | 2005-06-02 | 2005-07-13 | Trust | Chemical compounds |
| US20080108138A1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-05-08 | Vermette Patrick | Bioactive compositions and their use in cell patterning |
| KR102099462B1 (ko) | 2010-11-30 | 2020-04-10 | 제넨테크, 인크. | 저친화도 혈액-뇌 장벽 수용체 항체 및 그의 용도 |
| CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT346838B (de) * | 1975-01-22 | 1978-11-27 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| AT343811B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| GB1500421A (en) * | 1975-01-22 | 1978-02-08 | Farmaceutici Italia | Optically active anthracyclinones |
| AT343812B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven daunosaminylderivaten von anthracyclinonen |
| GB1511680A (en) | 1975-11-18 | 1978-05-24 | Farmaceutici Italia | Daunosaminyl anthracyclinones |
| GB1541436A (en) * | 1976-02-02 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| US4950738A (en) * | 1984-09-13 | 1990-08-21 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibiotics |
| US5162512A (en) * | 1982-03-09 | 1992-11-10 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibodies |
| US4867973A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-19 | Cytogen Corporation | Antibody-therapeutic agent conjugates |
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
| US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| GB8413464D0 (en) * | 1984-05-25 | 1984-07-04 | Erba Farmitalia | Anthracycline-anionic polymer conjugates |
| JPS61155334A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Teijin Ltd | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
| FR2584293B1 (fr) * | 1985-07-04 | 1989-03-17 | Ire Celltarg Sa | Anticorps utiles comme agents de pilotage et conjugues les incorporant |
-
1988
- 1988-03-10 MY MYPI88000250A patent/MY103231A/en unknown
- 1988-03-10 ES ES8800719A patent/ES2006109A6/es not_active Expired
- 1988-03-10 BE BE8800268A patent/BE1001051A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 NZ NZ223834A patent/NZ223834A/xx unknown
- 1988-03-10 JP JP63055074A patent/JP2736255B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 AU AU12881/88A patent/AU622105B2/en not_active Expired
- 1988-03-10 CA CA000561042A patent/CA1329156C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 IL IL85688A patent/IL85688A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 IE IE70188A patent/IE64781B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 HU HU881160A patent/HU205266B/hu unknown
- 1988-03-10 YU YU48288A patent/YU46858B/sh unknown
- 1988-03-10 KR KR1019880002464A patent/KR0130906B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 SE SE8800886A patent/SE503402C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 GR GR880100148A patent/GR1000059B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 DE DE3808166A patent/DE3808166C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 FI FI881158A patent/FI98706C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 IT IT8819746A patent/IT8819746A0/it unknown
- 1988-03-11 NL NL8800610A patent/NL8800610A/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CH CH936/88A patent/CH678815A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 NO NO881105A patent/NO178954C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CZ CS881612A patent/CZ281193B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 FR FR888803233A patent/FR2612074B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 PT PT86960A patent/PT86960B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 GB GB8805865A patent/GB2203154B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 CN CN88101810A patent/CN1045621C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 DK DK198801315A patent/DK173792B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 AT AT0067488A patent/AT395375B/de not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-15 RU SU5052164A patent/RU2106147C1/ru active
-
1995
- 1995-04-11 US US08/420,712 patent/US5798097A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1222694A (en) | Immunochemotherapy for malignant tumors, particularly pancreatic cancer | |
| Smyth et al. | Specific targeting of chlorambucil to tumors with the use of monoclonal antibodies | |
| Pietersz et al. | Immunochemotherapy of a murine thymoma with the use of idarubicin monoclonal antibody conjugates | |
| DK173792B1 (da) | Immunoglobulinkonjugater, fremgangsmåde til fremstilling af sådanne og farmaceutiske præparater med indhold deraf | |
| Smyth et al. | Selective enhancement of antitumor activity of N-acetyl melphalan upon conjugation to monoclonal antibodies | |
| ES2550937T3 (es) | Conjugado que comprende un modulador selectivo de los receptores estrogénicos y una toxina inactivadora de ribosomas | |
| US5075108A (en) | Melphalan derivatives | |
| EP0248040B1 (en) | Ricin-antibody conjugates | |
| EP0485749A2 (en) | Chemical modification of antibodies for creating of immunoconjugates | |
| RU2009500C1 (ru) | Способ получения цитотоксического коньюгата | |
| Arnon | Antibodies and dextran as anti-tumour drug carriers | |
| US20080095802A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients iwth transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in paients undergoing radiation therapy, and C) in vitaminpbinding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| CA2414401A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs a) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, b) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and c) in vitamin-binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| Arnon | Novel Application for Antibodies | |
| AU2007201744A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and C) in vitamin binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| WO1998056823A1 (en) | Induction of immune tolerance by immunotoxin | |
| WO1992014758A1 (en) | Conjugate molecules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AHB | Application shelved due to non-payment | ||
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |