WO1994019021A1 - Conjugues proteiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que medicament - Google Patents

Conjugues proteiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que medicament Download PDF

Info

Publication number
WO1994019021A1
WO1994019021A1 PCT/FR1994/000183 FR9400183W WO9419021A1 WO 1994019021 A1 WO1994019021 A1 WO 1994019021A1 FR 9400183 W FR9400183 W FR 9400183W WO 9419021 A1 WO9419021 A1 WO 9419021A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
afp
fetoprotein
cells
conjugate
protein conjugates
Prior art date
Application number
PCT/FR1994/000183
Other languages
English (en)
Inventor
Raymond Nakachian
Evgueni S. Severin
Serguei E. Severin
Vsevolod Kiselev
Original Assignee
Intromed Limited
Andreani, Jean-Xavier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intromed Limited, Andreani, Jean-Xavier filed Critical Intromed Limited
Priority to JP6518710A priority Critical patent/JPH08509698A/ja
Priority to EP94907594A priority patent/EP0684841A1/fr
Publication of WO1994019021A1 publication Critical patent/WO1994019021A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid

Definitions

  • PROTEIN CONJUGATES COMPOSITIONS CONTAINING THEM AND THEIR APPLICATIONS AS MEDICAMENTS.
  • the present invention relates to protein conjugates with specific affinity towards appropriate target cells, and more particularly towards cancer cells, as well as to their applications as an anticancer drug.
  • an amc is prepared so as to have specificity for an anti ⁇ gene present on the surface of the target cell, so that the amc will bind to the target cell, and when it is incorporated into said cell , it will transport its toxic conjugate inside the latter.
  • the toxic conjugate is mostly ricin, or the A subunit of ricin.
  • the B subunit binds to ubiquitous galactose residues on the cell surface, while the enzyme inactive A subunit enters the ribosomes. It has been estimated that a single castor molecule can inactivate all ribosomes of a cell. The invaded cell, unable to produce new proteins, dies.
  • agents can be incorporated into immunotoxins; mention may be made, in particular of bacterial or plant toxins (or their active fragments), radioactive atoms, and agents used in anticancer chemotherapy.
  • the immunotoxins thus formed direct the active substance (the toxin or the anticancer agent) towards the pathological domain and thus lead to the elimination of the target cells.
  • the toxin / specific antibody conjugates form very active immunotoxins, but they also have non-specific toxicity which restricts their application in vivo.
  • fragments of toxins devoid of sites capable of recognizing the targeted targets and conjugated to antibodies, are commonly used as immunotoxins.
  • Such hybrid molecules such as for example those which contain a deglycosylated ricin-A chain, are thus made highly specific.
  • their activity is lower than that of the immunotoxins comprising total ricin and this activity depends on the intensity with which the endocytosis takes place.
  • the translocation of the immunotoxin in the target cell essentially depends on the surface anti ⁇ gene recognized by the antibody component of the immunotoxin. It is an important step in the action of immunotoxins which, in a large number of cases, does not lead to endocytosis; consequently, the intracellular translocation of the immunotoxin therefore does not occur. In such cases, treatment therefore results in failure. In addition, many anti-gene markers present on the surface of cells are secreted. also in the extracellular medium. The effectiveness of the immunotoxin is therefore very reduced because of the competitive effect between surface antigens and secreted antigens.
  • cytotoxic agent is often problematic. Indeed, it must be relatively non-toxic once conjugated and become much more toxic after its transport to its site of action where intracellular enzymes release the toxic substance within tumor cells.
  • the Applicant has therefore set itself the goal of providing a composition, for therapeutic purposes, capable of acting only at the level of specific targets (cancer cells) and capable of promoting endocytosis (stimulation of the transport of substances across cell membranes).
  • the present invention relates to protein conjugates, of the type comprising a non-specific part and a part having a particular affinity for a specific type of target cells, characterized in that the part having a particular affinity for a specific type of target cells, (also called specific transport substance to the target cell) is ⁇ -fetoprotein and in that the non-specific part of said conjugate is chosen from the group which comprises the cytotoxic substances chosen from animal toxins, plant toxins, cytolytic enzymes and low molecular weight anti-cancer active principles selected from carboxyphosphoamide, amboclorin, doxorubicin, bleomycin, cisplatin, vinblastin, calichemycin and methotrexate or substances that modify the metabolism of cancer cells, such as nucleotide sequences d
  • conjugates retain some of the properties of ⁇ -fetoprotein and are, in particular, easily incorporated into cells which carry the ⁇ -fetoprotein receptor on their surface, by an endocytosis mechanism which stimulates penetration of the non-specific part (cytotoxic substance, nucleotide sequence) and are only active vis-à-vis cancer cell lines such as ly phomas, hepatomas, neuroblas omes, melanomas, astrocytomas, teratoblastomas, embryonic carcinomas, ovaries , testicular or presacral.
  • endocytosis mechanism which stimulates penetration of the non-specific part (cytotoxic substance, nucleotide sequence) and are only active vis-à-vis cancer cell lines such as ly phomas, hepatomas, neuroblas omes, melanomas, astrocytomas, teratoblastomas, embryonic carcinomas, ovaries , testicular or presacral.
  • the conjugate has, with respect to the target cells, an activity significantly higher than that obtained with the non-specific non-conjugated part.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions, characterized in that they comprise, as active principle, at least one protein conjugate according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • ⁇ -fetoprotein-cytotoxic protein conjugates chosen from the anti-cancer active principles are particularly suitable for being used for the preparation of a medicament intended for use in the treatment of cancers and in particular in the treatment of leukemias , lymphomas, hepatomas, neuroblastomas, melanomas and astrocytes.
  • the conjugates ⁇ -fetoprotein-vinblastine, ⁇ -fetoprotein-doxorubicin and ⁇ -fetoprotein-calichemicin are particularly suitable for being used for the preparation of a medicament intended for use in chronic myeloid leukemia.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention.
  • Amounts of ⁇ -fetoprotein, of the order of a milligram can be prepared by immunoaffinity techniques.
  • the first step therefore consists in preparing this fairly pure protein and in sufficient quantity (approximately 100 ⁇ g) to immunize mice and to prepare monoclonal antibodies which will then be used to purify the ⁇ -fetoprotein in significant quantities. one step.
  • the ⁇ -fetoprotein can be prepared from blood from the human fetal cord or from cancerous cells in culture (hepatomas, teratocarcinoma).
  • the production method consists, in fact, of separating this protein from the other proteins which accompany it, according to conventional methods known per se, such as ion exchange, affinity, exclusion chromatography on gel or hydrophobic interaction, preparative electrophoresis, dialysis and ultrafiltration.
  • the raw material whole blood or cell suspension
  • the total proteins are then purified by chromatography and then by preparative electrophoresis, so as to avoid any contamination by foreign proteins and in particular by albumin.
  • the eluted proteins are collected and then chromatography is carried out on a Mono Q column.
  • PHARMACIA FPLC SYSTEM Elution is carried out by a sodium chloride gradient (0-0.5 M) in the same buffer as above. The ⁇ -fetoprotein is eluted with 0.35 M of sodium chloride. After concentration by ul ⁇ trafiltration on a PM-10 membrane with a cutoff threshold of 10,000 daltons (AMICON), the proteins are chromatographed again by filtration on crosslinked agarose gel (Superose® 12, PHARMACIA) , in a column 25 mm in diameter and 80 cm long in a pH 7.0 phosphate buffer. The column having been previously calibrated, the peaks corresponding to a molecular weight of 70 Da and 140 kDa are collected.
  • the electrophoresis is carried out without SDS, from a concentration gel zone (4% polyacrylamide in the concentration gel and 7.5% in the separation gel).
  • a Tris-HCl buffer pH 6.7 is used in the concentration gel and a Tris-glycine buffer pH 8.3 in the separation gel.
  • the sample is diluted to half with Tris-HCl buffer pH 6.7.
  • Tris-HCl buffer pH 6.7 One part of glycerol is added for one part of sample diluted in the buffer, and one-tenth of the volume to be deposited of bromophenol blue solution is added in Tris-HCl pH 6.7 buffer, to visualize the front of migration.
  • Electrophoresis is carried out at 15 "C at 30 mA for about 4 hours.
  • Coomassie and the strip in its uncoloured part correspond- laying on the ⁇ -fetoprotein, is carefully cut to avoid contamination with the albumin still present at this stage of the purification.
  • the gel containing the ⁇ -foeto ⁇ protein is homogenized in pH 7.0 phosphate buffer and stirred in a tube for 1 hour.
  • the supernatant is collected and chromatographed on Cibacron Blue 2-Sepharose® as before, but in phosphate buffer pH 7.0. Proteins not retained by the gel are collected and then concentrated by ultrafiltration, as above. These proteins are then used to immunize mice in order to obtain antibodies which will make it possible to prepare significant amounts of ⁇ -fetoprotein by immunoaffinity.
  • the ⁇ -fetoprotein is used to produce antibodies of low affinity anti- ⁇ -fetoprotein. This production occurs by injecting ⁇ -fetoprotein into mice in the presence of Freund's adjuvant.
  • the popliteal lymph nodes are then removed from these mice and the cells of these lymph nodes are fused with myeloma cells to form hybridomas.
  • the immunization period is voluntarily chosen to be very short (one week) contrary to the usual methods which extend over several months.
  • mice This method makes it possible to produce clones of anti- ⁇ -fetoprotein antibodies of low affinity. More specifically, two BALB / c mice, about 4 months old, are immunized by injection of 20 ⁇ g of proteins associated with Freund's adjuvant, in a hind paw, twice to two days before , then a third time with 50 ⁇ g of protein without adjuvant, two days later. Three days after the last injection, or nine days in all, the mice are sacrificed and the popliteal lymph nodes are removed. They are homogenized and washed with DMEM medium without fetal calf serum and the homogenate is used to fuse with Sp2 / o myeloma cells. These mouse myeloma cells are conventionally used to produce hybridomas, they have the property of not developing in the HAT medium. Sp2 / o cells are cultured on DMEM- medium
  • Hybrimax with 10% fetal calf serum The fusion is carried out in the presence of PEG 3,000, at a concentration of 50% in DMEM medium from Fl thymocytes
  • Hybridomas are grown in HAT medium. The clones appear in 10-15 days in 75% of the cultures and correspond to Sp2 / o supplemented by immunocompetent cells.
  • the monoclonal antibodies of the IGg type are then purified by chromatography on Protein-A- Sepharose® (PHARMACIA). 5 ml of ascites liquid are centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, half diluted with Tris-HCl, pH 8.1, and placed on a column of Protein-A-Sepharose®. The column is washed with 100 ml of Tris-HCl buffer, pH 8, 1, and the immunoglobulins are eluted with an acetate buffer pH 6.0, then pH 4.5 and finally pH 3.5.
  • the low affinity anti- ⁇ -foeto ⁇ protein antibodies of one of the clones (10C3) are eluted at pH 4.5 and another (7H8) at pH 3.5.
  • the immunoglobulins are then concentrated by precipitation with ammonium sulfate at 50%, at 4 ° C for 18 hours and centrifuged for 30 minutes at 4000 rpm. The centrifugation pellet is redissolved in a minimum volume of PBS buffer and dialyzed against the same buffer, for 24 hours. 3 to 5 mg of antibody are thus obtained for 1 ml of ascites fluid taken from the mice.
  • the immunoglobulins thus purified are then immobilized on a Sepharose® gel (PHARMACIA) activated by cyanogen bromide according to the method pre ⁇ approved by the supplier of the gel.
  • PHARMACIA Sepharose® gel
  • a column 25 mm in diameter and 50 cm long is prepared with Sepharose gel to which the monoclonal antibody is fixed as described above.
  • the column is loaded with 50 ml of human fetal serum and the ⁇ -fetoprotein is eluted with a phosphate buffer in the form of a pH gradient ranging from 3.5 to 6.0.
  • the ⁇ -fetoprotein is eluted at pH 6.0, in a proportion of approximately 90%.
  • the ⁇ -fetoprotein is a glycoprotein.
  • the two domains of the molecule, protein and osidic can be used as binding sites for different substances.
