FR2612074A1 - Conjugue d'immunoglobuline contenant de l'idarubicine, medicament le contenant et procede de depletion in vitro d'un sous-groupe de lymphocytes t d'une population cellulaire utilisant ce conjugue - Google Patents

Abstract

UN CONJUGUE D'IMMUNOGLOBULINE COMPRENANT DE L'IDARUBICINE (IDA) CONJUGUEE A UN ANTICORPS MONOCLONAL OU A UN FRAGMENT DE CELUI-CI COMPRENANT AU MOINS UN DES SITES DE FIXATION DE L'ANTIGENE DE L'ANTICORPS EST UTILE COMME MEDICAMENT POUR TRAITER UN ETRE HUMAIN OU UN ANIMAL ATTEINT D'UN CANCER OU POUR PROVOQUER LA DEPLETION IN VIVO OU IN VITRO D'UN SOUS-GROUPE DE LYMPHOCYTES T DANS UNE POPULATION CELLULAIRE.

Description

La présente invention concerne un conjugué

d'immunoglobuline contenant de l'idarubicine, un médica-

ment le contenant et un procédé de déplétion in vitro

d'un sous-groupe de lymphocytes T d'une population cel-

lulaire utilisant ce conjugué. Le concept général de l'utilisation d'anticorps

monoclonaux (MoAb) pour diriger des agents antinéoplasi-

ques contre des tumeurs est connu et son importance thé-

rapeutique est actuellement en cours d'évaluation. De façon générale, cette approche comprend la production de conjugués d'un anticorps et d'un agent toxique capables sélectivement de localiser et d'endommager les cellules tumorales. On s'est principalement efforcé de construire des immunotoxines à partir des chatnes A de toxines et d'anticorps d'origine végétale et bactérienne, de façon

à ce que leur liaison à l'antigène et leur internalisa-

tion provoquent la mort des cellules. En pratique, de

nombreux MoAb semblant etre spécifiques des tumeurs réa-

gissent également avec des sous-populations de cellules no-males et, par conséquent, il est peut-être irréaliste d'utiliser de telles toxines puissantes en raison des lésions potentielles qu'elles sont susceptibles de créer aux tissus normaux. Une alternative moins dangereuse de l'emploi des toxines végétales consiste à coupler des anticorps à des médicaments anticancéreux classiques, tels que la doxorubicine, la vindésine, le chlorambucil, le melphalan et le méthotrexate. Par suite des effets toxiques non spécifiques des agents antinéoplasiques couramment utilisés, on a tenté d'accrottre leur index thérapeutique en les couplant à des MoAb dirigés contre

des antigènes tumoraux.

Les tentatives de suppression du rejet des gref-

fes provoqué par les cellules T dérivées du thymus sont souvent centrées sur la diminution de l'activité des

celLules T par utilisation d'une globuline antithymocy-

taire. Plus récemment, la mise au point des anticorps monoclonaux a permis de définir des sous-groupes de cellules T selon leur fonction in vitro et la présence

d'antigènes de surface spécifiques définis par des MoAb.

Cela a stimulé les recherches d'un mécanisme par lequel

les cellules T commandent le rejet des greffons, cen-

trées sur la division majeure en les sous-groupes auxi-

liaires/inducteurs et cytotoxiques/suppresseurs définis par les antigènes murins L3T4 et LY-2. Bien que le MoAb OKT3, un réactif anti-cellules T totales, se soit révélé actif in vitro, une étude récente a révélé que 20 MoAb

dirigés contre 20 antigènes lymphocytaires murins diffé-

rents étaient sans effet in vivo chez la souris et sont donc inutiles pour les études in vivo. Il est donc approprié d'examiner les moyens par lesquels ces MoAb très spécifiques peuvent être rendus plus puissants afin d'éliminer complètement les cellules leur servant de cible. L'utilisation de médicaments cytotoxiques couplés

à des MoAb constitue une telle approche.

Le potentiel clinique des conjugués médicament-

MoAb englobe l'immunochimiothérapie anticancéreuse et la réduction de divers troubles immunorégulateurs et le rejet des allogreffes. De nombreuses études ont démontré la cytotoxicité spécifique de toxines et de médicaments vis-à-vis des cellules tumorales lorsque ces toxines et médicaments sont couplés à un MoAb dirigé contre des antigènes associés aux tumeurs. Cependant, on s'est moins intéressé à l'utilisation in vivo de conjugués médicament-MoAb pour éradiquer les cellules T et étudier l'immunorégulation par les cellules T dans le rejet des greffons, bien que des conjugués toxine-anticorps aient été abondamment utilisés in vitro pour éradiquer les

cellules T avant une greffe de moëlle osseuse.

Les anthracyclines constituent un groupe impor-

tant d'agents antinéoplasiques utilisés dans la chimio-

thérapie anticancéreuse, parmi lesquelles La doxorubi-

cine et la daunorubicine se sont révélées efficaces

contre Les tumeurs solides. Le couplage de La daunorubi-

cine et de la doxorubicine à des anticorps entratne cependant une perte considérable de l'activité médica-

menteuse lorsque Le couplage est effectué par l'intermé-

diaire du groupe amino. Récemment, La daunorubicine a été couplée à des MoAb par L'intermédiaire de l'atome de carbone 14 par utilisation de la bromodaunorubicine. Ces conjugués se sont révélés actifs in vitro. Cependant, aucune étude in vivo n'a été mentionnée (Gallego et cecL., Int. J. Cancer, 1984, 33, 737-744). De plus, on a établi que Les conjugués daunorubicine-MoAb présentaient une toxicité non spécifique aux concentrations

>10 pg/ml.

La demanderesse a découvert que l'idarubicine (4-déméthoxydaunorubicine, Ida), peut etre coupLée à des MoAb et que les conjugués ont une activité antitumorale sélective et puissante in vitro et in vivo. La toxicité

non spécificue des conjugués Ida-MoAb ne s'est pas révé-

Lée in vivo à des doses <8,0 mg/kg. Les conju-

gués Ida-MoAb présentent une efficacité in vitro et in

vivo supérieure à celle des conjugués daunorubicine-MoAb.

De plus, la demanderesse a évalué la capacité des conjugués Ida-MoAb à éradiquer spécifiquement des populations cellulaires par couplage d'Ida à des MoAb connus pour réagir avec des sous-populations différentes 2+ -+. Ladmnese de lymphocytes (L3T4+, Ly-2 et Thy-1+). La demanderesse

a également établi que cela constitue un procédé éton-

namment efficace de déplétion cellulaire. Par exemple, le MoAb anti-Ly-2. 1, qui n'a pas d'effet mesurable in vivo sur les cellules Ly-2.1+, peut être transformé en un agent cytotoxique efficace par couplage avec l'agent

cytotoxique Ida.

En utilisant des antigènes MoAb dirigés contre Ly-2 et LT3T4, nous avons maintenant démontré qu'un Ida-MoAb peut éliminer des cellules cibles in vitro et in vivo. On peut obtenir des conjugués Ida-MoAb ayant un potentiel de déplétion spécifique de sous-groupes de cellules T responsables du rejet des greffons supérieur

à celui des globulines antilymphocytaires ou des réac-

tifs anti-cellules T totales, tels que le MoAb OKT3.

La présente invention fournit donc des conjugués d'immunoglobulines comprenant de l'Ida conjuguée à un

anticorps monoclonal ou à un fragment de celui-ci com-

prenant au moins un des sites de liaison d'antigène de l'anticorps.

L'Ida est décrit dans l'US-A-4077988. De préfé-

rence, on lie 2 à 8, et mieux 2 à 6 molécules d'Ida par covalence à chaque molécule d'anticorps ou de fragment d'anticorps. Les molécules d'Ida sont généralement, mais non nécessairement, conjuguées par la position 14 à l'anticorps monoclonal ou au fragment d'anticorps. De préférence, elles sont.liées directement, bien qu'il soit possible d'interposer un support ou un fragment de

liaison inerte. L'Ida peut cependant être liée à l'anti-

corps ou au fragment d'anticorps par l'intermédiaire du groupe amino. On peut pour cela utiliser un peptide espaceur dégradable, un support de dextran, un espaceur sensible aux acides ou un acide polyglutamique. Les groupes utilisés pour la liaison comprennent les groupes acides carboxyliques de polyaminoacides synthétiques,

tels que l'acide poly-L-glutamique et l'acide poly-L-aspar--

tique ou les protéines inertes, telles que la sérumalbumine

humaine ou les dextrannes fonctionnalisés,tels que le car-

boxyméthyldextranne, peuvent agir comme support.La taille

de ces supports peut varier de 10 à 60 kilodaltons.

Typiquement, chaque anticorps ou fragment d'anticorps est spécifique d'un antigène sur la surface

des cellules contre lesquelles on désire diriger l'Tda.

