ES2871905T3 - Inmunoconjugado que comprende anticuerpos de RS7 humanizados - Google Patents

Abstract

Un inmunoconjugado que comprende (i) un anticuerpo humanizado que comprende las secuencias de CDR (región determinante de la complementariedad) de la cadena pesada de CDR1 (NYGMN); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV), y las secuencias de CDR de la cadena ligera de CDR1 (KASQDVSIAVA); CDR2 (SASYRYT); y CDR3 (QQHYITPLT) y secuencias de la región marco (FR) del anticuerpo humano, en donde las secuencias de FR comprenden residuos de aminoácidos murinos sustituidos que se encuentran en una localización correspondiente en los residuos de aminoácidos 38, 46, 68 y 91 de la región variable de la cadena pesada murina de la Fig..3B y el residuo de aminoácido 20, 60, 85 y 100 de la región variable de la cadena ligera murina de la Fig. 3A, en donde el anticuerpo humanizado está conjugado con (ii) un fármaco.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoconjugado que comprende anticuerpos de RS7 humanizados

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo humanizado y un fármaco, el inmunoconjugado para su uso en el tratamiento del cáncer, y una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las proteínas de unión artificiales, en particular los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos modificados, se han probado ampliamente y se ha demostrado que son valiosos en la detección y el tratamiento de varios trastornos humanos, incluyendo cánceres, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades cardiovasculares (Filpula y McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents (1999) 9: 231-245). Por ejemplo, se han probado anticuerpos marcados con isótopos radiactivos para visualizar tumores después de la inyección a un paciente usando detectores disponibles en la técnica. La utilidad clínica de un anticuerpo o de un agente derivado de un anticuerpo depende principalmente de su capacidad para unirse a un antígeno objetivo específico. La selectividad es valiosa para administrar un agente de diagnóstico o terapéutico, como isótopos, fármacos, toxinas, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, enzimas, conjugados, radionúclidos o metales, a una localización objetivo durante las fases de detección y tratamiento de un trastorno humano, particularmente si el agente de diagnóstico o terapéutico es tóxico para el tejido normal en el cuerpo.

Las limitaciones potenciales de los sistemas de anticuerpos se analizan en Goldenberg, The American Journal of Medicine (1993) 94: 298-299. Los parámetros importantes en las técnicas de detección y tratamiento son la cantidad de dosis inyectada localizada específicamente en el sitio o sitios donde están presentes las células objetivo y la proporción de captación, es decir, la proporción de la concentración de anticuerpo unido específicamente a la de la radiactividad presente en los tejidos normales circundantes. Cuando se inyecta un anticuerpo en el torrente sanguíneo, pasa a través de una serie de compartimentos a medida que se metaboliza y se excreta. El anticuerpo debe poder localizar y unirse al antígeno de la célula objetivo mientras pasa por el resto del cuerpo. Los factores que controlan el direccionamiento del antígeno incluyen la localización, el tamaño, la densidad del antígeno, la accesibilidad del antígeno, la composición celular del tejido patológico y la farmacocinética de los anticuerpos dirigidos. Otros factores que afectan específicamente a los anticuerpos dirigidos contra el tumor incluyen la expresión de los antígenos objetivo, tanto en el tumor como en otros tejidos, y la toxicidad de la médula ósea resultante de la lenta depuración sanguínea de los anticuerpos radiomarcados. La cantidad de anticuerpos dirigidos acumulados por las células tumorales objetivo está influenciada por la vascularización y las barreras a la penetración de anticuerpos en los tumores, así como por la presión intratumoral. La captación no específica por órganos no objetivo como el hígado, los riñones o la médula ósea es otra limitación potencial de la técnica, especialmente para la radioinmunoterapia, donde la irradiación de la médula ósea provoca a menudo la toxicidad limitante de la dosis.

Un enfoque sugerido, al que se hace referencia como direccionamiento directo, es una técnica diseñada para dirigirse a antígenos específicos con anticuerpos que portan radioisótopos de diagnóstico o terapéuticos. En el contexto de los tumores, el enfoque de direccionamiento directo utiliza un anticuerpo monoespecífico antitumoral radiomarcado que reconoce el tumor objetivo a través de sus antígenos. La técnica implica inyectar el anticuerpo monoespecífico marcado en el paciente y permitir que el anticuerpo se localice en el tumor objetivo para obtener beneficios diagnósticos o terapéuticos. El anticuerpo no unido limpia el cuerpo. Este enfoque puede usarse para diagnosticar o tratar trastornos de mamíferos adicionales.

Otra solución sugerida, a la que se hace referencia como "Sistema de mejora de afinidad" (AES), es una técnica especialmente diseñada para superar las deficiencias de los tumores a los que apuntan los anticuerpos que portan radioisótopos de diagnóstico o terapéuticos (US-5.256.395 (1993), Barbet et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals (1999) 14: 153-166). El AES utiliza un hapteno radiomarcado y una proteína de unión biespecífica anti-tumor/anti-hapteno que reconoce tanto el tumor objetivo como el hapteno radioactivo. También pueden utilizarse para este procedimiento haptenos con mayor valencia y proteínas de unión con mayor especificidad. La técnica implica inyectar la proteína de unión en el paciente y permitir que se localice en el tumor objetivo. Después de una cantidad de tiempo suficiente para que la proteína de unión no unida se elimine del torrente sanguíneo, se administra el hapteno radiomarcado. El hapteno se une al complejo anticuerpo-antígeno localizado en el sitio de la célula objetivo para obtener beneficios diagnósticos o terapéuticos. El hapteno no unido limpia el cuerpo. Barbet menciona la posibilidad de que un hapteno bivalente pueda reticularse con un anticuerpo biespecífico, cuando este último se une a la superficie del tumor. Como resultado, el complejo radiomarcado es más estable y permanece en el tumor durante un período de tiempo más prolongado. Este sistema puede usarse para diagnosticar o tratar trastornos de mamíferos.

Sigue habiendo una necesidad en la técnica para la producción de proteínas de unión monoespecíficas multivalentes que sean útiles en un sistema de direccionamiento directo y para la producción de proteínas de unión multivalentes multiespecíficas que sean útiles en un sistema de mejora de la afinidad. Específicamente, sigue habiendo la necesidad de una proteína de unión que muestre una captación mejorada en los antígenos objetivo, una concentración disminuida en la sangre, y una protección óptima de los tejidos y células normales frente a los productos farmacéuticos tóxicos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

El problema subyacente de la presente invención se resuelve por la materia de las reivindicaciones independientes adjuntas; las realizaciones preferidas pueden tomarse de las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Más específicamente, el problema subyacente de la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante un inmunoconjugado que comprende (i) un anticuerpo humanizado que comprende las secuencias de la CDR (región determinante de la complementariedad) de la cadena pesada CDR1 (NYGMN); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV), y las secuencias de la CDR de la cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA); CDR2 (SASYRYT); y CDR3 (QQHYITPLT) y las secuencias de la región marco (FR) del anticuerpo humano, en donde las secuencias de FR comprenden residuos de aminoácidos murinos sustituidos encontrados en una localización correspondiente en los residuos de aminoácidos 38, 46, 68 y 91 de la región variable de la cadena pesada murina de la Fig. 3B y los residuos de aminoácidos 20, 85 y 100 de la región variable de la cadena ligera murina de la Fig. 3A, en donde el anticuerpo humanizado está conjugado con (ii) un fármaco.

En una realización del primer aspecto, dicho fármaco posee la propiedad farmacéutica seleccionada del grupo que consiste de agentes antimitóticos, alquilantes, antimetabolitos, antiangiogénicos, apoptóticos, alquiloides y antibióticos.

En una realización del primer aspecto, dicho fármaco se selecciona del grupo que consiste de mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos del ácido fólico, antraciclinas, taxanos, Inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, complejos de coordinación de platino, alcaloides de la vinca, ureas sustituidas, derivados de metilhidrazina, supresores adrenocorticales, antagonistas, endostatina, taxoles, derivados de camptotecina y doxorrubicina.

En una realización del primer aspecto, dicho fármaco es un agente quimioterapéutico contra el cáncer. En una realización del primer aspecto, el anticuerpo humanizado comprende secuencias de región constante de IgG1 de anticuerpo humano.

En una realización del primer aspecto, el anticuerpo humanizado se une al antígeno de Trop-2 (EGP-1) humano.

Más específicamente, el problema subyacente de la presente invención se resuelve en un segundo aspecto por el inmunoconjugado de acuerdo con el primer aspecto, incluyendo cualquier realización del mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer.

En una realización del segundo aspecto, el cáncer expresa el antígeno de T rop-2 (EGP-1).

En una realización del segundo aspecto, el cáncer se selecciona de grupo que consiste de cáncer de pulmón, mama, cabeza y cuello, ovario, próstata, vejiga, estómago y colon.

En una realización del segundo aspecto, el uso comprende además administrar un fármaco contra el cáncer.

En una realización del segundo aspecto, el uso comprende además administrar un inmunomodulador. En una realización del segundo aspecto, el uso comprende además administrar un anticuerpo humanizado, quimérico o humano desnudo.

En una realización del segundo aspecto, el uso comprende además administrar un anticuerpo humanizado, quimérico o humano conjugado.

Más específicamente, el problema subyacente de la presente invención se resuelve en un tercer aspecto por una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado de acuerdo con el primer aspecto, incluyendo cualquier realización del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por consiguiente, es un objeto de la presente divulgación proporcionar un anticuerpo monoclonal monoespecífico y fragmentos del mismo que reconocen un antígeno asociado a tumores, definido como glicoproteína-1 epitelial (EGP-1) por el MAb murino RS7-3G11 producido contra carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano. El antígeno de RS7 ha sido designado como EGP-1 (glicoproteína-1 epitelial) siguiendo la propuesta del 3° International IASLC Workshop on Lung Tumor and Differentiation Antigens. Por lo menos un epítopo asociado con EGP-1 se denomina alternativamente TROP2 en la bibliografía. En un ejemplo preferido, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención se une al mismo epítopo que el anticuerpo de RS7 murino divulgado por Stein (más abajo) y otros estudios anteriores. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento puede unirse a un epítopo distinto del epítopo al que se une el anticuerpo de RS7 murino divulgado por Stein. En un ejemplo preferido, el anticuerpo anti-EGP-1 o anti-TROP2 o un fragmento del mismo es un anticuerpo de RS7 quimérico, humanizado o completamente humano o un fragmento del mismo.

Por ejemplo, en la presente divulgación se contempla un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo, en donde las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable de cadena ligera del MAb de RS7 humanizado comprenden la CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de KASQDVSIAVA; la CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SASYRYT; y la CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de QQHYITPLT. Otro ejemplo de la presente divulgación es un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, en donde las CDR de la región variable de la cadena pesada del MAb de RS7 humanizado comprenden la CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de NYGMN; la CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de WINTYTGEPTYTDDFKG y la CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GGFGSSYWYFDV. También, el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende las CDR de un MAb de RS7 murino y la región marco (FR) de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano, en donde las CDR de la región variable de la cadena ligera del MAb de RS7 humanizado comprenden la CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de KASQDVSIAVA; la CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SASYRYT; y la CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de QQHYITPLT; y las CDR de la región variable de la cadena pesada del MAb de RS7 humanizado comprenden la CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de NYGMN; la CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de WINTYTGEPTYTDDFKG y la CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GGFGSSYWYFDV. Además, el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende además las FR de las regiones constantes de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano.

El anticuerpo de RS7 humanizado o fragmento puede comprender una FR de una cadena ligera y/o pesada que comprende por lo menos un aminoácido sustituido por un residuo de aminoácido que se encuentra en una localización correspondiente en el anticuerpo murino de RS7. Por ejemplo, por lo menos uno de los aminoácidos sustituidos está preferiblemente en una localización seleccionada del grupo que consiste del residuo 38, 46, 68 y 91 de la región variable de la cadena pesada murina de la figura 3B, y/o por lo menos uno de los aminoácidos sustituidos está preferiblemente en una localización seleccionada del grupo que consiste del residuo 20, 85 y 100 de la región variable de la cadena ligera murina de la figura 3A.

También se describe en la presente divulgación una proteína de fusión de anticuerpo o un fragmento de la misma que comprende por lo menos dos MAb anti-EGP-1 o fragmentos del mismo, en donde el MAb o fragmentos del mismo se seleccionan del MAb anti-EGP-1 o fragmentos del mismo de la presente invención. En una vena relacionada, la proteína de fusión del anticuerpo o fragmento de la misma comprende por lo menos un primer MAb anti-EGP-1 o fragmento del mismo de cualquiera de los anticuerpos anti-EGP-1 de la presente invención y por lo menos un segundo MAb o fragmento del mismo, distintos de los anticuerpos anti-EGP o fragmentos de los mismos en la presente invención. Por ejemplo, el segundo anticuerpo o fragmento del mismo puede ser un anticuerpo asociado a carcinoma o un fragmento del mismo. Otra realización preferida es una proteína de fusión o fragmento de la misma que comprende dos anticuerpos anti-EGP-! de unión a epítopo o fragmentos de los mismos.

Es un objeto de esta divulgación proporcionar un anticuerpo multiespecífico y fragmentos del mismo que reconozcan más de un epítopo en el antígeno de RS7 o que tenga afinidad por el antígeno de RS7 y por una molécula de hapteno. La última proteína de unión es útil para predirigirse a un antígeno objetivo. Por consiguiente, también se describe un método para administrar un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o una combinación de los mismos a un objetivo, que comprende: (i) administrar a un sujeto un MAb multivalente multiespecífico o fragmento del mismo (ii) esperar una cantidad de tiempo suficiente para que una cantidad de proteína no de unión limpie el torrente sanguíneo del sujeto; y (iii) administrar a dicho sujeto de una molécula portadora que comprende un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o una combinación de los mismos, que se une a un sitio de unión de dicho anticuerpo.

Es un objeto adiciona de esta divulgación proporcionar un método para administrar un agente de diagnóstico o terapéutico a una enfermedad objetivo que expresa el antígeno EGP-1. Por ejemplo, también se describe un método para administrar un agente de diagnóstico o terapéutico, o una combinación de los mismos, a un objetivo que comprende (i) proporcionar una composición que comprende un anticuerpo anti-EGP-1 o un fragmento del mismo unido a por lo menos uno de los agentes terapéuticos y/o de diagnóstico y (ii) administrar a un sujeto con necesidad de dicha composición. Preferiblemente, el agente de diagnóstico o terapéutico se selecciona del grupo que consiste de un isótopo, fármaco, toxina, inmunomodulador, hormona, enzima, factor de crecimiento, radionúclido, metal, agente de contraste y agente de detección.

En un ejemplo de la presente divulgación, el método para administrar un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o una combinación de los mismos a un objetivo comprende (i) administrar a un sujeto un anticuerpo multivalente, multiespecífico o fragmento que comprende uno o más sitios de unión al antígeno que tienen afinidad hacia un antígeno objetivo EGP-1 y uno o más sitios de unión a hapteno que tienen afinidad hacia una molécula de hapteno, (ii) esperar una cantidad de tiempo suficiente para que una cantidad del anticuerpo no de unión o fragmento limpie el torrente sanguíneo del sujeto y (iii) administrar a dicho sujeto un hapteno que comprende un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o una combinación de los mismos.

De acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones, el fármaco es un fármaco que posee la propiedad farmacéutica seleccionada del grupo que consiste de un antimitótico, alquilante, antimetabolito, antiangiogénico, apoptótico, antibiótico alquiloide y combinaciones de los mismos. También se prefiere un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste de una mostaza de nitrógeno, derivado de etilenimina, sulfonato de alquilo, nitrosurea, traizeno, análogo de ácido fólico, antraciclina, taxano, inhibidor de COX-2, inhibidor de tirosina quinasa, análogo de pirimidina, análogo de purina, antibiótico, enzima, epipodofilotoxina, complejo de coordinación platinim, alcaloide vinca, urea sustituida, derivado de metilhidrazina, supresor de adrenocorticol, antagonista, taxol de endostatina, camptotecinas, doxorrubicina, análogo de doxorrubicina y una combinación de los mismos. Preferiblemente, el agente de diagnóstico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido fotoactivo, preferiblemente entre 25 y 4000 keV, y un agente de contraste.