  • Any substance having a chemically active site can, a priori, be conjugated to the ⁇ -fetoprotein.
  • the molecules containing thiol residues can be linked to the ⁇ -fetoprotein by a reaction between amino groups of the protein and activated carboxylic esters or with imidates.
  • the fixing of molecules containing carboxylic residues is effected in a particularly effective manner by derivatives of carbodiimides. In general, the fixation on osidic residues is effected by modification with sodium metaeriodate, in particular when it is a question of fixing molecules containing free amino residues.
  • Targets for the conjugated ⁇ -fetoprotein Any cell having on its surface the receptor for the ⁇ -fetoprotein is a possible target for the conjugated ⁇ -fetoprotein. No normal cells or non-fetal has this receptor. Only fetal cells and cancer cells are provided with a proportion which exceeds 90% and this in more than 70 different cases of cancer (R. MORO et al., Tumor Biol., 8, 293, 1987).
  • EXAMPLE 2 Preparation of conjugates in accordance with the invention a) ⁇ -fetoprotein-toxin - ⁇ -fetoprotein (AFP) and diphtheria toxin (DT) conjugates.
  • AFP ⁇ -fetoprotein-toxin - ⁇ -fetoprotein
  • DT diphtheria toxin
  • diphtheria toxin 10 mg are placed in an aqueous solution containing 50 mM of dithiothreitol and incubated for 1 hour at room temperature.
  • the protein thus reduced is then purified by chromatography on a column of Sephadex® G-25 equilibrated in PBS buffer, or dialysis against the same buffer.
  • the reduced toxin is brought into contact with the modified ⁇ -fetoprotein and the solution of the two proteins is concentrated by ultrafiltration on a cellulose membrane having a cutoff threshold of 10,000 daltons. It is then left to incubate for 18 hours at room temperature.
  • the product obtained is then purified by chromatography on a column of Sephacryl® S-3.0 (PHARMACIA).
  • the final yield of the conjugation is 34%.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • R ricin A
  • ⁇ -fetoprotein 1 mg is dissolved in 1 ml of PBS buffer and mixed with 6 mg of SPDP (N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate) in ethanolic solution at a rate of 1 mg / ml. The mixture is incubated for 30 minutes, at room temperature, with constant agitation. The ⁇ -fetoprotein thus modified is dia ⁇ lysee against a 0.05 M borate buffer, pH 8.5.
  • SPDP N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate
  • ricin A is treated under the same conditions and in the same quantities as 1 ⁇ -fetoprotein.
  • the two modified proteins are then brought into contact, concentrated by ultrafiltration on a cellulose membrane with a cutoff threshold of 10,000 daltons up to a final volume of 5 ml, and incubated for 18 hours at room temperature.
  • the result of the conjugation thus produced is then purified by filtration chromatography on Sephacryl® S-300 gel.
  • the conjugate is recovered in its buffer pH 8.5, at the molecular weight corresponding to the sum of the molecular weights of the two proteins, ie approximately 102,000 daltons.
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • Asp asparaginase
  • CMC l-cyclohexyl-3 (2-morpholinoethyl) carbodiimide
  • Human AFP (Asp: AFP molar ratio of 1: 1) is added to a solution of asparaginase, activated by an excess, by a factor of the order of 2000, of CMC, at pH 5.4. The mixture obtained is incubated for 16 hours at room temperature and dialyzed against PBS.
  • Carboxyphosphoamide is the metabolite of cyclophosphoamide, a widely used anticancer molecule. Its metabolite, carboxyphosphoamide, cannot penetrate cells because of its high negative charge, and thus manifests low toxicity. If, by means of conjugation, carboxyphosphoamide enters the cells, it will be split into acrolein and phosphoramide by phosphoamidases which are particularly active in cells in the process of proliferation. The phosphoramide thus obtained is highly cytotoxic.
  • the conjugation between the ⁇ -fetoprotein and the carboxyphosphoamide is carried out at + 4 "C in pyridine containing 0.01 M HCl and EDC (1-ethyl-3 (3-dimethyl-aminopropyl ) carbodiimide) in an EDC: AFP proportion of 2500: 1.
  • EDC Hexamethylenediamine
  • HMDA Hexamethylenediamine
  • the final ⁇ -fetoprotein-hexamethylene-diamine-CFA proportions are 1: 10: 120
  • the resulting conjugate is dialyzed against PBS and then stored at -70 ° C.
  • N (CH2-CH2 ⁇ C1) 2 can be conjugated to the ⁇ -fetoprotein in the same way as carboxyphosphoamide, with a yield of approximately 65%.
  • Methotrexate (MT) is dissolved in a pyridine-HCl buffer, pH 5.0 and the ⁇ -fetoprotein (AFP) solution is prepared in the same buffer. EDC is added and the whole is agitated.
  • MT AFP: EDC is 10: 1: 2500. After shaking for 3 hours, the preparation is dialyzed against a PBS buffer and diluted in PBS until a concentration of AFP of 20 mg / ml is obtained.
  • DR doxorubicin
  • HC1, pH 5.0 and the ⁇ -fetoprotein (AFP) solution is prepared in the same buffer.
  • EDC and adipic acid are added.
  • Adipic acid plays the role of intercalator between AFP and DR; the DR: adipic acid: AFP: EDC ratio is 10: 50: 1: 2500.
  • Daunomycin has a free amino radical which allows direct conjugation with ⁇ -fetoprotein. Daunomycin is dissolved in pyridine at a concentration of 10%. A solution of ⁇ -fetoprotein in a hydrochloric buffer pH 5.0 is added, then adipic acid is added as an intercalator so that the proportions between the different products are variable but so that the ratio between ⁇ -fetoprotein and EDC is always from 1 to 2500.
  • the yield of the conjugation strongly depends on the different proportions between the products and ranges from 22% to 57%.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • RM rubomycin
  • AFP-RM conjugates are prepared according to the method used for doxorubicin.
  • AFP-BM conjugates are prepared using a method similar to that used for doxorubicin
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • CP cisplatin
  • AFP is added to a solution of cisplatin and EDC in 0.1 M pyridine buffer - HCl, pH
  • the reaction mixture is stirred overnight at 4 ° C or 2 hours at 20 ° C.
  • the conjugate obtained is dialyzed 3 times against a PBS buffer at 4 ° C, for 24 hours. Conjugate samples can be stored in the freezer.
  • the EDC: AFP molar ratio must not be less than 2000: 1.
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • VB vinblastine
  • Vinblastine does not have a free amino group; consequently, it is necessary to esterify it before carrying out a conjugation with AFP.
  • the esterification is carried out, at 37 ° C., by dropwise addition of 0.1 M KOH to a solution of vinblastine, until a pH of 9.5 is obtained.
  • the reaction mixture is neutralized with a 0.1 M pyridine-HCl solution at pH 5.0.
  • the vinblastine thus modified is conjugated to AFP, according to a method similar to that described above for cisplatin; however, for the application of this method to vinblastine, EDC is introduced last, since vinblastine interacts with the amino groups of AFP.
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • calichrobcine is first cleaved, by addition of dithiothreitol (up to 1 M) and AFP is modified by SPDP in PBS, pH 7.2, at 4 ° C , for 12 hours.
  • the solutions of calichrobcine, EDC and modified AFP are mixed with stirring overnight.
  • the conjugate obtained is dialyzed against a PBS buffer, for 24 hours.
  • the SPDP: AFP molar ratio depends on the calichemycin: AFP ratio sought, and must be greater by a factor of 8 than the latter.
  • EXAMPLE 3 Effects of the various conjugates in accordance with the invention on cultured human cancer cell lines.
  • QOS QOS T lymphoma
  • CEM CEM T lymphoma
  • Raji B lymphoma Raji B lymphoma
  • Namalva B lymphoma Nam
  • Hep HepG2a hepatoma
  • Amastrocytoma Ast
  • Melanoma Bro Bro
  • IMR neuroblastoma IMR - 32
  • the aforementioned culture medium can also be adapted to each specific culture.
  • Tables I to XI below which provide the percentage of surviving cells after an incubation of 72 hours with the cytotoxic substance alone (control) or with a conjugate in accordance with the invention (test).
  • AFP diphtheria toxin
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • R ricin A
  • CFA cytotoxicity of the ⁇ -fetoprotein coupled to carboxyphosphoamide is determined with variable proportions of HMDA- ⁇ -fetoprotein of between 0 and 120. This determination is carried out on QOS cells, belonging to a lymphoblastoid line, by measuring the quantity of tritiated thymidine incorporated relative to the controls ( ⁇ -fetoprotein (AFP) alone, carboxy- phosphoamide (CPA) and HMDA alone or as a mixture in the same proportions as in the conjugate).
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • CPA carboxy- phosphoamide
  • HMDA % of incorporated tritiated thymidine
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • AC amboclorin
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • DN daunomycin
  • test a is carried out on the same cells and under the same conditions as for the ⁇ -fetoprotein conjugated to the carboxypnosphoamide (test a)). 1. Without interlayer
  • Concentration Molar proportion Effect Effect in DN in DN AFP DN-AFP DN the medium
  • Concentration Molar proportion Effect Effect in DN in DN AFP DN-AFP DN the medium
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • RM rubomycin
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • CP cisplatin
  • AFP - ⁇ -fetoprotein
  • VB vinblastine
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • CCh calichrobcine
  • Type CCh AFP CCh AFP: CCh AF ?: CCh AFP: CCh AFP: from (24 CCh (48 CCh (60 CCh (240 CCh (24 CCh cel. PM) Z. - pM): 4 pM): 1 pM) ) 1: 2 nM) 1: 2
  • the samples obtained are incubated at 37 ° C for 30-45 min, to allow the sedimentation of erythrocytes.
  • the plasma is removed and the quantity of lymphocytes is estimated.
  • the plasma is transferred to an RPMI medium, in the presence of various antibiotics (penicillin, gentamycin).
  • the quantity of lymphocytes should not exceed 2.10 ⁇ / ml. If there are large amounts of leukemia cells in the sample, fetal bovine serum is added.
  • Plasma Lymphocytes Plasma Lymphocytes total (24 h) total (48 h) (24 h) (48 h)
  • the inhibitory effects are respectively a factor of about 45 and 16.
  • the inhibitory effect of conjugates is less pronounced than for patient 1; this is due to the type of leukemia, the age and the previous treatments of the patient.
  • the inhibitory effect of the conjugates is significantly more pronounced than that obtained with DR or CCh, alone.
  • P388 or L1210 leukemia is transmitted by injection of 10 7 suitable cells to male DBA mice weighing approximately 18 g.
  • the second day after the injection when the tumor has a quail of approximately 0.01 cm ⁇ - 1 , the treatment is started and includes the SC injection of an AFP-CCh conjugate (AFP: CC ratio. 1: 4), in accordance with the invention or calico-chemine alone (CCh at a dose of 0.6 ⁇ g / kg).
  • AFP-CCh conjugate AFP: CC ratio. 1: 4
  • calico-chemine alone CCh at a dose of 0.6 ⁇ g / kg.
  • Anti-cancer preparations are introduced in SC, in the region of the tumor or in IV, (once / day for 7 days).
  • a first group of animals used for control did not receive any preparation; a second group of animals also serving as controls received 0.2 ml of a 0.9% NaCl solution, in SC.
  • Each group includes 6 animals.
  • Monitoring of the size of the tumor is also carried out.
  • Tables XV, XVI and XVII below:
  • Agent Type Admin route Tumor volume
  • Table XV shows that both in P388 leukemia and in L1210 leukemia, a significant decrease in tumor volume is observed in the treated animals. These results confirm the interest of the conjugates according to the invention.
  • Table XVI shows the advantage of administering a conjugate according to the invention in SC.
  • P388 or L1210 leukemia is transmitted by injection of 10 'suitable cells to male DBA mice weighing approximately 18 g.
  • the treatment is started and includes SC injection of VB or AFP-VB conjugate (VB at a dose of 200 ⁇ g / kg, the AFP: VB ratio being 1:10) in the region of the tumor (1 fcis / day for 7 days) .
  • a first group of animals used for control did not receive any preparation; a second group of animals also serving as control received 0.2 ml of 0.9% NaCl solution, in SC.
  • Each group includes 6 animals.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Conjugués protéiques à affinité spécifique vis-à-vis de cellules cibles appropriées, et plus particulièrement vis-à-vis de cellules cancéreuses, ainsi que leurs applications en tant que médicament anticancéreux (propriétés cytolytiques). Ces conjugués protéiques, du type comprenant une partie non spécifique et une partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, sont caractérisés en ce que la partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, est de l'α-foetoprotéine, et la partie non spécifique dudit conjugué est choisie dans le groupe qui comprend les substances cytotoxiques choisies parmi les toxines animales, les toxines végétales, les enzymes cytolytiques et les principes actifs anticancéreux de bas poids moléculaire.

