ES2909746T3 - Dosificaciones de inmunoconjugados de anticuerpos y SN-38 para una eficacia mejorada y una toxicidad disminuida - Google Patents

Dosificaciones de inmunoconjugados de anticuerpos y SN-38 para una eficacia mejorada y una toxicidad disminuida Download PDF

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Abstract

Un inmunoconjugado que comprende SN-38 conjugado con un anticuerpo humanizado, en donde hay un conector CL2A entre el SN-38 y el anticuerpo, el anticuerpo humanizado es hRS7 (anti-TROP-2), se unen de 5 a 7 moléculas de SN-38 a cada molécula de anticuerpo y en donde la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38 **(Ver fórmula)** para su uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar el inmunoconjugado a un sujeto humano con cáncer; en donde el anticuerpo se une a EGP-1 (TROP-2); y en donde el inmunoconjugado se administra a una dosis de entre 8 mg/kg y 10 mg/kg.

Description

DESCRIPCIÓN
Dosificaciones de inmunoconjugados de anticuerpos y SN-38 para una eficacia mejorada y una toxicidad disminuida
CAMPO
La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. La divulgación de la presente se refiere al uso terapéutico de inmunoconjugados de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos y camptotecinas con capacidad mejorada para dirigirse a varias células cancerosas en sujetos humanos. Los anticuerpos y las fracciones terapéuticas se enlazan a través de un enlace intracelularmente escindible que aumenta la eficacia terapéutica. Los inmunoconjugados se administran a dosificaciones específicas y, opcionalmente, en programas de administración específicos que optimizan el efecto terapéutico. Las dosificaciones y los programas de administración optimizados de anticuerpos conjugados con SN-38 para uso terapéutico humano divulgados en la presente muestran una eficacia superior inesperada que no podría haberse previsto a partir de estudios en modelos animales, permitiendo el tratamiento eficaz de cánceres que son resistentes a las terapías anticancerígenas estándar, incluyendo el compuesto original, irinotecán (CPT-11).
ANTECEDENTES
Durante muchos años, el objetivo de los científicos en el campo de la terapia farmacológica específicamente dirigida ha sido usar anticuerpos monoclonales (MAbs) para la administración específica de agentes tóxicos a los cánceres humanos. Se han desarrollado conjugados de MAbs asociados a tumores y agentes tóxicos adecuados, pero han tenido un éxito mixto en la terapia del cáncer en humanos y prácticamente ninguna aplicación en otras enfermedades, como enfermedades infecciosas y autoinmunes. El agente tóxico suele ser un fármaco quimioterapéutico, aunque también se han conjugado radionucleidos emisores de partículas, o toxinas bacterianas o vegetales, con MAbs, especialmente para la terapia del cáncer (Sharkey y Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006 Julio-Agosto; 56(4):226-243) y, más recientemente, con radioinmunoconjugados para la terapia preclínica de ciertas enfermedades infecciosas (Dadachova y Casadevall, QJ Nucl Med Mol Imaging 2006;50(3):193-204).
Las ventajas de usar conjugados de MAb-fármaco quimioterapéutico son que (a) el propio fármaco quimioterapéutico está estructuralmente bien definido; (b) el fármaco quimioterapéutico se une a la proteína del MAb usando químicas de conjugación muy bien definidas, a menudo en sitios específicos alejados de las regiones de unión al antígeno de los MAb; (c) los conjugados de MAb-fármaco quimioterapéutico pueden elaborarse de manera más reproducible y habitualmente, con menos inmunogenicidad que los conjugados químicos que implican MAb y toxinas bacterianas o vegetales y, como tales, son más susceptibles de desarrollo comercial y aprobación reguladora; y (d) los conjugados MAb-fármaco quimioterapéutico son de órdenes de magnitud menos tóxicos sistémicamente que los conjugados de MAb con radionúclido, particularmente para la médula ósea sensible a la radiación.
La camptotecina (CPT) y sus derivados son una clase de potentes agentes antitumorales. El irinotecán (también denominado CPT-11) y el topotecan son análogos de CPT que son agentes terapéuticos contra el cáncer aprobados (Iyer y Ratain, Cancer Chemother. Phamacol. 42: S31-S43 (1998)). Los CPT actúan inhibiendo la enzima topoisomerasa I estabilizando el complejo topoisomerasa I-ADN (Liu, et al. en The Camptothecins: Unfolding Their Anticancer Potential, Liehr J.G., Giovanella, B.C. y Verschraegen (eds), NY Acad Sci., NY 922:1 -10 (2000)). Los CPT presentan problemas específicos en la preparación de conjugados. Un problema es la insolubilidad de la mayoría de los derivados de CPT en tampones acuosos. En segundo lugar, los CPT proporcionan desafíos específicos para la modificación estructural para conjugar macromoléculas. Por ejemplo, el propio CPT contiene solo un grupo hidroxilo terciario en el anillo-E. El grupo funcional hidroxilo en el caso de c Pt debe acoplarse a un conector adecuado para la posterior conjugación de proteínas; y en derivados de CPT potentes, como SN-38, el metabolito activo del agente quimioterapéutico CPT-11, y otros derivados que contienen hidroxilo C-10, como topotecán y 10-hidroxi-CPT, la presencia de un hidroxilo fenólico en la posición C-10 complica la derivatización de C-20-hidroxilo necesaria. En tercer lugar, la labilidad en condiciones fisiológicas de la fracción de 6-lactona del anillo E de las camptotecinas da como resultado una potencia antitumoral muy reducida. Por lo tanto, el protocolo de conjugación se realiza de tal manera que se lleve a cabo a un pH de 7 o inferior para evitar la apertura del anillo de lactona. Sin embargo, la conjugación de un CPT bifuncional que posea un grupo reactivo de amina como un éster activo típicamente requeriría un pH de 8 o mayor. En cuarto lugar, preferiblemente se incorpora una fracción escindible intracelularmente en el conector/espaciador que conecta los CPT y los anticuerpos u otras fracciones de unión.
Hay una necesidad de métodos más eficaces para preparar y administrar conjugados de anticuerpo-CPT, como conjugados de anticuerpo-SN-38. Preferiblemente, los métodos comprenden programas de dosificación y administración optimizados que maximicen la eficacia y minimicen la toxicidad de los conjugados de anticuerpo-CPT para uso terapéutico en pacientes humanos.
Cardillo et al., "Humanized Anti-Trop-2 IgG-SN-38 Conjugate for Effective Treatment of Diverse Epithelial Cancers: Preclinical Studies in Human Cáncer Xenograft Models and Monkeys", Clin Cáncer Res. 2011; 17(10); 3157-69, evalúa la eficacia de un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) SN-38-anti-Top-2 contra varios tipos de tumores sólidos y evalúa su tolerabilidad en ratones y monos.
SUMARIO
Como se usa en la presente, la abreviatura "CPT" puede referirse a camptotecina o cualquiera de sus derivados, como SN-38, a menos que se indique expresamente lo contrario. La presente invención resuelve una necesidad insatisfecha en la técnica proporcionando métodos y composiciones mejorados para preparar y administrar inmunoconjugados de CPT-anticuerpo. La camptotecina es SN-38. Los métodos y composiciones divulgados son útiles para el tratamiento de una variedad de enfermedades y afecciones que son refractarias o menos sensibles a otras formas de terapia, y pueden incluir enfermedades contra las cuales pueden desarrollarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno adecuados para el direccionamiento selectivo, o están disponibles o son conocidos. Las enfermedades o afecciones que pueden tratarse con los inmunoconjugados en cuestión incluyen, por ejemplo, cáncer o enfermedades provocadas por organismos infecciosos.
La fracción de direccionamiento es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser de varios isotipos, preferiblemente IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, más preferiblemente comprende secuencias de región constante y bisagra de IgG1 humana. El anticuerpo está humanizado (regiones marco e hipervariables (CDR) murinas humanas).
En la presente invención, el anticuerpo es hRS7 y la fracción quimioterapéutica es SN-38.
El inmunoconjugado para el uso de la invención es hRS7-SN-38.
La invención se refiere al inmunoconjugado y las composiciones para su uso en el tratamiento de un cáncer incluyendo, pero no limitados a, linfomas no Hodgkin, leucemias linfoides agudas y crónicas de células B, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, linfoma agudo de células B grandes, leucemia de células pilosas, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas y leucemias de células T, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, carcinomas, melanomas, sarcomas, gliomas, cáncer de huesos y de piel. Los carcinomas pueden incluir carcinomas de la cavidad oral, esófago, tracto gastrointestinal, tracto pulmonar, pulmón, estómago, colon, mama, ovario, próstata, útero, endometrio, cuello uterino, vejiga urinaria, páncreas, hueso, cerebro, tejido conectivo, hígado, vesícula biliar, vejiga urinaria, riñón, piel, sistema nervioso central y testículos.
En ciertas realizaciones, los conjugados de fármacos pueden usarse en combinación con cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia con anticuerpos desnudos, radioinmunoterapia, inmunomoduladores, vacunas y similares. Estas terapias de combinación pueden permitir que se administren dosis más bajas de cada agente terapéutico en tales combinaciones, reduciendo por tanto ciertos efectos secundarios graves y reduciendo potencialmente los ciclos de terapia necesarios. Cuando la toxicidad superpuesta es nula o mínima, también pueden administrarse dosis completas de cada uno.
La dosificación óptima de inmunoconjugados y composiciones incluye una dosificación de entre 8 mg/kg y 10 mg/kg, preferiblemente administrada semanalmente, dos veces por semana o cada dos semanas. El programa de dosificación óptimo puede incluir ciclos de tratamiento de dos semanas consecutivas de terapia seguidas de una, dos, tres o cuatro semanas de descanso, o semanas alternas de terapia y descanso, o una semana de terapia seguida de dos, tres o cuatro semanas de descanso., o tres semanas de terapia seguidas de una, dos, tres o cuatro semanas de descanso, o cuatro semanas de terapia seguidas de una, dos, tres o cuatro semanas de descanso, o cinco semanas de terapia seguidas de una, dos, tres, cuatro o cinco semanas de descanso, o administración una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes. El tratamiento puede extenderse durante cualquier número de ciclos, preferiblemente por lo menos 2, por lo menos 4, por lo menos 6, por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14 o por lo menos 16 ciclos. La persona con conocimientos ordinarios se dará cuenta de que pueden considerarse una variedad de factores, como la edad, la salud general, la función o el peso de órganos específicos, así como los efectos de la terapia previa en sistemas de órganos específicos (por ejemplo, médula ósea) al seleccionar una dosificación óptima de inmunoconjugado, y que la dosificación y/o la frecuencia de administración pueden aumentarse o disminuirse durante el curso de la terapia. La dosificación puede repetirse según sea necesario, y se observa evidencia de encogimiento del tumor después de tan solo 4 a 8 dosis. Las dosificaciones y los programas de administración optimizados divulgados en la presente muestran una eficacia superior inesperada y una toxicidad reducida en sujetos humanos, lo que no podría haberse previsto a partir de estudios en modelos animales. Sorprendentemente, la eficacia superior permite el tratamiento de tumores que se había descubierto con anterioridad que eran resistentes a una o más terapias anticancerígenas estándar, incluyendo el compuesto original, CPT-11, del que se deriva in vivo SN-38.
El uso en el tratamiento del cáncer puede incluir el uso de CT y/o PET/CT, o MRI, para medir la respuesta del tumor a intervalos regulares. También pueden monitorizarse los niveles en sangre de marcadores tumorales, como CEA (antígeno carcinoembrionario), CA19-9, AFP, CA 15.3 o PSA. Las dosificaciones y/o los programas de administración pueden ajustarse según sea necesario, de acuerdo con los resultados de imagenología y/o los niveles sanguíneos de los marcadores.
Un resultado sorprendente con los inmunoconjugados y las composiciones para su uso es la tolerabilidad inesperada de altas dosis de conjugado de anticuerpo-fármaco, incluso con infusiones repetidas, observándose toxicidades de grado relativamente bajo de náuseas y vómitos, o neutropenia manejable. Otro resultado sorprendente adicional es la falta de acumulación del conjugado anticuerpo-fármaco, a diferencia de otros productos que han conjugado SN-38 con albúmina, PEG u otros portadores. La falta de acumulación se asocia con una tolerabilidad mejorada y ausencia de toxicidad grave incluso después de dosificaciones repetidas o aumentadas. Estos resultados sorprendentes permiten la optimización de la dosificación y el programa de administración, con eficacias inesperadamente altas y toxicidades bajas. Los inmunoconjugados y composiciones reivindicados para su uso proporcionan la reducción de tumores sólidos, en individuos con cánceres previamente resistentes, del 15% o más, preferiblemente del 20% o más, preferiblemente del 30% o más, más preferiblemente del 40% o más en tamaño (medido por el diámetro más largo). El experto en la técnica se dará cuenta de que el tamaño del tumor puede medirse mediante una variedad de técnicas diferentes, como el volumen total del tumor, el tamaño máximo del tumor en cualquier dimensión o una combinación de mediciones de tamaño en varias dimensiones. Esto puede ser con procedimientos radiológicos estándar, como tomografía computarizada, ultrasonografía y/o tomografía por emisión de positrones. Los medios para medir el tamaño son menos importantes que observar una tendencia de disminución del tamaño del tumor con el tratamiento con inmunoconjugados, que preferiblemente da como resultado la eliminación del tumor.
Mientras que el inmunoconjugado o la composición para su uso pueden administrarse como una inyección en bolo periódica, en realizaciones alternativas el inmunoconjugado o la composición pueden administrarse mediante infusión continua de conjugados de anticuerpo-fármaco. Para aumentar la Cmax y extender la PK del inmunoconjugado en la sangre, puede administrarse una infusión continua, por ejemplo, mediante un catéter permanente. Tales dispositivos son conocidos en la técnica, como los catéteres HICKMAN®, BROVIAC® o PORT-A-CATH® (ver, por ejemplo, Skolnik et al., Ther Drug Monit 32:741-48, 2010) y puede usarse cualquier catéter permanente conocido. También se conocen en la técnica una variedad de bombas de infusión continua y puede usarse cualquiera de tales bombas de infusión conocidas. En la divulgación, el intervalo de dosificación para infusión continua puede estar entre 0,1 y 3,0 mg/kg por día. Estos inmunoconjugados o composiciones para el uso pueden administrarse mediante infusiones intravenosas durante períodos relativamente cortos de 2 a 5 horas, más preferiblemente de 2 a 3 horas.
Los inmunoconjugados y los programas de dosificación de la divulgación pueden ser eficaces en pacientes resistentes a las terapias estándar. Por ejemplo, puede administrarse un inmunoconjugado hMN-14-SN-38 a un paciente que no ha respondido a una terapia anterior con irinotecán, el agente original de SN-38. Sorprendentemente, el paciente resistente al irinotecán puede mostrar una respuesta parcial o incluso completa a hMN-14-SN-38. La capacidad del inmunoconjugado de dirigirse específicamente al tejido tumoral puede superar la resistencia tumoral mediante el direccionamiento mejorado y la administración potenciada del agente terapéutico. Otros inmunoconjugados de anticuerpo-SN-38 pueden mostrar una eficacia mejorada similar y/o una menor toxicidad, en comparación con tratamientos terapéuticos estándar alternativos y combinaciones de diferentes inmunoconjugados de SN-38, o los conjugados de SN-38-anticuerpo en combinación con un anticuerpo conjugado con un radionúclido, toxina u otro fármaco, pueden proporcionar una eficacia aún mayor y/o una toxicidad reducida. Un sujeto preferido específico puede ser un paciente con cáncer de colon metastásico, un paciente con cáncer de mama triple negativo, un paciente con cáncer de mama HER+, ER+, progesterona+, un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico (NSCLC), un paciente con cáncer de páncreas metastásico, un paciente con carcinoma de células renales metastásico, un paciente con cáncer gástrico metastásico, un paciente con cáncer de próstata metastásico o un paciente con cáncer de pulmón de células pequeñas metastásico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Terapia in vivo de ratones desnudos atímicos, portadores de carcinoma pancreático humano Capan 1, con conjugados MAb-CL2A-SN-38.
FIG. 2. Terapia in vivo de ratones desnudos atímicos, portadores de carcinoma pancreático humano BxPC3, con conjugados MAb-CL2A-SN-38.
FIG. 3. Terapia in vivo de ratones desnudos atímicos, portadores de carcinoma de colon humano LS174T, con conjugado hMN-14-CL2A-SN-38.
FIG. 4. Curvas de supervivencia de ratones tratados con hMN14-CL-SN-38 que portan enfermedad metastásica pulmonar GW-39.
FIG. 5. Eficacia terapéutica de hRS7-SN-38 ADC en varios modelos de enfermedad de xenoinjerto de tumor sólido. Se estudió la eficacia del tratamiento con ADC de hRS7-CL2-SN-38 y hRS7-CL2A-SN-38 en ratones portadores de xenoinjertos humanos de tumor de pulmón de células no pequeñas, colorrectal, pancreático y pulmonar de células escamosas. Todos los ADC y controles se administraron en las cantidades indicadas (expresadas como cantidad de SN-38 por dosis; flechas largas = inyecciones de conjugado, flechas cortas = inyecciones de irinotecán). (A) Se inyectó a ratones tumores Calu-3 (N = 5-7) con hRS7-CL2-SN-38 cada 4 días para un total de 4 inyecciones (q4dx4). (B) Se inyecto a ratones portadores de tumores COLO 205 (N= 5) (q4dx8) con ADC o cada 2 días para un total de 5 inyecciones (q2dx5) con MTD de irinotecán. Se trataron ratones portadores de tumores (C) Capan-1 (N = 10) o (D) BxPC-3 (N = 10) dos veces por semana durante 4 semanas con los agentes indicados. (E) Además del a Dc administrado dos veces por semana durante 4 semanas, los ratones portadores de tumores SK-MES-1 (N = 8) recibieron la MTD de CPT-11 (q2dx5).
FIG. 6. Eficacia comparativa de los conjugados de epratuzumab (Emab)-SN-38 y veltuzumab (Vmab)-SN-38 en el modelo de Ramos subcutáneo. A ratones desnudos (N = 10 por grupo) con tumores que promediaban aproximadamente 0,35 cm3 (0,20-0,55 cm3) se les administraron 0,25 o 0,5 mg de cada conjugado dos veces por semana durante 4 semanas.
FIG. 7. Especificidad del conjugado de Emab anti-CD22-SN-38 (línea continua) frente a un conjugado irrelevante de labetuzumab (Lmab)-SN-38 (línea discontinua) en ratones desnudos con tumores de Ramos subcutáneos. A los animales se les administraron dosis de los conjugados dos veces a la semana por vía intraperitoneal durante 4 semanas. A, B y C recibieron 75, 125 y 250 pg de cada conjugado por dosis (54,5, 91 y 182 pg/kg de SN-38, respectivamente, en base a un peso medio de 22 g). Supervivencia basada en el tiempo hasta la progresión (TTP) a 3,0 cm3, con tumores que comienzan en un tamaño medio de 0,4 cm3. En cada panel se muestran los valores de p que comparan la supervivencia mediana (mostrada) para el conjugado Emab-SN-38 con Lmab-SN-38. C, curvas de supervivencia (gris sólido) para otro grupo de animales a lo que se les administraron inyecciones intraperitoneales semanales de irinotecán (6,5 pg/dosis; equivalentes de SN-38 aproximadamente igual a la dosis de 250 pg del conjugado Emab-SN-38).
FIG. 8. Historial de tratamiento previo del paciente, antes de administrar IMMU-130 (labetuzumab-NS-38). El tratamiento previo incluyó colectomía/hepatectomía (lóbulo parcial) por CRC en estadio IV, terapia de ablación por radiofrecuencia de metástasis hepáticas, resección en cuña de metástasis pulmonares y quimioterapia con irinotecán/oxaliplatino, Folfirinox, Folfirinox bevacizumab, bevacizumab 5-FU/leucovorina, FolFiri, Folfiri cetuximab y cetuximab solo. El paciente recibió dosis de 16 mg/kg de IMMU-132 por infusión IV lenta cada dos semanas para un total de 17 dosis de tratamiento.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
En la descripción que sigue, se usan una serie de términos y se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la materia reivindicada. Los términos que no están expresamente definidos en la presente se usan de acuerdo con sus significados simples y ordinarios.
A menos que se especifique lo contrario, un o uno significa "uno o más".
El término aproximadamente se usa aquí para significar más o menos el diez por ciento (10%) de un valor. Por ejemplo, "aproximadamente 100" se refiere a cualquier número entre 90 y 110.
Un anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada por procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una porción de unión a antígeno de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede conjugarse o derivatizarse de otro modo dentro del alcance de la materia reivindicada. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (y subformas de IgG4), así como isotipos de IgA. Como se usa a continuación, la abreviatura "MAb" puede usarse indistintamente para referirse a un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticuerpo monoclonal o anticuerpo multiespecífico.
Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo como F(ab')2 , F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), anticuerpos de dominio único (DAB o VHH) y similares, incluyendo las medias moléculas de IgG4 citadas anteriormente (van der Neut Kolfschoten et al. (Science 2007; 317 (14 de septiembre): 1554-1557)). Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo útil se une con el mismo antígeno que reconoce el anticuerpo intacto. El término "fragmento de anticuerpo" también incluye proteínas sintéticas o modificadas genéticamente que actúan como un anticuerpo uniéndose a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten de las regiones variables, como los fragmentos "Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un péptido. conector ("proteínas scFv"). Los fragmentos pueden construirse de diferentes maneras para producir formas de unión multivalentes y/o multiespecíficas.
Un anticuerpo desnudo es generalmente un anticuerpo completo que no está conjugado con un agente terapéutico. Un anticuerpo desnudo puede mostrar efectos terapéuticos y/o citotóxicos, por ejemplo, mediante funciones dependientes de Fc, como la fijación del complemento (CDC) y ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Sin embargo, otros mecanismos, como la apoptosis, la antiangiogénesis, la actividad antimetastásica, la actividad antiadhesiva, la inhibición de la adhesión heterotípica u homotípica y la interferencia en las vías de señalización, también pueden proporcionar un efecto terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos de origen natural o recombinantes como anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos y fragmentos de los mismos. En algunos casos, un "anticuerpo desnudo" también puede referirse a un fragmento de anticuerpo "desnudo". Como se define en la presente, "desnudo" es sinónimo de "no conjugado”, y significa no enlazado o conjugado con un agente terapéutico.
Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante que contiene los dominios variables de las cadenas tanto pesada como ligera del anticuerpo, incluyendo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de una especie, preferiblemente un anticuerpo de roedor, más preferiblemente un anticuerpo murino, mientras que los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano. Para aplicaciones veterinarias, los dominios constantes del anticuerpo quimérico pueden derivarse de los de otras especies, como un primate, gato o perro.
Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la que las CDR de un anticuerpo de una especie; por ejemplo, un anticuerpo murino, se transfieren desde las cadenas variables pesada y ligera del anticuerpo murino a los dominios variables pesado y ligero humanos (regiones marco). Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano. En algunos casos, los residuos específicos de la región marco del anticuerpo humanizado, particularmente aquellos que están en contacto o cerca de las secuencias de CDR, pueden modificarse, por ejemplo, reemplazarse con los residuos correspondientes del anticuerpo original murino, de roedor, primate subhumano u otro.
Un anticuerpo humano es un anticuerpo obtenido, por ejemplo, de ratones transgénicos que han sido "modificados" para producir anticuerpos humanos en respuesta a una exposición antigénica. En esta técnica, los elementos de los loci de la cadena pesada y ligera humanas se introducen en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen interrupciones dirigidas de los loci endógenos de la cadena pesada y la cadena ligera. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para varios antígenos, y los ratones pueden usarse para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen en Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), y Taylor et al., Int. inmune 6:579 (1994)). También puede construirse un anticuerpo totalmente humano mediante métodos de transfección genética o cromosómica, así como tecnología de presentación en fagos, todos los cuales son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) para la producción de anticuerpos humanos y fragmentos de los mismos in vitro, de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. En esta técnica, los genes de dominio variable de anticuerpos humanos se clonan en marco en un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Como la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos puede realizarse en una variedad de formatos, para su revisión ver, por ejemplo, Johnson y Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3: 5564-571 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro. Ver Patentes de Estados Unidos N° 5,567,610 y 5,229,275.
Un agente terapéutico es un átomo, molécula o compuesto que es útil en el tratamiento de una enfermedad. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, inmunoconjugados, fármacos, agentes citotóxicos, agentes proapopoptóticos, toxinas, nucleasas (incluyendo ADNasas y ARNasas), hormonas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes o colorantes fotoactivos, radionúclidos, oligonucleótidos, ARN de interferencia, ARNip, ARNi, agentes antiangiogénicos, agentes quimioterapéuticos, citoquinas, quimiocinas, profármacos, enzimas, proteínas de unión o péptidos o combinaciones de los mismos.
Un inmunoconjugado es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, complejo de anticuerpo o proteína de fusión de anticuerpo que se conjuga con un agente terapéutico. La conjugación puede ser covalente o no covalente. Preferiblemente, la conjugación es covalente.
Como se usa en la presente, el término proteína de fusión de anticuerpos es una molécula de unión a antígeno producida recombinantemente en la que uno o más anticuerpos naturales, anticuerpos de cadena sencilla o fragmentos de anticuerpos se enlazan a otra fracción, como una proteína o un péptido, una toxina, una citoquina, una hormona, etc. En ciertas realizaciones preferidas, la proteína de fusión puede comprender dos o más anticuerpos iguales o diferentes, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de cadena sencilla fusionados entre sí, que pueden unirse al mismo epítopo, epítopos diferentes en el mismo antígeno, o diferentes antígenos.
Un inmunomodulador es un agente terapéutico que cuando está presente, altera, suprime o estimula el sistema inmunitario del cuerpo. Típicamente, un inmunomodulador de uso estimula las células inmunitarias para que proliferen o se activen en una cascada de respuesta inmunitaria, como macrófagos, células dendríticas, células B y/o células T. Sin embargo, en algunos casos, un inmunomodulador puede suprimir la proliferación o activación de células inmunitarias. Un ejemplo de un inmunomodulador como se describe en la presente es una citoquina, que es una pequeña proteína soluble de aproximadamente 5-20 kDa que es liberada por una población celular (por ejemplo, linfocitos T cebados) al entrar en contacto con antígenos específicos, y que actúa como un mediador intercelular entre las células. Como entenderá el experto en la técnica, los ejemplos de citoquinas incluyen linfocinas, monocinas, interleucinas y varias moléculas de señalización relacionadas. como el factor de necrosis tumoral (TNF) y los interferones. Las quimiocinas son un subconjunto de las citoquinas. Ciertas interleucinas e interferones son ejemplos de citoquinas que estimulan la proliferación de células T u otras células inmunitarias. Los interferones ejemplares incluyen interferón-a, interferón-p, interferón-y e interferón-A.
CPT es una abreviatura de camptotecina, y como se usa en la presente solicitud, CPT representa la propia camptotecina o un análogo o derivado de la camptotecina, como SN-38. Las estructuras de la camptotecina y algunos de sus análogos, con la numeración indicada y los anillos marcados con las letras A-E, se dan en la fórmula 1 en el Gráfico 1 a continuación.
Gráfico 1
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CPT: R1 = R2 = R3 = H
10-Hidroxi-CPT: R1 = OH; R2 = R3 = H
CPT-11:
Figure imgf000007_0002
R2 = etilo; R3 = H
SN-38: R1 = OH; R2 = etilo; R3 = H
Topotecán: R1 = OH; R2 = H; R3 = CH2 -N(CH3)2
Conjugados de camptotecina
A continuación, se describen métodos y composiciones no limitativos para preparar inmunoconjugados que comprenden un agente terapéutico de camptotecina unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. En realizaciones preferidas, la solubilidad del fármaco se mejora colocando una fracción de polietilenglicol (PEG) definido (es decir, un PEG que contiene un número definido de unidades monoméricas) entre el fármaco y el anticuerpo, en donde el PEG definido es un PEG de bajo peso molecular, que contiene preferiblemente de 1 a 30 unidades monoméricas, más preferiblemente que contiene de 1 a 12 unidades monoméricas.
Preferiblemente, un primer conector conecta el fármaco en un extremo y puede terminar con un acetileno o un grupo azida en el otro extremo. Este primer conector puede comprender una fracción de PEG definida con un grupo azida o acetileno en un extremo y un grupo reactivo diferente, como ácido carboxílico o grupo hidroxilo, en el otro extremo. Dicho PEG definido bifuncional puede unirse al grupo amino de un aminoalcohol, y el grupo hidroxilo de este último puede unirse al grupo hidroxilo del fármaco en forma de carbonato. Alternativamente, la fracción no azida (o acetileno) de dicho PEG bifuncional definido se une opcionalmente al extremo N-terminal de un L-aminoácido o un polipéptido, con el extremo C-terminal unido al grupo amino del aminoalcohol, y el grupo hidroxi del último se une al grupo hidroxilo del fármaco en la forma de carbonato o carbamato, respectivamente.
Un segundo conector, que comprende un grupo de acoplamiento de anticuerpos y un grupo reactivo complementario al grupo azida (o acetileno) del primer conector, concretamente acetileno (o azida), puede reaccionar con el conjugado de fármaco-(primer conector) a través de una reacción de cicloadición de acetilenoazida para proporcionar un producto farmacológico bifuncional final que es útil para conjugar con anticuerpos dirigidos a enfermedades. El grupo de acoplamiento del anticuerpo es preferiblemente un tiol o un grupo reactivo con tiol.
A continuación, se proporcionan métodos para la regeneración selectiva del grupo 10-hidroxilo en presencia del carbonato C-20 en preparaciones de precursores de fármaco-conector que implican análogos de CPT como SN-38. También pueden usarse otros grupos protectores para grupos hidroxilo reactivos en fármacos como el hidroxilo fenólico en SN-38, por ejemplo, t-butildimetilsililo o t-butildifenilsililo, y estos se desprotegen con fluoruro de tetrabutilamonio antes de enlazar el fármaco derivado a una fracción de acoplamiento de anticuerpos. El grupo 10-hidroxilo de los análogos de CPT se protege alternativamente como un éster o carbonato, distinto de 'BOC', de tal manera que el CPT bifuncional se conjuga con un anticuerpo sin desprotección previa de este grupo protector. El grupo protector se desprotege fácilmente en condiciones de pH fisiológico después de administrar el bioconjugado.
En el acoplamiento acetileno-azida, al que se hace referencia como "química de clic", la parte de azida puede estar en L2 con la parte de acetileno en L3. Alternativamente, L2 puede contener acetileno, con L3 conteniendo azida. "Química del clic" se refiere a una reacción de cicloadición catalizada por cobre (+1) entre una fracción de acetileno y una fracción de azida (Kolb HC y Sharpless KB, Drug Discov Today 2003; 8: 1128-37), aunque se conocen y pueden usarse formas alternativas de química del clic. La química del clic se lleva a cabo en una solución acuosa en condiciones de pH casi neutro y, por lo tanto, es adecuada para la conjugación de fármacos. La ventaja de la química de clic es que es quimioselectiva y complementa otras químicas de conjugación bien conocidas, como la reacción de tiol-maleimida.
Aunque la presente divulgación se centra en el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos como fracciones de direccionamiento, el experto en la técnica se dará cuenta de que cuando un conjugado comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, puede sustituirse otro tipo de fracción de direccionamiento, como un aptámero, un avimero, un aficuerpo o un ligando peptídico.
Una realización ejemplar de la divulgación está dirigida a un conjugado de un derivado farmacológico y un anticuerpo de fórmula general
MAb-[L2]-[L1]-[AA]m-[A’]-Fármaco (2)
donde MAb es un anticuerpo dirigido a la enfermedad; L2 es un componente del agente de reticulación que comprende una fracción de acoplamiento de anticuerpos y uno o más grupos acetileno (o azida); L1 comprende un PEG definido con azida (o acetileno) en un extremo, complementario a la fracción de acetileno (o azida) en L2, y un grupo reactivo como ácido carboxílico o grupo hidroxilo en el otro extremo; AA es un L-aminoácido; m es un número entero con valores de 0, 1, 2, 3 o 4; y A1 es un espaciador adicional, seleccionado del grupo de etanolamina, alcohol 4-hidroxibencílico, alcohol 4-aminobencílico o etilendiamina sustituida o no sustituida. Los aminoácidos L de 'AA' se seleccionan de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Si el grupo A' contiene hidroxilo, se enlaza al grupo hidroxilo o al grupo amino del fármaco en forma de carbonato o carbamato, respectivamente.
En una realización de la fórmula 2, A' es una etanolamina sustituida derivada de un L-aminoácido, en donde el grupo ácido carboxílico del aminoácido se reemplaza por una fracción hidroximetilo. A' puede derivarse de cualquiera de los siguientes L-aminoácidos: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
En un ejemplo del conjugado de la realización de la fórmula 2, m es 0, A' es L-valinol y el fármaco se ejemplifica con SN-38. La estructura resultante se muestra en la fórmula 3.
Figure imgf000008_0001
En otro ejemplo del conjugado de la realización de fórmula 2, m es 1 y está representado por una L-lisina derivatizada, A' es L-valinol y el fármaco está ejemplificado por SN-38. La estructura se muestra en la fórmula 4.
Figure imgf000009_0001
En esta realización, primero se forma un enlace amida entre el ácido carboxílico de un aminoácido como lisina y el grupo amino de valinol, usando grupos protectores ortogonales para los grupos amino de lisina. El grupo protector en el extremo N-terminal de la lisina se elimina, manteniendo intacto el grupo protector en la cadena lateral de la lisina, y el extremo N-terminal se acopla al grupo carboxilo en el PEG definido con azida (o acetileno) en el otro extremo. Luego, el grupo hidroxilo del valinol se une al derivado 20-cloroformiato de SN-38 protegido con 10-hidroxi, y este producto intermedio se acopla a un componente L2 que lleva la fracción de unión al anticuerpo, así como el grupo acetileno (o azida) complementario implicados en la química de la cicloadición de clic. Finalmente, la eliminación de los grupos protectores tanto en la cadena lateral de lisina como en SN-38 da el producto de este ejemplo, mostrado en la fórmula 3.
Aunque no se desea estar limitado a ninguna teoría, el producto SN-38 de pequeño peso molecular, concretamente, el carbonato de valinol-SN-38, generado después de la proteólisis intracelular, tiene la vía adicional de liberación de SN-38 intacto a través de la ciclación intramolecular que implica al grupo amino de valinol. y el carbonilo del carbonato.
En otra realización, A1 de fórmula general 2 es A-OH, por lo que A-OH es una fracción colapsable como alcohol 4-aminobencílico o un alcohol 4-aminobencílico sustituido con un grupo alquilo C1-C10 en la posición bencílica, y el último, a través de su grupo amino, se une a un L-aminoácido o un polipéptido que comprende hasta cuatro fracciones de L-aminoácido; en donde el extremo N-terminal está unido a un agente de reticulación que termina en el grupo de unión al anticuerpo.
A continuación, se proporciona un ejemplo de una realización, en donde la realización A-OH de A1 de fórmula general (2) se deriva de alcohol 4-aminobencílico sustituido, y 'AA' consiste de un solo L-aminoácido con m = 1 en la fórmula general (2), y el fármaco se ejemplifica con SN-38. La estructura se representa a continuación (fórmula 5, a la que se hace referencia como MAb-CLX-SN-38). El aminoácido individual de AA se selecciona de cualquiera de los siguientes L-aminoácidos: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. El sustituyente R en la fracción de alcohol 4-aminobencílico (realización A-OH de A') es hidrógeno o un grupo alquilo seleccionado de grupos alquilo C1-C10.
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En el inmunoconjugado y la composición para el uso de la invención, el aminoácido AA individual es L-lisina y R = H, y el fármaco está ejemplificado por SN-38 (fórmula 6; al que se hace referencia como MAb-CL2A-SN-38).
Figure imgf000010_0001
Son posibles otras realizaciones dentro del contexto de camptotecinas que contienen 10-hidroxi, como SN-38. En el ejemplo de SN-38 como fármaco, el grupo 10-hidroxilo más reactivo del fármaco se derivatiza sin afectar al grupo 20-hidroxilo. Dentro de la fórmula general 2, A1 es una etilendiamina sustituida. Un ejemplo de esta realización está representado por la fórmula '7' a continuación, en donde el grupo hidroxilo fenólico de SN-38 se derivatiza como un carbamato con una etilendiamina sustituida, con la otra amina de la diamina derivatizada como un carbamato con un alcohol 4-aminobencílico, y el grupo amino de este último está unido al dipéptido Phe-Lys. En esta estructura (fórmula 7), R y R' son independientemente hidrógeno o metilo. Se hace referencia como MAb-CL17-SN-38 o MAb-CL2E-SN-38, cuando R = R' = metilo.
Figure imgf000010_0002
En otra realización, el componente L1 del conjugado contiene un espaciador de polietilenglicol (PEG) definido con 1-30 unidades monoméricas de repetición. En otra realización preferida, el PEG es un PEG definido con 1-12 unidades monoméricas de repetición. La introducción de PEG puede implicar el uso de derivados de PEG heterobifuncionalizados que están disponibles comercialmente. El PEG heterobifuncional puede contener un grupo azida o acetileno. A continuación, en la fórmula 8 se proporciona un ejemplo de un PEG definido heterobifuncional que contiene 8 unidades monoméricas de repetición, siendo 'NHS' succinimidilo:
Figure imgf000010_0003
En una realización, L2 tiene una pluralidad de grupos acetileno (o azida), que varía entre 2 y 40, pero preferiblemente entre 2 y 20 y más preferiblemente entre 2 y 5, y una única fracción de unión a anticuerpo.
A continuación, se muestra un conjugado de SN-38 representativo de un anticuerpo que contiene múltiples moléculas de fármaco y una única fracción de unión al anticuerpo. El componente 'L2' de esta estructura se anexa a 2 grupos acetilénicos, dando como resultado la unión de dos moléculas de SN-38 anexadas con azida. La unión a MAb se representa como una succinimida.
