FR2577137A1 - Glycoproteines antitumorales, modifiees sur leurs motifs glucidiques - Google Patents

Abstract

Glycoprotéines antitumorales, obtenues par oxydation de leurs motifs glucidiques par les ions periodate, utiles comme médicaments et pour préparer des immunotoxines à longue durée d'action.

Description

Glycoprotéines antitumorales, modifiées sur leurs motifs glucidiques.

La présente invention concerne de nouvelles glycoprotéines antitumorales dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate.

Plus particulièrement, mais d'une façon non limitative, la présente invention se réfère à de nouvelles glycoprotéines inactivant les ribosomes et à longue durée d'action.

Le terme "glycoprotéine inactivant les ribosomes", tel qu'utilisé dans la présente description ainsi que dans les revendications, désigne toute substance portant des motifs saccharidiques appartenant à la classe des macromolécules inactivant les ribosomes et, par conséquent, inhibant la synthèse protéique de cellules eucaryotes, ainsi que tout fragment de ladite substance possédant la même propriété inactivante, ladite glycoprotéine inactivant les ribosomes pouvant être d'origine naturelle ou biosynthétique provenant d'une cellule dont le patrimoine génétique a été modifié dans ce but, ladite glycoprotéine inactivant les ribosomes pouvant également être modifiée sur les groupes fonctionnels de ses acides aminés de façon à pouvoir être aisément couplée à un anticorps.

Dans la description, l'expression "glycoprotéine inactivant les ribosomes" sera symbolisée GPIR.

Dans la description, le terme "periodate"
# désigne l'ion 104 que l'on trouve également indiqué dans la littérature sous le nom de "métaperiodate'.

Les glycoprotéines inactivant les ribosomes (GPIR) sont notamment utiles comme intermédiaires dans la préparation d'immunotoxines, par couplage avec des anticorps.

Dans le brevet US 4 340 535 et dans les demandes de brevet français nO 81/07596 et nO 81/21836 est décrite la préparation de produits anti-cancéreux dits conjugués obtenus par couplage, par liaison covalente, de la chaîne A de ricine avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre des antigènes portés par la cellule à détruire. Les produits de ce type ont été désignés et sont désignés dans la présente demande sous le nom générique d'Immunotoxînes.

On connait aussi des conjugués analogues aux immunotoxines à chaîne A de ricine précédemment décrites, ayant aussi vocation de médicaments anticancéreux et résultant du couplage par liaison covalente d'anticorps ou fragments d'anticorps à d'autres glycoprotéines inactivant les ribosomes telles que notamment la gélonine extraite de Gelonium multiflorum (Eur. J. Biochem., 1981, 116, 447-454, Cancer Res., 1984, 44, 129-133) ou l'inhibiteur extrait de Momordica charantia (MOM) (brevet US 4 368 149).

Ces glycoprotéines inactivant les ribosomes (GPIR) qui ont des propriétés semblables à celles de la chaîne A de ricine sont des substances de poids moléculaire d'un ordre de grandeur de 20 000 et 30 000 (Cancer Survey, 1982, 1, 489-520).

On sait également que l'activité cytotoxique de ces immunotoxines peut être potentialisée par diverses substances adjuvantes telles que les sels d'ammonium, diverses amines, ou certains ionophores carboxyliques, tels que la monensine, la nigéricine.

Toutefois, les effets thérapeutiques des immunotoxines, activées ou non, ne peuvent se manifester pleinement que dans la mesure où l'immunotoxine peut, par sa partie anticorps, se localiser in vivo, sous forme active, sur la cible cellulaire à détruire (condition sine qua non à toute expression d'activité des immunotoxines). La capacité de l'immunotoxine à se localiser sur la cible dépend en tout premier lieu de l'aptitude de l'immunotoxine à demeurer dans la circulation sanguine et les fluides extra-cellulaires sous forme active pendant des temps suffisants pour qu'elle atteigne sa cible cellulaire et à des concentrations suffisamment fortes pour que le taux d'occupation des sites antigéniques correspondants soit élevé.

De nombreuses études ont permis d'établir la cinétique d'élimination plasmatique des immunotoxines après injection intraveineuse dans différents modèles animaux. I1 est apparu qu'après l'injection le taux plasmatique d'immunotoxine biologiquement active décrott très rapidement et de façon très importante. Ainsi, typiquement, chez le lapin, dans un modèle utilisant une immunotoxine construite en couplant à l'aide d'un bras à p-ont disulfure la chaîne A de ricine à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène T65 des lymphocytes T humains (anticorps Tao1), il apparaît que 97 % de l'immunotoxine présente dans le sang circulant au temps O de l'injection disparaissent en 30 min et 99,9 % en 17 h.Cette rapide disparition de l'immunotoxine est bien évidemment préjudiciable à l'expression de sa capacité cytotoxique complète, en empêchant: que l'immunotoxine ne sature de façon durable une proportion élevée des antigènesZcibles portés par les cellules à détruire. En outre, la comparaison des cinétiques d'élimination plasmatique des immunotoxines avec celles des anticorps non conjugués correspondants montre qu'à l'inverse les anticorps - comme cela est bien connu - se maintiennent dans le plasma à un haut niveau pendant des temps relativement longs. Or il existe toujours, même dans les préparations d'immunotoxines les plus purifiées, un certain taux résiduel d'anticorps non conjugués.

Par le jeu des vitesses différentielles d'élimination des immunotoxines et des anticorps, progressivement les anticorps non conjugués, initialement très minoritaires, deviennent majoritaires au bout de quelques heures et donc, progressivement, ces anticorps deviennent par compétition de puissants antagonistes pour la fixation des immunotoxines sur leurs cibles.

I1 apparaît donc clairement l'intérêt d'accroître la persistance plasmatique des immunotoxines, sous forme active, afin d'augmenter à la fois la durée et le taux d'occupation des antigènes-cibles et par conséquent d'améliorer les effets thérapeutiques des immunotoxines.