Description

CONJUGUES PROTÉIQUES, COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS EN TANT QUE MEDICAMENT.
La présente invention est relative à des conjugués protéiques à affinité spécifique vis-à-vis de cellules cibles appropriées, et plus particulièrement vis-à-vis de cellules cancéreuses, ainsi qu'à leurs applications en tant que médicament anticancéreux
(propriétés cytolytiques) .
Le transport de molécules actives au niveau de sites biologiques particuliers a été suggéré par ERLICH, il y a plus de 100 ans. Les molécules utilisées sont plus efficaces et ont de moindres effets secondaires quand leur activité se manifeste seulement au contact des organes ou des cellules cibles. Cela est particulièrement important en cancérologie, où des substances toxiques ou hautement antigéniques sont administrées .
Le progrès le plus important dans ce domaine a été obtenu avec des molécules qui possèdent à la fois une partie non spécifique et une partie possédant une affi- nité particulière pour un type spécifique de cellules.
Depuis le développement des anticorps mono- clonaux (a c) , l'un des buts de la biotechnologie a été la synthèse d' immunotoxines, c'est-à-dire d'amcs spéci¬ fiques d'un type de cellules, couplés à un agent capable de détruire lesdites cellules. En général, un amc est préparé de manière à avoir une spécificité pour un anti¬ gène présent à la surface de la cellule cible, de telle sorte que 1 'amc se liera à la cellule cible, et lorsqu'il sera incorporé à ladite cellule, il transportera son conjugué toxique à l'intérieur de cette dernière.
Le conjugué toxique est, la plupart du temps, de la ricine, ou la sous-unité A de la ricine. La sous- unité B se lie aux résidus galactose omniprésents à la surface des cellules, tandis que la sous-unité A inactive enzymatique ent les ribosomes . Il a été estimé qu'une seule molécule de ricin peut inactiver tous les ribosomes d'une cellule. La cellule envahie, incapable de produire de nouvelles protéines, meurt.
Outre la ricine, d'autres agents peuvent être incorporés dans les immunotoxines ; on peut citer, notam- ment les toxines bactériennes ou végétales (ou leurs fragments actifs) , les atomes radioactifs, et des agents utilisés en chimiothérapie anticancéreuεe.
Dans tous les cas, les immunotoxines ainsi constituées, dirigent la substance active (la toxine ou 1 ' anticancéreux) vers le domaine pathologique et condui¬ sent ainsi à l'élimination des cellules cibles.
Les conjugués toxine/anticorps spécifiques forment des immunotoxines très actives, mais ils possè¬ dent aussi une toxicité non spécifique qui restreint leur application in vivo .
D'autre p-srt, des fragments de toxines, dépourvus de sites pouvant reconnaître les cibles visées et conjugués à des anticorps, sont employés couramment comme immunotoxines. De telles molécules hybrides, comme par exemple celles qui contiennent une chaîne ricine-A déglycoεylée, sont ainsi rendues hautement spécifiques. Toutefois, leur activité est plus faible que celle des immunotoxines comprenant la ricine totale et cette acti¬ vité dépend de l'intensité avec laquelle se fait 1 'endo- cytose.
En effet, la translocation de 1 ' immunotoxine dans la cellule cible dépend essentiellement de l'anti¬ gène de surface reconnu par la composante anticorps de 1 ' immunotoxine. C'est une étape importante dans l'action des immunotoxines qui, dans un grand nombre de cas, ne conduit pas à l'endocytoεe ; en conséquence, la translo¬ cation intracellulaire de 1 ' immunotoxine ne se produit donc pas. Dans de tels cas, le traitement se solde donc par un échec. De plus, de nombreux marqueurs anti- géniques, présents à la surface des cellules, sont sécré- tés aussi dans le milieu extracellulaire. L'efficacité de 1 ' immunotoxine est donc de ce fait très réduite à cause de l'effet de compétition entre les antigènes de surface et les antigènes sécrétés. Dans le cas particulier de la thérapeutique antitumorale, les résultats obtenus à l'aide d'immuno¬ toxines constituées de substances cytotoxiques liées à des anticorps spécifiques des tumeurs ne s'est pas révé¬ lée aussi concluante que ce que pouvait faire espérer la théorie. En effet, cette dernière supposait que ces anti¬ corps devaient conduire la molécule cytotoxique au sein de la cellule. Or, il est apparu que soit l'efficacité de la molécule cytotoxique est amoindrie, soit l'affinité de l'anticorps est amoindrie, soit les deux. D'autre part, la pénétration des substances cytotoxiques dans les cellules cibles s'est révélée sou¬ vent très problématique et l'effet cytotoxique ainsi très réduit.
De plus, il a été découvert que de nombreux produits obtenus par conjugaison entre des anticorps et de telles molécules cytotoxiques ne peuvent pas être em¬ ployées en tant que médicaments pour des raisons de solu¬ bilité ou diverses incompatibilités.
Parmi d'autres difficultés, le choix de l'agent cytotoxique est souvent problématique. En effet, celui-ci doit être relativement non toxique une fois conjugué et devenir beaucoup plus toxique après son transport sur son site d'action où des enzymes intracellulaires libèrent la substance toxique au sein des cellules tumorales.
La Demanderesse s'est, en conséquence donné pour but de pourvoir à une composition, à visée thérapeu¬ tique, apte à agir uniquement au niveau de cibles spéci¬ fiques (cellules cancéreuses) et apte à promouvoir l'endocytose (stimulation du transport de substances à travers les membranes cellulaires) . La présente invention a pour objet des conju¬ gués protéiques, du type comprenant une partie non spéci¬ fique et une partie possédant une affinicé particulière pour un type spécifique de cellules cibles, caractérisés en ce que la partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, (également dénommée substance de transport spécifique vers la cel¬ lule cible) est de l 'α-foetoprotéine et en ce que la par¬ tie non spécifique dudit conjugué est choisie dans le groupe qui comprend les substances cytotoxiques choisies parmi les toxines animales, les toxines végétales, les enzymes cytolytiques et les principes actifs anticancé¬ reux de bas poids moléculaire et sélectionnés parmi le carboxyphosphoamide, 1 'amboclorine, la doxorubicine, la bléomycine, le cisplatine, la vinblastine, la calichémi- cine et le méthotrexate ou les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses, telles que des séquences nucléotidiques, exprimant une protéine et les séquences nucléotidiques anti-sens. De manière surprenante, de tels conjugués conservent certaines des propriétés de 1 ' α-foetoprotéine et sont, en particulier, facilement incorporés dans les cellules qui portent le récepteur de 1 'α-foetoprotéine à leur surface, par un mécanisme d'endocytose qui stimule la pénétration de la partie non spécifique (substance cytotoxique, séquence nucléotidique) et ne sont actifs que vis-à-vis de lignées cellulaires cancéreuses telles que ly phomes, hépatomes, neuroblas omes , mélanomes, astrocytomes, tératoblastomes, carcinomes de type embryonnaire, ovariens, testiculaires ou présacraux.
Egalement de manière surprenante, outre le fait que la partie non spécifique (substance cytotoxique, enzyme, principe actif anticancéreux) et l'α- foetoprotéine conservent leur efficacité, le conjugué présente vis-à-vis des cellules cibles, une activité significativement supérieure à celle obtenue avec la partie non spécifique non-conjuguée.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent, à titre de principe actif, au moins un conjugué protéique conforme à l'invention ec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les conjugués protéiques α-foetoprotéine-sub- stances cytotoxiques choisies parmi les principes actifs anti-cancéreux sont particulièrement aptes à être utili¬ sés pour la préparation d'un médicament destiné à une utilisation dans le traitement des cancers et notamment dans le traitement des leucémies, des lymphomes, des hépatomes, des neuroblastomes des mélanomes et des astro- cytornes.
De manière préférée, les conjugués α- foetoprotéine-vinblastine, α-foetoprotéine-doxorubicine et α-foetoprotéine-calichémicine sont particulièrement aptes à être utilisés pour la préparation d'un médicament destiné à une utilisation dans la leucémie myéloide chro¬ nique.
Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré¬ sente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Obtention de 1'α-foetoprotéine. a) Préparation :
Des quantités d'α-foetoprotéine, de l'ordre du milligramme peuvent être préparées par des techniques d' immunoaffinité. (1) La première étape consiste donc à préparer cette protéine assez pure et en quantité suffisante (environ 100 μg) pour immuniser des souris et préparer des anticorps monoclonaux que l'on va ensuite utiliser pour purifier 1 'α-foetoprotéine en quantités importantes en une seule étape.
L'α-foetoprotéine peut être préparée à partir de sang du cordon de foetus humain ou de cellules cancé¬ reuses en culture (hépatomes, tératocarcinome) . La méthode de production consiste, en fait, à séparer cette protéine des autres protéines qui l'accompagnent, selon des méthodes classiques et connues par elles-mêmes, telles que chromatographie d'échange d'ions, d'affinité, d'exclusion sur gel ou d'interaction hydrophobe, électrophorèse préparative, dialyse et ultrafiltration.
Dans une première étape, la matière première, sang total ou suspension cellulaire, est centrifugée puis soumise à une dialyse ou à une ultrafiltration pour éli¬ miner les sels minéraux et les molécules de faible poids moléculaire. On purifie ensuite les protéines totales par chromatographie puis par électrophorèse préparative, de façon à éviter toute contamination par des protéines étrangères et en particulier par de l'albumine.