En un ejemplo de la presente divulgación, una secuencia de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica un MAb o un fragmento que contiene un MAb anti-EGP-1 o un fragmento del mismo de la presente invención; una proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de la misma que contiene por lo menos dos de dichos MAb o fragmentos de los mismos; una proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de la misma que contiene por lo menos un primer MAb anti-EGP-1 o fragmento del mismo que contiene el MAb o fragmento del mismo de los anticuerpos y fragmentos anti-EGP-1 de la presente invención y por lo menos un segundo MAb o fragmento del mismo, distinto del MAb anti-EGP-1 o fragmento del mismo descrito en la presente; o una proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de la misma que comprende por lo menos un primer MAb o fragmento del mismo que comprende dicho MAb o fragmento del mismo de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente y por lo menos un segundo MAb o fragmento del mismo, distinto del MAb o fragmento del mismo de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente, en donde el segundo MAb es reactivo con un antígeno seleccionado del grupo que consiste de EGP-2, MUC 1-4, A33, CSAp, CEA, Le(y), Tn, Tag-72, PSMA, PSA, EGFR, HER2/neu, AFP, HCG, HCG-beta, ferritina, PAP, PLAP, EGP-2, histona, citoqueratina, tenascina, CanAg, G 250 de cáncer de riñón, VGFR1, VGFR2, antígeno PAM4, productos oncogénicos o una combinación de los mismos. En cambio, el segundo MAb puede ser reactivo con antígenos endoteliales vasculares asociados con tumores, como VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) y P1GF (factor de crecimiento de la placenta). La selección del segundo anticuerpo depende del tipo de célula tumoral. Por ejemplo, anti-PSA o anticuerpos anti-PSMA pueden usarse para tratar o diagnosticar cáncer de próstata, anticuerpos anti-CEA o anti-MUC1, MUC2, MUC3 y MUC4 para cáncer de mama, ovario, pulmón y colon, EGFR para cáncer de colon y de cabeza y cuello, anticuerpos anti-CSAp para cáncer de colon y ovario y anti-HER/neu para cáncer de mama, ovario y otros cánceres. Estos se dan simplemente como ejemplos y no se pretende que sean limitativos. Los vectores de expresión y las células huésped que contienen esta secuencia de ADN también son realizaciones preferidas de la presente invención.

También se divulgan en la presente métodos para diagnosticar y tratar una enfermedad maligna. Por ejemplo, un método para diagnosticar o tratar cáncer comprende (i) administrar a un sujeto con necesidad de ello un anticuerpo o fragmento multivalente, multiespecífico que comprende uno o más sitios de unión a antígeno que tienen afinidad hacia un antígeno objetivo EGP-1 y uno o más sitios de unión a haptenos que tienen afinidad por una molécula de hapteno; (ii) esperar una cantidad de tiempo suficiente para que una cantidad de la proteína no de unión limpie el torrente sanguíneo del sujeto; y (iii) administrar a dicho sujeto un hapteno que comprende un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o una combinación de los mismos, que se une a un sitio de unión de dicho anticuerpo.

De igual manera, los métodos para diagnosticar y tratar una enfermedad maligna pueden comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión anti-EGP-1 o un fragmento de la misma o un conjugado terapéutico que comprende un MAb EGP-1 o un fragmento del mismo, en donde el MAb EGP-1 o fragmento del mismo o proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de la misma se une a por lo menos un agente terapéutico en un excipiente farmacéuticamente adecuado. En una vena relacionada, los anticuerpos anti-EGP-1 desnudos y fragmentos de los mismos, incluyendo las proteínas de fusión anti-EGP-1 desnudas y fragmentos de las mismas, también pueden usarse para tratar una enfermedad maligna. Los anticuerpos anti-EGP-1 desnudos pueden usarse para el diagnóstico in vitro de una enfermedad maligna, por ejemplo, con inmunoensayos o inmunohistoquímica, pero no para el diagnóstico in vivo, a menos que esto implique una tecnología de predireccionamiento, como AES. Sin embargo, los anticuerpos EGP-1 marcados pueden usarse para el diagnóstico y el tratamiento in vivo de una enfermedad maligna. Por ejemplo, en la presente se describe un método para tratar una célula cancerosa en un sujeto que comprende (i) administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un MAb anti-EGP-1 o un fragmento del mismo o una proteína de fusión de anticuerpos o un fragmento de la misma (ii) formular el MAb EGP-1 o un fragmento del mismo o la proteína de fusión de anticuerpos o un fragmento de la misma en un excipiente farmacéuticamente adecuado. De manera similar, también se contemplan en la presente invención combinaciones de MAb desnudos y fragmentos de los mismos con MAb conjugados o fragmentos de los mismos o proteínas de fusión o fragmentos de las mismas para diagnóstico y tratamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra una comparación de mRS7, cAb-VK#23 (cRS7) y cAb-VK#1 en ensayos de unión competitiva. Se usaron concentraciones variables de Abs competidores para competir con la unión de una cantidad constante de anticuerpo mRS7 biotinilado. Los resultados indican que la cadena ligera de Vk#1 no se une al antígeno de RS7.

La Figura 2 muestra las secuencias de ADN y aminoácidos que codifican (A) RS7 V^k clonado por 5' RACE y (B) RS7 VH clonado por RT-PCR. Las supuestas regiones CDR están subrayadas e indicadas. Los residuos de nucleótidos se numeran secuencialmente. La numeración de moléculas de Ig de Kabat se usa para los residuos de aminoácidos. En (B), la numeración de los residuos con una letra (en la parte superior) es el número de residuos precedentes más la letra, por ejemplo, el número de T que sigue a N52 es 52A; los números para N, N y L que siguen a 182 son 82A, 82B y 82C, respectivamente.

La Figura 3 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de (A) las cadenas V^k de SA-IA'cl humana, RS7 murina y hRS7 y (B) cadenas V^h de RF-TS3 humana, RS7 murina y hRS7. En (A), los puntos indican que los residuos en RS7 son idénticos a los residuos correspondientes en SA-1A'cl. Los guiones representan los espacios introducidos para ayudar a la alineación. Los recuadros representan las regiones CDR. Ambos residuos N- y C-terminales (subrayados) de hRS7 se fijan por el vector de estadificación usado. Por lo tanto, los residuos terminales correspondientes de RS7 no se comparan con los de la secuencia humana. Se usa el esquema de numeración de Kabat. En (B), los puntos indican que los residuos en RS7 son idénticos a los residuos correspondientes en RF-TS3. Los guiones representan los espacios introducidos para ayudar a la alineación. Los recuadros representan las regiones CDR. Ambos residuos N- y C-terminales (subrayados) de hRS7 se fijan por el vector de estadificación usado. Por lo tanto, los residuos terminales correspondientes de RS7 no se comparan con los de la secuencia de VH humana.

La Figura 4 muestra las secuencias de ADN y aminoácidos para (A) V^k de RS7 humanizado y (B) V^h de RS7 humanizado. Las secciones en negrita y subrayadas de las secuencias de aminoácidos indican las CDR definidas por el esquema de numeración de Kabat.

La Figura 5 muestra las (A) secuencias de ADNc y aminoácidos de la cadena ligera para V^k de RS7 humanizado y las secuencias de ADNc y aminoácidos de la cadena pesada para V^h de RS7 humanizado. Las secciones subrayadas de las secuencias de aminoácidos indican la secuencia del péptido líder para la secreción. "*" indica el codón de parada.

La Figura 6 muestra una comparación de mRS7, cRS7 y hRS7 en ensayos de unión competitiva. Se usaron concentraciones variables de Abs competidores para competir con la unión de una cantidad constante de RS7 biotinilado con el Ag recubierto en placas ELISA de 96 pocillos. hRS7 mostró una actividad de bloqueo comparable a la de RS7 y cRS7.

La Figura 7 muestra las secuencias de ADNc y aminoácidos de cadena ligera para V^k de RS7 humanizado. Las secciones subrayadas de las secuencias de aminoácidos indican la secuencia del péptido líder para la secreción. "*" indica el codón de parada. Los residuos de lisina también están subrayados.

La Figura 8 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la cadena pesada para V^k de RS7 humanizado. Las secciones subrayadas de las secuencias de aminoácidos indican la secuencia del péptido líder para la secreción. "*" indica el codón de parada. Los residuos de lisina también están subrayados.

La Figura 9 indica la estructura de las fracciones residuales de IMP-R4, IMP-R5 e IMP-R8.

La Figura 10 es un gráfico de barras de dosimetría debido a hRS7 radioyodado en el modelo de tumor MDA-MB-468.

La Figura 11 proporciona una serie de gráficos que demuestran los efectos de la radioinmunoterapia sobre el crecimiento tumoral de xenoinjertos de cáncer de mama en ratones desnudos.

La Figura 12 es una serie de gráficos que evalúan la toxicidad después del tratamiento con radioinmunoterapia de xenoinjertos de cáncer de mama en ratones desnudos.

La Figura 13 es un gráfico que demuestra los volúmenes tumorales medios relativos (MTV).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

A menos que se especifique lo contrario, "un" o "uno" significa "uno o más".

Un anticuerpo de RS7 (anteriormente designado RS7-3G11) es una IgG1 murina producida contra una preparación de membrana bruta de un carcinoma de células escamosas primario humano del pulmón. Ver Stein et al., Cancer Res. 50: 1330 (1990). El anticuerpo de RS7 reconoce un antígeno asociado a tumor, que fue definido por el MAb murino RS7-3G11 producido contra el carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano. Stein et al. divulga que el anticuerpo de RS7 reconoce una glicoproteína de 46-48 kDa, caracterizada como grupo 13. Stein et al., Int. J. Cancer Supp. 8: 98-102 (1994). Ver también, Basu et al., Int. J. Cancer 52: 472-479 (1995). El antígeno ha sido designado como EGP-1 (glicoproteína-1 epitelial) siguiendo la propuesta del 3° International IASLC Workshop on Lung Tumor and Differentiation Antigens. Ver, por ejemplo, DeLeij et al., Int. J. Cancer Supp., 8:60-63 (1994). Por consiguiente, como se describe en la presente, los antígenos de RS7 y EGP-1 son sinónimos. El antígeno EGP-1 también se denomina TROP2 en la bibliografía, pero puede haber múltiples epítopos tanto de EGP-1 como de TROP2.

Los estudios de citometría de flujo y tinción inmunohistoquímica han demostrado que el MAb de RS7 detecta antígeno en una variedad de tipos de tumores, con unión limitada al tejido humano normal. (Stein et al., (1990), supra). El anticuerpo de RS7 es reactivo con una glicoproteína EGP-1, que puede internalizarse rápidamente. EGP-1 se expresa principalmente por carcinomas como carcinomas de pulmón, estómago, vejiga urinaria, mama, ovario, útero y próstata. Los estudios de localización y terapia que utilizan MAb de RS7 murino radiomarcado en modelos animales han demostrado eficacia terapéutica y de direccionamiento tumoral (Stein et al., (1990), supra. Stein et al., (1991), supra).

Un estudio más reciente ha demostrado una fuerte tinción de RS7 en tumores de pulmón, mama, vejiga, ovario, útero, estómago y próstata. Ver Stein et al., Int. J. Cancer 55:938 (1993). Además, los casos de cáncer de pulmón en este estudio comprendían tanto carcinomas de células escamosas como adenocarcinomas. Id. Ambos tipos de células se tiñeron fuertemente, lo que indica que el anticuerpo de RS7 no distingue entre clases histológicas de carcinoma de pulmón de células no pequeñas.

Como se ha analizado anteriormente, el MAb de RS7 se internaliza rápidamente en las células objetivo (Stein et al. (1993), supra). La constante de tasa de internalización para RS7 MAb es intermedia entre las constantes de tasa de internalización de otros dos MAb de internalización rápida que se ha demostrado que son útiles para la producción de inmunotoxinas. Id. Está bien documentado que la internalización de conjugados de inmunotoxinas es un requisito absoluto para la actividad antitumoral. (Pastan et al., Cell 47:641 (1986)). La internalización de inmunoconjugados de fármacos también se ha descrito como un factor principal en la eficacia antitumoral. (Yang et al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA 85: 1189 (1988)). Por lo tanto, el antígeno de RS7 puede ser un objetivo importante para aquellos tipos de inmunoterapia que requieren internalización del agente terapéutico.

Por tanto, los estudios con el MAb de RS7 indican que el anticuerpo muestra varias propiedades importantes, que lo convierten en un candidato para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico clínico. Dado que el antígeno de RS7 proporciona un objetivo útil para el diagnóstico y la terapia, es deseable obtener un MAb que reconozca un epítopo del antígeno de RS7. Además, la disponibilidad de anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y humanos es esencial para el desarrollo de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de doble determinante, que es deseable para detectar el antígeno de RS7 en muestras clínicas y esencial para aplicaciones in vivo en humanos.

Con este fin, la presente invención describe anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos y fragmentos de los mismos que se unen al antígeno de RS7 y pueden usarse para métodos de diagnóstico y terapéuticos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de anticuerpos se describen en la Solicitud Provisional de Estados Unidos titulada "Anti-CD20 Antibodies And Fusion Proteins Thereof And Methods Of Use", expediente del representate N° 18733/1073, Provisional de Estados Unidos N° 60/356,132, Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 60/416,232 y Expediente del Representantee N° 18733/1155; anticuerpos hMN-14, como los divulgados en la Solicitud de Estados Unidos N° 5.874.540, que es un anticuerpo de antígeno anti-carcinoembrionario de Clase III (anticuerpo anti-CEA); anticuerpos Mu-9, como los descritos en la Solicitud de Estados Unidos N° 10/116,116; anticuerpos AFP, como los descritos en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 60/399,707; anticuerpos PAM4, como los descritos en la Solicitud Provisional de Estados Unidos titulada "Monoclonal Antibody cPAM4", Expediente del Representante N° 18733/1102; anticuerpos de RS7, como los descritos en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 60/360,229; y anticuerpos CD22, como los divulgados en las Patentes de Estados Unidos N° 5.789.554 y 6.187.287 y las Solicitudes de Estados Unidos N° 09/741,843 y 09/988,013. Un anticuerpo quimérico como se divulga en la presente es una proteína recombinante que contiene los dominios variables que incluyen las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de una especie, preferiblemente un anticuerpo de roedor, mientras que los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de una anticuerpo humano. Para aplicaciones veterinarias, los dominios constantes del anticuerpo quimérico pueden derivarse de los de otras especies. Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la que las CDR de un anticuerpo de una especie, por ejemplo, un anticuerpo de roedor, se transfieren desde las cadenas pesadas y variables del anticuerpo de roedor a los dominios variables pesados y ligeros humanos.

De acuerdo como la invención como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo de RS7 está humanizado. Como los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huésped humano como una proteína extraña, y las inyecciones repetidas pueden provocar reacciones de hipersensibilidad nocivas, la humanización de una secuencia de RS7 murina puede reducir la respuesta inmune adversa que pueden experimentar los pacientes. Para los anticuerpos monoclonales de base murina, a esto se hace referencia a menudo respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA). Otra realización de la presente divulgación es un anticuerpo anti-EGF-1 o fragmento del mismo que es un anticuerpo anti-EGP-1 de primate subhumano, anticuerpo anti-EGP-1 monoclonal murino (restringido a aplicaciones veterinarias), anticuerpo anti-EGP-1 quimérico, anticuerpo anti-EGP-1 humano y anticuerpo anti-EGP-1 humanizado. Algunos residuos humanos en las regiones marco del anticuerpo de RS7 humanizado o fragmentos del mismo pueden reemplazarse por sus contrapartidas murinas. También es posible que se use una combinación de secuencias marco de 2 anticuerpos humanos diferentes para VH. Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano.

Otro ejemplo de la presente divulgación es un anticuerpo de RS7 humano. Un anticuerpo humano es un anticuerpo obtenido de ratones transgénicos que han sido "modificados" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al desafío antigénico. En esta técnica, los elementos del locus de la cadena pesada y ligera humana se introducen en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen disrupciones dirigidas de los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera endógenos. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden usarse para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen por Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), yTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). También puede construirse un anticuerpo completamente humano mediante métodos de transfección genéticos o cromosómicos, así como tecnología de presentación de fagos, todos los cuales son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) para la producción de anticuerpos humanos y fragmentos de los mismos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominios variables de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. En esta técnica, los genes de dominios variables del anticuerpo se clonan en el marco en un gen de la proteína de la cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Como la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación de fagos puede realizarse en una variedad de formatos, para su revisión, ver, por ejemplo, Johnson y Chiswell, Current Opiniion in Structural Biology 3:5564-571 (1993).

El anticuerpo y fragmentos de los mismos de la presente se generan preferiblemente contra una preparación de membrana bruta de un carcinoma primario humano de células escamosas de pulmón. También, puede generarse el anticuerpo de RS7 y fragmentos del mismos contra una preparación de membrana de células viables de una línea celular de carcinoma de ovario humano. Además, el antígeno de RS7 puede ser proporcionado por células Colo 316 viables. En una línea relacionada, el anticuerpo de RS7 puede obtenerse usando una preparación sustancialmente pura del antígeno de RS7. Una proteína sustancialmente pura es una proteína que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, que están asociados con la proteína en la naturaleza. Como se describe en la presente, el término "anticuerpo de RS7" también incluye anticuerpos de RS7 quiméricos, humanos y humanizados.

Preparación de anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y humanos

Los anticuerpos monoclonales para antígenos específicos pueden obtenerse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975) y Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,VOL. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) (en lo sucesivo "Coligan"). Brevemente, los MAbs de antígeno RS7, como RS7, pueden obtenerse inyectando a los ratones una composición que comprende el antígeno de RS7, verificando la presencia de producción de anticuerpos extrayendo una muestra de suero, extrayendo el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno de RS7, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno de RS7, y aislando anticuerpos de RS7 a partid de cultivos de hibridoma.

Después de la generación inicial de anticuerpos para el inmunógeno, los anticuerpos pueden secuenciarse y prepararse posteriormente mediante técnicas recombinantes. Los expertos en la técnica conocen bien la humanización y quimerización de anticuerpos murinos y fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo regiones determinantes complementarias de ratón de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina de ratón en un dominio variable humano, y luego, sustituyendo residuos humanos en las regiones marco de las contrapartes murinas. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados evita los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas.