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En realizaciones preferidas, cuando el fármaco bifuncional contiene una fracción reactiva con tiol como grupo de unión al anticuerpo, los tioles del anticuerpo se generan en los grupos lisina del anticuerpo usando un reactivo de tiolación. Los métodos para introducir grupos tiol en anticuerpos mediante modificaciones de los grupos lisina de los MAb son bien conocidos en la técnica (Wong in Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991), págs. 20-22). Alternativamente, la reducción leve de los enlaces disulfuro intercatenarios en el anticuerpo (Willner et al., Bioconjugate Chem. 4:521-527 (1993)) usando agentes reductores como el ditiotreitol (DTT) puede generar de 7 a 10 tioles en el anticuerpo; que tiene la ventaja de incorporar múltiples fracciones de fármaco en la región intercatenaria del MAb lejos de la región de unión al antígeno. En una realización más preferida, la unión de SN-38 a grupos disulfuro sulfhidrilo reducidos da como resultado la formación de un inmunoconjugado de anticuerpo-SN-38 con 6 fracciones de SN-38 unidas covalentemente por molécula de anticuerpo. Se conocen otros métodos para proporcionar residuos de cisteína para la unión de fármacos u otros agentes terapéuticos, como el uso de anticuerpos modificados con cisteína (ver Patente de Estados Unidos N° 7.521.541.)
En el inmunoconjugado de la invención, la fracción quimioterapéutica es SN-38. En los conjugados de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada, el anticuerpo se enlaza a por lo menos una fracción quimioterapéutica; preferiblemente de 1 a aproximadamente 12 fracciones quimioterapéuticas; lo más preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 fracciones quimioterapéuticas. De acuerdo con la invención, el número de SN38 enlazados al anticuerpo es de 5 a 7.
Además, en una realización, el componente conector 'L2' comprende un grupo tiol que reacciona con un residuo reactivo de tiol introducido en uno o más grupos amino de la cadena lateral de lisina de dicho anticuerpo. En tales casos, el anticuerpo se derivatiza previamente con un grupo reactivo de tiol como una maleimida, vinilsulfona, bromoacetamida o yodoacetamida mediante procedimientos bien descritos en la técnica.
En el contexto de este trabajo, se descubrió sorprendentemente un proceso mediante el cual pueden prepararse conectores de fármacos de CPT en los que el CPT tiene adicionalmente un grupo 10-hidroxilo. Este proceso implica, pero no se limita a, la protección del grupo 10-hidroxilo como un derivado de f-butiloxicarbonilo (BOC), seguido de la preparación del penúltimo producto intermedio del conjugado fármaco-conector. Habitualmente, la eliminación del grupo BOC requiere un tratamiento con un ácido fuerte como el ácido trifluoroacético (TFA). En estas condiciones, el carbonato CPT 20-O-conector, que contiene grupos protectores a eliminar, también es susceptible de escisión, dando de este modo lugar a CPT no modificado. De hecho, la justificación para usar un grupo protector de metoxitritilo (MMT) suavemente eliminable para la cadena lateral de lisina de la molécula conectora, como se expone en la técnica, era precisamente evitar esta posibilidad (Walker et al., 2002). Se descubrió que la eliminación selectiva del grupo protector BOC fenólico es posible llevando a cabo reacciones de corta duración, de manera óptima de 3 a 5 minutos. En estas condiciones, el producto predominante fue aquel en el que se eliminó el 'BOC' en la posición 10-hidroxilo, mientras que el carbonato en la posición '20' estaba intacto.
Un enfoque alternativo implica proteger la posición 10-hidroxi del análogo de CPT con un grupo distinto de 'BOC', de tal manera que el producto final esté listo para la conjugación con anticuerpos sin necesidad de desproteger el grupo protector 10-OH. El grupo protector 10-hidroxi, que convierte el 10-OH en un carbonato fenólico o un éster fenólico, se desprotege fácilmente por las condiciones de pH fisiológico o por las esterasas después de la administración in vivo del conjugado. La eliminación más rápida de un carbonato fenólico en la posición 10 frente a un carbonato terciario en la posición 20 de 10-hidroxicamptotecina en condiciones fisiológicas ha sido descrita por He et al. (He et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 12: 4003-4008 (2004)). Un grupo protector 10-hidroxi en SN-38 puede ser 'COR' donde R puede ser un alquilo sustituido como "N(CH3)2-(CH2)n-" donde n es 1-10 y donde el grupo amino terminal está opcionalmente en forma de una sal cuaternaria para mejorar la solubilidad en agua, o un residuo de alquilo simple como "CH3-(CH2)n-" donde n es 0-10, o puede ser una fracción alcoxi como "CH3-(CH2)nO-" donde n es 0-10, o "N(CH3)2-(CH2)n-O-" donde n es 2-10, o " R1O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-" donde R1 es etilo o metilo y n es un número entero con valores de 0 a 10. Estos derivados 10-hidroxi se preparan fácilmente por tratamiento con el cloroformiato del reactivo elegido, si el derivado final va a ser un carbonato. Típicamente, la camptotecina que contiene 10-hidroxi como SN-38 se trata con un equivalente molar del cloroformiato en dimetilformamida usando trietilamina como base. En estas condiciones, la posición 20-OH no se ve afectada. Para formar 10-O-ésteres, se usa el cloruro de ácido del reactivo elegido.
En un proceso preferido de preparación de un conjugado de un derivado de fármaco y un anticuerpo de fórmula general 2, en donde los descriptores L2, L1, AA y A-X son como se describe en secciones anteriores, se prepara primero la fracción de fármaco bifuncional, [L2]-[L1]-[AA]m-[A-X]-fármaco, seguido de la conjugación de la fracción de fármaco bifuncional con el anticuerpo (indicado en la presente como "MAb").
En un proceso preferido de preparación de un conjugado de un derivado de fármaco y un anticuerpo de fórmula general 2, en donde los descriptores L2, L1, AA y A-OH son como se describe en secciones anteriores, la fracción de fármaco bifuncional se prepara primero enlazando A-OH al extremo C-terminal de AA a través de un enlace amida, seguido de acoplamiento del extremo amino de AA a un grupo de ácido carboxílico de L1. Si AA está ausente (es decir, m = 0), A-Oh se une directamente a L1 a través de un enlace amida. El agente de reticulación, [L1]-[AA]m-[A-OH], se une al grupo hidroxilo o amino del fármaco, y esto es seguido por la unión a la fracción L1, recurriendo a la reacción entre grupos azida (o acetileno) y acetileno (o azida) en L1 y L2 mediante química de clic.
El anticuerpo se une a un antígeno o epítopo de un antígeno expresado en una célula cancerosa o maligna. La célula cancerosa es preferiblemente una célula de un tumor hematopoyético, carcinoma, sarcoma, melanoma o un tumor glial. Una enfermedad maligna preferida para ser tratada de acuerdo con la presente invención es un tumor sólido maligno o una neoplasia hematopoyética.
En una realización preferida, la fracción escindible intracelularmente puede escindirse después de que se internalice en la célula tras la unión por el conjugado de MAb-fármaco a un receptor del mismo, y en particular escindirse mediante esterasas y peptidasas.
Técnicas generales de anticuerpos
Las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales contra virtualmente cualquier antígeno objetivo son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975), y Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991). Brevemente, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse inyectando a ratones una composición que comprende un antígeno, extirpando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando clones positivos que producen anticuerpos contra el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos contra el antígeno y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridomas.
Los MAbs pueden aislarse y purificarse a partir de cultivos de hibridomas mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína A o Proteína G Sefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico. Ver, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3. También, ver Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).
Después de la generación inicial de anticuerpos contra el inmunógeno, los anticuerpos pueden secuenciarse y prepararse posteriormente mediante técnicas recombinantes. La humanización y quimerización de anticuerpos murinos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la técnica, como se analiza a continuación.
El experto en la técnica se dará cuenta de que los métodos y composiciones divulgados pueden utilizar cualquiera de una amplia variedad de anticuerpos conocidos en la técnica. Los anticuerpos de uso pueden obtenerse comercialmente de una amplia variedad de fuentes conocidas. Por ejemplo, una variedad de líneas de hibridomas secretoras de anticuerpos están disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En la ATCC se han depositado una gran cantidad de anticuerpos contra varios objetivos de enfermedades, incluyendo, pero no limitadas a, antígenos asociados a tumores, y/o se han publicado secuencias de regiones variables y están disponibles para su uso en los métodos y composiciones reivindicados. Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 7.312.318; 7.282.567; 7.151.164 ; 7.074.403; 7.060.802 ; 7.056.509 ; 7.049.060; 7.045.132; 7.041.803 7.041.802 7.041.293 7.038.018 ; 7.037.498; 7.012.133 7.001.598 6.998.468 6.994.976; 6.994.852; 6.989.241 ; 6.974.863 6.965.018 ; 6.964.854 6.962.981 6.962.813 6.956.107 6.951.924 6.949.244; 6.946.129; 6.943.020 ; 6.939.547 6.921.645 6.921.645 6.921.533 6.919.433; 6.919.078 6.916.475 6.905.681; 6.899.879; 6.893.625 ; 6.887.468 ; 6.887.466; 6.884.594 6.881.405 6.878.812 6.875.580 6.872.568 6.867.006; 6.864.062; 6.861.511 6.861.227 6.861.226 ; 6.838.282; 6.835.549; 6.835.370; 6.824.780 6.824.778 6.812.206; 6.793.924; 6.783.758 ; 6.770.450 6.767.711 ; 6.764.688 6.764.681 6.764.679; 6.743.898 6.733.981 6.730.307; 6.720.155; 6.716.966 ; 6.709.653 6.693.176 ; 6.692.908; 6.689.607; 6.689.362; 6.689.355 6.682.737 6.682.736; 6.682.734; 6.673.344 6.653.104 ; 6.652.852; 6.635.482 6.630.144 6.610.833 6.610.294 6.605.441 6.605.279; 6.596.852; 6.592.868 ; 6.576.745 6.572;856 ; 6.566.076 6.562.618 6.545.130 6.544.749 6.534.058 6.528.625; 6.528.269; 6.521.227 6.518.404 6.511.665 6.491.915 ; 6.488.930; 6.482.598; 6.482.408 6.479.247 6.468.531; 6.468.529; 6.465.173 6.461.823 6.458.356 6.455.044 ; 6.455.040 6.451.310 6.444.206 6.441.143 ; 6.432.404; 6.432.402; 6.419.928 6.413.726 ; 6.406.694; 6.403.770 6.403.091 6.395.276; 6.395.274 6.387.350 6.383.759; 6.383.484; 6.376.654 6.372.215 6.359.126 ; 6.355.481 ; 6.355.444; 6.355.245; 6.355.244 6.346.246 6.344.198; 6.340.571; 6.340.459 6.331.175 ; 6.306.393; 6.254.868 6.187.287 6.183.744 6.129.914 6.120.767 6.096.289; 6.077.499; 5.922.302 ; 5.874.540 5.814.440 ; 5.798.229; 5.789.554; 5.776.456 5.736.119 5.716.595 5.677.136; 5.587.459; 5.443.953. 5.525.338. Estos son solamente ejemplares y se conocen en la técnica una amplia variedad de otros anticuerpos y sus hibridomas. El experto en la técnica se dará cuenta de que las secuencias de anticuerpos o los hibridomas secretores de anticuerpos contra casi cualquier antígeno asociado a una enfermedad pueden obtenerse mediante una simple búsqueda en las bases de datos de la ATCC, NCBI y/o USPTO para anticuerpos contra un objetivo de interés asociado a una enfermedad seleccionada. Los dominios de unión a antígeno de los anticuerpos clonados pueden amplificarse, escindirse, ligarse en un vector de expresión, transfectarse en una célula huésped adaptada y usarse para la producción de proteínas, usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Los anticuerpos aislados pueden conjugarse con agentes terapéuticos, como camptotecinas, usando las técnicas divulgadas en la presente.
Anticuerpos quiméricos y humanizados
Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante en la que las regiones variables de un anticuerpo humano han sido reemplazadas por las regiones variables de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, incluyendo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo de ratón. Los anticuerpos quiméricos muestran una inmunogenicidad disminuida y una estabilidad aumentada cuando se administran a un sujeto. Los métodos para construir anticuerpos quiméricos son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Leung et al., 1994, Hybridoma 13:469).
Un anticuerpo monoclonal quimérico puede humanizarse transfiriendo las CDR de ratón de las cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina de ratón a los dominios variables correspondientes de un anticuerpo humano. Las regiones marco (FR) de ratón en el anticuerpo monoclonal quimérico también se reemplazan con secuencias FR humanas. Para conservar la estabilidad y la especificidad antigénica del monoclonal humanizado, uno o más residuos FR humanos pueden ser reemplazados por los residuos homólogos de ratón. Pueden usarse anticuerpos monoclonales humanizados para el tratamiento terapéutico de sujetos. Las técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales humanizados son bien conocidas en la técnica. (Ver, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature, 321:522; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323;Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534; Carter et al., 1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest et al., 1991, Biotechnology 9:266; Singer et al., J. Immun., 1993, 150:2844).
Otras realizaciones pueden referirse a anticuerpos de primates no humanos. Pueden encontrarse técnicas generales para generar anticuerpos terapéuticamente útiles en babuinos, por ejemplo, en Goldenberg et al., WO 91/11465 (1991), y en Losman et al., Int. J. Cáncer 46: 310 (1990). Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos pueden obtenerse de ratones transgénicos que han sido modificados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a la exposición antigénica, como se analiza a continuación.
Anticuerpos humanos
Los métodos para producir anticuerpos totalmente humanos usando o enfoques combinatorios o animales transgénicos transformados con loci de inmunoglobulina humana son conocidos en la técnica (por ejemplo, Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad y Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke y Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50). Se espera que tales anticuerpos totalmente humanos muestren incluso menos efectos secundarios que los anticuerpos quiméricos o humanizados y que funcionen in vivo como anticuerpos humanos esencialmente endógenos. Los métodos y procedimientos divulgados pueden utilizar anticuerpos humanos producidos mediante tales técnicas.
En una alternativa, puede usarse la técnica de presentación en fagos para generar anticuerpos humanos (por ejemplo, Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40). Los anticuerpos humanos pueden generarse a partir de humanos normales o de humanos que presenten un estado de enfermedad particular, como el cáncer (Dantas-Barbosa et al., 2005). La ventaja de construir anticuerpos humanos a partir de un individuo enfermo es que el repertorio de anticuerpos circulantes puede estar sesgado hacia anticuerpos contra antígenos asociados a enfermedades.
En un ejemplo no limitativo de esta metodología, Dantas-Barbosa et al. (2005) construyeron una biblioteca de presentación en fagos de fragmentos de anticuerpos Fab humanos a partir de pacientes con osteosarcoma. En general, el ARN total se obtuvo de los linfocitos sanguíneos circulantes (Id.) Los Fab recombinantes se clonaron a partir de los repertorios de anticuerpos de cadena p, y y k y se insertaron en una biblioteca de presentación en fagos (Id.) Los ARN se convirtieron en ADNc y se usaron para elaborar bibliotecas de ADNc de Fab usando cebadores específicos contra las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.
222:581-97). La construcción de la biblioteca se realizó de acuerdo con Andris-Widhopf et al. (2000, en: Phage Display Laboratory Manual, Barbas et al. (eds), 1a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY págs. 9.1 a 9.22). Los fragmentos Fab finales se digirieron con endonucleasas de restricción y se insertaron en el genoma del bacteriófago para elaborar la biblioteca de presentación en fagos. Tales bibliotecas pueden examinarse mediante métodos estándar de presentación en fagos. El experto en la técnica se dará cuenta de que esta técnica es ejemplar solamente y que puede utilizarse cualquier método conocido para elaborar y examinar anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos mediante presentación en fagos.
En otra alternativa, pueden usarse animales transgénicos que han sido manipulados genéticamente para producir anticuerpos humanos para generar anticuerpos contra esencialmente cualquier objetivo inmunogénico, usando protocolos de inmunización estándar como se ha analizado anteriormente. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen en Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), y Taylor et al., Int. inmune 6:579 (1994). Un ejemplo no limitativo de tal sistema es el XENOMOUSE® (por ejemplo, Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23) de Abgenix (Fremont, CA). En el XENOMOUSE® y animales similares, los genes de anticuerpos de ratón han sido inactivados y reemplazados por genes de anticuerpos humanos funcionales, mientras que el resto del sistema inmunitario del ratón permanece intacto.
El XENOMOUSE® se transformó con YAC (cromosomas artificiales de levadura) configurados en la línea germinal que contenían porciones de los loci kappa de IgH e Ig humanos, incluyendo la mayoría de las secuencias de la región variable, junto con genes accesorios y secuencias reguladoras. El repertorio de regiones variables humanas puede usarse para generar células B productoras de anticuerpos, que pueden procesarse en hibridomas mediante técnicas conocidas. Un XENOMOUSE® inmunizado con un antígeno objetivo producirá anticuerpos humanos mediante la respuesta inmunitaria normal, que pueden recogerse y/o producirse mediante las técnicas estándar analizadas anteriormente. Están disponibles una variedad de cepas de XENOMOUSE®, cada una de las cuales es capaz de producir una clase diferente de anticuerpo. Se ha demostrado que los anticuerpos humanos producidos transgénicamente tienen potencial terapéutico, a la vez que conservan las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos humanos normales (Green et al., 1999). El experto en la técnica se dará cuenta de que las composiciones y los métodos reivindicados no se limitan al uso del sistema XENOMOUSE® sino que puede utilizarse cualquier animal transgénico que haya sido manipulado genéticamente para producir anticuerpos humanos.
Producción de fragmentos de anticuerpos
Algunas realizaciones de los métodos y/o composiciones reivindicados pueden referirse a fragmentos de anticuerpos. Tales fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos de anticuerpos mediante la escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S indicado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol y, opcionalmente, un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escisión de los enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Alternativamente, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc. Los métodos ejemplares para producir fragmentos de anticuerpos se divulgan en la Patente de Estados Unidos N° 4.036.945; Patente de Estados Unidos N° 4.331.647; Nisonoffet al., 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89:230; Porter, 1959, Biochem. J., 73:119; Edelman et al., 1967, METHODS IN ENZYMOLOGY, página 422 (Academic Press), y Coligan et al. (eds.), 1991, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons).
También pueden usarse otros métodos de escisión de anticuerpos, como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas Vh y Vl .. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe en Inbar et al., 1972, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 69:2659. Alternativamente, las cadenas variables pueden estar enlazadas por un enlace disulfuro intermolecular o reticuladas por productos químicos como el glutaraldehído. Ver Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.
Preferiblemente, los fragmentos Fv comprenden cadenas Vh yVVL conectadas por un conector peptídico. Estas proteínas de unión a antígeno de cadena sencilla (scFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios Vh y Vl, conectados por una secuencia conectora de oligonucleótidos. El gen estructural se inserta en un vector de expresión que posteriormente se introduce en una célula huésped, como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una única cadena polipeptídica con un péptido conector que une los dos dominios V. Los métodos para producir scFv son bien conocidos en la técnica. Ver Whitlow et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97; Bird et al., 1988, Science, 242:423; Patente de Estados Unidos N° 4.946.778; Pack et al., 1993, Bio/Technology, 11:1271, y Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.
Otra forma de fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de dominio único (dAb), a veces denominado anticuerpo de cadena sencilla. Las técnicas para producir anticuerpos de dominio único son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Cossins et al., Protein Expression and Purification, 2007, 51:253-59; Shuntao et al., Molec Immunol 2006, 43:1912-19 Tanha et al., J. Biol. Chem. 2001, 276:24774-780). Otros tipos de fragmentos de anticuerpos pueden comprender una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Los péptidos de CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") pueden obtenerse construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras de anticuerpos. Ver, Larrick et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106; Ritter et al. (eds.), 1995, Mo NOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, páginas 166-179 (Cambridge University Press); Birch et al., (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, páginas 137-185 (Wiley-Liss, Inc.).
Variaciones de anticuerpos
Las secuencias de anticuerpos, como las porciones Fc de los anticuerpos, pueden variarse para optimizar las características fisiológicas de los conjugados, como la vida media en suero. Los métodos de sustitución de secuencias de aminoácidos en proteínas son ampliamente conocidos en la técnica, como la mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2a ed., 1989). La variación puede implicar la adición o eliminación de uno o más sitios de glicosilación en la secuencia Fc (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6.254.868). Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos específicos en la secuencia Fc (por ejemplo, Hornick et al., 2000, J Nucl Med 41:355-62; Hinton et al., 2006, J Immunol 176:346-56; Petkova et al. 2006, Int Immunol 18:1759-69; Patente de Estados Unidos N° 7,217,797).
Antígenos objetivo y anticuerpos ejemplares
El anticuerpo que se usa reconoce y/o se une a un antígeno que se expresa a niveles elevados en las células objetivo y que se expresa predominante o exclusivamente en células enfermas frente a tejidos normales. Más preferiblemente, el anticuerpo se internaliza rápidamente después de la unión. Un anticuerpo de "internalización rápida" puede ser uno con una tasa de internalización de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 107 moléculas de anticuerpo por célula al día. En la presente invención, el inmunoconjugado comprende el anticuerpo hRS7 y se dirige al antígeno TROP 2.
Un análisis exhaustivo de objetivos de antígenos adecuados (Designación de Clúster, o CD) en células malignas hematopoyéticas, como se muestra por citometría de flujo y que puede ser una guía para seleccionar anticuerpos adecuados para inmunoterapia conjugada con fármacos es Craig and Foon, Blood prepublicado en línea el 15 de enero de 2008; DOL 10.1182/blood-2007-11 -120535.
Se usan anticuerpos que se internalizan rápidamente y luego se vuelven a expresar, procesar y presentar en las superficies celulares, lo que permite la captación y acumulación continua del conjugado circulante por parte de la célula.
Alotipos de anticuerpos
La inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos está asociada con un mayor riesgo de reacciones a la infusión y una menor duración de la respuesta terapéutica (Baert et al., 2003, N Engl J Med 348:602-08). La medida en la que los anticuerpos terapéuticos inducen una respuesta inmunitaria en el huésped puede determinarse en parte por el alotipo del anticuerpo (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). El alotipo del anticuerpo está relacionado con las variaciones de la secuencia de aminoácidos en localizaciones específicas en las secuencias de la región constante del anticuerpo. Los alotipos de anticuerpos IgG que contienen una región constante de tipo y de cadena pesada se designan alotipos Gm (1976, J Immunol 117:1056-59).
Para los anticuerpos humanos IgG1 comunes, el alotipo más prevalente es G1m1 (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). Sin embargo, el alotipo G1m3 también aparece con frecuencia en caucásicos (Id.). Se ha informado que los anticuerpos G1m1 contienen secuencias alotípicas que tienden a inducir una respuesta inmunitaria cuando se administran a receptores que no son Glml (nG1m1), como los pacientes G1m3 (Id.). Los anticuerpos de alotipo no Glml no son tan inmunogénicos cuando se administran a pacientes G1m1 (Id.).
El alotipo humano G1m1 comprende los aminoácidos ácido aspártico en la posición Kabat 356 y leucina en la posición Kabat 358 en la secuencia CH3 de la IgG1 de cadena pesada. El alotipo nG1m1 comprende los aminoácidos ácido glutámico en la posición de Kabat 356 y metionina en la posición de Kabat 358. Tanto los alotipos G1ml como nG1ml comprenden un residuo de ácido glutámico en la posición de Kabat 357 y a veces se ha ce referencia a los alotipos como alotipos DEL y EEM. Se muestra un ejemplo no limitativo de las secuencias de la región constante de la cadena pesada para los anticuerpos de alotipo G1m1 y nG1m1 para los anticuerpos ejemplares rituximab (SEQ ID NO: 85) y veltuzumab (SEQ ID NO: 86).
Secuencia de región variable de cadena pesada de rituximab (SEQ ID NO: 85)
AS TKGP S VFPL AP S SK S T SGGT AALGCLVKD YFPEP VTV S W N S GALT S GVHTFP A VL
QS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQT YICN VNHKP SNTK VDKKAEPK S CDKTHT CPPCP AP
ELLGGP S VFLFPPKPKD TLMISRTPE VTC V VVD V SHEDPE VKFNW Y VDGVE VHN AKT
KPREEQ YN ST YRVV S VLT VLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISK AKGQPREP
QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Región variable de la cadena pesada de veltuzumab (SEQ ID NO: 86
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP
ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQ YNSTYRVVS VLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Jefferis y Lefranc (2009, mAbs 1:1-7) revisaron las variaciones de secuencia características de los alotipos de IgG y su efecto sobre la inmunogenicidad. Informaron que el alotipo G1m3 se caracteriza por un residuo de arginina en la posición 214 de Kabat, en comparación con un residuo de lisina en Kabat 214 en el alotipo G1m17. El alotipo nG1m1,2 se caracterizó por ácido glutámico en la posición de Kabat 356, metionina en la posición de Kabat 358 y alanina en la posición de Kabat 431. El alotipo G1m1,2 se caracterizó por ácido aspártico en la posición de Kabat 356, leucina en la posición de Kabat 358 y glicina en la posición de Kabat 431. Además de las variantes de secuencia de la región constante de la cadena pesada, Jefferis y Lefranc (2009) informaron de variantes alotípicas en la región constante de la cadena ligera kappa, con el alotipo Km1 caracterizado por valina en la posición de Kabat 153 y leucina en la posición de Kabat 191, el alotipo Km1,2 por alanina en la posición de Kabat 153 y leucina en la posición de Kabat 191, y el alotipo Km3 caracterizado por alanina en la posición de Kabat 153 y valina en la posición de Kabat 191.
Con respecto a los anticuerpos terapéuticos, el veltuzumab y el rituximab son, respectivamente, anticuerpos IgG1 humanizados y quiméricos contra CD20, de uso para la terapia de una amplia variedad de enfermedades malignas hematológicas. La Tabla 6 compara las secuencias de alotipos de rituximab frente a veltuzumab. Como se muestra en la Tabla 6, el rituximab (G1m17,1) es una IgG1 de alotipo DEL, con una variación de secuencia adicional en la posición 214 de Kabat (CH1 de cadena pesada) de lisina en rituximab frente a arginina en veltuzumab. Se ha informado que el veltuzumab es menos inmunogénico en sujetos que el rituximab (ver, por ejemplo, Morchhauser et al., 2009, J Clin Oncol 27:3346-53; Goldenberg et al., 2009, Blood 113:1062-70; Robak & Robak, 2011, BioDrugs 25:13-25), un efecto que se ha atribuido a la diferencia entre anticuerpos humanizados y quiméricos. Sin embargo, la diferencia en los alotipos entre los alotipos EEM y DEL probablemente también explica la menor inmunogenicidad del veltuzumab.
Tabla 6. Aloti os de Rituximab frente a Veltuzumab
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Para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos en individuos de genotipo nG1m1, es deseable seleccionar el alotipo del anticuerpo para que corresponda al alotipo G1m3, caracterizado por arginina en Kabat 214, y el alotipo nulo nG1 m1,2, caracterizado por ácido glutámico en la posición de Kabat 356, metionina en la posición de Kabat 358 y alanina en la posición de Kabat 431. Sorprendentemente, se descubrió que la administración subcutánea repetida de anticuerpos G1m3 durante un largo período de tiempo no dio como resultado una respuesta inmunitaria significativa. En realizaciones alternativas, la cadena pesada de IgG4 humana en común con el alotipo G1m3 tiene arginina en Kabat 214, ácido glutámico en Kabat 356, metionina en Kabat 359 y alanina en Kabat 431. Como la inmunogenicidad parece estar relacionada por lo menos en parte con los residuos en esas localizaciones, el uso de la secuencia de la región constante de la cadena pesada de la IgG4 humana para anticuerpos terapéuticos también es una realización preferida. Las combinaciones de anticuerpos IgG1 G1m3 con anticuerpos IgG4 también pueden ser útiles para la administración terapéutica.
Sustituciones de aminoácidos
El experto en la técnica se dará cuenta de que, en general, las sustituciones de aminoácidos implican típicamente el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido de propiedades relativamente similares (es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras). Las propiedades de los varios aminoácidos y el efecto de la sustitución de aminoácidos sobre la estructura y función de la proteína han sido objeto de extensos estudios y conocimientos en la técnica.
Por ejemplo, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132). El carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte & Doolittle, 1982), estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (­ 3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). Al hacer sustituciones conservadoras, se prefiere el uso de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de ± 2, se prefieren más dentro de ± 1, y se prefieren incluso más ± 0,5.
La sustitución de aminoácidos también puede tener en cuenta la hidrofilicidad del residuo de aminoácido (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.554.101). Se han asignado valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0); glutamato (+3,0); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5.±.1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se prefiere el reemplazo de aminoácidos por otros de hidrofilicidad similar.
Otras consideraciones incluyen el tamaño de la cadena lateral del aminoácido. Por ejemplo, generalmente no sería preferible reemplazar un aminoácido con una cadena lateral compacta, como glicina o serina, con un aminoácido con una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, triptófano o tirosina. También se considera el efecto de varios residuos de aminoácidos sobre la estructura secundaria de la proteína. Mediante estudios empíricos, se ha determinado y se conoce en la técnica el efecto de diferentes residuos de aminoácidos sobre la tendencia de los dominios de proteínas a adoptar una estructura secundaria de hélice alfa, lámina beta o giro inverso (ver, por ejemplo, Chou & Fasman, 1974, Biochemistry, 13:222-245, 1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276, 1979, Biophys. J., 26:367-384).
En base a tales consideraciones y estudios empíricos exhaustivos, se han construido tablas de sustituciones de aminoácidos conservadoras y son conocidas en la técnica. Por ejemplo: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Alternativamente: Ala (A) leu, ile, val; Arg (R) gln, asn, lys; Asn (N) his, asp, lys, arg, gln; Asp (D) asn, glu; Cys (C) ala, ser; Gln (Q) glu, asn; Glu (E) gln, asp; Gly (G) ala; His (H) asn, gln, lys, arg; Ile (I) val, met, ala, phe, leu; Leu (L) val, met, ala, phe, ile; Lys (K) gln, asn, arg; Met (M) phe, ile, leu; Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr; Pro (p ) ala; Ser (S), thr; Thr (T) ser; Trp (W) phe, tyr; Tyr (Y) trp, phe, thr, ser; Val (V) ile, leu, met, phe, ala.
Otras consideraciones para las sustituciones de aminoácidos incluyen si el residuo está localizado o no en el interior de una proteína o si está expuesto al solvente. Para residuos interiores, las sustituciones conservadoras incluirían: Asp y Asn; Ser y Thr; Ser y Ala; Thr y Ala; Ala y Gly; Ile y Val; Val y Leu; Leu y Ile; Leu y Met; Phe y Tyr; Tyr y Trp. (Ver, por ejemplo, el sitio web de PROWL en rockefeller.edu) Para residuos expuestos a solventes, las sustituciones conservadoras incluirían: Asp y Asn; Asp y Glu; Glu y Gln; Glu y Ala; Gly y Asn; Ala y Pro; Ala y Gly; Ala y Ser; Ala y Lys; Ser y Thr; Lys y Arg; Val y Leu; Leu y Ile; Ile y Val; Phe y Tyr. (Id.) Se han construido varias matrices para ayudar en la selección de sustituciones de aminoácidos, como la matriz de puntuación PAM250, la matriz de Dayhoff, la matriz de Grantham, matriz de McLachlan, matriz de Doolittle, matriz de Henikoff, matriz de Miyata, matriz de Fitch, matriz de Jones, matriz de Rao, matriz de Levin y matriz de Risler (Ídem).
Al determinar las sustituciones de aminoácidos, también puede considerarse la existencia de enlaces intermoleculares o intramoleculares, como la formación de enlaces iónicos (puentes salinos) entre residuos con carga positiva (por ejemplo, His, Arg, Lys) y residuos con carga negativa (por ejemplo, Asp, Glu) o enlaces disulfuro entre residuos de cisteína cercanos.
Los métodos para sustituir cualquier aminoácido por cualquier otro aminoácido en una secuencia de proteína codificada son bien conocidos y constituyen una cuestión de experimentación rutinaria para el experto en la técnica, por ejemplo, mediante la técnica de mutagénesis dirigida al sitio o mediante la síntesis y ensamblaje de oligonucleótidos que codifican una sustitución de aminoácidos y corte y empalme en un constructo de vector de expresión.
Presentación en fagos
Los péptidos de unión pueden identificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye pero no se limita a, la técnica de presentación en fagos. En la técnica son bien conocidos varios métodos de presentación en fagos y técnicas para producir diversas poblaciones de péptidos. Por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.223.409; 5.622.699 y 6.068.829 divulgan métodos para preparar una biblioteca de fagos. La técnica de presentación en fagos implica la manipulación genética de bacteriófagos para que puedan expresarse péptidos pequeños en su superficie (Smith y Scott, 1985, Science 228:1315-1317; Smith y Scott, 1993, Meth. Enzymol. 21:228-257). Además de los péptidos, también pueden mostrarse dominios de proteínas más grandes, como los anticuerpos de cadena sencilla, en la superficie de las partículas de fago (Arap et al., 1998, Science 279:377-380).
Las secuencias de aminoácidos de direccionamiento selectivas para un órgano, tejido, tipo de célula o molécula objetivo dados pueden aislarse mediante adsorción (Pasqualini y Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366; Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162). En resumen, se administra una biblioteca de fagos que contienen péptidos dirigidos putativos a un organismo intacto o a órganos, tejidos, tipos de células o moléculas objetivo aisladas y se recogen muestras que contienen fagos unidos. El fago que se une a un objetivo puede eluirse de un órgano, tejido, tipo de célula o molécula objetivo y luego amplificarse cultivándolos en la bacteria huésped.
El fago puede propagarse en la bacteria huésped entre rondas de adsorción. En lugar de ser lisadas por el fago, la bacteria puede secretar múltiples copias del fago que muestran un inserto particular. Si se desea, el fago amplificado puede exponerse de nuevo a los órganos objetivo, tejidos, tipos de células o moléculas objetivo y recogerse para rondas adicionales de adsorción. Pueden realizarse múltiples rondas de adsorción hasta que se obtenga una población de aglutinantes selectivos o específicos. La secuencia de aminoácidos de los péptidos puede determinarse mediante la secuenciación del ADN correspondiente al inserto del péptido de direccionamiento en el genoma del fago. El péptido de direccionamiento identificado puede entonces producirse como un péptido sintético mediante técnicas estándar de química de proteínas (Arap et al., 1998, Smith et al., 1985).
Puede usarse un protocolo de sustracción para reducir aún más la unión de fagos de fondo. El propósito de la sustracción es eliminar fagos de la biblioteca que se unen a objetivos distintos del objetivo de interés. Alternativamente, la biblioteca de fagos puede preseleccionarse frente a una célula, tejido u órgano de control. Por ejemplo, los péptidos de unión a tumores pueden identificarse después de preseleccionar una biblioteca frente a una línea celular normal de control. Después de la sustracción, la biblioteca puede seleccionarse frente a la molécula, célula, tejido u órgano de interés. Se conocen otros métodos de protocolos de sustracción y pueden usarse en la puesta en práctica de los métodos reivindicados, por ejemplo, como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 5.840.841. 5.705.610. 5.670.312 y 5.492.807.
Protocolos de conjugación
El protocolo de conjugación preferido se basa en una reacción de tiol-maleimida, tiol-vinilsulfona, tiolbromoacetamida o tiol-yodoacetamida que es fácil a pH neutro o ácido. Esto evita la necesidad de condiciones de pH más altas para las conjugaciones como serían necesarias, por ejemplo, cuando se usan ésteres activos. Detalles adicionales de los protocolos de conjugación ejemplares se describen a continuación en la sección de Ejemplos. Tratamiento Terapéutico
La invención se refiere a inmunoconjugados y composiciones para su uso en un método para tratar a un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado terapéutico a un sujeto. Las enfermedades que pueden tratarse con los conjugados terapéuticos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, enfermedades malignas de células B (por ejemplo, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas). Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinomas del epitelio del sistema digestivo derivado del endodermo, cánceres como el cáncer de mama y el cáncer de pulmón de células no pequeñas, y otros carcinomas, sarcomas, tumores gliales, leucemias mieloides, etc. En la divulgación, pueden usarse anticuerpos contra un antígeno, por ejemplo, un antígeno oncofetal, producido por o asociado con un tumor sólido maligno o una neoplasia hematopoyética, por ejemplo, un tumor gastrointestinal, de estómago, de colon, de esófago, de hígado, de pulmón, de mama, de páncreas, de hígado, de próstata, de ovario, de testículo, cerebral, óseo o linfático, un sarcoma o un melanoma. Tales agentes terapéuticos pueden administrarse una o varias veces, dependiendo del estado de la enfermedad y la tolerabilidad del conjugado, y también pueden usarse opcionalmente en combinación con otras modalidades terapéuticas, como cirugía, radiación externa, radioinmunoterapia, inmunoterapia, quimioterapia, terapia antisentido, terapia de ARN de interferencia, terapia génica y similares. Cada combinación se adaptará al tipo de tumor, estadio, condición del paciente y terapia previa, y otros factores considerados por el médico tratante.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (es decir, vertebrados e invertebrados) incluyendo, pero no limitados a, mamíferos, incluyendo los seres humanos. No se pretende que el término se limite a una edad o sexo en particular. Por tanto, el término abarca sujetos adultos y recién nacidos, así como fetos, ya sean hombres o mujeres. Las dosis proporcionadas en la presente son para humanos, pero pueden ajustarse al tamaño de otros mamíferos, así como a niños, de acuerdo con el peso o el tamaño del metro cuadrado.
