CZ161288A3 - Immunoglobulin conjugate, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof - Google Patents
Immunoglobulin conjugate, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CZ161288A3 CZ161288A3 CS881612A CS161288A CZ161288A3 CZ 161288 A3 CZ161288 A3 CZ 161288A3 CS 881612 A CS881612 A CS 881612A CS 161288 A CS161288 A CS 161288A CZ 161288 A3 CZ161288 A3 CZ 161288A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ida
- antibody
- tumor
- fragment
- mice
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
1/
- 1 -
Tento vynález se týká imunoglobul lnového konjugátu, způsobu jeho přípravy a farmaceutlckého prostředku jej obsahujloího.
Je znám obecný koncept cílených protinádorových činidel s použitím monoktonálních protilátek (MoAbs). Jeho terapeutický význam je běžně oceňován. Tento přístup zahrnuje přípravu konjugátů protilátky a toxického činidla, schopných selektivně lokalizovat a poškozovat nádorové buňky. Hlavní pozornost je směrována ke konstrukci imunotoxlnů z A řetězce rostlinných a bakteriálních toxinú a protilátek, jejichž antigenová vazba a uložení uvnitř buňky vede ke smrti buňky. V praxi se používá mnoha MoAbs, o kterých se předpokládá, že jsou specifické pro nádory, reaktivních také se subpopulací normálních buněk. Z toho plyne, že může být nerealistické využívat takové silné toxiny kvůli jejich potenciálnímu poškozování normálních tkání. Bezpečnější alternativou než rostlinné toxiny je komplex protilátek s konvenčními protirakovinnými látkami (drogami), jako je například doxorubicin, Vindesin, Chlorambuci1, Melphalan a Methotrexát.
Vzhledem k nespecifickým toxickým účinnostem běžně používaných protinádorových činidel, byly dělány pokusy zvýšit jejich tterapeutický index zkomplexováním (kopulováním) s MoAbs na >/ nádorové antigeny.
Pokusy o potlačeni snahy vypudit (odmítnout) transplan- Γ
2 tát T buněk odvezených" ed- brzlíku často směřovaly ke snížení aktivity T buněk použitím antithymocytového globulinu. Nedávno, vzhledem k vývoji monoklonálních protilátek, bylo možné definovat podmnožinu T buněk podle jejich funkce in vitro a podle přítomnosti specifických povrchových antigenů definovaných MoAb (monoklonální protilátka). To stimulovalo výzkum mechanismu, kterým T buňky regulují odmítáni transplantátu, soustředěním se na základní rozdělení na podmnožiny pomocných (rozpoznávacích, helper) buněk/induktorů (inducer) (mobilizujících buněk) a cytotoxických/supresorových buněk, definovaných myšími antigeny L3T4· a Ly-2. Ačkoliv 0KT3 MoAb, činidlo proti všem T-buňkám, prokázala potenci in vivo, v nedávné studii bylo zjištěno, že 20 MoAb^í neměly u myší na 20 různých myších lymfocytových antigen^in vivo účinek a jsou tedy pro in vivo studie neužitečné. Je proto vhodné studovat prostředky, kterými mohou tyto vysoce specifické MoAb/ silněji a úplněji odstraňovat své cílové buňky. Jedním takovým přístupem je používáni cytotoxických látek (drog) komplexovaných s MoAb^.
Klinický potenciál konjugátů droga-^oAb zahrnuje imunochemotjiierapii rakoviny, zmírnění různých imunoregulač-ních poruch a snahy těla odmítat transplantát ze stejného druhu (alloggfrft). Mnohé studie prokázaly, že specifická cytotoxicita toxinů a drog na nádorové buňky, pokud jsou
- 3 - zkomplexovány s MoAb, vedla ke zvýšení antigenů asociovaných na nádor. Avšak méně důrazu bylo věnováno in vivo použití konjugátů droga-^oAb k vyhlazování T-buněk, k výzkumu imunore-gulaoe T buněk při snaze vypudit z těla transplantát, i když konjugáty toxin-protilátka byly intenzivně používány in vitro k vyhlazování T buněk před transplantací kostní dřeně. Důležitou skupinou protinádorových činidel, která se používají v chemoterapii rakoviny, jsou antracykliny, z nichž doxorubicin a daunořubicin jsou účinné na pevné nádory. Zkomplexováním (kopulací) daunorubieinu a doxorubicinu s protilátkami však má za výsledek podstatnou ztrátu aktivity drogy, pokud se zkomplexování provádí prostřednictvím aminové skupiny. Nedávno byl daunořubicin zkcmplexován s MoAbs atomem uhlíku C-14 za použití bromdaunorubicinu. Tyto kon-jugáty vykazují účinnost in vitro. Nemají však účinnost ve studiích in vivo iGallego a spol.; Int. J. Cancer 737 až 744 (1984·).]. Dále bylo ukázáno, že konjugáty daunorubi-cin-MoAb vykazují nespecifickou toxicitu při koncetraci vyšší než 10 ^ug/ml.
Autoři tohoto vynálezu zjistili, že ^darubicin (4—de-fj methoxy-daunorubici* který zde bude dále označován Ida) se může zkomplexovat s MoAb#' a že tyto konjugáty mají selektivní a silnou protinádorovou účinnost in vitro i in vivo. Ne-
4- specifleká toxicita konjugátů Ida-MoAb nebyla zřejmá při in vivo dávkách menSích než 8,0 ig/kg. Konjugáty Ida-MoAb ·&ιΐ větší in vitro 1 in vivo účinnost, neS konjugáty daunorub1c i n-MoAb. Předmětem tohoto vynálezu je imunoglobul lnový konjugát, obsahující antracyklin,konjugovaný s monoklonálnl protilátkou nebo s jejím fragmentem, obsahujícím alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky, který se vyznačuje tím, Se antracyklin je ldarublcin a ldarubicin je konjugován v poloze C-14 s monoklonálnl protilátkou, specifickou pro lidský nádor, nebo s jejím fragmentem. Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy 1munoglobul lnového konjugátu, který spočívá v tom, Se se a) smíchá buď monoklonálnl protilátka, specifická pro lidský nádor nebo její fragment, obsahující alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky s molárním přebytkem 14-halogen-idarublcinu, b) nechá reagovat směs při teplotě 18 aS 37° C, c) odstraní jakákoliv sraSenlna, d) odstraní nezreagované výchozí látky gelovou filtrací a e) odstraní volný ldarubicin ads^orpční chromatograf1í, nebo chromatograf1í na ionexu.
Dalším předmětem vynálezu je farmaceutický prostředek, obsahující jako účinnou sloSku imunoglobul lnový konjugát.
Ida je popsán v US patentu č. 4 077 988. Je výhodné, jestllSe se na kaSdou molekulu protilátky, nebo na kaSdou molekulu fragmentu protilátky kovalentně naváSe dvě aS osm molekul Ida, výhodněji dvě aS Šest molekul. Molekuly Ida jsou konjugovány s monoklonálnl protilátkou nebo s fragmentem monoklonálnl protilátky v poloze 14 a jsou vázány přímo.
5Τ-
Každá protilátka nebo fragment protilátky je specifický pro antigen na povrchu buněk^proti kterým je cílení Ida zamýšleno*> Například protilátka nebo fragment grotilátky může být specifický pro žádanou cílovou tkáň, jako je například lidský nádor. Příklady lidských nádorů, proti nimž může být zamýšleno cílit Ida, jsou rakoviny prsu, tračníku, plic, prostaty,. vaječníků,. brzlíku a jiné typy rakovin-, sarkomů a leukémií. Protilátka nebo fragment protilátky mohou být také specifické na zvířecí nádor. Lze použít protilátku nebo fragment protilátky,specifický na receptor lidského transferinu (TFR), který je přítomen při dělení buněk, v erythroidních prekurzorových buňkách a buňkách různých nádorů. Vhodná
anti-TFR monoklonální protilátka se. může ferinovému receptoru na buňky LiCR-LON-KMy-2 (Hmy-2).