De manière plus précise, 10 ml de sérum ombi- lical de foetus humain (12 semaines de gestation), sont dialyses contre une solution tampon pH 7,0 (6,5 mM bis- tris propane), pendant 24 heures, à travers une membrane de cellulose régénérée d'un seuil de coupure de 6 000- 8 000 daltons. Le sérum dialyse est ensuite placé sur une colonne de Cibacron Blue 2-Sépharose® CL-6B (PHARMACIA) de 26 mm de diamètre et 70 cm de long dans le même tam¬ pon. Cette opération a pour but d'éliminer la plus grande partie de l'albumine qui reste fixée sur le gel.
On recueille les protéines éluées et on réa- lise alors une chromatographie sur une colonne Mono Q
(PHARMACIA FPLC SYSTEM). L'élution est effectuée par un gradient de chlorure de sodium (0-0,5 M) dans le même tampon que précédemment. L'α-foetoprotéine est éluée par 0,35 M de chlorure de sodium. Après concentration par ul¬ trafiltration sur membrane PM-10 d'un seuil de coupure de 10 000 daltons (AMICON) , les protéines sont chromatogra- phiées à nouveau par filtration sur gel d'agarose réti¬ culé (Superose® 12, PHARMACIA), dans une colonne de 25 mm de diamètre et 80 cm de long dans un tampon phosphate pH 7, 0. La colonne ayant préalablement été étalonnée, on recueille les pics correspondant à un poids moléculaire de 70 Da et 140 kDa. Ces deux fractions sont réunies et soumises ensuite à une électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide : 1'électrophorèse est effectuée sans SDS, à partir d'une zone de gel de concentration (4 % de polyacrylamide dans le gel de concentration et 7,5 % dans le gel de séparation) . On utilise un tampon Tris-HCl pH 6,7 dans le gel de concentration et un tampon Tris- glycine pH 8,3 dans le gel de séparation.
L'échantillon est dilué au demi par du tampon Tris-HCl pH 6,7. On ajoute une partie de glycerol pour une partie d'échantillon dilué dans le tampon, et on ajoute un dixième du volume à déposer de solution de bleu de bromophénol dans du tampon Tris-HCl pH 6,7, pour vi¬ sualiser le front de migration. On effectue 1 'électropho- rèse à 15"C sous 30 mA pendant environ 4 heures.
Afin de déterminer la localisation de l'α- foetoprotéine sur le gel après migration, on effectue d'abord une électrophorèse de sérum foetal contre du sérum adulte dans les mêmes conditions. La concentration d'α-foetoprotéine dans le sang adulte est extrêmement faible. Ainsi, la comparaison des deux électrophorèses permet de rep rer la bande correspondant à l' α-foeto¬ protéine entre l'albumine et la transferrine dans le sang foetal . Le gel est coloré en partie par du bleu de
Coomassie et la bande, dans sa partie non colorée corres- pondant à 1 ' α-foetoprotéine, est découpée avec soin pour éviter la contamination avec l'albumine encore présente à ce stade de la purification. Le gel contenant 1 'α-foeto¬ protéine est homogénéisé dans du tampon phosphate pH 7,0 et soumis à une agitation dans un tube, pendant 1 heure.
Après centrifugation, le surnageant est recueilli et chromatographie sur Cibacron Blue 2-Sépha- rose® comme précédemment mais dans du tampon phosphate pH 7,0. Les protéines non retenues par le gel sont recueillies puis concentrées par ultrafiltration, comme précédemment. Ces protéines sont alors utilisées pour im¬ muniser des souris afin d'obtenir des anticorps qui vont permettre de préparer des quantités significatives d'α- foetoprotéine par immunoaffinité. (2) A ce stade, 1 'α-foetoprotéine est utilisée pour produire des anticorps de faible affinité anti-α- foetoprotéine. Cette production intervient en injectant de 1 'α-foetoprotéine à des souris, en présence d'adjuvant de Freund. Les ganglions lymphatiques poplités sont en- suite prélevés sur ces souris et les cellules de ces gan¬ glions sont fusionnées avec des cellules de myélomes pour former des hybridomes . La période d'immunisation est choisie volontairement très courte (une semaine) contrai¬ rement aux méthodes habituelles qui s'étendent sur plu- sieurs mois. D'autre part, on utilise ici des cellules ganglionnaires pour réaliser la fusion au lieu des splé- nocytes .
Cette méthode permet de produire des clones d'anticorps anti-α-foetoprotéine de faible affinité. De manière plus précise, deux souris BALB/c, âgées de 4 mois environ, sont immunisées par injection de 20 μg de protéines associées à de l'adjuvant de Freund, dans une patte postérieure, deux fois à deux jours d'in¬ tervalle, puis une troisième fois par 50 μg de protéines sans adjuvant, deux jours plus tard. Trois jours après la dernière injection, soit neuf jours en tout, les souris sont sacrifiées et on pré¬ lève les ganglions lymphatiques poplités. Ils sont homo¬ généisés et lavés par du milieu DMEM sans sérum de veau foetal et l'homogénat est utilisé pour effectuer une fu¬ sion avec des cellules de myélome Sp2/o. Ces cellules de myélome de souris sont classiquement utilisées pour pro¬ duire des hybridomes, elles ont la propriété de ne pas se développer dans le milieu HAT. On cultive les cellules Sp2/o sur milieu DMEM-
Hybrimax avec 10 % de sérum de veau foetal. La fusion est effectuée en présence de PEG 3 000, à une concentration de 50 % dans du milieu DMEM à partir des thymocytes Fl
(CBA x BALB/c) . Les hybridomes sont cultivés dans du mi- lieu HAT. Les clones apparaissent en 10-15 jours dans 75 % des cultures et correspondent à des Sp2/o complémen- tés par des cellules immunocompétentes.
Environ 40 clones différents produisent des anticorps monoclonaux anti-α-foetoprotéine. 9 d'entre eux ne réagissent pas avec le sérum humain normal par la technique ELISA et 5 ne réagissent pas par la méthode d'analyse im unologique après transfert (immunoblotting) . Deux clones sont choisis pour réaliser la séparation en quantité plus importante de 1'α-foetoprotéine, ils ne possèdent pas d'affinité croisée avec d'autres protéines sériques.
On injecte alors de 10 à 50 millions de cel¬ lules d'hybridomes chez une souris, afin de lui faire dé¬ velopper une tumeur productrice d'anticorps monoclonaux. Entre le lOème et 17ème jour après l'implantation, on prélève le liquide d'ascite afin de récupérer les anti¬ corps.
Les anticorps monoclonaux de type IGg sont pu¬ rifiés ensuite par chromatographie sur Protéine-A- Sépharose® (PHARMACIA) . 5 ml de liquide d'ascite sont centrifugés à 3 000 rpm pendant 20 minutes, dilués au demi par du tam¬ pon Tris-HCl, pH 8,1 et placés sur une colonne de Pro- téine-A-Sépharose®. La colonne est lavée par 100 ml de tampon Tris-HCl, pH 8, 1, et les immunoglobulines sont éluées par un tampon acétate pH 6,0, puis pH 4,5 et enfin pH 3,5. Les anticorps à faible affinité anti-α-foeto¬ protéine de l'un des clones (10C3) sont élues à pH 4,5 et un autre (7H8) à pH 3,5. Les immunoglobulines sont ensuite concentrées par précipitation par du sulfate d'ammonium à 50 %, à 4*C, pendant 18 heures et centrifugées pendant 30 minutes à 4 000 rpm. Le culot de centrifugation est redissous dans un volume minimal de tampon PBS et dialyse contre le même tampon, pendant 24 heures. On obtient ainsi de 3 à 5 mg d'anticorps pour 1 ml de liquide d'ascite prélevé sur les souris.
Les immunoglobulines ainsi purifiées sont en¬ suite immobilisées sur un gel de Sépharose® (PHARMACIA) activé par le bromure de cyanogène selon la méthode pré¬ conisée par le fournisseur du gel.
(3) On peut alors entreprendre la préparation en plus grande quantité de l 'α-foetoprotéine par chromatographie d'immunoaffinité après avoir immobilisé les anticorps sur support tel que le Sépharose® activé par la protéine A par exemple, de façon à lire la frac¬ tion Fc des Igl, Ig2 et Ig4.
Cette méthode générale permet d'obtenir des quantités substantielles d'α-foetoprotéine avec une grande pureté. Cette protéine préparée dans ces condi¬ tions s'avère stable.
De manière plus précise, on prépare une colonne de 25 mm de diamètre et 50 cm de long avec du gel de Sépharose sur lequel est fixé l'anticorps monoclonal comme décrit précédemment. On charge la colonne avec 50 ml de sérum foe¬ tal humain et 1 'α-foetoprotéine est éluée par un tampon phosphate sous la forme d un gradient de pH s 'étendant de 3,5 à 6,0. L 'α-foetoprotéine est éluée à pH 6,0, dans une proportion de 90 % environ. b) Conjugaison de 1 'α-foetoprotéine à diffé¬ rentes molécules actives :
L'α-foetoprotéine est une glycoprotéine. De la sorte, les deux domaines de la molécule, protéique et osidique, peuvent être utilisés comme sites de fixation de différentes substances. Toute substance ayant un site chimiquement actif peut être, a priori, conjuguée à l'α- foetoprotéine. D'une façon classique, les molécules contenant des résidus thiols peuvent être liées à l'α- foetoprotéine par une réaction entre des groupes aminés de la protéine et des esters carboxyliques activés ou avec des imidates . La fixation de molécules contenant des résidus carboxyliques est opérée de façon particulière¬ ment efficace par des dérivés de carbodiimides . En géné- rai, la fixation sur des résidus osidiques s'effectue par modification par le métapériodate de sodium, notamment quand il s'agit de fixer des molécules contenant des ré¬ sidus aminés libres.
Tous ces procédés sont déjà connus en eux- mêmes.