Los conjugados terapéuticos que comprenden un anticuerpo anti-EGP-1 (anti-TROP-2) como el MAb hRS7 pueden usarse para tratar carcinomas como los carcinomas de esófago, páncreas, pulmón, estómago, colon y recto, vejiga urinaria, mama, ovario, útero, riñón y próstata, como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 7.238.785; 7.517.964 y 8.084.583. Un anticuerpo hRS7 es un anticuerpo humanizado que comprende secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 90);
CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 91); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 92) y secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 93); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 94) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 95)
En otra realización, un agente terapéutico usado en combinación con el conjugado de camptotecina de esta invención puede comprender uno o más isótopos. Los isótopos radiactivos útiles para tratar tejidos enfermos incluyen, pero no se limitan a: 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62CU, 67CU, 90Y, 125I, 131I, 32P, 33P, 47SC, 111Ag, 67Ga,
142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au, 227Th y 211Pb. El radionúclido terapéutico tiene preferiblemente una energía de descomposición en el intervalo de 20 a 6000 keV, preferiblemente en el intervalo de 60 a 200 keV para un emisor Auger, 100-2500 keV para un emisor beta y 4000-6000 keV para un emisor alfa. Las energías de descomposición máximas de los nucleidos emisores de partículas beta útiles son preferiblemente de 20-5000 keV, más preferiblemente de 100-4000 keV y lo más preferiblemente de 500-2500 keV. También se prefieren los radionúclidos que se descomponen sustancialmente con partículas emisoras Auger. Por ejemplo, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m,
Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, 1-125, Ho-161, Os-189m e Ir-192. Las energías de descomposición de los nucleidos emisores de partículas beta útiles son preferentemente de <1.000 keV, más preferiblemente <100 keV y lo más preferible de <70 keV. También se prefieren los radionúclidos que se descomponen sustancialmente con la generación de partículas alfa. Tales radionucleidos incluyen, pero no se limitan a: Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223,
Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Th-227 y Fm-255. Las energías de descomposición de los radionucleidos emisores de partículas alfa útiles son preferiblemente de 2000-10000 keV, más preferiblemente de
3000-8000 keV y lo más preferible de 4000-7000 keV. Los radioisótopos potenciales adicionales de uso incluyen 11C
, 13N , 15O , 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105RU, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho,199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 169Yb, y similares.
Los radionúclidos y otros metales pueden administrarse, por ejemplo, usando grupos quelantes unidos a un anticuerpo o conjugado. Los quelatos macrocíclicos como NOTA, DOTA y TETA son útiles con una variedad de metales y radiometales, más particularmente con radionúclidos de galio, itrio y cobre, respectivamente. Tales complejos de metal-quelato pueden hacerse muy estables adaptando el tamaño del anillo al metal de interés.
Pueden usarse otros quelatos de tipo anillo, como poliéteres macrocíclicos para complejar 223Ra.
Los agentes terapéuticos útiles en combinación con los conjugados de camptotecina descritos en la presente también incluyen, por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos como alcaloides de la vinca, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabolitos, inhibidores de la tirosina quinasa, agentes alquilantes, antibióticos, inhibidores de Cox-2, antimitóticos, agentes antiangiogénicos y proapoptóticos, particularmente doxorrubicina, metotrexato, taxol, otras camptotecinas y otras de estas y otras clases de agentes anticancerígenos y similares.
Otros fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer incluyen mostazas nitrogenadas, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, triacenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, hormonas y similares. Los agentes quimioterapéuticos adecuados se describen en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y en GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7a Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985), así como ediciones revisadas de estas publicaciones. Otros agentes quimioterapéuticos adecuados, como fármacos experimentales, son conocidos por los expertos en la técnica.
Los fármacos ejemplares de utilidad incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, afatinib, aplidina, azaribina, anastrozol, antraciclinas, axitinib, AVL-101, AVL-291, bendamustina, bleomicina, bortezomib, bosutinib, briostatina-1, busulfán, caliqueamicina, camptotecina, carboplatino, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucilo, cisplatino (CDDP), inhibidores de Cox-2, irinotecán (CPT-11), SN-38, carboplatino, cladribina, camptotecanos, crizotinib, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dasatinib, dinaciclib, docetaxel, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina (2P-DOX), ciano-morfolino doxorrubicina, glucurónido de doxorrubicina, glucurónido de epirrubicina, erlotinib, estramustina epidofilotoxina, erlotinib, entinostat, agentes de unión al receptor de estrógeno, etopósido (VP16), glucurónido de etopósido, fosfato de etopósido, exemestano, fingolimod, floxuridina (FUdR), 3',5'-O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, inhibidores de la farnesilproteína transferasa, flavopiridol, fostamatinib, ganetespib, GDC-0834, GS-1101, gefitinib, gemcitabina, hidroxiurea, ibrutinib, idarrubicina, idelalisib, ifosfamida, imatinib, L-asparaginasa, lapatinib, lenolidamida, leucovorina, LFM-A13, lomustina, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, navelbine, neratinib, nilotinib, nitrosurea, olaparib, plicomicina, procarbazina, paclitaxel, PCI-32765, pentostatina, PSI-341, raloxifeno, semustina, sorafenib, estreptozocina, SU11248, sunitinib, tamoxifeno, temazolomida (una forma acuosa de DTIC) , transplatino, talidomida, tioguanina, tiotepa, tenipósido, topotecán, mostaza de uracilo, vatalanib, vinorelbina, vinblastina, vincristina, alcaloides de vinca y ZD1839. Tales agentes pueden ser parte de los conjugados descritos en la presente o, alternativamente, pueden administrarse en combinación con los conjugados descritos, ya sea antes, simultáneamente o después del conjugado. Alternativamente, pueden usarse uno o más anticuerpos desnudos terapéuticos como se conoce en la técnica en combinación con los conjugados descritos. Anteriormente se han descrito anticuerpos desnudos terapéuticos ejemplares.
Los agentes terapéuticos que pueden usarse junto con los conjugados de camptotecina también pueden comprender toxinas conjugadas con fracciones de direccionamiento. Las toxinas que pueden usarse a este respecto incluyen ricina, abrina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas. (Ver, por ejemplo, Pastan. et al., Cell (1986), 47:641, y Sharkey y Goldenberg, CA Cancer J Clin. Julio-Agosto de 2006;56(4):226-43). Toxinas adicionales adecuadas para su uso en la presente son conocidos por los expertos en la técnica y se divulgan en la US 6.077.499.
Otra clase más de agente terapéutico puede comprender uno o más inmunomoduladores. Los inmunomoduladores de utilidad pueden seleccionarse de una citoquina, un factor de crecimiento de células madre, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias (CSF), un interferón (IFN), eritropoyetina, trombopoyetina y una combinación de los mismos. Específicamente útiles son las linfotoxinas como el factor de necrosis tumoral (TNF), los factores hematopoyéticos, como la interleucina (IL), el factor estimulante de colonias, como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interferón, como los interferones-a, -p, -y o -A, y factor de crecimiento de células madre, como el designado “factor S1”. Entre las citoquinas se incluyen hormonas de crecimiento como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana N-metionil y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario, proteína OB; factor de necrosis tumoral-a y -p; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso como NGF-p; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (TGF) como TGF-a y TGF-p; factor de crecimiento tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones como interferón-a, -p e -y; factores estimulantes de colonias (CSF) como macrófagos-CSF (M-CSF); interleucinas (IL) como IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, kit-ligando o FLT-3, angiostatina, trombospondina, endostatina, factor de necrosis tumoral y linfotoxina (LT). Como se usa en la presente, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.
Las quimioquinas de utilidad incluyen RANTES, MCAF, MIP1-alfa, MIP1-Beta e IP-10.
El experto en la técnica se dará cuenta de que los inmunoconjugados en cuestión pueden usarse solos o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, como un segundo anticuerpo, un segundo fragmento de anticuerpo, un segundo inmunoconjugado, un radionúclido, una toxina, un fármaco, un agente quimioterapéutico, una radioterapia, una quimiocina, una citoquina, un inmunomodulador, una enzima, una hormona, un oligonucleótido, ARNA o ARNip. Tales agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse por separado, en combinación o unidos a los inmunoconjugados de anticuerpo-fármaco en cuestión.
Formulación y Administración
Las vías adecuadas de administración de los conjugados incluyen, sin limitación, administración oral, parenteral, subcutánea, rectal, transmucosal, intestinal, inyecciones intramusculares, intramedulares, intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intravítreas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. Las vías de administración preferidas son las parenterales. Alternativamente, puede administrarse el compuesto de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del compuesto directamente en un tumor sólido.
Los inmunoconjugados pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante lo cual el inmunoconjugado se combina en una mezcla con un excipiente farmacéuticamente adecuado. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un excipiente farmacéuticamente adecuado. Otros excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a Edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición (Mack Publishing Company 1990), y ediciones revisadas de los mismos.
En una realización preferida, el inmunoconjugado se formula en tampón biológico de Good (pH 6-7), usando un tampón seleccionado del grupo que consiste de ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES); ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA); ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES); ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES); ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES); ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS); ácido 3-(N-morfolinil)-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO); y piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) [Pipes]. Los tampones más preferidos son MES o MOPS, preferiblemente en el intervalo de concentración de 20 a 100 mM, más preferiblemente de aproximadamente 25 mM. El más preferido es MES 25 mM, pH 6,5. La formulación puede comprender además trehalosa 25 mM y polisorbato 80 al 0,01% v/v como excipientes, con la concentración de tampón final modificada a 22,25 mM como resultado de los excipientes añadidos. El método preferido de almacenamiento es como una formulación liofilizada de los conjugados, almacenados en el intervalo de temperatura de -20° C a 2° C, siendo el almacenamiento más preferido de 2° C a 8° C.
El inmunoconjugado puede formularse para administración intravenosa mediante, por ejemplo, inyección en bolo, infusión lenta o infusión continua. Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención se infunde durante un período de menos de aproximadamente 4 horas, y más preferiblemente, durante un período de menos de aproximadamente 3 horas. Por ejemplo, los primeros 25-50 mg podrían infundirse en el plazo de 30 minutos, preferiblemente incluso 15 minutos, y la fracción infundirse durante las siguientes 2-3 horas. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes del uso.
Pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción del conjugado terapéutico. Las preparaciones de liberación controlada pueden prepararse mediante el uso de polímeros para formar complejos o adsorber el inmunoconjugado. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de poli(etilen-co-acetato de vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebácico. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). La tasa de liberación de un inmunoconjugado de dicha matriz depende del peso molecular del inmunoconjugado, la cantidad de inmunoconjugado dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersas. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Otras formas de dosificación sólidas se describen en Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS a Nd DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5 a Edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición (Mack Publishing Company 1990), y ediciones revisadas de los mismos.
Generalmente, la dosificación de un inmunoconjugado administrado para humanos variará dependiendo de factores como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado médico general y el historial médico previo del paciente. La dosificación puede repetirse según sea necesario, por ejemplo, una vez por semana durante 4-10 semanas, una vez por semana durante 8 semanas o una vez por semana durante 4 semanas. También puede administrarse con menos frecuencia, como cada dos semanas durante varios meses, o mensualmente o trimestralmente durante muchos meses, según sea necesario en una terapia de mantenimiento. Puede usarse cualquier cantidad en el intervalo de 8 a 10 mg/kg. La dosificación se administra preferiblemente varias veces, una o dos veces por semana. Puede usarse un programa de dosificación mínimo de 4 semanas, más preferiblemente de 8 semanas, más preferiblemente de 16 semanas o más. El programa de administración puede comprender la administración una o dos veces por semana, en un ciclo seleccionado del grupo consistente en: (i) semanal; (ii) cada dos semanas; (iii) una semana de terapia seguida de dos, tres o cuatro semanas de descanso; (iv) dos semanas de terapia seguido de una, dos, tres o cuatro semanas de descanso; (v) tres semanas de terapia seguidas de una, dos, tres, cuatro o cinco semanas de descanso; (vi) cuatro semanas de terapia seguidas de una, dos, tres, cuatro o cinco semanas de descanso; (vii) cinco semanas de terapia seguidas de una, dos, tres, cuatro o cinco semanas de descanso; y (viii) mensual. El ciclo puede repetirse 4, 6, 8, 10, 12, 16 o 20 veces o más.
Alternativamente, un inmunoconjugado puede administrarse como una dosificación cada 2 o 3 semanas, repetirse durante un total de por lo menos 3 dosificaciones. O bien, dos veces por semana durante 4-6 semanas. Alternativamente, el programa de dosificación puede disminuirse, concretamente cada 2 o 3 semanas durante 2-3 meses. Se ha determinado, sin embargo, que pueden administrarse dosis incluso más altas de acuerdo con la divulgación, como 12 mg/kg una vez a la semana o una vez cada 2-3 semanas mediante infusión i.v. lenta, para ciclos de dosificación repetidos. El programa de dosificación puede repetirse opcionalmente en otros intervalos y la dosificación puede administrarse a través de varias vías parenterales, con el ajuste apropiado de la dosis y el programa.
Los inmunoconjugados son útiles para la terapia del cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, glioblastoma, melanoma, sarcoma y leucemia, mieloma o enfermedades malignas linfoides. A continuación se indican ejemplos más particulares de tales cánceres e incluyen: cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer epitelial de células escamosas), sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, astrocitomas, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer gástrico o de estómago incluyendo el cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma multiforme, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, carcinoma hepatocelular, tumores neuroendocrinos, cáncer de tiroides medular, carcinoma diferenciado de tiroides, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de endometrio o carcinoma de útero, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello. El término "cáncer" incluye células o tumores malignos primarios (por ejemplo, aquellos cuyas células no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto que no sean el sitio del tumor o enfermedad maligna original) y células o tumores malignos secundarios (por ejemplo, aquellos que surgen de la metástasis, la migración de células malignas o células tumorales a sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original).
Otros ejemplos de cánceres o enfermedades malignas incluyen, pero no se limitan a: leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cáncer hepatocelular (primario) en adultos, cáncer de hígado (primario) en adultos, leucemia linfocítica aguda en adultos, leucemia mieloide aguda en adultos, linfoma de Hodgkin en adultos, leucemia linfocítica en adultos, linfoma no Hodgkin en adultos, cáncer primario de hígado en adultos, sarcoma de tejidos blandos en adultos, linfoma relacionado con el SIDA, enfermedades malignas relacionadas con el SIDA, cáncer anal, astrocitoma, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, glioma de tronco encefálico, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de pelvis renal y uréter, linfoma (primario) del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer hepatocelular (primario) infantil, cáncer de hígado (primario) infantil, leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloide aguda infantil, glioma de tronco encefálico infantil, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, tumores extracraneales de células germinales infantiles, enfermedad de Hodgkin infantil, linfoma de Hodgkin infantil, glioma hipotalámico y de la vía visual infantil, leucemia linfoblástica infantil, meduloblastoma infantil, linfoma no Hodgkin infantil, tumores neuroectodérmicos primitivos pineales y supratentoriales infantiles, cáncer primario de hígado infantil, rabdomiosarcoma infantil, sarcoma de tejidos blandos infantil, glioma hipotalámico y de las vías visuales infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, carcinoma endocrino de células de los islotes del páncreas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer epitelial, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing y tumores relacionados, cáncer de páncreas exocrino, tumor extracraneal de células germinativas, tumor extragonadal de células germinativas, cáncer extrahepático de las vías biliares, cáncer ocular, cáncer de mama femenino, enfermedad de Gaucher, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores gastrointestinales, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, hipergammaglobulinemia, cáncer de hipofaringe, cánceres intestinales, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, cáncer pancreático de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de labio y la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, trastornos linfoproliferativos, macroglobulinemia, cáncer de mama masculino, mesotelioma maligno, timoma maligno, meduloblastoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso primario oculto metastásico, cáncer de cuello escamoso primario metastásico, cáncer de cuello escamoso metastásico, mieloma múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndrome mielodisplásico, leucemia mielógena, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de cuello escamoso metastásico primario oculto, cáncer de orofaringe, sarcoma fibroso osteo-/maligno, osteosarcoma/histiocitoma maligno fibroso, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, paraproteinemias, policitemia vera, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, tumor hipofisario, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer primario de hígado, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoidosis sarcomas, síndrome de Sézary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago, tumores neuroectodérmicos y pineales supratentoriales primitivos, linfoma de células T, cáncer testicular, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y del uréter, cáncer transitorio de la pelvis renal y del uréter, tumores trofoblásticos, cáncer de células de la pelvis renal y del uréter, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma de útero, cáncer de vagina, glioma hipotalámico y de las vías visuales, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de la neoplasia, localizada en un sistema orgánico mencionado anteriormente.
Los inmunoconjugados y composiciones para el uso descritos y reivindicados en la presente pueden usarse para tratar afecciones malignas o premalignas y para prevenir la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo pero no limitado a, los trastornos descritos anteriormente. Tales usos están indicados en condiciones conocidas o sospechadas de progresión previa a neoplasia o cáncer, en particular, cuando se ha producido un crecimiento de células no neoplásicas consistente de hiperplasia, metaplasia o, más particularmente, displasia (para una revisión de tales condiciones de crecimiento anormal, ver Robbins y Angell, Basic Pathology, 2a edición, W.B. Saunders Co., Filadelfia, págs. 68-79 (1976)).
La displasia es frecuentemente un precursor del cáncer y se encuentra principalmente en el epitelio. Es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, que implica una pérdida en la uniformidad de las células individuales y en la orientación arquitectónica de las células. La displasia se produce característicamente cuando existe irritación o inflamación crónica. Los trastornos displásicos que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, displasia ectodérmica anhidrótica, displasia anterofacial, displasia torácica asfixiante, displasia atriodigital, displasia broncopulmonar, displasia cerebral, displasia cervical, displasia condroectodérmica, displasia cleidocraneal, displasia ectodérmica congénita, displasia craneodiafisaria, displasia craneocarpotarsiana, displasia craneometafisaria, displasia de dentina, displasia diafisaria, displasia ectodérmica, displasia de esmalte, displasia encefalo-oftálmica, displasia epifisaria hemimelia, displasia epifisaria múltiple, displasia epifisaria punctata, displasia epitelial, displasia faciodigitogenital, displasia fibrosa familiar de los maxilares, displasia familiar de pliegues blancos, displasia fibromuscular, displasia fibrosa del hueso, displasia ósea florida, displasia hereditaria renal-retiniana, displasia ectodérmica hidrótica, displasia ectodérmica hipohidrótica, displasia tímica linfopénica, displasia mamaria, displasia mandibulofacial, displasia metafisaria, displasia de Mondini, displasia fibrosa monostótica, displasia mucoepitelial, displasia epifisaria múltiple, displasia oculoauriculovertebral, displasia oculodentodigital, displasia oculovertebral, displasia odontogénica, displasia oftalmomandibulomélica, displasia cementosa periapical, displasia fibrosa poliostótica, displasia espondiloepifisaria pseudoacondroplásica, displasia retiniana, displasia septo-óptica, displasia espondiloepifisaria y displasia ventriculoradial.
Los trastornos preneoplásicos adicionales que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, trastornos disproliferativos benignos (por ejemplo, tumores benignos, afecciones fibroquísticas, hipertrofia tisular, pólipos o adenomas intestinales y displasia esofágica), leucoplasia, queratosis, enfermedad de Bowen, piel de Farmer, queilitis solar y queratosis solar.
En realizaciones preferidas, el inmunoconjugado o la composición para el uso de la invención se usa para inhibir el crecimiento, la progresión y/o la metástasis de cánceres, en particular los enumerados anteriormente.
Enfermedades, trastornos y/o afecciones hiperproliferativas adicionales incluyen, pero no se limitan a, progresión y/o metástasis de enfermedades malignas y trastornos relacionados, como la leucemia (incluyendo leucemias agudas; por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda [incluyendo las mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia]) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica [granulocítica] y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
EJEMPLOS
Varias realizaciones se ilustran mediante los siguientes ejemplos.
General
Las abreviaturas usadas a continuación son: DCC, diciclohexilcarbodiimida; NHS, N-hidroxisuccinimida, DMAP, 4-dimetilaminopiridina; EEDQ, 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina; MMT, monometoxitritilo; PABOH, alcohol p-aminobencílico; PEG, polietilenglicol; SMCC, 4-(W-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo; TBAF, fluoruro de tetrabutilamonio; TBDMS, cloruro de terc-butildimetilsililo.
En los siguientes ejemplos se prepararon cloroformiatos de compuestos hidroxi usando trifosgeno y DMAP de acuerdo con el procedimiento descrito en Moon et al. (J. Medicinal Chem. 51:6916-6926, 2008). El tratamiento extractivo se refiere a la extracción con cloroformo, diclorometano o acetato de etilo, y lavado opcionalmente con bicarbonato saturado, agua y cloruro de sodio saturado. La cromatografía ultrarrápida se realizó usando gel de sílice de 230-400 mesh y gradiente de metanol-diclorometano, usando hasta un 15% v/v de metanol-diclorometano, a menos que se indique lo contrario. La HPLC de fase inversa se realizó por el Método A usando una columna de HPLC C18 de 7,8 x 300 mm, equipada con un filtro de precolumna y usando un gradiente de solvente del 100% de solvente A al 100% de solvente B en 10 minutos a un caudal de 3 ml por minuto y manteniendo al 100% el solvente B a un caudal de 4,5 ml por minuto durante 5 o 10 minutos; o por el Método B usando una columna Xbridge C18 de 4,6 x 30 mm, 2,5 pm, equipada con un filtro de precolumna, usando el gradiente de solvente del 100% de solvente A al 100% de solvente B a un caudal de 1,5 ml por minuto durante 4 min y 100% de solvente B a un caudal de 2 ml por minuto durante 1 minuto. El solvente A era acetato de amonio acuoso al 0,3%, pH 4,46, mientras que el solvente B era acetonitrilo-acetato de amonio acuoso 9:1 (0,3%), pH 4,46. La HPLC se monitorizó mediante un detector de absorbancia en línea dual ajustado a 360 nm y 254 nm.
Ejemplo de referencia 1. Preparación de CL6-SN-38
El CL6-SN-38 está representado en el Esquema-1. Se activó O-(2-azidoetil)-O'-(N-diglicolil-2-aminoetil)heptaetilenglicol disponible comercialmente ('PEG-N3 '; 227 mg) con DCC (100 mg), NHS (56 mg), y una cantidad catalítica de DMAP en 10 ml de diclorometano durante 10 min. A esta mezcla se le añadió L-valinol (46,3 mg) y la mezcla de la reacción se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. La filtración, seguido de la eliminación del solvente y la cromatografía ultrarrápida proporcionaron 214 mg de material oleoso transparente. Este producto intermedio (160 mg) se hizo reaccionar con 10-0-B0C-SN-38-20-0-cloroformiato, este último generado a partir de 10-0-BOC-SN-38 (123 mg) usando trifosgeno y DMAP. La reacción de acoplamiento se realizó en 4 ml de diclorometano durante 10 min y la mezcla de la reacción se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para obtener 130 mg (45% de rendimiento) de producto en forma de material espumoso. HPLC: R 11,80 min; espectro de masas por electropulverización: M+Na: m/z 1181.
El reactivo acetilénico que contiene maleimida, concretamente, 4-(N-maleimidometil)-N-(2-propinil)ciclohexano-1-carboxamida, necesario para la cicloadición de clic, se preparó haciendo reaccionar 0,107 g de SMCC y 0,021 ml de propargilamina (0,018 g; 1,01 equiv.) en diclorometano usando 1,1 equiv. de diisopropiletilamina. Después de 1 h, se eliminó el solvente y el producto se purificó por cromatografía ultrarrápida para obtener 83 mg del producto (polvo incoloro). El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 275 (M+H) y un pico base a m/e 192 en el modo de iones positivos, consistente con la estructura calculada para C15H18N2O3: 275.1390 (M+H), encontrado: 275.1394 (masa exacta).
El producto intermedio azido (126 mg) se disolvió en DMSO (1,5 ml) y agua (0,4 ml) y se hizo reaccionar con 60 mg de 4-(N-maleimidometil)-N-(2-propinil)ciclohexano-1-carboxamida y 15 mg de bromuro cuproso y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. La cromatografía ultrarrápida, después de la elaboración de la mezcla de la reacción, proporcionó 116 mg (75% de rendimiento) del producto de cicloadición. HPLC: R 11.20 min; espectro de masas por electropulverización: M+H y M+Na a m/z 1433 y 1456, respectivamente. Finalmente, la desprotección con una mezcla de TFA (5 ml), diclorometano (1 ml), anisol (0,1 ml) y agua (0,05 ml), seguido de precipitación con éter y posterior cromatografía ultrarrápida proporcionó el producto CL6-SN-38. como material gomoso. HPLC: R 9.98 minutos; espectro de masas por electropulverización: M+H y MH (modo de iones negativos) a m/z 1333 y 1356, respectivamente.
Esquema-1
Figure imgf000025_0001
Ejemplo de referencia 2. Preparación de CL7-SN-38
La síntesis se muestra esquemáticamente en el Esquema-2. Se hizo reaccionar L-valinol (40 mg) con Fmoc-Lys(MMT)-OH comercialmente disponible (253 mg) y EEDQ (107 mg) en 10 ml de diclorometano anhidro a temperatura ambiente, bajo argón, durante 3 h. El tratamiento de extracción seguido de cromatografía ultrarrápida proporcionó el producto Fmoc-Lys(MMT)-valinol como un líquido amarillo pálido (200 mg; ~70% de rendimiento). HPLC: ír 14.38 min; espectro de masas por electropulverización: M+H: m/z 727. Este producto intermedio (200 mg) se desprotegió con dietilamina (10 ml), y el producto (135 mg) se obtuvo con una pureza del ~90% después de la cromatografía ultrarrápida. HPLC: ír 10,91 min; espectro de masas por electropulverización: M+Na a m/z 527. Este producto (135 mg) se combinó con O-(2-azidoetil)-O'-(N-diglicolil-2-aminoetil)heptaetilenglicol disponible comercialmente ('PEG- N3 '; 150 mg, 1,1 equiv.) en presencia de EEDQ (72 mg, 1,1 equiv.) en 10 ml de diclorometano, y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El material bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para obtener 240 mg del producto purificado como un aceite amarillo claro (~87% de rendimiento). HPLC: ír 11,55 min; espectro de masas por electropulverización: M+H y M+Na a m/z 1041 y 1063, respectivamente.
Este producto intermedio (240 mg) se hizo reaccionar con 10-0-TBDMS-SN-38-20-0-cloroformiato, este último generado a partir de 10-0-TBDMS-SN-38 (122 mg) usando trifosgeno y DMAP. La reacción de acoplamiento se realizó en 5 ml de diclorometano durante 10 min y la mezcla de la reacción se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para obtener 327 mg de producto como una espuma de color amarillo pálido. Espectro de masas por electropulverización: M+H a m/z 1574. Se hizo reaccionar todo el producto con 0,25 mmol de TBAF en 10 ml de diclorometano durante 5 min, y la mezcla de la reacción se diluyó hasta 100 ml y se lavó con salmuera.
El producto bruto (250 mg) se disolvió en DMSO (2 ml) y agua (0,4 ml) y se hizo reaccionar con 114 mg de 4-(N-maleimidometil)-N-(2-propinil)ciclohexano-1-carboxamida (preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1) y 30 mg de bromuro cuproso y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La cromatografía ultrarrápida proporcionó 150 mg del penúltimo producto intermedio. Finalmente, la desprotección del grupo MMT con una mezcla de TFA (0,5 ml) y anisol (0,05 ml) en diclorometano (5 ml) durante 3 min, seguida de purificación por cromatografía ultrarrápida proporcionó 69 mg de CL7-SN-38 como un material gomoso. HPLC: ír 9,60 min; espectro de masas por electropulverización: M+H y M-H (modo de iones negativos) a m/z 1461 y 1459, respectivamente.
Figure imgf000026_0001
El CL6-SN-38 del ejemplo 1 (55,4 mg) se disolvió en diclorometano (5 ml) y se hizo reaccionar con cloroformiato de etilo (13,1 mg; 11,5 pl) y diisopropiletilamina (52,5 mg; 71 pl) y se agitó durante 20 min en atmósfera de argón. La mezcla de la reacción se diluyó con 100 ml de diclorometano y se lavó con 100 ml de cada uno de HCl 0,1 M, bicarbonato de sodio semisaturado y salmuera y se secó. La cromatografía ultrarrápida, después de la eliminación del solvente, proporcionó 59 mg del producto del título. HPLC: ír 10,74 min; masa exacta: calc.
1404.6457 (M+H) y 1426.6276 (M+Na); encontrado: 1404.6464 (M+H) y 1426.6288 (M+Na).
Ejemplo de referencia 4. Preparación de CL7-SN-38-10-O-CO 2 Et
El precursor de CL7-SN-38 del Ejemplo 2 (80 mg) se convirtió en 10-O-cloroformiato usando el procedimiento y la purificación descritos en el Ejemplo 3. Rendimiento: 60 mg. HPLC: R 12,32 min; espectro de masas por electropulverización: M+H y M-H (modo de iones negativos) a m/z 1806 y 1804, respectivamente. La desprotección de este material usando ácido dicloroacético y anisol en diclorometano dio el producto del título. HPLC: R 10,37 min; espectro de masas por electropulverización: M+H en m/z 1534.
Ejemplo de referencia 5. Preparaciones de CL6-SN-38-10-0-COR y CL7-SN-38-10-0-COR
Este ejemplo muestra que el grupo 10-OH de SN-38 está protegido como un carbonato o un éster, en lugar de como 'BOC', de tal manera que el producto final está listo para la conjugación con anticuerpos sin necesidad de desproteger el grupo protector 10-OH. Este grupo se desprotege fácilmente en condiciones de pH fisiológico después de la administración in vivo del conjugado de proteínas. En estos conjugados, 'R' puede ser un alquilo sustituido como (CH2)n-N(CH3)2 donde n es 2-10, o un alquilo simple como (CH2)n-CH3 donde n es 0-10, o puede ser una fracción alcoxi como "CH3-(CH2)n-O-" donde n es 0-10, o una fracción alcoxi sustituida como O-(CH2)n-N(CH3)2 donde n es 2-10 y donde el grupo amino terminal está opcionalmente en forma de una sal cuaternaria para mejorar la solubilidad acuosa, o "R1O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-" donde R1 es etilo o metilo y n es un número entero con valores de 0-10. En la versión más simple de la última categoría, R = "-O-(CH2)2-OCH3". Estos derivados 10-hidroxi se preparan fácilmente por tratamiento con el cloroformiato del reactivo elegido, si el derivado final va a ser un carbonato. Típicamente, la camptotecina que contiene 10-hidroxi como SN-38 se trata con un equivalente molar del cloroformiato en dimetilformamida usando trietilamina como base. En estas condiciones, la posición 20-OH no se ve afectada. Para formar 10-O-ésteres, se usa el cloruro de ácido del reactivo elegido. Tales derivatizaciones se logran convenientemente usando productos intermedios avanzados como se ilustra para los carbonatos de etilo simples de los Ejemplos 3 y 4.
Ejemplo 6. Preparación de CL2A-SN-38
A la mezcla de Fmoc-Lys(MMT)-OH comercialmente disponible (0,943 g), alcohol p-aminobencílico (0,190 g) en cloruro de metileno (10 ml) se le añadió EEDQ (0,382 g) a temperatura ambiente y se agitó durante 4 h. El tratamiento extractivo seguido de cromatografía ultrarrápida proporcionó 1,051 g de material en forma de espuma blanca. Todos los análisis de HPLC se realizaron por el Método B como se expone en 'General' en la sección 0148. HPLC tiempo de ret.: 3,53 min., El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 745.8 (M+H) y m/e 780.3 (M+Cl‘), consistente con la estructura. Este producto intermedio (0,93 g) se disolvió en dietilamina (10 ml) y se agitó durante 2 h. Después de eliminar el solvente, el residuo se lavó en hexano para obtener 0,6 g del producto intermedio ((2) en el Esquema 3) como un precipitado incoloro (91,6% puro por HPLC). HPLC tiempo de ret.: 2,06 min. El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 523.8 (M+H), m/e 546.2 (M+Na) y m/e 522.5 (M-H).
Este producto intermedio bruto (0,565 g) se combinó con O-(2-azidoeti l )-O'-(N-d igli co lil-2-aminoetil)heptaetilenglicol disponible comercialmente ('PEG-N3', 0,627 g) usando EEDQ en cloruro de metileno (10 ml). La eliminación del solvente y la cromatografía ultrarrápida proporcionaron 0,99 g del producto ((3) en el Esquema 3; aceite amarillo claro; 87% de rendimiento). HPLC tiempo de ret.: 2.45 min. El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 1061.3 (M+H), m/e 1082.7 (M+Na) y m/e 1058.8 (MH), consistentes con la estructura. Este producto intermedio (0,92 g) se hizo reaccionar con 10-O-TBDMS-SN-38-20-O-cloroformiato ((5) en el Esquema-3) en cloruro de metileno (10 ml) durante 10 min bajo argón. La mezcla se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para obtener 0,944 g como un aceite de color amarillo claro ((6) en el Esquema 3; rendimiento = 68%). HPLC tiempo de ret.: 4,18 min. A este producto intermedio (0,94 g) en cloruro de metileno (10 ml) se le añadió la mezcla de TBAF (1 M en THF, 0,885 ml) y ácido acético (0,085 ml) en cloruro de metileno (3 ml), luego se agitó durante 10 min. La mezcla se diluyó con cloruro de metileno (100 ml), se lavó con citrato de sodio 0,25 M y salmuera. La eliminación del solvente proporcionó 0,835 g de un producto oleoso amarillo. HPLC tiempo de ret.: 2,80 min., (99% de pureza). El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 1478 (M+H), m/e 1500.6 (M+Na), m/e 1476.5 (m H), m/e 1590.5 (M+TFA), consistentes con la estructura.
Esquema-3: Preparación de CL2A-SN-38
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Este producto intermedio SN-38 derivatizado con azido (0,803 g) se hizo reaccionar con 4-(N-maleimidometil)-N-(2-propinil)ciclohexano-1-carboxamida (0,233 g) en cloruro de metileno (10 ml) en presencia de CuBr (0,0083 g), DiEA (0,01 ml) y trifenilfosfina (0,015 g), durante 18 h. El tratamiento extractivo, incluyendo el lavado con EDTA 0,1 M (10 ml), y la cromatografía ultrarrápida proporcionaron 0,891 g como una espuma amarilla. (rendimiento = 93%), HPLC tiempo de ret.: 2,60 min. El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 1753.3 (M+H), m/e 1751.6 (M-H), 1864.5 (M+TFA), consistentes con la estructura. Finalmente, la desprotección del penúltimo producto intermedio (0,22 g) con una mezcla de ácido dicloroacético (0,3 ml) y anisol (0,03 ml) en cloruro de metileno (3 ml), seguido de precipitación con éter, proporcionó 0,18 g (97% de rendimiento) de CL2A-SN-38; (7) en el Esquema-3) como un polvo amarillo claro. HPLC tiempo de ret.: 1,88 minutos El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 1480,7 (M+H), 1478,5 (M-H), consistentes con la estructura.
Ejemplo de referencia 7. Preparación de CL2E-SN-38
Se hizo reaccionar N,N'-dimetiletilendiamina (3 ml) en cloruro de metileno (50 ml) con cloruro de monometoxitritilo (1,7 g). Después de 1 h de agitación, se eliminó el solvente a presión reducida y se recuperó el producto bruto mediante tratamiento extractivo (aceite amarillo; 2,13 g). Todos los análisis de HPLC se realizaron por el Método B como se establece en 'General' en la sección 0148. HPLC tiempo de ret.: 2,28 min. Este producto intermedio ((1) en el Esquema 4; 0,93 g) se añadió in situ a SN-38 activado, y el último ((2) en el Esquema 4) se preparó haciendo reaccionar SN-38 (0,3 g) con p-cloroformiato de nitrofenilo (0,185 g) y DIEA (0,293 ml) en DMF durante 1 h. Después de eliminar el solvente, el residuo se purificó sobre gel de sílice desactivado para obtener 0,442 g como un sólido blanco.
Este producto intermedio (0,442 g) se desprotegió con una mezcla de ácido trifluoroacético (1 ml) y anisol (0,1 ml) en cloruro de metileno (5 ml), seguido de precipitación con éter para obtener 0,197 g del producto ((3) en el Esquema-4) como un sólido blanco. Este producto intermedio ((3); 0,197 g) se acopló con un conector de PEG incorporado con dipéptido que contiene azida activado ((5) en el Esquema 4), tal activación se realizó haciendo reaccionar el conector de p Eg ((4) en el Esquema-4; 0,203 g) con carbonato de bis(4-nitrofenilo) (0,153 g) y DIEA (0,044 ml) en cloruro de metileno (8 ml). La cromatografía ultrarrápida proporcionó 0,2 g del producto intermedio SN-38 derivatizado con azida ((6) en el Esquema 4) como un sólido vítreo. HPLC tiempo de ret.: 2,8 min. El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 1740.5 (M+H), m/e 1762.9 (M+Na), m/e 1774.9 (M+Cl‘), consistentes con la estructura. Este producto intermedio ((6) en el Esquema 4; 0,2 g) se sometió a una cicloadición de clic con 4-(N-maleimidometil)-N-(2-propinil)ciclohexano-1-carboxamida (0,067 g) en cloruro de metileno en presencia de CuBr (0,007 g), DIEA (0,008 ml) y trifenilfosfina (0,012 g) durante 18 h. El tratamiento de la mezcla de la reacción, que incluía tratamiento con EDTA 0,1 M, seguido de cromatografía ultrarrápida, proporcionó 0,08 g del penúltimo producto intermedio en forma de una espuma amarillo claro. HPLC: ír = 2,63 min. El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 2035.9 (M+Na+), m/e 2047,9 (M+Ct), consistentes con la estructura. Finalmente, la desprotección de este producto intermedio (0,08 g) con una mezcla de ácido trifluoroacético (0,2 ml), anisol (0,12 ml) y agua (0,06 ml) en cloruro de metileno (2 ml), seguido de precipitación con éter, proporcionó 0,051 g de producto, CL17-SN-38 (también denominado CL2E-SN-38), como un polvo amarillo claro (rendimiento = 69%). HPLC tiempo de ret.: 1,95 min., ~99% de pureza. El espectro de masas por electropulverización mostró picos a m/e 1741.1 (M+H), 1775,5 (M+Ct), de acuerdo con la estructura.