Un anticuerpo humano de la presente divulgación, es decir, MAbs EGP-1 humanos u otros anticuerpos humanos, como MAbs anti-EGP-2, m Uc 1-4, CEA, CC49, CSAp, PSMA, PSA, EGFR, A33 y HER2/neu para la terapia de combinación con anticuerpos de RS7 humanizados, quiméricos o humanos, puede obtenerse de un animal no humano transgénico. Ver, por ejemplo, Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997); Patente de Estados Unidos N° 5.633.425. Un anticuerpo humano de la presente invención como se define en las reivindicaciones que puede usarse para terapia de combinación también puede ser reactivo con un antígeno seleccionado del grupo que consiste de Le(y), Tn, Tag-72, AFP, HCG, HCG-beta, ferritina, PAP, EGP-2, histona, citoqueratina, tenascina, CanAg, G 250 de cáncer de riñón, VGFR1, VGFR2 o una combinación de los mismos. Por ejemplo, puede recuperarse un anticuerpo humano de un ratón transgénico que posee loci de inmunoglobulina humana. El sistema inmunológico humoral de ratón se humaniza inactivando los genes de inmunoglobulina endógenos e introduciendo loci de inmunoglobulina humana. Los loci de inmunoglobulina humana son extremadamente complejos y comprenden un gran número de segmentos discretos que juntos ocupan casi el 0,2% del genoma humano. Para asegurar que los ratones transgénicos sean capaces de producir repertorios adecuados de anticuerpos, deben introducirse grandes porciones de loci de cadena pesada y ligera humana en el genoma del ratón. Esto se logra en un proceso escalonado que comienza con la formación de cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contienen loci de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada humana en la configuración de línea germinal. Como cada inserto tiene un tamaño de aproximadamente 1 Mb, la construcción de YAC requiere una recombinación homóloga de fragmentos superpuestos de los loci de inmunoglobulina. Los dos YAC, uno que contiene los loci de cadena pesada y otro que contiene los loci de cadena ligera, se introducen por separado en ratones mediante la fusión de esferoblastos de levadura que contienen YAC con células madre embrionarias de ratón. Luego, se microinyectan clones de células madre embrionarias en blastocistos de ratón. Los machos quiméricos resultantes se seleccionan para determinar su capacidad para transmitir el YAC a través de su línea germinal y se cruzan con ratones deficientes en la producción de anticuerpos murinos. El cruce de las dos cepas transgénicas, una que contiene los loci de la cadena pesada humana y la otra que contiene los loci de la cadena ligera humana, crea una progenie que produce anticuerpos humanos en respuesta a la inmunización.

Las técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulina murina se describen, por ejemplo, en la publicación de Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA 86: 3833 (1989). Las técnicas para producir MAb humanizados se describen, por ejemplo, por Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Singer et al., J. Immun. 150: 2844 (1992), Mountain et al. Biotechnol. Gineta. Eng. Rev. 10: 1 (1992), y Coligan en las páginas 10.19.1-10.19.11.

En general, las secuencias de V^k (cadena ligera variable) y V^h (cadena pesada variable) para anticuerpos de RS7 pueden obtenerse mediante una variedad de procedimientos de clonación molecular, como RT-PCR, 5'-RACE y cribado de bibliotecas de ADNc. Específicamente, los genes de VH y Vk del MAb de RS7 se clonaron mediante amplificación por PCR a partir de las células de hibridoma mediante ^rT-PCR y 5' RACE, respectivamente, y sus secuencias se determinaron mediante secuenciación de ADN. Para confirmar su autenticidad, los genes de V^l y V^h clonados pueden expresarse en cultivo celular como un Ab quimérico como describen Orlandi et al, (Proc. Natl. Acad. Sci., ^uS^a , 86: 3833 (1989)). En base de las secuencias del gen V, puede diseñarse y construirse un anticuerpo de RS7 humanizado como se describe por Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995)), el ADNc puede prepararse a partir de cualquier línea de hibridoma conocida o línea celular transfectada que produzca un anticuerpo de RS7 murino o quimérico mediante técnicas generales de clonación molecular (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual, 2a edición (1989)). En un ejemplo, se usa la línea de hibridoma RS7. La secuencia de VK para el mAb puede amplificarse usando los cebadores VK1BACK y VK1FOR (Orlandi et al., 1989) o el conjunto de cebadores extendido descrito por Leung et al. (BioTechniques, 15: 286 (1993)), mientras que las secuencias de V^h pueden amplificarse usando el par de cebadores VH1BACK/VH1FOR (Orlandi et al., 1989 anterior), o los cebadores que se aparean con la región constante de IgG murina descritos por Leung et al. (Hybridoma, 13: 469 (1994)). Las mezclas de reacción de PCR que contienen 10 pl del producto de ADNc de la primera cadena, 10 pl de tampón de PCR 10X [KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM (pH 8,3), MgCl²15 mM y 0,01% (p/v) de gelatina] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 250 pM de cada dNTP, 200 nM de los cebadores y 5 unidades de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus) pueden someterse a 30 ciclos de PCR. Cada ciclo de PCR consiste preferiblemente de desnaturalización a 94° C durante 1 min, apareamiento a 50° C durante 1,5 min y polimerización a 72° C durante 1,5 min. Los fragmentos Vk y VH amplificados se pueden purificar en agarosa al 2% (BioRad, Richmond, CA). De manera similar, los genes V humanizados pueden construirse mediante una combinación de síntesis de plantilla de oligonucleótidos largos y amplificación por PCR como se describe por Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995)).

Los productos de PCR para Vk pueden subclonarse en un vector de estadificación, como un vector de estadificación basado en pBR327, VKpBR, que contiene un promotor de Ig, una secuencia de péptido señal y sitios de restricción convenientes para facilitar la ligación en marco de los productos de PCR de Vk. Los productos de PCR para V^h pueden subclonarse en un vector de estadificación similar, como el VHpBS basado en pBluescript. Los clones individuales que contienen los productos de PCR respectivos pueden secuenciarse mediante, por ejemplo, el método de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad Sci., USA, 74: 5463 (1977)).

Se debe considerar que las secuencias de ADN descritas en la presente incluyen todos los alelos, mutantes y variantes de los mismos, ya sean de origen natural o inducido.

Los casetes de expresión que contienen V^k y VH, junto con las secuencias del promotor y del péptido señal pueden escindirse de VKpBR y VHpBS, respectivamente, mediante digestión de doble restricción como fragmentos HindIII-BamHI. Los casetes de expresión de V^k y VH pueden ligarse luego en vectores de expresión apropiados, como pKh y pG1g, respectivamente (Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994)). Los vectores de expresión pueden cotransfectarse en una célula apropiada, por ejemplo, Sp2/0-Ag14 de mieloma (ATCC, VA), colonias seleccionadas para resistencia a higromicina y fluidos sobrenadantes monitorizados para la producción de un RS7 MAb quimérico o humanizado mediante, por ejemplo, un ensayo ELISA, como se describe a continuación. Alternativamente, los casetes de expresión de Vk y VH pueden ensamblarse en los vectores de estadificación modificados, VKpBR2 y VHpBS2, escindidos como fragmentos XbaI/BamHI y XhoI/BamHI, respectivamente, y subclonados en un único vector de expresión, como pdHL2, como se describe por Gilles et al. (J. Immunol. Methods 125:191 (1989) y también mostrado en Losman et al., Cancer, 80:2660 (1997)) para la expresión en células Sp2/0-Ag14. Otro vector que es útil en la presente invención es el vector GS, como se describe en Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123 (2000), que se expresa preferiblemente en la línea celular NS0 y células CHO. Otros sistemas de expresión de mamíferos apropiados se describen en Werner et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 48 (II), Nr. 8, 870-880 (1998).

La cotransfección y el ensayo de clones que secretan anticuerpos mediante ELISA pueden llevarse a cabo de la siguiente manera. Pueden usarse aproximadamente 10 |jg de VKpKh (vector de expresión de cadena ligera) y 20 jg de VHpG1g (vector de expresión de cadena pesada) para la transfección de 5 x 10⁶ células de mieloma SP2/0 por electroporación (BioRad, Richmond, CA) de acuerdo con Co et al., J. Immunol., 148:1149 (1992). Después de la transfección, las células pueden cultivarse en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio HSFM completo (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) a 37° C, 5% de CO². El proceso de selección puede iniciarse después de dos días mediante la adición de medio de selección de higromicina (Calbiochem, San Diego, CA) a una concentración final de 500 unidades/ml de higromicina. Las colonias emergen típicamente 2-3 semanas después de la electroporación. Luego, los cultivos pueden expandirse para análisis adicional.

Las células huésped adecuadas incluyen células huésped microbianas o de mamífero. Un huésped preferido es la línea celular humana, PER.C6, que se desarrolló para la producción de MAb y otras proteínas de fusión. Por consiguiente, una realización preferida de la presente invención es una célula huésped que comprende una secuencia de ADN codificante y MAb anti-EGP-1, conjugado, proteína de fusión o fragmentos de la misma. Se generaron células PER.C6 (WO 97/00326) mediante transfección de células de retina embrionarias humanas primarias, usando un plásmido que contenía las secuencias codificantes E1A y E1B de Adserotipo 5 (Ad5) (nucleótidos Ad5 459-3510) bajo el control del promotor de fosfoglicerato quinasa humana (PGK). E1A y E1B son proteínas 1A y 1B de activación génica temprana de adenovirus, respectivamente. Los métodos y composiciones son particularmente útiles para generar una expresión estable de proteínas recombinantes humanas de interés que se modifican postraduccionalmente, por ejemplo, mediante glicosilación. Varias características hacen que PER.C6 sea particularmente útil como un huésped para la producción de proteínas recombinantes, de tal manera que PER.C6 es una línea celular humana completamente caracterizada y fue desarrollada de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Además, PER. ^c6 puede cultivarse como un cultivo en suspensión en un medio libre de suero definido desprovisto de cualquier proteína derivada de humanos o animales y su crecimiento es compatible con botellas rotativas, matraces agitadores, matraces giratorios y biorreactores con tiempos de duplicación de aproximadamente 35 horas. Finalmente, la presencia de E1A provoca una regulación por incrmento de la expresión de genes que están bajo el control del potenciador/promotor de CMV y la presencia de E13 previene la apoptosis dependiente de p53 posiblemente potenciada a través de la sobreexpresión del transgén recombinante. En una realización, la célula es capaz de producir de 2 a 200 veces más proteína recombinante y/o sustancia proteinácea que las líneas celulares de mamífero convencionales.

Los clones de transfectomas que son positivos para la secreción de cadena pesada quimérica o humanizada pueden identificarse mediante ensayo ELISA. Brevemente, las muestras de sobrenadante (~100 jl) de cultivos de transfectomas se añaden por triplicado a placas de microtitulación ELISA recubiertas previamente con anticuerpo específico de fragmento F(ab')² (GAH)-IgG de cabra antihumano, (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Las placas se incuban durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas no unidas se eliminan lavando tres veces con tampón de lavado (PBS que contiene polisorbato 20 al 0,05%). Se añadieron anticuerpos específicos del fragmento Fc GAH-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch) a los pocillos, (100 j l de stock de anticuerpo diluido x 10⁴ , suplementado con el anticuerpo no conjugado a una concentración final de 1,0 jg/ml). Después de una incubación de 1 h, las placas se lavan, típicamente tres veces. Se añade a los pocillos una solución de reacción, [100 jl, que contiene 167 jg de ortofenilendiamina (OPD) (Sigma, St. Louis, MO), peróxido de hidrógeno al 0,025% en PBS]. Se deja que el color se desarrolle en la oscuridad durante 30 minutos. La reacción se detiene mediante la adición de 50 j l de solución de HCl 4 N en cada pocillo antes de medir la absorbancia a 490 nm en un lector ELISA automático (Bio-Tek instruments, Winooski, VT). Los anticuerpos quiméricos unidos se determinan entonces con respecto a un estándar de anticuerpo quimérico irrelevante (que puede obtenerse de Scotgen, Ltd., Edinburg, Escocia).

Los anticuerpos pueden aislarse de los medios de cultivo celular de la siguiente manera. Los cultivos de transfectomas se adaptan al medio sin suero. Para la producción de anticuerpo quimérico, las células se cultivan como un cultivo de 500 ml en botellas rotativas usando HSFM. Los cultivos se centrifugan y el sobrenadante se filtra a través de una membrana de 0,2 p. El medio filtrado se pasa a través de una columna de proteína A (1 x 3 cm) a un caudal de 1 ml/min. Luego, la resina se lava con aproximadamente 10 volúmenes de columna de PBS y el anticuerpo unido a proteína A se eluye de la columna con tampón de glicina 0,1 M (pH 3,5) que contiene EDTA 10 mM. Se recogen fracciones de 1,0 ml en tubos que contienen 10 pl de Tris 3 M (pH 8,6) y se determinan las concentraciones de proteína a partir de la absorbancia a 280/260 nm. Las fracciones máximas se agrupan, se dializan contra PBS y se concentra el anticuerpo, por ejemplo, con el Centricon 30 (Amicon, Beverly, M^a ). La concentración de anticuerpo se determina mediante ELISA, como antes, y su concentración se ajusta a aproximadamente 1 mg/ml usando PBS. Se añade convenientemente a la muestra azida de sodio al 0,01% (p/v) como conservante.

Las secuencias de nucleótidos de los cebadores usados para preparar los anticuerpos de RS7 se enumeran en el Ejemplo 2, a continuación. En un ejemplo, un anticuerpo de RS7 humanizado o fragmento de anticuerpo comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un MAb de RS7 murino y las regiones marco (FR) de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano y las regiones constantes de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano, en donde las CDR de la región variable de cadena ligera del RS7 humanizado comprenden la CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de KASQDVSIAVA; la CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SASYRYT; y la CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de QQHYITPLT; y las CDR de la región variable de la cadena pesada del MAb de RS7 humanizado comprenden la CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de NYGMN; la CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de WINTYTGEPTYTDDFKG y la CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GGFGSSYWYFDV. También, las FR de las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo humanizado pueden comprender por lo menos un aminoácido sustituido de dichas FR correspondientes del MAb de RS7 murino.

Los MAb de RS7 pueden aislarse y purificarse a partir de cultivos de hibridomas mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico. Ver, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3. También, ver Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

Los MAb de RS7 pueden caracterizarse mediante una variedad de técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un MAb de RS7 para unirse al antígeno de RS7 puede verificarse usando un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, análisis de citometría de flujo o análisis Western.

Producción de fragmentos de anticuerpos de RS7

La presente divulgación contempla el uso de fragmentos de anticuerpos de RS7 y hRS7. Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Los fragmentos de anticuerpo son porciones de unión a antígeno de un anticuerpo, como F(ab')², Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Otros fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: los fragmentos F(ab)'² que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab', que pueden generarse reduciendo puentes disulfuro de los fragmentos F(ab)'². Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patentes de Estados Unidos N° 4.036.945 y 4.331.647 y referencias contenidas en las mismas. También, ver Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al., en METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, página 422 (Academic Press 1967), y Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab' (Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos de Fab' monoclonales con la especificidad deseada. La presente divulgación abarca anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.

Una molécula Fv de cadena sencilla (scFv) comprende un dominio VL y un dominio VH. Los dominios VL y VH se asocian para formar un sitio de unión objetivo. Estos dos dominios están además enlazados covalentemente por un conector peptídico (L). Una molécula scFv se denota como VL-L-VH si el dominio VL es la parte N-terminal de la molécula scFv, o como VH-L-VL si el dominio VH es la parte N-terminal de la molécula scFv. Los métodos para elaborar moléculas scFv y diseñar conectores peptídicos adecuados se describen en la Patente de Estados Unidos N° 4.704.692, Patente de Estados Unidos N° 4.946.778, R. Raag y M. Whitlow, "Single Chain Fvs". FASEB Vol 9:73-80 (1995) y R.E. Bird y B.W. Walker, "Single Chain Antibody Variable Regions", TIBTECH, Vol 9: 132-137 (1991).

Un fragmento de anticuerpo puede prepararse mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo de longitud completa o mediante expresión en E. coli u otro huésped del ADN que codifica el fragmento. Un fragmento de anticuerpo puede obtenerse mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos de longitud completa mediante métodos convencionales. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede producirse mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado F(ab')². Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol y, opcionalmente, un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Alternativamente, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patentes de Estados Unidos N° 4.036.945 y 4.331.647 y referencias contenidas en las mismas. También, ver Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al., en METHODS IN ENZYMOLOGY VOL.

1, página 422 (Academic Press 1967), y Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de complementariedad (CDR). Una CDR es un segmento de la región variable de un anticuerpo que tiene una estructura complementaria al epítopo al que se une el anticuerpo y es más variable que el resto de la región variable. Por consiguiente, a veces se hace referencia a una CDR como región hipervariable. Una región variable comprende tres CDR. Los péptidos de CDR pueden obtenerse construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras de anticuerpos. Ver, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), páginas 166-179 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), páginas 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995).