On peut ainsi envisager de fixer un grand nombre de substances, telles que des molécules cyto¬ toxiques, du matériel génétique (séquences nucléoti¬ diques), des inhibiteurs de réplication du génome (ADN antisens par exemple) , des enzymes ou encore des agents fluorescents, dans le but de repérer sous lumière ultra¬ violette les cellules cancéreuses. c) Cibles de 1 'α-foetoprotéine conjuguée : Toute cellule présentant à sa surface le ré- cepteur de 1 'α-foetoprotéine est une cible possible pour 1 'α-foetoprotéine conjuguée. Aucune cellule normale ou non foetale ne présente ce récepteur. Seules les cellules foetales et les cellules cancéreuses en sont pourvues dans une proportion qui dépasse 90 % et ce dans plus de 70 cas différents de cancers (R. MORO et al., Tumor Biol. , 8, 293, 1987) .
EXEMPLE 2 : Préparation de conjugués conformes à 1'invention a) Conjugués α-foetoprotéine-toxines - α-foetoprotéine (AFP) et toxine diphtérique (DT) .
A 10 ml d'une solution d'α-foetoprotéine concentrée à 1 mg/ml dans du tampon PBS, on ajoute 100 mg de SPDP (N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)propionate) en solution dans 160 ml de diméthylformamide. La solution est ensuite dialysee contre du tampon PBS ou chromatogra- phiée sur Séphadex® G-25 (PHARMACIA) , après équilibrage par du tampon PBS. La protéine ainsi modifiée est recueillie et concentrée par ultrafiltration sur membrane de cellulose ayant un seuil de coupure de 10 000 daltons. 10 mg de toxine diphtérique sont placés dans une solution aqueuse contenant 50 mM de dithiothréitol et incubés pendant 1 heure à température ambiante. La pro¬ téine ainsi réduite est ensuite purifiée par chromatogra¬ phie sur colonne de Séphadex® G-25 équilibrée dans du tampon PBS, ou dialysee contre le même tampon. La toxine réduite est mise en présence de 1 'α-foetoprotéine modi¬ fiée et la solution des deux protéines est concentrée par ultrafiltration sur membrane de cellulose ayant un seuil de coupure de 10 000 daltons. On laisse ensuite incuber pendant 18 heures à température ambiante.
Le produit obtenu est ensuite purifié par chromatographie sur colonne de Séphacryl® S-3.0 (PHARMACIA) .
Le rendement final de la conjugaison est de 34 %. - α-foetoprotéine (AFP) et ricine A (R) .
1 mg d'α-foetoprotéine est mis en solution dans 1 ml de tampon PBS et mélangé à 6 mg de SPDP (N- succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)propionate) en solution éthanolique à raison de 1 mg/ml. Le mélange est incubé pendant 30 minutes, à température ambiante, sous agita¬ tion constante. L'α-foetoprotéine ainsi modifiée est dia¬ lysee contre un tampon borate 0,05 M, pH 8,5.
Parallèlement, la ricine A est traitée dans les mêmes conditions et dans les mêmes quantités que 1 'α- foetoprotéine.
Les deux protéines modifiées sont ensuite mises en présence, concentrées par ultrafiltration sur membrane de cellulose à seuil de coupure de 10 000 daltons jusqu'à un volume final de 5 ml, et incu¬ bées pendant 18 heures à température ambiante.
Le résultat de la conjugaison ainsi réalisée est ensuite purifié par chromatographie de filtration sur gel de Séphacryl® S-300. Le conjugué est récupéré dans son tampon pH 8,5, au poids moléculaire correspondant à la somme des poids moléculaires des deux protéines, soit environ 102 000 daltons.
Le rendement final de la conjugaison est de 42 %. b) Conjugués α-foetoprotéine-enzymes
- α-foetoprotéine (AFP) et asparaginase (Asp) . Pour réaliser ladite conjugaison, on utilise du l-cyclohexyl-3 (2-morpholinoéthyl) carbodiimide (CMC) . On ajoute de l'AFP humaine (rapport molaire Asp:AFP de 1:1) à une solution d'asparaginase, activée par un excès, d'un facteur de l'ordre de 2000, de CMC, à pH 5,4. Le mélange obtenu est incubé pendant 16 heures à température ambiante et dialyse contre du PBS. c) Conjugués α-foetoprotéine-substance biolo- giquement active de bas poids moléculaire
- α-foetoprotéine (AFP) et carboxyphosphoamide
(CFA) . Le carboxyphosphoamide est le métabolite du cyclophosphoamide, molécule anticancéreuse largement uti¬ lisée. Son métabolite, le carboxyphosphoamide, ne peut pénétrer dans les cellules à cause de sa forte charge né¬ gative, et manifeste ainsi une faible toxicité. Si, au moyen de la conjugaison, le carboxyphosphoamide pénètre dans les cellules, il va être scindé en acroléine et en phosphoramide par des phosphoamidases particulièrement actives dans les cellules en cours de prolifération. Le phosphoramide ainsi obtenu est hautement cytotoxique. La conjugaison entre 1 'α-foetoprotéine et le carboxyphosphoamide est effectuée à +4"C dans de la pyri- dine contenant de l'HCl 0,01 M et de l'EDC (l-éthyl-3 (3- diméthyl-aminopropyl) carbodiimide) dans une proportion EDC:AFP de 2500:1. On utilise, de plus, de 1 'hexaméthylènediamine (HMDA) comme agent intercalant. Les proportions finales α-foetoprotéine-hexaméthylène- diamine-CFA sont de 1:10:120. Le conjugué qui en résulte est dialyse contre du PBS et conservé ensuite à -70 'C.
Le rendement final de la conjugaison est de 72 %.
- α-foetoprotéine (AFP) et amboclorine (AC) . L'a boclorine de formule HOOC- (CH2) 3-CgH4-
N(CH2-CH2~C1) 2 peut être conjuguée à 1 'α-foetoprotéine de la même façon que le carboxyphosphoamide, avec un ren- dément d'environ 65 %.
- α-foetoprotéine (AFP) et méthotrexate (MT) . Du méthotrexate (MT) est dissous dans un tampon pyridine-HCl, pH 5,0 et la solution d'α- foetoprotéine (AFP) est préparée dans le même tampon. De l'EDC est ajouté et l'ensemble est agité. Le rapport
MT:AFP:EDC est de 10:1:2500. Après agitation pendant 3 heures, la préparation est dialysee contre une tampon PBS et diluée dans du PBS jusqu'à l'obtention d'une concen¬ tration d'AFP de 20 mg/ml.
- α-foetoprotéine (AFP) et doxorubicine (DR) . De la DR est dissoute dans un tampon pyridine-
HC1, pH 5,0 et la solution d'α-foetoprotéine (AFP) est préparée dans le même tampon. De l'EDC et de l'acide adi- pique sont ajoutés. L'acide adipique joue le rôle d'intercalant entre l'AFP et la DR ; le rapport DR:acide adipique:AFP:EDC est de 10:50:1:2500.
- Conjugaison de 1'α-foetoprotéine avec la daunomycine.
La daunomycine possède un radical aminé libre qui permet la conjugaison directe avec 1'α-foetoprotéine. La daunomycine est dissoute dans de la pyri- dine à une concentration de 10 %. On ajoute une solution d'α-foetoprotéine dans un tampon chlorhydrique pH 5,0, puis on ajoute de l'acide adipique comme intercalant de façon à ce que les proportions entre les différents pro- duits soient variables mais de façon à ce que le rapport entre α-foetoprotéine et EDC soit toujours de 1 à 2500.
Le rendement de la conjugaison dépend forte¬ ment des différentes proportions entre les produits et s'étend de 22 % à 57 %. - α-foetoprotéine (AFP) et rubomycine (RM) .
Les conjugués AFP-RM sont préparés selon la méthode utilisée pour la doxorubicine.
- α-foetoprotéine (AFP) et bléomycine (BM) . Les conjugués AFP-BM sont préparés selon une méthode similaire à celle utilisée pour la doxorubicine
(pas d'ajout d'acide adipique) ; le rapport BM:AFP:EDC est de 100:1:2500.
- α-foetoprotéine (AFP) et cisplatine (CP) .
On ajoute de l'AFP à une solution de cispla- tine et d'EDC dans un tampon pyridine 0,1 M - HC1, pH
5,0. Le mélange reactionnel est agité pendant une nuit à 4°C ou 2 heures à 20°C. Le conjugué obtenu est dialyse 3 fois contre un tampon PBS à 4°C, pendant 24 heures. Des échantillons de conjugué peuvent être stockés au congéla¬ teur. Le rapport molaire EDC:AFP ne doit pas être infé- rieur à 2000:1.
- α-foetoprotéine (AFP) et vinblastine (VB) . La vinblastine ne présente pas de groupe amino libre ; en conséquence, il est nécessaire de l'estérifier avant de réaliser une conjugaison avec l'AFP. L 'estérification est réalisée, à 37°C, par addition goutte à goutte de KOH 0,1 M a une solution de vinblastine, jusqu'à l'obtention d'un pH de 9,5. Le mélange reactionnel est neutralisé par une solution de pyridine - HC1 0,1 M à pH 5,0. La vinblastine ainsi modi- fiée est conjuguée à l'AFP, selon une méthode similaire à celle décrite ci-dessus pour le cisplatine ; toutefois, pour l'application de cette méthode à la vinblastine, l'EDC est introduit en dernier, car la vinblastine inter¬ agit avec les groupes amino de l'AFP. - α-foetoprotéine (AFP) et calichémicine
(CCh) .
Pour obtenir de meilleures conditions de conjugaison, la calichémicine est tout d'abord clivée, par addition de dithiothréitol (jusqu'à 1 M) et l'AFP est modifiée par du SPDP dans du PBS, pH 7,2, à 4°C, pendant 12 heures. Les solutions de calichémicine, d'EDC et d'AFP modifiée sont mélangées sous agitation pendant une nuit. Le conjugué obtenu est dialyse contre un tampon PBS, pen¬ dant 24 heures. Le rapport molaire SPDP:AFP dépend du rapport calichémicine :AFP recherché, et doit être supé¬ rieur d'un facteur 8 à ce dernier. EXEMPLE 3 Effets des différents conjugués conformes à 1'invention sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines en culture.
L'action des conjugués a été testée sur les lignées suivantes : lymphome T QOS (QOS) , lymphome T CEM (CEM) , lymphome B Raji (Raji) , lymphome B Namalva (Nam) , hépa- tome HepG2a(Hep), astrocytome (Ast) , mélanome Bro (Bro) , et neuroblastome IMR - 32 (IMR) . _ Le protocole expérimental, commun à l'ensemble des tests effectués, est le suivant : les cellules sont mises en culture dans des plaques contenant 96 puits
(Linbro®) dans un milieu RPMI complémenté en sérum de veau fétal à 10 %, en pénicilline (100 unités/ml) et en streptomycine (100 mg/ml) , à 37°C et sous une atmosphère contenant 5 % de CO2. Le conjugué testé est ajouté, à une concentration de 5 mg/ml et après 48 à 72 heures, l'activité proliférante est vérifiée.
Le milieu de culture précité peut, en outre, être adapté à chaque culture spécifique.
Les résultats obtenus sont illustrés aux