Par ailleurs, des expériences de localisation in vivo de l'immunotoxine à chaîne A de ricine, radiomarquée-puis injectée chez des animaux sans cible spécifique, ont montré que, dans les premières minutes après l'injection, le conjugué se localise préférentiellement dans le foie. Il en est de même pour la chaîne A de ricine qui présente le meme devenir lorsqu'elle est injectée sous forme non couplée. Cela suggère fortement que l'immunotoxine se fixe dans le foie par l'intermédiaire de la sous-unité cytotoxique qu'elle contient. I1 est connu que la chaîne A de ricine est une glycoprotéine dont les groupements polyosidiques comprennent notamment des résidus de mannose et de N-acétyl- glucosamine, certains résidus de mannose étant en positions terminales (Agri. Biol.Chem., 1978, 42, 501). I1 a été également établi l'existence au niveau du foie de récepteurs capables de reconnaître des glycoprotéines ayant de tels résidus de mannose terminaux. I1 a été aussi montré que les glycoprotéines reconnues par ces récepteurs - présents essentiellement sur les cellules de
Kupffer - sont rapidement éliminées de la circulation sanguine par fixation sur ces cellules qui les métabolisent. Ceci est bien documenté notamment dans le cas de la bêta-glucuronidase, ainsi que dans le cas de la ribonucléase B (Arch. Biochem. Biophys., 1978, 188, 418 ; Advances in Enzymology, Meister A. Ed., New York, 1974 ; Pediat. Res., 1977, 11, 816).

De l'ensemble de ces données, il apparaît que la rapide élimination des immunotoxines à chaîne A de ricine peut s'expliquer par la reconnaissance des résidus mannose de la chaîne
A de ricine par les cellules hépatiques et en particulier les cellules de Kupffer.

Les études de cinétique d'élimination plasmatique d'autres GPIR, par exemple la gélonine ou le MOM, après injection intraveineuse chez l'animal, ont montré que, comme dans le cas de la chaîne A de ricine, le taux plasmatique de GPIR décroît très rapidement et de façon très importante après l'injection. Ainsi typiquement chez le lapin après injection de gélonine purifiée selon la méthode décrite (J. Biol. Chem., 1980, 255, 6947-6953) il apparaît que 93 % de la gélonine présente dans le sang circulant au temps 0 de l'injection disparaissent en I h et 99,99 % en 24 h.

Il est connu que par oxydation par les ions periodate des structures osidiques, y compris celles qui sont contenues dans les glycoprotéines, on provoque la rupture de la chaîne carbonée chaque fois que deux atomes de carbone adjacents portent des hydroxyles primaires ou secondaires. Si les deux hydroxyles contigus sont secondaires, comme cela est généralement le cas dans les oses cycliques présents dans les GPIR, l'oxydation conduit deux fonctions aldéhyde sur les carbones entre lesquels la rupture a eu lieu.

On a maintenant trouvé que,lorsqulon modifie les motifs glucidiques d'une glycoprotéine antitumorale par oxydation avec les ions periodate, l'activité biologique de celle-ci reste substantiellement inchangée.

On a également trouvé, d'une façon absolument inattendue, que, si on modifie les motifs glucidiques d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes par une oxydation par les ions periodate, on obtient une nouvelle glycoprotéine inactivant les ribosomes ayant la double propriété de conserver ses activités biologiques et d'être-éliminée très lentement de la circulation sanguine in vivo.

Ces nouvelles glycoprotéines inactivant les ribosomes et à longue durée d'action sont ci-après symbolisées
GPIR-la.

On a enfin trouvé que, lorsque ces nouvelles glycoprotéines inactivant les ribosomes et å longue durée d'action sont couplées à des anticorps, les conjugués obtenus conservent les propriétés biologiques connues pour des immunotoxines et présentent une cinétique d'élimination plasmatique lente.

La présente invention a donc pour objet, à titre de produits nouveaux, des glycoprotéines antitumorales modifiées dans leur structure, dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate.

La présente invention a plus particulièrement pour objet des glycoprotéines inactivant les ribosomes, dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate, ayant la meme activité et une demi-vie plus longue que celle de la glycoprotéine non modifiée.

De façon préférentielle, l'invention a pour objet des glycoprotéines inactivant les ribosomes et å longue durée d'action, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par traitement d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de O à 150C et à l'abri de la lumière, par déblocageéventuel des groupes thiol et isolement du produit final selon des méthodes connues.

Toute glycoprotéine antitumorale peut être modifiée sur ses motifs glucidiques par action de l'ion periodate selon les méthodes connues.

Des glycoprotéines inactivant les ribosomes utilisées comme produits de départ préférentiels pour l'oxydation par les ions periodate selon l'invention sont toutes les GPIR, comme la chaîne A de ricine, qui sont par elles-mêmes très faiblement cytotoxiques car elles ne peuvent se fixer sur les cellules, mais qui, par contre, après couplage à un anticorps reconnaissant des cellules particulières, deviennent hautement cytotoxiques pour ces cellules une fois que l'anticorps a reconnu sa cible.

Les composés de départ représentatifs sont la chaîne A de ricine, la gélonine et la substance extraite de Momordica charantia (MOM), telles qu'elles sont obtenues par la voie extractive.

D'autres GPIR utiles comme produits de départ pour l'oxydation par les ions periodate sont les suivants
Dianthin 30 de Dianthus caryophyllus
Dianthin 32 de
Agrostin A de Agrostemma gitnago
Agrostin B de
Agrostin C de " "
HCI de Hura crepitans
Asparagus officinalis inhibitor de asparagus officinalis
Les metiles substances, produites par la voie biosynthétique par des cellules dont le patrimoine génétique a été modifié dans ce but, sont des composés également convenables.

Des fragments des GPIR ci-dessus, a condition que de tels fragments retiennent tout ou partie de la propriété d'inactivation des ribosomes qui caractérise la GPIR dont ils sont issus, peuvent également être utilisés comme produit de départ.

