KR101809758B1 - 신규 형광 염료 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 반딧불이 루시페린 구조를 기반으로 하는 형광 염료를 제공한다. 이러한 염료는 더 짧은 파장에서 최적으로 여기되고, 50 nm 이상의 스토크스 변화를 갖는다. 본 발명의 형광 염료는 샘플에서 분석물의 검출에 사용될 수 있는 염료-접합체의 제조에 유용하다.

Description

신규 형광 염료 및 그의 용도{NOVEL FLUORESCENT DYES AND USES THEREOF}
발명의 분야
본 발명은 형광 염료, 보다 구체적으로 자외선 여기가능한 형광 염료 조성물, 화합물 및 접합체, 뿐만 아니라 그의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
형광 염료는 샘플에서 성분의 표지, 검출 및/또는 정량화를 위해 널리 사용된다. 이러한 검출 및/또는 정량화에 이용되는 다양한 접근법은 형광 현미경검사, 형광 면역검정, 세포의 유동 세포측정 분석, 및 다양한 다른 적용을 포함한다. 일반적으로, 검출 도구로서 형광 염료를 이용하는 여러 적용의 경우에는, 형광 염료를 리간드, 예컨대 단백질, 항체, 효소, 뉴클레오티드, 핵산, 및 다른 생물학적 및 비-생물학적 분자에 접합시켜, 염료-표지된 리간드를 제조하는 것이 필수적이다. 염료-표지된 리간드는 후속적인 생화학적 상호작용을 위한 특이성을 부여하는 중요한 시약이며, 여기서 형광 염료는 상기 상호작용의 검출 및/또는 정량화를 위한 방법을 제공한다.
형광 염료의 선택은 멀티플렉스, 멀티컬러 분석, 예컨대 형광 현미경검사, 형광 면역검정, 유동 세포측정법 및 다양한 다른 적용을 이용하는 적용에서 특히 중요하다. 특히, 특정한 검출 적용은 구체적인 여기 범위를 갖는 자외선 여기가능한 형광단을 필요로 한다.
구체적으로, 멀티컬러 유동 세포측정 기기에서 405 nm 바이올렛 레이저에 의해 효율적으로 여기될 수 있는 형광 염료가 요구된다. 이러한 적용을 위한 표적 염료는 본질적으로 하기 특징을 가져야 한다: 1) 그의 여기 스펙트럼 405 nm 근처에서 최대, 2) 스펙트럼적으로 분할가능한 강한 최대 방출, 3) 바람직하게는 50 nm 이상의 큰 스토크스(Stokes) 변화, 및 4) 반응성 기를 통해 생체분자에 커플링되는형광 염료의 능력. 이전에는, 상이한 리간드에 접합되어 광학적으로 및 전자적으로 분리가능한 형광 스펙트럼 특성을 갖는 염료-표지된 시약을 제공할 수 있는 자외선 여기가능한 형광단이 부족하였다.
본 발명의 형광 염료는 반딧불이 루시페린 화합물과 구조적으로 유사하다. 이러한 화합물은 이전에는 루시페린의 산화적 촉매작용에 의해 빛이 생성되는 화학발광 시약으로서 사용되었다. 효소 루시페라제에 대한 기질인 루시페린은 루시페라제의 존재 하에 산화되어, 옥시루시페린 및 빛의 형태로 방출되는 에너지를 생성한다. 이들 유형의 검정의 경우, 루시페라제-루시페린 반응은 광범위한 기질에 대한 단순하고 신속하며 민감한 검정을 위한 기준을 제공한다 (문헌 [Karicka, LJ., Analytical Biochemistry, 175, 14-21 (1988)]).
반딧불이 루시페린의 구조를 기반으로 하는 이러한 화학발광 염료가 광범위하게 사용되고 있지만, 이러한 사용은 반딧불이 루시페린과 유사한 구조를 갖는 화합물이 자외선 스펙트럼의 특정 부분 내에서 여기가능한 형광 염료로서 기능하는 능력을 입증하지 않는다. 이러한 자외선 여기가능한 형광 염료는 광범위한 적용, 예컨대 비제한적으로 멀티플렉스, 멀티컬러 형광 분석을 이용하는 적용에서 특히 유리하다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 반딧불이 루시페린 구조를 기반으로 하는 신규한 자외선 여기가능한 형광 염료, 그를 포함하는 조성물, 그의 중간체, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 하기 화학식 I을 갖는 형광 염료의 조성물이 제공된다.
<화학식 I>
Figure 112012012167554-pct00001
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이고;
각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
Z1은 H 또는 알킬이고;
여기서, W 기 중 하나 및 Z1은 부재할 수 있고, 부재하는 경우 이는 고리 C에서 C4와 C5 사이의 추가의 결합 (점선으로 표시됨)으로 대체되고;
Z2는 화학식의 -L-RG의 표지 치환기를 포함하고, 여기서 L은 결합 또는 연결기이고;
RG는 형광 염료를 또 다른 분자에 결합시킬 수 있는 반응성 기이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 형광 염료를 합성하기 위한 합성 중간체가 제공된다. 한 실시양태에서, 합성 중간체는 화학식으로 표시된다.
Figure 112012012167554-pct00002
상기 식에서,
Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이다.
또 다른 측면에서, 생체분자에 접합된 형광 염료를 포함하는 염료-접합체가 제공된다.
또 다른 측면에서, 샘플에서 분석물 또는 리간드의 존재 또는 상호작용을 위치확인 및 검출하는데 사용하기 위해 형광 염료 및 염료-접합체를 사용하는 방법이 제공된다. 구체적 실시양태에서, 염료-접합체에 결합하는 상보적 생체분자의 존재를 검출하기 위해 염료-접합체를 사용하는 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 염료-접합체에 결합하는 상보적 생체분자의 존재를 검출하기 위해 형광 염료, 염료 중간체 또는 염료-접합체를 포함하는 시약 및 키트가 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 자외선 여기가능한 형광 염료의 일반적인 구조를 도시한다.
도 2a-2d는 루시페린 유도체에 대한 합성 반응식을 도시한다.
도 3a 및 3b는 데히드로루시페린 산의 유도체에 대한 합성 반응식을 도시한다.
도 4는 2-컬러 유동 세포측정법을 이용하여 CD4-염료2 접합체 대 CD4-퍼시픽 오렌지 접합체의 상대적인 성능을 설명하는 히스토그램을 도시한다.
도 5는 10-컬러 유동 세포측정법을 이용하여 CD4-염료3 대 CD4-퍼시픽 오렌지 접합체의 상대적인 성능을 설명하는 히스토그램을 도시한다.
발명의 상세한 설명
정의
본원에 사용된 모든 과학 및 전문 용어는 달리 명시되지 않는 한 당업계에 일반적으로 사용되는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하기 단어 또는 어구는 명시된 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "활성화 에스테르"는 아미노 기와 자발적으로 반응하는 에스테르를 의미한다. 활성화 에스테르는 일반적으로 화학식 -COR (여기서, R은 양호한 이탈기임)을 갖는다. 활성화 에스테르에는 숙신이미딜옥시 (-OC6H4O2) (N-히드록시-숙신이미드 에스테르로도 공지됨), 술포숙신이미딜옥시 (-OC6H3O2-SO3H), -1-옥시벤조트리아졸릴 (-OC6H4N3)이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소를 함유하는 분지형, 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 기를 의미한다. 용어 "알킬"은 전형적으로 8개 이하의 탄소를 함유하는 "저급 알킬" 기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알케닐"은 1개 이상의 C--C 이중 결합을 함유하고 2 내지 20개의 탄소를 함유하는 분지형, 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 기를 의미한다. 용어 "알케닐"은 전형적으로 8개 이하의 탄소를 함유하는 "저급 알케닐" 기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알키닐"은 1개 이상의 C--C 삼중 결합을 함유하고 2 내지 20개의 탄소를 함유하는 분지형 또는 직쇄 탄화수소 기를 의미한다. 용어 "알키닐"은 전형적으로 8개 이하의 탄소를 함유하는 "저급 알키닐" 기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 H 이외의 1개 이상의 치환기로 치환될 수 있는, 1-5개의 카르보시클릭 방향족 고리를 함유하는 방향족 고리-함유 기를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분석물"은 샘플에서 그의 존재 또는 양이 검정에 의해 측정되는 물질을 의미한다. 분석물은 반응성 기, 예를 들어 그를 통해 본 발명의 염료가 분석물에 접합될 수 있는 기를 포함할 수 있다. 분석물은 특이적 결합 친화도를 갖는 특이적 결합 파트너가 존재하는 유기 및 생물학적 분자를 포함한다. 예시적 분석물에는 비제한적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, RNA, DNA-RNA 복합체, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 단편, 항체-DNA 키메라, 항원, 합텐, 단백질, 렉틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 비오틴이 포함된다. 다른 예시적 분석물로는 또한 약물 및 호르몬이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합된 분자" 또는 "CM"은 본 발명의 하나 이상의 염료와 회합된 생물학적 또는 비-생물학적 성분을 의미한다. 이러한 성분에는 비제한적으로 항원, 항체, 탄수화물 (예를 들어, 모노-, 올리고-, 및 폴리-사카라이드), 단백질, 펩티드, 합텐, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 중합체, 바이러스, 미생물, 또는 세포 또는 세포 성분이 포함된다. "접합된 분자"에는 또한 고체 지지체 (예를 들어, 합성 지지체, 크로마토그래피 지지체, 막, 또는 비드)가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형광 염료"는 전자기 스펙트럼의 자외선 및 자광선 영역에서 빛을 흡수하고 청색 영역에서 빛을 재방출하여 검출가능한 신호를 제공하는 화합물을 의미한다. "형광 염료"는 또한 접합체 분자로의 염료의 부착을 용이하게 하는 화학적 반응성 기를 갖는 형광 화합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염료-접합체"는 형광 염료가 생물학적 또는 비-생물학적 성분과 회합된 분자를 의미한다. 