Tableaux I à XI ci-après, qui fournissent le pourcentage de cellules survivantes après une incubation de 72 heures avec la substance cytotoxique seule (contrôle) ou avec un conjugué conforme à l'invention (test) .
- α-foetoprotéine (AFP) et toxine diphtérique
(DT )
Les résultat s sont illustrés au Tableau I ci- après TABLE;.u
Effet du conjugué AFP-TD sur des lignées cellulaires de 'lymphome humain T QOS (% de cellules survivantes)
Test Contrôle
20 μg/ml AFP et 48 58 12 μg/ml DT
20 μg/ml AFP et 44 34 24 μg/ml DT Contrôle : essai réalisé avec la DT seule, aux mêmes concentrations .
- α-foetoprotéine (AFP) et ricine A (R) .
Les résultats sont illustrés au Tableau II ci- après : TABLEAU II
Effet du conjugué AFP-R sur des lymphomes humains T QOS (% de cellules survivantes)
Test Contrôle
20 μg/ml AFP et 51 62 10 μg/ml R
20 μg/ml AFP et 14 20 20 μg/ml R Contrôle : essai réalisé avec la R seule, aux mêmes concentrations .
- α-foetoprotéine (AFP) et carboxyphosphoamide
(CFA) . a) On détermine la cytotoxicité de l'α-foeto- protéine couplée au carboxyphosphoamide avec des propor¬ tions variables de HMDA-α-foetoprotéine comprises entre 0 et 120. Cette détermination est réalisée sur des cellules QOS, appartenant à une lignée lymphoblastoide, en mesu¬ rant la quantité de thymidine tritiée incorporée par rap- port aux témoins (α-foetoprotéine (AFP) seule, carboxy- phosphoamide (CPA) et HMDA seuls ou en mélange dans les mêmes proportions que dans le conjugué) .
1. Sans HMDA (% de thymidine tritiée incorpo¬ rée) :
Concentration Proportion molaire Effet Effet en CPA dans CPA:AFP CPA-AFP CPA le milieu
0,75 μM 10:1 25 % 0 %
1,50 μM 20:1 98 % 0 %
3,75 μM 50:1 100 % 0 %
9, 00 μM 120:1 100 % 2 %
2. Avec HMDA (% de thymidine tritiée incorpo¬ rée)
Concentration Proportion molaire Effet Effet en CPA dans CPA:HMDA:AFP CPA-HMDA- CPA+AFP le milieu AFP
0,75 μM 120:20:1 97 % 0 %
1,50 μM 50:20:1 100 % 0 %
3,75 μM 20:50:1 100 % 0 %
9,00 μM 10:120:1 100 % 0 % b) Dans les mêmes conditions que celles illus¬ trées aux Tableaux I et II, on obtient les résultats sui¬ vants (% de cellules survivantes) :
TABLEAU III
AFP-CFA CFA AFP 1:120 (0, 8 μM)
Effet 1 87 144
- α-foetoprotéine (AFP) et amboclorine (AC) .
Les résultats sont illustrés au Tableau IV ci- apres x
Figure imgf000022_0001
]ffet du conjugué AFP-AC sur différentes lignées cellu¬ laires humaines (% ce ce: Iules survivantes)
Type de AC AFP:AC AC AFP:AC AC AFP:AC cellules (60 nM) = 1:5 (120nM) = 1:10 (240nM) = 1:20
(60 nM) (120nM) (240nM)
QOS 95 90 87 70 53 12
Hep 98 97 89 81 80 61
Bro 89 87 89 65 73 48
CEM 90 74 78 60 43 22
- α-foetoprotéine (AF?) et méthotrexate (MT) . a) Des essais comparatifs sont menés sur des cellules QOS (lignée lymphoblastoide) et des lymphocytes humains normaux. Les conjugués, comprenant différentes proportions de méthotrexate, sont ajoutés à des cultures de cellules QOS et à des cultures de lymphocytes humains normaux dans des boîtes à 96 puits (200 μl de milieu) . Les cultures sont incubées pendant 72 heures . La détec¬ tion et le comptage des cellules vivantes sont réalisés par coloration au bleu de thiazolyle (bromure de 3- (4, 5- diméthylthiazol-2-yl) -2, 5-diphényltétrazolium) .
Une solution de bleu de thiazolyle à une concentration de 1 mg/ml est ajoutée à la fin de l'incu¬ bation, à raison de 50 μl par puits. On incube à nouveau pendant 16 heures et on centrifuge pendant 5 minutes à 5 000 trs/min. Le surnageant est prélevé (150 μl exacte¬ ment mesurés) et on ajoute 150 μl de DMSO. Après dissolu¬ tion complète des cristaux de formazan, on lit la D.O. à 540 nm. Le témoin cultivé sans conjugué est affecté de la valeur 100 %. Concentration Proportion % de QOS % de en méthotrexate Méthotrexate- survi¬ lymphocytes dans le milieu AFP vantes survivants
1,50 μM 50:1 60 87
3,00 μM 100:1 53 82
6, 00 μM 200:1 48 91
12,00 μM 400:1 45 90 b) l'effet du conjugué AFP-MT est également étudié sur d'autres lignées cellulaires. Les résultats sont illustrés au Tableau V ci-après :
TABLEAU V
Effet du conjugué AFP-MT sur des lignées cellulaires humaines (% de cellules survivantes)
Type de MT AFP : MT MT AFP : MT MT AFP:MT cellules (24 nM) • = 1:2 (60 nM) = 1:5 (240nM) = 1:20 (24 nM) (60 nM) (240nM)
QOS 94 75 89 24 - -
Raji 91 76 80 72 - -
CEM 89 33 65 31 53 40
Nam 88 29 75 56 57 52
Bro 98 81 90 55 61 50
Ast 93 90 83 41 40 35
- α-foetoprotéine (AFP) et doxorubicine (DR) . a) Des essais comparatifs sont menés sur des cellules QOS (lignée lymphoblastoide) et des lymphocytes humains normaux exactement comme pour le méthotrexate. Concentration Proportion % de QOS % de en méthotrexate doxorubicine- survi¬ lymphocytes dans le milieu AFP vantes survivants
1,50 μM 50:1 22 66
3,00 μM 100:1 6 74
6, 00 μM 200:1 3 56
12,00 μM 400:1 2 71 b) Les effets du conjugué AFP-DR ont également été étudiés sur d'autres lignées cellulaires ; les résul¬ tats sont illustrés dans le Tableau VI ci-après :
TABLEAU VI
Effet du conjugué AFP-DR sur des lignées cellulaires humaines (% de cellules survivantes)
Type de DR AFP:DR DR AFP:DR DR AFP:DR cellules (24 nM) = 1:2 (48 nM) = 1:4 (60 nM) = 1:5
(24 nM) (48 nM) (60 nM)
QOS 87 17 85 10 80 4
Raji 99 23 - - - -
CEM 95 49 82 27 - -
Nam 90 25 81 6 65 3
IMR 95 83 85 53 60 42
Bro 91 55 95 80 71 36
Hep 104 81 95 80 71 30
Ast - - 87 70 55 14
- α-foetoprotéine (AFP) et daunomycine (DN) .
L'essai est réalisé sur les mêmes cellules et dans les mêmes conditions que pour 1 'α-foetoprotéine conjuguée au carboxypnosphoamide (essai a) ) . 1. Sans intercalant
Concentration Proportion molaire Effet Effet en DN dans DN:AFP DN-AFP DN le milieu
0,15 μM 10:1 75 % 5 %
0,30 μM 20:1 75 % 26 %
0,75 μM 50:1 100 % 37 %
1,50 μM 100:1 100 % 100 %
1,80 μM 120:1 100 % 100 %
2. Avec l'acide adioiσue comme intercalant
Concentration Proportion molaire Effet Effet en DN dans DN:AFP DN-AFP DN le milieu
0,15 μM 10:50:1 75 % 5 %
0,75 μM 50:120:1 100 % 37 %
1,80 μM 120:20:1 100 % 100 %
1,80 μM 120:50:1 100 % 100 %
1,80 μM 120:120:1 100 % 100 %
1,80 μM 120:250:1 100 % 100 %
- α-foetoprotéine (AFP) et rubomycine (RM) . Les effets obtenus avec le conjugué AFP-RM sur les cellules de lymphome humain T QOS sont illustrés au Tableau VII ci-après :
TABLEAU VII Effet du conjugué AFP-RM sur des lymphom.es humains T QOS (% de cellules survivantes)
Type de RM AFP:RM RM AFP:RM RM AFP:RM cellules (24 nM) = 1:2 (60 nM) = 1:5 (120nM) = 1:10
(24 nM) (60 nM) (120nM)
QOS 106 64 64 44 74 20
- α-foetoprotéine (AFP) et bléomycine (BM) . Les résultats sont illustrés au Tableau VIII ci-aores : TABLEAU VIII
Effet du conjugué APF-BM sur des lignées cellulaires humaines (% de cellules survivantes)
Type de cellules AFP:BM = 1:100 AFP BM (120 nM)
QOS 37 137 67
Hep 45 103 56
Ast 29 124 44
- α-foetoprotéine (AFP) et cisplatine (CP) .
Les résultats sont illustrés au Tableau IX ci- après
TABLEAU IX
Effet du conjugué AFP-CP sur des lignées cellulaires humaines (% de cellules survivantes)
Type de CP AFP : CP CP AFP : CP CP AFP : CP cellules (24 nM) = 1:2 (48 nM) = 1:4 (60 nM) = 1:5
(24 nM) (48 nM) (60 nM)
Ast 120 76 108 60 98 48
IMR 99 36 65 42 65 40
QOS 108 56 98 50 83 42
Bro 97 78 90 72 65 51
CEM 99 58 103 49 80 40
- α-foetoprotéine (AFP) et vinblastine (VB) .
Les résultats obtenus sur des cellules d' astrocytome sont illustrés au Tableau X ci-après : TABLEAU X Effet du conjugué AFP-VB sur des lignées cellulaires humaines d'astrocytome (% de cellules survivantes)
Type de VB AFP:VB VB AFP:VB VB AFP:VB cellules (24 nM) = 1:2 (48 nM) = 1:4 (60 nM) = 1:5
(24 nM) (48 nM) (60 nM)
Ast 42 24 41 26 38 20 α-foetoprotéine (AFP) et calichémicine (CCh).
Les résultats obtenus sur différentes lignées cellulaires humaines sont illustrés au Tableau XI ci- après :
TABLEAU XI Effet du conjugué AFP-CCh sur des lignées cellulaires humaines (% de cellules survivantes)
Type CCh AFP: CCh AFP: CCh AF?: CCh AFP: CCh AFP: de (24 CCh (48 CCh (60 CCh (240 CCh (24 CCh cel . pM) Z. - pM) : 4 pM) 1 : 5 pM) 1 :2 nM) 1:2
(24 (48 (60 (240 (24
* pM) pM) pM) pM) nM)
QOS 99 38 98 40 100 37 15 9 19 9
Ra-i - - - - - - 58 41 21 10
CEM - - - - - - 60 35 21 17
Bro 100 55 95 38 90 30 - - - -
48 heures d'incubation. EXEMPLE 4 : Effets inhibiteurs des différents conjugués conformes à 1'invention sur la prolifération de diffé¬ rentes cellules leucémiques.
I - effets des coniuσués AFP-DR et AFP-VB sur différentes leucémi--;. -z l'Homme. a) matériel _ méthode :
Après prélèvement du sang (5-7 ml), les échan¬ tillons obtenus sont incubés à 37°C, pendant 30-45 min, pour permettre la sédimentation des érythrocytes . Le plasma est retiré et la quantité de lymphocytes est éva¬ luée. Le plasma est transféré dans un milieu RPMI, en présence de différents antibiotiques (pénicilline, genta- mycine) . La quantité de lymphocytes ne doit pas excéder 2.10^/ml. En cas de quantités importantes de cellules leucémiques dans l'échantillon, on ajoute du sérum bovin fétal.
L'activité proliférative des cellules est e- surée par une méthode standard sur plaques à l'aide de thymidine tritiée après 24, 48 et 72 heures. b) patients : patient 1 : leucémie myéloïde chronique, chro¬ mosome Philadelphie + (enfant de 9 ans) , patient 2 : leucémie myéloïde chronique, chro¬ mosome Philadelphie - (femme de 69 ans), patient 3 : leucémie aigϋe (fille de 10 ans) , patient 4 : lymphosarcome primaire. c) résultats : Les résultats obtenus avec les conjugués AFP-
DR et AFP-VB sont illustrés aux Tableaux XII-XIV ci- après, chez les quatre patients précités :
TABLEAU XII : Patient 1 Les essais, avec le patient 1, ont été réalisés sur des lymphocytes et du plasma, après 24 et 48 heures
Plasma Lymphocytes Plasma Lymphocytes total (24 h) total (48 h) (24 h) (48 h)
DR 5,3 % 6,1 % 7,0 % 8,1 %