La chaîne A de ricine native, dont au moins l'un des groupements thiol est protégé, est un composé de départ préférentiel.

L'obtention de la chaîne A de la ricine pure est décrite dans le brevet US 4 340 535. La gélonine et le MOM sont également décrits.

La protection des groupes thiol des GPIR de départ est souhaitable lorsque lesdits groupes thiol sont ceux qui seront utilisés pour le couplage avec l'anticorps. Si pour le couplage oil utilise d'autres groupes fonctionnels, par exemple l'hydroxyle phénolique des tyrosines ou des groupes amines ou des groupes carboxyliques de la GPIR, la protection n'est pas effectuée.

Le blocage est effectué par réaction avec un agent susceptible de substituer les fonctions SH à l'aide d'un radical qui peut etre ensuite éliminé par réduction ou échange thiol/disulfure, par exemple l'acide dinitro-2,2 dithio > 5,5' dibenzoique (DTPàB) ou bien par l'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique ou encore par le dipyrîdyl-2,2' disulfure ou le dipyridyl-4,4' disulfure. En l'absence d'un tel traitement, les thiols libres peuvent disparaître pendant la réaction d'oxydation et dans ce cas ne peuvent être totalement régénérés , L'excès de l'agent bloquant est éliminé par dialyse ou tout autre traitement approprié.

La réaction d'oxydation periodique est effectuée à un pH acide, compris entre 3 et 7, de préférence entre 5 et 6,5. Le periodate est utilisé en excès ; plus particulièrement, la concentration en periodate alcalin est supérieure à la concentration des diols vicinaux susceptibles d'etre -oxydés : des concentrations de 10 à 50 ZZI en periodate de sodium pour des concentras tions de 1 a 10 mg/ml de sous-unité cytotoxique sont convenables,
La durée du traitement, réalisé 8 une température comprise entre O et 15"C et de préférence entre 1 et 50C et à l'obscurité, est est comprise entre 0,2 et 24 h.

La réaction est arrêtez par addition d'un réactif qui consomme le periodate restant, par exemple un excès d'éthylène-glycol et les sous-produits sont éliminés par dialyse ou par tout autre traitement approprié. Le produit obtenu à la fin de la réaction est isolé selon les techniques conventionnelles.

Si les groupes thiol dw produit de départ étaient bloqués, le déblocage est effectué selon les méthodes connues, par exemple par action d'un agent réducteur apte à libérer la fonction thiol préalablement bloquée tel que le mercapto-2 éthanol, ce qui conduit à l'obtention de la nouvelle glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action prête à être utilisée, par exemple pour le couplage avec un anticorps pour obtenir une immunotoxine.

Dans le cas de la chaîne A de ricine, la nouvelle molécule ainsi obtenue (symbolisée A-la) possède les propriétés principales suivantes - un poids moléculaire non significativement différent de celui de la chaîne A native. Ce procédé de modification ne fait apparattre de façon visible par électrophorèse en gradient de polyacrylamide des polymeres de la protéine qu'en très faible quantité et aucun produit de dégradation - un taux de groupements thiol libres supérieur a 0,7 par mole, - une immunoréactivité envers des anticorps de lapin anti-chaîne A de ricine que l'on ne peut distinguer de celle de la chaine A native, - une activité inhibitrice de la synthèse protéique dans un modèle acellulaire supérieure a SO % de celle provoquée par une égale quantité de chaîne A native, - enfin, après administration intraveineuse unique chez le lapin å une dose voisine de 0,4 mg/kg de poids corporel, le taux plasmatique de la chaîne A a longue durée d'action (A-la) au temps 23 h après l'injection est supérieur a 10 % du taux présent au temps zéro (contre 0,015 % pour la chaîne A native å ce même temps, soit un accroissement du taux plasmatique par un facteur largement supérieur 500).

De même dans le cas de la gélonine, la molécule obtenue par oxydation periodique possède les propriétés principales suivantes - un poids moléculaire non significativement différent de celui de la gélonine native, - une immunoréactivité envers les anticorps de lapin anti-gélonine que l'on ne peut distinguer de celle de la gélonine native, - enfin, après administration intraveineuse unique chez le lapin à une dose voisine de 0,3 mg/kg de poids corporel, le taux plasmatique de la gélonine modifiée, au temps 24 h après injection, est supérieur à 3 % du taux présent au temps zéro (contre 0,01 % pour la gélonine native à ce meme temps, soit un accroissement du taux plasmatique par un facteur supérieur a 200).

La préparation des conjugués ou immunotoxines a partir des glycoprotéines inactivant les ribosomes et d longue durée d'action est réalisée par n'importe quel procédé convenablement choisi dans la gamme de ceux qui sont décrits dans le brevet
US 4 340 535. Si la sous-unité cytotoxique choisie présente naturellement au moins un thiol la rendant apte au couplage, cette fonction sera préférentiellement mise en oeuvre par réaction avec l'anticorps ou fragment d'anticorps porteur d'un groupement disulfure activé. Si la sous-unité cytotoxique choisie ne possède pas naturellement de groupe thiol la rendant apte au couplage on pourra préférentiellement introduire artificiellement sur ladite sousunité au moins un groupement fonctionnel porteur d'un thiol libre, selon tout procédé connu, et poursuivre le couplage comme indiqué ci-dessus.L'introduction dudit groupement fonctionnel peut avoir lieu soit avant l'étape d'oxydation par les ions periodate mais il sera alors nécessaire que le radical thiol soit bloqué pendant l'étape d'oxydation puis débloqué après cette étape, soit après l'étape d'oxydation.

On obtient ainsi des immunotoxines modifiées qui ont acquis un caractère nouveau quant a leurs propriétés pharmacocinétiques. Plus particulièrement, par modification appropriée de la sous-unité cytotoxique on a pu ajouter aux propriétés de cytotoxicité spécifique des immunotoxines, sans qu'il leur soit porté atteinte, une nouvelle propriété tout aussi intrinsèque la capacité à manifester une lente cinétique d'élimination plasmatique.