Monoklonální protilátka nebo fragment protilátky jsou s výhodou ze stejného druhu, jako je ten, jemuž se imunoglobu- v<- linový konjugát podává. Lidská nebo myší monoklonální protilátka nebo fragment protilátky se tedy typicky používá tehdy, jestliže se konjugát má podávat lidem. Výhodné je také to, když protilátka nebo fragment protilátky je IgG třídy. Frag*. mentem protilátky může být fragment Fab, Feb' nebo F(ati50r Lze používat také IgM monomer, který lze odvodit od IgM protilátky štěpením proteolytickým enzymem.
Imunoglobulinové konjugáty se podle tohoto vynálezu připravují tak, že se. 3-éa kcnjuga-je—e-mopokloaéí&í - -p-rotildt- •feou nobo-s--je-gfa.-fragmentem.. S výhodou-ea-o-moHofeLoRálni protilátkou-nebo o joj-ím -fgagmontoa-nechá zreagovat 14-halo-vs monoklonální protilátkou nebo 3 je.lim fragmentem^ gen-Idajf Substituentěm v poloze 14 může byt atom fluoru, chlo- ru, bromu nebo jodu, s výhodou je jím však. atom bromu. 14-Brom-Ida je popsán v USA pat. δ. 4 125 607. Konjugace se tedy provede postupem, který sestává z: a) smíchání monoklonální protilátky nebo jejího fragmentu s molárním nadbytkem 14-halogen-Ida, b) zreagováním směsi při teplotě od 18 do 37 °C, c) odstraněním sraženiny, d) odstraněním nezreagovaných výchozích materiálů gelo-vou filtrací a e) odstraněním adsorbované drogy (Ida) adsorpcní chroma-tografií nebo chromátografií na ionexu. -7-
V*T
Stupeň (a) se typickým způsobem provádí v organickém rozpouštědle, které je mísitelné s vodou, jako je například Ν,Ν-dimethylformamid. Ve stupni (a) se s výhodou používá 14-halogen-Ida v 0 až 50-násobném molárním přebytku. Ve stupni (b) se reakce nechá probíhat po dobu 1 až 8 hodin. Typickou reakční teplotou je teplota místnosti.
konjugace. Jest-
používat jiných zp
Lze liže je žádoucí, etSývmezi Ida a ménoklonální protilátku nebo fragment protilátky bylxýloŽen inertní nosič nebo lin-ker, pak se nejdříve nosič nebo ri^ker připojí na atom uhlíku v poloze 14 v Ida a potdm následuje^Amtba na protilátku nebo na fragment protilátky. Také se může^j^k bylo shora uvedeno, protilátka nébo fragment protilátky vázal k Ida prostřednictvím amfnové skupiny za použití derm^ovatálíiého peptidového spaceru, dextranového nosiče, spaceru citlivého na kyselinu n£bo polyglutamové kyseliny.
Imunoglobulinové konjugáty podle vynálezu se mohou používat pro léčení lidí nebo jiných savců trpících rakovinou. Podává se terapeuticky účinné množství konjugátu. Rakovinou může být pevný nádor, ascity nebo leukemie. Lidské nádory, které lze léčit, jsou uvedeny výše. Mohou sj£>odávat dva nebo více konjugátů, při čemž monoklonální protilátka nebo fragment protilátky v každém konjugátu má jinou specifičnost. -δ-
Konjugát se může podávat injekčně. Může se podávat pa- renterálně, například intravenozně. Může se podávat místně nebo přímo do nádoru. Množství konjugátu, které se pacientovi podává, závisí na různých faktorech, jako je například druh léčeného nádoru a stav pacienta. Typicky se však podává 2 dávka od 10 do 200 mg konjugátu na m plochy těla pacienta. Konjugáty se mohou podávat s jinými chemotkerapeutickými činidly nebo s činidly, která zvyšují účinnost konjugátů, například s vasoaktivními činidly nebo s nádorovým nekro-tickým faktorem. —Tnnmnnrl nhnl i nmiá. Vr>n mnhnu prm^-ívat t.ftké pro spVoifické vyhlazování podmnožiny T lymfocytů z/populace buněk. LideKJiebo zvířatům se může podávat thejřápeuticky efektivní množství konjugátu, který obsahuje monoklonální protilátku nabo fragment ' protilátky směrované proti anti-genu buněčného povrchu prí^omnéh^na lymfocytech, které mají být vyhlazeny. Buněčná oťip^lace' se může s takovým kon-jugátem inkubovat také In vitro.
Mohou se^pdužívat kombinace konjugátů, které směřují proti dvěma^ci více antigenům buněčných povrchů, nsmfocyty, které^májí být vyhlazeny, mohou být rozpoznávacími, ih*i>re-i-nphn ny-tntoxickými T-buňkami . - 9- -yz-
podle vynálezu se může použít k prevei odmítnout transplantovanou tkán transplantátu příjemce. Ko^^ugáty se mohou používat jako imnrjersupresivni činidla. Pří jemciNU?ansplantátu se podává mííbžství konjugátu, které je efektivní prbsnrevBnci enahy^tela vypuzovat transplantát (odmítnout transplí^itát) */§ výhodou se v tomto případě vyhlazují cytotoxick^Ts^bunky. člověk nebo zvíře s rakovinou se může 1έξ±τ vyhlazováním supresorových T-buněk podáváním příslušného konjugátu. Autuimunní nemoci se mohou léčit podáváním konjugátu, kterým se vý^lazují pomocné T-bu$ky/(vyhledávací, rozpoznávací T-buňky). Va, všech ích se používají shora uvedené cesty podávání á^ahora rděné—dé-vky-podávání.
Imunoglobulinové konjugáty se formulují jako faraimceu-tické prosttředky s faxmaceuticky přijatelným nosičem, nebo ředidlem. Je možné používat jakýkoliv nosič nebo jakékoliv ředidlo. Mezi vhodné nosiče a ředidla patři fyziologický solný roztok a Ringerův roztok dextrozy.
Vynález je ilustrován následujícími příklady. Pokud jde o doprovázející výkresy, obrázky 1 až 12 se týkají příkladu 1, obrá^ý 13 fež -ab7 se týká příkladu 2 a obrázek 14 se týká příkladu 3. Příklad 1 zahrnuje pro srovnávací účely testy s anti-Ly-2.1 MoAb majícím specifičnost Ly-2.1/smodelo-vým systémem myšího nádoru z tkáně brzlumi IiT(l) 75 NS.Podrobnějii
Obrázek 1 ukazuje strukturu antracyklinových derivátů.
Obrázek 2 představuje kopulaci Ida (idarubicinu) s anti-Ly-2.1 (0,5 mg)· Je uvedena závislost počtu mo]^ Ida na mol anti-Ly-2.1 ( · ) (levá svislá osa) a množství proteinu (· ) (pravá svislá osa) jako funkce počtu nanomolů Ida v reakční směsi (vodorovná osa).
Obrázek 3 znamená titr protilátky měřený jako % rosetu tvořících buněk (svislá osa) proti zředění protilátky (.10“^) (vodorovná osa) anti-Ly-2.1 konjugátů na ITT (1)75NS E3 cílové buňky. Seriálová zředění byla dělána s roztokem 0,5 mg/ml bud anti-Ly-2.1 (a ) nebo anti-Ly-2.1 s dvěma (# ) nebo osmi ( o ) mol^ Ida na mol protilátky.