También pueden usarse otros métodos de escisión de anticuerpos, como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, la escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Producción de proteínas de fusión de anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y humanos

Las proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de las mismas pueden prepararse mediante una variedad de procedimientos convencionales, que van desde el enlace glutaraldehído hasta enlaces más específicos entre grupos funcionales. Los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos se unen preferiblemente de manera covalente entre sí, directamente o mediante una fracción conectora, a través de uno o más grupos funcionales en el anticuerpo o fragmento, por ejemplo, grupos amina, carboxilo, fenilo, tiol o hidroxilo. Pueden usarse varios conectores convencionales además del glutaraldehído, por ejemplo, disiocianatos, diiosotiocianatos, ésteres de bis(hidroxisuccinimida), carbodiimidas, ésteres de maleimidahidroxisuccinimida y similares.

Un método simple para producir proteínas de fusión de anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y humanos es mezclar los anticuerpos o fragmentos en presencia de glutaraldehído para formar una proteína de fusión de anticuerpos. Los enlaces de base de Schiff iniciales pueden estabilizarse, por ejemplo, mediante reducción de borohidruro a aminas secundarias. Puede usarse un diiosotiocianato o carbodiimida en lugar de glutaraldehído como conector no específico del sitio. Se espera que las proteínas de fusión de anticuerpos tengan una mayor especificidad de unión que los MAb, ya que las proteínas de fusión comprenden fracciones que se unen a por lo menos dos epítopos del antígeno de RS7. Por tanto, las proteínas de fusión de anticuerpos son la forma preferida de proteína de unión al antígeno de RS7 para terapia.

En el presente contexto, una proteína de fusión de anticuerpos comprende por lo menos dos MAb de RS7 quiméricos, humanizados o humanos, o fragmentos de los mismos, en donde por lo menos dos de los MAb o fragmentos se unen a diferentes epítopos del antígeno de RS7 o contra un epítopo de RS7 y el de un antígeno totalmente diferente. Por ejemplo, una proteína de fusión de anticuerpos de RS7 biespecífica puede comprender un anticuerpo CEA o un fragmento del mismo y el MAb de RS7 o un fragmento del mismo. Tal proteína de fusión de anticuerpos de RS7 biespecífica puede prepararse, por ejemplo, obteniendo un fragmento F(ab')2 de CEA como se ha descrito anteriormente. Los puentes disulfuro intercatenarios del fragmento F(ab')² del anticuerpo se reducen suavemente con cisteína, teniendo cuidado de evitar el enlace de cadena ligera-pesada, para formar fragmentos Fab'-SH. El o los grupos SH se activan con un exceso de conector de bis-maleimida (1,1 '-(metilendi-4,1 -fenilen)bismalemida). El MAb de RS7 se convierte en Fab'-SH y luego se hace reaccionar con el fragmento Fab'-SH de CEA activado para obtener una proteína de fusión de anticuerpo de RS7 biespecífica.

Puede obtenerse una proteína de fusión de anticuerpos de RS7 poliespecífica añadiendo fracciones de unión al antígeno de RS7 a una proteína de fusión de anticuerpo de RS7 quimérico, humanizado o humano biespecífica. Por ejemplo, puede hacerse reaccionar una proteína de fusión de anticuerpo biespecífica con 2-iminotiolano para introducir uno o más grupos sulfhidrilo para su uso en el acoplamiento de la proteína de fusión biespecífica a un tercer fragmento o MAb de antígeno de RS7, usando el procedimiento de activación de bismaleimida descrito anteriormente. Estas técnicas para producir compuestos de anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.925.648.

Los anticuerpos biespecíficos pueden elaborarse mediante una variedad de métodos convencionales, por ejemplo, escisión por disulfuro y reformación de mezclas de IgG completa o, preferiblemente fragmentos F(ab')², fusiones de más de un hibridoma para formar poliomas que producen anticuerpos que tienen más de una especificidad, y por ingeniería genética. Se han preparado proteínas de fusión de anticuerpos biespecíficas mediante escisión oxidativa de fragmentos Fab' resultantes de la escisión reductora de diferentes anticuerpos. Esto se lleva a cabo ventajosamente mezclando dos fragmentos F(ab')² diferentes producidos por digestión con pepsina de dos anticuerpos diferentes, escisión reductora para formar una mezcla de fragmentos Fab', seguido de reforma oxidativa de los enlaces disulfuro para producir una mezcla de fragmentos F(ab')2 que incluyen proteínas de fusión de anticuerpos biespecíficas que contienen una porción Fab' específica para cada uno de los epítopos originales. Técnicas generales para la preparación de proteínas de fusión de anticuerpos pueden encontrarse, por ejemplo, en Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961), Hammerling et al., J. Exp. Med 128: 1461 (1968) y Patente de Estados Unidos N° 4.331.647. En la presente divulgación se contempla una proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de la misma que comprende por lo menos un primer MAb anti-EGP-1 o fragmento del mismo y por lo menos un segundo MAb o fragmento del mismo, distinto de los MAb anti-EGP-1 o fragmentos de los mismos de la presente invención.

Puede conseguirse un enlace más selectivo usando un conector heterobifuncional como el éster de maleimidahidroxisuccinimida. La reacción del éster con un anticuerpo o fragmento derivatizará grupos amina en el anticuerpo o fragmento, y el derivado puede hacerse reaccionar con, por ejemplo, un fragmento Fab de anticuerpo que tiene grupos sulfhidrilo libres (o un fragmento más grande o anticuerpo intacto con grupos sulfhidrilo unidos al mismo por, por ejemplo, reactivo de Traut). Es menos probable que dicho conector reticule grupos en el mismo anticuerpo y mejore la selectividad del enlace.

Es ventajoso enlazar los anticuerpos o fragmentos en sitios alejados de los sitios de unión al antígeno. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante un enlace a grupos sulfhidrilo intercatenarios escindidos, como se ha indicado anteriormente. Otro método implica hacer reaccionar un anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con otro anticuerpo que tiene por lo menos una función amina libre. Esto da como resultado un enlace de base de Schiff (mime) inicial, que se estabiliza preferiblemente mediante reducción a una amina secundaria, por ejemplo, mediante reducción con borohidruro, para formar el compuesto final. Tales enlaces específicos del sitio se divulgan, para moléculas pequeñas, en la Patente de Estados Unidos N° 4.671.958 y para sumandos más grandes en la Patente de Estados Unidos N° 4.699.784.

Los scFv con conectores de más de 12 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, conectores de 15 o 18 residuos) permiten la interacción entre los dominios V^H y V^L en la misma cadena y generalmente forman una mezcla de monómeros, dímeros (denominados diacuerpos) y pequeñas cantidades de multímeros de masa más alta, (Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157). Sin embargo, los scFv con conectores de 5 o menos residuos de aminoácidos prohíben el emparejamiento intramolecular de los dominios V^H y V^L en la misma cadena, forzando el emparejamiento con los dominios V^h y V^l en una cadena diferente. Los conectores entre 3 y 12 residuos forman predominantemente dímeros (Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604). Con conectores entre 0 y 2 residuos, se forman estructuras triméricas (denominadas triacuerpos), tetraméricas (denominadas tetracuerpos) o estrucutras oligoméricas superiores de scFv; sin embargo, los patrones exactos de oligomerización parecen depender de la composición así como de la orientación de los dominios V, además de la longitud del conector. Por ejemplo, los scFv del anticuerpo anti-neuraminidasa NC10 formaron predominantemente trímeros (orientación V^h a V^l) o tetrámeros (orientación V^l a V^h) con conectores de 0 residuos (Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574). Para scFv construidos a partir de NC10 con conectores de 1 y 2 residuos, la orientación de V^h a V^l formaba predominantemente diacuerpos (Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604); por el contrario, la orientación V^l a V^h formó una mezcla de tetrámeros, trímeros, dímeros y multímeros de mayor masa (Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574). Para scFv construidos a partir del anticuerpo anti-CD19 HD37 en la orientación V^h a V^l, el conector de 0 residuos formó exclusivamente trímeros y el conector de 1 residuo formó exclusivamente tetrámeros (Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168).

Los anticuerpos de RS7 y fragmentos de los mismos de la presente divulgación también pueden usarse para producir diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos específicos de antígeno, que son multivalentes pero monoespecíficos. La asociación no covalente de dos o más moléculas scFv puede formar diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos funcionales. Los diacuerpos monoespecíficos son homodímeros del mismo scFv, donde cada scFv comprende el dominio V^h del anticuerpo seleccionado conectado por un conector corto al dominio V^l del mismo anticuerpo. Un diacuerpo es un dímero bivalente formado por la asociación no covalente de dos scFv, produciendo dos sitios de unión a Fv. Un triacuerpo resulta de la formación de un trímero trivalente de tres scFv, produciendo tres sitios de unión, y un tetracuerpo es un tetrámero tetravalente de cuatro scFv, lo que da como resultado cuatro sitios de unión. Se han elaborado varios diacuerpos monoespecíficos usando un vector de expresión que contiene un constructo de gen recombinante que comprende Vm-conector-VL1. Ver Holliger et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1302 (1996); Holliger et al., Nature Biotechnology 15: 632-631 (1997); Helfrich et al., Int. J. Cancer 76: 232-239 (1998); Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77: 763-772 (1998); Holiger et al., Cáncer Research 59: 2909-2916 (1999)). Los métodos de construcción de scFv se divulgan en la US-4.946.778 (1990) y la US-5.132.405 (1992). Los métodos para producir proteínas de unión monoespecíficas multivalentes basadas en scFv se divulgan en la US-5.837.242 (1998), la US-5.844.094 (1998) y la WO-98/44001 (1998). Un ejemplo de la presente divulgación es un anticuerpo multivalente, multiespecífico o fragmento del mismo que comprende uno o más sitios de unión a antígeno que tienen afinidad hacia un antígeno objetivo EGP-1 y uno o más sitios de unión a hapteno que tienen afinidad hacia moléculas de hapteno.

Determinación de la afinidad de unión del anticuerpo

Las afinidades de unión comparativas de los anticuerpos mRS7, cRS7 y hRS7 aislados de este modo pueden determinarse mediante radioinmunoensayo directo. RS7 puede marcarse con 131I o 125I usando el método de las cloraminas-T (ver, por ejemplo, Greenwood et al., Biochem. J., 89: 123 (1963)). La actividad específica del anticuerpo yodado se ajusta típicamente a aproximadamente 10 pCi/pg. Los anticuerpos marcados y no marcados se diluyen a las concentraciones apropiadas usando medio de reacción (HSFM suplementado con suero de caballo al 1% y 100 pg/ml de gentamicina). Las concentraciones apropiadas de anticuerpos marcados como no marcados se añaden juntas a los tubos de reacción en un volumen total de 100 pl. Se muestrea un cultivo de células ME180 (una línea celular de carcinoma de cuello uterino humano) y se determina la concentración celular. El cultivo se centrifuga y las células recogidas se lavan una vez en medio de reacción seguido de resuspensión en medio de reacción hasta una concentración final de aproximadamente 107 células/ml. Todos los procedimientos se llevan a cabo en frío a 4° C. Se añade la suspensión celular, 100 pl, a los tubos de reacción. La reacción se lleva a cabo a 4° C durante 2 h con agitación suave periódica de los tubos de reacción para resuspender las células. Después del período de reacción, se añaden 5 ml de tampón de lavado (PBS que contiene BSA al 1%) a cada tubo. La suspensión se centrifuga y el sedimento celular se lava por segunda vez con otros 5 ml de tampón de lavado. Después de la centrifugación, se determina la cantidad de radiactividad restante que queda en el sedimento celular en un contador gamma (Minaxi, Packard Instruments, Sterling, Va.).

Vectores de expresión

Un vector de expresión es una molécula de ADN que comprende un gen que se expresa en una célula huésped. Típicamente, la expresión génica se coloca bajo el control de ciertos elementos reguladores, incluyendo los promotores constitutivos o inducibles, los elementos reguladores específicos de tejido y los potenciadores. Se dice que tal gen está "enlazado operativamente" a los elementos reguladores. Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la transcripción de un gen estructural. Un gen estructural es una secuencia de ADN que se transcribe en ARN mensajero (ARNm) que luego se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. Típicamente, un promotor se localiza en la región 5' de un gen, proximal al sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Si un promotor es un promotor inducible, entonces la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. Por el contrario, la tasa de transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. Un potenciador es un elemento regulador del ADN que puede aumentar la eficiencia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la transcripción.

Una molécula de ADN aislada es un fragmento de ADN que no está integrado en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, un gen de antígeno de RS7 clonado es un fragmento de ADN que se ha separado del ADN genómico de una célula de mamífero. Otro ejemplo de una molécula de ADN aislada es una molécula de ADN sintetizada químicamente que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. El ADN complementario (ADNc) es una molécula de ADN de cadena sencilla que se forma a partir de una plantilla de ARNm por la enzima transcriptasa inversa. Típicamente, se emplea un cebador complementario a porciones de ARNm para el inicio de la transcripción inversa. Los expertos en la técnica también usan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN de cadena doble que consiste de dicha molécula de ADN de cadena sencilla y su cadena de ADN complementaria.

Un vector de clonación es una molécula de ADN, como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma en una célula huésped. Los vectores de clonación contienen típicamente uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los que pueden insertarse secuencias de ADN extraño de una manera determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, así como un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen típicamente genes que proporcionan resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina. Un huésped recombinante puede ser cualquier célula procariota o eucariota que contenga o un vector de clonación o un vector de expresión. Este término también incluye aquellas células procariotas o eucariotas que han sido modificadas genéticamente para contener el gen o genes clonados en el cromosoma o genoma de la célula huésped. El término expresión se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción de ARNm en uno o más polipéptidos.

Uso de anticuerpos de RS7 humanizados, humanos y quiméricos para el tratamiento y el diagnóstico En la presente divulgación se contempla un método para diagnosticar o tratar una enfermedad maligna en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado terapéutico que comprende un MAb EGP-1 o un fragmento del mismo o una proteína de fusión de anticuerpos o fragmento de la misma, en donde el MAb EGP-1 o fragmento del mismo o proteína de fusión de anticuerpos o fragmento de la misma se une a por lo menos un agente terapéutico y luego se formula en un excipiente farmacéuticamente adecuado. También se contempla que un MAb EGP-1 no conjugado (desnudo) o un constructo de fusión con otras fracciones de unión a antígeno también puede usarse como un agente terapéutico para células cancerosas que expresan EGP-1. Estos anticuerpos no conjugados pueden administrarse ventajosamente en combinación con otras modalidades terapéuticas, como quimioterapia, radioterapia y/o inmunoterapia, ya sea juntos o en varias secuencias y programas. También se prefiere un método para diagnosticar o tratar el cáncer, que comprende: administrar un anticuerpo multivalente, multiespecífico o un fragmento del mismo que comprende uno o más sitios de unión al antígeno hacia un antígeno EGP-1 y uno o más sitios de unión a hapteno a un sujeto con necesidad de ellos, esperar una cantidad de tiempo suficiente para que una cantidad de la proteína no unida limpie el torrente sanguíneo del sujeto; y luego administrar al sujeto una molécula portadora que comprende un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o una combinación de los mismos, que se une al sitio de unión del anticuerpo multivalente, multiespecífico o fragmento del mismo. En un ejemplo, el cáncer es un cáncer de pulmón, mama, cabeza y cuello, ovario, próstata, vejiga o colon.

La tecnología de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales (MAb) ha proporcionado un método para la producción de sondas moleculares capaces de localizar o destruir células cancerosas. Se han usado técnicas de imagenología de tumores que usan MAb radiomarcados para delimitar la invasión cancerosa en varias enfermedades malignas. En animales de experimentación y en humanos, se han usado anticuerpos para la radioinmunodetección de antígeno carcinoembrionario en diversos tumores que expresan antígeno carcinoembrionario, y también tumores como melanoma, carcinoma de colon y carcinoma de mama con otros anticuerpos dirigidos. Goldenberg et al., Cancer Res. 40: 2984 (1980); Hwang et al., Cancer Res. 45: 4150 (1985); Zalcberg et al., J. Nat'l Cancer Inst. 71: 801 (1983); Colcher et al., Cancer Res. 43: 736 (1983); (Larson et al., J. Nucl. Med. 24: 123 (1983); DeLand et al., Cancer Res. 40: 3046 (1980); Epenetos et al., Lancet 2: 999 (1982).

El uso de MAb para el diagnóstico in vitro es bien conocido. Ver, por ejemplo, Carlsson et al., Bio/Technology 7 (6): 567 (1989). Por ejemplo, los MAb pueden usarse para detectar la presencia de un antígeno asociado a un tumor en el tejido de muestras de biopsia. Los MAb también pueden usarse para medir la cantidad de antígeno asociado a tumores en muestras de fluidos clínicos usando técnicas como radioinmunoensayo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, e inmunoensayo de fluorescencia.

Pueden usarse conjugados de MAb dirigidos a tumores y toxinas para destruir selectivamente células cancerosas in vivo (Spalding, Bio/Technology 9(8): 701 (1991); Goldenberg, Scientific American Science & Medicine 1(1): 64 (1994)). Por ejemplo, los estudios terapéuticos en modelos animales experimentales han demostrado la actividad antitumoral de los anticuerpos portadores de radionúclidos citotóxicos. (Goldenberg et al., Cancer Res. 41: 4354 (1981), Cheung et al., J. Nat'l Cancer Inst. 77: 739 (1986), y Senekowitsch et al., J. Nucl. Med 30: 531 (1989)). También, ver Stein et al., Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4: 703 (1991). Además, se han iniciado ensayos terapéuticos de fase I con algunos de estos MAb para el tratamiento de linfoma, melanoma y otras enfermedades malignas. Ver, por ejemplo, DeNardo et al., Int. J. Cancer Supl. 3: 96 (1988) y Goldenberg et al., J. Clin. Oncol. 9: 548 (1991).