이러한 생물학적 또는 비-생물학적 성분은 또한 "접합된 분자"로서 지칭된다. 한 실시양태에서, 접합된 분자로의 형광 염료의 회합은 공유 연결을 통해 이루어진다. 염료-접합체의 예에는 항원, 항체, 탄수화물, 단백질, 펩티드, 합텐, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 중합체, 고체 지지체 (예를 들어, 합성 지지체, 크로마토그래피 지지체, 막 또는 비드), 바이러스, 미생물, 또는 세포 또는 세포 성분의 접합체가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형광단"은 소정의 파장 범위에서 에너지를 흡수하고 흡수 범위 이외의 파장 범위에서 에너지를 방출할 수 있는 분자를 의미한다. 용어 "여기 파장"은 형광단이 에너지를 흡수하는 파장의 범위를 의미한다. 용어 "방출 파장"은 형광단이 에너지 또는 형광을 방출하는 파장의 범위를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "할로겐"은 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘 원자를 의미한다. 유사하게, 용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도 기를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "할로알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 1개 이상의 할로겐 원자에 의해 치환된 알킬 기를 의미한다. 한 실시양태에서, 할로알킬은 1, 2 또는 3개의 할로 기로 치환될 수 있다. 용어 할로알킬은 또한 퍼플루오로-알킬 기를 포함한다. 할로알킬의 예는 트리플루오로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 펜타클로로에틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "연결기" 또는 "L"은 염료를 반응성 기 또는 RG에 연결시키는 기를 의미한다. 연결기는 결합, 원자, 또는 또 다른 2가 또는 다가 기일 수 있다. 연결기는 그의 일부가 고리 구조의 일부분일 수 있는 원자의 직쇄 또는 분지쇄를 포함할 수 있다. 연결기는 일반적으로 1 내지 약 50개의 비-수소 원자, 더욱 일반적으로 1 내지 약 30개의 비-수소 원자를 함유한다. 쇄를 포함하는 원자는 형광 염료를 또 다른 잔기, 예컨대 화학적 반응성 기에 공유 연결시키는 C, O, N, S, P, Si, B 및 Se 원자, 바람직하게는 C, O, N, P 및 S 원자로부터 선택된다. 할로겐 원자는 쇄 또는 고리 상의 치환기로서 존재할 수 있다. 연결 치환기를 포함하는 전형적인 관능기에는 알켄, 알킬렌, 아릴렌, 알케닐렌, 에테르, 퍼옥시드, 케톤으로서의 카르보닐, 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 티오에스테르 또는 아미드 기, 아민, 아미딘, 카르바메이트, 우레아, 이민, 이미드, 이미데이트, 카르보디이미드, 히드라진, 디아조, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포네이트 에스테르, 티오에테르, 디술피드, 술폭시드, 술폰, 술포네이트 에스테르, 술페이트 에스테르 및 티오우레아 기가 포함된다. 연결기의 예에는 치환 또는 비치환된 폴리메틸렌, 아릴렌, 알킬아릴렌, 아릴렌알킬 또는 아릴티오가 포함된다.
염료를 반응성 기에 연결시키기 위한 본 발명에 따른 1개의 연결기는 화학식 R1C(O)R2 (여기서, R1은 결합, 또는 염료에 부착되는 C1-10 메틸렌 (CH2)n이고, C(O)는 카르보닐 기이고, R2는 OH, 또는 카르보닐 기를 반응성 기 RG에 부착시키는 결합임)를 갖는다. 이 연결기의 예에는 하기가 포함된다:
하기 설명된 또 다른 실시양태에서, 연결기는 화학식 R1C(O)A1R3C(O)R2 (여기서, R1은 상기 기재된 바와 같은 결합 또는 C1-10 메틸렌이고, A1은 NH, S 또는 O이고, R3은 알케닐 (CH2)n, 1개 이상의 불포화 결합을 갖는 5 또는 6원 고리, 또는 C1-10 메틸렌 (CH2)n과 5 또는 6원 고리의 조합이고, R2는 OH, 또는 말단 카르보닐 기를 반응성 기 RG에 부착시키는 결합이다. 이 연결기의 예에는 하기가 포함된다:
Figure 112012012167554-pct00004
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "반응성 기" 또는 "RG"는 그의 존재가 공유 부착 또는 물리적 힘에 의해 또 다른 분자와의 결합을 용이하게 하는 원자 또는 기이다. 반응성 기의 선택된 예는 표 1에 도시된다. 일부 실시양태에서, 또 다른 화합물로의 본 발명의 형광 화합물의 부착은, 예를 들어 반응성 기가 이탈기, 예컨대 할로겐 원자 또는 토실레이트 기인 경우, 반응성 기로부터 1개 이상의 원자의 손실을 수반할 것이고, 형광 표지 화합물은 친핵성 치환 반응에 의해 또 다른 화합물에 공유 부착된다. 다른 실시양태에서, 공유 결합 형성에 의한 또 다른 화합물로의 형광 표지 화합물의 부착은 추가의 반응, 예컨대 마이클(Michael) 부가 또는 고리부가 반응, 예컨대 딜스-알더(Diels-Alder) 반응에서 또는 반응성 기가 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트 기인 경우에 일어나는 바와 같이, 반응성 기 내의 결합의 재편성을 수반할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 부착은 공유 결합 형성을 수반하지 않고, 오히려 물리적 힘을 수반할 것이며, 이 경우에는 반응성 기가 변경되지 않은 채로 남아 있는다. 물리적 힘이란, 인력, 예컨대 수소 결합, 정전기적 또는 이온성 인력, 소수성 인력, 예컨대 염기 적층, 및 특이적 친화성 상호작용, 예컨대 비오틴-스트렙타비딘, 항원-항체 및 뉴클레오티드-뉴클레오티드 상호작용을 의미한다.
<표 1>
Figure 112012012167554-pct00005
반응성 기가 잔기, 예컨대 카르복실산, 또는 카르복실산의 활성화 에스테르인 경우, 반응성 염료는 1개 이상의 아미노 기를 함유하는 분자, 예컨대 단백질, 펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 합텐과의 염료 접합체를 제조하는데 특히 유용하다. 반응성 기가 말레이미드 또는 할로아세트아미드인 경우, 반응성 염료는 티올-함유 분자와의 접합에 특히 유용하다. 반응성 기가 히드라지드인 경우, 반응성 염료는 퍼아이오데이트-산화된 탄수화물 및 당단백질과의 접합에 특히 유용하다.
한 실시양태에서, 반응성 기는 카르복실산, 카르복실산의 숙신이미딜 에스테르, 이소티오시아네이트, 할로아세트아미드, 히드라진, 지방족 아민 및 말레이미드 기를 포함한다. 각각의 이러한 반응성 기를 제조하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 특별한 목적을 위한 그의 적용은 당업자에의 능력 내에 있다.
이관능성 커플링 시약이 또한 표지를 중등도 반응성 기를 갖는 유기 및 생물학적 분자에 커플링하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [L. J. Kricka, Ligand-Binder Assays, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, pp. 18-20, Table 2.2] 및 [T. H Ji, "Bifunctional Reagents," Methods in Enzymology, 91, 580-609 (1983)] 참조). 최종 구조 내로 혼입되는 시약, 및 2개의 반응물을 커플링시키지 않고 단지 커플링을 위해서만 작용하는 시약의 두 가지 유형의 이관능성 시약이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샘플"은 분석하고자 하는 하나 이상 분석물을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 유체를 의미한다. 형광 염료를 이용하여 분석되는 전형적인 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 정액, 타액, 세포 용해물, 조직 추출물 등이다. 샘플은 또한 희석제, 완충제, 세제, 오염물, 및 체액에 일반적으로 존재하는 다른 이러한 성분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합 쌍"은 상호적 결합 친화도를 나타내는 두 가지 물질을 의미한다. 예에는 항원-항체, 합텐-항체, 항체-항체 쌍, 상보적 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴, 효소-기질, 호르몬-호르몬 수용체, 렉틴-탄수화물, IgG-단백질 A, IgG-단백질 G, 핵산-핵산 결합 단백질 및 핵산-항-핵산 항체가 포함된다 (표 2).
<표 2>
Figure 112012012167554-pct00006
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치환된"은 기 상의 1개 이상의 수소 원자가 C, O, N, S, P, Si, F, Cl, Br, I로부터 선택된 1 내지 50개의 원자를 갖는 또 다른 원자 또는 기로 대체된 것을 의미한다. 치환된 기와 관련하여, 다중 치환점이 존재할 수 있다는 것으로 의도된다.
본 발명의 조성물
본 발명은 반딧불이 루시페린의 구조를 기반으로 하며 특정한 기능적 이점을 가진 일종의 형광 염료를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 형광 염료는 더 짧은 파장 (340 내지 450 nm)에서의 여기에 적합하고, 일반적으로 500 내지 550 nm의 파장에서의 최대 방출, 좁은 방출 대역폭, 약 50 nm 이상의 큰 스토크스 변화, 및 다른 유리한 형광 특성을 갖는다.