Obrázek 4 ukazuje inhibiční účinek Ida ( » ) nebo Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol^ Ida/ftiol protilátky, ( # ) na E3 buňky ve 24-hodinovém testu; jsou uvedena procenta inhibi-ce inkorporace /^H7thymidinu (svislá osa) proti koncentraci Ida (M) (vodorovná osa).
Obrázek 5 ukazuje inhibiční účinek Ida ( · ),. Ida--anti-Ly-2.1, 5 molíi Ida/mol protilátky ( # ) nebo Ida--anti-TFR, 5 mol^ Ida^ífol protilátky (o) na (ly-2+)E3 buňky v testu 30-minutové inhibice; jsou uvedena procenta inhibice inkorporace /^H/thymidinu (svislá osa) proti koncentraci Ida (M) (vodorovná osa).
Obrázek 6 ukazuje inhibiční účinek Ida-anti-Ly-2.1, 5 mol^ Ida/mol protilátky (o) a konjugátu plus anti-Ly-2.1 ( · ) na B3 cílové buňky ve 30-minutovém testu specifičnosti -x- jsou uvedena procenta inhibice inkorporace /%/thymidinu (svislá osa) proti koncentraci Ida(M) (vodorovná osa).
Obrázek 7 znamená růst E3 nádoru z tkáně brzlíku (thymfejii}) v CBF^ myších, kterým bylo podkožně podáno 2.10^ buněk. Skupinám po 10 myších byly intravenozně podány prostředky v místě označeném šipkou: PBS ( Q ), Ida ( m ), anti-Ly-2.1 ( A ), Ida-anti-TFR ( o) nebo Ida-anti-Ly-24l ( · ). Je uvedena é-t-redn-í velikost nádoru v cm (na svislé ose) proti dnům po inokulaci (vodorovná osa). Svislé čárky znamenají + standardní chybu od Střední hodnoty.
Obrázek 8 znamená křivku růstu individuálního nádoru u myší CBF^, jímjt bylo subkutánně podáno 2,0.10 E3 nádorových buněk a které byly léčeny tak, že jim byl 4. a 5. den po-dán Ida-anti-Ly-2.1 konjugát. Velikost nádoru (cm ) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa).
Obrázek 9 ukazuje růst E3 nádoru z tkáně brzlíku 6 (thymom) u CBF-^ myší, jímž bylo subkutánně podáno 3,0.10 / buněk. Skupiny po deseti myších byly léčeny intravenoaním podáním(v místě označeném šipkou): PBS ( Q ), anti-Ly-2.1 ( A ), Ida ( ® ) nebo Ida-anti-Ly-2.1 konjugátu ( · ). Střední velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa).
Obrázek 10 ukazuje růst E3 nádoru z tkáně brzlíku (thymol) u CBF^ myší, jimž bylo subkutánně podáno 3,0.10^ - Ί£-
buněk. Skupiny po deseti myších byly protinádorově léčeny podáním (v místě označeném šipkou); PBS ( P anti-Ly-2.1 ( A ),. Ida ( ) nebo Ida-anti-Ly-2.1 konjugátu ( 9 ). Střední velikost nádoru (cm ) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná o&K Obrázek 11 ukazuje růst COLO 205 lidského nádoru
/ (štěpu z jiného druhu; xenograft) u^nahych myší, kterým bylo subkutánně podáno 2.10 buněk. Skupiny po deseti myších byly léčeny intravenosním podáním (v místě označeném šipr kou): PBS (A ) , volného Ida ( φ), konjugátu Ida-250-30.6 ( # ), směsi Ida a 250-30.6 ( O) a 250-30.6 ( JL ). -Střední. velikost nádoru (cm ) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa). Svislé čárky znamenají + standardní chybu od /trední hodnoty.
Obrázek 12 ukazuje individuální křivky růstu nádoru
(štěpu z jiného druhu) u nahých myší, kterým byl (v místech označených šipkou) intravenojně podán konjugát Ida-250-30.6. Čárkovaná čárka znamená velikost nádoru u myší léčených PBS. Velikost nádoru (cm2) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa). idarubicinu -(Ida·)— s a^i-LlTÍ^i^l^Snig) · J^ivedena gávislost počtu inkorporo-vaných molů Ida nan!&lvanti-L3T4 (# ) (levá svislá osa) a množství proteinu ( · ) (práVéksvislá osa) jako funkce počtu nannmnlA—Ida v rpnVftrvf qttižri—(.VQjrior&3 isa).
-X -x-
Obrázek 14 ukazuje titr protilátky měřený jako/^-řo-\ / setu tvořících buněk (svislá osa) proti zředění protilátky
(.10*1) (Vodorovná osa) kon^ugátů anti-Thy-1 na/lTT(1)75NS E3 cílové buňky. Seriálová zředění byla dělána/s roztokem \ / 1,0 mg/ml bu3[ anti-Thy-1-( ♦ ) nebo konjugáxu s jedním. ( o ), čtyřmi\ 9 ) nebo sedmi ( -O ) moly/Ida/dnol anti-Thy-1.
Obrázek 15 ul^azuje účinek aplikaeíe Ida-MoAb a MoAb na počet L3T4' a Lýy2+ buněk ve sle/lně u myší léčených Ida-anti-L3T4 ( anti-L3T4 ), Ida-anti-Ly-2.1 ( ·->♦) , anti-Ly-2.1 ( A) nejbo neléčených (D* Q) myší; % rosetu tvoříc ích\bun|k (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů (Vodorovná osa).
Obrázek 16 ukazuje' účinek léčení kombinovaným Ida-MoAb konjugátem na přežití' P388D1 nádoru transplantátu (přes H-2 a bez H-2 diferencí) u CBA m\ší.. Skupinám 10 až 15 myší se subkutánně podá 8,,0.10^ nádorových buněk P388D1, načež se jim. podá je/na z následujících složek (v místě Šipky): i) PBS ( Φ )/ ii) anti-L3T4 a anti-Ly\2.1 ( o ), iii) Ida- -anti-L3Ty(· ), iv) Ida-anti-Ly-2.1 (V ) a v) Ida-anti-L3T4 \ 2 a Ida-an/ti-Ly-2.1 ( A )♦ Střední velikost nádoru (cm ) (svisla osa) je uvedena v závislosti na po\tu dnů po in-okulbci nádoru (vodorovná osa). Svislé čárkj\znamenají ♦ /standardní odchylku od střední hodnoty. -3*.-
Obřá^ek 17 ukazuje účinek konjugátu Ida-anti-Thy na přežití P38OT3ssriádorového transplantátu u CBA myš^r^ákupi- nám po deseti myšíbh^se subkutánnl injekcíj>cdá 1,0.10' P388D1 nádorových buněk^jačež se jpa<(v místě šipky) intra- véno sně podá jedna z následu*£fcc^n látek; i) PBS ( P ), i i) anfci-Thy-1 ( 9 )^κΊΓϋ) Ida-aidl4-Thy-l ( Jl ). 2
Střední v.eliko§Jt^nádoru (cm ) (svislé osěrk je ujedena v závislo^t±"na počtu dnů po inokulacl nádoru (vb^orovná osa)· měna jí-.i.-standardní uhýbu od 5tPednfr<Q<fano ty. « +
Obrázek ukazuje růst COLO 205 (30.6 , 17.1 ) trans
plantátu z různého druhu (xenograft) u'nahých myší* kterým é bylo injekčně podáno 3.10 buněk na myš. Skupiny po deseti myších byly léčeny intraperitoneálním podáním (v místě označeném šipkou) PBS ( D ), 17.1-Ida ( o ), 30.6-Ida ( Δ ) nebo směsi 30.6-Ida a 17.1-Ida ( # ). Střední velikost 2 hodnoty. Celková nádoru (cm ) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa). Syislé čárky zna-měnají + standardní odchylku odZstředňí hc dávka byla 200 ^ug.