Les exemples suivants permettent de mieux comprendre l'invention sans en limiter la portée.

Exemple 1
Cet exemple démontre, après injection intraveineuse chez l'animal, l'élimination lente de la chaîne A de ricine modifiée par le periodate de sodium.

I. Modification de la chaîne A de ricine par le periodate de sodium.

1) Blocage du SH naturel par le DTNB.

La chaîne A de ricine a été préparée et purifiée ainsi qu'il a été indiqué dans le brevet US 4 340 535. A 10 ml d'une solution de chaîne A de ricine a 5,6 mg/ml ( 0,84 groupement thiol par chaîne A) dans le tampon PBS (tampon phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7) on ajoute 20 équivalents d'une solution d'acide dinitro-2,2' dithio-5,5' dibenzoique (DTNB) soit 385 1 d'une solution 0,1 M de DTNB dans un tampon phosphate 125 mM pH 7 (cette solution est amenée à pH 7 à l'aide d'hydroxyde de sodium). On laisse l'incubation se poursuivre pendant 20 min à 200C. On dialyse ensuite la solution contre du tampon PBS à 40C, on obtient ainsi 53 mg de chaîne A bloquée sur la fonction thiol, en solution à 5 mg/ml.

2) Oxydation périodique de la chaîne A bloquée.

A 6 ml de solution a 5 mg/ml de chaine A bloquée, amenée à pH 6 à l'aide d'acide acétique 1 M, on ajoute 120 d'une solution de periodate de sodium 0,5 M dans l'eau. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 16 h a 4"C dans l'obscurité.

La réaction d'oxydation est arrêtée par addition de 620/um d'une solution aqueuse d'éthylene-glycol 1 M. Après 15 min d'incubation à 200C, le milieu réactionnel est dialysé a 40C contre du tampon
PBS. L'oxydation periodique fait apparaître un léger précipité protéique qui est éliminé par centrifugation a 10 000 x g pendant 30 min. On obtient ainsi 24 mg de chaine A bloquée et oxydée a une concentration de 3,4 mg/ml.

3) Déblocage des groupements thiol.

A 6 ml de chaine A bloquée et oxydée 9 3,4 mg/ml dans le tampon A, on ajoute comme agent réducteur du mercapto-2 éthanol a la concentration finale de 1 7. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 1 h à 200 C. On dialyse ensuite la solution contre le tampon PBS a 4 C. On obtient ainsi 19 mg de chaîne A oxydée a une concentration de 2,8 mg/ml.

En utilisant la technique au DTNB (Methods in
Enzymology, 1972, 25, 457 (Academic Press)) on détermine que la chaîne A modifiée obtenue présente 0,70 groupement thiol libre par mole. Le poids moléculaire de la chaîne A modifiée est de 30 000 +/- 3 000, déterminé par électrophorèse en gradient de polyacrylamide en présence de dodécyl-sulfate de sodium.

La préparation de chaîne A dont les motifs polysaccharidiques ont été ;ydés, obtenue précédemment, a été étudiée en ce qui concerne se activités enzymatiques d'inhibition de la synthèse protéique et es propriétés pharmacocinétiques.

II. Activité enzymatique de la chaîne A A longue durée d'action, mesurée sur un modèle acellulaire.

la propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est dlinhiber la synthèse protéique cellulaire par altération de la sous-unité ribosomale 60 S.

Le protocole in vitro utilisé comporte l'emploi de fractions subcellulaires.de foie de rat convenablement couplée mentées et capables d'incorporer la 14C-phénylalanine en présence d'un ARN messager artificiel, l'acide polyuridylique.

Le mode opératoire employé pour préparer les fractions subeellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14Cphénylalanine est une adaptation de la méthode décrite dans
Biochemica Biophysica Acta 1973, 312 608-615, mettant en oeuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépatocytes de rat. l'échantillon contenant la chaîne A est introduit sous la forme d'une solution convenablement diluée dans un tampon Tris HC1 50 ig, pH 7,6 contenant du mercapto-2 éthanol à 0,2 % et de la sérum-albumine bovine à 15 rg/ml.

A partir des données de comptage, on calcule par rapport a un milieu témoin sans inhibiteur le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 14C-phénylalanine dans les protéines par chaque milieu réactionnel contenant de la chaîne A de ricine.

L'activité inhibitrice a été déterminée. On observe une CI50 égale à 7,8.10 -9 mole/l pour la chaîne A oxydée. La CI50 de la chaîne A témoin de l'expérience est de 13.10 9 mole/l : la modification n'entraîne donc pas de perte d'activité de la chaîne A.

III. Propriétés pharmacocinétiques de la chaîne A a longue durée d'action (A-la)
La chaîne A est administrée chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité de chaîne A injectée correspond à 0,415 mg/kg. Les échantillons de sang sont prélevés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immunoradiométrique ci-après désigné par l'abréviation IRM-1.

Cette technique a l'avantage de doser la chaîne
A sans modification de celle-ci. Ce dosage est réalisé dans des plaques à microtitrations (par exemple : "NUNC-TSP screening system"
Poly Labo Block France) dont le couvercle est muni de pointes hyperabsorbantes qui plongent dans les puits du socle. Ces pointes constituent les phases solides. Des anticorps de brebis anti-chaîne A de ricine (ci-après désignés sous 11 abréviation Acl), purifiés par chromatographie d'affinité, sont absorbés sur les phases solides.