AFP:DR 1:50 2,9 % 2,2 % 1,8 % 3,9 %
VB 65,5 % 52,1 %
AFP:VB 1:10 48,3 % 43,8 %
Ces résultats montrent que dès 24 heures d'incubation avec le conjugué AFP-DR 1:50, on observe une diminution d'un facteur de l'ordre de 35, de l'activité proliférative, alors que le DR seul n'entraîne qu'une diminution d'un facteur de l'ordre de 20 (plasma total) .
Dans le cas des lymphocytes, les effets inhibiteurs sont respectivement d'un facteur de l'ordre de 45 et 16.
Après 48 heures d'incubation, l'effet est encore plus prononcé.
L'effet inhibiteur du conjugué AFP-VB s'est révélé moins prononcé, mais l'essai a été réalisé avec de très faibles concentrations de VB.
Les essais réalisés avec le patient 2, ont été effectués uniquement sur du plasma.
TABLEAU XIII : Patient 2
Plasma total
24 h 48 h 72 h
DR 58 g. 70 g. "o 33 %
AFP:DR 1:50 47 g. 55 "o 21 %
VB 68 g, *o 55 g. 31 %
AFP:VB 1:10 53 g. 37 g.
"o 17 %
Chez ce patient, l'effet inhibiteur des conju¬ gués est moins prononcé que pour le patient 1 ; ceci est dû au type de leucémie, à l'âge et aux traitements précé¬ dents du patient.
Les essais avec les patients 3 et 4 ont été réalisés sur le sang total, après une incubation de 72 heures . TABLEAU XIV
Patient 3 Patient 4
DR 14 % 78 %
AFP:DR = 1:50 7 % 48 %
CCh 29 % 92 %
AFP:CCh = 1:10 8 % 45 %
VB 10 % 88 %
AFP:VB = 1:10 7 % 62 %
Pour le patient 3, l'effet inhibiteur des conjugués est significativement plus prononcé que celui obtenu avec DR ou CCh, seuls.
II - effets des conjugués AFP-CCh sur des leucémies murines .
On transmet une leucémie P388 ou L1210 par injection de 107 cellules convenables à des souris DBA mâles, d'un poids d'environ 18 g. Le deuxième jour après l'injection, lorsque la tumeur présente une caille d'environ 0,01 cm→-1 , le traitement est mis en place et comprend l'injection SC d'un conjugué AFP-CCh (rapport AFP:CC. de 1:4), conforme à l'invention ou de cali- chémicine seule (CCh à une dose de 0,6 μg/kg) .
Les préparations anti-cancéreuses sont intro¬ duites en SC, dans la région de la tumeur ou en IV, (1 fois/jour pendant 7 jours) . Un premier groupe d'animaux servant de contrôle n'ont reçu aucune préparation ; un deuxième groupe d'animaux servant également de contrôle ont reçu 0, 2 ml d'une solution de NaCl à 0,9 %, en SC . Chaque groupe comprend 6 animaux. L'augmentation de la durée de vie est calculée selon la formule suivante : %ILS=100. (T/C-l) , dans laquelle T représente la moyenne de temps de survie en jours du groupe expérimental et C représente la moyenne de temps de survie en jours, du groupe contrôle. Une surveillance de la taille de la tumeur est également réalisée. Le volume des tumeurs est calculé pendant l'expérience, selon ±a formule suivante : V=l/2 L. ^, dans laquelle L représente la longueur de la tumeur et représente la largeur de la tumeur. Les résultats sont illustrés dans les Tableaux XV, XVI et XVII ci-après :
TABLEAU XV
Type Agent Voie de admin. Volume c ^ tumeur
0 3ème 5ème 7ème 9ème jour jour jour jour jour contr. - 0,01 0,18 0,61 1,05 3,1
0,9 % s . c . 0,01 0,10 0,30 0,83 2,81 NaCl
CCh i .v. 0,01 0,12 0,74 1,14 3,41
P388 CCh s .c . 0,01 0,08 0,19 0,42 1,21
AFP- i .v. 0,01 0,09 0,34 1,13 2,6 CCh
AFP- s .c . 0,01 0,08 0,14 0,27 0,81 CCh contr. - 0,01 0,05 0,19 0,22 0,6
0,9 % s .c . 0,01 0,09 0,15 0,31 0,56
NaCl
CCh i .v. 0,01 0,02 0,15 0,30 0,52
L1210 CCh s .c . 0,01 0,03 0,08 0,12 0,29
AFP- i .v. 0,01 0,04 0,11 0,20 0,28 CCh
AFP- s . c . 0,01 0,03 0,10 0,09 0,16 CCh TABLEAU XVI
Leucémie Agent Voie Durée de % ILS admin. vie contrôle - 20 0
0, 9% NaCl s.c. 21 7
CCh i .v. 21,5 7,5
CCh s.c. 24,5 22,5
P388 AFP-CCh i .v. 19 -5
AFP-CCh s.c. 27,8 39 contrôle 11,5 0
PBS s.c. 13 13
CCh i .v. 12,5 8,7
L1210 CCh s.c. 17 48
AFP-CCh i .v. 14 21,7
AFP-CCh s.c. 19,5 69,5
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) TABLEAU XVII
Agent Dose Nombre de Durée de % ILS μg/kg souris vie
Contrôle 0,9 % NaCl 30 7 0
CCh 0,9 6 9,2 31,4
AFP-CCh 0,9 6 10,5 51,8
CCh 2,7 6 9,7 38, 6
AFP-CCh 2,7 6 8,5 21
CCh 8 6 9,5 35,7
AFP-CCh 8 6 11,5 60,7
CCh 24 6 6 -14
AFP-CCh 24 6 5,7 -18,6
Le Tableau XV montre qu'aussi bien dans la leucémie P388 que dans la leucémie L1210, on observe chez les animaux traités, une diminution significative du volume des tumeurs. Ces résultats confirment l'intérêt des conjugués conformes à l'invention. Le Tableau XVI montre l'intérêt de l'administration d'un conjugué conforme à l'invention en SC.
En ce qui concerne la leucémie L1210, l'effet de différentes concentrations de calichémicine seule ou sous la forme de conjugué a été testé (concentrations de 0,9 μg à 24 μg) ; le Tableau XVI montre que l'on obtient les meilleurs résultats en utilisant de faibles concen¬ trations d'agent cytotoxique.
III - effets des conjugués AFP-VB sur la leucémie murine.
On transmet une leucémie P388 ou L1210 par injection de 10 ' cellules convenables a des souris DBA mâles, d'un poids d'environ 18 g. Le deuxième jour après l'injection, lorsque la tumeur présente une taille d'environ 0,01 cτvr' , le traitement est mis en place et comprend l'injection SC de VB ou de conjugué AFP-VB (VB à une dose de 200 μg/kg, le rapport AFP:VB étant de 1:10) dans la région de la tumeur (1 fcis/jour pendant 7 jours) . Un premier groupe d'animaux servant de contrôle n'ont reçu aucune préparation ; un deuxième groupe d'animaux servant également de contrôle ont reçu 0,2 ml d'une solution de NaCl à 0,9 %, en SC . Chaque groupe comprend 6 animaux. L'augmentation de la durée de vie est calculée à l'aide de l'équation %ILS=100. (T/C-l) , dans laquelle T représente la moyenne de temps de survie en jours du groupe expérimental et C représente la moyenne de temps de survie en jours, du groupe contrôle.
Les résultats obtenus sont illustrés au Tableau XVII ci-après :
TABLEAU XVII
Leucémie Agent Voie Durée de % ILS vie contrôle - 20 0
0, 9% NaCl s.c. 21 7
P388 VB s.c. 20 0
AFP-VB s.c. 23,8 19 contrôle - 11,5 0
0/9% NaCl s.c. 13 13
L1210 VB s.c. 18,8 63,5
AFP-VB s.c. 22 91,3
Ce Tableau XVII montre que les deux types de leucémies sont traitées à la fois par la VB seule et le conjugué conforme à l'invention ; toutefois, le %IL3 est significativement plus important pour le conjugué AFP-VB que pour la VB seule.
En ce qui concerne la leucémie L1210, l'effet de différentes concentrations de VB seule ou de conjugué AFP-VB ont été testés. Le protocole de traitement est similaire à celui décrit ci-dessus ; toutefois des concentrations comprises entre 7,5 μg et 200 μg/kg ont été testées ainsi que la voie péritonéale.
TABLEAU XVII
Agent Dose Nombre de Durée de % ILS μg/kg souris vie
Contrôle 0,9 % NaCl 30 7 0
VB 7,5 6 8,8 25,7
AFP-VB 7,5 6 10,5 50
VB 22 6 8,5 21,4
AFP-VB 22 6 11,3 68,6
VB 67 6 9,2 31,4
AFP-VB 67 6 12 71,4
VB 200 6 9,7 38,6
AFP-VB 200 6 13,2 88,6
Ce Tableau XVIII montre les résultats signifi- cativement meilleurs obtenus avec les conjugués conformes à l'invention, notamment à des doses de 200 μg/kg.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve¬ nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar¬ ter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Conjugués protéiques, du type comprenant une partie non spécifique et une partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, caractérisés en ce que la partie possédant une affinité particulière pour un type spécifique de cellules cibles, (également dénommée substance de transport spéci¬ fique vers la cellule cible) est de l 'α-foetoprotéine et en ce que la partie non spécifique dudit conjugué est choisie dans le groupe qui comprend les substances cyto¬ toxiques choisies parmi les toxines animales, les toxines végétales, les enzymes cytolytiques et les principes actifs anticancéreux, de bas poids moléculaire et sélec¬ tionnés parmi le carboxyphosphoamide, 1 ' amboclorine, la doxorubicine, la bléomycine, le cisplatine, la vinblas¬ tine, la calichémicine et le méthotrexate ou les sub¬ stances modifiant le métabolisme des cellules cancé¬ reuses, telles que des séquences nucléotidiques.
2 ° ) Compositions pharmaceutiques, caractéri- sées en ce qu'elles comprennent, à titre de principe actif, au moins un conjugué selon la revendication 1 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
3 ° ) Compositions pharmaceutiques selon la revendication 2, caractérisées en ce que les substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses sont choisies parmi les séquences nucléotidiques exprimant une protéine et les séquences nucléotidiques anti-sens.
4°) Utilisation de conjugués protéiques α- foetoprotéine-substances cytotoxiques choisies parmi les principes actifs anticancéreux pour la préparation d'un médicament destiné à une utilisation dans le traitement des cancers .
5°) Utilisation de conjugués protéines α- foetoprotéine-vinblastine dans la préparation d'un médi- cament destiné à une utilisation dans le traitement des leucémies . 6°) Utilisation de conjugués protéines α- foetoprotéine-doxorubicine dans la préparation d'un médi¬ cament destiné à une utilisation dans le traitement des leucémies. 7°) Utilisation de conjugués protéines α- foetoprotéine-calichémicine dans la préparation d'un mé¬ dicament destiné à une utilisation dans le traitement des leucémies.
PCT/FR1994/000183 1993-02-18 1994-02-18 Conjugues proteiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que medicament WO1994019021A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6518710A JPH08509698A (ja) 1993-02-18 1994-02-18 蛋白質複合体、それを含む組成物及びその医薬としての用途
EP94907594A EP0684841A1 (fr) 1993-02-18 1994-02-18 Conjugues proteiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que medicament