Par exemple, l'anticorps ou le fragment d'anticorps peut

être spécifique d'un tissu cible désiré, tel qu'un néo-

plasme humain. Des exemples des néoplasmes humains contre lesquels on peut souhaiter diriger l'Ida sont les cancers du sein, du colon, du poumon, de la prostate, de l'ovaire, du thymus et d'autres cancers, sarcomes et leucémies. L'anticorps ou le fragment d'anticorps peut

sinon etre spécifique d'un néoplasme d'animal. Un anti-

corps ou fragment d'anticorps spécifique du récepteur à la transférine humaine (TFR) qui est présent sur les cellules en division, les celtules érythroblastiques et les cellules de diverses tumeurs peut être utilisé. Un

anticorps monoclonal anti-TFR approprié peut être pro-

duit contre le récepteur à la transférine sur les cellu-

les LyCR-LON-HMy-2 (HMy-2).

Lorsque les conjugués d'immunoglobuline sont

destinés à l'utilisation dans la déplétion d'une popula-

tion spécifique de lymphocytes T, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est spécifique d'un antigène de surface cellulaire qui est lui-même spécifique de ces lymphocytes T. L'anticorps ou le fragment d'anticorps

peut donc être spécifique d'une population de lympho-

cytes T auxiliaires, suppresseurs ou cytotoxiques.

De préférence, l'anticorps monoclonal ou le fragment d'anticorps appartient à la même espèce que celle à laquelle le conjugué d'immunoglobuline doit être admnnistré. On emploie donc typiquement un anticorps monoclonal ou fragment d'anticorps humain ou de souris lorsqu'on désire administrer le conjugué à des êtres humains. Egalement, de préférence, l'anticorps ou le fragment d'anticorps appartient à la classe IgG. Le fragment d'anticorps peut être le fragment Fab, Fab' ou

F(ab')2. Une IgM monomère, qui peut dériver d'un anti-

corps IgM par digestion avec une enzyme protéolytique,

peut également être utilisée.

Les conjugués d'immunoglobuline sont préparés

selon l'invention par un procédé comprenant la conjugai-

son d'Ida à l'anticorps monoclonal ou au fragment de

celui-ci. De préférence, on fait réagir une 14-halo-

géno-Ida avec l'anticorps monoclonal ou son fragment. Le substituant de la position 14 peut être le fluor, le chlore, Le brome ou l'iode, mais c'est de préférence le

brome. La 14-bromo-Ida est décrite dans l'US-A-4125607.

La conjugaison peut donc être effectuée seLon un procédé comprenant: (a) le mélange de l'anticorps monoclonal ou de son fragment avec un excès molaire de 14-hatogéno-Ida, (b) la réaction du méLange entre 18 et 37 C, (c) l'élimination de tout précipité, (d) l'élimination des matières de départ n'ayant pas réagi par filtration sur gel, et

(e) l'élimination du médicament (Ida) adsorbé.

par chromatographie d'adsorption ou chromatographie

d'échange d'ions.

Typiquement, le stade (a) est effectué dans un

solvant organique miscible à l'eau, tel que le N,N-di-

méthylformamide. De préférence, l'excès molaire de la

14-halogéno-Ida dans le stade (a) est de 0 à 50 fois.

Dans le stade (b), on effectue de préférence la réaction pendant une période de 1 à 8 heures. Typiquement, La

réaction est effectuée à La température ambiante.

Cependant, d'autres procédés de conjugaison peu-

vent etre utilisés. Lorsqu'on désire un conjugué ayant un support ou fragment de Liaison inerte interposé entre

L'Ida et L'anticorps monocLonal ou le fragment d'anti-

corps, on fixe tout d'abord typiquement Le support ou le fragment de liaison à l'atome de carbone C-i4 de L'Ida

puis on le Lie à L'anticorps ou au fragment d'anticorps.

Egalement, comme mentionné ci-dessus, L'anticorps ou le

fragment d'anticorps peut être Lié à l'Ida par L'inter-

médiaire du groupe amino par utilisation d'un peptide

espaceur dégradabLe, d'un support de dextran, d'un espa-

ceur sensible aux acides ou d'acide polyglutamique.

Les conjugués d'immunogLobuline de l'invention peuvent être utilisés pour traiter un être humain ou un autre mammifère atteint d'un cancer. On peut administrer

une quantité thérapeutique efficace du conjugué. Le can-

cer peut être une tumeur solide, une tumeur ascitique ou

une Leucémie. Des néoplasmes humains que l'orn peut trai-

ter ont été mentionnés ci-dessus. On peut administrer deux ou plusieurs conjugués, L'anticorps monoclonal ou le fragment d'anticorps de chaque conjugué ayant une

spécificité différente.

On peut administrer un conjugué par injection.

On peut l'administrer par voie parentérale, par exemple intraveineuse. On peut l'administrer par voie locale ou directement dans la tumeur. Le quantité d'un conjugué administré à un patient dépend de divers facteurs, tels que la tumeur à traiter et l'état du patient. Cependant, de façon typique, on peut administrer une dose de 10 à200rrmg de conjugué par m de surface du corps du patient. Le conjuqué

peut être administré avec d'autres agents chimiothéra-

peutiques ou avec des agents qui accroissent l'activité des conjugués, comme des agents vasodilatateurs ou le

facteur de nécrose tumorale.

Les conjugués d'immunoglobuline peuvent égale-

ment être utilisés pour La dépLétion spécifique d'un

sous-groupe de lymphocytes T d'une population de cellu-

les. Une quantité thérapeutique efficace d'un conjugué comprenant un anticorps monoclonal ou un fragment

d'anticorps dirigé contre un antigére de surface cellu-

laire présent sur les lymphocytes à réduire peut etre administré à un être humain ou à un animal. Sinon, une population cellulaire peut être incubée in vitro avec un

teL conjugué.

On peut utiliser une combinaison de conjugués dirigés contre deux ou plusieurs antigènes de surface cellulaire. Les lymphocytes dont on désire effectuer la déplétion peuvent être des lymphocytes i auxiliaires,

suppresseurs ou cytotoxiques.

Cet aspect de l'invention peut être utilisé pour éviter le rejet d'un tissu greffé chez un receveur de greffon. Les conjugués peuvent être utilisés comme agents immunosuppresseurs. On administre au receveur du greffon une quantité de conjugué efficace pour éviter le rejet du greffon. De préférence, dans ce cas, on réalise une dépLétion des cellules T cytotoxiques. Un etre humain ou un animal atteint d'un cancer peut être traité

par déplétion des lymphocytes T suppresseurs par admi-

nistration d'un conjugué approprié. Des maladies auto-

immunes peuvent être traitées par l'administration d'un conjugué afin d'effectuer une déplétion des lymphocytes T auxiliaires. Dans chaque cas, la voie d'administration

et la dose du conjugué sont comme mentionné ci-dessus.

Les conjugués d'immunoglobuline sont présentés

sous forme de compositions pharmaceutiques avec un sup-

port ou diluant convenant en pharmacie. On peut utiliser un support ou diluant approprié quelconque. Des supports et diluants appropriés comprennent la solution salée

physiologique et la solution glucosée de Ringer.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Sur les dessins, les figures 1 à 12 concernent l'exempLe I et les figures 13 à 14 concernent l'exemple 2. Plus particulièrement: la figure 1 représente la structure de dérivés de l'anthracycline;

la figure 2 représente le couplage de l'idarubi-

cine (Ida) à l'anti-Ly-2.1 (0,5 mg). Les moles d'Ida incorporées par moles d'anti-Ly-2.1 (m) (ordonnées de gauche) et la récupération des protéines (C) (ordonnées de droite) sont représentées en fonction du nombre de nmol d'Ida dans le mélange réactionnel (abscisses); la figure 3 représente le titre d'anticorps

mesuré par le pourcentage de cellules formant des roset-

tes (ordonnées) en fonction de la dilution de l'anti-

corps (- 1) (abscisses) de conjugués d'anti-Ly-2.1 sur des cellules cible ITT(1) 75NS E3. Des dilutions en série ont été effectuées à partir d'une solution à 0,5 mg/ml soit d'anti-Ly-2.1 (A) soit d'anti-Ly-2.1 avec 2 (e) ou 8 (o) moles d'Ida/mole d'anticorps; la figure 4 représente l'effet inhibiteur de l'Ida (C) ou de l'Ida-anti-Ly-2.1 Ce), 5 moles d'Ida/mole d'anticorps, sur les cellules E3 dans un

essai en 24 heures dans lequel le pourcentage d'inhibi-

tion de l'incorporation de la [3H]-thymidine (ordonnées) est représenté en fonction de la concentration de l'Ida (M) (abscisses); la figure 5 représente l'effet inhibiteur de l'Ida C(), de l'Ida-anti-Ly-2.1 (Ce), 5 moles d'Ida/mole d'anticorps, ou d'Ida-anti-TFR (o), 5 moles d'Ida/mole d'anticorps sur des cellules (Ly-2+) E3 dans un essai