Los anticuerpos humanizados, quiméricos y completamente humanos y fragmentos de los mismos son adecuados para su uso en métodos terapéuticos y métodos de diagnóstico. Por consiguiente, en la presente invención se contempla un método para administrar un agente de diagnóstico o terapéutico, o una combinación de los mismos, a un objetivo que comprende (i) proporcionar una composición que comprende un anticuerpo anti-EGP-1 y (ii) administrar a un sujeto con necesidad del mismo, el conjugado de anticuerpos de diagnóstico o terapéutico. Preferiblemente, los anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y completamente humanos y fragmentos de los mismos de la presente divulgación se usan en métodos para tratar enfermedades malignas.

También se describe en la presente un conjugado de diagnóstico o terapéutico dirigido a células cancerosas que comprende un componente de anticuerpo que comprende un mAb anti-EGP-1 o un fragmento del mismo o una proteína de fusión de anticuerpo o fragmento de la misma que se une a la célula cancerosa, en donde el componente de anticuerpo se une a por lo menos un agente de diagnóstico o por lo menos a un agente terapéutico. Preferiblemente, el conjugado de diagnóstico comprende por lo menos un agente de diagnóstico fotoactivo o un agente de contraste de MRI. Aún preferido, el agente de diagnóstico es un marcador radiactivo con una energía entre 60 y 4.000 keV.

De acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones, las composiciones para el tratamiento pueden contener por lo menos un anticuerpo de RS7 humanizado, quimérico o humano desnudo o conjugado en combinación con el anticuerpo humanizado conjugado. La presente invención como se define en las reivindicaciones también contempla la administración del anticuerpo conjugado con un agente terapéutico como un inmunomodulador, o un agente de diagnóstico que no está conjugado con el anticuerpo anti-EGP-1. Los anticuerpos desnudos o conjugados contra el mismo epítopo o antígeno o uno diferente también pueden combinarse con uno o más de los anticuerpos de la presente divulgación.

Por consiguiente, la presente invención contempla la administración de anticuerpos anti-EGP-1 y fragmentos de los mismos solos, como un anticuerpo desnudo o fragmento de anticuerpo, o administrado como una terapia multimodal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de RS7 humanizado, quimérico o completamente humano o fragmento del mismo. Las terapias multimodales de la presente invención como se define en las reivindicaciones incluyen además inmunoterapia con un anticuerpo anti-EGP-1 desnudo suplementado con la administración del inmunoconjugado de la invención como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, un anticuerpo de RS7 humanizado, quimérico o completamente humano puede combinarse con otro RS7 quimérico, humanizado desnudo u otro anticuerpo, o un RS7 quimérico humanizado u otro anticuerpo conjugarse con un isótopo, uno o más agentes quimioterapéuticos, citoquinas, toxinas o una combinación de los mismos. Por ejemplo, la presente divulgación contempla el tratamiento de un anticuerpo EGP-1 o RS7 desnudo o conjugado o fragmentos del mismo antes, en combinación con, o después de otros anticuerpos asociados a tumores/carcinomas sólidos como anticuerpos anti-EGP-2, CEA, CSAp, ^m U^c 1-4, EGFR, HER2/neu, PSA, CC49 (anticuerpo anti-Tag 72) y PSMA. También puede usarse en esta divulgación una proteína de fusión de un anticuerpo de RS7 humanizado, quimérico o completamente humano y una toxina. Pueden construirse muchas combinaciones de anticuerpos diferentes, ya sea como anticuerpos desnudos o como parcialmente desnudos y parcialmente conjugados con un agente terapéutico o inmunomodulador. Alternativamente, pueden emplearse diferentes combinaciones de anticuerpos desnudos para la administración en combinación con otros agentes terapéuticos, como un fármaco citotóxico o con radiación. También pueden elaborarse combinaciones de tales anticuerpos, ventajosamente, con oligonucleótidos antisentido, como se conoce en la técnica. Como tales, los conjugados terapéuticos pueden comprender un oligonucleótido, especialmente un oligonucleótido antisentido que preferiblemente se dirigen contra oncogenes y productos oncogénicos de enfermedades malignas de células B. Por ejemplo, las moléculas antisentido que inhiben la expresión de bcl-2 que se describe en la U.S. 5.734.033 (Reed), también pueden conjugarse o formar la porción de agente terapéutico de una proteína de fusión de anticuerpos o administrarse con un anticuerpo de RS7 humanizado de la presente divulgación.

Las proteínas de unión monoespecíficas descritas en la presente que están enlazadas a agentes de diagnóstico o terapéuticos se dirigen directamente a los tumores positivos para RS7. Las moléculas monoespecíficas se unen selectivamente a antígenos objetivo y, a medida que aumenta el número de sitios de unión en la molécula, aumenta la afinidad por la célula objetivo y se observa un tiempo de residencia más largo en la localización deseada. Además, las moléculas no unidas al antígeno se eliminan del cuerpo rápidamente y se minimiza la exposición de los tejidos normales. Un uso de proteínas de unión multiespecíficas es el pre-direccionamiento de tumores positivos para RS7 para la administración específica posterior de agentes de diagnóstico o terapéuticos. Los agentes son transportados por péptidos que contienen histamina succinil glicil (HSG). El anticuerpo monoclonal murino designado 679 (un IgG1, K) se une con alta afinidad a moléculas que contienen la fracción de tripéptido, HSG (Morel et al, Molecular immunology, 27, 995-1000, 1990). 679 MAb puede formar una proteína de unión biespecífica con hRS7 que se une con HSG y el antígeno objetivo. También pueden utilizarse haptenos alternativos. Estas proteínas de unión se unen selectivamente a antígenos dirigidos, permitiendo una afinidad aumetada y un tiempo de residencia más prolongado en la localización deseada. Además, los diacuerpos no unidos a antígenos se eliminan del cuerpo rápidamente y se minimiza la exposición de los tejidos normales.

Los anticuerpos de RS7 y fragmentos de los mismos pueden usarse para tratar trastornos de mamíferos como el cáncer. El cáncer incluye, pero no se limita a, cánceres de pulmón, mama, vejiga, ovario, próstata y colon.

La administración de un agente de diagnóstico o terapéutico a un objetivo para diagnóstico o tratamiento de acuerdo con la invención incluye proporcionar el anticuerpo anti-EGP-1 o fragmentos del mismo con un agente de diagnóstico o terapéutico y administrar a un sujeto con necesidad de ello con la proteína de unión. El diagnóstico requiere además el paso de detectar las proteínas unidas con técnicas conocidas.

La administración del inmunoconjugado de la invención como se define en las reivindicaciones puede realizarse en un mamífero mediante inyección intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, perfusión a través de un catéter regional, o inyección intralesional directa. Cuando se administra la proteína de unión por inyección, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante bolos individuales o múltiples. Son factibles dosis en el intervalo de 20 a 800 mg/m2, preferiblemente con dosis entre 100 y 500 mg/m2, para terapia, y dosis proporcionalmente más bajas recomendadas para imagenología de diagnóstico, como de 0,5 mg a 100 mg/paciente. Dichas dosis pueden repetirse con diferentes frecuencias, dependiendo de la situación clínica y la tolerancia del paciente.

El anticuerpo con el agente de diagnóstico o terapéutico puede proporcionarse como un kit para uso terapéutico y diagnóstico en humanos o mamíferos en un vehículo de inyección farmacéuticamente aceptable, preferiblemente solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH y concentración fisiológicos. Preferiblemente, la preparación será estéril, especialmente si está destinada para su uso en humanos. Los componentes opcionales de tales kits incluyen estabilizadores, tampones, reactivos de marcado, radioisótopos, compuestos paramagnéticos, segundo anticuerpo para una depuración mejorada y jeringuillas, columnas, viales y similares convencionales.

Terapia de anticuerpos desnudos

Puede formularse una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y completamente humanos, desnudos o sus fragmentos, en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La eficacia de los anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y completamente humanos desnudos también puede mejorarse sulementando estos anticuerpos desnudos con uno o más de otros anticuerpos desnudos, con uno o más inmunoconjugados de anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados y completamente humanos conjugados con un agente terapéutico, como un fármaco, toxina, inmunomodulador, hormona, factor de crecimiento, enzima o radionúclidos terapéuticos, o con uno o más agentes terapéuticos, que incluyen un fármaco, toxina, inmunomodulador, hormona, factor de crecimiento, enzima, oligonucleótido o radionúclido terapéutico, administrado concurrente o secuencialmente o de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito, con los anticuerpos de RS7 o fragmentos de los mismos.

En un ejemplo, los anticuerpos de RS7 desnudos o conjugados de la presente invención se combinan con por lo menos un fármaco contra el cáncer. Dicha terapia de combinación puede mejorar el efecto del fármaco o reducir la dosis de fármaco que se necesita. Por ejemplo, se determinó el valor de IC50 para Dox-RS7 y 2P-Dox-RS7 en una línea celular de cáncer de pulmón, Calu3, y dos líneas celulares de cáncer de mama, MDA468 y T47D, respectivamente. Las células Calu3 y T47D son positivas para un antígeno EGP-1 y negativas para un antígeno CEA, y MDA468 es positiva para los antígenos tanto EGP-1 como CEA. Los resultados indican que el valor de IC50 para Dox-RS7 es 0.04 pg/ml y para 2P-Dox-RS7 es 0,023 pg/ml. Por lo tanto, la conjugación de un anticuerpo anti-EGP-1 humano, humanizado o quimérico desnudo o fragmento de la presente invención con un fármaco particular, como 2P-Dox, puede ayudar a superar la resistencia a múltiples fármacos. Esto también es posible cuando el anticuerpo se administra en combinación con un fármaco particular, como se describe.

Inmunoconjugados RS7

La presente invención como se define en las reivindicaciones también contempla el uso de anticuerpos de RS7 humanizados para terapia. El objetivo de la inmunoterapia es administrar dosis citotóxicas de radiactividad, toxina, citoquina, enzima; u hormona, o fármaco a las células objetivo, a la vez que se minimiza la exposición a tejidos no objetivo. Las proteínas de unión al antígeno de RS7 de la presente invención pueden usarse para tratar una variedad de tumores, como los de pulmón, mama, vejiga, ovario, útero, estómago y próstata.

Cualquiera de los anticuerpos o proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente divulgación puede conjugarse con uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico. Generalmente, se une un agente terapéutico o de diagnóstico a cada anticuerpo o fragmento de anticuerpo, pero puede unirse más de un agente terapéutico o agente de diagnóstico al mismo anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Si la región Fc está ausente (por ejemplo, cuando el anticuerpo usado como el componente de anticuerpo del inmunoconjugado es un fragmento de anticuerpo), es posible introducir una fracción de carbohidrato en la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo. Ver, por ejemplo, Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); Hansen et al., Patente de Estados Unidos N° 5.443.953 (1995), Leung et al., Patente de Estados Unidos N° 6.254.868. La fracción de carbohidrato modificado se usa para unir el agente terapéutico o de diagnóstico.

Los métodos para conjugar péptidos con componentes de anticuerpos a través de una fracción de carbohidrato de anticuerpo son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990); y Shih et al., Patente de Estados Unidos N° 5.057.313. El método general implica hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con un polímero portador que tiene por lo menos una función amina libre y que está cargado con una pluralidad de péptidos. Esta reacción da como resultado un enlace de base de Schiff inicial (imina), que puede estabilizarse mediante reducción con una amina secundaria para formar el conjugado final. Además, puede unirse al anticuerpo un quelante como DTPA (como Mx-DTPA), DOTA, TETA o NOTA.

Las proteínas de fusión de anticuerpos de la presente divulgación comprenden dos o más anticuerpos o fragmentos de los mismos y cada uno de los anticuerpos o fragmentos que componen esta proteína de fusión puede contener un agente terapéutico o de diagnóstico. Además, uno o más de los anticuerpos o fragmentos de la proteína de fusión de anticuerpos pueden tener unido más de un agente terapéutico o de diagnóstico. Además, no es necesario que los agentes terapéuticos sean los mismos, pero pueden ser agentes terapéuticos diferentes, por ejemplo, puede unirse un fármaco y un radioisótopo a la misma proteína de fusión. Particularmente, una IgG puede radiomarcarse con 131I y unirse a un fármaco. El 131I puede incorporarse en la tirosina de la IgG y el fármaco unirse al grupo amino épsilon de las lisinas de IgG. Tanto los agentes terapéuticos como los de diagnóstico también pueden unirse a grupos SH reducidos y a las cadenas laterales de carbohidratos.

De acuerdo con la invención como se define en las reivindicación, puede conjugarse ventajosamente una amplia variedad de reactivos terapéuticos con los anticuerpos. Los agentes terapéuticos enumerados aquí son aquellos agentes que también son útiles para la administración por separado con el anticuerpo desnudo como se ha descrito anteriormente. Los agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos como alcaloides de la vinca, antraciclinas, epidofilotoxina, taxanos, antimetabolitos, agentes alquilantes, antibióticos, urea sustituida, enzimas, inhibidores de Cox-2, antimitóticos, agentes antiangiogénicos y apoptotóicos, particularmente doxorrubicina, análogos de doxorrubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos y otros de estas y otras clases de agentes anticancerígenos, derivado de metilhidrazina, supresor adrenocortical, antagonista, endostatina, taxol y similares. Otros fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer útiles para la preparación de inmunoconjugados y proteínas de fusión de anticuerpos incluyen mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, hormonas, inhibidores de tirosina quinasa, como los que inhiben una tirosina quinasa receptora de EGF, una tirosina quinasa BCR ABL o una tirosina quinasa receptora de VEGF, y similares. Los agentes quimioterapéuticos adecuados se describen en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y en GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7a Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985), así como ediciones revisadas de estas publicaciones. Los expertos en la técnica conocen otros agentes quimioterapéuticos adecuados, como fármacos experimentales.

Una toxina, como la exotoxina de Pseudomonas, también puede formar un complejo o formar la porción de agente terapéutico de un inmunoconjugado de los anticuerpos de RS7 y hRS7 de la presente invención. Otras toxinas adecuadamente empleadas en la preparación de tales conjugados u otras proteínas de fusión, incluyen ricina, abrina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antiviral de fitolaca, gelonina, toxina difterina, exotoxina de Pseudomonas, y endotoxina de Pseudomonas. Ver, por ejemplo, Pastan et al., Cell 47: 641 (1986) y Goldenberg, CA-A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Las toxinas adicionales adecuadas para su uso en la presente invención son conocidas por los expertos en la técnica y se divulgan en la Patente de Estados Unidos 6.077.499.

Un inmunomodulador, como una citoquina, también puede conjugarse con, o formar la porción de agente terapéutico del inmunoconjugado EGP-1, RS7 y hRS7, o administrarse sin conjugar a los anticuerpos de RS7 quiméricos, humanizados o humanos o fragmentos de los mismos de la presente invención. Como se usa en la presente, el término "inmunomodulador" incluye citoquinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, como el factor de necrosis tumoral (TNF), y factores hematopoyéticos, como las interleucinas (por ejemplo, Interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, lL-10, IL-12, IL-18 e IL-21), factores estimulantes de colonias (por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)), interferones (por ejemplo, interferones-a, -p y -^y), el factor de crecimiento de células madre designado "factor S1", eritropoyetina y trombopoyetina, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de fracciones de inmunomoduladores adecuados incluyen IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, interferón-Y, TNF-a y similares. Alternativamente, los sujetos pueden recibir anticuerpos EGP-1 o RS7 desnudos y una citoquina administrada por separado, que puede administrarse antes, concurrentemente o después de la administración de los anticuerpos de RS7 desnudos. El anticuerpo de RS7 también puede conjugarse con el inmunomodulador. El inmunomodulador también puede conjugarse con un anticuerpo híbrido que consiste de uno o más anticuerpos que se unen a diferentes antígenos.

Puede unirse un agente terapéutico o de diagnóstico en la región bisagra de un componente de anticuerpo reducido mediante la formación de un enlace disulfuro. Como alternativa, tales péptidos pueden unirse al componente de anticuerpo usando un reticulante heterobifuncional, como 3-(2-piridilditio) propionato de W-succinilo (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994). Las técnicas generales para tal conjugación son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al, " Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in MOⁿO^c LONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995). Alternativamente, el agente terapéutico o de diagnóstico puede conjugarse mediante una fracción de carbohidrato en la región Fc del anticuerpo. El grupo carbohidrato puede usarse para aumentar la carga del mismo péptido que está unido a un grupo tiol, o la fracción de carbohidrato puede usarse para unirse a un péptido diferente.