Esquema-4: Preparación de CL2E-SN-38
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Ejemplo 8. Conjugación de productos de SN-38 bifuncionales a anticuerpos levemente reducidos
En estos estudios se usaron el MAb humanizado anti-CEACAM5, hMN-14 (también conocido como labetuzumab), el MAb humanizado anti-CD22, hLL2 (también conocido como epratuzumab), el MAb humanizado anti-CD20, hA20 (también conocido como veltuzumab), el MAb humanizado anti-EGP-1, hRS7, y el MAb humanizado anti-mucina, hPAM4 (también conocido como clivatuzumab). Cada anticuerpo se redujo con ditiotreitol (DTT), usado en un exceso molar de 50 a 70 veces, en PBS 40 mM, pH 7,4, que contenía EDTA 5,4 mM, a 37° C (baño) durante 45 min. El producto reducido se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño y/o diafiltración, y se intercambió el tampón por un tampón adecuado a pH 6,5. El contenido de tiol se determinó mediante el ensayo de Ellman y estuvo en el intervalo de 6,5 a 8,5 sH/IgG. Alternativamente, los anticuerpos se redujeron con Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) en tampón de fosfato a pH en el intervalo de 5-7, seguido de conjugación in situ. El MAb reducido se hizo reaccionar con un exceso molar de ~10 a 15 veces de 'CL6-SN-38' del Ejemplo 1, o 'CL7-SN-38' del Ejemplo 2, o 'CL6-SN-38-10-0-CÜ2Et' del Ejemplo 3, o 'CL7-SN-38-10-0-CÜ2Et' del ejemplo 4, CL2A-SN-38 del ejemplo 6 o CL2E-SN-38 del ejemplo 7 usando dMs O al 7-15% v/v como cosolvente e incubando durante 20 min a temperatura ambiente. El conjugado se purificó por SEC centrifugada, paso a través de una columna hidrófoba y finalmente por ultrafiltración-diafiltración. El producto se ensayó para SN-38 mediante absorbancia a 366 nm y correlación con valores estándar, mientras que la concentración de proteína se dedujo de la absorbancia a 280 nm, corregida por el exceso de absorbancia de SN-38 a esta longitud de onda. De esta manera se determinaron las relaciones de sustitución SN-38/MAb. Los conjugados purificados se almacenaron como formulaciones liofilizadas en viales de vidrio, se taparon al vacío y se almacenaron en un congelador a -20° C. Las relaciones de sustitución molar (MSR) de SN-38 obtenidas para algunos de estos conjugados, que normalmente estaban en el intervalo de 5 a 7, se muestran en la Tabla 7.
T l 7: R l i n i i n m l r M R N- MA n l n n
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Ejemplo 9. Eficacias terapéuticas in vivo en modelos preclínicos de carcinoma pancreático o de colon humano
Se trataron ratones desnudos atímicos inmunocomprometidos (hembra), portadores de xenoinjertos subcutáneos de tumores pancreáticos o de colon humanos con conjugado CL2A-SN-38 específico o conjugado de control, o se dejaron sin tratar. Se observaron las eficacias terapéuticas de los conjugados específicos. La FIG. 1 muestra un modelo de tumor pancreático Capan 1, en donde los conjugados CL2A-SN-38 específicos de anticuerpos hRS7 (anti-EGP-1), hPAM4 (anti-mucina) y hMN-14 (anti-CEACAM5) mostraron mejores eficacias que el conjugado hA20-CL2A-SN-38 de control (anti-CD20) y control sin tratar. De manera similar, en un modelo BXPC3 de cáncer de páncreas humano, el hRS7-CL2A-SN-38 específico mostró una mejor eficacia terapéutica que los tratamientos de control (FIG. 2). De igual manera, en un modelo LS174T agresivo de carcinoma de colon humano, el tratamiento con hMN-14-CL2A-SN-38 específico fue más eficaz que la ausencia de tratamiento (FIG. 3).
Ejemplo de referencia 10. Terapia in vivo de metástasis pulmonares de tumores colónicos humanos GW-39 en ratones desnudos usando hMN-14-[CL1-SN-38] y hMN-14-[CL2-SN-38]
Se estableció un modelo metastásico de pulmón de carcinoma de colon en ratones desnudos mediante inyección i.v. de suspensión de tumor de colon humano GW-39, y la terapia se inició 14 días después. Se inyectaron conjugados de anticuerpos anti-CEACAM5 específicos, hMN14-CL1-SN-38 y hMN14-CL2-SN-38, así como conjugados de control de MAb anti-CD22 no dirigidos, hLL2-CL1-SN-38 y hLL2-CL2-SN-38 y mezclas equivalentes de hMN14 y SN-38 en un programa de dosis de q4dx8, usando diferentes dosis. La FIG. 4 (MSR = relación de sustitución molar de SN-38/anticuerpo) muestra efectos terapéuticos selectivos debido a los conjugados de hMN-14. A dosificaciones equivalentes de 250 pg, los ratones tratados con hMN14-CL1-SN-38 o hMN14-CL2-SN-38 mostraron una supervivencia mediana de más de 107 días. Los ratones tratados con los anticuerpos conjugados de control hLL2-CL1-SN-38 y hLL2-CL2-SN-38, que no se dirigen específicamente a las células de cáncer de pulmón, mostraron una supervivencia mediana de 56 y 77 días, mientras que los ratones tratados con hMN14 IgG no conjugado y SN-38 libre mostraron una supervivencia mediana de 45 días, comparable con el control de solución salina sin tratar de 43,5 días. Se observó claramente un aumento significativo y sorprendente en la eficacia del conjugado de anticuerpo-SN-38 dirigido a células cancerosas conjugado, que fue sustancialmente más eficaz que el anticuerpo no conjugado y el agente quimioterapéutico libre por sí solos. También se observó la sensibilidad a la dosis del efecto terapéutico del anticuerpo conjugado. Estos resultados demuestran la clara superioridad de los conjugados de SN-38-anticuerpo en comparación con el efecto combinado de tanto el anticuerpo no conjugado como el SN-38 libre en el mismo sistema de cáncer de pulmón humano in vivo.
Ejemplo 11. Uso de conjugado IgG-SN-38 anti-TROP-2 humanizado para el tratamiento eficaz de diversos cánceres epiteliales
Resumen
El propósito de este estudio era evaluar la eficacia de un conjugado de fármaco-anticuerpo (ADC) SN-38-anti-TROP-2 contra varios tipos de tumores sólidos humanos, y evaluar su tolerabilidad en ratones y monos, esto último con reactividad cruzada de tejido cruzado a hRS7 similar al de los humanos. Dos derivados de SN-38, CL2-SN-38 y CL2A-SN-38, se conjugaron con el anticuerpo humanizado anti-TROP-2, hRS7. Los inmunoconjugados se caracterizaron in vitro en cuanto a estabilidad, unión y citotoxicidad. La eficacia se probó en cinco modelos diferentes de xenoinjerto de tumor sólido humano que expresaban el antígeno TROP-2. La toxicidad se evaluó en ratones y en monos Cynomolgus.
Los conjugados de hRS7 de los dos derivados de SN-38 fueron equivalentes en sustitución de fármacos (~6), unión celular (Kd ~ 1,2 nmol/l), citotoxicidad (IC50 ~ 2,2 nmol/L) y estabilidad en suero in vitro (t/y2 ~ 20 horas). La exposición de las células al ADC demostró vías de señalización que llevan a la escisión de PARP, pero se observaron diferencias frente a SN-38 libre en la regulación por incremento de p53 y p21. Se produjeron efectos antitumorales significativos por hRS7-SN-38 en dosis no tóxicas en ratones portadores de tumores Calu-3 (P<0,05), Capan-1 (P<0,018), BxPC-3 (P<0,005) y COLO 205 (P<0,033) en comparación con los ADC de control no de direccionamiento. Los ratones toleraron una dosis de 2 x 12 mg/kg (equivalentes de SN-38) con elevaciones de corta duración solamente en los niveles de enzimas hepáticas ALT y AST. Los monos Cynomolgus infundidos con 2 x 0,96 mg/kg mostraron solo disminuciones transitorias en los recuentos sanguíneos, aunque, lo que es más importante, los valores no cayeron por debajo de los intervalos normales.
Concluimos que el ADC anti-TROP-2 hRS7-CL2A-SN-38 proporcionó efectos antitumorales significativos y específicos contra una variedad de tipos de tumores sólidos humanos. Fue bien tolerado en monos, con una expresión de TROP-2 tisular similar a la de los humanos. (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69).
Relevancia traslacional
El tratamiento con éxito con irinotecán de pacientes con tumores sólidos ha sido limitado debido en gran parte a la baja tasa de conversión del profármaco CPT-11 en el metabolito activo SN-38. Otros han examinado formas no dirigidas de SN-38 como un medio para evitar la necesidad de esta conversión y administrar SN-38 pasivamente a los tumores. Conjugamos SN-38 covalentemente con un anticuerpo anti-TROP-2 humanizado, hRS7. Este conjugado de anticuerpo-fármaco tiene efectos antitumorales específicos en una variedad de modelos de xenoinjerto de cáncer humano s.c., incluyendo el carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinomas de pulmón de células escamosas, pancreático y colorrectal, todos a dosis no tóxicas (por ejemplo, <3,2 mg/kg de dosis equivalente de SN-38 acumulativa).
TROP-2 se expresa ampliamente en muchos cánceres epiteliales, pero también en algunos tejidos normales y, por lo tanto, se realizó un estudio de aumento de dosis en monos Cynomolgus para evaluar la seguridad clínica de este conjugado. Los monos toleraron 24 mg de equivalentes de SN-38/kg con solo toxicidades menores y reversibles. Dados su direccionamiento al tumor y su perfil de seguridad, hRS7-SN-38 puede proporcionar una mejora en el tratamiento de tumores sólidos que responden al irinotecán.
Introducción
El antígeno de superficie celular del trofoblasto humano (TROP-2), también conocido como GA733-1 (antígeno gástrico 733-1), EGP-1 (glicoproteína epitelial-1) y TACSTD2 (transductor de señales de calcio asociado a tumores), se expresa en una variedad de carcinomas humanos y tiene significado pronóstico en algunos, estando asociado con una enfermedad más agresiva (ver, por ejemplo, Alberti et al., 1992, Hybridoma 11:539-45; Stein et al., 1993, Int J Cancer 55:938 -46; Stein et al., 1994, Int J Cancer Suppl. 8:98-102). Los estudios del papel funcional de TROP-2 en una línea celular de cáncer de páncreas de ratón transfectada con TROP-2 murino revelaron una proliferación aumentada en condiciones de suero bajo, migración y crecimiento independiente del anclaje in vitro, y tasa de crecimiento mejorada con evidencia de una expresión de Ki-67 aumentada in vivo y una probabilidad más alta de metástasis (Cubas et al., 2010, Mol Cancer 9:253).
La distribución del antígeno TROP-2 en muchos cánceres epiteliales lo convierte en un objetivo terapéutico atractivo. Stein y sus colaboradores (1993, Int J Cancer 55:938-46) caracterizaron un anticuerpo, designado RS7-3G11 (RS7), que se unía a EGP-1, que estaba presente en una serie de tumores sólidos, pero el antígeno también se expresaba en algunos tejidos normales, habitualmente con menor intensidad, o en regiones restringidas. Se documentaron eficacias terapéuticas y de direccionamiento en una serie de xenoinjertos de tumores humanos usando RS7 radiomarcado (Shih et al., 1995, Cancer Res 55:5857s-63s; Stein et al., 1997, Cancer 80:2636-41; Govindan et al., 2004, Breast Cancer Res Treat 84:173-82), pero este anticuerpo de internalización no mostró actividad terapéutica en forma no conjugada (Shih et al., 1995, Cancer Res 55:5857s-63s). Sin embargo, in vitro ha demostrado actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra carcinomas positivos para TROP-2.
Informamos la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) usando una IgG anti-CEACAM5 (CD66e) acoplada a varios derivados de SN-38, un inhibidor de la topoisomerasa-I que es el componente activo del irinotecán, o CPT-11 (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61). Los derivados variaron en sus propiedades de estabilidad sérica in vitro, y los estudios in vivo encontraron que una forma (designada como CL2) era más eficaz para prevenir o detener el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas y colón humano que otros enlaces con mayor o menor estabilidad.
Es importante destacar que estos efectos se produjeron a dosis no tóxicas, y las pruebas iniciales no pudieron determinar una toxicidad limitante de la dosis (Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15: 6052-61). Estos resultados fueron alentadores, pero también sorprendentes, porque el anticuerpo CEACAM5 no se internaliza, una propiedad que se considera crítica para el éxito de un ADC. Especulamos que la actividad terapéutica del conjugado anti-CEACAM5-SN-38 podría estar relacionada con la liberación lenta de SN-38 dentro del tumor después de la localización del anticuerpo. Como el irinotecán funciona mejor cuando las células están expuestas durante la fase S de su ciclo de crecimiento, se espera que una liberación sostenida mejore las respuestas. De hecho, el SN-38 acoplado a agentes extensores del plasma no de direccionamiento, como el polietilenglicol (PEG) o las micelas, ha demostrado una mayor eficacia que el irinotecán o el SN-38 solos (por ejemplo, Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66:10048- 56), dando un apoyo adicional a este mecanismo.
Dada la amplia reactividad del anticuerpo RS7 con los cánceres epiteliales y su capacidad de internalización, planteamos la hipótesis de que un conjugado de RS7-SN-38 podría beneficiarse no solo de la liberación sostenida del fármaco, sino también de la administración intracelular directa. Por lo tanto, preparamos y probamos la eficacia de los conjugados de SN-38 usando una versión humanizada del anticuerpo murino RS7 (hRS7). Se realizó una ligera modificación al derivado de SN-38 (Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61), que mejoró la calidad del conjugado sin alterar su estabilidad in vitro ni su eficacia in vivo. Este nuevo derivado (designado CL2A) es actualmente el agente preferido para el acoplamiento de SN-38 a anticuerpos. En la presente, mostramos la eficacia del conjugado hRS7-SN-38 en varias líneas celulares de cáncer epitelial implantadas en ratones desnudos a dosificaciones no tóxicas, y otros estudios revelan que se podrían tolerar dosis sustancialmente más altas. Más importante, los estudios de toxicidad en monos que también expresan TROP-2 en tejidos similares a los humanos mostraron que hRS7-SN-38 fue tolerado en cantidades apreciablemente más altas que la dosis terapéuticamente eficaz en ratones, proporcionando evidencia de que este conjugado es un agente prometedor para tratar pacientes con una amplia variedad de cánceres epiteliales.
Materiales y métodos
Líneas celulares, anticuerpos y agentes quimioterapéuticos. Todas las líneas celulares de cáncer humano usadas en este estudio se adquirieron de la American Type Culture Collection. Estos incluyen Calu-3 (carcinoma de pulmón de células no pequeñas), SK-MES-1 (carcinoma de pulmón de células escamosas), COLO 205 (adenocarcinoma de colon), Capan-1 y BxPC-3 (adenocarcinomas de páncreas) y PC-3 (adenocarcinomas de próstada). Los anticuerpos IgG RS7 humanizado y anti-CD20 humanizado de control (hA20 IgG, veltuzumab) y anti-CD22 (hLL2 IgG, epratuzumab) se prepararon en Immunomedics, Inc. El irinotecán (20 mg/ml) se obtuvo de Hospira, Inc.
Inmunoconjugados SN-38 y aspectos in vitro. La síntesis de CL2-SN-38 se ha descrito anteriormente (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26). Su conjugación con hRS7 IgG y la estabilidad del suero se realizaron como se describe (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61). Las preparaciones de CL2A-SN-38 (MW 1480) y su conjugado hRS7 y los estudios de estabilidad, unión y citotoxicidad se realizaron como se ha descrito anteriormente (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26). Se prepararon lisados celulares y se realizó inmunotransferencia para p21Waf1/Cip, p53 y PARP (poli-ADP-ribosa polimerasa).
Estudios terapéuticos in vivo. Para todos los estudios en animales, las dosis de inmunoconjugados de SN-38 e irinotecán se muestran en equivalentes de SN-38. En base a una proporción de sustitución media de SN-38/IgG de 6, una dosis de 500 pg de a Dc para un ratón de 20 g (25 mg/kg) contiene 0,4 mg/kg de SN-38. Las dosis de irinotecán se muestran de igual manera como equivalentes de SN-38 (es decir, 40 mg de irinotecán/kg equivalen a 24 mg/kg de SN-38). Se adquirieron ratones desnudos atímicos (nu/nu) hembra NCr, de 4 a 8 semanas de edad, y ratones macho Swiss-Webster, de 10 semanas de edad, de Taconic Farms. Se realizaron estudios de tolerabilidad en monos Cynomolgus (Macaca fascicularis;2,5-4 kg macho y hembra) por SNBL USA, Ltd. Se implantaron a los animales por vía subcutánea diferentes líneas celulares de cáncer humano. El volumen tumoral (TV) se determinó mediante mediciones en 2 dimensiones usando calibres, con volúmenes definidos como: L x w2/2, donde L es la dimensión más larga del tumor y w es la más corta. Los tumores variaron en tamaño entre 0,10 y 0,47 cm3 cuando comenzó la terapia. Los regímenes de tratamiento, las dosificaciones y el número de animales en cada experimento se describen en los Resultados. El hRS7-CL2A-SN-38 liofilizado y el ADC de control se reconstituyeron y diluyeron según se requirió en solución salina estéril. Todos los reactivos se administraron por vía intraperitoneal (0,1 ml), excepto el irinotecán, que se administró por vía intravenosa. El régimen de dosificación estuvo influenciado por nuestras investigaciones anteriores, donde el ADC se administró cada 4 días o dos veces por semana durante períodos de tiempo variables (Moon et al., 2008, J Med Chem 51: 6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61). Esta frecuencia de dosificación reflejó una consideración de la vida media en suero del conjugado in vitro, para permitir una exposición más continua al ADC.
Estadísticas. Las curvas de crecimiento se determinaron como cambio porcentual en el TV inicial a lo largo del tiempo. El análisis estadístico del crecimiento tumoral se basó en el área bajo la curva (AUC). Los perfiles de crecimiento tumoral individual se obtuvieron a través de modelos de curvas lineales. Se empleó una prueba f para determinar la igualdad de varianza entre grupos antes del análisis estadístico de las curvas de crecimiento. Se usó una prueba t de 2 colas para evaluar la significancia estadística entre los varios grupos de tratamiento y controles, excepto para el control de solución salina, donde se usó una prueba t de 1 cola (significancia en P < 0,05). Las comparaciones estadísticas de AUC se realizaron solo hasta el momento en que el primer animal dentro de un grupo fue sacrificado debido a la progresión.
Farmacocinética y biodistribución. Se inyectaron hRS7-CL2A-SN-38 y hRS7 IgG radiomarcados con 111In en ratones desnudos que tenían tumores SK-MES-1 s.c. (~0,3 cm3). A un grupo se le inyectó por vía intravenosa 20 |jC¡ (250 |jg de proteína) de INIn-hRS7-CL2A-SN-38, mientras que otro grupo recibió 20 jC i (250 |jg de proteína) de 111In-hRS7 IgG. En varios puntos temporales, los ratones (5 por punto temporales) fueron anestesiados, sangrados mediante punción intracardíaca y luego se sacrificaron. Se extirparon los tumores y varios tejidos, sepesaron y contaron mediante centelleo y para determinar el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g). A un tercer grupo se le inyectaron 250 jg de hRS7-CL2A-SN-38 sin marcar 3 días antes de la administración de 111InhRS7-CL2A-SN-38 y también se les realizó necropsia. Se usó una prueba t de 2 colas para comparar la captación de hRS7-CL2A-SN-38 y hRS7 IgG después de determinar la igualdad de varianza usando la prueba f. El análisis farmacocinético de la depuración sanguínea se realizó usando el software WinNonLin (Parsight Corp.).
Tolerabilidad en ratones Swiss-Webster y monos Cynomolgus. Brevemente, los ratones se clasificaron en 4 grupos cada uno para recibir inyecciones i.p. de 2 ml de un control de tampón de acetato de sodio o 3 dosis diferentes de hRS7-CL2A-SN-38 (4, 8 o 12 mg/kg de SN-38) en los días 0 y 3 seguido de la recogida de sangre y suero, como se describe en los Resultados. A los monos Cynomolgus (3 machos y 3 hembras; 2,5-4,0 kg) se les administraron 2 dosis diferentes de hRS7-CL2A-SN-38. Las dosis, tiempos y número de monos de los que se sacó sangre para la evaluación de posibles toxicidades hematológicas y químicas séricas se describen en los Resultados. Resultados
Estabilidad y potencia de hRS7-CL2A-SN-38. Se usaron dos enlaces diferentes para conjugar SN-38 con hRS7 IgG. El primero se denomina CL2-SN-38 y se ha descrito anteriormente (Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26; Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61). Se realizó un cambio menor en la síntesis del conector CL2 en el sentido de que se eliminó la fracción de fenilalanina. Este cambio simplificó la síntesis, pero no afectó al resultado de la conjugación (por ejemplo, tanto CL2-SN-38 como CL2A-SN-38 incorporaron ~6 SN-38 por molécula de IgG). Las comparaciones en paralelo no encontraron diferencias significativas en la estabilidad del suero, la unión al antígeno o la citotoxicidad in vitro (no mostrado).
Para confirmar que el cambio en el conector SN-38 de CL2 a CL2A no afectó a la potencia in vivo, se compararon hRS7-CL2A y hRS7-CL2-SN-38 en ratones con tumores COLO 205 o Capan-1 (no mostrado), usando 0,4 mg o 0,2 mg/kg de s N-38 dos veces por semana x 4 semanas, respectivamente, y con tumores iniciales de 0,25 cm3 de tamaño en ambos estudios. Tanto los conjugados de hRS7-CL2A como de CL2-SN-38 inhibieron significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los no tratados (AUC14 días P < 0,002 frente a solución salina en el modelo COLO 205; AUC21 días P <0,001 frente a solución salina en el modelo Capan-1), y un ADC de control anti-CD20 no de direccionamiento, hA20-CL2A-SN-38 (AUC14 días P < 0,003 en el modelo COlO-205; AUC35 días: P <0,002 en modelo Capan-1). Al final del estudio (día 140) en el modelo Capan-1, el 50% de los ratones tratados con hRS7-CL2A-SN-38 y el 40% de los ratones hRS7-CL2-SN-38 estaban libres de tumores, mientras que sólo el 20% de los animales tratados con hA20-ADC no tenían signos visibles de enfermedad. Es importante destacar que no hubo diferencias en la eficacia entre los 2 conjugados específicos en ambos modelos tumorales.
Mecanismo de acción. Los estudios de citotoxicidad in vitro demostraron que hRS7-CL2A-SN-38 tenía valores de IC50 en el intervalo de nmol/l contra varias líneas de tumores sólidos diferentes (Tabla 8). La IC50 con SN38 libre fue menor que el conjugado en todas las líneas celulares. Aunque no hubo correlación entre la expresión de TROP-2 y la sensibilidad a hRS7-CL2A-SN-38, la relación IC50 del AdC frente al SN-38 libre fue menor en las células con mayor expresión de TROP-2, lo que muy probablemente refleja la mayor capacidad de internalizar el fármaco cuando hay más antígeno presente.
Tabla 8. Expresión de TROP-2 y citotoxicidad in vitro de SN-38 y hRS7-SN-38 en varias líneas tumorales sólidas
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Se sabe que SN-38 activa varias vías de señalización en las células, lo que lleva a la apoptosis. Nuestros estudios iniciales examinaron la expresión de 2 proteínas implicadas en eventos de señalización temprana (p21Waf1/Cip1 y p53) y 1 evento apoptótico tardío [escisión de poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP)] in vitro (no mostrado). En BxPC-3, SN-38 llevó a un aumento de 20 veces en la expresión de p21Waf1/Cip1, mientras que hRS7-CL2A-SN-38 resultó en solo un aumento de 10 veces, un descubrimiento consistente con la mayor actividad con SN-libre. 38 en esta línea celular (Tabla 8). Sin embargo, hRS7-CL2A-SN-38 aumentó la expresión de p21Waf1/Cip1 en Calu-3 más de 2 veces sobre el SN-38 libre (no mostrado).
Se observó una mayor disparidad entre los eventos de señalización mediados por hRS7-CL2A-SN-38 y SN-38 libre en la expresión de p53. Tanto en BxPC-3 como en Calu-3, la regulación por incremento de p53 con SN-38 libre no fue evidente hasta las 48 horas, mientras que hRS7-CL2A-SN-38 reguló por incremento p53 en 24 horas (no mostrado). Además, la expresión de p53 en células expuestas a ADC fue mayor en ambas líneas celulares en comparación con SN-38 (no mostrado). Curiosamente, aunque hRS7 IgG no tuvo un efecto apreciable sobre la expresión de p21Waf1/Cip1, indujo la regulación por incremento de p53 tanto en BxPC-3 como en Calu-3, pero solo después de una exposición de 48 horas. En términos de eventos apoptóticos posteriores, la escisión de PARP fue evidente en ambas líneas celulares cuando se incubaron con SN-38 o el conjugado (no mostrado). La presencia de la PARP escindida fue mayor a las 24 horas en BxPC-3, lo que se correlaciona con una alta expresión de p21 y su IC50 más baja. El mayor grado de escisión con SN-38 libre sobre el ADC fue consistente con los descubrimientos de citotoxicidad.
Eficacia de hRS7-SN-38. Debido a que TROP-2 se expresa ampliamente en varios carcinomas humanos, se realizaron estudios en varios modelos de cáncer humano diferentes, que comenzaron con una evaluación del enlace de hRS7-CL2-SN-38, pero más tarde se usaron conjugados con el enlace CL2A. A los ratones desnudos portadores de Calu-3 que se les dieron 0,04 mg de SN-38/kg de hRS7-CL2-SN-38 cada 4 días x 4 tuvieron una respuesta significativamente mejorada en comparación con los animales a los que se administró la cantidad equivalente de hLL2-CL2-SN-38 (TV = 0,14 ± 0,22 cm3 frente a 0,80 ± 0,91 cm3, respectivamente, AUC42 días P < 0,026; FIG. 5A). Se observó una respuesta a la dosis cuando se aumentó la dosis a 0,4 mg/kg de SN-38. A este nivel de dosis más alto, todos los ratones a los que se les dio el conjugado específico de hRS7 se "curaron" en el plazo de 28 días y permanecieron libres de tumores hasta el final del estudio el día 147, mientras que los tumores volvieron a crecer en los animales tratados con el ADC irrelevante (específico frente a irrelevante AUC98 días: P = 0,05). En ratones que recibieron la mezcla de hRS7 IgG y SN-38, los tumores progresaron >4,5 veces el día 56 (TV = 1,10 ± 0,88 cm3; AUC56 días P < 0,006 frente a hRS7-CL2-SN-38).
También se examinó la eficacia en xenoinjertos de tumores humanos colónicos (COLO 205) y pancreáticos (Capan-1). En animales portadores de tumores c OlO 205, (FIG. 5B), hRS7-CL2-SN-38 (0,4 mg/kg, q4dx8) impidió el crecimiento tumoral durante el período de tratamiento de 28 días con tumores significativamente más pequeños en comparación con el control ADC anti-CD20 (hA20-CL2-SN-38), o hRS7 IgG (TV = 0,16 ± 0,09 cm3, 1,19 ± 0,59 cm3 y 1,77 ± 0,93 cm3, respectivamente; AUC28 días P < 0,016). La MTD de irinotecán (24 mg SN-38/kg, q2dx5) fue tan eficaz como hRS7-CL2-SN-38, porque el suero de ratón puede convertir el irinotecán en SN-38 de manera más eficiente que el suero humano, pero la dosis de SN-38 en el irinotecán (2400 pg acumulativos) fue 37,5 veces mayor que con el conjugado (64 pg en total).
Los animales que portaban Capan-1 no mostraron una respuesta significativa al irinotecán solo cuando se les administró una dosis de SN-38 equivalente al conjugado hRS7-CL2-SN-38 (por ejemplo, en el día 35, el tamaño tumoral medio fue de 0,04 ± 0,05 cm3 en animales a los que se les administraron 0,4 mg de SN-38/kg hRS7-SN-38 frente a 1,78 ± 0,62 cm3 en animales tratados con irinotecán a los que se les administraron 0,4 mg/kg de SN-38 AUCdía35 P < 0,001; FIG. 5C). Cuando la dosis de irinotecán se aumentó 10 veces a 4 mg/kg de SN-38, la respuesta mejoró, pero aún no fue tan significativa como el conjugado al nivel de dosis de 0,4 mg/kg de SN-38 (TV = 0,17 ± 0,18 cm3 frente a 1,69 ± 0,47 cm 3, AUCdía49 P < 0,001). Una dosis igual de hA20-CL2-SN-38 de no direccionamiento también tuvo un efecto antitumoral significativo en comparación con los animales tratados con irinotecán, pero el conjugado específico de hRS7 fue significativamente mejor que el ADC irrelevante (TV = 0,17 ± 0,18 cm3 frente a 0,80 ± 0,68 cm3, AUCdía49 P < 0,018).
Los estudios con el ADC hRS7-CL2A-SN-38 se ampliaron luego a otros 2 modelos de cánceres epiteliales humanos. En ratones portadores de tumores pancreáticos humanos BxPC-3 (FIG. 5D), hRS7-CL2A-SN-38 volvió a inhibir significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los ratones de control tratados con solución salina o una cantidad equivalente de hA20-CL2A-SN-38 no de direccionamiento (TV = 0,24 ± 0,11 cm3 frente a 1,17 ± 0,45 cm3 y 1,05 ± 0,73 cm3, respectivamente; AUCdía21 P < 0,001), o irinotecán administrado a una dosis equivalente a SN-38 10 veces superior (TV = 0,27 ± 0,18 cm3 frente a 0,90 ± 0,62 cm3, respectivamente; AUCdía25 p < 0,004). Curiosamente, en ratones portadores de tumores de pulmón de células escamosas humanas SK-MES-1 tratados con 0,4 mg/kg de ADC (FIG. 5E), la inhibición del crecimiento tumoral fue superior a la solución salina o hRS7 IgG no conjugada (TV = 0,36 ± 0,25 cm3 frente a 1,02 ± 0,70 cm3 y 1,30 ± 1,08 cm3, respectivamente; AUC28 días, P < 0,043), pero el hA20-CL2A-SN-38 no de direccionamiento o la MTD de irinotecán proporcionó los mismos efectos antitumorales que el conjugado específico de hRS7-SN-38. En todos los estudios murinos, el ADC hRS7-SN-38 fue bien tolerado en términos de pérdida de peso corporal (no mostrado).
Biodistribución de hRS7-CL2A-SN-38. Las biodistribuciones de hRS7-CL2A-SN-38 o hRS7 IgG no conjugado se compararon en ratones portadores de xenoinjertos de carcinoma de pulmón de células escamosas humanas SK-MES-1 (no mostrado), usando los respectivos sustratos marcados con 111In. Se realizó un análisis farmacocinético para determinar la depuración de hRS7-CL2A-SN-38 con respecto a hRS7 no conjugado (no mostrado). El ADC se depuró más rápido que la cantidad equivalente de hRS7 no conjugado, y el ADC mostró una vida media y un tiempo de residencia medio ~40% más cortos. No obstante, esto tuvo un impacto mínimo en la captación del tumor (no mostrado). Aunque hubo diferencias significativas en los puntos temporales de 24 y 48 horas, a las 72 horas (captación máxima) las cantidades de ambos agentes en el tumor eran similares. Entre los tejidos normales, las diferencias hepáticas y esplénicas fueron las más llamativas (no mostrado). A las 24 horas después de la inyección, había >2 veces más hRS7-CL2A-SN-38 en el hígado que hRS7 IgG. Por el contrario, en el bazo había 3 veces más hRS7 IgG parental presente en la captación máxima (punto temporal de 48 horas) que hRS7-CL2A-SN-38. La captación y la depuración en el resto de los tejidos reflejó generalmente diferencias en la concentración en sangre.
Debido a que se administraron dosis dos veces por semana para la terapia, se examinó la captación tumoral en un grupo de animales que habían recibido primero una dosis previa de 0,2 mg/kg (250 pg de proteína) del ADC hRS73 días antes de la inyección del anticuerpo marcado con 111In. La captación tumoral de 111In-hRS7-CL2A-SN-38 en ratones predosificados se redujo sustancialmente en cada punto temporal en comparación con los animales que no recibieron la predosis (por ejemplo, a las 72 horas, la captación tumoral predosificada fue del 12,5% ± 3,8% DI/g frente a 25,4% ± 8,1% ID/g en animales que no recibieron la predosis; P = 0,0123). La predosificación no tuvo un impacto apreciable sobre la depuración sanguínea o la captación tisular (no mostrado). Estos estudios sugieren que en algunos modelos tumorales, la acumulación tumoral del anticuerpo específico puede reducirse con la o las dosis precedentes, lo que probablemente explica por qué la especificidad de una respuesta terapéutica podría disminuir con dosis de ADC crecientes y por qué no está indicado un aumento de dosis adicional.
Tolerabilidad de hRS7-CL2A-SN-38 en ratones Swiss-Webster y monos Cynomolgus. Los ratones Swiss-Webster toleraron 2 dosis durante 3 días, cada una de 4, 8 y 12 mg de SN-38/kg de hRS7-CL2A-SN-38, con una pérdida de peso transitoria mínima (no mostrado). No se produjo toxicidad hematopoyética y las químicas en suero solo revelaron niveles elevados de aspartato transaminasa (AST) y alanina transaminasa (no mostrado). Siete días después del tratamiento, la AST aumentó por encima de los niveles normales (>298 U/l) en los 3 grupos de tratamiento (no mostrado), con la proporción más grande de ratones en el grupo de 2 x 8 mg/kg. Sin embargo, a los 15 días después del tratamiento, la mayoría de los animales estaban dentro del intervalo normal. Los niveles de ALT también estaban por encima del intervalo normal (>77 U/l) en el plazo de 7 días de tratamiento (no mostrado) y con evidencia de normalización el día 15. Los hígados de todos estos ratones no mostraron evidencia histológica de daño tisular (no mostrado). En cuanto a la función renal, sólo los niveles de glucosa y cloruro estaban algo elevados en los grupos tratados. Con 2 x 8 mg/kg, 5 de 7 ratones tenían niveles de glucosa ligeramente elevados (intervalo de 273-320 mg/dl, extremo superior de 263 mg/dl normales) que volvieron a la normalidad 15 días después de la inyección. De manera similar, los niveles de cloruro estaban ligeramente elevados, variando de 116 a 127 mmol/l (extremo superior del intervalo normal de 115 mmol/l) en los 2 grupos de dosis más altas (57% en el grupo de 2 x 8 mg/kg y 100% de los ratones en el grupo de de 2 x 12 mg/kg), y permanecieron elevados hasta 15 días después de la inyección. Esto también podría ser indicativo de toxicidad gastrointestinal, porque la mayor parte del cloruro se obtiene a través de la absorción en el intestino; sin embargo, al terminar, no hubo evidencia histológica de daño tisular en ningún sistema de órganos examinado (no mostrado).
Como los ratones no expresan TROP-2 unida por hRS7, se requirió un modelo más adecuado para determinar el potencial del conjugado hRS7 para uso clínico. Los estudios de inmunohistología revelaron la unión en múltiples tejidos tanto en humanos como en monos Cynomolgus (mama, ojo, tracto gastrointestinal, riñón, pulmón, ovario, trompa de Falopio, páncreas, paratiroides, próstata, glándula salival, piel, timo, tiroides, amígdala, uréter, orina vejiga y útero; no mostrado). En base a esta reactividad cruzada, se realizó un estudio de tolerabilidad en monos.
El grupo que recibió 2 x 0,96 mg de SN-38/kg de hRS7-CL2A-SN-38 no tuvo eventos clínicos significativos después de la infusión y hasta la finalización del estudio. La pérdida de peso no superó el 7,3% y volvió a los pesos de aclimatación el día 15. Se observaron disminuciones transitorias en la mayoría de los datos del hemograma (no mostrado), pero los valores no cayeron por debajo de los intervalos normales. No se encontraron valores anormales en las químicas del suero. La histopatología de los animales a los que se les realizó la necropsia el día 11 (8 días después de la última inyección) mostró cambios microscópicos en los órganos hematopoyéticos (timo, ganglios linfáticos mandibulares y mesentéricos, bazo y médula ósea), órganos gastrointestinales (estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon y recto), los órganos reproductivos femeninos (ovario, útero y vagina) y en el sitio de la inyección. Estos cambios variaron de mínimos a moderados y se revirtieron por completo al final del período de recuperación (día 32) en todos los tejidos, excepto en el timo y el tracto gastrointestinal, que tendían a una recuperación completa en este punto temporal posterior.
Al nivel de dosis de 2 x 1,92 mg de SN-38/kg del conjugado, hubo 1 muerte por complicaciones gastrointestinales y supresión de la médula ósea, y otros animales dentro de este grupo mostraron eventos adversos similares, pero más graves que los del grupo de 2 x 0,96 mg /kg. Estos datos indican que las toxicidades limitantes de la dosis fueron idénticas a las del irinotecán; concretamente, intestinal y hematológico. Por tanto, la MTD para hRS7-CL2A-SN-38 se encuentra entre 2 x 0,96 y 1,92 mg de SN-38/kg, lo que representa una dosis equivalente en humanos de 2 x 0,3 a 0,6 mg/kg de SN-38.
Análisis
TROP-2 es una proteína expresada en muchos tumores epiteliales, incluyendo los cánceres de pulmón, mama, colorrectal, páncreas, próstata y ovario, lo que la convierte en un objetivo potencialmente importante para la administración de agentes citotóxicos. El anticuerpo RS7 se internaliza cuando se une a TROP-2 (Shih et al., 1995, Cancer Res 55:5857s-63s), lo que permite la administración intracelular directa de citotóxicos.
La conjugación de fármacos quimioterapéuticos con anticuerpos se ha explorado durante más de 30 años. Debido a que una parte sustancial de un ADC no es procesada por el tumor, sino por los tejidos normales, hay riesgo de que estos agentes sean demasiado tóxicos para los sistemas de órganos normales antes de alcanzar el nivel terapéutico en los tumores. Al igual que con cualquier agente terapéutico, la ventana terapéutica es un factor clave que determina el potencial de un ADC y, por lo tanto, en lugar de examinar fármacos "ultratóxicos", elegimos SN-38 como el componente farmacológico del ADC dirigido a TROP-2.