AU
Obrázek $$ ukazuje růst transplantátu (xeijograftu) LIM2210 lidského nádoru tra^čníku u němých myší, jimž byl implantován fragment nádoru (1 až 5 miligramů). Skupiny po deseti myších byly léčeny intraveno£ním podáním (v místě označeném šipkou) PBS ( D ), 17.1-Ida ( A ), JGT-13-Ida ( * ), 27<1-Ida ( · ) a 30.6-Ida ( o ). -Střsdní velikost nádoru (cm ) (svislá osa) je uvedena v závislosti na počtu dnů po inokulaci nádoru (vodorovná osa)· Svislé čárky znamenají + střední chybu od Celková dávka byla 80 yug. Příklad 1
Materiály a způsoby práce Nádorové buňky
Buněčné linie sledované v této studii zahrnují (Ly-2+) myší nádor z tkáně brzlíku (thymeáj) ITT(l) 75NS E3 variantu (E3) ^Smith a spol.: J. Nati. Cancer Inst. 76, 503 až 510 (1986)·_7> (ly-2“, TFR”) lymfom EL4 /Eorowitz a spol·:
Science 160. 533 až 535 (1968)./, (TFR+) lidskou buněčnou linii CEM /Foley a spol·: Cancer 18, 522 až 529 (1965)«7 a ~ £Semple et al.,""čancer Bes. 197.8 38· '1345-1255) (250-30*6 ) lidskou buněčnou linii COLO 205^·Butiky byly uchovávány in vitro v mediu DME (Dulbecco's Modified Eagle's medium) nebo v mediu EPMI 1640 (Flow Laboratories, Sydney, Austrálie), doplněném 10% teplem inaktivova-ným telecím (z nově narozených telat) šerem (Flow), 2 mM glutaminu (Commonwealth Sérum Laboratories, Sydney, Austrálie), 100 ug/ml střep torny činu (Glaxo, Kelbourn, Austrálie) a 100 m.j./ml penicilinu (Commonwealth Sérum Laboratories). v E3 nádor se uchovává in vivo šerifovým pasážováním -1S--X-
ÍAfo (C57BL/6xBALB/c) F1 myších (CBF·^ myši). Buňky z^kapaliny a-eedrfců se promyjí a centrifugují (400 G x 5 minut) dvakrát ve fosforečnanovém pufru (PBS), pH = 7,3, resuspendují se v PBS a subkutánní injekcí (s.c.) se podají do abdominální (břišní) stěn^yší. Před použitím se z nich vyvinou hmatatelné nádory. Myši se pak podrobí sériím intravenokních (i.v.) nebo intranádorových léčení (i.t·). Velikost nádorů se měří denně posuvným měřítkem* Měří se podél kolmých os nádoru. Získaná data se zaznamenají - znamenají střední velikost nádoru (což je výsledek ze dvou průměrů + střední chyba).
Myši
Pro práci se používali CBA a (C57BL/6KBALB/c)myši hele (CBF1 myši) a nahé- myši (nu/nu), které byly získány z Department of Pathology, University of Melbourne. V každém pokusu byly používány pokusné skupiny s 8 až 10 jedinci, všechny stejného pohlaví a stáří.
Monoklonální protilátky
Jako monoklonální protilátky byly používány (MoAb^S): i) Anti-Ly-2.1 (IgGl) reaktivní s myší Ly.,2.1 specificitou ^flogarth a spol.: Immunology 135 až 144 (1982).7, ii) A3C6 (anti-TFR) /IgGl) reaktivní s lidským transferinovým receptorem (TFR) /Panaccio a spol.: Immunology and Cell 65. 461 až 472 (1987) ·7 a iii) protilátka označená 250-30.6, reaktivní na antigen t přítomný v lidských karcinomových buňkách tračníku.
vysráženlm 40% ,ýzou stejným puf- síran rem. Tyto surové preparáty se budf absorbují na Protein-A-Sepharose (Pharmacia lne., Piscataway, New Jersey), intenzivně se promyjí PBS (pH 7,3) a eluují se 0,2M glycinem/HCl (pH 2,8) nebo se nechají projít kolonou Affigel blue (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney), Po neutralizaci se monoklonální protilátky dialyzují proti PBS, rozdělí se '''v na jednotlivé podíly a skladují se při teplotě -70 °C. A3C6 se získávají imunizací CBA myší intraperitoneálně v týdenních intervalech po dobu 3 týdnů 2.10^ LiCR-LON-HMy-2(HMy-2) buněk (0KT9+V*), odstraněním slezin třetí den po poslední injekci a spojením s P3-NSI-AG4-1(NS-1) buňkami. Příprava a stanovení konjugátů
Neporušený anti-Ly-2.1, anti-TFR MoAb nebo 250-30.6 (1 až 2 miligramy na mililitr v boritanovém pufru, pH = 8,0) se smíchá s molárníra nadbytkem (1 až 50) 14-brom-4-demethoxydaunorubicinu (Br-Ida), který je rozpuštěn v N,N-dimethylformamidu (10 mg/ml). Reakce se udržuje 4 hodiny za teploty místnosti. Sraženina se odstraní odstřelováním - 47- - )>β<- (400G, po dobu 5 minut). Volný Br-Ida a další nezreagované výchozí materiály se odstraní gelovou filtrací chromatogra- fií na koloně Sephadexu G-25 (PD-10, Pharmacia). Konjugáty se pak nechají projít kolonou s náplní Porapak Q (Milli- pore), aby se odstranila adsorbovaná droga /Rlederwieser a spol.: J. Chromatogr. 215 až 223 (1971).7· Množství
Ida, která je zahrnuta v konjugátech droga-MoAb, se stanovuje 3 -1 -1 absorpční spektrofotometrií při 483 mm (E^g = 3,4.10 M cm ) a odhadem proteinů /Bradford: Anal. Biochim 22, 248 až 253 (1972).7.
Aktivita protilátky
Pro stanovení účinnosti protilátky Ida-MoAb konjugétů a srovnání s volnou MoAb (která byla podrobena stejným postupům, které se používají při konjugaci) se používá test rosety s ovčím anti-myším imunoglobulinem (SAMG) ,/Paris a McKenzie: J. Immunol. Methods 2Q, 173 až 183 (1978).7.
Aktivita drog
Pro stanovení účinnosti drogy se používají následující testy: a) Test 24-hodinové inhibice: 100yul buněk (2 až 5· .loVml) še dá na mikrotitrovací destičku s plochým dnem a inkubuje se jednu hodinu při teplotě 37 °C. Volný ,íderubi-cin (Ida) (rozpuštěný v PBS) a Ida-MoAb konjugáty se asepticky zfiltrují# Připraví se jejich roztoky ve sterilním PBS· K buňkám se přidá 50/ul volného Ida nebo konjugátu* Každý vzorek se zopakuje ve dvou jamkách· Do kontrolních ja-
mek se přidá 50 ^ul PBS a buňky se kultivují při teplotě 37 °C při 7 % C02 24- hodin· b) Test 50-minutové inhibices Do sterilních Eppendor-
se resuspendují ve sterilní droze nebo konjugátu a vše se smíchá a míchá třicet minut při 37 °C· Buňky se pak odstřelují (4-00 pět minut) a resuspendují v růstovém mediu# Odebírají se lOOul podíly, které se nanesou na mikrotitro- vaci destičku· Vzorky se inkubují 16 až 24- hodin# Každý vzorek se testuje duplicitně, tj# současně ve 2 jamkách· Po inkubační době (u obou těchto testů) se přidá
(specifická aktivita 5 Ci/mmol, Amersham). Destičky se inku- buji dvě až čtyři hodiny# Buňky se isolují, vysuší, jed- notlivé vzory se oddělí a spočítají se na β-scintilaČním
hibice ve vztahu k procentům kontroly# Standardní chyba pro kterýkoliv bod byla stanovována na základě duplicitního měřeni# Tato chyba pro kterýkoliv experimentální bod nepřevyšovala pět procent.