Además, un anticuerpo radiomarcado, inmunoconjugado, o fragmentos del mismo pueden comprender un radioisótopo emisor de y o un emisor de positrones útil para imagenología de diagnóstico. Los radioisótopos adecuados, particularmente en el intervalo de energía de 25 a 4.000 keV, incluyen 131I, 123I, 124I, 86Y,, 62Cu, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94mTc, 18F, 11C, 13N, 15O, 75Br, y similares. Ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos titulada "Labeling Targeting Agents with Gallium-68"- Inventors G.L.Griffiths y W.J. McBride, (Solicitud provisional de Estados Unidos N° 60/342.104), que divulga emisores de positrones, como 18F, 68Ga, 94mTc y similares, con propósitos de imagenología. Preferiblemente, el intervalo de energía para los radionúclidos de diagnóstico y terapéuticos es de 25-4.000 keV. Otros radionucleidos útiles incluyen 90Y, 111In, 125I, 3H, 35S, 14C, 186Re, 188Re, 189Re, 177Lu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 211At, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 94mT c, 121mTc, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 111Ag, 197Pt, 109Pd, 32P, 33P, 47Sc, 153Sm, 177Lu, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe; 8F, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 86Y, 169Yb, 166Dy, 212Pb, y 223Ra.

Por ejemplo, el 67Cu, considerado uno de los radioisótopos más prometedores para la radioinmunoterapia debido a su vida media de 61,5 horas y su abundante suministro de partículas beta y rayos gamma, puede conjugarse con una proteína de unión al antígeno de RS7 usando el agente quelante, ácido p-bromoacetamido.-bencil-tetraetilaminotraacético (TETA). Chase, supra. Alternativamente, el 90Y, que emite una partícula beta energética, puede acoplarse a una proteína de unión al antígeno de RS7 usando ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Además, un método para el radiomarcado directo del MAb de RS7 con 131I se describe en Stein et al. (1991), supra, y la patente de Govindan et al., WO 9911294A1 titulada "Stable Radioiodine Conjugates and Methods for Their Synthesis”.

Los anticuerpos de RS7 o fragmentos de los mismos de la presente divulgación que tienen un portador cargado de sumando de boro para la terapia de activación de neutrones térmicos normalmente se realizarán de maneras similares. Sin embargo, será ventajoso esperar hasta que el inmunoconjugado RS7 no dirigido se elimine antes de realizar la irradiación de neutrones. La depuración puede acelerarse usando un anticuerpo que se une al anticuerpo de RS7. Ver Patente de Estados Unidos N° 4.624.846 para una descripción de este principio general. Por ejemplo, los sumandos de boro, como los carboranos, pueden unirse a los anticuerpos de RS7. Los carboranos pueden prepararse con funciones carboxilo en cadenas laterales colgantes, como es bien conocido en la técnica. La unión de carboranos a un portador, como el aminodextrano, puede lograrse mediante la activación de los grupos carboxilo de los carboranos y la condensación con aminas sobre el portador. Luego, el conjugado intermedio se conjuga con el anticuerpo de RS7. Después de la administración del conjugado de anticuerpo de RS7, un sumando de boro se activa mediante irradiación de neutrones térmicos y se convierte en átomos radiactivos que se descomponen por emisión a para producir efectos de corto alcance altamente tóxicos.

Además, la presente divulgación incluye métodos para diagnosticar cáncer en un sujeto. El diagnóstico puede lograrse administrando una cantidad diagnósticamente eficaz de un conjugado de diagnóstico, formulado en un excipiente farmacéuticamente adecuado, y detectando dicho marcador. Por ejemplo, pueden usarse agentes radiactivos y no radiactivos como agentes de diagnóstico. Un agente de diagnóstico no radiactivo adecuado es un agente de contraste adecuado para imagenología por resonancia magnética, tomografía computarizada o ultrasonidos. Los agentes de imagenología magnética incluyen, por ejemplo, metales no radiactivos, como manganeso, hierro y gadolinio, complejados con combinaciones de metal-quelato que incluyen 2-bencil-DTPA y sus análogos de monometilo y ciclohexilo, cuando se usan junto con los anticuerpos de la invención. Ver N° de serie de Estados Unidos 09/921.290 presentada el 10 de octubre de 2001.

Por consiguiente, se describe un método para diagnosticar una enfermedad maligna en un sujeto, que comprende (i) realizar un ensayo de diagnóstico in vitro en un espécimen del sujeto con una composición que comprende un MAb anti-EGP-1 desnudo o un fragmento del mismo o una proteína de fusión de anticuerpos desnudos o fragmento de la misma. Por ejemplo, pueden usarse métodos de diagnóstico in vitro por RT-PCR e inmunoensayo para detectar la presencia de cantidades minúsculas de EGP-1 en tejidos, sangre y otros fluidos corporales como un método útil de diagnóstico/detección. Puede usarse inmunohistoquímica para detectar la presencia de EGP-1 en una célula o tejido. Preferiblemente, la enfermedad maligna que se está diagnosticando es un cáncer. Lo más preferible, el cáncer se selecciona del grupo de pulmón, próstata, ovario, mama, colon y vejiga.

Además, puede conjugarse un quelante como DTPA, DOTA, TETA o NOTA o un péptido adecuado, al que un marcador detectable, como una molécula fluorescente, o un agente citotóxico, como un metal pesado o un radionúclido. Por ejemplo, puede obtenerse un inmunoconjugado terapéuticamente útil conjugando un agente fotoactivo o un colorante con una proteína de fusión de anticuerpos. Se han usado composiciones fluorescentes, como fluorocromo y otros cromógenos, o colorantes, como porfirinas sensibles a la luz visible, para detectar y tratar lesiones dirigiendo la luz adecuada a la lesión. En terapia, esto se ha denominado fotoradiación, fototerapia o terapia fotodinámica (Jori et al. (Eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986)). Además, los anticuerpos monoclonales se han acoplado con colorantes fotoactivados para lograr la fototerapia. Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983); idem., Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986); idem., Photochem. Photobiol.

46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991). Sin embargo, estos estudios anteriores no incluyeron el uso de aplicaciones de terapia endoscópica, especialmente con el uso de fragmentos o subfragmentos de anticuerpos. Por tanto, la presente invención contempla el uso terapéutico de inmunoconjugados que comprenden agentes fotoactivos o colorantes.

También se contemplan en la presente invención agentes de contraste como un agente de contraste para MRI, un ion paramagnético y un agente potenciador de ultrasonidos. Por ejemplo, los iones de gadolinio, los iones de lantano, los iones de manganeso u otros marcadores comparables, agentes de contraste de TC y agentes de contraste de ultrasonidos son adecuados para su uso en la presente invención. En una realización preferida, el agente potenciador de ultrasonidos es un liposoma que comprende una IgG de RS7 humanizada o un fragmento de la misma. También se prefiere que el liposoma esté lleno de gas.

Para propósitos terapéuticos, los anticuerpos de RS7 y fragmentos de los mismos de la presente divulgación se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que un anticuerpo se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor.

Diagnóstico in vitro

La presente divulgación contempla el uso de anticuerpos de RS7, incluyendo anticuerpos de RS7 y hRS7 y fragmentos de los mismos, para cribar muestras biológicas in vitro para determinar la presencia del antígeno de RS7. En tales inmunoensayos, el anticuerpo de RS7 puede utilizarse en fase líquida o unirse a un portador en fase sólida, como se describe a continuación. Además, ver Stein et al. (1993), supra, y Stein et al., Cancer Res. 49: 32 (1989).

Un ejemplo de un método de cribado para determinar si una muestra biológica contiene el antígeno de RS7 es el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo, en una forma de RIA, la sustancia bajo prueba se mezcla con MAb de antígeno de RS7 en presencia de antígeno de RS7 radiomarcado. En este método, la concentración de la sustancia de ensayo será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de RS7 marcado unido al MAb y directamente relacionada con la cantidad de antígeno de RS7 marcado libre. Otros métodos de cribado adecuados serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

Alternativamente, pueden realizarse ensayos in vitro en los que una proteína de unión al antígeno de RS7 se une a un portador en fase sólida. Por ejemplo, los MAb pueden unirse a un polímero, como el aminodextrano, para enlazar el MAb a un soporte insoluble como una perla, una placa o un tubo recubiertos de polímero.

Otros ensayos in vitro adecuados resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Las concentraciones específicas de la proteína de unión al antígeno de RS7 detectablemente marcada y el antígeno de RS7, la temperatura y el tiempo de incubación, así como otras condiciones del ensayo pueden variarse, dependiendo de varios factores, que incluyen la concentración del antígeno de RS7 en la muestra, la naturaleza de la muestra y similares. La actividad de unión de una muestra de proteína de unión al antígeno de RS7 puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica podrán determinar las condiciones de ensayo óptimas y operativas para cada determinación empleando experimentación de rutina.

Pueden añadirse a los ensayos otros pasos como lavado, agitación, remover, filtrado y similares, según sea habitual o necesario para la situación particular.

La presencia del antígeno de RS7 en una muestra biológica puede determinarse usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En el ELISA competitivo directo, una preparación de antígeno puro o semipuro se une a un soporte sólido que es insoluble en el fluido o extracto celular que se está probando y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado detectablemente para permitir la detección y/o cuantificación del complejo binario formado entre el antígeno en fase sólida y el anticuerpo marcado.

Por el contrario, un ELISA de "doble determinante", también conocido como "ELISA de dos sitios" o "ensayo sándwich", requiere pequeñas cantidades de antígeno y el ensayo no requiere una purificación extensa del antígeno. Por tanto, se prefiere el ELISA de doble determinante al ELISA competitivo directo para la detección de un antígeno en una muestra clínica. Ver, por ejemplo, el uso del ELISA de doble determinante para la cuantificación de la oncoproteína c-myc en muestras de biopsia. Field et al., Oncogene 4: 1463 (1989); Spandidos et al., AntiCancer Res. 9: 821 (1989).

En un ELISA de doble determinante, una cantidad de MAb o fragmento de anticuerpo no marcado (el "anticuerpo de captura") se une a un soporte sólido, la muestra de prueba se pone en contacto con el anticuerpo de captura y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado detectablemente (o fragmento de anticuerpo) para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo de captura, el antígeno y el anticuerpo marcado. Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo como F(ab')², F(ab)², Fab', Fab y similares. En el presente contexto, un fragmento de anticuerpo es una porción de un MAb de RS7 que se une a un epítopo del antígeno de RS7. El término "fragmento de anticuerpo" también incluye cualquier proteína sintética o modificada genéticamente que actúa como un anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten de la región variable de la cadena ligera, fragmentos "Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas polipeptídicas recombinantes de cadena sencilla en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico. Una proteína de fusión de anticuerpos es una composición de anticuerpos poliespecífica que comprende por lo menos dos anticuerpos sustancialmente monoespecíficos o fragmentos de anticuerpos, en donde por lo menos dos de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se unen a diferentes epítopos del antígeno de RS7. Una proteína de fusión de RS7 también incluye un conjugado de una proteína de fusión de anticuerpo con un agente de diagnóstico o terapéutico. El término anticuerpo de RS7 incluye anticuerpos humanizados, quiméricos, humanos y murinos, fragmentos de anticuerpos de los mismos, inmunoconjugados y fragmentos de los mismos y proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de las mismas.

Los métodos para realizar un ELISA de doble determinante son bien conocidos. Ver, por ejemplo, Field et al., Supra, Spandidos et al., Supra, y Moore et al., Twin-Site ELISAs for fos and myc Oncoproteins Using the AMPAK System," en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, páginas 273-281 (The Humana Press, Inc. 1992). Por ejemplo, en un método para la detección del antígeno de RS7 usando el ELISA de doble determinante, el tejido finamente picado de una muestra de biopsia se liofiliza y se vuelve a suspender en tampón de lisis (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4) que contiene 1% de nonidet-p40 (NP40), 0,6 pl/ml de aprotinina, 0,2 mM de fluoruro de fenil metil sulfonilo, 0,1 pg/ml de leupeptina y 1 mM de EDTA a una concentración de 10-20 mg de tejido (peso húmedo) por 500 pl de solución. La suspensión se incuba durante 60 minutos en hielo y luego se somete a sonicación durante aproximadamente seis intervalos de 10 segundos. El material insoluble se elimina por centrifugación.

El extracto soluble se añade a los pocillos de la placa de microtitulación que contienen un MAb de antígeno de RS7 adsorbido como anticuerpo de captura. El antígeno de RS7 capturado es luego reconocido por un segundo MAb de antígeno de RS7, que se ha acoplado con fosfatasa alcalina. La cantidad de fosfatasa alcalina unida, proporcional a la cantidad de antígeno de RS7 en el extracto, se detecta colorimétricamente usando un sustrato cromogénico, como p-nitrofenilfosfato.

Alternativamente, puede realizarse un ELISA de doble determinante para el antígeno de RS7 usando peroxidasa de rábano picante. Los expertos en la técnica pueden idear otras variaciones de preparación de muestras y el ELISA de doble determinante con experimentación rutinaria.

En el ELISA de doble determinante, el anticuerpo soluble o el fragmento de anticuerpo debe unirse a un epítopo de RS7 que sea distinto del epítopo reconocido por el anticuerpo de captura. Por ejemplo, el anticuerpo soluble puede ser el MAb de RS7, mientras que el anticuerpo de captura puede ser MR23. Alternativamente, el anticuerpo soluble puede ser MR23, mientras que el anticuerpo de captura puede ser el MAb de RS7.

Puede realizarse ELISA de doble determinante para determinar si el antígeno de RS7 está presente en una muestra de biopsia. Alternativamente, el ensayo puede realizarse para cuantificar la cantidad de antígeno de RS7 que está presente en una muestra clínica de fluido corporal. El ensayo cuantitativo puede realizarse incluyendo diluciones de antígeno de RS7 purificado. A continuación se ilustra un método para purificar el antígeno de RS7.

Los MAb de RS7 y fragmentos de los mismos de la presente divulgación también son adecuados para la preparación de un kit de ensayo. Tal kit puede comprender un medio portador que está compartimentado para recibir en confinamiento estrecho uno o más medios de recipiente como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de dichos medios de recipiente los elementos separados del inmunoensayo.

Por ejemplo, puede haber un medio de recipiente que contenga el anticuerpo de captura inmovilizado sobre un soporte en fase sólida, y un medio de recipiente adicional que contenga anticuerpos marcados detectablemente en solución. Medios de recipiente adicionales pueden contener soluciones estándar que comprenden diluciones en serie de antígeno de RS7. Las soluciones estándar de antígeno de RS7 pueden usarse para preparar una curva estándar con la concentración de antígeno de RS7 representada en abscisas y la señal de detección en ordenadas. Los resultados obtenidos de una muestra que contiene antígeno de RS7 pueden interpolarse de tal gráfico para dar la concentración de antígeno de RS7 en la muestra biológica.

Los anticuerpos de RS7 y sus fragmentos de la presente divulgación también pueden usarse para detectar la presencia del antígeno de RS7 en secciones de tejido preparadas a partir de una muestra histológica. Tal detección in situ puede usarse para determinar la presencia del antígeno de RS7 y para determinar la distribución del antígeno de RS7 en el tejido examinado. La detección in situ puede lograrse aplicando una proteína de unión al antígeno de RS7 marcada de manera detectable a secciones de tejido congeladas. Los estudios indican que el antígeno de RS7 no se conserva en secciones incrustadas en parafina. Stein et al. (1993), supra. Las técnicas generales de detección in situ son bien conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Ponder "Cell Marking Techniques and Their Application", en MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk (ed.) (IRL Press 1987), y Coligan en las páginas 5.8.1-5.8.8. También, ver Stein et al. (1989), supra, y Stein et al. (1993), supra.

Los anticuerpos de RS7 y sus fragmentos pueden marcarse de manera detectable con cualquier agente de detección apropiado, por ejemplo, un radioisótopo, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador bioluminiscente o un marcador paramagnético. Los métodos para elaborar y detectar tales proteínas de unión al antígeno de RS7 marcadas de manera detectable son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen con más detalle a continuación.

La fracción marcadora puede ser un radioisótopo que se detecta mediante el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía. En una realización preferida, el conjugado de diagnóstico es un isótopo emisor de gamma, beta o positrones. Una fracción marcadora en la presente descripción se refiere a una molécula que generará una señal en condiciones predeterminadas. Los ejemplos de fracciones marcadoras incluyen radioisótopos, enzimas, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes y marcadores paramagnéticos. Como se usa en la presente, un agente de diagnóstico o terapéutico es una molécula o átomo que se conjuga con una fracción de anticuerpo para producir un conjugado que es útil para diagnóstico y para terapia. Los ejemplos de agentes de diagnóstico o terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, quelantes, colorantes, cromógenos, compuestos de boro y fracciones marcadoras. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son 3H, 131I, 35S, 14C, y preferiblemente 125I. Ejemplos de otros radionucleidos son, por ejemplo, 90Y, 111In, 99mTc, 186Re, 188Re, 177Lu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, y 211At. También se encuentran disponibles radionucleidos adicionales como agentes de diagnóstico y terapéuticos. Los isótopos de imagenología de diagnóstico adecuados están habitualmente en el intervalo de 25 a 4.000 keV, mientras que los radionucleidos terapéuticos adecuados suelen estar en el intervalo de 60 a 700 keV.