SN-38 es un potente inhibidor de la topoisomerasa-I, con valores de IC50 en el intervalo nanomolar en varias líneas celulares. Es la forma activa del profármaco, irinotecán, que se usa para el tratamiento del cáncer colorrectal y que también tiene actividad en los cánceres de pulmón, mama y cerebro. Razonamos que un SN-38 dirigido directamente, en forma de ADC, sería una terapia significativamente mejorada sobre CPT-11, al superar la bioconversión baja y variable del paciente de este último a SN-38 activo.
El péptido Phe-Lys insertado en el derivado CL2 original permitió una posible escisión a través de la catepsina B. En un esfuerzo por simplificar el proceso de síntesis, en CL2A, se eliminó la fenilalanina y, por tanto, se eliminó el sitio de escisión de la catepsina B. Curiosamente, este producto tenía un perfil cromatográfico mejor definido en comparación con el perfil amplio obtenido con CL2 (no mostrado), pero lo que es más importante, este cambio no tuvo impacto en la unión, la estabilidad o la potencia del conjugado en las pruebas en pralelo. Estos datos sugieren que SN-38 en CL2 se liberó del conjugado principalmente por la escisión en el enlace de carbonato de bencilo sensible al pH con el anillo de lactona de SN-38 y no por el sitio de escisión de la catepsina B.
La citotoxicidad in vitro de hRS7 ADC frente a una variedad de líneas de células de tumores sólidos tuvo consistentemente valores de IC50 en el intervalo de nmol/l. Sin embargo, las células expuestas a SN-38 libre demostraron un valor de IC50 más bajo en comparación con el ADC. Esta disparidad entre SN-38 libre y conjugado también se informó para ENZ-2208 (Sapra et al., 2008, Clin Cancer Res 14:1888-96) y NK012 (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66:10048-56).). ENZ-2208 utiliza un PEG ramificado para unir de aproximadamente 3,5 a 4 moléculas de SN-38 por PEG, mientras que NK012 es una nanopartícula de micela que contiene un 20% de SN-38 en peso. Con nuestro ADC, esta disparidad (es decir, la proporción de potencia con SN-38 libre frente a conjugado) disminuyó a medida que aumentaban los niveles de expresión de TROP-2 en las células tumorales, lo que sugiere una ventaja para la administración dirigida del fármaco. En términos de estabilidad sérica in vitro, las formas CL2- y CL2A-SN-38 de hRS7-SN-38 proporcionaron una t/y2 de ~20 horas, lo que contrasta con la breve t/y2 de 12,3 minutos informada para ENZ-2208 (Zhao et al., 2008, Bioconjug Chem 19:849-59), pero similar a la liberación del 57% de SN-38 de NK012 en condiciones fisiológicas después de 24 horas (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66: 10048-56).
El tratamiento de ratones portadores de tumores con hRS7-SN-38 (ya sea con CL2-SN-38 o con CL2A-SN-38) inhibió significativamente el crecimiento del tumor en 5 modelos de tumores diferentes. En 4 de ellos, se observaron regresiones tumorales y, en el caso de Calu-3, todos los ratones que recibieron la dosis más alta de hRS7-SN-38 estaban libres de tumores al finalizar el estudio. A diferencia de los humanos, el irinotecán se convierte de manera muy eficiente en SN-38 mediante una esterasa plasmática en ratones, con una tasa de conversión de más del 50% y con una mayor eficacia en ratones que en humanos. Cuando se administró irinotecán a niveles de SN-38 10 veces más altos o equivalentes, hRS7-SN-38 fue significativamente mejor en el control del crecimiento tumoral. Solo cuando se administró irinotecán en su MTD de 24 mg/kg q2dx5 (37,5 veces más SN-38) igualó la eficacia de hRS7-SN-38. En pacientes, esperamos que esta ventaja favorezca incluso más a hRS7-CL2A-SN-38, porque la bnioconversión del irinotecán sería sustancialmente más baja.
También demostramos en algunas líneas celulares que expresan antígenos, como SK-MES-1, que el uso de un ADC de unión a antígeno no garantiza mejores respuestas terapéuticas que un conjugado irrelevante que no se une. Este no es un descubrimiento inusual o inesperado. De hecho, los conjugados de SN-38 que no se unen mencionados anteriormente mejoran la actividad terapéutica en comparación con el irinotecán, por lo que se espera que un conjugado de IgG-SN-38 irrelevante tenga cierta actividad. Esto está relacionado con el hecho de que los tumores tienen vasos inmaduros con fugas que permiten el paso de macromoléculas mejor que los tejidos normales. Con nuestro conjugado, el 50% del SN-38 se liberará en ~13 horas cuando el pH se reduzca a un nivel que imite los niveles lisosomales (por ejemplo, pH 5,3 a 37° C; datos no mostrados), mientras que, al pH neutro de suero, la tasa de liberación se reduce casi 2 veces. Si un conjugado irrelevante se introduce en un microambiente tumoral ácido, se espera que libere algo de SN-38 localmente. Otros factores, como la fisiología del tumor y las sensibilidades innatas al fármaco, también desempeñarán un papel en la definición de esta actividad "de referencia". Sin embargo, un conjugado específico con un tiempo de residencia más largo debería tener una potencia mejorada sobre esta respuesta de referencia siempre que haya suficiente antígeno para capturar el anticuerpo específico. Los estudios de biodistribución en el modelo SK-MES-1 también mostraron que, si el antígeno tumoral se satura como consecuencia de dosificación sucesiva, se reduce la captación tumoral del conjugado específico, lo que produce resultados terapéuticos similares a los encontrados con un conjugado irrelevante.
Aunque es un desafío hacer comparaciones directas entre nuestro ADC y los informes publicados de otros agentes de administración de SN-38, pueden hacerse algunas observaciones generales. En nuestros estudios de terapia, la dosis individual más alta fue de 0,4 mg/kg de SN-38. En el modelo Calu-3, solo se administraron 4 inyecciones para una dosis total acumulada de 1,6 mg/kg de SN-38 o 32 pg de SN-38 en un ratón de 20 g. Se realizaron múltiples estudios con ENZ-2208 usando su MTD de 10 mg/kg x 5, y los estudios preclínicos con NK012 implicaron su MTD de 30 mg/kg x 3. Por tanto, se obtuvieron efectos antitumorales significativos con hRS7-SN-38 a los 30 veces y 55 veces menos equivalentes de SN-38 que las dosis informadas en ENZ-2208 y NK012, respectivamente. Incluso con 10 veces menos de hRS7 ADC (0,04 mg/kg), se observaron efectos antitumorales significativos, mientras que no se presentaron dosis más bajas de ENZ-2208, y cuando la dosis de NK012 se disminuyó 4 veces a 7,5 mg/kg, se perdió eficacia (Koizumi et al., 2006, Cancer Res 66:10048-56). Los ratones normales no mostraron toxicidad aguda con una dosis acumulada durante 1 semana de 24 mg/kg de SN-38 (1500 mg/kg del conjugado), lo que indica que la MTD era mayor. Por tanto, los animales portadores de tumores fueron tratados eficazmente con cantidades de equivalentes de SN-38 de 7,5 a 15 veces menores.
Como inhibidor de la topoisomerasa-I, SN-38 induce un daño significativo al ADN de una célula, con una regulación por incremento de p53 y p21WAF1/Cip1 que da como resultado la activación de la caspasa y la escisión de PARP. Cuando expusimos las células BxPC-3 y Calu-3 a nuestro ADC, tanto p53 como p21WAF1/Cip1 fueron regulados por incremento por encima de los niveles de referencia. Además, la escisión de PARp también fue evidente en ambas líneas celulares, lo que confirma un evento apoptótico en estas células. De interés fue la mayor regulación por incremento de p21WAF1/Cip1 en BxPC-3 y Calu-3 con respecto a p53 tanto por SN-38 libre como por nuestro hRS7-SN-38. Esto puede ser indicativo del estado mutacional de p53 en estas 2 líneas celulares y el uso de una vía independiente de p53 para la apoptosis mediada por p21WAF1/Cip1.
Una observación interesante fue la regulación por incremento temprana de p53 tanto en BxPC-3 como en Calu-3 a las 24 horas mediada por el hRS7-ADC con respecto al SN-38 libre. Incluso la IgG hRS7 desnuda podría regular por incremento p53 en estas líneas celulares, aunque solo después de una exposición de 48 horas. La sobreexpresión y la reticulación de TROP-2 por parte de los anticuerpos se han relacionado con varios eventos de señalización relacionados con MAPK, así como con la liberación de calcio intracelular. Si bien la unión de hRS7 no fue suficiente para inducir la apoptosis en BxPC-3 y Calu-3, como lo demuestra la falta de escisión de PARP, puede ser suficiente para cebar una célula, de tal manera que la inclusión de SN-38 conjugado con hRS7 puede llevar a un mayor efecto sobre la inhibición del crecimiento tumoral. Actualmente se están realizando estudios para comprender qué vías están implicadas con la administración de hRS7 de SN-38 y cómo pueden diferir del SN-38 libre, y que efecto puede desempeñas el estado de p53 en esta señalización.
Los estudios de biodistribución revelaron que hRS7-CL2A-SN-38 tenía una captación tumoral similar a la hRS7 IgG parental, pero se depuraba sustancialmente más rápido con una captación hepática 2 veces mayor, lo que puede deberse a la hidrofobicidad de SN-38. Con la depuración del ADC a través del hígado, se esperaba que las toxicidades hepáticas y gastrointestinales fueran limitantes de la dosis. Aunque los ratones tenían evidencias de aumento de las transaminasas hepáticas, la toxicidad gastrointestinal fue leve en el mejor de los casos, con solo una pérdida transitoria de peso y no se observaron anomalías en el examen histopatológico. Curiosamente, no se observó toxicidad hematológica. Sin embargo, los monos mostraron un perfil de toxicidad idéntico al esperado para el irinotecán, siendo la toxicidad gastrointestinal y hematológica limitante de la dosis.
Debido a que TROP-2 reconocido por hRS7 no se expresa en ratones, era de vital importancia realizar estudios de toxicidad en monos que tienen una expresión tisular de TROP-2 similar a la de los humanos. Los monos toleraron 0,96 mg/kg/dosis (~12 mg/m2) con toxicidad leve y reversible, que se extrapola a una dosis humana de ~03 mg/kg/dosis (~11 mg/m2). En un ensayo clínico de fase I de NK012, los pacientes con tumores sólidos toleraron 28 mg/m2 de SN-38 cada 3 semanas con neutropenia de grado 4 como toxicidad limitante de la dosis (Hamaguchi et al., 2010, Clin Cancer Res 16:5058- 66). De manera similar, los ensayos clínicos de fase I con ENZ-2208 revelaron neutropenia febril limitante de la dosis, con la recomendación de administrar 10 mg/m2 cada 3 semanas o 16 mg/m2 si a los pacientes se les administró G-CSF. Como los monos toleraron una dosis equivalente humana acumulada de 22 mg/m2, es posible que, aunque hRS7 se una a varios tejidos normales, la MTD para un solo tratamiento del ADC de hRS7 podría ser similar a la de otros agentes de SN-38 no de direccionamiento. De hecho, la especificidad del anticuerpo anti-TROP-2 no pareció desempeñar un papel en la definición de la DLT, porque el perfil de toxicidad fue similar al del irinotecán. Más importante aún, si la actividad antitumoral puede lograrse en humanos como en ratones que respondieron con una dosis equivalente humana de solo 0,03 mg de equivalentes de SN-38/kg/dosis, entonces podrían lograrse respuestas antitumorales clínicamente significativas.
En conclusión, los estudios de toxicología en monos, combinados con modelos de xenoinjerto de cáncer humano in vivo en ratones, han indicado que este ADC dirigido a TROP-2 es un tratamiento eficaz en varios tumores de diferente origen epitelial.
Ejemplo de referencia 12. Anti-CD22 (epratuzumab) conjugado-SN-38 para la terapia de enfermedades malignas hematológicas
Resumen
Anteriormente descubrimos que los anticuerpos de internalización lenta conjugados con SN-38 podrían usarse con éxito cuando se preparan con un conector que permite que aproximadamente el 50% del SN-38 unido a IgG se disocie en el suero cada 24 horas. En este estudio, se examinó la eficacia de los conjugados SN-38 preparados con epratuzumab (de internalización rápida) y veltuzumab (de internalización lenta), IgG anti-CD22 y anti-CD20 humanizadas, respectivamente, para el tratamiento de enfermedades malignas de células B. Ambos conjugados de anticuerpo-fármaco tuvieron una actividad nanomolar similar contra una variedad de líneas celulares de linfoma/leucemia humana, pero la liberación lenta de SN-38 comprometió la discriminación de potencia in vitro incluso contra un conjugado irrelevante. Cuando SN-38 se enlazó establemente al conjugado anti-CD22, su potencia se redujo de 40 a 55 veces. Por lo tanto, se realizaron estudios adicionales solo con el conector menos estable que se disocia lentamente. In vivo, se descubrió una actividad antitumoral similar entre el conjugado de anticuerpofármaco CD22 y CD20 en ratones con xenoinjertos de Ramos, aunque Ramos expresó 15 veces más CD20 que CD22, lo que sugiere que la internalización del conjugado epratuzumab-SN-38 (Emab- SN-38) potenció su actividad. Emab-SN-38 fue más eficaz que un conjugado IgG-SN-38 irrelevante que no se une in vivo, eliminando la mayoría de los xenoinjertos de Ramos bien establecidos en dosis no tóxicas. Los estudios in vitro e in vivo demostraron que Emab-SN-38 podría combinarse con veltuzumab no conjugado para un tratamiento más eficaz. Por tanto, Emab-SN-38 es activo en el linfoma y la leucemia a dosis muy por debajo de los niveles tóxicos y, por lo tanto, representa un nuevo agente prometedor con potencial terapéutico solo o combinado con la terapia con anticuerpos anti-CD20. (Sharkey et al., 2011, Mol Cancer Ther 11:224-34).
Introducción
Se ha centrado un esfuerzo significativo en la terapia biológica de la leucemia y el linfoma, donde se recibieron anticuerpos no conjugados (por ejemplo, rituximab, alemtuzumab, ofatumumab), radioinmunoconjugados (90Y-ibritumomab tiuxetan, 131I- tositumomab) y un conjugado de fármacos (gemtuzumab ozogamicina) recibieron la aprobación de laU.S. Food and Drug Administration (FDA). Otro conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC), brentuximab vedotin (SGN-35; anti-CD30-auristatin E), recibió recientemente la aprobación acelerada de la FDA para el linfoma de Hodgkin y los linfomas anaplásicos de células grandes. También hay una serie de otros ADC en desarrollo preclínico y clínico que se dirigen a CD19, CD22, CD37, CD74 y CD79b.
Los anticuerpos contra todos estos objetivos son opciones lógicas para los portadores de fármacos, ya que se internalizan. La internalización y la especificidad de CD22 lo han convertido en un objetivo particularmente importante para la leucemia y los linternas, con por lo menos 3 conjugados anti-CD22 diferentes en investigación clínica, incluyendo CMC-544 (calicheamicina conjugada lábil en ácido), un conjugado anti-CD22-maitansina (MCC-DM1 enlazado establemente) y CAT-3888 (formalmente BL22; una proteína de fusión de cadena sencilla de exotoxina de Pseudomonas). El agente activo en todos estos conjugados tiene una potencia subnanomolar (es decir, los denominados ultratóxicos).
Recientemente desarrollamos métodos para conjugar anticuerpos con SN-38, un inhibidor de la topoisomerasa I con baja potencia nanomolar que se deriva del profármaco irinotecán (Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-62; Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916-26). Inicialmente examinamos cuatro químicas de enlace de SN-38 usando conjugados preparados con un anticuerpo anti-CEACAM5 de internalización lenta (Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-62; Moon et al., 2008, J Med Chem 51:6916 -26). Los conjugados retuvieron la unión a CEACAM5, pero diferían en la tasa de disociación de SN-38 en suero humano, con vidas medias que variaban de aproximadamente 10 a 67 horas (Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-62). Finalmente, seleccionamos el conector denominado CL2, con estabilidad intermedia (~50% disociado en 24-35 horas), para un mayor desarrollo. CL2 se modificó recientemente, eliminando la fenilalanina en el dipéptido escindible de catepsina B para simplificar y mejorar los rendimientos de fabricación. El nuevo derivado, designado CL2A, retiene el enlace de carbonato sensible al pH con el SN-38, pero ya no es escindido selectivamente por la catepsina B. Sin embargo, tiene una estabilidad en suero y una actividad in vivo idénticas a las del conector CL2 original (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Como se encontró una eficacia significativa sin toxicidad con el anti-CEACAM5-SN-38 de internalización lenta, postulamos que su actividad se vio favorecida por la liberación lenta de SN-38 del anticuerpo después de que se localizó en un tumor. Por tanto, el objetivo principal de este informe fue evaluar las perspectivas terapéuticas de los conjugados preparados usando el conector CL2A con dos anticuerpos que son altamente específicos para los cánceres de células B, pero difieren en sus propiedades de internalización y expresión de antígenos.
El epratuzumab (Emab) es una IgG1 anti-CD22 humanizada de internalización rápida (por ejemplo, >50% en el plazo de 1 hora) que se ha evaluado ampliamente en linfoma y leucemia en forma no conjugada o conjugada. El veltuzumab (Vmab) es un anticuerpo anti-CD20 humanizado que también se está estudiando clínicamente, pero se internaliza lentamente (por ejemplo, ~10% en 1 hora). El CD20 se expresa habitualmente a niveles mucho más altos que el CD22 en el linfoma no Hodgkin, mientras que el CD22 se expresa preferiblemente en la leucemia linfoblástica aguda (ALL), pero no en el mieloma múltiple. Ambos anticuerpos son eficaces en pacientes como agentes no conjugados, pero solo el veltuzumab es activo en modelos de xenoinjerto murino (Stein et al., 2004, Clin Cancer Res 10:2868-76). En base a estudios previos que mostraron que 90Y-Emab combinado con veltuzumab no conjugado tuvo una mayor eficacia en modelos de NHL (Mattes et al., 2008, Clin Cancer Res 14:6154-60), también examinamos la combinación Emab-SN-38 Vmab, ya que esto podría proporcionar un beneficio adicional sin competir por el mismo antígeno objetivo ni tener toxicidad adicional.
Materiales y métodos
Líneas celulares. Se adquirieron Ramos, Raji, Daudi (linfomas de Burkitt) y JeKo-1 (linfoma de células del manto) de la American Type Culture Collection. REH, RS4;11, MN-60 y 697 (ALl ) se adquirieron de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. WSU-FSCCL (NHL folicular) fue un regalo del Dr. Mitchell R. Smith (Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA). Todas las líneas celulares se cultivaron en una incubadora con CO2 humidificada (5%) a 37° C en medios suplementados recomendados que contenían entre un 10 y un 20% de suero de ternera fetal y se comprobaron periódicamente para Mycoplasma.
Anticuerpos y métodos de conjugación. El epratuzumab y el veltuzumab son anticuerpos monoclonales IgG1 anti-CD22 y anti-CD20 humanizados, respectivamente. El abetuzumab (Lmab), un IgG1 anti-CEACAM5 humanizado, y RS7, un anticuerpo anti-TROP-2 humanizado (ambos de Immunomedics, Inc.), se usaron como controles irrelevantes no de unión. En la presente, Emab-SN-38, Vmab-SN-38 y Lmab-SN-38 se refieren a conjugados preparados usando el conector CL2A que se ha descrito anteriormente. Los estudios in vitro en suero humano mostraron que aproximadamente el 50% de la fracción SN-38 activa se libera de la IgG cada día (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). Otro conector, designado CL2E, es estable en suero humano durante 14 días, pero contiene un sitio de escisión de catepsina B para facilitar la liberación de SN-38 cuando se procesa en lisosomas. El método para preparar CL2E y las estructuras de los conectores CL2A y CL2E se dan en los Ejemplos anteriores. Los conjugados contenían aproximadamente 6 unidades de SN-38 por IgG (por ejemplo, 1,0 mg del conjugado de IgG-SN-38 contiene - 16 pg de SN-38).
Unión celular in vitro y citotoxicidad. La citometría de flujo se llevó a cabo usando los anticuerpos irrelevantes y específicos no conjugados incubados durante 1 hora a 4° C, y la unión se reveló usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-fragmento Fcy específico de cabra anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch), también incubados durante 1 hora a 4° C. La mediana de la fluorescencia se determinó en un citómetro de flujo FACSCALIBUR® (Becton Dickinson) usando un paquete de software CellQuest.
La citotoxicidad se determinó usando el ensayo de reducción de colorante MTS (Promega). Se generaron curvas de respuesta a la dosis [con/sin F(ab')2 de Fcy antihumano de cabra; Jackson ImmunoResearch] a partir de la media de determinaciones por triplicado, y los valores de IC50 se calcularon usando el software PRISM® GraphPad (v5), con comparaciones estadísticas usando una prueba F en las curvas de mejor ajuste para los datos. La significancia se fijó a P < 0,05.
Inmunotransferencia. Después de 24 o 48 horas de exposición a los agentes de prueba, los marcadores de apoptosis temprana (expresión de p21) y tardía (escisión de PARP) se revelaron mediante transferencia Western.
Estudios in vivo. El modelo Ramos subcutáneo se inició implantando 1 x 107 células (0,2 ml) de cultivo (>95% de viabilidad) en ratones desnudos hembra de 4 a 6 semanas de edad (Taconic). Tres semanas después de la implantación, los animales con tumores que variaban entre 0,4 y 0,8 cm3 (medidos con calibre, L x W x D) se separaron en grupos de animales, cada uno con el mismo intervalo de tamaños de tumores. El tamaño del tumor y los pesos corporales se midieron por lo menos una vez a la semana, y los animales se retiraron del estudio cuando los tumores crecieron hasta 3,0 cm3 o si experimentaron una pérdida de peso corporal del 20% o más. Los modelos intravenosos WSU-FSCCL y 697 se iniciaron mediante inyección intravenosa de 2,5 x 106 y 1 x 107 células, respectivamente, en ratones hembra inmunodeficientes combinados graves (SCID) (Taconic). El tratamiento comenzó 5 días después de la administración de las células WSU-FSCCL y 7 días después de la inoculación de 697. Los animales se observaron diariamente, usando parálisis de las patas traseras u otros signos de morbilidad como criterios de valoración de supervivencia alternativos. Todos los tratamientos se administraron por vía intraperitoneal en <0,2 ml. Las dosificaciones específicas y la frecuencia se dan en la sección de Resultados. Como los ratones convierten el irinotecán en SN-38 de manera eficiente, la dosificación de irinotecán se ajustó en base a los equivalentes de SN-38; Los equivalentes molares de SN-38 se basan en el 1,6% de la masa de ADC y el 60% de la masa de irinotecán.
La eficacia se expresó en una curva de Kaplan-Meier, usando el tiempo hasta la progresión (TTP) como criterios de valoración de supervivencia alternativos, como se ha indicado anteriormente. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de intervalo logarítmico usando el software PRISM® GraphPad (significancia, P < 0,05).
Resultados
Expresión de antígenos y citotoxicidad in vitro. Todas las líneas celulares fueron altamente susceptibles a SN-38, con valores de EC50 que variaban entre 0,13 nmol/l para Daudi y 2,28 nmol/l para RS4;11 (Tabla 9). Excepto por 697 y RS4;11, el conjugado anti-CD22 Emab-SN-38 fue de 2 a 7 veces menos efectivo que SN-38. Este es un descubrimiento común con nuestros conjugados SN-38 dirigidos, así como con otros no dirigidos. A pesar de las diferencias en la expresión del antígeno, Emab-SN-38 y Vmab-SN-38 tenían potencias similares a las del conjugado Lmab-SN-38 anti-CEACAM5 que no se une, lo que probablemente se debió a la disociación de aproximadamente el 90% de SN-38 durante el ensayo MTS de 4 días. Otros procedimientos in vitro que usaban tiempos de exposición más cortos también fueron ineficaces para discriminar las diferencias en las potencias de los conjugados. Por ejemplo, la tinción con anexina V después de una exposición de 1 día no logró encontrar diferencias entre las células tratadas y no tratadas (no mostrado). También se examinó la regulación por incremento de la escisión de p21 y PARP como marcadores tempranos y tardíos de apoptosis, respectivamente. Ramos no expresó p21. Sin embargo, se detectó la escisión de PARP, pero solo después de una exposición de 48 horas, y se expresó más fuertemente en las células tratadas con SN-38 (no mostrado). La línea celular WSU-FSCCL expresó p21, pero ni la regulación por incremento de p21 ni la escisión de PARP fueron evidentes hasta 48 horas después de la exposición a Emab-SN-38. Sin embargo, ambos se observaron después de una exposición de 24 horas con SN-38 libre (no mostrado). Mientras que la intensidad potenciada y la activación temprana de eventos apoptóticos con SN-38 libre fue consistente con su EC50 sobre la forma conjugada de IgG, los resultados indicaron que se requeriría un período de exposición de por lo menos 48 horas, pero en ese momento, aproximadamente el 75% del SN-38 se liberaría del conjugado.
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Examinamos de nuevo la escisión de PARP y la expresión de p21, esta vez en células tratadas con Emab-SN-38 Vmab. Confirmando el estudio anterior en Ramos, la escisión de PARP se produce primero solo después de una exposición de 48 horas al conjugado, sin cambios en la expresión en presencia de un anticuerpo de reticulación (no mostrado). La exposición a veltuzumab durante más de 48 horas no tuvo efecto sobre la escisión de PARP, pero la escisión fue fuerte en el plazo de 24 horas cuando se añadió un anticuerpo de reticulación (no mostrado). Sin embargo, cuando se combinó veltuzumab solo (sin reticulante) con Emab-SN-38, se produjo la escisión de PARP después de una exposición de 24 horas (no mostrado), lo que indica que veltuzumab podría inducir un inicio más rápido de la apoptosis, incluso en ausencia de reticulación. La única diferencia notable en la línea celular WSU-FSCCL fue que la combinación mejoró enormemente la expresión de p21 a las 48 horas (no mostrado), sugiriendo de nuevo una aceleración de la inducción de apoptosis cuando el veltuzumab se combina con el conjugado Emab-SN-38. El retraso en la inducción de apoptosis en WSU-FSCCL en comparación con Ramos probablemente se explica por la menor expresión de CD22 y c D20.
Los agentes ultratóxicos utilizan a menudo conectores que son muy estables en el suero, ya que su liberación prematura aumentaría la toxicidad, pero estos conjugados deben internalizarse para que el fármaco se administre de manera óptima. Debido a que el epratuzumab se internaliza rápidamente, examinamos si podría beneficiarse de un SN-38 enlazado de manera más estable, comparando la citotoxicidad in vitro del conjugado Emab-SN-38 enlazado a CL2A con el conjugado CL2E-SN-38 estable en suero. Ambos conjugados tenían una afinidad de unión similar (no mostrado), pero el Emab-CL2E-SN-38 más estable era aproximadamente 40 a 55 veces menos potente que el conjugado de CL2a en 3 líneas celulares (no mostrado). Aunque faltaba especificidad con los conjugados de CL2A, el Emab-CL2E-SN-38 fue consistentemente aproximadamente dos veces más potente que el conjugado de Lmab-anti-CEACAM5-CL2E-SN-38 que no se une (no mostrado). Concluimos que era improbable que el conjugado enlazado más establemente fuese apropiado para un conjugado de veltuzumab de internalización lenta y por lo tanto continuamos nuestra investigación solo con los conjugados de SN-38 enlazados a CL2A.
Debido a las limitaciones de los ensayos in vitro, la eficacia se evaluó en modelos de xenoinjertos. Como se indica en la Tabla 9, todas las líneas celulares de linfoma tienen una expresión mucho mayor de CD20 que de CD22. Daudi tuvo la expresión más alta de CD22 y CD20, pero es muy sensible in vivo al veltuzumab no conjugado y las pruebas in vitro revelaron la mayor sensibilidad a SN-38 (Tabla 9). Es probable que estas propiedades dificulten la evaluación de las diferencias en la actividad atribuida al conjugado de SN-38 frente al anticuerpo no conjugado, en particular cuando el epratuzumab no conjugado no es un tratamiento eficaz en animales. Como Ramos había sido usado anteriormente para mostrar una ventaja por combinar 90Y-Emab con veltuzumab (Mattes et al., 2008, Clin Cancer Res 14:6154-60), elegimos comenzar con una comparación de los conjugados Emab-SN-38 y Vmab-SN-38 en la línea celular de Burkitt humana Ramos. A pesar de que la citometría de flujo mostró una expresión 15 veces mayor de CD20 que de CD22, la inmunohistología de los xenoinjertos de Ramos mostró CD22 y CD20 abundantes, con CD22 aparentemente expresado de manera más uniforme que CD20 (no mostrado).
Los xenoinjertos de Ramos en animales no tratados progresaron rápidamente, alcanzando el tamaño de terminación de 3,0 cm3 desde su tamaño inicial de 0,4 cm3 en 6 días (no mostrado), y como se ha informado anteriormente, ni el veltuzumab ni el epratuzumab afectaron apreciablemente la progresión de xenoinjertos de Ramos bien establecidos (Sharkey et al., 2009, J Nucl Med 50:444-53). En consonancia con los descubrimientos anteriores usando otros conjugados de SN-38, ninguno de los animales tratados con un régimen de tratamiento de 0,5 mg/dosis de 4 semanas, dos veces a la semana, tuvo una pérdida de peso apreciable. Ambos conjugados fueron altamente eficaces en el control del crecimiento tumoral, con un 80% o más de los animales sin evidencia de tumor al final del tratamiento de 4 semanas (FIG. 6). La dosis de 0,25 mg de Vmab-SN-38 controló mejor el crecimiento durante las primeras 4 semanas, pero a 0,5 mg se observó un control temprano del crecimiento similar para ambos conjugados. Por tanto, a pesar de una expresión 15 veces mayor de CD20 que de CD22, Emab-SN-38 se comparó favorablemente con Vmab-SN-38. Por lo tanto, los estudios restantes se centraron en Emab-SN-38 solo o en combinación con veltuzumab no conjugado.
Respuesta a la dosis y especificidad de Emab-SN-38. Se observó una relación de respuesta a la dosis para los conjugados de Emab-SN-38 específicos y Lmab-SN-38 irrelevantes, pero Emab-SN-38 tuvo un control de crecimiento significativamente mejor en 2 de los 3 niveles probados, y con una fuerte tendencia a favor del conjugado específico a la dosis intermedia (FIG. 7). De nuevo, 0,25 mg de Emab-SN-38 extirparon la mayoría de los tumores; aquí, 7 de 10 animales estaban libres de tumores al final del período de monitorización de 12 semanas, sin cambios en el peso corporal. Los animales que recibieron irinotecán solo (6,5 pg/dosis; aproximadamente los mismos equivalentes de SN-38 que 0,25 mg de conjugado) tuvieron una supervivencia mediana de 1,9 semanas, con 3 de 11 animales libres de tumores al final del estudio, lo que no fue significativamente diferente de la supervivencia mediana de 3,45 semanas para el conjugado de Lmab-SN-38 irrelevante (P = 0,452; FIG. 7C).
En el modelo de leucemia diseminada 697, la supervivencia mediana de los animales tratados con solución salina fue de solo 17 días desde la inoculación del tumor. Los animales que recibieron epratuzumab no conjugado más irinotecán (los mismos equivalentes molares de SN-38 que 0,5 mg del conjugado) tuvieron la misma supervivencia mediana, mientras que los animales que recibieron 0,5 mg de Emab-SN-38 dos veces a la semana comenzando 7 días después de la inoculación del tumor sobrevivieron hasta los 24,5 días., significativamente más largo que los animales no tratados (P < 0,0001) o para epratuzumab no conjugado administrado con irinotecán (P = 0,016). Sin embargo, Emab-SN-38 no fue significativamente mejor que el conjugado irrelevante (supervivencia mediana = 22 días; P = 0,304), lo que probablemente refleja la baja expresión de CD22 en esta línea celular.
Emab-SN-38 combinado con Vmab anti-CD20 no conjugado. Anteriormente informamos de respuestas mejoradas cuando 90Y-Emab se combinó con veltuzumab no conjugado en el modelo Ramos subcutáneo (Mattes et al., 2008, Clin Cancer Res 14: 6154-60) y, por tanto, esta posibilidad se examinó con Emab-SN-38. En un estudio piloto, se administró veltuzumab (0,1 mg), 0,1 mg de Emab-SN-38 o Emab-SN-38 Vmab (todos los agentes administrados dos veces por semana durante 4 semanas) a 5 animales portadores de tumores Ramos subcutáneos que promediaban aproximadamente 0,3 cm3. La TTP mediana a 2,0 cm3 fue de 22, 14 y más de 77 días, respectivamente (veltuzumab frente a Emab-SN-38 solo, P = 0,59; Emab-SN-38 Vmab frente a Emab-SN-38, P = 0,0145), lo que proporciona una indicación de que la combinación de veltuzumab con Emab-SN-38 mejoró la respuesta terapéutica general. En un estudio de seguimiento que también usó un régimen de tratamiento de 4 semanas dos veces a la semana, 6 de 11 animales que recibieron 0,1 mg de Emab-SN-38 más 0,1 mg de veltuzumab no tuvieron evidencia de tumores 16 semanas después del inicio del tratamiento, mientras que la supervivencia mediana para los animales que recibieron veltuzumab solo o con 0,1 mg del Lmab-SN-38 de control fue de 1,9 y 3,3 semanas, respectivamente, con 3 de 11 animales sin tumor a las 16 semanas en cada uno de estos grupos (no mostrado). A pesar de la TTP mediana más larga y más sobrevivientes, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos. Por tanto, en el modelo de Ramos, que tiene abundante CD20 y niveles moderados de CD22, el conjugado Emab-SN-38 administrado a niveles de dosis no tóxicos no fue significativamente mejor que la terapia anti-CD20 no conjugada, pero la adición de Emab-SN-38 a la terapia anti-CD20 no conjugada pareció mejorar. mejorar la respuesta sin toxicidad. Es importante recalcar que los conjugados de SN-38 se administran a niveles muy inferiores a su dosis máxima tolerada, por lo que estos resultados no deben interpretarse como que la terapia anti-CD20 no conjugada es igual a la del conjugado Emab-SN-38.
Se realizaron dos estudios adicionales en un modelo implantado por vía intravenosa usando la línea celular de NHL folicular WSU-FSCCL que tiene una baja expresión de CD20 y CD22 (no mostrado). El tiempo de supervivencia mediano para los animales tratados con solución salina fue de 40 a 42 días desde la implantación del tumor. El irinotecán solo (no mostrado), administrado en una dosis que contenía los mismos equivalentes de SN-38 que 0,3 mg de ADC, aumentó la supervivencia mediana (49 frente a 40 días, respectivamente; P = 0,042), pero 14 de 15 animales sucumbieron a la progresión de la enfermedad el día 49, el mismo día que se eliminaron los últimos 4 de 15 animales en el grupo de solución salina (no mostrado). A pesar de su expresión de CD20 relativamente baja, el veltuzumab solo (35 pg dos veces por semana x 4 semanas) fue eficaz en este modelo. La supervivencia mediana aumentó a 91 días en el primer estudio, con 2 curas (día 161), y a 77 días en el segundo, pero sin sobrevivientes después de 89 días (veltuzumab solo frente a tratamiento con solución salina, P < 0,001 en ambos estudios). El epratuzumab no conjugado (0,3 mg/dosis) combinado con irinotecán y veltuzumab tuvo la misma supervivencia mediana que el veltuzumab solo, lo que sugiere que ni el epratuzumab ni el irinotecán contribuyeron a la respuesta neta.
Como era de esperar debido a la baja expresión de CD22 por WSU-FSCCL, Emab-SN-38 solo no fue tan eficaz como en Ramos. Con la dosis de 0,15 mg, no se observaron beneficios significativos sobre el grupo de solución salina, pero con 0,3 mg, la supervivencia mediana aumentó a 63 días, proporcionando una mejora significativa en comparación con los animales tratados con solución salina (P = 0,006). El segundo estudio, usando 0,3 mg de Emab-SN-38, confirmó una mayor supervivencia en comparación con el grupo de solución salina (75 frente a 40 días; P < 0,0001). La especificidad de esta respuesta no fue evidente en el primer estudio, donde la supervivencia mediana del conjugado irrelevante Lmab-SN-38 y Emab-SN-38 no fue diferente a niveles de dosis de 0,15 o 0,3 mg (42 frente a 49 días y 63 frente a 63 días para los conjugados Emab-SN-38 frente a anti-CEACAM5-SN-38 en los 2 niveles de dosis, respectivamente). Sin embargo, en el segundo estudio, la dosis de 0,3 mg de Emab-SN-38 proporcionó una supervivencia significativamente mejorada con respecto al conjugado irrelevante (75 frente a 49 días; P < 0,0001). De nuevo, la dificultad para mostrar especificidad en este modelo probablemente esté relacionada con la baja expresión de CD22.
La combinación del Emab-SN-38 específico con veltuzumab aumenta sustancialmente la supervivencia, con evidencia de respuestas más sólidas que el control Lmab-SN-38. Por ejemplo, en el primer estudio, los animales tratados con veltuzumab más 0,15 o 0,3 mg del conjugado de control tuvieron una supervivencia mediana de 98 y 91 días, respectivamente, que fue similar a la de veltuzumab solo (91 días; no mostrado). Sin embargo, veltuzumab más 0,15 mg del conjugado específico de Emab-SN-38 aumentó la supervivencia mediana a 140 días. Aunque esta mejora no fue significativamente mayor que la de veltuzumab solo (P = 0,257), cuando la dosis de Emab-SN-38 se aumentó a 0,3 mg con veltuzumab, 6 de 10 animales permanecían vivos al final del estudio, lo que proporcionó una ventaja de supervivencia significativa sobre el conjugado de control más veltuzumab (P = 0,0002). En un segundo estudio, la supervivencia mediana de veltuzumab solo fue más corta que en el primero (77 frente a 91 días); sin embargo, la supervivencia mediana del conjugado de control con veltuzumab fue de nuevo de 91 días, lo que ahora proporcionó una ventaja de supervivencia significativa sobre el veltuzumab solo (P < 0,0001). La combinación del conjugado específico de Emab-SN-38 con veltuzumab extendió la supervivencia mediana a 126 días, que fue significativamente más larga que la supervivencia mediana de 75 y 77 días para Emab-SN-38 y veltuzumab solos, respectivamente (P < 0,0001 para cada uno). Sin embargo, en este estudio, no cumplió del todo los requisitos para una mejora estadística sobre la combinación con el conjugado anti-CEACAM5-SN-38 de control (P = 0,078).