Toxic ita
Skupinám po deseti až dvaceti CBA myších byly jednou
intravenozní injekcí podávány různé dávky Ida nebo Ida-anti--Iy-2.1. Zaznamenává se přežiti myši proti dávce drogy, která se podá (v mg/kg)· Orgány těchto myši se odstraní a zjisti se jejich hmotnost· Potom se fixuji formalinem a obarvi se hematoxylinem a eosinem. Výsledky· Příprava a charakterizace konjugátů
Br-Ida (obrázek 1) se kovalentně zkomlexuje (zkopuluje) s několika monoklonálnimi protilátkami (Moábfc) * proti lidskému TFR, proti antigenu přítomnému na lidských buňkách rakoviny tračníku (protilátka 250-30.6) a proti myšímu Ly-2 alloantigenu. Re akční podmínky pro konjugaci se stanoví tak, že se mění molárni nadbytek Br-Ida přidávaný k MoAb^. Udělá se tak kompromis mezi vyšší inkorporací Ida a nižším výtěžkem proteinu, Ida-anti-Ly-2·1 (obrázek 2), Ida-anti-TPR a Ida--250-30,6 (data nejsou uvedena) inkorporovaly 3 až 5 molekul Ida s výtěžkem proteinu větším než 50 %\ reakce Br-Ida 8 MoAbfc může poskytovat dva typy vazeb (obr, 1C a ID), Pro zjištění toho, který typ Je přítomen, se konjugáty vystav! po dobu 48 hodin působeni pH 4,5 nebo pH 9»0. Uvolněná volná droga se absorbuje do řorapaku Q a vzorky se spektrofoto-metricky vyhodnotí. Působením báze se uvolní 50 % vázané drogy (pH 9,0), zatímco při pH 4,5 nebyla zřejmá žádná ztráta. Z toho lze usuzovat, že alespoň 50 % drogy Je vázáno esterovou vazbou (obrázek ID), Jelikož esterová vazba Je citlivá -20-
na bazické prostředí, zatímco aminová vazba je za těchto podmínek stálá·
Aktivita protilátky
Titry protilátky před a po konjugaci byly měřeny me-y^dou rosety a byly stanovovány jako zředěni, při kterém 50 % cílových buněk vykazuje rosety· Ida-anti-Ly-2.1 konjugáty, kberé obsahuji 2 a 8 molekul Ida, mají titry protilátky na E3 buňky 1 í 56 000 a 1 : 33 000, zatímco titr nekonjugované protilátky je 1 s 80 000 (obrázek 3)·
Ida-250-30,6 konjugáty, které obsahují 2 a 6 molekul Ida, ma_ - * ' K* · jí titry protilátky na buňky COLO 205 1 * 16 000 a 1 s 11 000, zatímco titry nekonjugované protilátky jsou 1 : 33 000·
To znamená, že konjugačním postupem došlo k jistým zlotám aktivity protilátky· Konjugáty, které obsahují méně než šest molekul Ida na molekulu MoAb, byly použity pro studie in vitro a in vivo. KPoznamenejme-ž, že rozpustnost a ucinfc-nost protilátky Ida-anti-Ly-2,1 konjugátů podstatně poklesla pod tyto hladiny inkorporace pa (data nejsou uvedena)· Maximální počet molekul, které mohou být užitečně iíkor-pórovány, se liší podle individuální protilátky.
Aktivita in vitro ^flždarubicinu a konjugátů. ^darubicin-MoAb
In vitro cytotoxicita Ida a dvou Ida-MoAb konjugátů myší ITT(1)75NS E3 buněčné linie (Ly-2+ΤΙΊθ a lidské CEM
I
Y - 24- -X- buněčné linie (Ly-2"TFR+) byla měřena testem 24-hodinové inhibine. Byly stanoveny hodnoty H>50 (50% inhibice inkor-porace /3H/-thymidinu vzhledem ke kontrole}. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4 a v tabulce 1. Holota pro Ida je v oblasti ljO až 2ř0 ·10 7 M pro obě testované buněčné linie (obrázek 4, tabulka 1). Hodnota ID^0 pro Ida-anti-Ly--2.1 na E3 byla čtyřikrát větší (obrázek 4) a pro Ida-anti--TFR na CEM 1 až 2krát větší než byly tyto hodnoty pro volný Ida (Tabulka 1). Volný Ida je tedy toxičtější jak na E3 tak na CEM než Ida-anti-L^ .1 a Ida-anti-TFR. Tyto Ida-MoAb konjugáty však znamenají destinésobně nižší toxicitu než nereaktivní buněčné linie (tabulka 1). To znamená, že jejich cytotoxické působení je specifické a je důsledkem retence jejich protilátkové aktivity (obrázek 3).
Tabulka 1 Účinek konjugátů ý[d a r ub icin-monoklonální protilátka na nádojjvé buňky^ nádoryé buně čná linie ------- —-...... — — -------— ' střední hodnoty ID^ stanovené pro Ida Ida-anti-Ly-2,1 Ida-anti-TFR E3 1,2.10 4,3.10"v 2,3.10"c (5)2 (3) (2) CEM 2,2.10"7 2,0.10"6 3,0.10“7 (5) (2) (3) -.2.2- -χ- ^ ID^q znamená 50% inhibici inkorporace /“^H-thymidinu7 vzhledem ke kontrole 2 počet testovaných prostředků
Konjugáty Ida-250-30.6 byly nepatrně méně účinné než volný Ida· Volný Idg měl ID^q 6·10”® M, konjugát měl hodnotu IDjjq 3»5.10”^ M (na cílovou buněčnou linii COLO 205)·
Aby se zjistilo, zda cytotoxický účinek konjugátů na cílové buňky je selektivní, byly Ida-anti-Ly-2.1 a Ida--anti-TFR po dobu třiceti minut inkubovány s E3 (Ly-2 ) buňkami (před tím, než byl nenavázaný konjugát vymyt a než byla měřena cytotoxicita)♦ Konjugát Ida-anti-Ly-2.1 měl hodnotu ID^q 6,2.10“^ M, volného Ida byl 5,2.10”^ M (obrázek 5)· Naproti tomu nereaktivní konjugát Ida-anti-TFR měl IDjjq 5,0*10”^ M, tj. desetkrát větší než voLný Ida. To znamená, že vazebná aktivita na protilátku konjugátu Ida-anti-Ly-2.1 vede k jeho selektivní toxicitě. Podobně se (před promytím a před testem cytotoxicity) inkubuje konjugát Ida-250-30.6 a volná dtoga a to po dobu třiceti minut s buněčnými liniemi COLO 205 (250-30.6 +ve) a E3 (250-30.6 -ve). Obě buněčné linie vykazovaly podobnou odpově# na volnou drogu, tj. 9,2.10”^ pro COLO 205 a 9,8. .10 M pro E3. Avšak konjugát Ida-250-30.6 byl čtyřnásobně toxičtější na buněčnou linii C010 205 než na protilátku nereaktivní buněčné linie E3. Podobné výsledky byly získány pro buněčnou linii GEM a Ida-anti-Ly-2.1 jako nereaktivní kontrolu (data neuvedena)· Abychom si byli jisti, že cyto-toxicita Ida-MoAb konjugátů je specifická na cílové buňky a vyskytuje se na místě vazby antigenu, provedli jsme st- uu. inhibice cytotoxicity konjugátu s použitím volné MoAb· Při koncentraci Ida 4·,0.10"^ M (2yUg anti-Ly-2.1) byla cy-totoxicita konjugátu anti-I»^2.1 na buňky E3 po přidáni 50yUg (250yug/ml) anti-Ly-2.1 snížena o 70 % (obrázek 6)·
To znamená, že cytotoxicita konjugátu Ida-anti-Ly-2.1 je přímo svázána s jeho schopností vázat protilátku. Podobné kontrolní výsledky byly získány s 250-30.6. Je třeba poznamenat, že anti-Ly-2.1, anti-TPR a 250.30*6 byly ve všech testech netoxické (data nejsou uvedena).