본 발명의 형광 염료는 바이올렛 405 nm 레이저에서 특히 유용하다. 기존 바이올렛 레이저 여기가능한 염료 (예를 들어, 퍼시픽 오렌지)와 비교하여, 본 발명의 형광 염료는 유사한 흡광성을 가짐에도 불구하고, 놀랍게도 및 뜻밖에 더 밝은 형광을 보여준다. 본 발명의 형광 염료는 반응성 기를 통해 접합된 분자에 커플링되는데 매우 적합하다. 또한, 본 발명의 염료-접합체, 특히 단백질 접합체는 심지어 비교적 높은 염료 치환 정도에서도 밝은 형광을 나타낸다. 이러한 특성은 본 발명의 염료를 특히 멀티컬러, 멀티플렉스 적용에 매우 적합하게 한다.
하기 화학식 I의 형광 염료가 제공된다.
<화학식 I>
Figure 112012012167554-pct00007
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이고;
각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
Z1은 H 또는 알킬이고;
여기서, W 기 중 하나 및 Z1은 부재할 수 있고, 부재하는 경우 이는 고리 C에서 C4와 C5 사이의 추가의 결합 (점선으로 표시됨)으로 대체되고;
Z2는 화학식 -L-RG의 표지 치환기를 포함하고, 여기서 L은 결합, 또는 반응성 기 RG에 염료를 연결시키는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함할 수 있고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고;
RG는 카르복실산, 카르복실산의 활성화 에스테르, 산 무수물, 산 클로라이드, 아실 아지드, 아실 할라이드, 알데히드, 클로로포르메이트, 아민, 히드록시, 히드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 토실, 말레이미드, N-히드록시-숙신이미드 에스테르, 아지리딘, 이민 및 디술피드 기를 포함한다.
화학식 I의 형광 염료의 한 실시양태에서, 하기 화학식 I-A에서와 같이 X1 및 X2는 S이다.
<화학식 I-A>
Figure 112012012167554-pct00008
상기 식에서,
Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이고;
Z1은 H 또는 알킬이고;
각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
L-RG에서, L은 결합, 또는 반응성 기 RG에 염료를 연결시키는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함할 수 있고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고;
RG는 카르복실산, 카르복실산의 활성화 에스테르, 산 무수물, 산 클로라이드, 아실 아지드, 아실 할라이드, 알데히드, 클로로포르메이트, 아민, 히드록시, 히드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 토실, 말레이미드, N-히드록시-숙신이미드 에스테르, 아지리딘, 이민 및 디술피드 기를 포함할 수 있다.
화학식 I-A의 염료의 선택된 실시양태는 표 3에 도시된다.
<표 3>
Figure 112012012167554-pct00009
다른 실시양태에서, 형광 염료는 하기 화학식 I-B를 갖는다.
<화학식 I-B>
Figure 112012012167554-pct00010
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐이거나; 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이고;
W는 H 또는 알킬이고;
L은 결합, 또는 반응성기 RG에 염료를 연결시키는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함할 수 있고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고;
RG는 카르복실산, 카르복실산의 활성화 에스테르, 산 무수물, 산 클로라이드, 아실 아지드, 아실 할라이드, 알데히드, 클로로포르메이트, 아민, 히드록시, 히드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 토실, 말레이미드, N-히드록시-숙신이미드 에스테르, 아지리딘, 이민 및 디술피드 기를 포함할 수 있다.
화학식 I-B의 형광 염료의 한 실시양태에서, 하기 화학식에서 제공된 바와 같이 X1 및 X2는 S이다.
Figure 112012012167554-pct00011
상기 식에서,
Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬이고;
W는 H 또는 알킬이고;
L은 결합 또는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함하고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고;
RG는 반응성 기이고, 여기서 RG는 카르복실산, 카르복실산의 활성화 에스테르, 산 무수물, 산 클로라이드, 아실 아지드, 아실 할라이드, 알데히드, 클로로포르메이트, 아민, 히드록시, 히드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 토실, 말레이미드, N-히드록시-숙신이미드 에스테르, 아지리딘, 이민 및 디술피드 기를 포함할 수 있다.
화학식 I-B의 염료의 선택된 실시양태는 표 4에 도시된다.
<표 4>
Figure 112012012167554-pct00012
본 발명은 본 발명의 형광 염료를 합성하는데 사용될 수 있는 합성 중간체 화합물을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 중간체 화합물은 하기 화학식 II에 의해 표시된다.
<화학식 II>
Figure 112012012167554-pct00013
상기 식에서,
Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐이거나, 또는 Yl 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이다.
또 다른 실시양태에서, 중간체 화합물은 하기 화학식 III에 의해 표시된다:
<화학식 III>
Figure 112012012167554-pct00014
상기 식에서,
X2는 S 또는 O이고;
각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
Z1은 H 또는 알킬이고;
LH는 OH 또는 NH(CH2)nCOOH (n은 1 내지 10임)이다.
본 발명의 형광 염료는 하나 이상 접합된 분자 "CM"과 공유 또는 비-공유 회합될 수 있다. 공유 회합은 접합된 분자 CM을 상기 기재된 바와 같은 연결기 L을 통해 형광 염료에 부착시키는 것을 비롯한, 다양한 메카니즘을 통해 일어날 수 있고, 공유 연결을 수반할 수 있다.
염료가 하나 이상의 분자와 비-공유 회합되는 경우, 회합은 고체 또는 반고체 매트릭스, 예컨대 비드 또는 표면 내에 또는 상에 염료 또는 합성 중간체 화합물의 도입, 또는 비특이적 상호작용, 예컨대 수소 결합, 이온성 결합 또는 소수성 상호작용 (예컨대, 반 데르 발스(Van der Waals) 힘)에 의한 것을 비롯한, 다양한 메카니즘을 통해 일어날 수 있다. 회합된 분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드, 비드, 마이크로플레이트 웰 표면, 금속 표면, 반도체 및 비-전도성 표면, 나노-입자, 및 다른 고체 표면으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 회합 또는 접합된 분자는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 초과의 형광 염료와 회합되거나 그에 접합될 수 있다. 일반적으로, 생물학적 물질의 염료-접합체의 제조 방법은 당업계에서 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1996 Edition Academic Press, Chapter 8, pages 298-362]; [Nataliya Panchuk, et al., J. Histochemistry & Cytochemistry, 1179-1188 (1999)]; [S Bhatacharya, et al., Bioconjugate Chemistry, Volume 19, 1186-1193 (2008)]; [B. Dworecki, et al., http://www.piercenet.com/files/DyLight％20Poster％206-7-04.pdf]을 참조한다. 전형적으로, 형광단과 염료-접합체의 회합 또는 접합은 형광단의 스펙트럼 특성을 상기 분자에게 부여한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 형광 염료는 공유 연결을 통해 접합된 분자 CM에 부착되고, 염료-접합체는 하기 화학식을 갖는다.
Figure 112012012167554-pct00015
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
Y1 및 Y2는 개별적으로 H, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐을 나타내고,
각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
Z1은 H 또는 알킬이고;
여기서, W 기 중 하나 및 Z1은 부재할 수 있고, 부재하는 경우 이는 고리 C에서 C4와 C5 사이의 추가의 결합 (점선으로 표시됨)으로 대체되고;
L은 독립적으로 결합 또는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함하고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고;
CM은 접합된 분자이다.
본 발명에 따른 염료-접합체를 제조하기 위해 이용될 수 있는 접합된 분자 CM에는 아미노산, 펩티드, 단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 효소, 지질, 비-생물학적 중합체, 세포 및 세포 성분이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 접합되는 분자는 접합을 용이하게 하거나 후속적인 반응성을 보장하기 위해 1개 이상의 관능기 상에서 보호될 수 있다.
분자가 펩티드인 경우, 펩티드는 디펩티드 또는 더 큰 펩티드일 수 있고, 전형적으로 5 내지 50개의 아미노산을 포함한다. 접합된 분자가 단백질인 경우, 이는 효소, 항체, 촉매 항체, 키나제, 렉틴, 당단백질, 히스톤, 알부민, 지단백질, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 호르몬, 독소, 성장 인자일 수 있다. 전형적으로, 접합된 단백질은 항체, 항체 단편, 아비딘, 스트렙타비딘, 렉틴 또는 성장 인자이다.
접합된 분자는 예를 들어 핵산 중합체, 예컨대 DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드 (또는 그의 하이브리드) 또는 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중-가닥 또는 사중-가닥 DNA 또는 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA일 수 있다. 접합된 분자는 또한 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란인 탄수화물을 포함할 수 있다.
회합 또는 접합된 분자는 특이적 결합 쌍의 구성원일 수 있으며, 따라서 상기 특이적 결합 쌍의 상보적 구성원을 위한 검출 시약으로서 유용할 수 있다. 특이적 결합 쌍 구성원의 염료-접합체는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 샘플에서 상보적 특이적 결합 쌍 구성원의 존재를 검출하고, 임의로 정량화하는데 유용할 수 있다.
대표적인 특이적 결합 쌍에는 비제한적으로 리간드 및 수용체가 포함될 수 있고, 하기 쌍이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다: 항원-항체, 비오틴-아비딘, 비오틴-스트렙타비딘, IgG-단백질 A, IgG-단백질 G, 탄수화물-렉틴, 효소-효소 기질; DNA-상보적 가닥 DNA, 및 RNA-상보적 가닥 RNA, 호르몬-호르몬 수용체 (표 2).
형광 염료 화합물의 제조 방법
본 발명의 한 측면에서, 하기 화학식 I의 형광 염료의 제조 방법이 제공된다.