d'inhibition en 30 minutes o le pourcentage d'inhibi-

tion de l'incorporation de [3H]-thymidine (ordonnées) est représenté en fonction de la concentration de l'Ida (M) (abscisses); la figure 6 représente l'effet inhibiteur de l'Ida-anti-Ly-2.1 (Co), 5 moles d'Ida/mole d'anticorps, et du conjugué plus l'anti-Ly-2.1 Ce) sur des cellules cibles E3 dans un essai de spécificité en 30 minutes o

le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de [3H]-

thymidine (ordonnées) est représenté en fonction de la concentration de l'Ida CM) (abscisses); la figure 7 représente la croissance du thymome E3 chez des souris CBF1 auxquelles on a injecté par voie sous-cutanée 2 x 106 cellules. Des groupes de 10 souris ont reçu des traitements intraveineux, indiqués par une flèche; PBS (o), Ida (=), anti-Ly-2.1 (à), Ida-anti-TFR (o) ou Ida-anti-Ly-2.1 (Ce). La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction

des jours suivant l'inoculation de la tumeur (abscis-

ses). Les barres d'erreur représentent + l'erreur type de la moyenne; la figure 8 représente des courbes de croissance tumorale individuelLes de souris CBF1 auxquelles on a

injecté par voie sous-cutanée 2,0 x 106 cellules tumora-

les E3 traitées par voie intraveineuse les jours 4 et 5 avec le conjugué Ida-anti-Ly-2.1. La taille des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction des jours suivant l'inoculation de la tumeur (abscisses); la figu-e 9 représente la croissance du thymome E3 chez des souris CBF1 auxquelles on a injecté par voie sous-cutanée 3,0 x 106 ceLlules. Des groupes de souris ont reçu les traitements intraveineux indiqués par une flèche; PBS (o), anti-Ly-2.1 (À), Ida (Cm) ou conjugué Ida-anti-Ly-2.1 (Ce). La taille moyenne des tumreu-s (cr2) (ordonnées) est représentée en fonction du

nombre de jours suivant l'inoculation de la tumeur (abs-

cisses). Les barres d'erreur représentent + l'erreur type de la moyenne; la figure 10 représente la croisance du thymome E3 chez des souris CBF1 auxquelles on a injecté par voie sous-cutanée 3,0 x 106 cellules. Des groupes de souris ont reçu les traitements antitumoraux indiqués par une flèche; PBS ('), anti-Ly-2.1 (à), Ida (a), ou conjugué Ida-anti-Ly-2.1 (.) . La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction du

nombre de jours suivant l'inoculation de la tumeur (abs-

cisses). Les barres d'erreur représentent + l'erreur type de la moyenne;

la figure 11 représente la croissance d'un xéno-

greffon de tumeur humaine Colo 205 chez des souris "nude" auxquelles on a injecté par voie sous-cutanée 2 x 106 cellules. Des groupes de 10 souris ont reçu les traitements intraveineux suivants indiqués par une flèche; PBS (A), Ida libre (O), conjugué Ida-250-30.6

(C.), mélange d'Ida et de 250-30.6 (O) et 250-30.6 (à).

1 1 La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de La tumeur (abscisses) . Les barres d'erreur représentent + l'erreur type de la taille moyenne des tumeurs;

la figure 12 représente les courbes de crois-

sance individueLLes des tumeurs de souris "nude" ayant

reçu un xénogreffon qui ont été traitées par voie intra-

veineuse (fLèche) avec le conjugué Ida-250-30.6. Le trait discontinu représente la taille moyenne des tumeurs des souris traitées par le PBS. La taille des tumeurs (cm2) (crdonnées) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de la tumeur Cabscissen);

la figure 13 illustre le couplage de l'idarubi-

cine (ida) à l'anti-L3T4 (0,5 mg). Les moles d'Ida

incorporées par mole d'anti-L3T4 (+) (ordonnées de gau-

che) et la récupération protéinique (C) (ordonnées de droite) sont représentées en fonction du nombre de nmol d'Ida dans le mélange réactionnel (abscisses); la figure 14 montre le titre des anticorps mesuré en pourcentage de cellules formant des rosettes (ordonnées) en fonction de la dilution d'anticorps Cx 10-1) (abscisses) de conjugués d'anti-Thy-1 sur des cellules cibles ITT (1) 75NS E3. Des dilutions en série ont été effectuées à partir d'une solution à 1,0 mg/ml soit d'anti- Thy-1 C+), soit de conjugué avec 1 (o), 4 (e) ou 7 (O) moles d'Ida/mole d'anti-Thy-1; la figure 15 montre l'effet du traitement par un Ida-MoAb et un MoAb sur le nombre des cellules L3T4+ et

Ly-2+ dans la rate de souris traitées par l'Ida-anti-

L3T4 (--*), traitées par l'anti-L3T4 ( &--A), traitées pear l'Ida-anti-Ly2.1 (--e), traitées par l'anti-Ly-2.1

(C--A) ou non traitées (o--o) o le pourcentage de cel-

lules formant des rosettes (ordonnées) est représenté en fonction du temps en jours (abscisses); La figure 16 montre l'effet d'un traitement avec une association de conjugués d'Ida-MoAb sur La survie chez des souris CBA d'un greffon de tumeur P388D1 (à travers des barrières H-2 ou non-H-2). Des groupes de 10 à 15 souris ont reçu une injection sous- cutanée de 8,0 x

106 cellules tumorales T388D1 et ont reçu un des traite-

ments intraveineux (flèche) suivants: (i) PBS (+), (ii) anti-L3T4 et antiLy-2.1 (o), (iii) Ida-anti-L3T4 (m),

(iv) Ida-anti-Ly-2.1 (o) et (v) Ida-anti-L3T4 et Ida-

anti-Ly-2.1 (C). La taiLle moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction du nombre de

jours suivant l'inoculation de la tumeur (abscisses).

Les barres d'erreur représentent + L'erreur type de La moyenne; et

la figure 17 montre l'effet du conjugué Ida-

anti-Thy-1 sur la survie chez des souris CBA d'un gref-

fon de tumeur P388D1. Des groupes de 10 souris ont reçu une injection sous-cutanée de 1,0 x 107 cellules de

tumeur P388Di et ornt reçu par voie intraveineuse (flè-

che) un des traitements suivants: (i) PBS (D), (ii) anti-Thy-1 (C) et (iii) Ida-anti-Thy-1 (A). La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de la tumeur (abscisses). Les barres d'erreur représentent + l'erreur type de la moyenne;

la figure 18 montre la croissance d'un xénogref-

fon de Colo 205 (30.6+, 17.1+) chez des souris "nude" auxquelles on a injecté 8 x 106 cellules/souris. Des

groupes de 10 souris ont été traités par voie intrapéri-

tonéale comme indiqué par une flèche avec du PBS (a); du 17.1-Ida (o); du 30.6-Ida (C) ou un mélange de 30.6-Ida et de 17.1-Ida (a). La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de la tumeur (abscisses). Les barres d'erreur représentent + l'erreur type de la moyenne. La dose totale d'Ida était de Fg;

la figure 19 montre la croissance d'un xénogref-

fonrt de tumeur humaine du c6Lon LIM2210 chez des souris "nude'" auxqueLfes un fragment de tumeur (1-5 mg) a été implanté. Des groupes de 10 souris ont été traités par voie intraveineuse, comme indiqué par une fLèche, avec du PBS (o); du 17.1-Ida (C+); du JGT-13-Ida (À); du 17.1-ida (e) ou du 30.6-Ida (o). La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction

des iours suivant l'inoculation de la tumeur (abscis-

ses). Les barres d'erreur représentent + l'erreur type

de La moyenne. La dose totale d'Ida était de 80 pg.