Análisis
Durante los últimos 10 años, los ADC han logrado avances sustanciales en la terapia contra el cáncer, aunque también ha habido algunos contratiempos. Los avances se proporcionaron en gran medida cuando los investigadores eligieron examinar agentes que eran demasiado tóxicos para ser usados solos, pero cuando se acoplaron con un anticuerpo, estos llamados ultratóxicos proporcionaron respuestas sustancialmente mejoradas en las pruebas preclínicas. La reciente aprobación de brentuximab vedotina, un conjugado de auristatina, en el linfoma de Hodgkin y el éxito clínico con el conjugado de trastuzumab-DMl anti-HER2-maitansina como agente único en el cáncer de mama refractario al trastuzumab no conjugado sugieren que estos ADC que portan agentes ultratóxicos se están convirtiendo en modalidades de tratamiento aceptadas. Sin embargo, los conjugados preparados con agentes que son potentes en el intervalo picomolar pueden tener un riesgo de toxicidad aumentado, como sugiere la reciente decisión de retirar gemruzumab ozogamicina, el conjugado anti-CD33-caliqueamicina, del mercado (Ravandi, 2011, J Clin Oncol 29:349-51). Por tanto, el éxito de un ADC puede depender de la identificación de las químicas apropiadas para unir el fármaco y el anticuerpo entre sí, así como de la definición de un objetivo adecuado que se exprese lo suficiente para permitir una administración adecuada y selectiva del agente citotóxico.
Desarrollamos un conector para acoplar SN-38 a IgG que permite que SN-38 se libere lentamente del conjugado en suero (aproximadamente el 50% por día). Con este conector, un anticuerpo que se internaliza lentamente podría ser un agente terapéutico eficaz, quizás porque el conjugado localizado en un tumor libera localmente una cantidad suficiente de fármaco, incluso sin interiorizarse. El conector de CL2A también se usó recientemente con un anticuerpo contra TROP-2 que se informó que se internalizaba rápidamente (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17: 3157-69). Por tanto, parece que el mecanismo de liberación lenta es beneficioso para los anticuerpos internalizantes y no internalizantes.
En este informe, ampliamos nuestra evaluación del conector CL2A comparando conjugados de SN-38 preparados con epratuzumab, una IgG anti-CD22 de internalización rápida, y veltuzumab, una IgG anti-CD20 de internalización lenta, para el tratamiento de enfermedades malignas de células B. Estudios anteriores con el original murino de epratuzumab habían indicado que la mayor parte del anticuerpo se internaliza en 1 hora y el 50% de CD22 se vuelve a expresar en la superficie celular en el plazo de 5 horas (Shih et al., 1994, Int J Cancer 56:538-45).). Este proceso de internalización y reexpresión permitiría la administración intracelular que podría compensar la menor expresión superficial de CD22. Debido a que muchas de las enfermedades malignas de células B expresan mucho más CD20 que CD22, un conjugado dirigido a CD20 podría administrar más moles de fármaco liberando su carga tóxica después de localizarse en el tumor.
Los estudios de citotoxicidad in vitro no pudieron discriminar la potencia de los conjugados específicos o incluso de un conjugado irrelevante debido a la liberación de SN-38 del conjugado al medio. De hecho, el SN-38 solo fue algo más potente que los conjugados, lo que puede reflejar su capacidad acelerada para introducirse en la célula y activar la topoisomerasa I. Como otros estudios revelaron que los conjugados requerían una exposición de 48 horas antes de que pudieran verse los primeros signos de apoptosis, llegamos a la conclusión de que las pruebas in vitro no podrían discriminar la potencia de estos 2 conjugados y, por lo tanto, recurrimos a estudios in vivo.
En modelos de xenoinjerto, ambos conjugados tenían una actividad antitumoral similar contra los tumores de Ramos, que la citometría de flujo había indicado que expresaba casi 15 veces más CD20 que CD22. Esto apoyó la selección del conjugado Emab anti-CD22-SN-38 especialmente porque podría combinarse con la terapia Vmab anti-CD20 no conjugado sin preocuparse de que cualquiera de los agentes interfiriera con la unión del otro agente. De hecho, si se usara un conjugado anti-CD20-SN-38, la dosis total de proteína IgG dada probablemente estaría por debajo del nivel típicamente necesario para tratamientos eficaces con anticuerpos anti-CD20 no conjugados, ya que la toxicidad limitante de la dosis estaría impulsada por el contenido de SN -38. Añadir más anti-CD20 no marcado a un conjugado anti-CD20-SN-38 podría reducir la captación del conjugado y disminuir potencialmente su eficacia. Sin embargo, como hemos mostrado anteriormente en estudios de combinación que usan epratuzumab radiomarcado con veltuzumab no conjugado, pueden derivarse beneficios de ambos agentes dadas sus dosificaciones seguras y eficaces máximas. Los estudios in vitro demostraron que el veltuzumab, incluso en ausencia de la reticulación que se usa para mejorar la señalización, aceleró los eventos apoptóticos iniciados con Emab-SN-38. Por tanto, siempre que el conjugado Emab-SN-38 fuese tan eficaz como el conjugado anti-CD20, seleccionar el conjugado Emab-SN-38 es una opción lógica porque permite una terapia de combinación más efectiva, incluso en tumores donde uno o ambos antígenos tienen baja expresión.
Como la mayoría de los ADC que usan fármacos ultratóxicos están enlazados de manera estable, también probamos un conjugado anti-CD22-SN-38 estable en suero, pero escindible intracelularmente, pero determinamos que era de 40 a 55 veces menos potente que el conector c L2A. Otros han examinado una variedad de fármacos ultratóxicos conjugados con anticuerpos anti-CD20 o anti-CD22, descubriendo que los conjugados de internalización son generalmente más activos, pero también observaron que incluso los anticuerpos de internalización lenta podrían ser eficaces si el fármaco liberado penetrara la membrana celular. Aunque el conector de tipo CL2A puede ser apropiado para SN-38, puede no ser óptimo para un agente más tóxico, en el que incluso una liberación pequeña sostenida en el suero aumentaría la toxicidad y comprometería la ventana terapéutica.
Emab-SN-38 fue activo a una dosis acumulada de 0,6 mg en ratones portadores de Ramos (75 pg dos veces a la semana durante 4 semanas), lo que se extrapola a una dosis humana de solo 2,5 mg/kg. Por tanto, Emab-SN-38 debería tener una amplia ventana terapéutica en los pacientes. Además, se combinó una dosis eficaz y segura del conjugado anti-TROP-2-SN-38 con una dosis máxima tolerada de un anticuerpo marcado con 90Y sin un aumento apreciable de la toxicidad, pero con una eficacia mejorada (Sharkey et al., 2011)., Mol Cancer Ther 10:1072-81). Por tanto, el perfil de seguridad y eficacia de estos conjugados de anticuerpos de SN-38 es muy favorable para otras terapias combinadas.
Aunque el irinotecán no se usa de forma rutinaria para el tratamiento de cánceres hematopoyéticos, SN-38 fue tan potente en líneas celulares de linfoma y leucemia como en tumores sólidos (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). En la línea celular WSU-FSCCL, los conjugados de IgG específicos e irrelevantes fueron significativamente mejores que el irinotecán, mientras que en Ramos, la TTP mediana con el conjugado irrelevante fue más larga pero no significativamente mejor que el irinotecán. Estos resultados son consistentes con otros estudios que han demostrado que una IgG no específica es un excelente portador de fármacos y más potente in vivo que el fármaco libre o los conjugados preparados con albúmina o polietilenglicol (PEG)-Fc. Aunque el conjugado de PEG-SN-38 tenía efectos antitumorales significativos, se administró en sus cantidades máximas toleradas, que variaban de 10 a 30 mg/kg de equivalentes de SN-38 (Sapra et al., 2009, Haematologica 94:1456-9). Por el contrario, la dosis acumulada máxima de SN-38 administrada durante 4 semanas a animales portadores de Ramos fue de solo 1,6 mg/kg (es decir, una dosificación de 0,25 mg de Emab-SN-38 administrada dos veces a la semana durante 4 semanas) y no fue tóxica.
La actividad terapéutica específica de Emab-SN-38 pareció mejorar en las líneas celulares con mayor expresión de CD22. Por ejemplo, en Ramos, se registraron efectos terapéuticos específicos de Emab-SN-38 solo en 2 de los 3 niveles de dosis diferentes examinados, y se extirpó por completo una cantidad considerable de tumores. Por el contrario, en WSU-FSCCL que tenía una expresión de CD22 unas 2,5 veces menor, Emab-SN-38 mejoró significativamente la supervivencia en comparación con el conjugado anti-CEACAM5-SN-38 irrelevante en 1 de los 2 estudios. Sin embargo, es importante hacer hincapié que cuando se usa en combinación con la terapia anti-CD20 no conjugada, Emab-SN-38 amplifica la respuesta terapéutica. Por tanto, la combinación de estos dos tratamientos podría aumentar la respuesta incluso en situaciones en las que CD22 no se expresa en gran medida.
En conclusión, usando el conector CL2A-SN-28 menos estable, el conjugado de Emab anti-CD22-SN-38 fue igualmente activo a dosis no tóxicas in vivo como un conjugado anti-CD20-SN-38 similar, a pesar del hecho de que la expresión de CD20 fue más de una vez logarítmica mayor que CD22. Las respuestas terapéuticas se beneficiaron de la combinación de Emab-SN-38 con la terapia anti-CD20 de Vmab no conjugado, incluso cuando la expresión de CD22 era baja, lo que sugiere que la terapia de combinación podría mejorar las respuestas en una serie de enfermedades malignas de células B cuando ambos antígenos están presentes. Los estudios actuales sugieren que esta combinación es muy potente en diversos modelos preclínicos de linfoma y leucemia, pero parece tener menos toxicidad para el huésped.
Ejemplo de referencia 13. Conjugados anti-CD74 (Milatuzumab) SN-38 para el tratamiento de cánceres humanos CD74+
Resumen
CD74 es un objetivo atractivo para los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), ya que se internaliza y se recicla después de la unión del anticuerpo. CD74 se asocia principalmente con cánceres hematológicos, pero también se expresa en cánceres sólidos. Por lo tanto, se examinó la utilidad de los ADC preparados con el anticuerpo anti-CD74 humanizado, milatuzumab, para la terapia de tumores sólidos que expresan CD74. Se prepararon milatuzumab-doxorrubicina y dos conjugados de milatuzumab-SN-38 con conectores escindibles (CL2A y CL2E), que difieren en su estabilidad en suero y en cómo liberan SN-38 en el lisosoma. La expresión de CD74 se determinó mediante citometría de flujo e inmunohistología. Los estudios de citotoxicidad in vitro y terapéuticos in vivo se realizaron en las líneas celulares de cáncer humano A-375 (melanoma), HuH-7 y Hep-G2 (hepatoma), Capan-1 (pancreático) y NCI-N87 (gástrico) y linfoma de Raji Burkitt. El ADC de milatuzumab-SN-38 se comparó con los ADC de SN-38 preparados con anticuerpos anti-TROP-2 y anti-CEACAM6 en xenoinjertos que expresaban sus antígenos objetivo.
La milatuzumab-doxorrubicina fue más eficaz en el modelo de linfoma, mientras que en A-375 y Capan-1, solo el milatuzumab-CL2A-SN-38 mostró un beneficio terapéutico. A pesar de una expresión superficial mucho más baja de CD74 que TROP-2 o CEACAM6, el milatuzumab-CL2A-SN-38 tuvo una eficacia similar en Capan-1 que anti-TROP-2 CL2A-SN-38, pero en NCI-N87, los conjugados anti-CEACAM6 y anti-TROP-2 fueron superiores. Los estudios en 2 líneas celulares de hepatoma a un nivel de dosis individual mostraron un beneficio significativo sobre los animales tratados con solución salina, pero no contra un conjugado de IgG irrelevante. CD74 es un objetivo adecuado para los ADC en algunos xenoinjertos de tumores sólidos, con eficacia influenciada en gran medida por la uniformidad de la expresión de CD74, y con conjugados de SN-38 ligados a CL2A que proporcionan las mejores respuestas terapéuticas.
Introducción
CD74, a la que se hace referencia como cadena invariable o Ii, es una glicoproteína transmembrana de tipo II que se asocia con HLA-DR e inhibe la unión de péptidos antigénicos a la estructura de presentación de antígenos de clase II. Sirve como molécula chaperona, dirigiendo los complejos de cadenas invariantes hacia endosomas y lisosomas, una molécula accesoria en la maduración de las células B, usando una vía mediada por NF-kB, y en las respuestas de las células T a través de interacciones con CD44 (Naujokas et al., 1993, Cell 74:257-68), y es un receptor para la citoquina proinflamatoria, factor inhibidor de la migración de macrófagos (Leng et al., 2003, J Exp Med 197:1467-76), que está implicado en la activación de la proliferación celular y las vías de supervivencia.
En tejidos humanos normales, CD74 se expresa principalmente en células B, monocitos, macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans, subconjuntos de células T activadas y epitelio tímico (no mostrado), y se expresa en más del 90% de los tumores de células B (Burton et al., 2004, Clin Cancer Res 10:6606-11; Stein et al., 2004, Blood 104:3705-11). Los primeros estudios tenían datos contradictorios sobre la presencia de CD74 en la membrana, en parte porque los anticuerpos contra la cadena invariable eran específicos para la porción citoplásmica de la molécula, pero también porque hay relativamente pocas copias en la superficie y su vida media en la superficie celular es muy corta. Aproximadamente el 80% de CD74 en la superficie celular está asociado con el antígeno MHC II HLA-DR (Roche et al., 1993, PNAS USA 90:8581-85). Usando el anticuerpo murino anti-CD74, LL1, se estimó que la línea celular de linfoma Raji Burkitt tenía 4,8 x 104 copias/célula, pero debido al rápido tránsito intracelular, ~8 x 106 moléculas de anticuerpo se internalizaron y catabolizaron por día (Hansen et al., 1996, Biochem J 320:293-300). Por tanto, la internalización de CD74 es muy dinámica, ya que el anticuerpo se mueve rápidamente desde la superficie y se descarga dentro de la célula, seguido de la reexpresión de CD74 en la superficie. La internalización de Fab' se produce tan rápidamente como la unión de IgG, lo que indica que no se requiere la unión bivalente. Estudios posteriores con una versión injertada de CDR de LL1 murino, milatuzumab (hLL1), descubrieron que el anticuerpo podría alterar la proliferación de células B, la migración y la expresión de moléculas de adhesión (Stein et al., 2004, Blood 104:3705-11; Qu et al., 2002, Proc Am Assoc Cancer Res 43:255; Frolich et al., 2012, Arthritis Res Ther 14:R54), pero las excepcionales propiedades de internalización del anticuerpo anti-CD74 lo convirtieron en un portador eficaz para la administración intracelular de agentes terapéuticos contra el cáncer (por ejemplo, Griffiths et al., 2003, Clin Cancer Res 9:6567-71). En base a los resultados preclínicos de eficacia y toxicología, se han iniciado los ensayos clínicos de fase I con milatuzumab-doxorrubicina en mieloma múltiple (Kaufman et al., 2008, ASH Annual Meeting Abstracts, 112:3697), así como en linfoma no Hodgkin y leucemia linfocítica crónica.
Curiosamente, CD74 también se expresa en cánceres no hematopoyéticos, como gástrico, renal, de vejiga urinaria, cánceres de pulmón de células no pequeñas, ciertos sarcomas y glioblastoma (por ejemplo, Gold et al., 2010, Int J Clin Exp Pathol 4: 1-12), y por lo tanto puede ser un objetivo terapéutico para tumores sólidos que expresan este antígeno. Como un conjugado de milatuzumab-doxorrubicina fue muy activo en modelos de cánceres hematológicos, era una opción lógica para esta evaluación. Sin embargo, recientemente desarrollamos procedimientos para acoplar el inhibidor de topoisomerasa I altamente potente, SN-38, a anticuerpos. SN-38 es la forma activa del irinotecán, cuya farmacología y metabolismo son bien conocidos. Estos conjugados tienen una potencia nanomolar en líneas de células tumorales sólidas y descubrimos que eran activos con anticuerpos que no estaban internalizados activamente. Estudios anteriores indicaron una preferencia por un conector (CL2A) que permitía que SN-38 se disociara del conjugado en el suero con una vida media de ~1 día, en lugar de otros conectores que eran más o menos estables en el suero. Sin embargo, dada la excepcional capacidad de internalización del milatuzumab, se desarrollo un nuevo conector que es altamente estable en suero, pero puede liberar SN38 cuando se lleva en el lisosoma.
La investigación actual examina las perspectivas de usar estos tres conjugados anti-CD74 de milatuzumab, uno con doxorrubicina y dos conjugados de SN-38, para una terapia eficaz principalmente contra tumores sólidos.
Materiales y métodos
Líneas de células tumorales humanas. Las líneas celulares de linfoma Raji Burkitt, A-375 (melanoma), Capan-1 (adenocarcinoma pancreático), NCI-N87 (carcinoma gástrico), hepatoma Hep-G2 y mieloma MC/CAR se adquirieron de la American Tissue Culture Collection (Manassas, VA). La línea celular de hepatoma HuH-7 se adquirió del Japan Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japón). Todas las líneas celulares se cultivaron en una incubadora con CO2 humidificada (5%) a 37° C en los medios recomendados que contenían entre un 10% y un 20% de suero de ternero fetal y suplementos. Las células se pasaron <50 veces y se comprobaron periódicamente para detectar micoplasma.
Anticuerpos y métodos de conjugación. El milatuzumab (MAb anti-CD74), epratuzumab (anti-CD22), veltuzumab (anti-CD20), labetuzumab (anti-CEACAM5), hMN15 (anti-CEACAM6) y hRS7 (anti-TROP-2) son anticuerpos monoclonales de IgG1 humanizados. Los conectores CL2A y CL2E y sus derivados de SN-38 se prepararon y conjugaron con anticuerpos como se describe en los Ejemplos anteriores. Los conjugados de milatuzumab-doxorrubicina se prepararon como se ha descrito anteriormente (Griffiths et al., 2003, Clin Cancer Res 9:6567-71). Todos los conjugados se prepararon mediante reducción con disulfuro de la IgG, seguido de reacción con los derivados de maleimida correspondientes de estos conectores. Los análisis espectrofotométricos estimaron que la relación de sustitución molar de fármaco: IgG era de 5-7 (1,0 mg de la proteína contiene ~16 pg de SN-38 o 25 pg de equivalente de doxorrubicina).
Unión celular in vitro y citotoxicidad. Los ensayos para comparar la unión celular del milatuzumab no conjugado y conjugado con células positivas para antígeno y las pruebas de citotoxicidad usaron el método de reducción de colorante MTS (Promega, Madison, WI).
Citometría de flujo e inmunohistología. La citometría de flujo se realizó de una manera que proporcionó una evaluación del antígeno unido a membrana solamente o de membrana y citoplasmático. La inmunohistología se realizó en secciones incrustadas en parafina fijadas con formalina de xenoinjertos de tumores subcutáneos, tinción sin métodos de recuperación de antígenos, usando anticuerpos a 10 pg/ml que se revelaron con un conjugado de IgG antihumana.
Estudios in vivo. Se adquirieron ratones desnudos hembra (4-8 semanas de edad) o ratones SCID hembra (7 semanas de edad) de Taconic (Germantown, NY) y se usaron después de una cuarentena de 1 semana. Todos los agentes, incluyendo los controles de solución salina, se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana durante 4 semanas. Las dosis específicas se dan en los Resultados. La toxicidad se evaluó mediante mediciones de peso semanales. Para el modelo de linfoma de Raji Burkitt, se inyectaron a ratones SCID por vía intravenosa 2,5 x 106 células Raji en 0,1 ml de medio. Cinco días después, los animales recibieron una única inyección intravenosa (0,1 ml) del conjugado o solución salina (N = 10/grupo). Los ratones se observaron diariamente en busca de signos de angustia y parálisis, y se sacrificaron cuando se desarrolló parálisis en las extremidades traseras, > 15% de pérdida del peso inicial o si estaban moribundos (criterios de valoración de supervivencia alternativos).
Los tumores subcutáneos se midieron con un calibre en dos dimensiones, y el volumen del tumor (TV) se calculó como L x w2/2, donde L es el diámetro más largo y w es el más corto. Las mediciones se realizaron por lo menos una vez a la semana, y los animales se sacrificaron cuando los tumores crecieron hasta 1,0 cm3 (es decir, criterio de valoración de supervivencia alternativo). Se implantó la línea celular de melanoma A-375 (6 x 106 células en 0,2 ml) en ratones desnudos y la terapia se inició cuando los tumores promediaron 0,23 ± 0,06 cm3 (N = 8/grupo). Se implantó Capan-1 por vía subcutánea en ratones desnudos usando una combinación de suspensión tumoral de tumores sometidos a pases en serie (0,3 ml de una suspensión tumoral al 15% p/v) combinada con 8 x 106 células de cultivo de tejidos. Los tratamientos se iniciaron cuando el TV promedió 0,27 ± 0,05 cm3 (N = 10/grupo). Los xenoinjertos de tumor gástrico NCI-N87 se iniciaron inyectando subcutáneamente 0,2 ml de una mezcla 1:1 (v/v) de matrigel y 1 x 107 células del cultivo terminal. La terapia se inició cuando el TV promedió 0,249 ± 0,045 cm3 (N = 7/grupo). Se siguió el mismo procedimiento para desarrollar los xenoinjertos de hepatoma Hep-G2 y HuH-7 en ratones desnudos. La terapia se inició cuando Hep-G2 promedió 0,364 ± 0,062 cm3 (N = 5/grupo) y HuH-7 promedió 0,298 ± 0,055 cm3 (N = 5/grupo).
La eficacia se expresa en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, usando los criterios de valoración alternativos mencionados anteriormente para determinar los tiempos medianos de supervivencia. El análisis se realizó mediante una prueba de intervalos logarítmicos (Mantel-Cox) usando el software Prism GraphPad (LaJolla, CA), con una significancia de P <0,05.
Resultados
Expresión de CD74 en líneas de células tumorales humanas y xenoinjertos. Seis líneas celulares derivadas de 4 tipos de tumores sólidos diferentes se identificaron como positivas para CD74 basándose principalmente en el análisis de células permeabilizadas (Tabla 10), como el MFI de CD74 solo de membrana en las líneas celulares de tumores sólidos muy a menudo era <2 veces mayor que el MFI de fondo (excepto la línea celular de melanoma A-375). La expresión de CD74 superficial en Raji fue >5 veces mayor que en las líneas celulares de tumor sólido, pero el CD74 total en las células Raji permeabilizadas fue similar a la mayoría de las líneas celulares de tumor sólido.
T a b la 10. Expresión de CD74 por citometría de flujo expresada como intensidad fluorescente media (MFI) de l l l i n iiv r mil z m .
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La inmunohistología mostró que los xenoinjertos subcutáneos de Raji tenían una tinción intensa y en gran parte uniforme, con un marcado prominente en la superficie celular (no mostrado). La línea celular de hepatoma Hep-G2 tuvo la captación más uniforme de los tumores sólidos, con tinción moderadamente fuerte, pero predominantemente citoplásmica (no mostrado), seguido por la línea celular de melanoma A-375 que tuvo una tinción algo menos uniforme con tinción más intensa, aunque principalmente expresión citoplasmática (no mostrado). Las líneas celulares de carcinoma gástrico pancreático Capan-1 (no mostrado) y NCI-N87 (no mostrado) tenían una tinción moderada (Capan-1) a intensa (NCI-N87) de CD74, pero no estaba uniformemente distribuida. La línea celular de hepatoma HuH-7 (no mostrado) tenía la tinción menos uniforme y más débil.
Inmunorreactividad de los conjugados. Los valores de Kd para milatuzumab no conjugado, conjugados de milatuzumab-CL2A- y CL2E-SN-38 no fueron significativamente diferentes, con una media de 0,77 nM, 0,59 nM y 0,80 nM, respectivamente. Los valores de Kd para el milatuzumab no conjugado y conjugado con doxorrubicina medidos en la línea celular de mieloma múltiple MC/CAR fueron de 0,5 ± 0,02 nM y 0,8 ± 0,2 nM, respectivamente (Sapra et al., 2008, Clin Cancer Res 14: 1888-96).
Liberación de fármacos in vitro y estabilidades en suero de los conjugados. Los mecanismos de liberación de SN-38 de los conectores CL2A y CL2E protegidos con mercaptoetanol se determinaron en un entorno que simulaba parcialmente las condiciones lisosomales, concretamente pH bajo (pH 5,0) y en presencia o ausencia de catepsina B. El sustrato CL2E-SN-38 era inerte a pH 5 en ausencia de la enzima (no mostrado), pero en presencia de catepsina B, la escisión en el sitio Phe-Lys avanzó rápidamente, con una vida media de 34 min (no mostrado). La formación de SN-38 activo requiere la ciclación intramolecular del enlace carbamato en la 10a posición de SN-38, que se produjo más lentamente, con una vida media de 10,7 h (no mostrado).
Como se esperaba, la catepsina B no tuvo ningún efecto sobre la liberación de SN-38 activo en el conector CL2A. Sin embargo, CL2A tiene un enlace de carbonato de bencilo escindible, liberando SN-38 activo a una tasa similar a la del conector CL2E a pH 5,0, con una vida media de ~10,2 h (no mostrado). El conjugado de milatuzumab-doxorrubicina, que tiene un enlace de acilhidrazona sensible al pH, tuvo una vida media de 7 a 8 h a pH 5,0 (no mostrado).
Aunque todos estos conectores liberan el fármaco a tasas relativamente similares en condiciones lisosomalmente relevantes, tienen estabilidades muy diferentes en suero. El milatuzumab-CL2A-SN-38 liberó el 50% de SN-38 libre en 21,55 ± 0,17 h (no mostrado), en consonancia con otros conjugados de CL2A-SN-38. Sin embargo, el conjugado CL2E-SN-38 era muy inerte, con una vida media extrapolada a ~2100 h. El conjugado de milatuzumab-doxorrubicina liberó el 50% de la doxorrubicina en 98 h, lo que fue similar a otros 2 conjugados de anticuerpo-doxorrubicina (no mostrado).
Citotoxicidad. Un problema importante relacionado con la evaluación de estos conjugados fue la potencia relativa de la doxorrubicina y el SN-38 libres en las líneas de células tumorales sólidas y hematopoyéticas. Nuestro grupo informó anteriormente que SN-38 era activo en varias líneas celulares de linfoma de células B y leucemia aguda, con potencias que variaban de 0,13 a 2,28 nM (Sharkey et al., 2011, Mol Cancer Ther 11:224-34). La potencia de SN-38 en 4 de las líneas celulares de tumor sólido que se usaron luego para estudios de terapia in vivo variaron de 2,0 a 6 nM (no mostrado). La doxorrubicina tuvo una respuesta mixta, con una potencia de 3-4 nM en las líneas celulares de linfoma Raji y melanoma A-375, pero fue casi 10 veces menos potente contra las líneas celulares Capan-1, NCI-N87 y Hep G2. Otros estudios que compararon la potencia de SN-38 con la doxorrubicina encontraron: cáncer de colon LS174T, 18 frente a 18 (potencia nM de SN-38 frente a doxorrubicina, respectivamente); cáncer de mama MDA-MB-231, 2 frente a 2 nM; cáncer de ovario SK-OV-4, 18 frente a 90 nM; adenocarcinoma de pulmón Calu-3, 32 frente a 582 nM; cáncer de páncreas Capan-2, 37 frente a 221 nM; y cáncer de pulmón de células pequeñas NCI-H466, 0,1 frente a 2 nM. Por tanto, SN-38 fue de 5 a 20 veces más potente que la doxorrubicina en 4 de estas 6 líneas celulares, con una potencia similar en LS174T y MDA-MB-231. En conjunto, estos datos indican que la doxorrubicina es menos eficaz contra los tumores sólidos que el SN-38, mientras que SN-38 parece ser igualmente eficaz en tumores sólidos y hematopoyéticos.
Como se esperaba, las 3 formas conjugadas fueron a menudo de un orden de magnitud menos potentes que el fármaco libre in vitro, ya que se espera que ambos fármacos se transporten fácilmente a las células, mientras que los conjugados de fármacos requieren la unión de anticuerpos para transportar el fármaco dentro de la célula (no mostrado). El conjugado de SN-38 enlazado a CL2A es una excepción, ya que más del 90% del SN-38 se libera del conjugado al medio durante el período de ensayo de 4 días (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17: 3157-69; Sharkey et al., 2011, Mol Cancer Ther 11:224-34). Por tanto, incluso si el conjugado se internalizase rápidamente, sería difícil discernir las diferencias entre el fármaco libre y el fármaco enlazado a CL2A.
El SN-38 unido a CL2E estable se desempeñó comparativamente bien en la línea celular Raji, en comparación con el SN-38 libre, pero tuvo una potencia sustancialmente menor (de 7 a 16 veces) en las 4 líneas celulares de tumores sólidos, lo que sugiere que la relativamente baja expresión superficial de CD74 puede desempeñar un papel en la minimización del transporte de fármacos en estos tumores sólidos. El conjugado de milatuzumab-doxorrubicina tuvo diferencias sustanciales en su potencia en comparación con la doxorrubicina libre en todas las líneas celulares, que fue de una magnitud similar a la de los conjugados CL2E-SN-38 con SN-38 libre en las líneas celulares de tumores sólidos.
En las 6 líneas celulares adicionales mencionadas anteriormente, el conjugado de milatuzumab-CL2A-SN-38 fue de 9 a 60 veces más potente que el conjugado de milatuzumab-doxorrubicina (no mostrado), pero de nuevo, este resultado estuvo influenciado en gran medida por el hecho de que el conjugado enlazado a CL2A libera la mayor parte de su SN-38 en el medio durante el período de incubación de 4 días, mientras que el conjugado de doxorrubicina liberaría como máximo el 50% de su fármaco durante este mismo tiempo. El milatuzumab enlazado a CL2E no se examinó en estas otras líneas celulares.
Terapia in vivo de xenoinjertos de tumores humanos. Estudios previos in vivo con los conjugados de milatuzumab-doxorrubicina o SN-38 preparados con varios anticuerpos habían indicado que eran eficaces a dosis mucho más bajas que su dosis máxima tolerada (Griffiths et al., 2003, Clin Cancer Res 9: 6567-71; Sapra et al., 2005, Clin Cancer Res 11:5257-64; Govindan et al., 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61; Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69; Sharkey et al., 2011, Mol Cancer Ther 11:224-34), y por lo tanto las pruebas in vivo se centraron en comparar cantidades similares, pero fijas, de cada conjugado a niveles que eran bien tolerados.
Los estudios iniciales examinaron primero los conjugados de doxorrubicina y SN-38 en un modelo de linfoma Raji diseminado para evaluar cómo se compara el conjugado de milatuzumab-doxorrubicina con los 2 conjugados de SN-38 (no mostrado). Todos los conjugados específicos fueron significativamente mejores que el conjugado de labetuzumab-SN-38 no de direccionamiento o los animales tratados con solución salina, que tuvieron una supervivencia mediana de solo 20 días (P <0,0001). A pesar de que los estudios in vitro indicaron una ventaja de hasta 8 veces para los conjugados SN-38 en Raji, la mejor supervivencia se observó con los conjugados de milatuzumab-doxorrubicina, donde a todos los animales a los que se les dio una única dosis de 17,5 mg/kg (350 pg) y a 7/10 animales a los que se les dieron 2,0 mg/kg (40 pg) estaban vivos al final del estudio (día 112) (por ejemplo, dosis de 17,5 mg/kg de milatuzumab-doxorrubicina frente a milatuzumab-CL2A-SN-38, P =0,0012). La supervivencia fue significativamente menor para los conjugados de CL2E-SN-38 más estables (P< 0,0001 y P = 0,0197, dosis de 17,5 y 2,0 mg/kg para CL2A frente a CL2E, respectivamente), aunque los estudios in vitro sugirieron que ambos conjugados liberan SN-38 activo a tasas similares cuando se internaliza.
Se examinaron cinco líneas celulares de tumores sólidos, comenzando con la línea celular de melanoma A-375, ya que tenía la mejor respuesta in vitro tanto a la doxorrubicina como al SN-38. Los xenoinjertos de A-375 crecieron rápidamente, teniendo los animales de control tratados con solución salina una supervivencia mediana de sólo 10,5 días (no mostrado). Una dosis de dos veces por semana de 12,5 mg/kg (0,25 mg por animal) del conjugado milatuzumab-CL2A-SN-38 prolongó la supervivencia a 28 días (P = 0,0006), que fue significativamente mejor que el conjugado de epratuzumab-CL2A-SN-38 de control que tiene una supervivencia mediana de 17,5 días (P = 0,0089), y este último no es significativamente diferente de los animales tratados con solución salina (P = 0,1967). El conjugado de milatuzumab-CL2A proporcionó una supervivencia significativamente mayor que el conjugado de milatuzumab-CL2E-SN-38 (P = 0,0014), que tuvo la misma supervivencia mediana de 14 días que su conjugado de epratuzumab-CL2E-SN-38 de control. A pesar de administrar una dosis dos veces mayor de milatuzumab-doxorrubicina que los conjugados SN-38, la supervivencia mediana no fue mejor que la de los animales tratados con solución salina (10,5 días).
Al igual que con el modelo de melanoma A-375, en Capan-1, solo fue eficaz el conjugado SN-38 enlazado a CL2A, con una supervivencia mediana de 35 días, significativamente diferente de los animales no tratados (P <0.036) (no mostrado), incluso a una dosis más baja (5 mg/kg; 100 pg por animal) (P<0,02). Ni los conjugados de milatuzumab-CL2E ni los de epratuzumab-CL2A-SN-38 no de direccionamiento, o una dosis 2 veces mayor del conjugado de milatuzumab-doxorrubicina, proporcionaron ninguna ventaja de supervivencia (P = 0,44 frente a solución salina). Es de destacar que en el mismo estudio con animales que recibieron la misma dosis del conjugado anti-TROP-2 CL2A-SN-38 de internalización (hRS7-SN-38; IMMU-132), la supervivencia mediana fue igual a milatuzumab-CL2A- SN-38 (no mostrado). El conjugado hRS7-CL2A-SN-38 se había identificado previamente como un ADC de interés para el tratamiento de una variedad de tumores sólidos (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69). El MFI para hRS7 de unión a superficie en Capan-1 fue de 237 (no mostrado), en comparación con 22 para milatuzumab (ver la Tabla 10). Por tanto, a pesar de tener una expresión de antígeno de superficie sustancialmente más baja, el conjugado de milatuzumab-CL2A-SN-38 funcionó tan bien como el conjugado de hRS7-CL2A-SN-38 en este modelo.
Como el conjugado de milatuzumab-doxorrubicina tuvo resultados terapéuticos inferiores en 2 de los xenoinjertos de tumor sólido, el enfoque cambió para comparar los conjugados de milatuzumab-SN-38 con los conjugados de SN-38 preparados con otros anticuerpos humanizados contra TROP-2 (hRS7) o CEACAM6 (hMN-15), que se expresan más en la superficie de muchos tumores sólidos (Blumenthal et al., 2007, BMC Cancer 7:2; Stein et al., 1993, Int J Cancer 55:938-46). Se examinaron tres modelos de xenoinjerto adicionales.
En el modelo de tumor gástrico, NCI-N87, los animales que recibieron 17,5 mg/kg/dosis (350 pg) de milatuzumab-CL2A-SN-38 mejoraron algo la supervivencia, pero no alcanzaron la significancia estadística en comparación con los animales tratados con solución salina (31 frente a 14 días; P = 0,0760) o con el conjugado anti-CD20-CL2A-SN39 de veltuzumab que no se une (21 días; P = 0,3128) (no mostrado). Sin embargo, los conjugados hRS7- y hMN-15-CL2A mejoraron significativamente la supervivencia mediana a 66 y 63 días, respectivamente (P = 0,0001). El MFI para TRo P-2 y CEACAM6 expresados en superficie fue 795 y 1123, respectivamente, mucho más alto que CD74 que fue solo 5 (ver la Tabla 10). La inmunohistología mostró una expresión citoplasmática relativamente intensa de CD74 en el xenoinjerto de esta línea celular, pero lo que es más importante, estaba dispersa, apareciendo solo en bolsas definidas dentro del tumor (no mostrado). CEACAM6 y TROP-2 se expresaron más uniformemente que CD74 (no mostrado), estando CEACAM6 más intensamente presente tanto en el citoplasma como en la membrana, y TROP-2 se encontraba principalmente en la membrana. Por tanto, la supervivencia mejorada con los conjugados anti-CEACAM6 y anti-TROP-2 muy probablemente refleja tanto una densidad de antígeno más alta como una expresión más uniforme en NCI-N87.
En la línea celular de hepatoma Hep-G2 (no mostrada), la inmunohistología mostró una expresión muy uniforme con una tinción citoplasmática moderada de CD74, y la citometría de flujo indicó una expresión superficial relativamente baja (MFI = 9). El MFI con hMN-15 fue de 175 y la inmunohistología mostró una expresión citoplasmática y de membrana bastante uniforme de CEACAM6, con bolsas aisladas de tinción de membrana muy intensa (no mostrado). Un estudio en animales con xenoinjertos de Hep-G2 encontró que el milatuzumab-CL2A-SN-38 extendió la supervivencia a 45 días en comparación con los 21 días en el grupo tratado con solución salina (P = 0,0048), mientras que el conjugado hMN-15-CL2A-SN-38 mejoró la supervivencia a 35 días. Hubo una tendencia a favor del conjugado de milatuzumab sobre hMN-15-CL2A-SN-38, pero no alcanzó significancia estadística (46 frente a 35 días; P = 0,0802). Sin embargo, el conjugado de veltuzumab-CL2A-SN-38 que no se une proporcionó una ventaja de supervivencia similar a la del conjugado de milatuzumab. Previamente, observamos que los resultados terapéuticos con conjugados que no se unen podrían ser similares a los del conjugado enlazado a CL2A específico, particularmente a dosis de proteínas más altas, pero la titulación de los conjugados específicos y de control generalmente se revela de manera selectiva. Por tanto, ninguno de los conjugados específicos proporcionó una ventaja terapéutica selectiva a estas dosis en esta línea celular.