<화학식 I>
Figure 112012012167554-pct00016
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
Y1 및 Y2는 개별적으로 H, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐을 나타내고,
각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
Z1은 H 또는 알킬이고;
여기서, W 기 중 하나 및 Z1은 부재할 수 있고, 부재하는 경우 이는 고리 C에서 C4와 C5 사이의 추가의 결합 (점선으로 표시됨)으로 대체되고;
Z2는 화학식 -L-RG의 표지 치환기를 포함하며, 여기서 L은 독립적으로 결합 또는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함하고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고;
RG는 카르복실산, 카르복실산의 활성화 에스테르, 산 무수물, 산 클로라이드, 아실 아지드, 아실 할라이드, 알데히드, 클로로포르메이트, 아민, 히드록실, 히드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 토실, 말레이미드, N-히드록시-숙신이미드 에스테르, 아지리딘, 이민 및 디술피드 기로 이루어진 군으로부터 선택된 반응성 기이다.
한 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 본 발명의 형광 염료는 도 2a-2d에 도시된 합성 반응식을 이용하여 합성될 수 있다.
Figure 112012012167554-pct00017
상기 식에서,
Y1 및 Y2는 개별적으로 H, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐을 나타내고;
X2는 S 또는 O이고;
각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
Z1은 H 또는 알킬이고;
L은 O 또는 NH(CH2)nCOO (n은 1 내지 10임)이다.
상기 방법은
(a) 도 2b에 도시된 방법을 이용하여 하기 화학식을 갖는 염료의 시아노벤조티아졸 중간체를 형성하고
Figure 112012012167554-pct00018
(상기 식에서, Y1 및 Y2는 개별적으로 H, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐을 나타냄);
(b) 시아노벤조티아졸 중간체를 하기 화학식의 변형된 아미노산과 반응시킴으로써 염료의 카르복실 유도체를 형성하여
Figure 112012012167554-pct00019
(상기 식에서, X2는 S 또는 O이고; 각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고; Z1은 H 또는 알킬이고; LH는 OH 또는 NH(CH2)nCOOH (n은 1 내지 10임)임);
하기 화학식의 루시페린 유도체를 제공하는 단계
Figure 112012012167554-pct00020
(상기 식에서, X2는 S 또는 O이고; Y1 및 Y2는 개별적으로 H, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐을 나타내고; 각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고; Z1은 H 또는 알킬이고; LH는 OH 또는 NH(CH2)nCOOH (n은 1 내지 10임)임); 및
(c) LH에서 카르복실 기의 히드록실 관능기를 반응성 기로 대체하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 본 발명의 형광 염료는 도 3a에 도시된 합성 반응식을 이용하여 합성된다.
Figure 112012012167554-pct00021
상기 식에서,
Y1 및 Y2는 개별적으로 H, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐을 나타내고;
R은 H 또는 알킬이다.
또 다른 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 본 발명의 형광 염료는 도 3b에 도시된 합성 반응식을 이용하여 합성될 수 있다 (문헌 [Bagley, MC. et al., J. Am. Chem. Soc., 122, 3301-3313 (2000)]).
Figure 112012012167554-pct00022
상기 식에서,
Y1 및 Y2는 개별적으로 H, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알콕시 또는 알케닐을 나타내고;
R은 H 또는 알킬이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 염료-접합체의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 반응성 기를 포함하는 본 발명의 형광 염료를 접합된 분자와 혼합하는 것을 포함한다. 접합된 분자는 아미노산, 단백질, 펩티드, 항체, 항체 단편, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 핵산 중합체일 수 있다. 접합된 분자는 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란인 탄수화물을 포함할 수 있다. 전형적으로, 형광단과 접합된 분자의 접합은 형광단의 스펙트럼 특성을 상기 분자에게 부여한다.
염료-접합체의 제조 방법의 당업계에서 널리 공지되어 있다. 펩티드 또는 단백질 접합체의 제조의 경우, 전형적으로 상기 방법은 먼저 실온 이하에서 (전형적으로 4-25℃) 약 1-10 mg/ml의 수성 완충제 중에 접합시키고자 하는 단백질을 용해시키는 것을 포함한다. 보레이트 또는 카르보네이트/비카르보네이트 완충제 (pH 약 8.0-9)는 숙신이미딜 에스테르와의 반응에, 포스페이트 완충제 (pH 약 4.0-8)는 티올-반응성 관능기와의 반응에, 및 카르보네이트 또는 보레이트 완충제 (pH 약 9.0-9.8)는 이소티오시아네이트 및 디클로로트리아진과의 반응에 대해 특히 적합하다. 적절한 반응성 염료를 적합한 접합 정도를 제공하는데 충분한 양으로 비수성 용매 (보통 DMSO 또는 DMF)에 용해시키고, 접합시키고자 하는 단백질의 용액에 첨가한다. 임의의 단백질 또는 다른 성분에 사용되는 반응성 염료의 적절한 양은 일반적으로 다양한 양의 반응성 염료를 접합시키고자 하는 단백질에 첨가하는 실험에 의해 사전 결정된다. 반응성 염료는 일반적으로 접합시키고자 하는 단백질의 5-100배 과량으로 사용된다. 성분 용액에 반응성 화합물을 첨가한 후, 혼합물을 적합한 기간 동안 (전형적으로 실온에서 약 1 시간 내지 얼음 상에서 수시간) 인큐베이션하고, 염료-접합체를 겔 여과, 투석, HPLC 또는 다른 적합한 방법에 의해 접합되지 않은 염료로부터 분리한다. 염료-접합체는 그의 목적하는 적용에서 시험될 때까지 용액 중에 저장될 수 있거나 또는 동결건조될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 항체, 항체 단편, 아비딘, 렉틴, 효소, 단백질 A 및 G, 세포 단백질, 알부민, 히스톤, 성장 인자, 호르몬, 및 다른 단백질을 사용하여 염료-접합체를 제조하는데 적용가능하다.
사용 방법
본 발명은 특이적 결합 쌍의 상보적 구성원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 염료-접합체를 샘플과 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물에 의해 형성된 복합체를 검출하여, 상보적 구성원을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 특이적 결합 쌍의 상보적 구성원을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 샘플에서 분석물의 검출 및/또는 정량화를 위해 본 발명의 반응성 염료 및 염료-접합체를 비롯한 형광 염료를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 성분의 불균일 혼합물, 예컨대 무손상 세포, 세포 추출물, 박테리아, 바이러스, 소기관, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 실시양태에서, 샘플은 단일 성분 또는 균일한 군의 성분들, 예를 들어 생물학적 중합체, 예컨대 아미노산 중합체, 핵산 중합체, 탄수화물 중합체 또는 지질 막 복합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 반응성 염료 및 염료-접합체를 비롯한 본 발명의 형광 염료는 분석물이 식별 또는 정량화될 수 있도록 샘플에서 분석물을 염색 또는 표지하는데 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 염료-접합체를 비롯한 형광 염료는 생물학적 또는 비-생물학적 유체에서 표적 분석물에 대한 검정으로 검출가능한 미량 원소로서 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 반응성 염료 및 염료-접합체를 비롯한 형광 염료는, 접합된 분자가 특이적 결합 쌍 (예를 들어, 표 2)의 상보적 구성원인 리간드를 포함하는 샘플을 검출하는데 사용된다. 따라서, 리간드는 한 구성원이고, 접합된 분자는 특이적 결합 쌍의 다른 구성원이다. 염료-접합체를 비롯한 형광 염료는 또한 염료-접합체와 상보적 결합 분자 사이의 상호작용을 확인하기 위해 사용된다.
상기 방법의 제1 단계에서, 본 발명의 반응성 염료 및 염료-접합체를 비롯한 형광 염료는 일반적으로 검출가능한 광학 반응을 수득하도록 선택된 조건 하에서 상기 기재된 본 발명의 염료를 관심 샘플과 조합함으로서 사용된다. 염료-접합체는 전형적으로 샘플의 성분과 공유 또는 비-공유 회합 또는 복합체를 형성하거나, 또는 단순히 샘플의 영역 내에 또는 샘플의 일부분으로 존재한다. 이어서, 샘플을 광학 반응을 도출하기 위해 선택된 파장에서 발광시킨다. 전형적으로, 샘플의 염색을 이용하여, 광학 반응을 표준과 추가로 비교함으로써 샘플의 규정된 특성을 결정한다.