EXEMPLE 1

Matériels et méthodes Cellules tumorales Les lignées cellulaires examinées dans cette étude comprenaient la variante ITT(1) 75NS E3 (E3) de O thymome murin (Ly-2+) (Smyth et coll., J. Natl. Cancer Inst. 1986, 76, 503-510), le lymphome EL4 (Ly-2-, TFR-) (Horowitz et coll., Science, 1968 160 533-535), la lignée de cellules humaines CEM (TFR+) (Foley et coll., Cancer 1965, 18, 522-529) et- La lignée de cellules humaines Colo 205 (250-30.6+). Les cellules étaient entretenues in vitro dans du milieu de Eagle modifié par

Dulbecco (DME) ou du milieu RPMI 1640 (Flow Laborato-

ries, Sydney, Australie), avec addition de 10 % de sérum de veau nouveauné inactivé par chauffage (Flow), 2 mM de glutamine (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australie); 100 pg/ml de streptomycine (Glaxo, Melbourne, Australie) et 100 UI/ml de pénicilline (Commonwealth Serum Laboratories). La tumeur E3 était entretenue in vivo par des passages successifs sur des souris (C57BL/6 x BALB/c)F1 (souris CBF1). Les cellules du liquide d'ascite étaient lavées et centrifugées (400 g x 5 min) deux fois dans du tampon salé phosphaté (PBS) à pH 7,3, remises en suspension dans du PBS et injectées par voie sous-cutanée (s.c.) dans la paroi abdominale des souris; ces dernières présentaient des tumeurs palpables avant le traitement. Les souris ont été soumises à des séries de traitements intraveineux (i.v.) ou intratumoraux (i.t.) puis les tailles des tumeurs ont été mesurées chaque jour avec un pied à coulisse, la mesure étant effectuée selon les axes

perpendiculaires des tumeurs. Les données ont été enre-

gistrées comme taille moyenne des tumeurs (produit des

deux diamètres + l'erreur type).

Souri s Les souris CBA et (C56BL/6 x BALB/c (souris CBF1) et les souris "nude" (nu/nu) ont été produites au Service de Pathologie de l'Université de Melbourne. Des groupes expérimentaux de 8 à 10 souris de même sexe et

de même àge cnt été utilisés dans chaque expérience.

Anticorps monoclonaux Les MoAb utilisés ont été: (i) l'anti-Ly-2.1 (IgG1) réagissant avec une spécificité pour Ly-2.1 murin (Hogarth et coll. Immunology 1982 46 135-144) et (ii) l'A3C6 (anti-TFR) (IgG1) réagissant avec le récepteur à

la transférine humaine (TFR) (Panaccio et coll., Immuno-

logy and Cell Biology, 65, p. 461-472, 1987); et (iii)

un anticorps appelé 250-30.6 réagissant contre un anti-

gène présent sur les cellules de carcinome du c6lon humain.

Les MoAb ont été isolés du liquide d'ascite par

précipitation avec du sulfate d'ammonium à 40 %, disso-

lution dans du PBS et dialyse avec le même tampon. Ces préparations brutes ont été soit absorbées sur du Protéine-A-Sépharose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), lavées abondamment avec du PBS (pH 7,3) et éluées avec de la glycine 0,2 M/HCl (pH 2,8) soit passées à travers une colonne d'Affigel bLue (Bio-Rad Laboratories, Pty. Ltd., Sydney). Apres neutralisation, les MoAb ont ensuite été dialysés contre du PBS, divisés

et conservés à -70 C. L'A3C6 a été obtenu par immunisa-

tion intrapéritonéale de souris CBA à des intervalles d'une semaine pendant 3 semaines avec 2 x 106 cellules LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2) (OKT9+ve), prélèvement des rates

trois semaines après la dernière injection et fusionne-

ment avec des cellules P3-NSI-AG4-1 (NS-1).

Prqa ration et détermination quantitative des conjugués On a mélangé des formes intactes des MoAb arnti-Ly-2.1, anti-TFR ou 250-30.6 (1-2 mg/ml dans du tampon borate à pH 8,0) avec un excès molaire (1-50) de 14-bromo4-déméthoxydaunorubicine (Br-Ida) dissoute dans du N,N-diméthylformamide (DMF) à 10 mg/ml. La réaction a été maintenue à la température ambiantependant 4 heures avant centrifugation (400 g x 5 minutes) pour éliminer tout précipité. La Br-Ida l-bre et les autres matières

de départ n'ayant pas réagi ont été éliminées par chro-

mat3graphie par filtration sur gel avec une colonne de Sephadex G-25 (PD10; Pharmacia) et on a fait ensuite passer les conjugués à travers une colonne de Porapak Q (Millipore) pour éliminer tout médicament adsorbé

(Niederwieser et col., J. Chromatog. 1971 54, 215-223).

La quantité d'Ida incorporée aux conjugués médicament-

MoAb a été déterminée par spectrophotométrie d'absor-

bance à 483 nm (E498 = 3,4 x 103 M 1cm-1) et par estima-

tion des protéines (Bradford, Anal. Biochem. 1976 72,

248-253).

Activité d'anticorps Une détermination par formation de rosettes utilisant une immunoglobuline de mouton anti-souris a été utilisée pour déterminer l'activité d'anticorps des conjugués Ida-MoAb par comparaison avec le MoAb libre ayant subi les memes opérations que celles du procédé de coupLage (Parish et McKensie, J. Immunol. Methods 1978

, 173-183).

Activité médicamenteuse (a) essai d'inhibition en 24 heures: 100 il de cellules (2-5 x 106/ml) ont été introduits dans une plaque de microtitrage à fond plat et incubés pendant 1 heure à 37 C. De l'idarubicine (Ida) libre (dissoute dans le PBS) et des conjugués Ida- MoAb ont été filtrés aseptiquement et des dilutions ont été effectuées dans du PBS stérile; 50 pL d'Ida libre ou de conjugué ont été ajoutés aux cellules en utilisant 2 cupules pour chaque échantillon; les cupules témoins recevaient FI de PBS et les cellules ont été cultivées à 37 C

avec 7 % de CO02 pendant 24 heures.

(b) essai d'inhibition en 30 minutes: 200 pl de cellules (2-5 x 106/ml) ont été recueillis dans des tubes Eppendorf stériles, remis en suspension dans le médicament ou le conjugué stérile et mélangés pendant

minutes à 37 C. Les cellules ont ensuite été centri-

fugées (400 g x 5 min), remises en suspension dans le milieu de culture et des portions de 100 pl ont été distribuées dans une plaque de microtitrage avec des cupules en double pour chaque échantillon avant une

période d'incubation de 16-24 heures.

Après la période d'incubation dans les deux essais, 50.l du milieu de culture contenant 1 pCi de [3H]-thymidine (activité spécifique: 5 Ci/mmol;

Amersham) ont été ajoutés et les plaques ont été incu-

bées pendant 2-4 heures. Les cellules ont ensuite été recueillies et séchées et les échantillons individuels

ont été séparés et comptés avec un compteur à scintilla-

tion R. L'incorporation de la [3H]-thymidine a été exprimée en pourcentage d'inhibition de l'incorporation des témoins. L'erreur standard pour tout point a été calculée à partir des déterminations en double et ne

dépassait pas 5 % pour tout point expérimental.

Toxicité Des groupes de 10 à 20 souris CBA ont reçu une injection i.v. unique de diverses doses d'Ida ou d'Ida-anti-Ly-2.1 et les souris survivantes ont été notées en fonction de la dose de-médicament administrée en mg/kg. Les organes de ces souris ont été prélevés et pesés avant fixation dans la formaline et coloration par

l'hématoxyline et l'éosine.

Résultats Prércration et caractérisation des conjugués La Br-Ida (figure 1) a été couplée par covalence

à plusieurs MoAb: contre le TFR humain, contre un anti-

gène présent sur les cellules humaines de cancer du cElcn (anticorps 25030.6) et contre l'alloantigène Ly-2 murin. Les conditions de la réaction de conjugaison ont été établies par variation de l'excès molaire de BrIda ajouté aux MoAb et établissement d'un compromis entre une incorporation supérieure d'Ida et des récupérations moindres des protéines. L'Ida-anti-Ly-2.1 (figure 2),

l'Ida-anti-TFR et l'Ida-250-30.6 (valeurs non présen-

tées) ont incorporé 3 à 5 molécules d'Ida avec des récu-

pérations des protéines supérieures à 50 %. La réaction de la Br-Ida avec les MoAb pourrait produire deux types de liaisons (figure 1C et D). Pour établir la liaison présente, les conjugués ont été portés à pH 4,5 ou à pH 9,0 pendant 48 heures, le médicament non conjugué

libéré a été absorbé dans du Porapak Q et les échantil-

* lons ont été soumis à une nouvelle détermination quanti-

tative par spectrophotométrie. Cinquante % du médicament lié ont été libérés lors de l'exposition à l'action d'une base (pH 9,0) tandis qu'aucune perte n'a été observée à pH 4,5. Cela suggère qu'au moins 50 % du médicament sont unis par une liaison ester (figure 1D),

car la liaison ester est sensible aux conditions basi-

ques tandis que la liaison amine est stable.