Otro estudio que usó la línea celular de hepatoma HuH-7 (no mostrado), que tenía una expresión de superficie similar, pero niveles citoplasmáticos ligeramente más bajos que Hep-G2 (ver la Tabla 10), descubrió que el conjugado hMN-15-SN-38 proporionaba una ventaja de supervivencia más prolongada (35 frente a 18 días), aunque no significativamente diferente, que el conjugado de milatuzumab-CL2A (P = 0,2944). Aunque los conjugados de hMN-15 y milatuzumab fueron significativamente mejores que los animales tratados con solución salina (P = 0,008 y 0,009, respectivamente), de nuevo, ninguno de los conjugados fue significativamente diferente del conjugado de veltuzumab-SN-38 no dirigido a este nivel de dosis (P = 0,4602 y 0,9033, respectivamente). La expresión superficial de CEACAM6 fue relativamente baja en esta línea celular (MFI = 81), y la inmunohistología mostró que tanto CD74 (no mostrado) como CEACAM6 (no mostrado) eran muy débiles y estaban muy dispersos.
Análisis
El enfoque del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) para la quimioterapia selectiva de tumores es un área de considerable interés actual (por ejemplo, Govindan et al., 2012, Expert Opin Biol Ther 12:873-90; Sapra et al., 2011, Expert Opin Biol Ther 20:1131-49. Los éxitos clínicos recientes (Pro et al., 2012, Expert Opin Biol Ther 12:1415-21; LoRusso et al., 2011, Clin Cancer Res 17:437-47) se han producido en gran parte con la adopción de fármacos supertóxicos en lugar de los agentes quimioterapéuticos convencionales que se habían usado con anterioridad. Sin embargo, la selección del objetivo, el anticuerpo y el conector del fármaco son todos factores que influyen en el rendimiento óptimo de un ADC. Por ejemplo, en el caso de trastuzumab-DM1, HER2 abunda en los tumores que expresan este antígeno, el anticuerpo se internaliza y el propio anticuerpo tiene actividad antitumoral, todo lo cual podría combinarse para mejorar el resultado terapéutico. En marcado contraste, CD74 se expresa a un nivel mucho más bajo en la superficie de las células, pero sus propiedades únicas de internalización y reexpresión en la superficie han permitido que un ADC anti-CD74 de milatuzumab sea eficaz en modelos de xenoinjerto de cáncer hematopoyético incluso con un fármaco moderadamente tóxico, como la doxorrubicina (Griffiths et al., 2003, Clin Cancer Res 9:6567-71; Sapra et al., 2005, Clin Cancer Res 11:5257-64). Aunque la doxorrubicina se usa con más frecuencia en los cánceres hematopoyéticos, mientras que el SN-38 y otras camptotecinas se administran a pacientes con tumores sólidos, decidimos evaluar la utilidad de la doxorrubicina y los conjugados de SN-38 de milatuzumab en tumores sólidos. El conjugado de milatuzumab-doxorrubicina fue eficaz en modelos de xenoinjerto de varios cánceres hematológicos, lo que llevó a su prueba clínica (NCT01101594 y NCT01585688), mientras que varios conjugados de SN-38 fueron eficaces en modelos de tumores sólidos y hematológicos, lo que llevó a la creación de 2 nuevos conjugados de SN-38 siendo buscados en ensayos clínicos de Fase I de cáncer colorrectal y epiteliales diversos (NCT01270698 y NCT01631552).
In vitro, la doxorrubicina no conjugada y SN-38 tuvieron una potencia similar a la de la doxorrubicina contra la línea celular de linfoma Raji, pero SN-38 fue más potente en varias líneas celulares de tumores sólidos diferentes. Curiosamente, in vivo, el conjugado de milatuzumab-doxorrubicina proporcionó la mejor respuesta en Raji en comparación con los conjugados de milatuzumab-SN-38. Sin embargo, en Capan-1 y A-375, milatuzumabdoxorrubicina fue menos eficaz que el conjugado de milatuzumab SN-38 enlazado a CL2A, aunque las pruebas in vitro indicaron que A-375 era igualmente sensible a la doxorrubicina libre que al SN-38 libre. Otras dos líneas celulares, cáncer de mama MDA-MB-231 y cáncer de colon LS174T, también tenían una potencia similar con doxorrubicina libre como SN-38 in vitro, pero dado que las pruebas in vitro indicaron que SN-38 fue igualmente eficaz en cánceres sólidos y hematológicos, y como SN-38 tiene una potencia de 5 a 20 veces mayor que la doxorrubicina en la mayoría de las líneas celulares de tumores sólidos evaluadas, decidimos centrarnos en los 2 conjugados de milatuzumab-SN-38 para la terapia de tumores sólidos. Sin embargo, para evaluar mejor la utilidad de los conjugados de milatuzumab-SN-38, incluimos una evaluación comparativa con los ADC de SN-38 preparados con anticuerpos contra otros antígenos que están presentes en una variedad de tumores sólidos.
Anteriormente, habíamos investigado las respuestas terapéuticas con el conjugado SN-38 enlazado a CL2A anti-TROP-2 hRS7 internalizado en la línea celular Capan-1 (Cardillo et al., 2011, Clin Cancer Res 17: 3157-69) y, por lo tanto, se comparó la eficacia de los conjugados de milatuzumab y hRS7 SN-38. En este estudio, ambos conjugados mejoraron significativamente la supervivencia en comparación con los anticuerpos de control, con los conjugados de SN-38 enlazados a CL2A de cada uno fueron superiores a los conjugados enlazados a CL2E. Como la citometría de flujo había indicado que la expresión de TROP-2 era mayor que la de CD74 en Capan-1, este resultado sugirió que las capacidades de transporte de CD74, que se sabía que eran excepcionales, eran más eficientes que las de TROP-2. Sin embargo, es bien sabido que la accesibilidad del antígeno (es decir, barreras de membrana frente a citoplasma, fisiológicas y de "sitio de unión") y la distribución entre las células dentro de un tumor son factores críticos que influyen en todas las formas de terapia dirigida, particularmente aquellas que dependen de una administración intracelular adecuada de un producto a células individuales (Thurber et al., 2008, Adv Drug Del Rev 60:1421-34). En situaciones en las que el antígeno no se expresa uniformemente en todas las células dentro del tumor, tener un agente dirigido que libere lentamente su carga útil después de localizarse en el tumor, como los conjugados enlazados a CL2A, permitiría que el fármaco se difunda a células transeúntes no dirigidas, mejorando de este modo su intervalo de eficacia. De hecho, la alta expresión de antígeno podría impedir potencialmente la penetración del tumor según el efecto de barrera del sitio de unión, pero el mecanismo de liberación extracelular podría proporcionar un mecanismo para que el fármaco se difunda dentro del tumor. También se piensa que este mecanismo ayuda a la eficacia de otros conjugados que hemos examinado usando anticuerpos de internalización deficiente, como anti-CEACAM5 y anti-CEACAM6 usados en la presente. Los conjugados basados en milatuzumab dependen más de la interacción directa del anticuerpo con la célula tumoral, aprovechando la rápida internalización y reexpresión de CD74 que puede compensar su menor abundancia en la superficie de las células. Sin embargo, esta ventaja se vería mitigada cuando el CD74 esté muy disperso dentro del tumor, y sin un mecanismo para retener el conjugado dentro del tumor, se perdería el beneficio de la liberación lenta del fármaco del conjugado. Una revisión previa de tumores gastrointestinales humanos realizada por nuestro grupo sugiere que a menudo tienen un alto nivel de expresión con buena uniformidad (Gold et al., 2010, Int J Clin Exp Pathol 4:1-12).
Durante nuestra evaluación inicial de conectores adecuados para SN-38, se examinó una serie de derivados diferentes, incluyendo un conector similar a 'CL2E' que fue diseñado para acoplarse en la posición 20-hidroxilo de SN-38, similar al conector CL2A. Sin embargo, ese conjugado de anticuerpos carecía de suficiente actividad antitumoral y no se buscó. Dadas las excepcionales propiedades de internalización de milatuzumab, decidimos revisar la química del conector SN-38, con la hipótesis de que la rápida internalización de un conjugado de CD74 mejoraría la carga de fármaco de un conjugado más estable. Supusimos que, si el grupo saliente era fenólico, esto podría promover la ciclación y, por lo tanto, el conector CL2E se diseñó para unirse en la posición fenólica 10 de SN-38.
Al principio, el conjugado de SN-38 enlazado a CL2E tenía una IC50 prometedoramente similar a la del conjugado de c L2A en la línea celular Raji, lo que era consistente con la opinión de que, si se internalizaban rápidamente, ambos conjugados liberarían la forma activa de SN-38 aproximadamente a la misma tasa. Sin embargo, como ya se ha mencionado, la actividad in vitro del conjugado de CL2A está influenciada en gran medida por la liberación de SN-38 en el medio y no refleja necesariamente la captación por el conjugado intacto. Cuando se descubrió que el conjugado enlazado a CL2E era mucho menos potente en las líneas de células tumorales sólidas que el conjugado de CL2A, esto sugirió que la menor expresión superficial de CD74 afectó a la internalización de SN-38 a través de la unión de milatuzumab. Sin embargo, cuando los estudios in vivo en Raji mostraron que el milatuzumab-CL2A-SN-38 era superior al conjugado de CL2E, se tuvo que considerar algún otro factor que afectaría a la eficacia de CL2E. Una posible explicación es que el diseño del conector en CL2E-SN-38 deja la posición 20 del fármaco sin derivatizar, lo que hace que el grupo lactona sea susceptible a la apertura del anillo. De hecho, los estudios con irinotecán han demostrado que la potencia de SN-38 se ve disminuida por una serie de factores, con la apertura del anillo de lactona a la forma de carboxilato que posee solo el 10% de la potencia de la forma de lactona intacta. Por el contrario, el SN-38 enlazado a CL2A se derivatiza en la posición 20-hidroxilo, un proceso que estabiliza el grupo lactona en las camptotecinas en condiciones fisiológicas. Por tanto, es probable que el anillo de lactona de SN-38 esté protegido contra la escisión en el conjugado CL2A, pero no en el CL2E. Por tanto, la desestabilización del anillo de lactona podría hacer contribuido a la eficacia disminuida de CL2E in vivo. Como los estudios de estabilidad in vitro y el análisis de la estabilidad del suero se realizaron en condiciones ácidas, no tenemos una medida directa de la forma carboxilato de SN-38 en ninguno de estos conjugados.
En conclusión, los resultados in vitro e in vivo indican que el conjugado de milatuzumab-doxorrubicina es superior al conjugado de CL2A-SN-38 en la línea celular de linfoma de Raji, lo que puede reflejar la estabilidad mejorada del conjugado de doxorrubicina en comparación con el de CL2A. Sin embargo, el descubrimiento de que el conjugado de CL2A-SN-38 fue más eficaz que el conjugado altamente estable de CL2E-SN-38 sugiere que pueden estar en juego otros problemas, potencialmente relacionados con la activación de la sensibilidad al fármaco o la línea celular.
CD74 tiene múltiples funciones en la biología celular; en las células presentadoras de antígenos, puede tener una función más dominante en el procesamiento de péptidos antigénicos, mientras que en los tumores sólidos, su función podría estar más relacionada con la supervivencia. Estas diferentes funciones podrían afectar al tráfico y al procesamiento intracelular. Alternativamente, la menor eficacia del SN-38 enlazado a CL2E podría reflejar la inactivación del fármaco por la apertura del anillo de lactona en SN-38, lo que implica la importancia del conector específico. Finalmente, en los modelos de tumor sólido, la accesibilidad del antígeno parece tener una función dominante en la definición de la potencia de milatuzumab-CL2A-SN-38 cuando se mide frente a conjugados preparados con otros anticuerpos de internalización (hRS7) o de internalización deficiente (hMN15) que eran más accesibles (expresados en superficie) y abundantes. Sospechamos que este descubrimiento es universal para las terapias dirigidas, pero estos estudios han demostrado al menos que las propiedades de internalización únicas de un agente dirigido a CD74 pueden proporciona una eficacia significativa incluso cuando la expresión de superficie del antígeno objetivo es mínima.
Ejemplo 14. Uso de hRS7-SN-38 (IMMU-132) para tratar el cáncer de colon metastásico refractario a la terapia (mCRC)
La paciente era una mujer de 62 años con mCRC que originalmente presentó enfermedad metastásica en enero de 2012. Se sometió a una colectomía transversa ileal laparoscópica como primera terapia un par de semanas después del diagnóstico y luego recibió 4 ciclos de FOLFOX (leucovorina, 5 -fluorouracilo, oxaliplatino) quimioterapia en un entorno neoadyuvante antes de la hepatectomía derecha en marzo de 2012 para la extirpación de lesiones metastásicas en el lóbulo derecho del hígado. A esto le siguió un régimen adyuvante de FOLFOX que se reanudó en junio de 2012, para un total de 12 ciclos de FOLFOX. En agosto, el oxaliplatino se eliminó del régimen debido al empeoramiento de la neurotoxicidad. Su último ciclo de 5-FU fue el 25/09/2012.
La CT realizada en enero de 2013 mostró metástasis en el hígado. Luego fue evaluada como una buena candidata para la inscripción en el estudio de investigación IMMU-132 (hRS7-SN-38). Las comorbilidades en su historial médico incluyen asma, diabetes mellitus, hipertensión, hipercolesterolemia, soplo cardíaco, hernia de hiato, hipotiroidismo, síndrome del túnel carpiano, glaucoma, depresión, síndrome de piernas inquietas y neuropatía. Su historial quirúrgico incluye ligadura tubular (1975), tiroidectomía (1983), colescistectomía (2001), liberación del túnel carpiano (2008) y cirugía de glaucoma.
En el momento de ingresar en este ensayo, su lesión objetivo era un tumor de 3,1 cm en el lóbulo izquierdo del hígado. Las lesiones no objetivo incluyeron varias masas hipoatenuadas en el hígado. Su CEA de referencia era de 781 ng/m.
Después de que la paciente firmase el consentimiento informado, se administró IMMU-132 en un programa de una vez a la semana por infusión durante 2 semanas consecutivas, luego una semana de descanso, constituyendo esto un ciclo de tratamiento. Estos ciclos se repitieron según la tolerancia. La primera infusión de IMMU-132 (8 mg/kg) se inició el 15 de febrero de 2013 y se completó sin eventos notables. Experimentó náuseas (Grado 2) y fatiga (Grado 2) durante el curso del primer ciclo y ha continuado el tratamiento desde entonces sin eventos adversos importantes. Informó de alopecia y estreñimiento en marzo de 2013. La primera evaluación de respuesta realizada (después de 6 dosis) el 08/04/2013 mostró una reducción de la lesión objetivo de un 29% mediante tomografía computarizada (CT). Su nivel de CEA disminuyó a 230 ng/ml el 25 de marzo de 2013. En la segunda evaluación de respuesta (después de 10 dosis) el 23 de mayo de 2013, la lesión objetivo se redujo en un 39%, constituyendo por tanto una respuesta parcial por criterios RECIST. Ha continuado el tratamiento desde el 14/06/13, recibiendo 6 ciclos que constituyen 12 dosis de hRS7-SN-38 (IMMU-132) a 8 mg/kg. Su salud general y sus síntomas clínicos mejoraron considerablemente desde que comenzó este tratamiento de investigación.
Ejemplo 15. Uso de hRS7-SN-38 (IMMU-132) para tratar el cáncer de mama metastásico refractario a la terapia
La paciente era una mujer de 57 años con cáncer de mama en estadio IV, triple negativo (ER/PR negativo, HER-neu negativo), diagnosticado originalmente en 2005. Se sometió a una lumpectomía de la mama izquierda en 2005, seguida de ACT de dosis densa en un entorno adyuvante en septiembre de 2005. Luego recibió radioterapia, que finalizó en noviembre. La recurrencia local de la enfermedad se identificó cuando la paciente palpó un bulto en la mama contralateral (derecha) a principios de 2012 y luego se trató con quimioterapia c Mf (ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo). Su enfermedad recurrió en el mismo año, con lesiones metastásicas en la piel de la pared torácica. Luego recibió régimen de quimioterapia de carboplatino TAXOL®, durante el cual se produjo trombocitopenia. Su enfermedad progresó y comenzó con doxorrubicina semanal, que continuó durante 6 dosis. La enfermedad de la piel también estaba progresando. Una exploración FDG-PET el 26/09/2012 mostró progresión de la enfermedad en la pared torácica y ganglios axilares sólidos y agrandados. La paciente recibió oxicodona para el control del dolor.
Se le administró IXEMPRA® desde octubre de 2012 hasta febrero de 2013 (cada 2 semanas durante 4 meses), cuando la lesión de la pared torácica se abrió y sangró. Luego le administraron XELODA®, que no toleraba bien debido a la neuropatía en manos y pies, así como al estreñimiento. Las lesiones cutáneas fueron progresivas y luego se inscribió en el ensayo IMMU-132 después de dar su consentimiento informado. La paciente también tenía historial médico de hipertiroidismo y trastornos visuales, con alto riesgo de enfermedad del SNC (sin embargo, la MRI cerebral fue negativa para enfermedad del SNC). En el momento de la inscripción en este ensayo, sus lesiones cutáneas (objetivo) en la mama derecha medían 4,4 cm y 2,0 cm en el diámetro más grande. Tenía otra lesión no objetivo en la mama derecha y un ganglio linfático agrandado en la axila derecha e izquierda.
La primera infusión de IMMU-132 (12 mg/kg) se inició el 12 de marzo de 2013, la cual fue bien tolerada. Su segunda infusión se retrasó debido a una reducción del recuento absoluto de neutrófilos (RAN) de Grado 3 (0,9) en el día programado de la infusión, una semana después. Después de una semana de retraso y después de recibir NEULASTA®, se le administró su segunda IMMU-132, con una reducción de la dosis del 25% a 9 mg/kg. Posteriormente, ha estado recibiendo IMMU-132 según lo programado según el protocolo, una vez a la semana durante 2 semanas, luego una semana de descanso. Su primera evaluación de respuesta el 17 de mayo de 2013, después de 3 ciclos de terapia, mostró una disminución del 43% en la suma del diámetro largo de las lesiones objetivo, lo que constituye una respuesta parcial según los criterios RECIST. Continúa el tratamiento al nivel de dosis de 9 mg/kg. Su salud general y sus síntomas clínicos mejoraron considerablemente desde que comenzó el tratamiento con IMMU-132.
Ejemplo 16. Uso de hRS7-SN-38 (IMMU-132) para tratar cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico refractario
Se trata de un hombre de 60 años diagnosticado con cáncer de pulmón de células no pequeñas. El paciente recibe regímenes de quimioterapia de carboplatino, bevacizumab durante 6 meses y muestra una respuesta, y luego, después de progresar, recibe ciclos adicionales de quimioterapia con carboplatino, etopósido, TAXOTERE®, gemcitabina durante los 2 años siguientes, con respuestas ocasionales que no duran más de 2 meses. El paciente presenta entonces una masa mediastínica izquierda de 6,5 x 4 cm y derrame pleural.
Después de firmar el consentimiento informado, al paciente se le administra IMMU-132 a una dosis de 18 mg/kg cada dos semanas. Durante las dos primeras inyecciones, se experimentan períodos breves de neutropenia y diarrea, con 4 deposiciones en 4 horas, pero se resuelven o responden a los medicamentos sintomáticos en 2 días. Después de un total de 6 infusiones de IMMU-132, la evaluación por CC de la lesión índice muestra una reducción del 22%, justo por debajo de una respuesta parcial pero una reducción definitiva del tumor. El paciente continúa con esta terapia durante otros dos meses, cuando se observa por CT una respuesta parcial de reducción tumoral del 45% de la suma de los diámetros de la lesión índice, constituyendo por tanto una respuesta parcial según los criterios RECIST.
Ejemplo 17. Uso de hRS7-SN-38 (IMMU-132) para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas metastásico refractario
Esta es una mujer de 65 años de edad con un diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas que afecta el pulmón izquierdo, los ganglios linfáticos mediastínicos y evidencia en MRI de metástasis en el lóbulo parietal izquierdo del cerebro. La quimioterapia previa incluye carboplatino, etopósido y topotecán, pero no se observó respuesta. La radioterapia tampoco logra controlar su enfermedad. Luego se le administra IMMU-132 a una dosis de 18 mg/kg una vez cada tres semanas para un total de 5 infusiones. Después de la segunda dosis, experimenta hipotensión y neutropenia de grado 2, que mejoran antes de la siguiente infusión. Después de la quinta infusión, un estudio de Ct muestra una reducción del 13% de su masa pulmonar izquierda objetivo. La m Ri del cerebro también muestra una reducción del 10% de esta metástasis. Continúa con su dosificación de IMMU-132 cada 3 semanas durante otros 3 meses y continúa mostrando una mejoría objetiva y subjetiva de su condición, con una reducción del 25% de la masa del pulmón izquierdo y una reducción del 21% de la metástasis cerebral.
Ejemplo 18. Terapia de un paciente con cáncer gástrico con enfermedad metastásica en estadio IV con hRS7-SN-38 (IMMU-132)
Este paciente es un varón de 60 años con antecedentes de tabaquismo y períodos de consumo excesivo de alcohol durante un período de 40 años. Experimenta pérdida de peso, incomodidad para comer y dolor que no se alivia con los antiácidos, dolor abdominal frecuente, dolor lumbar y, más recientemente, ganglios palpables en ambas axilas. Busca consejo médico y, después de un estudio diagnóstico, se muestra que tiene un adenocarcinoma, incluyendo algunas características escamosas, en la unión gastroesofágica, en base a una biopsia a través de un gastroscopio. Los estudios radiológicos (TC y FDG-PET) también revelan enfermedad metastásica en axila derecha e izquierda, región mediastínica, columna lumbar e hígado (2 tumores en el lóbulo derecho y 1 en el izquierdo, todos de entre 2 y 4 cm de diámetro). Se reseca su tumor gástrico y luego se lo somete a un ciclo de quimioterapia con epirrubicina, cisplatino y 5-fluorouracilo. Después de 4 meses y un periodo de descanso de 6 semanas, se cambia a quimioterapia con docetaxel, que tampoco logra controlar su enfermedad, en base a la progresión confirmada por mediciones de CR de los tumores metastásicos y alguna desorientación general.
Luego, el paciente recibe terapia con IMMU-132 (hRS7-SN-38) a una dosis de 10 mg/kg infundidos cada dos semanas por un total de 6 dosis, después de lo cual se realizan estudios de CT para evaluar el estado de su enfermedad. Estas infusiones se toleran bien, con algunas náuseas y diarrea leves, que se controlan con medicamentos sintomáticos. Los estudios de CT revelan que la suma de sus lesiones metastásicas índice ha disminuido en un 2 8 %, por lo que continúa con esta terapia durante otros 5 ciclos. Los estudios de CT de seguimiento muestran que la enfermedad sigue estando reducida en aproximadamente un 35% según los criterios RECIST con respecto a sus mediciones de referencia antes de la terapia con IMMU-132, y su estado general también parece haber mejorado, con el paciente recuperando una actitud optimista hacia su enfermedad que está bajo control.
Ejemplo de referencia 19. Terapia de paciente con cáncer de colon avanzado refractario a quimioinmunoterapia previa, usando solo IMMU-130 (labetuzumab-SN-38)
El paciente es un hombre de 50 años con historial de cáncer de colon metastásico en estadio IV, diagnosticado por primera vez en 2 0 0 8 y sometido a una colectomía y hepatectomía parcial para los cánceres de colon primario y metastásico, respectivamente. Luego recibió quimioterapia, según lo indicado. FIG. 8, que incluía irinotecán, oxaliplatino, FOLFIRINOX (5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán, oxaliplatino) y bevacizumab, así como bevacizumab combinado con 5-fluorouracilo/leucovorina, durante casi 2 años. A partir de entonces, recibió ciclos de cetuximab, ya sea solo o combinado con quimioterapia FOLFIRI (leucovorina, 5-fluorouracilo, irinotecán) durante el siguiente año o más. En 2009, recibió terapia de ablación por radiofrecuencia de sus metástasis hepáticas mientras estaba bajo quimioinmunoterapia, y a finales de 2010 se sometió a una resección en cuña de sus metástasis pulmonares, que se repitió unos meses después, a principios de 2011. A pesar de haber recibido quimioinmunoterapia en 2011, aparecieron nuevas metástasis pulmonares a finales de 2011, y en 2012 se visualizaron metástasis tanto pulmonares como hepáticas. Su título de referencia de antígeno carcinoembrionario (CEA) en plasma fue de 12,5 ng/ml justo antes de someterse a la terapia de anticuerpos y fármacos con IMMU-130. Las lesiones índice elegidas por el radiólogo para medir el cambio de tamaño del tumor mediante tomografía computarizada fueron el lóbulo medio del pulmón derecho y las metástasis hepáticas, ambas con un total de 91 mm como la suma de sus diámetros más largos en el valor de referencia antes de la terapia de IMMU-130 (anti-CEACAM5-SN-38).
Este paciente recibió dosis de 16 mg/kg de IMMU-130 por infusión IV lenta cada dos semanas para un total de 17 dosis de tratamiento. El paciente toleró bien la terapia, teniendo solo náuseas, diarrea y fatiga de grado 1 después del primer tratamiento, lo que se produjo después de los tratamientos 4 y 5, pero no posteriormente, porque recibió medicación para estos efectos secundarios. Después del tratamiento 3, mostró alopecia (grado 2), que estuvo presente durante la terapia posterior. Las náuseas, la diarrea y los vómitos ocasionales duraron solo 2 o 3 días, y su fatiga después de la primera infusión duró 2 semanas. Por lo demás, el paciente toleró bien la terapia. Debido a la larga duración de la recepción de este anticuerpo humanizado (injertado con CDR) conjugado con SN-38, se midió su sangre en busca de anticuerpos anti-labetuzumab y no se detectó ninguno, incluso después de 16 dosis.
Las primeras mediciones de tomografía computarizada (CT) se realizaron después de 4 tratamientos y mostraron un cambio del 28,6% con respecto a la suma de las mediciones realizadas al inicio, antes de esta terapia, en las lesiones índice. Después de 8 tratamientos, esta reducción pasó a ser del 40,6%, constituyendo por tanto una remisión parcial según los criterios RECIST. Esta respuesta se mantuvo durante otros 2 meses, cuando sus mediciones de CT indicaron que las lesiones índice eran un 31,9% menores que las mediciones de referencia, pero algo más altas que la disminución anterior del 40,6% medida. Por tanto, en base a las mediciones de CT cuidadosas de las lesiones índice en el pulmón y el hígado, este paciente, en el que había fracasado la quimioterapia y la inmunoterapia anteriores, incluyendo el irinotecán (molécula principal de SN-38), mostró una respuesta objetiva al metabolito activo del irintotecán (o camptotequina), SN-38, cuando se dirige a través del anticuerpo humanizado anti-CEACAM5, labetuzumab (hMN-14). Fue sorprendente que aunque el irinotecán (CPT-11) actúa liberando SN-38 in vivo, el anticuerpo anti-CEACAM5 conjugado con SN-38 demostró ser eficaz en un paciente con cáncer colorrectal al inducir una respuesta parcial después de que el paciente no respondiera previamente a su última terapia que contenía irinotecán. La reducción del título de CEA en plasma del paciente también corroboró los descubrimientos de la CT: cayó del nivel de referencia de 12,6 ng/ml a 2,1 ng/ml después de la tercera dosis de terapia, y estuvo entre 1,7 y 3,6 ng/ml entre las dosis 8 y 12. Habitualmente se considera que el título en plasma normal de CEA está entre 2,5 y 5,0 ng/ml, por lo que esta terapia efectuó una normalización de su título CEA en la sangre.
Ejemplo de referencia 20. Terapia de un paciente con cáncer de colon avanzado con IMMU-130
Esta paciente es una mujer de 75 años de edad inicialmente diagnosticada con cáncer de colon metastásico (Estadio IV). Tiene una hemicolectomía parcial derecha y resección de su intestino delgado y luego recibe las terapias FOLFOX, FOLFOX bevacizumab, FOLFIRI ramucirumab y FOLFIRI cetuximab durante un año y medio, cuando muestra progresión de la enfermedad, con diseminación de la enfermedad al fondo de saco posterior, omento, con ascitis en la pelvis y derrame pleural en el lado derecho de la cavidad torácica. Su título de CEA de referencia justo antes de esta terapia es de 15 ng/ml. Se le administran 6 mg/kg de IMMU-130 (anti-CEACAM5-SN-38) dos veces por semana durante 2 semanas consecutivas, y luego una semana de descanso (ciclo de 3 semanas), para más de 20 dosis, lo que se tolera muy bien, sin ninguna toxicidad hematológica o no hematológica importante. En el plazo de 2 meses de terapia, su título de CEA en plasma se reduce modestamente a 1,3 ng/ml, pero en la evaluación de 8 semanas muestra una reducción del 21% de las lesiones tumorales índice, que aumenta a una reducción del 27% a las 13 semanas. Sorprendentemente, la ascitis y el derrame pleural del paciente disminuyen (este último desapareciendo) en este momento, mejorando por tanto notablemente el estado general del paciente. La paciente continúa con su terapia de investigación.
Ejemplo de referencia 21. Paciente con cáncer gástrico con enfermedad metastásica en estadio IV tratado con IMMU-130
El paciente es un varón de 52 años que buscó atención médica por malestar gástrico y dolor relacionado con la alimentación desde hacía unos 6 años y con pérdida de peso en los últimos 12 meses. La palpación del área del estómago revela un bulto firme que se sometió luego a gastroscopia, revelando una masa ulcerosa en la parte inferior del estómago. Se realiza una biopsia y se diagnostica como un adenocarcinoma gástrico. Las pruebas de laboratorio no revelan cambios anormales específicos, excepto que las pruebas de función hepática, LDH y CEA están elevados, siendo este último de 10,2 ng/ml. Luego, la paciente se somete a una exploración PET de cuerpo completo, que revela, además del tumor gástrico, enfermedad metastásica en la axila izquierda y en el lóbulo derecho del hígado (2 pequeñas metástasis). Al paciente se le reseca el tumor gástrico y luego se toman mediciones de CT de referencia de sus tumores metastásicos. Cuatro semanas después de la cirugía, recibe 3 ciclos de quimioterapia de combinación que consisten de un régimen de cisplatino y 5-fluorouracilo (CF), pero no lo tolera bien, por lo que se cambia al tratamiento con docetaxel. Parece que la enfermedad se estabiliza durante aproximadamente 4 meses, en base a las exploraciones por CT, pero luego las quejas del paciente por mayor pérdida de peso, dolor abdominal, pérdida de apetito y fatiga extrema hacen que se repitan los estudios de CT, que muestran un aumento en el tamaño de las metástasis en una cantidad del 20% y una lesión sospechosa en el sitio de la resección gástrica original.
Luego, al paciente se le administra terapia experimental con IMMU-130 (anti-CEACAM5-SN-38) en un programa semanal de 8 mg/kg. Lo tolera bien, pero después de 3 semanas muestra neutropenia de grado 2 y diarrea de grado 1. Su cuarta infusión se pospone una semana, y luego se reinstituyen las infusiones semanales, sin evidencia de diarrea o neutropenia para las siguientes 4 inyecciones. Luego, el paciente se somete a un estudio de CT para medir el tamaño de su tumor metastásico y para ver el área original de la resección gástrica. El radiólogo mide, de acuerdo con criterios RECIST, una disminución de la suma de las lesiones metastásicas, en comparación con el valor de referencia anterior a la terapia con IMMU-130, del 23%. No parece haber ninguna lesión clara en el área de la resección gástrica original. El título de CEA del paciente en este momento es de 7,2 ng/ml, que es muy inferior al valor de referencia pre-IMMU-130 de 14,5 ng/ml. El paciente continúa con la terapia semanal de IMMU-130 a la misma dosis de 8,0 mg/kg, y después de un total de 13 infusiones, sus estudios de CT muestran que una metástasis hepática ha desaparecido y la suma de todas las lesiones metastásicas se ha reducido en un 41%. constituyendo una respuesta parcial por RECIST. El estado general del paciente mejora y reanuda sus actividades habituales mientras continúa recibiendo una terapia de mantenimiento de 8 mg/kg IMMU-130 cada tres semanas durante otras 4 inyecciones. En la última medición de CEA en sangre, el valor es de 4,8 ng/ml, que está dentro del intervalo normal para un fumador, como es el caso de este paciente.
Ejemplo de referencia 22. Terapia de cáncer de mama metastásico triple negativo recidivante con hMN-15-SN-38
Mujer de 58 años con cáncer de mama metastásico triple negativo previamente tratado con bevacizumab más paclitaxel, sin respuesta, presenta metástasis en varias costillas, vértebras lumbares, lesión solitaria que mide 3 cm de diámetro en pulmón izquierdo, con dolor óseo y fatiga considerables. Se le administra una terapia experimental con el anticuerpo monoclonal humanizado anti-CEACAM6, hMN-15 IgG, conjugado con 6 moléculas de SN-38 por IgG. Se le administra una infusión de 12 mg/kg cada tres semanas, repetidas en 4 dosis, como curso de terapia. Excepto por neutropenia transitoria de grado 2 y algo de diarrea inicial, tolera bien la terapia, que luego se repite, después de un descanso de 2 meses, para otro ciclo. El examen radiológico indica que tiene una respuesta parcial según los criterios RECIST, porque la suma de los diámetros de las lesiones índice disminuye en un 39%. Su estado general, incluyendo el dolor óseo, también mejora y vuelve casi al mismo nivel de actividad que antes de su enfermedad.
Ejemplo de referencia 23. Terapia de carcinoma de colon metastásico, generalmente refractivo, recidivante con hMN-15-SN-38
Mujer de 46 años con cáncer de colon metastásico estadio IV, con historial anterior de resección de la lesión primaria que además presentaba metástasis hepáticas sincrónicas a ambos lóbulos hepáticos, así como un foco único de diseminación al pulmón derecho; estas metástasis miden, por CT, entre 2 y 5 cm de diámetro. Se somete a varios ciclos de quimioterapia durante un período de 3 años, incluyendo 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán, oxaliplatino, cetuximab y bevacizumab. En dos ocasiones, hay evidencia de estabilización de la enfermedad o una respuesta a corto plazo, pero no hay reducción del 30% o más de sus lesiones medidas. Su título de CEA en plasma de referencia antes de la terapia con hMN-14-SN-38 es de 46 ng/ml, y sus lesiones índice totales miden una suma de 92 mm.
La terapia con hMN-15-SN-38 se instituye a 12 mg/kg por semana durante 2 semanas, con un período de descanso de una semana posteriormente, en el plazo de un ciclo de 21 días. Este ciclo se repite 3 veces, con solo neutropenia transitoria y efectos secundarios gastrointestinales (náuseas, vómitos, diarrea). Sorprendentemente, a pesar de no responder a la terapia con FOLFIRI (que incluye irinotecán o CPT-11), la paciente muestra una respuesta parcial según los criterios RECIST después de completar su terapia. Luego se la coloca en un programa de mantenimiento de esta terapia a una dosis de 16 mg/kg una vez al mes durante los siguientes 6 meses. Las exploraciones de seguimiento muestran que su enfermedad permanece bajo control como una respuesta parcial (PR) y, en general, la paciente se encuentra en buenas condiciones con un estado funcional de Kaaarnofsky del 90%.
Ejemplo de referencia 24. Paciente con cáncer de colon con enfermedad metastásica en estadio IV tratado con conjugado anti-CSAp-SN-38
Este paciente presenta metástasis de cáncer de colon en el lóbulo izquierdo del hígado y en ambos pulmones, después de una resección de un adenocarinoma de colon sigmoide de 9 cm, seguido de quimioinmunoterapia con FOLIFIRI y cetuximab durante 6 meses, y luego FOLFOX seguido de bevacizumab durante un período adicional de aproximadamente 9 meses. Diez meses después de la resección inicial y después del comienzo de la terapia, la enfermedad estable que se creía presente muestra progresión por el crecimiento de las lesiones y la aparición de una nueva metástasis en la glándula suprarrenal izquierda. Su CEA en plasma en este momento es de 52 ng/ml y su estado general parece haberse deteriorado, con dolores abdominales, fatiga y anemia limítrofe, lo que sugiere una posible hemorragia interna.
Ahora se le administra un conjugado de SN-38 de anticuerpo hMu-9 (anti-CSAp) a una dosis de 12 mg/kg semanalmente durante dos semanas, con una semana de descanso, como ciclo de tratamiento, y luego se repite para ciclos de tratamiento adicionales midiendo sus recuentos sanguíneos cada semana y recibiendo medicación con atropina para las reacciones gastrointestinales. Se observa alopecia de grado 2 después del primer ciclo de tratamiento, pero solo neutropenia de grado 1. Después de 3 ciclos de tratamiento, su título de CEA en plasma se reduce a 19 ng/ml, y en este momento sus mediciones de CT muestran una disminución de las lesiones índice en el hígado y los pulmones en un 24,1%. Después de 3 ciclos adicionales de terapia, muestra una reducción en la CT de las lesiones índice del 31,4% y una reducción del tamaño de la masa suprarrenal de aproximadamente un 40%. Se considera que este paciente está respondiendo a la terapia farmacológica con anticuerpo anti-CSAp-SN-38 y continúa con esta terapia. El estado general parece mejorar, con menos fatiga, sin dolor abdominal ni malestar, y generalmente con más energía.