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9301833A FR2701710B1 (fr) 1993-02-18 1993-02-18 Conjugués protéiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que médicament et réactif de diagnostic.
FR93/01833 1993-02-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1994019021A1 true WO1994019021A1 (fr) 1994-09-01

Family

ID=9444175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1994/000183 WO1994019021A1 (fr) 1993-02-18 1994-02-18 Conjugues proteiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que medicament

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0684841A1 (fr)
JP (1) JPH08509698A (fr)
CA (1) CA2155953A1 (fr)
FR (1) FR2701710B1 (fr)
WO (1) WO1994019021A1 (fr)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996009551A1 (fr) * 1994-09-19 1996-03-28 Moro Ricardo J Detection et traitement du cancer
EP0712313A1 (fr) * 1993-07-09 1996-05-22 Alexei Kondratyev Conjugues de medicaments pro-cytotoxiques destines a la therapie contre le cancer
US5926113A (en) * 1995-05-05 1999-07-20 L & H Company, Inc. Automatic determination of traffic signal preemption using differential GPS
EP3659307A4 (fr) * 2017-07-28 2021-09-22 Yale University Médicaments anticancéreux et leurs procédés de fabrication et d'utilisation

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6635740B1 (en) 1997-03-27 2003-10-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
US6680058B1 (en) 1997-09-03 2004-01-20 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993005774A1 (fr) * 1991-09-25 1993-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Complexes d'antibiotiques d'anthracycline et d'acides gras polyinsatures dans des emulsions de lipides

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4195073A (en) * 1977-10-27 1980-03-25 Hoffmann-La Roche Inc. Radioimmunoassay of alpha 1 fetoprotein
US4894348A (en) * 1987-07-01 1990-01-16 Ronald Robert C Fluorescein-conjugated proteins with enhanced fluorescence

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993005774A1 (fr) * 1991-09-25 1993-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Complexes d'antibiotiques d'anthracycline et d'acides gras polyinsatures dans des emulsions de lipides

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H.F. DEUTSCH ET AL.: "ANTHRACYCLINE-POLYUNSATURATED FATTY ACID (PUFA) COMPLEXES WITH ALPHA-FETOPROTEIN (AFP) AND THEIR UPTAKE BY TUMOR CELLS", TUMOR BIOLOGY, vol. 8, no. 6, 1987, pages 289 - 290 *
J. URIEL ET AL.: "ALPHAFOETOPROTEIN UPTAKE BY CLONED CELL LINES DERIVED FROM A NICKEL-INDUCED RAT RHABDOMYOSARCOMA", THE BRITISH JOURNAL OF CANCER, vol. 48, no. 2, 1983, pages 261 - 269 *
J.E.F. REYNOLDS: "MARTINDALE, THE EXTRA PHARMACOPOEIA", 1989, THE PHARMACEUTICAL PRESS, LONDON *
M. GEUSKENS ET AL.: "A STUDY, BY ELECTRON MICROSCOPY, OF THE SPECIFIC UPTAKE OF ALPHA-FETOPROTEIN BY MOUSE EMBRYONIC FIBROBLASTS IN RELATION TO IN VITRO AGING, AND BY HUMAN MAMMARY EPITHELIAL TUMOUR CELLS IN COMPARISON WITH NORMAL DONORS CELLS", JOURNAL OF SUBMICROSCOPIC CYTOLOGY AND PATHOLOGY, vol. 23, no. 1, 1991, pages 59 - 66 *
W.M. MAIESE ET AL.: "CALICHEAMICINS, A NOVEL FAMILY OF ANTITUMOR ANTIBIOTICS: TAXONOMY, FERMENTATION AND BIOLOGICAL PROPERTIES", THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, vol. 42, no. 4, 1989, pages 558 - 563 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0712313A1 (fr) * 1993-07-09 1996-05-22 Alexei Kondratyev Conjugues de medicaments pro-cytotoxiques destines a la therapie contre le cancer
EP0712313A4 (fr) * 1993-07-09 1998-10-07 Alexei Kondratyev Conjugues de medicaments pro-cytotoxiques destines a la therapie contre le cancer
WO1996009551A1 (fr) * 1994-09-19 1996-03-28 Moro Ricardo J Detection et traitement du cancer
AU714966B2 (en) * 1994-09-19 2000-01-13 Ricardo J Moro Detection and treatment of cancer
EP1956374A1 (fr) * 1994-09-19 2008-08-13 Ricardo J. Moro Détection et traitement du cancer
EP1955714A1 (fr) * 1994-09-19 2008-08-13 Ricardo J. Moro Détection et traitement du cancer
US5926113A (en) * 1995-05-05 1999-07-20 L & H Company, Inc. Automatic determination of traffic signal preemption using differential GPS
EP3659307A4 (fr) * 2017-07-28 2021-09-22 Yale University Médicaments anticancéreux et leurs procédés de fabrication et d'utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
CA2155953A1 (fr) 1994-09-01
JPH08509698A (ja) 1996-10-15
FR2701710A1 (fr) 1994-08-26
FR2701710B1 (fr) 1995-04-21
EP0684841A1 (fr) 1995-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7360377B2 (ja) アントラサイクリン誘導体を含む、結合タンパク質薬物複合体（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
EP0089880B1 (fr) Nouveaux conjugués associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations médicamenteuses utilisant lesdits conjugués
JP2020507329A (ja) 機能化赤血球系細胞
CN107198778A (zh) 用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物
JPS6069033A (ja) 免疫毒素複合体
US6403092B1 (en) Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex
JPH11505704A (ja) アンチｃｄ−１９抗体の単鎖可変領域フラグメントを含む免疫コンジュゲート
WO2021170961A1 (fr) Conjugués anticorps-médicament anti-cd56 et leur utilisation en thérapie
CA2224413C (fr) Immunovecteurs utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire
JP7069135B2 (ja) アルブミンベースのナノ医薬品を使用するための組成物及び方法
WO1994019021A1 (fr) Conjugues proteiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que medicament
JP2023532679A (ja) 抗体－薬物コンジュゲート及び抗体－サポニンコンジュゲートの組合せ
BE1001051A4 (fr) Conjugue d'immunoglobuline contenant de l'idarubicine, medicament le contenant et procede de depletion in vitro d'un sous-groupe de lymphocytes t d'une population cellulaire utilisant ce conjugue.
EP0172045B1 (fr) Glycoprotéines antitumorales, modifiées sur leurs motifs glucidiques, procédé d'obtention
EP0234151B1 (fr) Glycoprotéines modifiées par oxydation et formation de base de Schiff, inhibant les ribosomes, procédé d'obtention et immunotoxines comprenant une telle glycoprotéine
KR20150138233A (ko) 세포사멸 유도용 조성물 및 방법
EP0130132A1 (fr) Immunotoxine antitumorale, préparations pharmaceutiques la contenant et son utilisation in vitro
NO168989B (no) Fremgangsmaate for aa oeke loeseligheten av f. eks. immunokonjugatpreparater
Balneger et al. Generation of αCD11b-CpG antibody conjugates for the targeted stimulation of myeloid cells
AU754988B2 (en) Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex
EP0283329A1 (fr) Conjugués d'hydrazide d'alcaloide de vinca lie a une immunoglobuline
Kuehne Design and characterization of a membrane-active GALA-OKT9 conjugate and its effect on transferrin-gelonin immunotoxin efficacy
FR2564839A1 (fr) Conjugues associant par liaison covalente un ionophore carboxylique monovalent et une macromolecule et leur utilisation comme agents potentialisateurs des immunotoxines
FR2575160A1 (fr) Composes ionophores carboxyliques monovalents
FR2577137A1 (fr) Glycoproteines antitumorales, modifiees sur leurs motifs glucidiques

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2155953

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1994907594

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1994907594

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 1996 501064

Country of ref document: US

Date of ref document: 19960111

Kind code of ref document: A

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1994907594

Country of ref document: EP