Pour cela 200 pu d'une solution d'Acl à 10 /ug/ml dans le tampon
PBS sont distribués dans les puits. Les pointes sont mises contact d'abord avec la solution d'Acl pendant 24 h å 40C puis avec du sérum de veau foetal pendant 3 h a 20"C pour saturer tous les sites de fixation. L'immunoabsorbant saturé est alors mis en contact pendant 3 h a 200C avec les échantillons plasmatiques à doser å différentes dilutions ou avec des solutions de chaîne A de concentrations connues pour l'établissement de la courbe d'etalonnage.Un lavage est effectué par un tampon PBS, puis l'immunoabsorbant est mis en contact pendant 2 h à 200C avec les anticorps de brebis anti-cbaîne A de ricine purifiés par chromatographie d'affinité et radiomarqués (ci-après désignés par l'abréviation
Ac2). Le radiomarquage de l'Ac2 est réalisé avec l'iode 125 en présence de chloramine T selon la méthode de Greenwood et Hunter (Biochem. J., 1963, 89, 114) ; l'activité spécifique des Ac2 radiomarqués est de 5 à lOjuCi/g. 106 cpm d'Ac2 radiomarqués sont introduits sous 200vil dans un tampon PBS, contenant 0,1 % de sérum-albumine bovine. Après lavage dans le tampon PBS, les pointes sont détachées et la quantité d'Ac2 lié est mesurée par comptage de la radioactivité.La mesure de la concentration en chaîne A dans les échantillons à doser se fait par référence a la courbe d'étalonnage réalisée avec la chaîne A introduite différentes concentrations connues. Lorsque de la chaîne A à longue durée d'action est injectée chez l'animal, cette même chaîne A à longue durée d'action est utilisée pour l'établissement de la courbe d'étalonnage correspondante.

Les valeurs de concentration en chaîne A dans le plasma sanguin mesuré par cette technique sont reproductibles et fiables. Le seuil de détection est de 1 ng/ml.

L'étude de la reproductibilité intra- et inter-essais donne des coefficients de variation inférieurs à 10 % pour les valeurs de concentration comprises dans la gamme de 1 a 200 ng/ml.

Les résultats de ces expériences sont représentés sous la forme de courbes présentant en abscisse le temps, exprimé en heure, et en ordonnée, sur échelle logarithmique, la concentration plasma tique du produit mesuré, rapportée en pourcent de la concentration plasmatique théorique au temps zéro. Cette valeur appelée "concentration plasmatique relative" (COR) est calculée à l'aide de l'expression suivante
Concentration mesurée au temps t CPR = - - - - x 100
quantité injectée/volume plasmatique
Le volume plasmatique est considéré égal a 36 ml/kg de poids corporel de l'animal.

La figure 1 montre la courbe d'élimination plasmatique, en fonction du temps, de la chaîne A de ricine native injectée par voie intraveineuse. Cette courbe (courbe 1) présente deux phases : dans la première phase, le produit disparaît très rapidement de la circulation puisque,trois heures après'l'injection, il ne reste plus dans le plasma que 0,1 % de la dose administrée. Dans la deuxième phase, la décroissance est plus lente.

Lorsque la chaîne A a été oxydée sur ses motifs polysaccharidiques, le profil d'élimination est profondément modifié : la première phase d'élimination - responsable de la disparition de la plus grande partie du produit - est pratiquement abolie, ce qui conduit à un accroissement considérable des taux plasmatiques de chaîne A. Vingt heures après l'injection, la con centration de la chaîne A oxydée est 600 fois supérieure à ce qu'elle est quand la chaîne A n'est pas modifiée (courbe 2).

Exemple 2
Cet exemple démontre l'importance de la durée du traitement oxydatif sur les propriétés pharmacocinétiques de la chaîne A oxydée.

Six préparations de chaîne A oxydée sont réalisées en utilisant la procédure indiquée dans l'exemple 1 excepté pour la durée du traitement au periodate de sodium. Les temps de traitement sont les suivant : zéro : (arrêt immédiat par ltéthylène-glycol), 20 min, 40 min, 2,5 h, 4 h et 18 h.

Ces différentes préparations sont injectées chez le lapin et la concentration plasmatique relative de la chaîne A est mesurée au temps 23 h selon la même procédure que dans l'exemple 1.

Les résultats sont représentés sur la figure II.

Ces résultats indiquent que 1) l'accroissement du taux plasmatique de la chaîne A est bien dd à l'oxydation periodique puisque, lorsque la réaction est immédiatement arrêtée, la concentration plasmatique de chaîne A est idéntique à celle obtenue pour la chaîne A native, 2) il est nécessaire que la durée de cette réaction soit relativement longue pour obtenir des effets optimaux.

Exemple 3
Cet exemple démontre, après injection intraveineuse chez l'animal, 1) l'élimination rapide de la gélonine native et 2) l'élimination lente de la gélonine modifiée par le periodate de sodium.

I. Modification de la gélonine par le periodate de sodium.

La gélonine a été préparée et purifiée à partir de Gelonium multiflorum selon la méthode décrite (J. Biol. Chem.

(1980), 255, 6947-6953). La réaction d'oxydation est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites pour la chaîne A de ricine dans l'exemple 1 excepté que l'étape de blocage des thiols par le
DTNB n'est pas pratiquée.

En effet, le couplage de la gélonine à l'anticorps n'étant pas généralement pratiquée a partir de groupements thiol naturels de la gêlonine, les groupements thiol seront introduits artificiellement après l'étape d'oxydation selon la technique décrite dans Cancer Res., 1984, 44, 129-133. A 1 ml de solution a 3 mg/ml de gélonine dans le tampon PBS, amenée à pH 6 à l'aide d'acide acétique 1 M, on ajoute 21 pl d'une solution de periodate de sodium 0,5 M dans l'eau. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 16 h à 40C dans l'obscurité. La réaction est arrêtée par addition de 105 l d'une solution aqueuse d'éthylène-glycol 1 iil,
Après 15 min d'incubation à 20 C, le milieu réactionnel est dialysé 40C contre du tampon PBS.On obtient ainsi après centrifugation à 10 000 x g pendant 30 min 2,9 mg de gélonine oxydée à une concen tration de 2,5 mg/ml.

Comme la chaîne A de ricîne, la propriété fonda- mentale de la gélonine est d'inhiber la synthèse protéique de cellules eucaryotes par altération de la sous-unité ribosomale 60 S (Biochem. J. (1982), 207, 505-509). Dans le cas de la gélonine aussi, la modification due à lVoxydatiofl periodique n'entraîne pas de perte d'activité.