Activité d'anticorps

Les titres des anticorps avant et après conju-

gaison ont été mesurés selon la méthode de formation des rosettes et exprimés comme la dilution à laquelle 50 % des cellules cibles ont présenté des rosettes. Les conjugués Ida-anti-Ly-2.1 contenant 2 et 8 molécules

d'Ida avaient des titres des anticorps contre les cellu-

les E3 respectivement de 1/56 000 et 1/33 000, tandis que le titre de l'anticorps non conjugué était de

1/80 000 (figure 3). Les conjugués idî-250-30.6 conte-

nant 2 et 6 molécules d'Ida avaient des titres des anti-

corps contre les cellules Colo 205 respectivement de 1/16 000 et 1/11 000, tandis que le titre de l'anticorps non conjugué était de 1/33 000. Il y a donc une certaine perte de l'activité d'anticorps due à l'opération de conjugaison; les conjugués avec moins de 6 molécules d'Ida par molécule de MoAb ont été utilisés pour les

études in vitro et in vivo. Il faut noter que La solubi-

lité et l'activité d'anticorps des conjugués Ida-anti-

Ly-2.1 ont diminué notablement au-delà de ces taux d'incorporation d'Ida (valeurs non présentées). Le

nombre maximal des molécules d'Ida que l'on peut utile-

ment incorporer varie selon l'anticorps individuel.

Activité in vitro de l'idarubicine et de conjugués idarubicine-MoAb La cytotoxicité in vitro de l'Ida et de deux conjugués Ida-MoAb sur la lignée de cellules murines ITT(1) 75NS E3 (Ly-2+, TFR-) et la lignée de cellules humaines CEM (Ly-2, TFR+) a été mesurée dans un essai d'inhibition en 24 heures et les valeurs de la DI50

(inhibition à 50 % de l'incorporation de la [3H]-thymi-

dine des témoins) ont été déterminées. Les résultats sont illustrés par la figure 4 et le tableau 1. La D5.0 de l'Ida était dans la gamme de 1,0 à 2,5 x 10-7 M pour les deux Lignées cellulaires étudiées (figure 4, tableau 1). La DI50 pour l'Ida-anti-Ly-2.1 relativement à E3 était quatre fois supérieure (figure 4) e-t pour L'Ida-anti-TFR relativement à CEM, les DI50 étaient une à deux fois supérieures à celle de L'Ida libre (tableau 1). Donc, l'Ida libre est plus cytotoxique pour E3 et CME que respectivement l'Ida-anti-Ly-2.1 et

l'Ida-anti-TFR. Cependant, ces conjugués Ida-MoAb pré-

sentent une cytotoxicité 10 fois inférieure vis-à-vis des lignées cellulaires non réactives (tableau 1), ce qui indique que leur action cytotoxique est spécifique et résulte du maintien de l'activité d'anticorps

(figure 3).

TABLEAU 1

Effet de conjugué idarubicine-anticorps monoclonal sur des cellules tumorales1 Lignée de Valeurs moyennes de la DI50 déterminées pour cellules Ida Ida-anti-Ly-2.1 Ida-anti-TFR tumorales E3 1,2 x 10- 7 4,3 x 10-7 2,3 x 10-6

(5)2 (3) (2)

CEM 2,2 x 10 7 2,0 x 10 6 3,0 x 10-7

(5) (2) (3)

1 DI50 = inhibition à 50 % de l'incorporation de la

[3H]-thymidine des témoins.

2 = nombre des préparations étudiées.

Les conjugués Ida-250-30.6 ont été légèrement moins actifs que l'Ida libre. L'Ida libre avait une DI50 de 6 x 10-8 M, tandis que le conjugué avait une DI50 de 3,5 x 10 7 M sur la lignée de cellules cibles

Colo 205.

Pour déterminer si les conjugués présentaient sélectivement leur action cytotoxique vis-à-vis des cellules cibles, l'Ida-ant-Ly-2.1 et l'Ida-antiTFR ont celtuLes cibLes, l'Ida-anti-Ly-2.1 et l'Ida-anti-TFR ont été incubés pendant 30 minutes avec des cellules E3 (Ly-2+) avant élimination par lavage du conjugué non lié

et mesure de la cytotoxicité. Le conjugué Ida-anti-

Ly-2.1 avait une DI50 de 6,2 x 10-7 M tandis que la DI50 de l'Ida libre était de 5,2 x 10-7 M (figure 5). En revanche, le conjugué Ida-anti-TFR non réactif avait une DI50 de 5,0 x 10-6 M, c'est-à-dire 10 fois supérieure à celle de l'Ida libre, ce qui démontre que l'activité de liaison d'anticorps du conjugué Ida-Ly-2.1 résultait de

sa cytotoxicité sélective. De façon semblable, le conju-

gué Ida-250-30.6 et le médicament libre ont été incubés pendant 30 minutes avec les lignées cellulaires Colo 205 (250-30.6 + ve) et E3 (250- 30.6 ve) avant lavage et essai de la cytotoxicité. Les deux lignées cellulaires

ont présenté une réaction semblable à la dose de médica-

ment libre, c'est-à-dire 9,2 x 10-7 M pour Colo 205 et

9,8 x 10:7 M pour E3. Cependant, le conjugué Ida-250-

30.6 était quatre fois plus toxique pour Colo 205 que pour la lignée de cellules E3 ne réagissant pas avec l'anticorps. Les mêmes résultats ont été obtenus avec la lignée cellulaire CEM et l'Ida-anti-Ly-2.1 en tant que témoin non réactif (valeurs non présentées). Pour confirmer que la cytotoxicité des conjugués Ida-MoAb

pour les cellules cibles était spécifique et se produi-

sait aux sites de liaison d'anticorps, on a étudié l'inhibition de la cytotoxicité du conjugué par emploi de MoAb libre. A une concentration en Ida de 4,0 x -6 M (2 pg d'anti-Ly-2.1), la cytotoxicité du conjugué antiLy-2.1 sur les cellules E3 a été réduite de 70 % par addition de 50 pg (250 pg/ml) d'anti-Ly-2.1 (figure 6) indiquant que la cytotoxicité du conjugué Ida-anti-Ly-2.1 est liée directement à sa capacité de liaison d'anticorps. Des résultats témoins semblables ont été obtenus avec le 25030.6. Il faut noter que dans tous les essais, l'anti-Ly-2.1, l'anti-TFR et le 250-30.6 libres étaient-non cytotoxiques (valeurs non présentées) Traitement in_ vitro du thymome murin ITT(1) 75NS E3 Pour évaluer l'inhibition de la croissance des tumeurs solides, des groupes-de souris CBF1 (10 par groupe) ont été inoculés par voie sous-cutanée avec 2,0 x 106celLules E3 dans la région abdominale et traités avec des injections i.v. d'un des composés suivants: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2.1; (iii) Ida; (iv) Ida-anti-TFR; ou (v) Ida-anti-Ly-2.1. Les souris recevaient 20 tg d'Ida et/ou 1 200 pg d'anti-Ly-2.1, respectivement les jours 4 et 5 (taille des tumeurs =

0,1 cm2) après l'inoculation de la tumeur.

Au cours des 24 heures du premier traitement, 'es souris traitées par l'Ida-anti-Ly-2.1 avaient une taille moyenne des tumeurs égale à 20 % de celle des souris traitées par le PBS (c'est-à-dire une diminution de 80 % de la masse tumorale (figure 7); il s'est révéré évident que l'anti-Ly-2. seul et l'Ida liée par covaLence au MoAb anti-TFR non spécifique n'influaient pas sur la croissance de la tumeur E3. Les tumeurs des souris recevant l'Ida seule ont été réduites jusqu'à %; cependant, trois de ces souris sont mortes et les

autres présentaient une diminution de 25 % du poids cor-

porel. Les courbes individuelles de croissance tumorale des souris recevant l'Ida-anti-Ly-2.1 ont démontré une

régression de neuf des dix tumeurs au cours du traite-

ment (figure 8); en fait, cinq des dix tumeurs ont totalement régressé et ne sont pas réapparues

(>200 jours) et les tumeurs qui-continuaient à se déve-

lopper à la fin du traitement (cinq sur dix) se dévelop-

paient plus lentement que les tumeurs des souris trai-

tées par le PBS et l'Ida-anti-TFR. Une autre expérience a été effectuée pour évaluer le traitement i.v. de tumeurs plus grosses en utilisant l'Ida-anti-Ly-2.1. Des

2612 0 7 4

groupes de souris CBF1 (10 par groupe) ont été inoculés avec 3,0 x 106 cellules E3 et les souris ont ensuite

reçu respectivement 15 pg et 900 pg d'Ida et d'anti-

Ly-2.1 les jours 6 (taille des tumeurs = 0,2 cm2) et 7 après l'inoculation des tumeurs (figure 9). Les souris traitées par l'Ida-anti- Ly-2.1 avaient une taille moyenne des tumeurs de 50 % de celle des souris traitées par le PBS et de 66 % de celle des souris traitées par

l'Ida au jour 7, et cette tendance s'est maintenue jus-

qu'à la fin de l'étude (jour 18). Les courbes indivi-

duelles de croissance des tumeurs des 10 souris CBF1 recevant l'Ida-antiLy-2.1 ont démontré l'existence de quatre régressions et de quatre disparitions complètes

de la masse tumorale (>200 jours; valeurs non présen-

tées). Donc, l'Ida-anti-Ly-2.1 a été efficace contre des tumeurs plus grosses et, dans les deux expériences, l'activité antitumorale de l'Ida a été considérablement

améliorée par couplage avec le MoAb anti-Ly-2.1.