Los anticuerpos de RS7 usados de acuerdo con la presente invención como se define en las reivindicaciones también pueden marcarse con un compuesto fluorescente. La presencia de un MAb marcado con fluorescencia se determina exponiendo la proteína de unión al antígeno de RS7 a la luz de longitud de onda adecuada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcado fluorescentes incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. Las proteínas de unión al antígeno de RS7 marcadas con fluorescencia son particularmente útiles para análisis de citometría de flujo.

Alternativamente, los anticuerpos de RS7 y sus fragmentos pueden marcarse de manera detectable acoplando la proteína de unión al antígeno de RS7 a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del MAb marcado con quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que se genera durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcado quimioluminiscentes incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.

De manera similar, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar anticuerpos de RS7 y fragmentos de los mismos de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para marcado incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Alternativamente, los anticuerpos de RS7 y fragmentos de los mismos se pueden marcar de manera detectable enlazando el anticuerpo de RS7 a una enzima. Cuando el conjugado anticuerpo de RS7-enzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, la fracción de enzima reacciona con el sustrato para producir una fracción química que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Ejemplos de enzimas que pueden usarse para marcar de manera detectable el anticuerpo de RS7 incluyen malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, aglicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa.

Los anticuerpos de RS7, las proteínas de fusión, y fragmentos de los mismos también pueden marcarse con iones paramagnéticos con propósitos de diagnóstico in vivo. Los agentes de contraste que son particularmente útiles para la imagenología por resonancia magnética comprenden iones de Gd, Mn, Dy o Fe. Los anticuerpos de RS7 y fragmentos de los mismos también pueden conjugarse con agentes de contraste/potenciadores de ultrasonidos. Por ejemplo, el agente de contraste de ultrasonidos es un liposoma que comprende una IgG de RS7 humanizada o un fragmento de la misma. También se prefiere, el agente de contraste de ultrasonidos es un liposoma que está lleno de gas.

En una línea relacionada, un anticuerpo biespecífico puede conjugarse con un agente de contraste. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede comprender más de un agente de mejora de la imagen para su uso en la imagenología por ultrasonidos. En un ejemplo, el agente de contraste es un liposoma. Preferiblemente, el liposoma comprende un péptido DTPA bivalente unido covalentemente a la superficie exterior del liposoma. Aún más preferido, el liposoma está lleno de gas.

Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. La unión de fracciones de marcadores a anticuerpos de RS7 puede lograrse usando técnicas estándar conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977), Shih et al., Int'l J Cancer 46: 1101 (1990), Stein et al. (1990), supra y Stein et al. (1993), supra. También, ver en general, Coligan.

Los métodos de detección in vitro e in situ descritos anteriormente pueden usarse para ayudar en el diagnóstico o estadificación de una condición patológica. Por ejemplo, tales métodos pueden usarse para detectar tumores que expresan el antígeno de RS7, incluyendo tumores de pulmón, mama, vejiga, ovario, útero, estómago y próstata.

Diagnóstico in vivo

La presente divulgación también contempla el uso de anticuerpos de RS7 para diagnóstico in vivo. El método de imagenología de diagnóstico con MAb radiomarcados es bien conocido. En la técnica de inmunoescintografía, por ejemplo, los anticuerpos se marcan con un radioisótopo emisor de rayos gamma y se introducen en un paciente. Se usa una cámara gamma para detectar la localización y distribución de los radioisótopos emisores de rayos gamma. Ver, por ejemplo, Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING A^nd THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición, Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), y Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," en BIOTECh No LOg Y AND PHAr Ma CY 227-49, Pezzuto et al (eds.) (Chapman & Hall 1993).

Para la imagenología de diagnóstico, los radioisótopos pueden unirse al anticuerpo de RS7 ya sea directa o indirectamente usando un grupo funcional intermediario. Los grupos funcionales intermedios útiles incluyen quelantes como ácido etilendiaminotetraacético y ácido dietilentriaminopentaacético. Por ejemplo, ver Shih et al., Supra, y la Patente de Estados Unidos N° 5.057.313.

La dosis de radiación administrada al paciente se mantiene al nivel más bajo posible mediante la elección del isótopo para la mejor combinación de vida media mínima, retención mínima en el cuerpo y cantidad mínima de isótopo que permitirá la detección y medición precisa. Los ejemplos de radioisótopos que pueden unirse al anticuerpo de RS7 y son apropiados para la imagenología de diagnóstico incluyen 99mTc y 111In.

Excipiente farmacéuticamente adecuado.

Pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción de un anticuerpo de RS7 en una aplicación terapéutica. Pueden prepararse preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para formar complejos o adsorber el anticuerpo de RS7. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de poli(acetato de etileno-co-vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebácico. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). La tasa de liberación de un anticuerpo de RS7 de dicha matriz depende del peso molecular del anticuerpo de RS7, la cantidad de anticuerpo de RS7 dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersas. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., Supra. Otras formas de dosificación sólidas se describen en REMⁱN^g TON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a ed. (1990).

Los anticuerpos de RS7 humanizados, quiméricos y humanos que se administrarán a un sujeto pueden consistir del anticuerpo solo, inmunoconjugado, proteína de fusión o pueden comprender uno o más excipientes farmacéuticamente adecuados, uno o más ingredientes adicionales o alguna combinación de estos.

El inmunoconjugado de la presente invención como se define en las reivindicaciones puede formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que el inmunoconjugado o el anticuerpo desnudo se combina en una mezcla con un excipiente farmacéuticamente adecuado. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un excipiente farmacéuticamente adecuado. Otros excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a Edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición (Mack Publishing Company 1990), y ediciones revisadas de los mismos.

El inmunoconjugado de la presente invención como se define en las reivindicaciones puede formularse para administración intravenosa mediante, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituirlo con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes del uso.

Pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción del conjugado terapéutico o del anticuerpo desnudo. Pueden prepararse preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para formar complejos o adsorber el inmunoconjugado o el anticuerpo desnudo. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de poli(acetato de etileno-co-vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebácico. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). La tasa de liberación de un inmunoconjugado o anticuerpo de dicha matriz depende del peso molecular del inmunoconjugado o anticuerpo, la cantidad de inmunoconjugado, el anticuerpo dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersas. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Otras formas de dosificación sólidas se describen en Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a Edición (Lea & Febiger 1990), yGennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición (Mack Publishing Company 1990), y ediciones revisadas de los mismos.

El inmunoconjugado, la proteína de fusión de anticuerpos, el anticuerpo desnudo, y fragmentos de los mismos también pueden administrarse a un mamífero por vía subcutánea o incluso por otras vías parenterales. En una realización preferida, el anticuerpo anti-EGP-1 o fragmento del mismo se administra en una dosificación de 10 a 2000 miligramos de proteína por dosis. Además, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante bolos individuales o múltiples. En general, la dosificación de un inmunoconjugado, proteína de fusión o anticuerpo desnudo administrado para humanos variará dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado médico general y el historial médico previo del paciente. Típicamente, es deseable proporcionar al receptor una dosificación de inmunoconjugado, proteína de fusión de anticuerpos o anticuerpo desnudo que está en el intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a 20 mg/kg como una única infusión intravenosa, aunque también puede administrarse una dosis menor o mayor según lo dicten las circunstancias. Esta dosificación puede repetirse según sea necesario, por ejemplo, una vez a la semana durante 4-10 semanas, preferiblemente una vez a la semana durante 8 semanas, y más preferiblemente, una vez a la semana durante 4 semanas. También puede administrarse con menos frecuencia, como cada dos semanas durante varios meses. La dosificación puede administrarse a través de varias vías parenterales, con el ajuste apropiado de la dosis y el programa.

Los anticuerpos de RS7 de la presente invención como se define en las reivindicaciones pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que los anticuerpos de RS7 se combinan en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "portador farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un portador farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Ed. (1990).

Para propósitos de terapia, el inmunoconjugado, la proteína de fusión, o el anticuerpo desnudo se administra a un mamífero en una cantidad terapéuticamente eficaz. Un sujeto adecuado para la presente invención es habitualmente un humano, aunque también se contempla un sujeto animal no humano. Se dice que una preparación de anticuerpos se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un mamífero receptor.

Ejemplo 1. Construcción de un anticuerpo de RS7 quimérico

Clonación molecular de genes de RS7Vk y VH

Se preparó ARN y ARNm citoplasmático total a partir de células de hibridoma productoras de RS7. Los genes que codifican las secuencias de Vk y VH se clonaron mediante RT-PCR y 5'RACE y las secuencias se determinaron mediante secuenciación de ADN. Se secuenciaron múltiples clones independientes para eliminar posibles errores resultantes de la reacción de PCR. Los análisis de secuencia revelaron la presencia de dos transcripciones de Vk (N° 1 y N° 23) y una de VH (RS7VH). Combinando cada uno de los supuestos Vk murinos con la VH, se generaron dos Ab quiméricos (cAb) que contenían dominios de la región constante humana y se expresaron en células Sp2/0 mediante transfección. Los clones productores de cAb se identificaron cribando los sobrenadantes del cultivo celular de los clones de células transfectadas mediante ELISA. Los clones positivos se expandieron y los cAb se purificaron a partir de los sobrenadantes del cultivo celular. El ensayo de unión a Ag mostro que solo el cAb compuesto de Vk#23 y VH, cAb-VK#23, se unió a los micropocillos recubiertos con la fracción de membrana bruta de ME 180, una célula de carcinoma cervical humana (ATCC, Rockville, MD) (Figura 1). El cAb con la combinación de V^k#1 y VH, cAb-VK#1, no mostró unión a los pocillos recubiertos con Ag. Por lo tanto, el cAb inmunorreactivo (con Vk#23) se designó como cRS7. Las secuencias de V^h murina clonada y VK funcional (#23) como los productos finales de la PCR se designaron como RS7Vk (Figura 2A) y RS7VH (Figura 2B), respectivamente.

Ensayo de actividad de unión para Abs de RS7

Se usó un ensayo de unión ELISA competitivo para evaluar la afinidad de unión de cRS7 modificado. Brevemente, se mezcla una cantidad constante de RS7 murino biotinilado con concentraciones variables (0,01-100 pg/ml) de Abs de prueba (RS7 o cRS7), y se añade a micropocillos recubiertos con Ag y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añade estreptavidina conjugada con HRP y se incuba durante 1 h a temperatura ambiente. La cantidad de estreptavidina conjugada con ^h R^p unida al RS7 biotinilado unido a Ag se reveló mediante la lectura de OD⁴⁹⁰ después de la adición de una solución de sustrato que contenía 4 mM de clorhidrato de orto-fenilendiamina y 0,04% de H²O². Mediante este tipo de ensayo de unión a Ag competitivo, se reveló que cRS7 y RS7 murino competían igualmente bien por la unión de RS7 murino biotinilado a los pocilios recubiertos de antígeno, confirmando así la autenticidad de las secuencias de V^k y VH obtenidas (Fig. 1).

Ejemplo 2. Método de construcción del anticuerpo hRS7

Diseño de secuencia de genes V de hRS7

Al buscar las secuencias de V^k y VH humanas en la base de datos de Kabat, se descubrió que las FR de V^k y VH de RS7 muestran el grado más alto de homología de secuencia con la V^k de SA-1A'cl y la VH de RF-TS3 humanas, respectivamente. Una excepción es la FR4 de RS7VH, que mostró la homología de secuencia más alta con la de VH de NEWM. Por lo tanto, se usaron secuencias marco de SA-1A'CL humanas como andamiaje para injertar las CDR de RS7Vk (Figura 3A), y se usó una combinación de secuencias marco de RF-TS3 y NEWM para RS7V^h (Figura 4). Hay una serie de cambios de aminoácidos en cada cadena fuera de las regiones CDR en comparación con los marcos del anticuerpo humano de partida. Varios residuos de aminoácidos en las FR murinas que flanquean las CDR supuestas se mantuvieron en la Fv de hRS7 remodelada en base a las pautas establecidas con anterioridad Qu, Z., Losman, M.J., Eliassen, K.C., Hansen, H.J., Goldenberg, D.M. y Leung, S.O. (1999). Humanization of Immu31, an alpha-fetoprotein-specific antibody. Clin. Cancer Res. 5, 3095s-3100s. Estos residuos son S20, D60, V85 y A100 de RS7Vk y K38, K46, A78 y F91 de RS7VH (Figura 3A y 3B).

Construcción de secuencias Vde hRS7

Se usó una estrategia modificada como la descrita po Leung et al. Leung, S.O., Shevitz, J., Pellegrini, M.C., Dion, A.S., Shih, L.B., Goldenberg, D.M., y Hansen, H.J. (1994) Chimerization of LL2, a rapidly internalizing antibody specific for B cell lymphoma. Hybridoma, 13: 469-476) para construir los genes VL y VH designados para hRS7 usando una combinación de síntesis de oligonucleótidos largos y PCR como se ilustra en la Figura 4. Para la construcción del dominio VH de hRS7, se sintetizaron dos oligonucleótidos largos, hRS7VHA (176-mer) y hRS7VHB (168-mer) en un sintetizador de ADN automatizado (Applied Biosystem).

hRS7VHA representa nt 23 a 198 del dominio hRS7VH

5’-GGTCTGAGTT GAAGAAGCCT GGGGCCTCAG TGAAGGTTTC

CTGCAAGGCT TCTGGATACA CCTTCACAAA CTATGGAATG AACTGGGTGA

AGCAGGCCCC TGGACAAGGG CTTAAATGGA TGGGCTGGAT AAACACCTAC

ACTGGAGAGC CAACATATAC TGATGACTTC AAGGGA-3’

hRS7VHB representa la cadena negativa del dominio hRS7VH complementario a nt 174 a 340.

5’-ACCCTTGGCC CCAGACATCG AAGTACCAGT AGCTACTACC

GAACCCCCCT CTTGCACAGA AATACACGGC AGTGTCGTCA GCCTTTAGGC

TGCTGATCTG GAGATATGCC GTGCTGACAG AGGTGTCCAA GGAGAAGGCA

AACCGTCCCT TGAAGTCATC AGTATATG-3’

Las secuencias 3'-terminales (residuos de 23 nt) de hRS7VHA y B son complementarias entre sí. En condiciones de PCR definidas, los extremos 3' de hRS7VHA y B se aparean para formar un ADN de cadena doble corto flanqueado por el resto de los oligonucleótidos largos. Cada extremo apareado sirve como un cebador para la transcripción del ADN de cadena sencilla, lo que da como resultado un ADN de cadena doble compuesto por los nt 23 a 340 de hRS7VH. Este ADN se amplificó adicionalmente en presencia de dos oligonucleótidos cortos, hRS7VHBACK y hRS7VHFOR para formar la hRS7VH de longitud completa.

hRS7VHBACK S’-GTGGTGCTGC AGCAATCTGG GTCTGAGTTG AAGAAGCC-3’

hRS7VHFOR 5 ’-TGAGGAGACG GTGACCAGGG ACCCTTGGCC CCAGACAT-3’

Se amplificó la cantidad mínima de hRS7VHA y B (determinada empíricamente) en presencia de 10 pl de tampón de PCR 10x (KCl 500 mM, tampón Tris.HCL 100 mM, pH 8,3, MgCb 15 mM), 2 pmol de hRS7VHBACK y hRS7VHFOR, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct). Esta mezcla de reacción se sometió a 3 ciclos de reacción de PCR que consistieron en desnaturalización a 94° C durante 1 minuto, apareamiento a 45° C durante 1 minuto y polimerización a 72° C durante 1,5 minutos, seguido de 27 ciclos de reacción de PCR que consistían en de desnaturalización a 94° C durante 1 minuto, apareamiento a 55° C durante 1 minuto y polimerización a 72° C durante 1 minuto. El producto amplificado por PCR de cadena doble para hRS7VH se purificó en gel, se digirió por restricción con PstI y BstEII y se clonó en los sitios PstI/BstEII complementarios del vector de estadificación de cadena pesada, VHpBS2.

Para construir el ADN de longitud completa de la secuencia de V^k humanizada, se sintetizaron hRS7VKA (156-mer) y hRS7VKB (155-mer) como se ha descrito anteriormente. hRS7VKA y B se amplificaron mediante dos oligonucleótidos cortos hRS7VKBACK y hRS7VKFOR como se ha descrito anteriormente.

HRS7VKA representa entre 20 y 175 nt del dominio hRS7VK.

5’-CTCCATCCTC CCTGTCTGCA TCTGTAGGAG ACAGAGTCAG CATCACCTGC

AAGGCCAGTC AGGATGTGAG TATTGCTGTA GCCTGGTATC AGCAGAAACC

AGGGAAAGCC CCTAAGCTCC TGATCTACTC GGCATCCTAC CGGTACACTG

GAGTCC-3’

hRS7VKB representa la cadena negativa del dominio hRS7VK complementario a nt 155 a 320.

5’-CCTTGGTCCC AGCACCGAAC GTGAGCGGAG TAATATAATG

TTGCTGACAG TAATAAACTG CAAAATCTTC AGGTTGCAGA CTGCTGATGG

TGAGAGTGAA ATCTGTCCCA GATCCACTGC CACTGAACCT ATCAGGGACT

CCAGTGTACC GGTAG-3’

hRS7VKBACK 5’-GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTG-3’

hRS7VKFOR 5'-ACGTTAGATC TCCACCTTGG TCCCAGCACC G-3'

Los productos de PCR purificados en gel para hRS7VK se digirieron por restricción con PvuII y BglIII y se clonaron en los sitios PvuI/BcII complementarios del vector de estadificación de cadena ligera, VKpBR2. El vector de expresión final hRS7pdHL2 se construyó subclonando secuencialmente los fragmentos XbaI-BamHI y XhoI/BamHI de hRS7VK y VH, respectivamente, en pdHL2 como se ha descrito anteriormente.