11. Propriétés pharmacocinétiques de la gélonine à longue durée d'action.

La gélonine native ou modifiée selon les procédures développées ci-dessus est administrée chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité de gélonine injectée est comprise entre 0,3 et 0,4 mg/kg. les échantillons de sang sont prélevés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immlnoradioo métrique ci-après désigné par l'abréviation IRM 2.

Cet essai est réalisé selon la même technique que pour le test IRM 1 excepté que la solution Acl est ici une solution d'anticorps de lapin anti-gélonine purifiés par chromatographie d'affinité, les anticorps Ac2 étant les mêmes anticorps radiomarqués. La procédure de radiomarquage est identique à celle décrite pour la technique IRN 1. La mesure de la concentration en gélonine native ou gélonine modifiée dans les échantillons à doser se fait par référence à une courbe d'étalonnage réalisée avec la gélonine native ou modifiée introduite à différentes concentrations connues. L'essai IRM-2 répond aux mêmes caractéristiques de fiabilité et reproductibilité que celles décrites pour la technique IRM 1.

Les résultats de ces expérience sont représentés de la meme façon que pour la channe A de ricine dans exemple 1.

La figure 3 montre les courbes d'élimination plasmatique, en fonction du temps, de la gélonine native et de la gélonine oxydée injectées par voie intraveineuse. La gélonine native, comme la chaîne A de ricine native, disparait très rapidement de la circulation puisque 99,99 % de la gélonine présente dans le sang circulant disparaissent en 24 h (courbe 1). Lorsque la gélonine a été oxydée sur ses motifs polysaccharidiques, le profil d'élimination est profondément modifié : 24 h après l'injection la concentration de la gélonine oxydée est 300 fois supérieure a celle de la gélonine native (courbe 2).

Ainsi, comme pour la chaîne A de ricine, ces résultats prouvent que l'oxydation périodique a modifié les sucres impliqués dans le processus de reconnaissance responsable de l'élimination de la gélonine au point d'empecher cette reconnaissance.

Exemple 4
Conjugué obtenu par réaction entre un anticorps anti-cellules T humaines (anticorps dirigé contre l'antigène T65) substitué par des groupements disulfure activé et la chaîne A de ricine oxydée.

a) Anticorps anti-cellules T humaines (ou anticorps T101)
Cet anticorps a été obtenu selon la méthode décrite dans Journal of Immunology, 1980, 125 (2), 725-737.

b) Chaîne A de ricine oxydée : la chaîne A de ricine a été préparée ainsi qu'il a été indiqué dans 11 exemple 1.

Il Anticorps activés anti-cellules T humaines.

A 100 pl d'une solution a 20 mg/ml d'acide (pyridyl 2 disulfanyl)-3 propionique dans le tertiobutanol, on ajoute 20 lul d'une solution à 60,3 mg/ml d'éthyl-l (dimethylamino-3 propyl)-3 carbodiimide et on laisse 3 min température ambiante.

On ajoute 68 ,ul de la solution ainsi obtenue a 2 ml d'une solution d'anticorps 9 8,9 mg/ml dans le tampon PBS. Le mélange est agité 15 min à 300C puis dialysé contre du tampon PBS à 40C. Après dialyse, la solution protéique est centrifugée et l'on obtient ainsi .15 mg d'anticorps activé à une concentration de 7,9 mg/ml.

Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2 éthanol, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 3,8 groupements disulfure mixte activé par mole d'anticorps.

III. Préparation de l'immunotoxine à chaîne A de ricine a longue durée d'action.

A 1,5 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenue (concentration 7,9 mg/ml, soit 11,8 mg d'anticorps activés), on ajoute 2,46 ml de chaîne A modifiée a 2,87 mg/ml et on incube 20 h à 20"C. La solution est centrifugée puis purifiée par filtration sur colonne de Séphadex G100 avec mesure de la densité optique de l'effluent a 280 nm. le regroupement des fractions contenant d la fois l'anticorps et la chaîne A conduit à 15 ml de solution d'immunotoxine 9 0,7 mg/ml soit 10,5 mg. Cette solution contient 0,14 mg de chaîne A oxydée couplée à l'anticorps par ml.

Le taux de couplage moyen de cette préparation est donc de 1,2 mole de chaîne A oxydée par mole d'anticorps.

L'immunotoxine à chaîne A de ricine oxydée,
IT (A-la) T101 obtenue comme indiqué ci-dessus a été étudiée en ce qui concerne ses propriétés pharmacocinétiques et ses propriétés de cytotoxicité spécifique vis-à-vis des cellules cibles.

Exemple 5
Cet exemple démontre l'acquisition de la propriété de lente élimination plasmatique des immunotoxines à chaîne A de ricine à longue durée d'action désignées en abregé
IT (A-la).

I. Mode opératoire
Le conjugué préparé selon la procédure développée dans l'exemple 3 est administré chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité injectée correspond à 0,415 mg/kg exprimé en chaîne A. Les échantillons de sang sont prélevés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immunoradiométrique à deux sites ci-après désigné par l'abréviation IRM-3.

Cet essai est réalisé selon la même technique que pour le test IRM-1 excepté que la solution Ac2 est ici une solution d'anticorps de chèvres anti-IgG de souris purifiés par chromatographie d'affinité et radiomarqués comme décrit pour la technique IRM-1. La mesure de la concentration en immunotoxine modifiée dans les échantillons à doser se fait par référence à une courbe d'étalonnage réalisée avec l'immunotoxine modifiée introduite à différentes concentrations connues. L'essai IRM-3 répond aux mêmes caractéristiques de fiabilité et de reproductibilité que celles décrites pour la technique IRM-1.

Pour comparaison, une étude contrôle est réalisée dans les mêmes conditions avec le conjugué appelé IT-T101 obtenu par réaction entre le même anticorps T101 substitué par des groupements disulfure activé et la chaîne A native de ricine.