본 발명의 한 측면에서, 염료-접합체는 표지된 단백질, 예컨대 항체, 항체 단편, 아비딘 또는 스트렙아비딘 등이다. 이러한 실시양태에서, 염료-접합체는 전형적으로 항원, 합텐 또는 비오틴인 상보적 특이적 결합 쌍을 검출하는데 사용된다. 본 발명의 이러한 염료-접합체는 다양한 적용을 이용하여 샘플에서 분석물을 검출하는데 사용될 수 있다. 주요 적용은 면역형광, 형광 동소 혼성화 (FISH), 유동 세포측정법, 수용체의 표지, 및 표지된 세포의 추적을 포함한다. 특정한 검출 방법, 예를 들어 결합된 접합체 대 결합되지 않은 접합체의 공간적 분리/분할을 본질적으로 수반하는 혈구 계산을 기반으로 하는 방법의 경우, 분석 혼합물로부터 결합되지 않은 염료-접합체를 제거하는 것이 필요하지는 않다. 그러나, 다른 검출 방법, 예를 들어 결합된 접합체 대 결합되지 않은 접합체의 공간적 분리/분할을 수반하지 않는 면역검정의 경우, 광학 반응을 검출하기 전에 분석 혼합물로부터 결합되지 않은 염료-접합체를 제거하는 것이 필요할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 형광 염료 및 염료-접합체는 레이저 염료로서의 유용성을 가질 수 있다. 본 발명의 염료 및 염료-접합체가 자외선 또는 바이올렛 레이저에 의해 여기되기 때문에, 이러한 염료 및 염료-접합체는 더 긴 파장에서 여기되는 다른 염료를 이용하는 멀티플렉스 검정에 특히 유용하다. 한 실시양태에서, 이러한 염료 및 염료-접합체는 약 350-405 nm에서 여기되고, 더 긴 파장 (예를 들어, 480 nm 이상)에서 여기되는 염료와 함께 사용되는 경우 그의 방출 스펙트럼은 더 긴 파장에서 여기되는 염료와 구별가능하다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 염료-접합체는 샘플에서 하나 이상 분석물을 검출하기 위한 멀티컬러 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 다중 염료-접합체는 멀티컬러 분석을 이용하여 샘플에서 다중 분석물을 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 다중 염료-접합체, 예를 들어 제1 염료-접합체 및 제2 염료-접합체를 포함하는 본 발명의 조성물을 샘플과 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이 조성물에서, 제1 염료-접합체의 성분은 제1 분석물을 위한 결합 파트너이고, 제2 염료-접합체의 성분은 제2 분석물을 위한 결합 파트너이다. 인큐베이션은 제1 분석물과 제1 염료-접합체 사이의 상호작용을 유도하는데 적절한 조건 하에서 지속시킨다. 이 인큐베이션 동안, 유사한 상호작용이 제2 분석물과 제2 염료-접합체 사이에서 일어나는 것이 일반적으로 바람직하지만, 제2 염료-접합체와 제2 분석물 사이의 염료-접합체-분석물 복합체의 형성을 유도하기 위해 필요에 따라 인큐베이션 조건을 변화시키는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 적어도 제1 염료-접합체-분석물 복합체의 형성 이후, 샘플은 복합체가 형광을 발생시키는데 적절한 파장의 빛으로 발광되며, 그로 인해 제1 분석물이 검출된다. 제2 분석물은 유사한 방식으로 검출되고, 제1 분석물과 동시에 검출될 수 있거나 또는 각각의 형광 염료-접합체의 형광을 유도하는데 적절한 파장에서 샘플의 순차적 발광에 의해 검출될 수 있다. 특정한 측면에서, 발광 및/또는 검출 단계는 유동 세포측정기를 포함한다.
대안적으로, 바람직하게는 상이한 파장에서 형광을 발생시키는 다중 염료-접합체는 분석물의 상이한 특징을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물의 세포 또는 에피토프는 상이한 색상의 염료-접합체로 표지될 수 있고, 표적을 검출하여, 각각의 표적에 대한 각각의 색상의 공동-위치화를 이용하여 그의 신원을 확인한다.
본 발명의 염료 및 염료-접합체는 진단 적용을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 염료 및 염료-접합체는 대상체에서 병원성 유기체 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균)의 존재를 검출하는데 유용할 수 있다. 대안적으로, 특정 분석물의 존재 및/또는 특정 분석물의 양 및/또는 특정 분석물의 변이체는 대상체에서의 병적 상태와 관련있을 수 있다. 따라서, 이러한 분석물에 결합하는 본 발명의 염료 및 염료-접합체는 특정 분석물 및/또는 그의 변이체의 존재 및/또는 양을 측정하는데, 따라서 병적 상태의 존재 및/또는 범위를 진단하는데 유용성을 가질 수 있다.
본 발명의 키트
본 발명의 한 측면은 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 임의의 염료를 이용하여 다양한 검정의 실시를 용이하게 하는 키트 제제이다. 본 발명의 키트는 전형적으로 염료-접합체의 제조에 유용한 화학 반응성 표지로서 존재하거나 또는 접합된 분자가 특이적 결합 쌍 구성원인 경우 염료-접합체로서 존재하는 본 발명의 형광 염료를 포함한다. 선택된 접합된 분자에는 비제한적으로 생물학적 분자의 중합체 (예를 들어 단백질, 핵산 또는 탄수화물)가 포함된다. 구체적 실시양태에서, 표 3 및 4에 열거된 본 발명의 염료는 이러한 키트의 제조에 특히 적합하다.
바람직하게는, 키트는 표 5에 열거된 하나 이상의 형광 염료를 포함한다.
<표 5>
Figure 112012012167554-pct00023
Figure 112012012167554-pct00024
키트는 또한 염료1, 염료2, 염료3, 염료4, 염료5, 염료6 또는 염료7의 염료-접합체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적 실시양태에서, 키트는 본 발명의 반응성 염료, 및 염료를 적절한 관능기를 갖는 분자에 접합시키기는 것에 대한, 및 임의로 염료-접합체를 회수하는데 대한 지침서를 포함한다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 키트는 샘플에서 분석물 또는 리간드를 검출하는 검정을 수행하는 것에 대한 지침서를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세포 표면 수용체 또는 효소, 또는 항체가 결합할 수 있는 다른 리간드를 검출하는 것에 대한 지침서가 제공된다.
키트는 임의로 수용액으로서 전형적으로 존재하는 하나 이상의 완충제를 추가로 포함한다. 본 발명의 키트는 임의로 추가의 검출 시약, 생성된 표지된 분자의 정제를 위한 정제 매질, 형광 표준, 효소, 효소 억제제, 유기 용매, 또는 본 발명의 방법의 수행을 위한 지침서를 추가로 포함한다.
<실시예>
본 발명의 다양한 실시양태는 하기 예시된 실시예에 의해 추가로 증명된다. 실시예는 설명을 위해 제공하고, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위 또는 특허청구범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
하기 실시예는 반딧불이 루시페린의 디할로 유도체 및 이들 각각의 NHS 에스테르의 합성을 위한 일반적 방법을 기재한다.
1. 아펠 염의 제조
Figure 112012012167554-pct00025
500-mL 둥근-바닥 플라스크를 아르곤 하에 클로로아세토니트릴 (20 mL), 황 모노클로라이드 (120 mL), 및 CH2Cl2 (110 mL)로 충전하였다. 반응물을 아르곤 하에 3 일 동안 교반하였고, 그 동안 갈색 침전물이 형성되었다. 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하고, CH2Cl2 (300 mL) 및 헥산 (300 mL)으로 세척하였다. 세척된 고체를 진공 건조하여, 생성물을 갈색 고체로서 수득하였다 (75％ 수율).
2. 2-시아노벤조티아졸의 제조
하기 절차는 5,7-디클로로-6-히드록시-2-시아노벤조티아졸의 제조에 대한 것이다. 5,7-디플루오로-6-히드록시-2-시아노벤조티아졸의 제조는 동일한 절차를 따랐으며, 매우 유사한 결과를 나타내었다.
Figure 112012012167554-pct00026
5-L 둥근-바닥 플라스크를 1,3-디클로로-2-메톡시니트로벤젠 (0.33 mol), 염화암모늄 (3.3 mol), 및 에탄올 (1200 mL)로 충전하였다. 아연 분말 (3.3 mol)을 교반된 혼합물에 신속히 첨가하였다. 반응 혼합물을 수분 후에 거의 환류시까지 가온시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 밤새 교반한 후, 현탁액을 여과하여 잔류 아연 및 염화암모늄을 제거하였다. 여과물을 감압 하에 농축시키고, 생성된 고체를 CH2Cl2 (1500 mL)에 재현탁시켰다. 현탁액을 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축시켜, 치환된 아닐린을 백색 고체 (0.33 mol)로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00027
2-L 3구형 둥근-바닥 플라스크를 오븐 건조하고, 아르곤 흐름 하에 냉각시켰다. 플라스크를 1,3-디클로로-2-메톡시아닐린 (0.33 mol), 피리딘 (75 mL), 및 CH2Cl2 (550 mL)로 충전하였다. 용액을 환류시키면서 아펠 염 (0.33 mol)을 5 분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. TLC는 15 분 후에 아닐린의 완전한 소멸을 나타내었다. 반응 혼합물을 오렌지색 고체로 농축시켰다. 고체를 2.5 L의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 유기 용액을 유형 1 물 (2 x 1000 mL) 및 염수 (1000 mL)로 세척하였다. 세척된 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜, 아펠 염 부가물을 고체로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00028
500-mL 3구형 둥근-바닥 플라스크에 아르곤 유입구 라인, 및 출구로 연결된 버블러를 가진 수냉식 응축기를 장착하였다. 플라스크를 아펠 염 부가물 (0.134 mol)로 충전하고, 140℃의 표면 온도로 1 시간 동안 가열하였다. 톨루엔 (50 mL)을 첨가하고, 반응물을 90℃로 냉각시켰다. CH2Cl2 (100 mL) 및 실리카 (50 g)를 첨가하였다. 생성된 슬러리를 여과하고, 여과 케이크를 CH2Cl2 (200 mL)로 세척하였다. 합한 여과물 및 세척물을 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (CH2Cl2/헥산)하여, 5,7-디클로로-6-메톡시-2-시아노벤조티아졸을 고체 (0.031 mol)로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00029
250-mL 둥근-바닥 플라스크를 피리디늄 히드로클로라이드 (160 mmol) 및 5,7-디클로로-6-메톡시-2-시아노벤조티아졸 (8.2 mmol)로 충전하였다. 반응물을 아르곤 하에 패딩한 다음, 195℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 유형 1 물 (150 mL)을 첨가하고, 혼합물을 초음파 처리하여 고체를 용해시켰다. 수용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 에틸 아세테이트를 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜, 생성물을 황색 고체 (2.8 mmol)로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00030
3. 아미노산의 제조
Figure 112012012167554-pct00031
변형된 페니실라민의 합성
Figure 112012012167554-pct00032
2000-mL 둥근-바닥 플라스크를 DL-페니실라민 (10 g) 및 아세톤 (1000 mL)으로 충전하였다. 모든 고체가 용해될 때까지 (대략 24 시간) 반응물을 환류시켰다. 반응 혼합물을 고온 상태에서 여과하고, 밤새 실온으로 냉각시켰다. 소량의 결정이 밤새 형성되었다. 반응 혼합물을 밤새 -20℃에서 유지시켰다. 생성된 고체를 흡인 여과에 의해 수집하고, 아세톤 (300 mL)으로 세척하였다. 티아졸 생성물을 아르곤 하에 건조시켰다 (11.9 g).