Ejemplo de referencia 25. Tratamiento de cáncer de mama con inmunoconjugado anti-CEACAM6-SN-38
Esta paciente tiene cáncer de mama metastásico triple negativo (no expresa receptor de estrógenos, receptor de progesterona o Her2/neu) que recidivó después de varias terapias diferentes durante los últimos 3 años. Presenta varios tumores pequeños en ambos pulmones, así como metástasis en las vértebras C4, C5, T2 y T3, así como en varias costillas bilateralmente. Está bajo terapia estándar para sus lesiones osteolíticas, y ahora comienza tratamiento con hMN-15-SN-38 a una dosis de 16 mg/kg una vez a la semana durante 3 semanas, con una pausa de una semana, y luego reanuda este ciclo de terapia de 3 semanas dos veces más. Dos semanas después de la terapia, se realizan exploraciones por CT para evaluar la respuesta y se observa que 2 de las metástasis pulmonares pequeñas han desaparecido mientras que 1 de las lesiones más grandes parece haber disminuido en aproximadamente un 40%. Las metástasis a las vértebras todavía están presentes, pero las lesiones de C4 y C5 parecen un 25% más pequeñas. De las metástasis en las costillas, 2 de 6 lesiones pequeñas parecen tener un tamaño muy reducido y no se sabe con certeza si son áreas viables o pequeñas de cicatriz o necrosis. Los marcadores tumorales de la paciente, así como sus títulos de LDH, parecen mostrar niveles estables o reducidos, lo que indica que la progresión de la enfermedad se ha detenido y también hay alguna evidencia de reducción de la enfermedad. Subjetivamente, la paciente se siente mucho mejor, con menos fatiga y dolor de huesos y mejora de la respiración. Ha experimentado náuseas y vómitos mínimos después de cada terapia, que se pasaron en una semana. El único otro efecto secundario ha sido una trombocitopenia transitoria, que también se pasa en 7 días. Está en observación y reanudará los ciclos de terapia en el plazo de 2 meses.
Ejemplo de referencia 26. Tratamiento de cáncer de colon metastásico con inmunoconjugados de combinación anti-CEACAM5 y anti-CEACAM6-SN-38
Este paciente tiene cáncer de colon metastásico, con evidencia en la CT de enfermedad en el hígado (lesión de 5 cm en el lóbulo derecho y lesión de 3 cm en el lóbulo izquierdo), así como 2 metástasis (tamaños de 2 y 3 cm) en el pulmón derecho. El cáncer primario de colon se resecó previamente y el paciente tuvo ciclos de terapia postoperatoria debido a metástasis metacrónicas en el hígado y los pulmones. Durante la terapia, las metástasis hepáticas crecen y la metástasis de un pulmón se convierte en dos, por lo que el paciente es candidato para la quimioinmunoterapia experimental. Luego comienza un curso de conjugados de anticuerpo-fármaco doble, labetuzumab (hMN-14)-SN-38 y hMN-15-SN-38, cada uno administrado en días alternos a dosis de 8 mg/kg, una vez por semana durante 2 semanas, y luego se repite mensualmente durante 4 meses. Dos semanas después de la terapia, se evalúa el estado del paciente mediante CT y pruebas de laboratorio. Las exploraciones de CT revelan que el tumor grande en el lóbulo hepático derecho se reduce en un 50%, el tumor en el lóbulo izquierdo en aproximadamente un 33% y las metástasis pulmonares en aproximadamente un 20% acumulativamente para ambos tumores. Su título de CEA en sangre disminuyó de 22 ng/ml al inicio de la terapia a 6 ng/ml en este seguimiento. Subjetivamente, el paciente afirma que se siente más fuerte y también parece tener más vigor en las actividades diarias. Los efectos secundarios son trombocitopenia y leucopenia transitorias, que vuelven a los intervalos normales en el plazo de 2 semanas después de la terapia, y varios episodios de náuseas y vómitos, controlados con medicación antiemética. Está previsto que el paciente reanude estos ciclos de terapia en aproximadamente 2 meses, después de otro chequeo para determinar el estado de la enfermedad.
Ejemplo de referencia 27. Infusión continua de conjugados de anticuerpo-fármaco
El paciente fue resecado previamente por un carcinoma de recto y recibe radioquimioterapia pre- y postoperatoria como tratamiento convencional. Ha estado libre de tumor durante cuatro años, pero ahora presenta 3 lesiones metastásicas pequeñas en el lóbulo hepático derecho, descubiertas por CT de rutina y valores de CEA en sangre de seguimiento, que aumentan a 6,3 ng/ml desde los 3,0 ng/ml después de la terapia inicial. Se le coloca un catéter permanente y una infusión continua de labetuzumab-SN-28 a una dosis de 2 mg/kg durante 17 días. Luego recibe una terapia de infusión continua repetida 5 semanas más tarde, ahora durante 3 semanas, a 1 mg/kg. Tres semanas después, las exploraciones por CT y la monitorización de CEA en sangre revelan que una de las metástasis hepáticas ha desaparecido y las otras dos son iguales o un poco más pequeñas. El título de CEA en sangre mide ahora 2,4 ng/ml. Ella no es sintomática, y solo experimenta nauseas y vómitos de grado 2 mientras está en terapía, y neutropenia de grado 2, ambas pasan con el tiempo.
Ejemplo de referencia 28. Terapia de cáncer de colon metastásico avanzado con inmunoconjugado anti-CEACAM5
El paciente es un hombre de 50 años de edad que ha fracasado en terapias anteriores para el cáncer de colon metastásico. La primera línea de terapia es FOLFIRINOX AVASTIN® (desarrollada de manera escalonada) comenzando con IROX (Irinotecán Oxaliplatino) en el primer ciclo. Tras iniciar este tratamiento el paciente presenta una CT que muestra disminución del tamaño de las metástasis hepáticas. A esto le sigue una cirugía para extirpar el tejido tumoral. La quimioterapia adyuvante es una continuación del régimen de primera línea (sin la parte IROX) que resultó en un período transitorio sin recurrencia. Después de un intervalo de aproximadamente 1 año, una CT revela la recurrencia de las metástasis hepáticas. Esto lleva al inicio del régimen de segunda línea (FOLFIRI Cetuximab). Otra CT muestra una respuesta en las metástasis hepáticas. Luego se realiza la ablación por radiofrecuencia de las metástasis hepáticas, seguido de la continuación de la quimioterapia adyuvante con FOLFIRINOX Cetuximab, seguido de Cetuximab de mantenimiento durante aproximadamente un año. Otra exploración por CT no muestra evidencia de enfermedad. Una exploración adicional muestra posibles nódulos pulmonares, lo que se confirma. Esto lleva a una resección en cuña de los nódulos pulmonares. Posteriormente se reinicia FOLFIRI Cetuximab y se continúa. Las exploraciones por CT posteriores muestran metástasis tanto en el pulmón como en el hígado.
En el momento de la administración del inmunoconjugado hMN-14-SN-38, el paciente tiene cáncer de colon metastásico avanzado, con metástasis tanto en el pulmón como en el hígado, que no responde al irinotecán (camptotecina). El inmunoconjugado hMN-14-SN-38 se administra a una dosificación de 12 mg/kg, que se repite cada dos semanas. El paciente muestra una respuesta parcial con reducción de tumores metastásicos según los criterios RECIST.
Cabe destacar que solo un paciente en esta cohorte de 12 mg/kg (administrados cada dos semanas) muestra un grado hematológico (neutropenia) de grado 2 y la mayoría de los pacientes tienen náuseas, vómitos o alopecia de grado 1 o 2, que son signos de actividad del conjugado anticuerpo-fármaco, pero son bien tolerados. El efecto de la fracción de anticuerpo en el direccionamiento mejorado de la camptotecina explica la eficacia de la fracción de SN-38 en el cáncer que previamente había sido resistente al irinotecán no conjugado.
Ejemplo de referencia 29. Tratamiento de cáncer de páncreas metastásico con inmunoconjugado anti-MUC5ac-SN-38
Este paciente de 44 años tiene un historial de carcinoma de páncreas metastásico, con adenocarcinoma ductal de páncreas inoperable en cabeza de páncreas, y presenta metástasis en lóbulos hepáticos izquierdo y derecho, el primero mide 3 x 4 cm y el segundo mide 2 x 3 cm. Al paciente se le administra un ciclo de gemcitabina pero no muestra una respuesta objetiva. Cuatro semanas más tarde, se le administra hPAM4-SN-38 i.v. a una dosis de 8 mg/kg dos veces a la semana durante 2 semanas, con una semana de descanso, y luego se repite durante otros 2 ciclos. Los estudios de CT se realizan una semana después y muestran una reducción total en la masa tumoral (todos los sitios) del 32% (respuesta parcial), junto con una caída en su título de CA19-9 en sangre de 220 en el valor de referencia de 75 en el momento de la evaluación radiológica. El paciente muestra solo náuseas y vómitos de grado 1 después de cada tratamiento con el conjugado anticuerpo-fármaco, y una neutropenia de grado 2 al final del último ciclo de tratamiento, que se resuelve 4 semanas después. No se administra premedicación para prevenir las reacciones a la infusión.
Ejemplo de referencia 30. Uso de hL243-SN-38 para tratar el cáncer de colon metastásico refractario a la terapia (mCRC)
El paciente es un hombre de 67 años que presenta cáncer de colon metastásico. Después de la colectomía transversa poco después del diagnóstico, el paciente recibe 4 ciclos de quimioterapia FOLFOX en un entorno neoadyuvante antes de la hepatectomía parcial para extirpar las lesiones metastásicas en el lóbulo izquierdo del hígado. A esto le sigue un régimen adyuvante de FOLFOX para un total de 10 ciclos de FOLFOX.
La CT muestra metástasis en el hígado. Su lesión objetivo es un tumor de 3,0 cm en el lóbulo izquierdo del hígado. Las lesiones no objetivo incluyeron varias masas hipoatenuadas en el hígado. El CEA de referencia es de 685 ng/ml.
Después de que el paciente hubo firmado el consentimiento informado, se administra hL 243-SN-38 (10 mg/kg) en semanas alternas durante 4 meses. El paciente experimenta náuseas (Grado 2) y fatiga (Grado 2) después del primer tratamiento y continúa el tratamiento sin eventos adversos importantes. La primera evaluación de respuesta realizada (después de 8 dosis) muestra una reducción de la lesión objetivo en un 26% mediante tomografía computarizada (CT) y su nivel de CEA disminuye a 245 ng/ml. En la segunda evaluación de respuesta (después de 12 dosis), la lesión objetivo se ha reducido en un 35%. Su salud general y sus síntomas clínicos han mejorado considerablemente.
Ejemplo de referencia 31. Tratamiento de linfoma folicular recidivante con IMMU-114-SN-38 (anti-HLA-DR-SN-38)
Después de recibir quimioterapia R-CHOP para el linfoma folicular que presenta enfermedad extensa en varios ganglios linfáticos regionales (cervical, axilar, mediastínico, inguinal, abdominal) e implicación de la médula, a este hombre de 68 años se le administra el agente experimental, IMMU-114- SN-38 (anti-HLA-DR-SN-38) a una dosis de 10 mg/kg semanales durante 3 semanas, con un descanso de 3 semanas y luego un segundo ciclo de otras 3 semanas. Luego se evalúa por cambio en las lesiones tumorales índice por CT, y muestra una reducción del 23% de acuerdo con los criterios de CHESON. La terapia se repite durante otros 2 ciclos, que luego muestra una reducción del 55% del tumor por CT, que es una respuesta parcial.
Ejemplo de referencia 32. Tratamiento de leucemia linfocítica crónica recidivante con IMMU-114-SN-38 Un hombre de 67 años con antecedentes de CLL, como se define en la definición del Taller Internacional sobre Leucemia Linfocítica Crónica y las clasificaciones de la Organización Mundial de la Salud, presenta recaída de la enfermedad después de terapias previas con fludarabina, dexametasona y rituximab, así como un régimen de CVP. Ahora tiene fiebre y sudores nocturnos asociados con un agrandamiento generalizado de los ganglios linfáticos, una producción reducida de hemoglobina y plaquetas, así como un recuento de leucocitos que aumenta rápidamente. Su LDH está elevado y la beta-2-microglobulina es casi el doble de lo normal. Al paciente se le administra terapia con el conjugado IMMU-114-SN-38 en un programa de dosificación de 8 mg/kg semanalmente durante 4 semanas, un descanso de 2 semanas y luego el ciclo se repite de nuevo. La evaluación muestra que los parámetros hematológicos del paciente están mejorando y sus células de CLL circulantes parecen estar disminuyendo en número. Luego la terapia se resume durante otros 3 ciclos, después de lo cual sus valores hematológicos y de laboratorio indican que tiene una respuesta parcial.
Ejemplo de referencia 33. Uso de hMN-15-SN-38 para tratar cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico refractario
El paciente es un hombre de 58 años diagnosticado de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Inicialmente recibe regímenes de quimioterapia con carboplatino, bevacizumab durante 6 meses y muestra una respuesta, y luego, después de progresar, recibe ciclos adicionales de quimioterapia con carboplatino, etopósido, TAXOTERE®, gemcitabina durante los 2 años siguientes, con respuestas ocasionales que no duran más de 2 meses. El paciente presenta entonces una masa mediastínica izquierda de 5,5 x 3,5 cm y derrame pleural.
Después de firmar el consentimiento informado, el paciente recibe hMN-15-SN-38 a una dosis de 12 mg/kg cada dos semanas. Durante las dos primeras inyecciones, se experimentan períodos breves de neutropenia y diarrea, pero estos se pasan o responden a los medicamentos sintomáticos en el plazo de 2 días. Después de un total de 6 infusiones de hMN-15-SN-38, la evaluación por CT de la lesión objetivo muestra una reducción del 22%. El paciente continúa con esta terapia durante otros dos meses, cuando se observa una respuesta parcial del 45% por CT.
Ejemplo de referencia 34. Tratamiento de un paciente con linfoma folicular con hA19-SN-38.
Varón de 60 años que presenta dolor abdominal y presencia de masa palpable. El paciente tiene estudios de CT y FDG-PET que confirman la presencia de la masa con adenopatías patológicas en los ganglios mediastinos, axilares y del cuello. Las pruebas de laboratorio son normales excepto por LDH elevado y beta-2-microglobulina. La biopsia de médula ósea revela varios agregados linfoides paratrabeculares y perivasculares. Estos son linfocíticos con expresión de CD20, CD19 y CD 10 por inmunotinción. El diagnóstico final es linfoma folicular de grado 2, estadio IVA, con una puntuación FLIPI de 4. El diámetro más largo del ganglio afectado más grande es de 7 cm. Al paciente se le administra un anticuerpo monoclonal anti-CD 19 humanizado IgG (hA19) conjugado con SN-38 (6 moléculas de fármaco por IgG). La dosificación es de 6 mg/kg semanalmente durante 4 semanas consecutivas, dos semanas de descanso, y luego ciclos repetidos de 4 semanas de tratamiento cada 6 semanas. Después de 5 ciclos, las evaluaciones de la médula ósea y por imagenología (CT) muestran una respuesta parcial, donde las lesiones medibles disminuyen en aproximadamente un 60% y la médula ósea está mucho menos infiltrada. Además, los títulos de LDH y beta-2-microglobulina también disminuyen.
Ejemplo de referencia 35. Tratamiento de ALL de células B precursoras en recaída con hA19-SN-38
Esta mujer de 51 años ha estado bajo tratamiento para ALL de células B precursoras con cromosoma Filadelfia negativo, que muestra la tinción de células de ALL para CD19, CD20, CD10, CD38 y CD45. Más del 20% de los linfoblastos de la médula y la sangre expresan CD19 y CD20. El paciente había recibido terapia previa con clofarabina y citarabina, lo que dio como resultado una toxicidad hematológica considerable, pero sin respuesta. También se inició un ciclo de citarabina en dosis altas (ara-C), pero el paciente no pudo tolerarlo. Se le administra terapia con hA19-SN-38 a dosis semanales por infusión de 6 mg/kg durante 5 semanas y luego 2 semanas de descanso, repitiendo esta terapia dos veces más. Sorprendentemente, muestra una mejoría en los recuentos de sangre y médula, suficientes para determinar una respuesta parcial. Tras un reposo de 2 meses debido a neutropenia (grado 3), la terapia se reanuda a 8 mg/kg cada dos semanas durante otros 4 ciclos. En este momento, ha mejorado mucho y se está considerando una terapia de mantenimiento para tratar de llevarla a una etapa en la que pueda ser candidata para un trasplante de células madre.
Ejemplo de referencia 36. Tratamiento de linfoma con inmunoconjugado anti-CD22-SN-38
El paciente es un hombre de 62 años con linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) recidivante. Después de 6 ciclos de quimioinmunoterapia con R-CHOP, ahora presenta una diseminación extensa de los ganglios linfáticos en los ganglios linfáticos mediastínicos, axilares e inguinales. Se le administra epratuzumab-SN-38 (anti-CD22) a una dosis de 12 mg/kg semanales x 3, con una semana de descanso, y luego se repite de nuevo durante otros dos ciclos. Una semana más tarde, se evalúa al paciente mediante imagenología por CT y se mide la masa total del tumor y muestra una disminución del 35% (respuesta parcial), que parece mantenerse durante los siguientes 3 meses. Los efectos secundarios son solo trombocitopenia y náuseas y vómitos de grado 1 después del tratamiento, que se pasan en 2 semanas. No se administra preterapia para reducir las reacciones a la infusión.
Ejemplo de referencia 37. Terapia de combinación de linfoma folicular con veltuzumab y epratuzumab-SN-38 en el entorno de primera línea.
Una mujer de 35 años es diagnosticada con un linfoma folicular de bajo grado y buena puntuación FLIPI, que se presenta en los ganglios linfáticos cervicales, tanto en la axila como en el mediastino. Su bazo no está agrandado y la biopsia de médula ósea no revela implicación de la enfermedad. Sintomáticamente no está muy afectada, sólo con períodos de temperatura elevada, sudores nocturnos y algo más fatigada de lo habitual. Su médico decide no emprender un proceso de observación y espera, sino administrar a esta mujer una terapia menos agresiva que combina un curso subcutáneo del anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD20, veltuzumab, semanalmente x 4 semanas (200 mg/m2) combinado con dos cursos semanales del anti-CD22 epratuzumab-SN-38, siendo cada infusión una dosis de 8 mg/kg. Esta terapia de combinación se repite 2 meses después, y después de esto, la paciente es evaluada mediante estudios de imagenología por TC y FDG-PET, así como una biopsia de médula ósea. Sorprendentemente, se observa una reducción de aproximadamente el 90% de toda la enfermedad, y luego se le administra otro curso de esta terapia de combinación después de un descanso de 4 semanas. La evaluación 4 semanas después muestra una respuesta completa radiológica (y biopsia de médula ósea). Su médico decide repetir este curso de terapia 8 meses después y las pruebas radiológicas/patológicas muestran una remisión completa sostenida.
Ejemplo de referencia 38. Terapia de primera línea de linfoma folicular usando veltuzumab-SN-38
La paciente es una mujer de 41 años que presenta linfoma folicular de bajo grado, con ganglios linfáticos cervicales y axilares bilaterales medibles (2-3 cm cada uno), masa mediastínica de 4 cm de diámetro y agrandamiento del bazo. Se le administran 3 ciclos de tratamiento con veltuzumab-SN-38 (anti-CD20-SN-38), y cada ciclo consiste de una infusión de 10 mg/kg una vez cada 3 semanas. Después de completar la terapia, las mediciones de su tumor por CT muestran una reducción del 80%. Luego recibe 2 ciclos adicionales de terapia y las mediciones por CT indican que se logró una respuesta completa. Esto se confirma mediante imagenología por FDG-PET.
Ejemplo de referencia 39. Terapia de DLBCL recidivante con anticuerpo humanizado 1F5 conjugado con SN-38
Una mujer de 53 años presenta un linfoma difuso de células B grandes recurrente en sitios paraaórticos abdominales y mediastínicos 8 meses después de mostrar una respuesta parcial a la quimioterapia con R-CHOP administrada durante 6 ciclos. Ella se niega a recibir más quimioterapia citotóxica, por lo que recibe una terapia más suave que consiste de 10 mg/kg de anticuerpo monoclonal 1F5 anti-CD20 humanizado, conjugado con aproximadamente 6 moléculas de SN-28 por molécula de anticuerpo, una vez por semana cada dos semanas durante 5 infusiones. Los estudios por CT y FDG-PET indican una reducción adicional de sus linfomas en un 40%, por lo que después de un período de descanso de 4 semanas, se reanuda la terapia a una dosis de 8 mg/kg cada 3 semanas para un total de 5 infusiones. La evaluación de su enfermedad revela una reducción de aproximadamente el 80%.
Ejemplo de referencia 40. Terapia de leucemia linfocítica crónica recidivante con rituximab-SN-38
Un hombre de 62 años con un historial de CLL de 8 años, que había respondido en el pasado a la terapia con fludarabina, ciclofosfamida y rituximab, y después de una recaída a ibrutinib para una respuesta parcial que duró 9 meses, presenta una enfermedad progresiva. Al paciente se le administra monoterapia con rituximab-SN-38 en un programa de 12 mg/kg cada 2 semanas durante 3 ciclos, reducido a 8 mg/kg cada dos semanas durante otros 4 ciclos. Se observa una mejoría sostenida en las citopenias, reflejada en más del 50% o un nivel de hemoglobina superior a 11 g por decilitro, un recuento absoluto de neutrófilos superior a 1500 células por cmm, o un recuento de plaquetas superior a 11k/cmm, que fue duradero durante aproximadamente 9 meses.
Ejemplo de referencia 41. Terapia de primera línea de DLBCL con veltuzumab-SN-38 combinado con bendamustina.
Un hombre de 59 años se presenta con múltiples sitios de DLBCL, incluyendo los ganglios linfáticos torácicos, abdominales e inguinales y agrandamiento del bazo, según lo confirmado por CT, FDG-PET y diagnósticos inmunohistológicos/patológicos. La bendamustina se administra a una dosis de 90 mg/m2 los días 1 y 2, combinado con veltuzumab-SN-38 a dosis de 6 mg/kg los días 7 y 14, cada 4 semanas durante cuatro ciclos. La evaluación radiológica posterior muestra una respuesta parcial. Después de un descanso de 2 meses, la terapia se repite por otros 2 ciclos, y luego la evaluación radiológica muestra una respuesta completa. Las citopenias, en su mayoría neutropenia, son manejables y no alcanzan un nivel de grado 3.
Ejemplo de referencia 42. Terapia de primera línea de linfoma de células del manto (MCL) con veltuzumab-SN-38 combinado con lenalidomida.
El paciente es un hombre de 68 años diagnosticado con MCL después de presentar una molestia gastrointestinal y letargo. La colonoscopia revela una masa cecal de 7 cm y su estudio revela que tiene una enfermedad en estadio IV. Recibe una terapia de combinación de lenalidomida, 25 mg por vía oral al día los días 1 a 21 cada 28 días. Después de dos ciclos se le administra veltuzumab-SN-38 en semanas alternas a una dosis de 10 mg/kg durante 3 tratamientos, con 2 semanas de descanso. Luego esto se repite de nuevo. Dos semanas después de completar esta terapia, el paciente muestra una respuesta parcial de su lesión índice medida y se visualiza una reducción de otros ganglios linfáticos. Cuatro meses después, se repite el tratamiento con lenalidomida durante 21 días, seguido de 2 ciclos de veltuzumab-SN-38. Luego se muestra que su enfermedad se reduce aún más, aunque todavía no es una respuesta completa.
Ejemplo de referencia 43. Terapia con epratuzumab-SN-38 de un paciente con linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) recidivante/refractario
Un hombre de 65 años con síntomas de pérdida de peso se somete a una biopsia de una masa epigástrica, que se diagnostica como un linfoma difuso de células B grandes. Recibe tratamiento con 6 ciclos de R-CHOP estándar (rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona). Tiene neutropenia prolongada y persistente (700 ANC) con trombocitopenia leve (50-70k/ml), pero sin anemia real. Su IPI es alto. La masa epigástrica no muestra ningún cambio después de esta terapia, y se le pone un régimen de tratamiento suave de anti-CD22 epratuzumab-SN-38. Este es un régimen de 4 mg/kg infundidos cada dos semanas durante 4 infusiones, luego una vez cada tres semanas durante otras 3 infusiones. Su linfoma epigástrico se mide por CT una semana después y muestra una marcada reducción del 52%. El paciente continúa este tratamiento cada tres semanas durante otros 3 meses, y continúa mostrando esta reducción de su masa de linfoma con estabilización de su peso y mejora de su energía y actividades.
Ejemplo de referencia 44. Terapia de RFB4 humanizado de un paciente con linfoma folicular recidivante
Una mujer de 42 años presenta un dolor agudo, constante y severo en la parte inferior del abdomen que se irradia a la espalda. Las pruebas de laboratorio son normales, pero una ecografía abdominal muestra una masa sólida heterogénea en la parte anterior inferior izquierda, que mide 7,5 x 6,2 x 7,0 cm. Las exploraciones por CT revelan una gran masa dentro del mesenterio del intestino delgado izquierdo, con afectación de los ganglios linfáticos adyacentes. Una biopsia con aguja guiada por CT de la masa muestra que se trata de un linfoma folicular, grado 3. La inmunohistoquímica muestra un tipo de células B con resultados positivos para CD19, CD20, CD22, Bcl-2 y Bcl-6. Los estudios PET no revelan enfermedad por encima del diafragma, en la médula ósea o en el bazo, pero la biopsia de médula ósea confirma implicación del linfoma. El paciente se somete a 6 ciclos de quimioterapia con R-CHOP, lo que da como resultado una respuesta completa a esta terapia 4 meses después. Sin embargo, 10 meses después, sufre una recaída, con recurrencia de su masa abdominal y de los ganglios linfáticos adyacentes, así como agrandamiento del bazo y mayor afectación de la médula ósea según lo determinado por estudios de PET y biopsia. Ahora comienza un curso de terapia con el anticuerpo monoclonal anti-CD22 humanizado, RFB4, conjugado con 6 moléculas SN-38 por IgG, a una dosis de 8 mg/kg semanales durante 3 semanas, y luego continúa con 8 mg/kg cada otra semana para otros 4 tratamientos. A las dos semanas se somete a estudios de CT y FDG-PET, y sus lesiones abdominales y bazo muestran una reducción del 40%, y una disminución general de implicación medular. Después de un descanso de 4 semanas, se implementa la terapia a 4 mg/kg semanalmente durante 4 semanas, seguido de 6 mg/kg cada dos semanas durante otros 5 tratamientos, con una reducción medible adicional de la suma de los tamaños de todas las lesiones medidas en un total del 60%. La paciente continúa con una terapia de mantenimiento de hRFB4-SN-38 de 8 mg/kg una vez al mes durante los siguientes 5 meses y mantiene su respuesta terapéutica.
Ejemplo de referencia 45. Terapia con epratuzumab-SN-38 de un paciente con leucemia linfoblástica aguda recidivante/refractaria.
Un hombre de 29 años con leucemia linfoblástica aguda (ALL) de células B precursoras de CD22+ no ha respondido a la terapia con PEG-asparaginasa, ciclofosfamida, daunorrubicina, citarabina (ara-C), vincristina, leucovorina, prednisona, metotrexato y 6 -mercaptopurina y terapia de apoyo con G-CSF (Neupogen), administrada como terapia de inducción/mantenimiento bajo un protocolo de Larson modificado. La leucemia del paciente es negativo para cromosoma Filadelfia. En base a los recuentos de blastos de leucemia en sangre y médula ósea, el paciente muestra solo una respuesta mínima, y la enfermedad progresa 4 meses después. Luego se le administra una dosificación semanal de epratuzumab-SN-38 en un programa inicial de 6 mg/kg durante 4 semanas, y luego se reduce a 6 mg/kg cada dos semanas durante 6 infusiones adicionales. Luego se evalúa al paciente mediante blastos leucémicos en sangre y médula, así como estudios con FDG del tamaño del bazo e implicación de la médula ósea, y parece que se logra una respuesta parcial, con una mejora concomitante en los signos y síntomas generales del paciente. Luego, esta terapia continúa durante los siguientes 8 meses, pero a 5 mg/kg cada dos semanas, con 3 semanas de terapia y 2 semanas de descanso, y se logra una remisión completa. El paciente ahora está siendo evaluado como candidato para el trasplante de células madre hematopoyéticas.
Ejemplo de referencia 46. Terapia con RFB4-SN-38 humanizado de un paciente con leucemia linfoblástica aguda recidivante/refractaria
Después de no responder a HIDAC (terapia de ara-C en dosis altas), este hombre de 20 años con leucemia linfoblástica aguda de células B precursoras recibe terapia anti-CD22 humanizada con hRFB4 IgG conjugado con SN-38 (media de 6 moléculas de fármaco por IgG), con un programa de dosificación de 10 mg/kg semanalmente durante dos semanas, luego 1 semana de descanso, seguido de infusiones de 10 mg/kg cada dos semanas durante 5 tratamientos adicionales. Luego se evalúa al paciente para determinar la presencia de células blásticas leucémicas en sangre y médula, y muestra una reducción >90%. Después de un descanso de 4 semanas, se repite este curso de terapia y la evaluación 4 semanas más tarde muestra una respuesta completa sin enfermedad residual mínima, medida por PCR.
Ejemplo de referencia 47. Terapia de consolidación con epratuzumab-SN-38 en un paciente con DLBCL que recibe quimioterapia R-CHOP
A esta mujer de 56 años con adenopatía cervical bilateral y adenopatías cervicales de 1,5 a 2,0 cm, así como adenopatía axilar derecha de 3 cm, así como adenopatías retroperitoneales y pélvicas bilaterales de 2,5 a 3,0 cm, se le diagnostica linfoma difuso de células B grandes en estadio 3 que es positivo para CD20 y CD22. La ponen en un régimen de quimioterapia R-CHOP estándar administrado cada 21 días con filgrastim y antibióticos profilácticos. Después de recibir 6 ciclos de esta terapia, a la paciente se le da un período de descanso de 2 meses y luego recibe una terapia de consolidación con 8 mg/kg de epratuzumab-SN-38, infundidos cada dos semanas durante 3 tratamientos. Mientras que la respuesta después de la quimioterapia R-CHOP es mínima (menos del 30% de cambio en las lesiones medidas), la terapia de consolidación con epratuzumab-SN-38 da como resultado una respuesta parcial (>50% de disminución en la suma de todas las lesiones índice). Después de un descanso de 3 meses, se repite este curso de terapia con epratuzumab-SN-38, administrándose de nuevo a la paciente filgrastim y antibióticos profilácticos, y mantiene su buena remisión.
Ejemplo de referencia 48. Tratamiento de cáncer testicular metastásico recidivante con IMMU-31-SN-38
El paciente es un hombre de 30 años con antecedentes de cáncer testicular resecado del testículo derecho, con metástasis sincrónicas en ambos pulmones que responde bien a la quimioterapia combinada. En el momento del diagnóstico, su título sanguíneo de alfafetoproteína (AFP) está elevado a 1110 ng/ml, pero disminuye a 109 ng/ml después de una terapia con éxito. Ahora presenta un título de AFP que aumenta gradualmente durante un período de 3 años, por lo que se realizan exploraciones por CT y FDG-PET de su cuerpo, que revelan la recurrencia de metástasis pulmonares en ambos pulmones. Recibe terapia con el anticuerpo anti-AFP, IMMU-31 IgG, conjugado con SN-38 a razón de 6 moléculas de fármaco por IgG. Recibe dosis semanales de 12 mg/kg de este conjugado anticuerpo-fármaco durante 3 semanas de un ciclo de 4 semanas, repetido por otro ciclo, pero con reducción de la terapéutica a 10 mg/kg. Luego esto se repite durante otros 2 ciclos. Dos semanas después, el examen radiológico de sus pulmones revela que las metástasis han desaparecido. Su título de AFP en sangre es ahora de 18 ng/ml. El paciente vuelve a su actividad normal habiendo logrado una respuesta completa.
Ejemplo de referencia 49. Tratamiento de carcinoma hepatocelular metastásico recidivante con IMMU-31-SN-38
Un varón de 58 años con historial de infección por hepatitis B, exceso de alcohol y tabaquismo, lleva primero con cirrosis hepática y luego un diagnóstico de carcinoma hepatocelular. En el momento en que se presenta después de haber tenido una resección de una parte de su hígado, también hay ganglios linfáticos regionales implicados. El paciente recibe un ciclo de terapia con sorafenib, indica alguna mejoría general, pero no tiene ninguna reducción de su ganglio linfático regional ni metástasis en 2 pulmones (pulmón derecho). La CT del hígado también sugiere que puede haber una recurrencia en el parénquima hepático restante. A este paciente se la administran ahora 3 ciclos de terapia con IMMU-31-SN-38, cada uno de los cuales comprende un programa de 16 mg/kg semanales durante 2 semanas de un ciclo de 4 semanas. Después de los 3 ciclos que comprenden 6 dosis, el paciente es reevaluado y muestra una disminución en su título de AFP circulante desde el valor inicial de 2.000 ng/ml a 170 ng/ml, así como una reducción del 20% de la suma de sus lesiones índice medidas. Después de un descanso de 2 meses, se instituye otro curso de terapia de 3 ciclos, pero con una reducción de la dosis a 1 mg/kg por infusión. Un mes después, hay una mayor reducción de toda la lesión medida, al 35% del valor de referencia, así como una ligera disminución en el título de AFP en sangre a 100 ng/ml. El paciente sigue una terapia de mantenimiento de una dosis por mes mientras no haya progresión de la enfermedad o toxicidades limitantes.
Ejemplo 50. Almacenamiento de inmunoconjugados
Los conjugados descritos en el Ejemplo 8 se purificaron y se intercambió el tampón con ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), pH 6,5, y luego se formularon con trehalosa (concentración final 25 mM) y

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoconjugado que comprende SN-38 conjugado con un anticuerpo humanizado, en donde hay un conector CL2A entre el s N-38 y el anticuerpo, el anticuerpo humanizado es hRS7 (anti-TROP-2), se unen de 5 a 7 moléculas de SN-38 a cada molécula de anticuerpo y en donde la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38
Figure imgf000112_0001
para su uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar el inmunoconjugado a un sujeto humano con cáncer; en donde el anticuerpo se une a EGP-1 (TROP-2); y en donde el inmunoconjugado se administra a una dosis de entre 8 mg/kg y 10 mg/kg.
2. Una composición de inmunoconjugado que comprende SN-38 conjugado con un anticuerpo humanizado, en donde hay un conector CL2A entre el SN-38 y el anticuerpo, el anticuerpo humanizado es hRS7 (anti-TROP-2), las moléculas de anticuerpo están unidas a 5 a 7 moléculas de SN-38 y en donde la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38
Figure imgf000112_0002
para su uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar la composición a un sujeto humano con cáncer; en donde el anticuerpo se une a EGP-1 (TROP-2); y en donde la composición se administra a una dosificación de inmunoconjugado de entre 8 mg/kg y 10 mg/kg.
3. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde la dosificación se selecciona del grupo que consiste de 8 mg/kg, 9 mg/kg y 10 mg/kg.
4. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo anti-EGP-1 comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 90); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 91); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 92) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 93); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 94) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 95).
5. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde el cáncer es un tumor sólido y el tratamiento da como resultado una reducción en el tamaño del tumor de por lo menos un 15%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, o por lo menos un 40%.
6. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de linfoma de células B, leucemia de células B, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de tiroides medular, cáncer de riñón cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de testículo, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de recto y melanoma.
7. El inmunoconjugado o composición para el uso de la reivindicación 6, en donde la leucemia de células B o el linfoma de células B se selecciona del grupo que consiste de formas indolentes de linfoma de células B, formas agresivas de linfoma de células B, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia de células pilosas, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma difuso de células B, linfoma de células del manto y mieloma múltiple.
8. El inmunoconjugado o composición para el uso de la reivindicación 6, en donde el cáncer es metastásico.
9. El inmunoconjugado o composición para el uso de la reivindicación 8, en donde el método comprende además reducir el tamaño o eliminar las metástasis.
10. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde el paciente no ha respondido a por lo menos otra terapia, antes del tratamiento con el inmunoconjugado o la composición.
11. El inmunoconjugado o composición para el uso de la reivindicación 10, en donde el paciente no ha respondido a la terapia con irinotecán, antes del tratamiento con el inmunoconjugado o la composición.
12. El inmunoconjugado o composición para el uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer es un tumor sólido y el tratamiento da como resultado una reducción del tamaño del tumor de por lo menos un 15%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30% o por lo menos un 40%.
13. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde hay 6 moléculas de SN-38 unidas a cada molécula de anticuerpo.
14. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde hay 7 moléculas de SN-38 unidas a cada molécula de anticuerpo.
15. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde el inmunoconjugado o la composición se administra en combinación con una o más modalidades terapéuticas seleccionadas del grupo que consiste de anticuerpos no conjugados, anticuerpos radiomarcados, anticuerpos conjugados con fármacos, anticuerpos conjugados con toxinas, terapia génica, quimioterapia, péptidos terapéuticos, terapia con citoquinas, oligonucleótidos, radioterapia localizada, cirugía y terapia con ARN de interferencia.
16. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 1 o la composición para el uso de la reivindicación 2, en donde el cáncer es cáncer de páncreas, colorrectal, de pulmón, de estómago, de vejiga urinaria, renal, de mama, de ovario, de útero o de próstata.
17. El inmunoconjugado o composición para el uso de la reivindicación 16, en donde el cáncer es cáncer de colon metastásico y el paciente no ha respondido a la quimioterapia FOLFIRI o FOLFOX antes de la administración del inmunoconjugado o composición; o en donde el cáncer es cáncer de mama metastásico triple negativo y el paciente no ha respondido a la terapia con CMF, carboplatino o paclitaxel antes de la administración del inmunoconjugado o composición; o en donde el cáncer es cáncer de pulmón metastásico y el paciente no ha respondido a la terapia con carboplatino, bevacizumab, etopósido, topotecán, docetaxel o gemcitabina antes de la administración del inmunoconjugado o la composición.
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