La préparation et les propriétés cytotoxiques de ce conjugué ont été décrites dans la demande de brevet français n" 81j21836. Les résultats de ces expériences sont représentés de la même façon que pour la chaîne A de ricine non couplée dans l'exemple 1.

II. Résultats.

La figure 4 montre les courbes d'élimination plasmatique en fonction du temps de 1'IT T101 et de 1'IT (A-la)
T101 injectées par voie intraveineuse. Vingt-quatre heures après l'injection, la concentration d'immunotoxine active est 140 fois supérieure pour 1'IT (A-la) T101 que pour 1'IT T101. Ce fait démontre que les nouvelles propriétés pharmacocinétiques de la chaîne A oxydée sont conservées après couplage à un anticorps.

Exemple 6
Cet exemple démontre le maintien des propriétés de cytotoxicité spécifique de 1'IT (A-la) T101 vis-à-vis des cellules cibles.

La propriété-biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la synthèse protéique cellulaire par altération de la sous-unité ribosomale 60S. La technique utilisée met en oeuvre un modèle cellulaire dans lequel on mesure l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture.

Les cellules utilisées appartiennent à la lignée cellulaire CEM issue d'une leucémie T humaine qui porte l'antigène T65. les cellules sont incubées en présence de la substance à étudier puis, en fin dtincubation, on procède à la mesure du taux d'incorporation de l4C-leucine par les cellules ainsi traitées.

Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la technique décrite dans Journal of Biological Chemistry 1974, 249 (11), 3557-3562 utilisant le traceur 14C-leucine pour la détermination du taux de synthèse protéique. La détermination de la.

radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration
A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisse la concentration molaire en chaîne A des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique.

On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14C-leucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI50)
La figure 5 représente les courbes obtenues dans la même expérience avec 1'IT (A-la) TlOl et la chaîne A oxydée non couplée an présence de chlorure d'ammonium 10 mM dans le milieu d'incubation. On peut constater sur cette figure que l'IT (A-la) T101 a une très forte activité cytotoxique (CI50 = 5,5 x 10 -12 M) environ 80 000 fois supérieure à celle de la chaîne A oxydée non couplée mesurée dans les mêmes conditions.

Exemple 7
Cet exemple démontre l'efficacité cytotoxique comparée de 1'IT (A-la) TlOl et de 1'IT TlOl vis-S-vis des cellules cibles CEM, mesurée dans un test clonogénique.

La vocation des immunotoxines est l'éradication des cellules cibles jusqu'd la dernière. Cette performance ne peut être évaluée qu'avec une technique d'une grande sensibilité les tests d'inhibition de formation de colonies offrent cette possibilité puisqu'une seule cellule survivante peut être visualisée parmi plusieurs millions de cellules mortes. Ceci est rendu possible par des conditions de culture optimales en milieu gélifié, appliquées a la lignée lymphoide humaine CEM.

I. Technique de mesure de la cytotoxicité par inhibition de la formation de colonies.

Le milieu utilisé pour le clonage est le milieu RPI 1640 auquel on ajoute 1 mN d'alpha-cétoglutarate de 1 mM d'oxaloacétate de sodium, 5 % de sérum de veau foetal inac tivé et 10 % de sérum de cheval inactivé. Une première solution d'agar a 0,3 % (Agarose type VII, laboratoires SIGMA) est préparée dans ce milieu, disposée en couche mince dans de petites botes de
Pétri et solidifiée a +40C. Les cellules sont mélangées à une seconde solution d'agar a 0,275 % maintenue à 37"C, déposée ensuite sur la premiere couche et solidifiée.Ces concentrations d'agar ont été choisies après une étude préliminaire visant à optimiser a la fois l'efficacité de clonage, la dimension des colonies et la consistance du milieu. Après 15-jours en incubateur, les colonies sont dénombrées à l'aide d'un compteur automatique de colonies ("ARTÉK", DYNATECH, U.S.A.). Lfétablissement d'une droite d'étalonnage où sont portés le nombre de cellules ensemencées en fonction du nombre de colonies formées est indispensable pour déterminer 1'efficacité du clonage et ainsi le nombre exact de cellules survivantes au traitement par l'immunotoxine.Nous avons vérifié que l'efficacité du clonage reflétée par cette droite étalon n'est pratiquement pas influencée par la présence d'une proportion élevée-de cellules mortes, situation naturellement rencontrée quand les cellules sont traitées par l'immunotoxine.

Le traitement à 1'immunotoxine est réalisé par incubation des cellules en phase de croissance exponentielle et à la concentration de 1o6 iml avec l'immunotoxine IT (A-la)
T101 ou IT T101 à différentes concentrations, sous un volume total de 1 ml de milieu RPMI-1640 contenant 10 % de sérum de veau foetal inactivé, et 10 mM de chlorure d'ammonium.L'incubation a lieu 370 C, sous atmosphere contenant 5 % de gaz carbonique et avec agitation horizontale des tubes tests (2 500 tours par minute avec agitateur "GIRATORY G-2", NEW-BRUNsWTCK). Les cellules sont ensuite lavées et différentes dilutions sont réalisées avant mélange à la solution d'agar, de façon que la lecture du nombre de cellules survivantes puisse être faite dans la zone de sensibilité maximale donnée par la droite étalon.Les résultats sont exprimés par le nombre absolu de cellules survivantes extrapolé à partir de l'effi- cacité de clonage, en utilisant la relation suivante
Cxd nombre absolu de cellules survivantes
E où C est le nombre de clones par boite de Pétri, d est le facteur de dilution de la préparation cellulaire examinée, et E est l'efficacité de clonage établie à partir de la pente de la droite d'étalonnage. Chaque point correspond à la moyenne de trois essais.