Traitement in vivo de la tumeur du côlon humain Colo 205

L'effet du conjugué Ida-anti-250-30.6 a été éva-

lué chez des souris "nude" (nu/nu) portant des xénogref-

fons de Colo 205.

L'injection sous-cutanée de 2 x 106 cellules dans la paroi abdominale a provoqué une masse palpable en quatre jours (environ 0,1 cm2). Des groupes de dix

souris ont ensuite été traités par des injections i.v.

d'un des composés suivants: (i) PBS; (ii) 250-30.6; (iii) Ida plus 250-30. 6 (non conjugué); (iv) Ida; (v) conjugué Ida-250-30.6. Au total, 275 pg d'Ida ont

été administrés dans une série de 5 injections intra-

veineuses les jours 4, 5, 6, 10 et 12 après l'inocula-

tion de la tumeur.

Aucun effet thérapeutique n'est apparu dans les groupes de souris traités par le PBS ou le 250-30.6 non

conjugué. Avec L'Ida seule, deux souris sur dix ont sur-

vécu tandis que toutes Les souris du groupe recevant l'Ida non conjuguée plus Le 250-30.6 étaient mortes au jour 7 après avoir présenté des symptômes de toxicité tels qu'une perte de poids. Les souris recevant le

conjugué Ida-250-30.6 ont présenté une diminution consi-

dérable de la taille des tumeurs. Ces résultats sont illustrés par la figure 11. Par contre, les courbes de croissance tumorale des souris individuelles (figure 12) ont montré que cinq des dix souris présentaient des tumeurs ayant régressé au jour 7; ces tumeurs croissant ensuite er ne laissant que deux souris sur dix sans tumeur. Ces souris n'ont pas présenté d'effet dO à la toxicité. Traitement intratumoral Le traitement intratumoral s'est révélé être une technique utile pour l'immunothérapie des tumeurs des animaux et de l'homme. Par conséquent, des études ont été effectuées pour caractériser l'activité antitumorale

des conjugués Ida-anti-Ly-2.1 lorsqu'ils sont adminis-

trés directement dans une tumeur E3 solide. Des groupes

de 10 souris CBF1 ayant subi une implantation sous-

cutanée de 3,0 x 106 cellules E3 ont développé des tumeurs (0,1-0,2 cm2) 5 jours après l'inoculation de la tumeur. Les traitements consistaient en deux injections aux jours 5 et 6 après l'implantation de la tumeur, les souris recevant un des traitements suivants: (1) PBS; (2) Ida; (3) antiLy-2.1; ou (4) Ida-anti-Ly-2.1 (Ida totale = 30 g). L'Ida-anti-Ly-2.1 a présenté l'activité antitumorale maximale, l'Ida libre et l'anti-Ly-2.1 seul n'ayant pas d'effet sur la croissance tumorale lors de l'administration directe dans la tumeur. Les souris traitées par l'Idaanti-Ly-2.1 avaient une taille moyenne des tumeurs de 60 % de celle des souris traitées par le PBS au jour 8 et de 30 % de celle des souris traitées par le PBS au jour 13 (figure 10). Les courbes individuelles de croissance des tumeurs (valeurs non présentées! des souris traitées par l'Ida-anti-Ly-2.1 ont indiqué 1 régression complète tandis que les souris restantes présentaient un ralentissement retardé de La croissance tumorale 3 jours après l'achèvement du traitement. JToxJici té Pour les expériences de toxicité aiguë, des

groupes de 10 souris CBA (Ly-2.1'+) ont reçu une injec-

tion unique de diverses doses d'Ida, d'Ida-anti-Ly-2.1 ou d'Ida-ar.ti-TFR. Toutes les souris injectées avec

l'Ida ont présenté une perte initiale de poids attei-

gnant 25 % du poids d'origine; cependant, aucune perte oe poids n'a été observee ch.ez les souris traitées avec l'un ou l'autre conjugué Tda-MoAb. Le tableau 2 présente la toxicité de l'Ida et des conjugués Ida-MoAb exprimée par les valeurs de la Dl50 et de la DL10. Comme on le voit, le UL10 de 'Ida-anti-Ly-2.1 était de 10,0 mg/kg d'Ida par rapport à 0,75 mc/kg seulement pour l'Ida libre. De plts, le conjugué Ida-anrti-TFR avait une DL10

de 8,0 mg/kg. Les conjugués Ida-MoAb n'ont pas été étu-

diés à une dose correspondant à la DL50. Ces résultats démontrent l'index thérapeutique supérieur des conjugués

Ida-MoAb par rapport à l'Ida libre.

TABLEAU 2

Effet des conjugués idarubicine-anticorps monoclonal chez les souris CBA Ida (mg/kg)

DL10 DL50

Ida 0,75 3,00 Ida-anti-Ly-2.1 10,00 NE Ida-anti-7FP 15,00 NE

26 1 2074

Résultats histopatholoqiques Effet aigu: L'administrztion intraveineuse d'Ida libre (1,0 mg/kg) a provoqué une atrophie de la pulpe blanche de la rate 15 jours après le traitement et une certaine hypertrophie des fibres du muscle cardiaque (valeurs non

présentées). En revanche, une dose unique d'Ida-anti-

Ly-2.1 (2,4 mg/kg) n'a provoqué aucune toxicité tissu-

laire non spécifique après 15 et 30 jours, bien qu'un certain gonflement des hépatocytes ait été observé au

jour 15.

EXEMPLE 2

Matériels et méthodes Souris Des souris (DBA/2 x BALB/c)FI et CBA ont été produites au Service de PathoLogie, Université de Melbourne. Des groupes expérimentaux de 10 à 20 souris, toutes de meme sexe et de même Ége, ont été utilisés

dans chaque expérience.

Cellules tumorales Les Lignées cellulaires examinées dans cette étude comprenaient la variante ITT(1) 75NS E3 (E3) de thymome murin (Ly-2+), le lymphome EL4 'L3T4+) (Horowitz et coll., Science 1968 160 533-535), le carcinome du colon humain Colo 205 (Semple et coll., Cancer Res. 1978 38 1345-1355) et les cellules T de leucémie humaine CEM (Ly-2-, L3T4-) (Foley et colL., Cancer, 1965 18 522-529). Les cellules ont été entretenues in vitro comme décrit dans l'exemple 1. La lignée de cellules macrophages P388D1 était entretenue in vivo par des passages successifs sur souris (DBA/2 x BALB/c)F1. Les

cellules du liquide d'ascite étaient lavées et centrifu-

gées (400 g x 5 min) deux fois dans du tampon saLé phos-

phaté (PBS, pH 7,3), remises en suspension dans du PBS

et injectées par voie sous-cutanée dans la paroi abdomi-

nale des souris qui développaient ensuite des greffons tumoraux palpables. Les souris étaient ensuite soumises à une série de traitements intraveineux et les tailles des tumeurs étaient mesurées chaque jour avec un pied à coulisse, la mesure étant effectuée selon les axes

perpendiculaires des tumeurs. Les valeurs étaient enre-

gistrées comme la taille moyenne des tumeurs (produit

des deux diamètres + erreur type).

Anticorps rmonoclonaux Les anticorps monoclonaux contre les antigènes de surface des cellules murines L3T4, Ly-2 et Ty-1, qui

caractérisent des sous-populations distinctes de Lympho-

cytes, ont été utilisés comme système modèle.

Les MoAb utilisés étaient: (i) anti-Ly-2.1 (IgG2a murine) réagissant avec une spécificité pour Ly-2.1 murin (Horgarth et coll. Immunology, 1982, 46,

-144), (ii) H129.19 (anti-L3T4) (IgG2b de rat) réa-

gissant avec une spécificité pour L3T4 murin (Pierres et coll. J. Immunology 1984 132 2775-2782) et (iii) l'anti-Thy-1 (IgG2b de rat) réagissant avec les

cellules T murines (Marshak-Rothstein et coll., J. Immu-

nology, 1979 122 2491-2497). Les anticorps ont été iso-

Lés, purifiés et conservés comme décrit dans l'exemple

1. L'activité des anticorps a été déterminée par forma-

tion des rosettes avec une immunoglobuline de mouton

antisouris, comme décrit dans l'exemple 1.