Figure 112012012167554-pct00033
250-mL 둥근-바닥 플라스크를 아르곤 하에 티아졸 산 (11.9 g) 및 포름산나트륨 (4.3 g)으로 충전하였다. 포름산 (98％, 100 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수 조에서 0℃로 냉각시켰다. 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 아세트산 무수물 (33.3 mL)을 45 분에 걸쳐 적가하였다. 빙수 조를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 35℃에서 제거하여, 백색 고체를 수득하였다. 고체를 유형 1 물 (200 mL) 중에서 교반하고, 흡인 여과에 의해 수집하였다. 고체를 유형 1 물 (100 mL)로 세척하고, 공기 건조시켰다 (7.4 g). 합한 여과물 및 세척물을 에틸 아세테이트 (3 x 300 mL)로 추출하였다. 추출물을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 농축시켜, 연황색 고체 (6.8 g)를 수득하였다. 1H NMR은 두 고체가 목적 화합물의 이성질체 혼합물 (대략 85:15)인 것으로 나타내었다.
Figure 112012012167554-pct00034
Figure 112012012167554-pct00035
둥근-바닥 플라스크를 포르밀화 티아졸 산 (1 당량), 트리에틸아민 (2 당량s) 및 CH2Cl2로 충전하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 빙수 조에서 아르곤 하에 교반하였다. 이소부틸클로로포르메이트 (1 당량)를 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후, 아미노 에스테르 (1 당량)를 첨가하였다. 빙수 조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 1.0 M HCl (75 mL), 5％ NaHCO3 (75 mL), 및 유형 1 물 (75 mL)로 세척하였다. 유기 층을 감압 하에 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (50:50 에틸 아세테이트:헥산)하여, 목적 생성물을 수득하였다 (60-70％ 수율). 1H NMR은 생성물의 이성질체 혼합물을 나타내었다.
Figure 112012012167554-pct00036
둥근-바닥 플라스크를 포르밀화 티아졸 에스테르, 및 디옥산:2.0 M HCl (50:50)로 충전하였다. 반응 혼합물을 85℃에서 아르곤 하에 밤새 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜, 변형된 페니실라민을 검 고체로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00037
메틸화 시스테인의 합성
Figure 112012012167554-pct00038
시스테인 메틸 에스테르 (8.6 g), 피발알데히드 (11 mL), 및 트리에틸아민 (8 mL)을 펜탄 중에서 교반하였다. 반응 혼합물을 환류시켰고, 그 동안 딘-스타크(Dean-Stark) 트랩을 통해 물을 제거하였다. 36 시간 후, 반응물을 실온으로 냉각시켰고, 고체가 형성되었다. 고체를 흡인 여과에 의해 수집하고, 에테르로 세척하였다.
100-mL 둥근-바닥 플라스크를 티아졸 에스테르 (4.0 g), 포름산 (98％, 30 mL) 및 포름산나트륨 (1.5 g)으로 충전하였다. 반응 혼합물을 아르곤 하에 교반하고, 빙수 조에서 0℃로 냉각시켰다. 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 아세트산 무수물 (5.7 mL)을 30 분에 걸쳐 적가하였다. 빙수 조를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 생성된 고체를 유형 1 물 (100 mL) 중에서 교반하였다. 고체 NaHCO3의 첨가에 의해 pH를 7-8로 조정하였다. 수용액을 에테르 (3 x 100 mL)로 추출하였다. 추출물을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 농축시켜, 고체를 수득하였다. 고체를 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정화하였다.
Figure 112012012167554-pct00039
-78℃에서 무수 THF (100 mL) 중 리튬 디이소프로필아민 (12 mmol)의 용액을 아르곤 하에 교반하였다. 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라히드로-2(1H)-피리미디논 (DMPU, 10 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 90 분 동안 교반하였다. 포르밀화 티아졸 에스테르 (10 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 -78℃에서 1 시간 동안 교반하였다. MeI (15 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 -78℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 드라이 아이스/아세톤 조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 염수에 녹였다. 수용액을 에테르 (100 mL)로 추출하였다. 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 농축시켜, 고체를 수득하였다. 고체를 10％ 에틸 아세테이트/헥산에 의해 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 1H NMR은 생성물의 부분입체이성질체 혼합물을 나타내었다.
Figure 112012012167554-pct00040
메틸화 티아졸 에스테르 (1.8 g) 및 5M HCl (30 mL)을 105℃에서 3 일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 수성 상을 감압 하에 농축시켜, 검 고체를 수득하였다.
4. 6-히드록시 루시페린 산의 제조
이는 기본 루시페린 구조의 제조를 위한 전형적인 절차이다.
Figure 112012012167554-pct00041
100-mL 둥근-바닥 플라스크를 시아노벤조티아졸 (0.5 mmol) 및 메탄올 (25 mL)로 충전하였다. 교반된 반응 혼합물을 1 시간 동안 아르곤으로 살포하였다. pH 9 (Na2CO3의 첨가에 의해 pH 조정)를 갖는 물 중 아미노산 (1 mmol)의 아르곤-살포된 용액을 제조하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 아르곤 하에 교반하였고, TLC는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응물을 감압 하에 대략 10 mL로 농축시키고, 유형 1 물 (40 mL)로 희석하였다. 수용액을 에틸 아세테이트 (3 x 75 mL)로 추출하고, 추출물을 따로 두었다. 수용액을 진한 HCl의 적가에 의해 pH 2로 조정하였다. 산성화된 수용액을 에틸 아세테이트 (3 x 75 mL)로 다시 추출하였다. 6개의 추출물을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜, 생성물을 고체로서 수득하였다 (40-90％ 수율).
Figure 112012012167554-pct00042
화합물 6J (L= NH2(CH2)5COOH)는 화합물 6H로부터 출발하여 세 단계로 제조하였다. 카르복실산 6H와 N-히드록시숙신이미드 및 DCC의 반응에 의해 NHS 에스테르 7H를 수득하였고, 이를 메틸 6-아미노헥사노에이트와 커플링시켰다. 생성된 메틸 에스테르를 염기에 의해 가수분해하여 6J를 수득하였다.
5. 루시페린 NHS 에스테르의 제조
Figure 112012012167554-pct00043
이는 루시페린 NHS 에스테르의 제조를 위한 전형적인 절차이다.
10-mL 둥근-바닥 플라스크를 아르곤으로 패딩하고, 루시페린 (0.3 mmol), N-히드록시숙신이미드 (0.3 mmol), 및 DCC (0.305 mmol)로 충전하였다. 무수 THF (4 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 적은 부피의 CH2Cl2를 첨가하였다. 백색 침전물이 형성되었고, 이를 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜, 검 고체를 수득하였다. 고체를 최소량의 THF에 용해시키고, 헥산을 첨가하여, 고체를 재형성하였다. 용매를 경사분리하였고, 상기 절차를 2회 더 반복하여, 생성물을 황색 고체로서 수득하였다 (60％ 수율).
Figure 112012012167554-pct00044
6. 루시페린 말레이미드 유도체의 제조
Figure 112012012167554-pct00045
루시페린 NHS 에스테르 (22 mg)를 무수 THF 중에서 교반하였다. N-(2-아미노에틸)말레이미드-트리플루오로아세트산 (13 mg)을 첨가한 후, 수성 NaHCO3를 첨가하였다. 혼합물을 4 시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 혼합물을 5 mL의 물에 용해시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 고체를 아세톤에 용해시키고, 헥산을 첨가하여 침전물이 생성되었고, 이를 공기 건조시켰다 (13 mg).
Figure 112012012167554-pct00046
형광 염료1 (7H)의 제조:
Figure 112012012167554-pct00047
형광 염료 1 (LD1; 7H)을 상기 기재된 합성 반응식을 이용하여 합성하였다. 간략히, 상기 기재된 방법을 이용하여 합성된 2-시아노-5,7-디클로로-6-히드록시벤조티아졸 (4A)을 상기에 상세히 기재된 조건 하에 D,L-페니실라민 (5C)과 반응시켜, 5,7-디클로로-6-히드록시 루시페린 산 (6H)을 수득하였다.
5,7-디클로로-6-히드록시 루시페린 NHS 에스테르의 합성의 경우, 디클로로-6-히드록시 루시페린 산 (6H)을 상기 기재된 바와 같이 DCC의 존재 하에 N-히드록시숙신이미드와 반응시켰다. 생성된 NHS 에스테르 (7H)를 상기 기재된 바와 같이 정제하고 NMR에 의해 특징분석하였다.