Transfección y expresión de anticuerpos para hRS7

Se linealizaron aproximadamente 30 pg de los vectores de expresión para hRS7 mediante digestión con SalI y se transfectaron en células Sp2/0-Agl4 mediante electroporación (450 V y 25 pF). Las células transfectadas se colocaron en placas de 96 pocillos durante 2 días y luego se seleccionaron por su resistencia a fármacos añadiendo MTX al medio a una concentración final de 0,025 pM. Las colonias resistentes a MTX emergieron en los pocillos 2-3 semanas. Los sobrenadantes de las colonias que sobrevivieron a la selección se cribaron para la secreción de Ab humano mediante un ensayo ELISA. Brevemente, se añadieron 100 pl de sobrenadantes a los pocillos de una placa de microtitulación recubierta previamente con GAH-IgG, Ab específico de fragmento F(ab')² y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas no unidas se eliminaron lavando tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía polisorbato 20 al 0,05%). Se añadió a los pocillos Ab específico del fragmento Fc, GAH-IgG conjugado con HRP. Después de una incubación de 1 h, se lavó la placa. El Ab conjugado a HRP unido se reveló mediante la lectura de A490nm después de la adición de una solución de sustrato que contenía OPD 4 mM y 0,04% de H²O². Los clones celulares positivos se expandieron y la IgG de hRS7 se purificó del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad en una columna de Proteína A.

Actividad de unión del anticuerpo de RS7 humanizado

Se usó un ensayo de unión competitiva ELISA usando una placa recubierta con extracto de membrana celular ME180 para evaluar la inmunorreactividad de hRS7 como se describe (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938-946 (1993)). La fracción de membrana celular ME180 se preparó mediante sonicación y centrifugación. El extracto de membrana bruto se revistió en una placa de PVC de fondo plano de 96 pocillos mediante centrifugación y se fijó con glutaraldehído al 0,1%. Se añadió una cantidad constante de RS7 murino biotinilado mezclado con concentraciones variables de mRS7, cRS7 o hRS7 a los pocillos recubiertos de membrana y se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 h. Después del lavado, se añadió estreptavidina conjugada con HRP y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La cantidad de estreptavidina conjugada con HRP unida a la mRS7 biotinilada unida a la membrana se reveló mediante lectura de A^490nm después de la adición de una solución de sustrato que contenía 4 mM de clorhidrato de orto-fenilendiamina y 0,04% de H²O². Como se muestra en los ensayos de competencia en la Figura 6, la IgG de hRS7 mostró actividades de unión comparables con las de mRS7 y cRS7, lo que confirma que la afinidad de unión de RS7 se conservó en la humanización.

Ejemplo 3. Radioyodaciones de RS7 humanizado usando marcadores residualizantes

La fracción residualizante (IMP-R4, IMP-R5 o IMP-R8) se radioyodó y se acopló a hRS7 reducido con disulfuro siguiendo el procedimiento descrito en otra parte (Govindan SV, et al. Bioconjugate Chem. 1999;10:231-240). Ver Figura 9. Al residualizar marcados de yodo radiactivo usando 125I, para preparar 125I-IMP-Rx-hRS7 donde x = 4, 5 u 8), se obtuvieron rendimientos globales y las actividades específicas (entre paréntesis) del 87,1% (3,38 mCi/mg), 34,3% (0,97 mCi/mg) y 76,6% (2,93 mCi/mg) usando IMP-R4, IMP-R5 e iMp -R8, respectivamente. En marcados de 131I a gran escala usando la entidad 131I-IMP-R4, se obtuvieron los siguientes resultados. Usando 20,4 mCi de 131I, 35,7 nmol de IMP-R4 y 3,22 mg de hRS7 reducido con DTT, se obtuvo un rendimiento global del 60% (3,80 mCi/mg). Una serie diferente usando 30,3 mCi de 131I, IMP-R4 y hRS7 reducido produjo un rendimiento del 69,7% (3,88 mCi/mg). Una tercera serie con 13,97 mCi de 131I dio una incorporación del 71,8% (4,42 mCi/mg). Un marcado con 131I-IMP-R4 usando 13,6 mCi de 131I y un anticuerpo humanizado no específico, hLL2, dio como resultado un rendimiento del 64,4% (3,67 mCi/mg).

Ejemplo 4. Experimentos preclínicos en un modelo animal de cáncer de mama

Para estudios de direccionamiento tumoral, los tumores se propagaron en ratones desnudos hembra de 5-8 semanas de edad por inyección subcutánea de ~2,3 x 107 células MDA-MB-468 cultivadas, y se usaron los animales después de un mes cuando el tamaño del tumor alcanzó ~01-a-0,2 cm3. A los ratones se les inyectó iv una mezcla de ~10 pCi de 125I-[IMP-Rx]-hRS7 donde x = 4,5 u 8, y 20-25 pCi de 131I-MAb (método CT). Por tanto, cada experimento era un experimento de marcado emparejado con 125I/131I. En los momentos indicados, se determinaron las biodistribuciones en varios órganos y sangre, y se expresaron como % de dosis inyectada por gramo. Se hicieron correcciones por retrodispersión de 131I en ventana de 125I para determinar las biodistribuciones de 125I.

Para los estudios de terapia, se estudiaron los patrones de crecimiento tumoral en varios formatos para determinar el método óptimo para el crecimiento constante del tumor. Se llegó a la conclusión de que el método usado para los experimentos de direccionamiento era óptimo después de aproximadamente 8 semanas de crecimiento tumoral, y se podía usar del 30 al 50% de los animales en base a los perfiles de crecimiento tumoral. Para los estudios de terapia, a los animales portadores de tumores se les inyectó i.v. 131I-IMPR4-hRS7 fue el agente examinado, y se comparó con material radioyodado directamente, 131I-hRS7. Los pesos corporales de referencia se compararon con mediciones semanales de pesos corporales y volúmenes tumorales. Los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 3 cm3. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por IACUC.

Biodistribuciones animales in vivo

Estos experimentos se llevaron a cabo usando preparaciones de hRS7 de doble marcado (125I-IMP-RxhRS7 donde x = 4, 5 u 8, con cada agente mezclado con el marcador directo 131I-hRS7) en los tumores que crecieron en ratones desnudos NIH Swiss. Las Tablas 1A, 1B y 1C describen biodistribuciones detalladas que muestran el rendimiento superior usando los marcadores de residualización. Por ejemplo, el % de dosis inyectada por gramo de tumor el día 7 fue de 41,6 ± 3,0%, 32,2 ± 11,6% y 24,7 ± 8,5% para 125I-IMP-R4-hRS7, 125I-IMP-R5-hRS7 y 125I -IMP-R8-hRS7, respectivamente, mientras que para 131I-hRS7 marcado directamente en el mismo punto temporal en cada uno de los experimentos de marcado dual fueron de 5,9 ± 0,9%, 6,2 ± 2,1% y 6,7 ± 2,3%. Las proporciones de tumor a no tumor para el mismo punto temporal fueron de 1,7 a 7,6 veces más altas con 125I-IMP-R4-hRS7, de 1,7 a 6,0 veces más altas con 125I-IMP-R5-hRS7, y de 2,0 a 4,8 veces más altas con 125I-IMP-R8-hRS7 en comparación con las proporciones con 13 I-hRS7 (datos no mostrados).

Tabla 1. Biodistribuciones de RS7 humanizado, marcado dual con 125I-IMP-R (R4 o R5 o R8) y 131I-hRS7 (método CT) en ratones desnudos NIH Swiss portadores de xenoinjertos tumorales MDA-MB-468

T l 1A121-IMP-R4-hR fr n 111-hR T

T l -1B121-IMP-R-hR fr n 111-hR m T

T l -1 121-IMP-R -hR fr n 111-hR m T

Los cálculos de dosimetría, basados en biodistribuciones usando 125I en lugar de 131I, se realizaron usando el método de Siegel, JA y Stabin, MG (Journal of Nuclear Medicine 1994; 35: 152-156). La Tabla-2 compara conjuntos de marcadores de yodo radiactivo residualizante y convencional, y la Figura-10 describe los datos gráficamente. Se ve que todos los agentes residualizantes funcionan de manera óptima en términos de dosis administrada a las proporciones de tumor y tumor a no tumor; Se eligió 131I-IMP-R4-hRS7 para experimentos de terapia en vista de los rendimientos radioquímicos ventajosos y las actividades específicas que pueden obtenerse para el mismo agente.

Terapia de xenoinjertos de carcinoma de mama humano MDA-MB-468 en ratones desnudos

Dosis máxima tolerada (MTD): a partir de los datos de dosimetría (Tabla 2, grupo 1), las cantidades de mCi de 131I-IMP-R4-hRS7 y 131I-hRS7, que producen una dosis de radiación de 1500 cGy a la sangre (MTD estimada) se calcularon en 0,231 mCi y 0,285 mCi, respectivamente. La determinación experimental de MTD se llevó a cabo usando dosis crecientes de cada agente en ratones desnudos suizos. Para 131I-IMP-R4-hRS7, se administraron a los grupos de animales 200, 225, 250, 275, 300 y 325 pCi; 1 de cada cinco animales en el grupo de dosis de 250 pCi murió en la semana 4, mientras que 3 de cada 4 animales en el grupo de dosis de 300 pCi murieron entre las semanas 2 y 4. Aunque la supervivencia de los animales en los grupos de dosis de 275 y 325 pCi a las cinco semanas fue inesperado, llegamos a la conclusión de que la MTD estaba entre 231 pCi (calculada a partir de los datos de dosimetría) y 250 pCi de la dosis administrada. Para el 131I-hRS7 (radioyodación basada en 'CT'), se inyectaron a los grupos de animales 250, 280, 310, 340, 370 y 400 pCi; entre las semanas 2 y 3, murieron seis de los seis animales del grupo de dosis de 340 pCi, tres de los seis animales del grupo de dosis de 370 pCi y cuatro de los cuatro animales del grupo de dosis de 400 pCi. En base a esto, se proyectó que la MTD estaría en el intervalo de 280-310 pCi.

Estudio de terapia-1

Para este primer experimento de terapia, que compara la eficacia de 131I-IMPR-4-hRS7 con la de 131I-hRS7 (método CT), cada agente se usó a ~70% de su dosis máxima tolerada. Se considera que una dosis única de 175 pCi del agente residualizante es significativamente más eficaz que 200 pCi del agente de yodo radiactivo convencional. En este experimento, que también incluyó controles no tratados, se usaron 10 o 11 animales por grupo, y los tres grupos fueron aleatorizados de tal manera que la distribución de los tamaños de los tumores iniciales fue muy similar. Los volúmenes tumorales medios para los tres grupos antes de la terapia (día -2) fueron 0,312 ± 0,181, 0,308 ± 0,203 y 0,303 ± 0,212.

En este experimento, los datos provisionales hasta el día 49 se muestran en la Figura 11 a continuación. El panel superior en la Figura-11 muestra los volúmenes tumorales (cm3) para animales individuales en cada grupo, y el panel inferior indica los volúmenes tumorales medios en dos formatos. Hubo tres muertes en el grupo no tratado. El control del crecimiento tumoral es significativamente mejor para el grupo del marcador residualizante en comparación con el marcador convencional y los grupos no tratados, como se determinó por la prueba t de Student en el área bajo las curvas (AUC) para los volúmenes tumorales medios (MTV) hasta el día 49. El día 49, la significancia (valores de p) para las diferencias en el AUC de MTV debido a la terapia con 131I-IMP-R4-hRS7, con los valores p respectivos para las diferencias de volumen tumoral antes de la terapia (día -2) entre paréntesis, son las siguientes. Frente a no tratado: 0,05 (0,78); frente a 131I-hRS7 (CT): 0,03 (0,98); para 131I-hRS7 (CT) frente a no tratado: 0,14 (0,81). Hay una divergencia continua en los volúmenes tumorales medios entre los grupos de yodo radiactivo convencional y residualizante el día 49, el último grupo llevando a una disminución continuada. A las 8 semanas después de la terapia, se observaron remisiones completas en 5 de 11 ratones tratados con 131I-IMP-R4-hRS7, y la MTV fue del 20% del valor inicial. La MTV en los ratones no tratados y tratados con 131I-hRS7 a las 8 semanas fueron el 280% y el 163% de los valores iniciales respectivos, respectivamente, con 1 remisión completa de 11 ratones en el grupo de 131I-hRS7.

Los tratamientos fueron bien tolerados. El peso corporal medio del grupo de IMP-R4 el día -2 era de 21,93 ± 2,03 y el del día 49 era de 23,68 ± 1,81; para el grupo 'CT', los pesos corporales medios fueron 21,77 ± 2,21 y 23,90 ± 2,64 en los días -2 y 49, respectivamente. Las mielotoxicidades de los grupos tratados, determinadas por los recuentos de células sanguíneas, se muestran en la Figura-12. Brevemente: con 131I-IMP-R4-hRS7, se alcanzaron puntos más bajos del 34%, 7% y 61% de los niveles de control para los recuentos de WBC, linfocitos y neutrófilos, respectivamente, una semana después de la administración del agente. Para la semana 5, estos se recuperaron al 74%, 58% y 92% de los niveles de control, respectivamente, y permanecieron en el 45%, 36% y 51% de los niveles de control el día 49; y para 131I-hRS7 (CT): se alcanzaron puntos más bajos del 41%, 13% y 67% de los niveles de control para los recuentos de WBC, linfocitos y neutrófilos, respectivamente, una semana después de la administración del agente. Para la semana 5, estos se recuperaron al 85%, 67% y 103% de los niveles de control, respectivamente, y permanecieron en el 42%, 32% y 49% de los niveles de control el día 49.

Estudio de terapia-2

Especificidad de RAIT usando 131I-IMP-R4-hRS7 en el modelo de tumor MDA-MB-468

Se comparó la eficacia de 131I-IMP-R4-hRS7 con la del anticuerpo humanizado de control no específico, hLL2 (MAb anti-CD-22), marcado con 131I-IMP-R4. En este experimento, se administraron 175 pCi de cada agente. Esto representa ~70% de la dosis máxima tolerada de 131I-IMP-R4-hRS7. En este experimento, que incluía controles no tratados, se usaron 7-8 animales por grupo, y los grupos se asignaron aleatoriamente con respecto a las distribuciones del volumen tumoral inicial como en el experimento de terapia 1. La Figura 13, que muestra los volúmenes tumorales medios (MTV) relativos para los tres grupos (MTV antes de la terapia: 100), es indicativa de la especificidad del control del crecimiento.

Ejemplo 5. Tratamiento de una paciente con cáncer de mama con MAb de RS7 humanizado Y-90 y con MAb

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un inmunoconjugado que comprende (i) un anticuerpo humanizado que comprende las secuencias de CDR (región determinante de la complementariedad) de la cadena pesada de CDR1 (NYGMN); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV), y las secuencias de CDR de la cadena ligera de CDR1 (KASQDVSIAVA); CDR2 (SASYRYT); y CDR3 (QQHYITPLT) y secuencias de la región marco (FR) del anticuerpo humano, en donde las secuencias de FR comprenden residuos de aminoácidos murinos sustituidos que se encuentran en una localización correspondiente en los residuos de aminoácidos 38, 46, 68 y 91 de la región variable de la cadena pesada murina de la Fig..3B y el residuo de aminoácido 20, 60, 85 y 100 de la región variable de la cadena ligera murina de la Fig. 3A, en donde el anticuerpo humanizado está conjugado con (ii) un fármaco.

2. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fármaco posee la propiedad farmacéutica seleccionada del grupo que consiste de agentes antimitóticos, alquilantes, antimetabolitos, antiangiogénicos, apoptóticos, alquiloides y antibióticos.

3. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fármaco se selecciona del grupo que consiste de mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, complejos de coordinación de platino, alcaloides de vinca, ureas sustituidas, derivados de metilhidrazina, supresores adrenocorticales, antagonistas, endostatina, taxoles, derivados de camptotecina, y doxorrubicina.

4. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fármaco es un agente quimioterapéutico contra el cáncer.

5. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo humanizado comprende secuencias de la región constante de IgG1 del anticuerpo humanas.

6. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo humanizado se une al antígeno Trop-2 (EGP-1) humano.

7. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en el tratamiento del cáncer.

8. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 7, en donde el cáncer expresa el antígeno Trop-2.

9. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 7, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pulmón, mama, cabeza y cuello, ovario, próstata, vejiga, estómago y colon.

10. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 7, en donde el uso comprende además administrar un fármaco contra el cáncer.

11. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 7, en donde el uso comprende además administrar un inmunomodulador.

12. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 7, en donde el uso comprende además administrar un anticuerpo humanizado, quimérico o humano desnudo.

13. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 7, en donde el uso comprende además administrar un anticuerpo humanizado, quimérico o humano conjugado.

14. Una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.