II. Résultats.

La figure 6 montre les courbes d'activité cytotoxique sur les cellules CEM des immunotoxines IT (A-la) T101 et
IT T101 en présence de chlorure d'ammonium à 10 mM en fonction de la concentration en immunotoxine (exprimée en molarité de chaîne
A). Il apparaît que les efficacités de ces deux produits sont du même ordre de grandeur. La cytoréduction obtenue est extrêmement importante dans les deux cas puisque pour des concentrations aussi faibles que 10 lez M le taux de cellules survivantes résiduelles est de l'ordre de 0,001 % de la valeur initiale. Cet effet est hautement spécifique puisque, a ces concentrations, il a été vérifié que la chaîne A non couplée ou une immunotoxine non spécifique sont sans effet sur ces cellules.

Cet exemple démontre que 1'IT (A-la) T101 a des propriétés de cytotoxicité spécifique pratiquement identiques à celles de 1'IT T101 conventionnelle
Exemple 8
Toxicité de la chaîne A à longue durée d'action injectée chez la souris.

I1 était important de vérifier quel était l'impact toxicologique global sur l'animal entier de la chaîne A oxydée (la toxicité des immunotoxines étant du même ordre de grandeur que celle de la chaîne A à doses molaires égales). Pour cela, nous avons déterminé la dose létale 50 % de la chaîne A oxydée, administrée par voie intraveineuse chez la souris Charles River France
CD1 en comparaison avec celle de la chaîne A native.

Les valeurs trouvées sont indiquées dans le tableau t.

Tableau 1

<tb> <SEP> Dl50 <SEP>
<tb> <SEP> (microgrammes/souris)
<tb> Chaine <SEP> A <SEP> native <SEP> 550
<tb> Chaîne <SEP> A <SEP> oxydée <SEP> 800
<tb>
Ces résultats montrent que la toxicité de la chaîne A oxydée est inférieure à celle de la chaîne A native. Ceci signifie qu'en dépit d'un accroissement considérable du taux plasmatique de la chaîne A lorsque celle-ci a été modifiée par oxydation la toxicité du produit n'est non seulement pas accrue, mais qu'au contraire elle est sensiblement diminuée.

On peut donc utiliser en tant que médicament en thérapeutique humaine les immunotoxines sous-unités cytotoxiques modifiées. Ces immunotoxines modifiées peuvent être utilisées pour le traitement des affections cancéreuses ou non dont les cellules cibles seraient reconnues par l'anticorps utilisé pour la préparation de l'immunotoxine. Les modalités optimales d'administration ainsi que la durée du traitement devront être déterminées dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affection à traiter.

D'une façon plus générale, les glycoprotéines antitumorales, dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate et qui ont une demi-vie plus longue que celle des glycoprotéines antitumorales non modifiées correspondantes, sont utiles comme médicaments.

La présente invention concerne donc, selon un aspect ultérieur, des médicaments antitumoraux, dans lesquels une glycoprotéine antitumorale dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate est conditionnée pour être utilisée par voie injectable et de préférence par voie intraveineuse.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Une glycoprotéine à action antitumorale dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate.

2. Une glycoprotéine inactivant les ribosomes, dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation parl'ion periodate, ayant substantiellement la même activité et une dezi-vie plus longue que la glycoprotéine inactivant les ribosomes non Qodi- fiée.

3. Une glycoprotéine inactivant les ribosomes et a longue durée d'action, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par traitement d'une solution aqueuse d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 24 h à la température de O à 15 C et a labri de la lumière, par déblocage éventuel des groupes thiol et par isolement du produit final selon des méthodes connues.

4. Une chaîne A de ricine à longue durée d'action1 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par traitement d'une solution aqueuse de chaîne A de ricin, dont les groupes thiol sont éventuel lement protégés, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h a la température de O à 15 C et à l'abri de la lumière, par déblocage éventuel des groupes thiol et par isolement du produit final selon des méthodes connues.

5. Une gélonine a longue durée d'action, caracrérisée,en ce qu'elle est obtenue par traitement d'une solution aqueuse de gélonine, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de O & les et a l'abri de la lumière, par déblocage éventuel des groupes thiol et par isolement du produit final selon des methodes connus.

6. Une chaîne A de ricine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir soit d'une chaîne A de ricine qui est la chaîne A de la ricine native Qu un fragment de chaîne A de ricine native,soit d'une chaîne A de ricine ou d'un fragment de celle-ci produits par voie de biosynthèse par une cellule dont le patrimoine génétique a été opportunément oditî

7.Une chaîne A de ricine selon l'une des revendications 4 et 6 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par traitement d'une solution aqueuse de chaîne A de ricin, dont au moins l'un des groupes thiol est protégé par réaction avec le dinitro-2,2' dithio-5,5' dibeazoate, avec une solution aqueuse de periodate de sodium pendant une période de temps de 0,2 à 24 h a la température d'environ 40C et à l'abri de la lumière, par traitement du mélange avec du mercapto-2 éthanol et isolement du produit ainsi obtenu selon des méthodes connues.

8. Une gélonine selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par traitement d'une solution aqueuse de gélonine avec une solution aqueuse de periodate de sodium pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température d'environ 40C et à l'abri de la lumière, par traitement du mélange avec du mercapto-2 éthanol et isolement du produit ainsi obtenu selon des méthodes connues.

9. Procédé pour la préparation d'une glycoprotéine antitumorale selon la revendication 1, caracterisé en ce qu'on soumet la glycoprotéine antitumorale non modifiée à une oxydation par les ions periodate.

10. Procédé pour la préparation d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action, caractérisé en ce que l'on traite une solution aqueuse d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de O à 150C et à l'abri de la lumière, par déblocage éventuel du groupe thiol et par isolement du produit final selon des méthodes connues.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que comme produit de départ on utilise soit une chaîne A de ricine qui est la chaîne A de ricine native ou un fragment de chaîne A de la ricine native, soit une chaîne A de ricine ou un fragment de celle-ci produits par voie de biosynthèse par une cellule dont le patrimoine génétique a été opportunément modifié.