형광 염료2 (7J)의 제조:
Figure 112012012167554-pct00048
형광 염료 2 (LD2; 화합물 7J)를 상기에 상세히 기재된 조건 하에서 2-시아노-5,7-디클로로-6-히드록시벤조티아졸 (4A)을 화합물 5F와 반응시켜 5,7-디클로로-6-히드록시 루시페린 산 (6J)을 수득하는 것을 제외하고는, 상기 기재된 합성 반응식을 이용하여 합성하였다.
다음, 디클로로-6-히드록시 루시페린 산 (6J)을 상기 기재된 바와 같이 DCC의 존재 하에 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜 NHS 에스테르 (7J)를 수득하였고, 이를 상기 기재된 바와 같이 정제하고 NMR에 의해 분석하였다.
형광 염료3 (7C)의 제조:
Figure 112012012167554-pct00049
형광 염료 3 (LD3; 7C)을 2-시아노-5,7-디플루오로-6-히드록시벤조티아졸 (4B)을 상기에 상세히 기재된 조건 하에서 D,L-페니실라민 (5C)과 반응시켜 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 산 (6C)을 수득하는 것을 제외하고는, 상기 기재된 합성 반응식을 이용하여 합성하였다.
다음, 디플루오로-6-히드록시 루시페린 산 (6C)을 상기 기재된 바와 같이 DCC의 존재 하에 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 NHS 에스테르 (7C)를 수득하였고, 이를 상기 기재된 바와 같이 정제하고 NMR에 의해 분석하였다.
형광 염료4 (7B)의 제조:
Figure 112012012167554-pct00050
형광 염료 4 (LD4; 7B)를 2-시아노-5,7-디플루오로-6-히드록시벤조티아졸 (4B)을 상기에 상세히 기재된 조건 하에서 화합물 5B와 반응시켜 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 산 (6C)을 수득하는 것을 제외하고는, 상기 기재된 합성 반응식을 이용하여 합성하였다. 다음, 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 산 (6C)을 상기 기재된 바와 같이 DCC의 존재 하에 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 NHS 에스테르 (7C)를 수득하였고, 이를 상기 기재된 바와 같이 정제하고 NMR에 의해 분석하였다.
형광 염료5 (7E)의 제조
Figure 112012012167554-pct00051
형광 염료 5 (LD5; 7E)를 2-시아노-5,7-디플루오로-6-히드록시벤조티아졸 (4B)을 상기에 상세히 기재된 조건 하에서 화합물 5E와 반응시켜 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 산 (6E)을 수득하는 것을 제외하고는, 상기 기재된 합성 반응식을 이용하여 합성하였다. 다음, 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 산 (6E)을 상기 기재된 바와 같이 DCC의 존재 하에 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜, 5,7-디플루오로-6-히드록시 루시페린 NHS 에스테르 (7E)를 수득하였고, 이를 상기 기재된 바와 같이 정제하고 NMR에 의해 분석하였다.
형광 염료6 (9B)의 제조
Figure 112012012167554-pct00052
형광 염료 6 (LD6)을 하기 기재된 반응식을 이용하여 합성하였다.
Figure 112012012167554-pct00053
N-Boc-L-글루탐산 γ-t-부틸 에스테르 (4.3 g)를 0℃에서 CH2Cl2 중에서 교반하엿다. 트리에틸아민 (2 mL)을 시린지를 통해 첨가한 후, 에틸 클로로포르메이트 (1.4 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60 분 동안 교반하고, 여과하고, 고체를 무수 THF로 세척하였다. 여과물 및 세척물을 합하고, 첨가 깔때기로 옮겼다. 용액을 0℃에서 H2O 중 NaBH4의 교반된 용액 (20 mL)에 30 분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5 시간 동안 교반한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하였다. 용액을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (20:80 에틸 아세테이트:헥산)에 의해 생성물을 오일로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00054
아미노 알콜 (3.5 g)을 아르곤 패드 하에 0℃에서 피리딘 (25 mL) 중에서 교반하였다. 토실 클로라이드 (3.0 g)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 6 시간 동안 교반하였다.
용액을 실온으로 가온시키고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 생성된 고체를 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 용액을 포화 NaHCO3로 세척한 후, 염수로 세척하였다. 세척된 용액을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피에 의해 생성물을 오일로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00055
무수 DMF 중 토실레이트 에스테르 (3.9 g) 및 티오아세트산칼륨 (2.9 g)의 용액을 실온에서 3 일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (300 mL)로 희석하고, 염수 (3 x 100 mL)로 세척하였다. 세척된 용액을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (15:85 에틸 아세테이트:헥산)에 의해 생성물을 오일로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00056
티오아세테이트 (2.5 g)를 탈기된 6N HCl에서 105℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 농축시켜, 적색 오일을 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00057
Figure 112012012167554-pct00058
플라스크를 2-시아노-5,7-디플루오로-6-히드록시벤조티아졸 (110 mg) 및 메탄올 (25 mL)로 충전하였다. 교반된 반응 혼합물을 1 시간 동안 아르곤으로 살포하였다. pH 9 (Na2CO3의 첨가에 의해 pH 조정됨)를 갖는 물 중 아미노산 (300 mg)의 아르곤-살포된 용액을 제조하여, 3회 분량을 1 시간 간격으로 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응물을 감압 하에 대략 10 mL로 농축시키고, 유형 1 물 (40 mL)로 희석하였다. 수용액을 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하고, 추출물을 따로 두었다. 수용액을 진한 HCl의 적가에 의해 pH 2로 산성화시켰다. 산성화된 수용액을 에틸 아세테이트 (2 x 50 mL)로 다시 추출하였다. 두 추출물을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜, 생성물을 고체 (130 mg)로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00059
플라스크를 아르곤으로 패딩하고, 데옥소루시페린 산 (41 mg), N-히드록시숙신이미드 (15 mg), 및 DCC (26 mg)로 충전하였다. 무수 THF (4 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하여 고체를 제거하였다. 헥산을 침전된 고체에 첨가하고, 이를 흡인 여과에 의해 수집하였다. 고체를 THF에 재용해시키고, 헥산을 침전된 고체에 첨가하였다. 고체를 흡인 여과에 의해 수집하고, 공기 건조시켰다.
Figure 112012012167554-pct00060
데히드로루시페린 (10)의 제조.
Figure 112012012167554-pct00061
하기 반응 설명은 실시예 10A에 대한 것이며, 유사한 반응 조건이 10B의 경우에 이용되었다. 1H NMR 데이터는 두 경우에 대해 제공된다.
2-시아노-5,7-디클로로-6-히드록시벤조티아졸 (2.8 mmol)을 피리딘 (20 mL) 및 트리에틸아민 (0.3 mL) 중에서 교반하였다. 황화수소를 4.5 시간 동안 용액을 통해 버블링하였다. 황화수소의 첨가를 멈추고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 스트립핑하고, 생성된 고체를 메탄올로부터 재결정화하였다.
Figure 112012012167554-pct00062
상기로부터의 벤조티아졸 생성물 (55 mg)을 메탄올 (5 mL)에 현탁시켰다. 에틸 브로모피루베이트 (100 mg)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 7 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰고, 고체가 형성되었다. 고체를 흡인 여과에 의해 수집하고, 메탄올로 세척하고, 공기 건조시켰다 (35 mg).
Figure 112012012167554-pct00063
데히드로루시페린 에틸 에스테르 (30 mg)를 메탄올 및 1N NaOH에 현탁시켰다. 반응물을 실온에서 2 일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N HCl에 의해 pH 2로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 (2 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜, 생성물을 고체로서 수득하였다.
Figure 112012012167554-pct00064
8. 5-클로로-4-히드록시 루시페린 산 (11A) 및 NHS 에스테르 (11B)의 제조
Figure 112012012167554-pct00065
4-히드록시 루시페린 산 및 NHS 에스테르에 대한 합성 경로는 6-히드록시 루시페린 산 및 NHS 에스테르의 제조에 이용된 합성 경로와 동일하다. NMR 데이터는 상기 화합물에 대해 제공된다.
Figure 112012012167554-pct00066
9. 6-클로로-5-히드록시 루시페린 산 (12D)의 제조
Figure 112012012167554-pct00067
5-히드록시 루시페린 산에 대한 합성 경로는 6-히드록시 루시페린 산의 제조에 이용된 합성 경로와 동일하다. NMR 데이터는 상기 화합물에 대해 제공된다.
Figure 112012012167554-pct00068
10. 5,7-디메틸-6-히드록시 디메틸 루시페린 산 (13E)의 제조
Figure 112012012167554-pct00069
5,7-디메틸-6-히드록시 디메틸 루시페린 산에 대한 합성 경로는 6-히드록시 루시페린 산의 제조에 이용된 합성 경로와 동일하다. NMR 데이터는 상기 화합물에 대해 제공된다.
Figure 112012012167554-pct00070
11. 트리플루오로메틸-치환된 루시페린 산 (14E) 및 NHS 에스테르 (형광 염료7; 14F)의 제조
Figure 112012012167554-pct00071
트리플루오로메틸-치환된 루시페린 산 및 NHS 에스테르에 대한 합성 경로는 6-히드록시 루시페린 산 및 NHS 에스테르에 이용된 합성 경로와 동일하다. NMR 데이터는 상기 화합물에 대해 제공된다.