Préparation de coniugués idarubicine-anticorps monoclonal Un MoAb (1-2 mg/ml) a été mélangé avec un excès

molaire de 5 à 20 fois de 14-bromo-4-déméthoxydaunoru-

bicine (Br-Ida) dissoute à 10 mg/ml dans le N,N-dimé-

thylformamide pendant 4 heures à pH 8,0 (tampon borate 0,05 M) et à la température ambiante. Après réaction et purification, la quantité d'Ida incorporée au conjugué

obtenu a été déterminée comme décrit dans l'exemple 1.

Activité médicamenteuse On a effectué deux essais (24 heures et minutes) pour évaluer l'activité médicamenteuse comme décrit dans l'exemple 1 en utilisant une concentration

des cellules de 1 à 5 x 106/ml.

SéroL ogie

Une méthode par formation de rosettes a été uti-

lisée dans ces expériences pour déterminer le titre des anticorps et le nombre des cellules L3T4+ et Ly-2+. Ce

procédé comprenait la liaison d'immunoglobuline de mou-

ton anti-scuris oui détecte également l'immunoglobuline de rat (Ig) couplée à des globules rouges de mouton pour

détecter les anticorps sur la surface des cellules lym-

phoides. L'Ig de surface de cellules spléniques Ig+ a été éliminée par coiffage avec de l'immunoglobuline de mouton anti-souris (25 pl et 2 ml de cellules à 107/tl); les cellules ont ensuite été maintenues sur de la glace dans un milieu contenant 0,01'% d'azide de

sodium pour éviter la resynthèse de l'immunoglobuline.

Résultats L'étude a été effectuée en phases séparées:

(a) une caractérisation in vitro de trois conju-

gués Ida-MoAb différents, puis (b) la démonstration de leur utilité dans la dépLétion active de sous-groupes de cellules T avant ou

pendant le rejet d'un allogreffon de cellules tumorales.

Préparation et caractérisation des conjugués De la Br-Ida a été couplée par covalence à un MoAb dirigé contre les antigènes murins L3T4, Ly-2 et Thy-1. Les conditions de la réaction de conjugaison ont été établies par variation de l'excès molaire de Br-Ida ajouté au MoAb et établissement d'un compromis entre une incorporation accrue d'Ida et des récupérations moindres

des protéines. L'Ida-anti-L3T4 (figure 13), l'Ida-anti-

Ly-2.1 et l'Ida-anti-Thy-1 (valeurs non présentées)

26 1 2074

incorporaient 3 à 6 molécules d'Ida, avec des récupéra-

tions des protéines supérieures à 50%.

Activité d'anticorps

Les titres des anticorps avant et après conju-

gaison ont été mesurés selon la méthode de formation des rosettes et exprimés par la dilution à laquelle 50 % des

cellules cibles E3 présentaient des rosettes. Les conju-

gués Ida-anti-Thy-1 contenant 1, 4 et 7 molécules d'Ida avaient des titres des anticorps respectivement de 1/425 000, 1/170 000 et 1/130 000, tandis que le titre de l'anticorps non modifié était de 1/550 000

(figure 14). Il y a donc une certaine perte de l'acti-

vité d'anticorps lors de la conjugaison à l'Ida; cepen-

dant, les conjugués avec moins de 4 molécules d'Ida au MoAb ont été utilisés pour les études in vitro et in vivo. De même, l'activité d'anticorps des deux conjugués

Ida-anti-Ly-2.1 et Ida-anti-L3T4 (valeurs non présen-

tées) a notablement diminué par incorporation de plus de

6 moLécules d'Ida par molécule de MoAb.

Activité médicamenteuse in vitro La cytotoxicité des conjugués Ida-MoAb a été étudiée sur diverses cellules cibles réactives selon un

essai en 24 heures et comparée à celle de l'Ida libre.

L'activité de l'Ida libre était 4 à 10 fois supérieure à celle des conjugués Ida-MoAb, avec une DI 50(inhibition à 50 % de l'incorporation de [3H]- thymidine des témoins) de l'Ida libre se situant à 6,6-9,0 x 108 M vis-à-vis des lignées de cellules tumorales étudiées. Il est évident que le conjugué Ida-anti-Ly-2.1 était le

conjugué le plus cytotoxique (DI50 = 4,3 x 10-7) lors-

qu'il a été étudié contre la lignée cellulaire ITT(1) NS E3, qui est une variante de la lignée cellulaire native enrichie en antigène Ly-2. Pour examiner la

sélectivité de l'action du conjugué vis-à-vis des cellu-

les cibles, des conjugués Ida-MoAb ont été incubés pen-

dant 3 minutes avec Les ceLLuLes cibLes avant éLimina-

tion par Lavage du conjugué non Lié et mesure de La

cytotoxicité. SeLon cet essai en 30 minutes, Les conju-

gués Ida-MoAb non réactifs avaient une DI50 10 à 50 fois supérieure à celle de l'Ida libre, ce qui démontre que

la liaison à l'anticorps est essentielle à la cytotoxi-

cité du conjugué Ida-MoAb. Il faut noter qu'aucun des MoAb utilisés dans cet essai n'avait in vitro une action cytotoxique sur les cellules cibles en l'absence de complément. Les résultats sont regroupés dans le

tableau 3.

TABLEAU 3

Effet de conjugués idarubicine-anticorps monoclonal.

DI50 moyenne sur les cellules tumorales Lignée de cellules Essai Valeurs moyennes de la DI50 (Ida (M)) déterminés pour tumorales Ida Ida-anti-Ly-2. 1 Ida-anti-L3T4 Ida-anti-Thy-1 E3 24 h2 7,8 x 108 4,3 x 10-7 NE 9,0 x 107 min3 1,8 x 10 -7 4,3 x 10-7 NE 1,2 x 10 -6 EL4 24 h 6,6 x 10-8 NE 6,0 x 10-7 NE min 1,6 x 10- 7 NE 6,2 x 10 7 NE CEM 24 h 9,0 x 10-8 NE NE NE min 2,2 x 10-7 6,0 x 10-6 NE NE Colo 205 24 h 8,0 x 10-8 NE NE NE min 1,2 x 10 7 NE 4,0 x 10 -6 5,8 x 10-6 1 DI50 = Inhibition à 50 % de l'incorporation de [3H]-thymidine des témoins 2 elon un essai de cytotoxicité en 24 heures

3 _

selon un essai en 30 minutes NE = non étudié Activité in vivo de conjugués idarubicine-anticorps monoclonal

L'activité immunosuppressive in vivo des conju-

gués Ida-MoAb a été comparée à celle du MoAb seul par détermination de la capacité des conjugués à réaliser une dépLétion sélective des cellules L3T4+ ou Ly-2+ de

la rate. Des souris CBA ont reçu quatre injections i.v.

de conjugué anti-Ly-2.1 ou anti-L3T4 (30 Fg d'Ida/1,5 mg

de MoAb) les jours 0, 2, 5 et 10 et le nombre des cellu-

les Ly-2+ ou L3T4+ dans la rate a été suivi par détermi-

nation de la formation de rosettes. Pour chaque traite-

ment, les cellules spléniques de deux souris traitées

ont été examinées chaque jour et La moyenne des résul-

tats a été établie (figure 15). Il s'est produit une baisse rapide du nombre des cellules L3T4+ d'environ %. des cellules spléniques totales chez la souris normale le jour 0 à environ 4 % chez les souris traitées

par l'Ida-anti-L3T4 au jour 20. Cette déplétion des cel-

lules L3T4+ a persisté pendant plus de 60 jours avant ou'un accroissement graduel soit observé. La déplétion

après le traitement in vivo avec l'anti-L3T4 seul a.éga-

lement nrovoaué une baisse nette-du nombre des cellules

L3T4+ (30 %, à 5 %).

Le conjugué Ida-anti-Ly-2.1 a réduit le nombre des celLules Ly-2+ de la rate de 25 % à 5 % au jour 10; 2 5 cependant, le nombre des cellules Ly-2+ a commencé à augmenter au jour 15 et est revenu à la normale aux jours 40-50. Il est intéressant de noter que le MoAb

anti-Ly-2.1 seul a été incapable de provoquer une déplé-

tion notable des cellules Ly-2; il semble que la variation du nombre des cellules Ly-2+ et L3T4+ des souris témoins non traitées soit due à lavariation naturelle d'une souris à l'autre. Il a donc été évident

que l'Ida-anti-L3T4 et l'Ida-anti-Ly-2.1 pourraient res-

pectivement provoquer une déplétion des cellules L3T4+ 3 5

ou Ly-2+ dans les rates des souris traitées, plus effi-

cacement que le MoAb seul. L'effet du conjugué Ida-

anti-Ly-2.1 est important car Le MoAb anti-Ly-2.1 est totalement dépourvu d'effet lorsqu'on l'utilise seul, mais peut être transformé en un agent immunosuppresseur puissant lorsqu'il est couplé à l'Ida. La déplétion entretenue par les conjugués médicament-MoAb a donc été appropriée à l'examen du rôle des cellules Ly-2+ et

L3T4+ in vivo dans la réaction de rejet du greffon.