Aplikace myšího thymomu (nádoru z tkáně brzlíku) ITT(1)75NS E3 in^číš* Při stanovování inhibice růstu pevných nádorů byly skupiny CBP^ myší (10 myší ve skupině), jimž bylo do břišní g dutiny subkutánně (s.c.) naočkováno 2,0.10 buněk E3, léčeny intravenosními (i.v.) injekcemi jednou z následujících látek* i) PBS, ii) anti-Ly-2.1, iii) Ida, iv) Ida-anti-TFR nebo v) Ida-anti-Ly-2.1. Myším bylo podáno 20 ^ig Ida a/nebo 1200yug anti-Ly-2.1 čtvrtý a pátý den po naočkování nádoru (velikost nádoru 0,1 cm^)· — 2-h --X- Během 24 hodin po prvá aplikaci byla ^tř-edn-i velikost nádoru u myáí, jimž byl podán Ida-anti-Ly-2.1, 20 % ve srovnání se pt£ední velikosti nádoru u myší, jimž byl podán PBS (tj. došlo k 80% poklesu hmotnosti nádoru) (obrázek7*· sedají) * Je zřejmé, že anti-Ly-2.1 samotný a Idajkovalentně vázaný na nespecifickou anti-TFR MoAB,neovlivňuje růst nádoru E3* Nádory myší, které obdržely samotný Ida, byly sníženy až na 50 %. Avšak tři z těchto myáí zemřely a další měly o 25 % sníženou tělesnou hmotnost. Křivky růstu nádorů jednotlivých myší, kterým byl podán Ida-anti-Ly-2.1, vykazují během doby léčení u 9 z 10 regresi nádoru (obrázek 8). U 5 z 10 nádorů došlo k úplné regresi a tyto nádory se neobjevily po dobu delší než 200 dnů. Ty nádory, které pokračovaly v růstu po ukončení léčení (5 z 10), rostly pomaleji než nádory u myší, který byly podány PBS a Ida-anti-TFR.
Další pokus byl proveden proto, aby bylo možno zjistit i.v. léčení větších nádorů za použití Ida-anti-Ly-2.1. Skupinám g CBF-^ myší (deset myší v každé skupihě) se naočkuje 3,0.10 buněk E3. Myším se pak podá 15yug Ida a 900yug anti-Ly-2.1 šestý den (velikost nádoru = 0,2 cm2) a sedmý den po naoč-kování nádoru (obr. 9). -Střední velikost nádoru u myší, které byly léčeny Ida-anti-Ly-2.1, byla 50 % ve srovnání s myšími, které byly léčeny PBS, a 66 % ve srovnání s myš^pai, které byly léčeny Ida (sedmý den). Tent^ trend pokračoval až do ukončení studií (osmnáctý den). Křivky růstu jednotlivých -25- nádorů deseti CBP^ myší, které obdržely Ida-anti-Ly-2.1, ukázaly, že došlo ke 4 případům regrese a k 1 úplnému odstranění hmoty nádoru (po dobu delší než 200 dnů; data nejsou uvedena). Ida-anti-Ly-2.1 byl tedy účinný proti véU kým nádorům. Protinádorová účinnost Ida v obou pokusech byla značně lepší, pokud Ida byl zkomplexován s anti-Ly-2«l · MoAb. Léčení nádoru lidského tračníku COLO 205 in vitro Účinnost konjugátu Ida-anti-250-30.6 byla stanovována holých. u tiaeýeh myší (nu/nu), které nesly transplantáty (z jiného druhuj xenografty) COLO 205· g
Podkožní injekcí 2.10° buněk do břišní stěny se během čtyř dnů získá hmatatelná hrudka o velikosti přibližně 2 / 0,1 cm . Skupiny po 10 myších se pak léčí intravenoaními injekcemi jedné z následujících látek: i) PBS, ii^. 250-30.6, iii) Ida plus 250-30.6 (nekonjugovaný), iv) Ida, v) konju- gát Ida-250-30.6. Celkově bylo podáno 275^ug Ida v se*riích pěti intravenoaních injekcí čtvrtý, pátý, šestý, desátý a dvanáctý den po naočkování nádoru.
Ve skupinách myší, které byly léčeny podáváním PBS nebo nekonjugovaného 250-30.6, nebyl pozorován terapeutický efekt. Při podání samotného Ida přežily 2 z 10 myší, avšak ve skupině, které byl podán nekonjugovaný Ida plus -Μ- -χ- 250-30.6, byly všechny myši mrtvé během 7 dnů, když před tím vykazovaly symptomy otravy, jako je například ztráta hmotnosti. U myší, kterým, byl podán konjugát Ida-250-30.6, bylo pozorováno značné snížení velikosti nádoru. Tyto výsledky jsou ilustrovány na obrázku 11. Křivky růstu nádorů jednotlivých myší (obrázek 12) ukázaly, že 5 z 10 myší mělo nádory, u nichž po sedmi dnech byla pozorována regrese.
Tyto nádory pak pokračovaly v růstu, při^čemž 2 z 10 myší zůstaly bez nádorů. Tyto myši nevykazovaly žádné účinky toxicity.
Protinádorová léčení
Protinádorová terapie je užitečnou technikou imuno- tjíerapie nádorů zvířat a lidí. Byly ptcto provedeny studie, které by charakterizovaly protinádorovou účinnost konjugá- tů Ida-anti-Ly-2.1 při přímém podávání do pevného nádoru E3. Skupinám po deseti CBF^ myších se spon^Žnně implantuje 3,0.10^ buněk E3. Pátý den po naočkování nádoru se vyvi- 2 nou nádory o velikosti 0,1 až 0,2 cm · Léčení sestává ze dvou injekcí, které se podávají pátý a šestý den po implantaci nádoru. Při léčení se myším podávají následující látky: 1) PBS, 2) Ida, 3) Anti-Ly-2.1 nebo 4) Ida-anti-Ly-2.1 (celkem Ida = 30 ug). Největší protinádorovou účinnost vykazoval Ida-anti-Ly-2.1. Volný Ida a anti-Ly-2.1 neovlivňovaly růst nádoru, pokud byly podávány přímo do nádoru. - 27- -X-
Myši, které byly léčeny podáváním Ida-anti-Ly-2.1, měly střední velikost nádoru 60 % ve srovnání s myšmi, které byly léšeny podáváním PBS (osmý den) a 30 % ve srovnání s myšmi, kterým byl podáván PBS (13. den) (obrázek 10). Křivky růstu nádorů (data nejsou uvedena) jednotlivých myší, které byly léčeny podáváním Ida-anti-Ly-2.1, ukazují, že v jednom případě došlo k úplné regresi, zatímco u zbývajících myší došlo ke zpožděné redukci růstu nádoru třetí den po ukončení léčení.
Toxicita
Pokusy stanovení toxicity byly prováděny na skupinách deseti CBA myší (Ly 2.1+), kterým byly podávány po jediné injekci různých dávek bu$ Ida, Ida-anti-Ly-2.1 nebo Ida--anti-TFR. Všechny myši, kterým byl injekčně podán Ida, vykazovaly ztráty hmotnosti až na 25 % původní hmotnosti. Žádná ztráta hmotnosti však nebyla pozorována u myší, které byly léčeny jakýmkoliv Ida-MoAb konjugétem. V tabulce 2 jsou uvedeny toxicity Ida a konjugátů Ida-MoAb jako hodnoty LD^q a LD^q. Jak áe vidět z tabulky, hodnota LD^q Pro Ida-anti-Ly-2.1 je 10,0 mgAg (Ida), pro volný Ida pouze 0,75 mgAg. Hodnota LD10 pro konjugát Ida-anti-TFR je 8,0 mgAg. Konjugáty Ida-MoAb nebyly testovány na hodnotu LD50· Tyto výsledky demonstrují větší tAerapeutický index konjugátů Ida-MoAb ve srovnánífvolným Ida. -Z&-
Tabulka 2
Účinek konjugátů Idasubicin-monoklonální protilátka na myši CBA
Ida (mgAg) LD-, . 10 “50 Ida 0,75 3,00 Ida-anti-Ly-2.1 10,00 N.T. Ida-anti-TFR 15,00 N.T. N.T.znamená netestováno.
Histopatologické výsledky
Akutní účinek: Intraveno£ní podávání volného Ida (1,0 mgAg) vedlo k atrofii bílé dřeně sleziny 15 dnů po podávání a k jisté hypertrofii vláken srdečního svalu (data nejsou uvedena). Naproti tomu jednotlivá dávka Ida-anti--Ly-2.1 (2,4 mgAg) nezpůsobila jakoukoliv nespecifickou tkáňovou toxicitu po 15 a po 30 dnech, i když 15· den lze pozorovat jisté bobtnání hepatocytů.
Materiály a způsekypráce Myši ^---- hnnrn- V tomto příkladu se používá jí (^BA/2xgALB/c) F-j_ a CBA avšérr—které hyl.y„získány 7, Depňrt.mpnt. nf Patholn -ff- -x- Nádctrový transplantát u myší, jimž byl podán PBS, přežil 15 dnuN^amotný anti-Thy-1 HoAb udržel přežíváni nádorového transplantátu, po dobu 28 až 32 dnů s maximální jrtředni velikostí nádoru 0,5Bscmc (šestý den) (obrázek/*?). U myší, jimž byl podán Ida-anti-Tliý^l, 30 % nádoro^řých transplantátů bylo úplně vypuzeno čtyřicátý čtej^, zatjíúíco zbývajících 70 % pokračovalo v růstu, eventuálnŠ^TS^· den) umožnilo, že se střední velikost nádoru této^eíupiny zvýšila. Ida-anti-Thy-1, podobně jako kombi^aúe Ida-anti-Ly-2.1 axí4a-anti-L3T4, je tedy schopný vyhladit Ly-2*r a 1304^ buňky, tak&e většina z P388D1 náborových transplantátů přežívá u myší CBi^aniž aniž se objevila normálně rychlá odpověú těla spočívající bnitnutí transplantátu» Přiklad * l
Konjugáty se připravuji podle postupu, popsaného v přikladu 1 £ída a monoklonálni protilátka 17·1 (Thompson a spol.: Proč. Nati. Oancer Int. 22» 4-°9 až 419 (1983)·)! výši IgG2aJ a Ida a monoklonálni protilátka 30.β IThompson a spol.»
Brit. J. Cancer 42, 595 až 6Ο5 (1983), myší IgG2b] . Buňky
Colo 205 karcinomu lidského tr3)£níku (30.6+, 17·1+) se sub- hoUm ’ 6 kutánně naočkují nahým myším v dávce 8.10 buněk na myš. apflnnhnm, který -jo -popoá»·-v-přikladu A Naočkované myši se pak podrobí sériím, intraperitoneálních léčení. Velikost nádorů se měří posuvným měřítkem, měří se podle navzájem - 30- kín/uutfÝiAúi kolmých os* Data se uvádějí jako střední velikost nádoru (což je produkt dvou změřených průměrů. + standardní chyba). Výsledky jsou uvedeny na obrázku tUt, 43. Příklad #,3
Konjugáty se připravuji podle postupu,popsaného v příkladu 1 {ida a monoklonální protilátka 17.1» Ida a monoklo-nální protilátka JGT-13 (myší IgGly^ reaktivní s karcinoem-bryonnlm antigenem na karcinom tra^čníku, ale nikoliv s normálními tkáněmi^, Ida a monoklonální protiláka 27.1 (myši IgGl, reaktivní s antigenem mléčné tukové globule na početných nádorech tra^čníku) a Ida a monoklonální protilátka 30. 6). Transplantát (z jiného druhu, tj. xenograft) nádoru lidského trajfeníku LIM2210 (1 až 5 mg) se subkutánně implantuje h&^ff^ším. Tyto implantované myši se pak podrobí sériím intravenojgních léčení. Velikost nádorů se měří posuvným měřítkem, měří se podle navzájem kolmých os. Data se uvádějí jako/stár^řvelikost nádoru (což je produkt dvou změřených průměrů + standardní chyba). Výsledky jsou uvedeny na obrázku <4.
Claims (10)
- -J4- ->sz- PATENTOVÉ NÁROKY 1. Iaunoglobulinový konjugát, obsahující antracyklin konjugovany s monoklonální protilátkou nebo s jejím fragmente·, obsahujícím alespoň jedno antigenová vazebné místo protilátky, ve kterém je antracyklinem idarubicin a idarubicin je konjugován v poloze C-14 s monoklonální protilátkou, specifickou pro lidsky nádor, nebo s jejím fragmentem.
- 2. Imunoglobul lnový konjugát podle nároku 1, kde 2 až δ molekul idarubiclnu je kovalentně vázáno ke každé moÍ«;.&.!i: proti látky.
- 3. Imunoglobul inovy konjugát podle nároku 1 nebo 2, kde monoklonální protilátka nebo její fragment jsou specifické pro receptor lidského transferinu.
- 4. Imunoglobul inovy konjugát podle nároku 1 nebo 2, kde monoklonální protilátka nebo její fragment jsou specifické pro lidsky nádor prsu, tračníku, plic, prostaty nebo vaječníků.
- 5. Způsob přípravy imunoglobul lnového konugátu podle nároku 1, vyznačující se tím , Se se a) smíchá buď monoklonální protilátka, specifická pro lidsky nádor nebo její fragment, obsahující alespoň jedno antigenové vazebné místo protilátky, s molárnlm nadbytkem 14-halogen-idarubiclnu, b) nechá reagovat směs při teplotě 18 až 37^* C, c) odstraní jakákoliv sraženina, d) odstraní nezreagované výchozí látky gelovou filtrací a e) odstraní volny idarubicin adsorpčni chromatografií nebo chromatografi i na lonexu.-32-
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj lei se t í , Se se jako aonoklonální protilátka nebo její fragment pouSije aonoklonální protilátka nebo její fragaent, specifický pro receptor lidského transferinu.
- 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se ti a, Se aonoklonální protilátka nebo její fragaent jsou specifické pro lidský nádor prsu, tračníku, plic, prostaty nebo vaječníků.
- 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 aS 7, vyznačující se tía , Se se jako 14-halogen-idarubicin pouSije 14-broa-idarubicin.
- 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5aS8, vyznačující se tía , Se se stupeň b) provádí při teplotě aístnosti.