Effet de l'Ida-anti-L3T4, de l'Ida-anti-Ly-2.1 et de l'Ida-anti-Thy-1 sur la surviede greffons tumoraux

Dans ces expériences, les conjugués Ida-anti-

L3T4, Ida-anti-Ly-2.1 et Ida-anti-Thy-1 ont été utilisés pour accroître la durée de survie de greffons tumoraux

P388D1 chez des souris CBA, les allogreffes étant effec-

tués à travers les barrières H-2 (classes I et II) et non-H-2. (a) Traitement avec une association de coniugués Des groupes de 10 à 15 souris CBA ont reçu des injections sous-cutanées de 8,0 x 106 cellules tumorales P388D1 et ont reçu une injection intraveineuse les jours -1, 0 (= jour de l'inoculation de la tumeur), 3, 5 et 10 d'un des composants suivants: (i) PBS, (ii) anti-L3T4

et anti-Ly-2.1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti-

Ly-2.1 et (v) Ida-anti-L3T4 et Ida-anti-Ly-2.1. La quan-

tité totale d'Ida et de MoAb reçue était respectivement de 125 pg et 5,75 mg. Les greffons tumoraux des souris traitées par le PBS et par les MoAb ont survécu 14 à 17 jours avec une taille maximale moyenne des tumeurs de

0,31 cm, ce qui démontre que les deux MoAb non conju-

gués associés sont incapables de réaliser une déplétion

efficace des cellules L3T4+ et Ly-2+ telle que le gref-

fon tumoral puisse survivre (figure 16). De plus, l'Ida-anti-Ly-2.1 et l'Ida-anti-L3T4 seuls n'ont pu que prolonger la survie du greffon (20-28 jours) avec des tailles maximales moyennes des.tumeurs de 0,40 cm2 à 0,50 cm2. Il est probable que l'Ida-anti-Ly-2.1 ou l'Ida-anti-L3T4 seuLs n'ont pas pu éliminer toutes les cellules T et qu'une provocation antigénique puissante (comme on L'observe avec les différences complètes du complexe majeur d'histocompatibiLité) a été capable de stimuler les cellules Ly-2 et L3T4+ restantes pour qu'elles prolifèrent et provoquent une réaction de rejet. En revanche, une association des deux conjugués IIa-anti-L>-2. et Ida-anti-L3T4 a permis à 14/15 des greffons turoraux P3ô8oD d'échapper au rejce et c'a.gi:enter ce taille jusqu'à ce que Les souris soient sacrifiées (jour 50-2,00 cm2). On a noté qu'un petit nombre de ces tumeurs P388D1 traitées avec un conjugué ont présenté une certraine ràgression de la taitLe des oJrs 8 à 16; cependant, une déplétion continue des ce[luies L3T4+ et Ly-2+ (jour 10) a permis au greffon de tumeur P38aD1 de présenter rune croissance tumorale réglère. (b) Ccnjugué Ida-anti-Thy-1 On a injecté à des groupes de 10 souris CBA par voie sous- cutanée 10 cellules de tumeur P388D1 et, par voie intraveineuse, l'un des composés suivants aux jours

-1, O, 5 et 6; (i) PBS, (ii) anti-Thy-1 et (iii) Ida-

anti-Th-y-1. La quantité totale d'Ida et d'anti-Thy-1 reçue a été respectivement de 130 pg et 5,4 mg et les greffons tumoraux des souris traitées par le PBS ont survécu pendant 15 jours. Le MoAb anti-Thy-1 seul a assuré la survie du greffon tumoral pendant 28 à 32 jours avec une taille maximale moyenne de la tumeur

de 0,58 cm2 (jour 6) (figure 17). Chez les souris trai-

tées par L'Ida-anti-Thy-1, 30 %l des greffons tumoraux ont été complètement rejetés au jour 40 tandis que les % restants ont continué à crottre pour finalement permettre (jour 32) l'augmentation de la taille moyenne des tumeurs du grouDe. Donc, l'Ida-anti-Thy-1, comme L'association Ida-anti-Ly-2.1 et l'Ida-anti-L3T4, a été capable de provoquer une déplélior des ccllules Ly-2+ et L3T44 telle qu'une majorité des greffons de tumeur P388D1 ont survécu chez les souris CBA en l'absence de

la réaction normale de rejet rapide.

EXEMPLE 3

On a préparé des conjugués selon le mode opéra-

toire décrit dans l'exemple 1 entre l'Ida et l'anticorps monoclonal 17.1 (Thompson et autres, Proc. NatL. Cancer Inst. 7C., p. 409-41i, ICG2A rrurine) et erntre l'Ida et l'anticorps mcroclcnai 30.6 (Thomrpsor, et autres, Br. J. Cancer, 47, p.595-605, 1983, IGG2B murine). Des cellules du carcinome humain du c5lon Colo 205 (30.6+, 17.1) ont

ête inoculées par voie sous-cutanée à des sou-

ris "nude" à raison de- 8 x 10C cellules/souris, comme décrit dans l'exemple 2. Les souris inoculées ont

ensuite été soumises à une série de traitements intrapé-

ritoreaux. La taille des tumeurs a été mesurée avec un pied à coulisse en effectuant la mesure selon les axes

perpendiculaires des tumeurs. Les valeurs ont été enre-

gistrées sous forme de la taille moyenne des tumeurs

(produit des deux diamètres + l'erreur type). Les résul-

tats sont illustrés par la figure 18.

EXEMPLE 4

On a préparé des conjugués selon le mode opéra-

toire décrit dans l'exemple 1 entre l'Ida et l'anticorps monoclonal 17.1, entre l'Ida et l'anticorps monoclonal

JGT-13: (IGG1 murine, réactive avec L'antigène carci-

noembryonnaire sur le carcinome du côlon, mais pas avec les tissus normaux), entre l'Ida et l'anticorps monoclonal 27.1: (IGG1 murine, réactive avec l'antigène de globules de graisse de lait humain sur un certain nombre de

tumeurs du côlon) et entre l'Ida et l'anticorps mono-

clonal 30.6. Un xénogreffon de tumeur humaine du côlon LIM2210 (1-5 mg) a été implanté par voie sous-cutanée

à des souris "nude". Les souris, après implan-

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tation, ont été soumises à une série de traitements intraveineux. La taille des tumeurs a été mesurée avec un pied à coulisse en effectuant la mesure selon les axes perpendiculaires des tumeurs. Les valeurs ont été enregistrées sous forme de la taille moyenne des tumeurs

(produit des deux diamètres l'erreur type). Les résul-

tats sont illustrés par la figure 19.

Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadi e de l'invention.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Conjugué d'immunoglobuline caractérisé en ce qu'il comprend de l'idarubicine (Ida) conjuguée à un

anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci compre-

nant au moins un des sites antigéniques de l'anticorps.

2. Conjugué selon la revendication 1, caracté-

risé en ce que l'anticorps monoclonal ou le fragment de

celui-ci est spécifique d'un tissu cible désiré.

3. Conjugué selon la revendication 2, caracté-

risé en ce qLe le tissu cible est un néoplasme humain.

4. Conjugué selon la revendication 1, caracté-

-risé en ce que l'anticorps monoclonal ou le fragment de celui-ci est spécifique d'un antigène de surface des cellules lymphocytaires T.

5. Conjugué seLon l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que 2 à 8 molé-

cules d'Ida sont liées par covalence à chaque molécule d'anticorps.

6. Conjugué selon l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisé en ce que L'Ida est conjuguée à l'anticorps monoclonal ou à son fragment par

La position C-1. de l'Ida.

7. Procédé pour la préparation d'un conjugué

d'immunoglobuline selon l'une quelconque des revendica-

tions précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend La conjugaison de l'Ida à l'anticorps monoclonal ou à son fragment.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé

en ce qu'on fait réagir une 14-halogéno-Ida avec l'anti-

corps monoclonal ou son fragment.

9. Nouveaux médicaments utiles notamment pour le traitement du cancer et pour provoquer la déplétion d'un sous-groupe de lymphocytes T, caractérisés en ce qu'ils

contiennent comme produit actif l'un au moins des conju-

gués d'immunoglobuline selon l'une quelconque des reven-

dications 1 à 6 ou que L'on a préparés selon Le procédé

de L'une des revendications 7 et 8, avec un support ou

diluant convenant en pharmacie.

10. Procédé de déplétion spécifique d'un sous-

groupe de Lymphocytes T dans une population de cellules,

caractérisé en ce qu'il comprend l'incubation des cellu-

Les in vitro avec un conjugué d'immunoglobuLine selon la revendication 1 dans lequel L'anticorps monoclonal ou son fragment est spécifique d'un antigène de surface cellulaire présent sur les lymphocytes dont on désire la déplétion.