- 10. Faraaceutický prostředek k léčení lidských nádorů, obsahující faraaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo, vyznačující se tía , Se dále obsahuje iaunoglobul lnový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 aS 4 jako účinnou sloSku.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI080387 | 1987-03-11 | ||
| AUPI295587 | 1987-07-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ161288A3 true CZ161288A3 (en) | 1996-07-17 |
| CZ281193B6 CZ281193B6 (cs) | 1996-07-17 |
Family
ID=25643244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS881612A CZ281193B6 (cs) | 1987-03-11 | 1988-03-11 | Imunoglobulinový konjugát a způsob jeho přípravy a farmaceutický přípravek, který jej obsahuje |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5798097A (cs) |
| JP (1) | JP2736255B2 (cs) |
| KR (1) | KR0130906B1 (cs) |
| CN (1) | CN1045621C (cs) |
| AT (1) | AT395375B (cs) |
| AU (1) | AU622105B2 (cs) |
| BE (1) | BE1001051A4 (cs) |
| CA (1) | CA1329156C (cs) |
| CH (1) | CH678815A5 (cs) |
| CZ (1) | CZ281193B6 (cs) |
| DE (1) | DE3808166C2 (cs) |
| DK (1) | DK173792B1 (cs) |
| ES (1) | ES2006109A6 (cs) |
| FI (1) | FI98706C (cs) |
| FR (1) | FR2612074B1 (cs) |
| GB (1) | GB2203154B (cs) |
| GR (1) | GR1000059B (cs) |
| HU (1) | HU205266B (cs) |
| IE (1) | IE64781B1 (cs) |
| IL (1) | IL85688A0 (cs) |
| IT (1) | IT8819746A0 (cs) |
| MY (1) | MY103231A (cs) |
| NL (1) | NL8800610A (cs) |
| NO (1) | NO178954C (cs) |
| NZ (1) | NZ223834A (cs) |
| PT (1) | PT86960B (cs) |
| RU (1) | RU2106147C1 (cs) |
| SE (1) | SE503402C2 (cs) |
| YU (1) | YU46858B (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6824777B1 (en) | 1992-10-09 | 2004-11-30 | Licentia Ltd. | Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| EP1353952B1 (en) | 1994-11-14 | 2007-04-11 | Ludwig Institute For Cancer Research | Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy |
| WO2000021560A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Flt4 (VEGFR-3) AS A TARGET FOR TUMOR IMAGING AND ANTI-TUMOR THERAPY |
| EP1343531A2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-09-17 | McGILL UNIVERSITY | Conjugates of antibodies and anticancer drugs |
| CA2522700A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Cytovia, Inc. | Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays |
| GB0511266D0 (en) * | 2005-06-02 | 2005-07-13 | Trust | Chemical compounds |
| US20080108138A1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-05-08 | Vermette Patrick | Bioactive compositions and their use in cell patterning |
| KR102099462B1 (ko) | 2010-11-30 | 2020-04-10 | 제넨테크, 인크. | 저친화도 혈액-뇌 장벽 수용체 항체 및 그의 용도 |
| CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT346838B (de) * | 1975-01-22 | 1978-11-27 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| AT343811B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven anthracyclinonen |
| GB1500421A (en) * | 1975-01-22 | 1978-02-08 | Farmaceutici Italia | Optically active anthracyclinones |
| AT343812B (de) * | 1975-01-22 | 1978-06-26 | Farmaceutici Italia | Verfahren zur herstellung von neuen optisch aktiven daunosaminylderivaten von anthracyclinonen |
| GB1511680A (en) | 1975-11-18 | 1978-05-24 | Farmaceutici Italia | Daunosaminyl anthracyclinones |
| GB1541436A (en) * | 1976-02-02 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| US4950738A (en) * | 1984-09-13 | 1990-08-21 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibiotics |
| US5162512A (en) * | 1982-03-09 | 1992-11-10 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibodies |
| US4867973A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-19 | Cytogen Corporation | Antibody-therapeutic agent conjugates |
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
| US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| GB8413464D0 (en) * | 1984-05-25 | 1984-07-04 | Erba Farmitalia | Anthracycline-anionic polymer conjugates |
| JPS61155334A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Teijin Ltd | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
| FR2584293B1 (fr) * | 1985-07-04 | 1989-03-17 | Ire Celltarg Sa | Anticorps utiles comme agents de pilotage et conjugues les incorporant |
-
1988
- 1988-03-10 MY MYPI88000250A patent/MY103231A/en unknown
- 1988-03-10 ES ES8800719A patent/ES2006109A6/es not_active Expired
- 1988-03-10 BE BE8800268A patent/BE1001051A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 NZ NZ223834A patent/NZ223834A/xx unknown
- 1988-03-10 JP JP63055074A patent/JP2736255B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 AU AU12881/88A patent/AU622105B2/en not_active Expired
- 1988-03-10 CA CA000561042A patent/CA1329156C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 IL IL85688A patent/IL85688A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 IE IE70188A patent/IE64781B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 HU HU881160A patent/HU205266B/hu unknown
- 1988-03-10 YU YU48288A patent/YU46858B/sh unknown
- 1988-03-10 KR KR1019880002464A patent/KR0130906B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 SE SE8800886A patent/SE503402C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 GR GR880100148A patent/GR1000059B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 DE DE3808166A patent/DE3808166C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 FI FI881158A patent/FI98706C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 IT IT8819746A patent/IT8819746A0/it unknown
- 1988-03-11 NL NL8800610A patent/NL8800610A/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CH CH936/88A patent/CH678815A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 NO NO881105A patent/NO178954C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 CZ CS881612A patent/CZ281193B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 FR FR888803233A patent/FR2612074B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 PT PT86960A patent/PT86960B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 GB GB8805865A patent/GB2203154B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 CN CN88101810A patent/CN1045621C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-11 DK DK198801315A patent/DK173792B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 AT AT0067488A patent/AT395375B/de not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-15 RU SU5052164A patent/RU2106147C1/ru active
-
1995
- 1995-04-11 US US08/420,712 patent/US5798097A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0354729B1 (en) | Cytotoxic drug conjugates | |
| ES2909746T3 (es) | Dosificaciones de inmunoconjugados de anticuerpos y SN-38 para una eficacia mejorada y una toxicidad disminuida | |
| AU2019282767A1 (en) | Camptothecin conjugates | |
| US4485093A (en) | Immunotoxin conjugate which comprises arsanilic acid, useful for treating malignant tumors, particularly pancreatic cancer | |
| JPS6330289B2 (cs) | ||
| CN109069664A (zh) | 抗cd74抗体偶联物，包含抗cd74抗体偶联物的组合物以及抗cd74抗体偶联物的使用方法 | |
| JP2002544173A (ja) | 抗ｃｄ２２抗体を用いたｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法 | |
| US20200207859A1 (en) | Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma | |
| JPH10511989A (ja) | 特異的結合ペア構成要素の細胞調節性複合体 | |
| US5830473A (en) | Antibodies against T cells as therapeutics | |
| CZ161288A3 (en) | Immunoglobulin conjugate, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof | |
| US5144012A (en) | Cytotoxic drug conjugates | |
| EP0250486A1 (en) | Melphalan derivatives | |
| EP0476408A1 (en) | Chemical conjugation of morpholino anthracyclines to antibodies | |
| US5151266A (en) | Use of anionic detergents with conjugates of monoclonal or polyclonal antibodies | |
| Arnon | Antibodies and dextran as anti-tumour drug carriers | |
| JP2022500454A (ja) | 抗葉酸受容体抗体コンジュゲートによる併用療法 | |
| RU2009500C1 (ru) | Способ получения цитотоксического коньюгата | |
| Arnon | Novel Application for Antibodies | |
| Mottram et al. | New anti-CD3 agents for transplantation tolerance | |
| JPH0611714B2 (ja) | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 | |
| JPH0611713B2 (ja) | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 | |
| JPH0653682B2 (ja) | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20080311 |