Figure 112012012167554-pct00072
루시페린 화합물의 형광 측정
형광 측정 실험은 호리바 조빈 이본 플루오로맥스-3(HORIBA Jobin Yvon Fluoromax®-3) 분광측정계 상에서 수행되었다. 전형적으로, 달리 나타내지 않는 한 여기 파장은 405 nm로 설정되었다. 여기 및 방출 슬릿은 1 nm이었다. 25 mM 트리스 pH 8.0 완충제 중 20 μM의 염료의 용액을 이용하여, 표 6에 도시된 최대 방출 파장에서 형광 스펙트럼을 수득하고 강도를 측정하엿다.
<표 6>
Figure 112012012167554-pct00073
실시예 2
하기 실시예는 항체 분자에 본 발명의 형광 염료를 접합시키는 방법을 기재한다.
전형적 실험에서, 루시페린 유도체의 항체 접합체는 다음과 같이 제조된다. 관심 항체를 4 mg/ml로 50 mM 보레이트 pH 9.0 완충제 중에서 제조하였다. 염료 시약은 5 mg/ml의 농도를 제공하도록 무수 DMSO에 용해시켰다. DMSO 중 염료의 사전 결정된 양을 혼합하면서 항체 용액에 천천히 첨가하였다. 반응물을 실온에 60분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, PBS, 2 mM EDTA 중 글리실 글리신 (사용된 염료에 대해 200 몰 과량) 용액을 75 mg/ml로 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 염료-항체 접합체를 PBS 중에서 평형화된 세파덱스(Sephadex) G-50 칼럼 상에서 탈염화에 의해 분리하였다. 용리를 280 nm 흡광도에 대해 모니터링하였고, 밴드를 함유하는 항체를 칼럼으로부터 수집하였다. 치환 정도 (F/P 값)는 280 nm에서 및 염료 피크의 최대 흡수에서 염료-접합체에 대한 흡광도 값을 측정함으로써 결정하였다. 치환 정도는 표 7에 도시된 바와 같이 접합에 사용되는 염료에 대한 흡광 계수를 이용하여 계산되었다.
<표 7>
Figure 112012012167554-pct00074
하기 표 (표 8)는 본 발명의 6가지 염료와 대표적인 항체의 다양한 접합체에 대한 데이터를 제공한다.
<표 8>
Figure 112012012167554-pct00075
실시예 3:
하기 실시예는 유동 세포측정법에서 항체-염료 접합체를 사용하는 방법을 제공한다.
유동 분석
본 발명의 항체-염료 접합체의 다양한 조성물의 최적량 (적정에 의해 별도로 결정됨)을 독립적으로 전혈 (0.1 mL)을 함유하는 생물학적 시편과 합하고, 10-15 분 동안 인큐베이션하고, 베르사라이즈(VersaLyse™) 용해 시약을 이용하는 표준 절차를 이용하여 가공하고, 유동 세포측정기를 이용하여 분석하였다.
간략하게, 처리된 생물학적 시편을 베르사라이즈™ 시약/0.2％ 포름알데히드 (1 mL)와 10 분 동안 합하고, 처리된 시편을 회전시키고, 상청액을 흡인시키고, 펠릿을 PBS (2 mL)에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 회전시키고, 분석을 위해 펠릿을 PBS/0.1％ 포름알데히드 (1 mL)에 재현탁시켰다. 림프구 집단을 전방향 및 측방향 산란 특성에 기반하여 유동 세포측정법에 의해 선택하였다. 하위 집단을 특이적 모노클로날 항체를 이용하여 확인하였다. 형광 신호를 접합체의 형광 방출 스펙트럼에 기반하여 선택된 적절한 밴드 통과 필터를 사용하여 수집하였다.
유사하게, 항체-퍼시픽 오렌지(Pacific Orange™) 접합체를 평가하였다. 선택된 경우에서, 다양한 루시페린 유도체 염료-항체 접합체의 유동 데이터 결과를 상응하는 항체-퍼시픽 오렌지 염료-접합체와 비교하였다. 하기 표는 이러한 결과를 요약한다 (표 9). 항체-본 발명의 형광 염료의 접합체는 항체-퍼시픽 오렌지 접합체와 비교하여 우수한 신호/잡음 값을 나타내었다.
<표 9>
Figure 112012012167554-pct00076
2-컬러 유동 분석:
선택된 경우에서, 405 nm 레이저 라인, CD8-퍼시픽 블루(Pacific Blue™) 염료-접합체 및 본 발명의 CD4-루시페린 유도체 염료를 사용하여, 2-컬러 유동 분석을 유사하게 수행하였다. 결과를 CD8-퍼시픽 블루 염료 접합체 및 CD4-퍼시픽 오렌지 염료 (인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation))에 대한 상응하는 성능과 비교하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 항체-염료2 접합체는 항체-퍼시픽 오렌지™ 접합체에 비해 더 밝은 신호를 나타내었다.
멀티컬러 유동 분석:
본 발명의 염료 중 하나 (염료3)에 대해, 10-컬러 적용을 또한 405 nm 레이저, 488 nm 레이저 및 635 nm 레이저를 구비한 3 레이저 10 컬러 PMT 기기 상에서 증명하였다. 550/40 nm 밴드 통과 필터를 사용하여 포토멀티플라이어 튜브 내로 형광 출력을 수집하였다. 하기 항체 시약을 사용하였다:
1. CD45 (RA)-FITC
2. CD56-PE
3. CD45(RO)-ECD
4. CD25-PC5
5. CD19-PC7
6. CD3-APC
7. CD27-APCA700
8. CD5-APCCy7
9. CD8-퍼시픽 블루
10. CD4-퍼시픽 오렌지/CD4-염료3.
도 5에 도시된 히스토그램은 10-컬러 유동 검정에서 CD4-염료3 접합체가 CD4-퍼시픽 오렌지 접합체에 비해 더 밝은 신호를 제공함을 설명한다.

Claims (24)

  1. 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00112

    상기 식에서,
    X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
    Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이고;
    여기서, 각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
    Z1은 H 또는 알킬이고;
    여기서, W 기 중 하나 및 Z1은 부재할 수 있고, 부재하는 경우 이는 고리 C에서 C4와 C5 사이의 추가의 결합으로 대체되고;
    L은 독립적으로 결합 또는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함하고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고; 및
    RG는 반응성 기이고, 여기서 RG는
    Figure 112017087975121-pct00113
    ,
    Figure 112017087975121-pct00114
    ,
    Figure 112017087975121-pct00115
    , -C(O)Cl, -C(O)N=N+=N-, -C(O)-할라이드, -C(O)H, -OC(O)Cl, -NH-NH2, -N=C(O), -N=C=S, -SO2-할라이드,
    Figure 112017087975121-pct00116
    ,
    Figure 112017087975121-pct00117
    ,
    Figure 112017087975121-pct00118
    , 및
    Figure 112017087975121-pct00119
    로 이루어진 군으로부터 선택된 반응성 기를 포함하는 것이다.
  2. 제1항에 있어서, 연결기가 화학식 R1C(O)R2 (여기서, R1은 결합, 또는 염료에 부착되는 (CH2)n이고 (여기서 n은 1 내지 10), C(O)는 카르보닐 기이고, R2는 카르보닐 기를 반응성 기 RG에 부착시키는 결합임); 또는 R1C(O)A1R3C(O)R2 (여기서, R1은 결합 또는 (CH2)n이고 (여기서 n은 1 내지 10), C(O)는 카르보닐 기이고, A1은 NH, S 또는 O이고, R3은 (CH2)n (여기서 n은 1 내지 10), 1개 이상의 불포화 결합을 갖는 5 또는 6원 고리, 또는 (CH2)n (여기서 n은 1 내지 10)과 5 또는 6원 고리의 조합이고, R2는 말단 카르보닐 기를 반응성 기 RG에 부착시키는 결합임)를 포함하는 것인 형광 염료.
  3. 제1항에 있어서, RG가
    Figure 112017087975121-pct00120
    , -NH-NH2, -N=C=S, 또는
    Figure 112017087975121-pct00121
    를 포함하는 것인 형광 염료.
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00122

    상기 식에서,
    R은 숙신이미드옥시, NH(CH2)nCO-숙신이미드 또는 NH(CH2)n-말레이미드를 나타내고, 여기서 n은 1 내지 10이다.
  5. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00123
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00124

    상기 식에서,
    R은 숙신이미드옥시, NH(CH2)nCO-숙신이미드 또는 NH(CH2)n-말레이미드를 나타내고, 여기서 n은 1 내지 10이다.
  7. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00125
  8. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00126
  9. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00127
  10. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00128

    상기 식에서,
    R은 숙신이미드옥시, NH(CH2)nCO-숙신이미드 또는 NH(CH2)n-말레이미드를 나타내고, 여기서 n은 1 내지 10이다.
  11. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 형광 염료.
    Figure 112017087975121-pct00129

    상기 식에서,
    X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
    Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이고;
    W는 H 또는 알킬이고;
    L은 독립적으로 결합 또는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함하고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고; 및
    RG는
    Figure 112017087975121-pct00130
    ,
    Figure 112017087975121-pct00131
    ,
    Figure 112017087975121-pct00132
    , -C(O)Cl, -C(O)N=N+=N-, -C(O)-할라이드, -C(O)H, -OC(O)Cl, -NH-NH2, -N=C(O), -N=C=S, -SO2-할라이드,
    Figure 112017087975121-pct00133
    ,
    Figure 112017087975121-pct00134
    ,
    Figure 112017087975121-pct00135
    , 및
    Figure 112017087975121-pct00136
    로 이루어진 군으로부터 선택된 반응성 기이다.
  12. 제1항에 있어서, 340 nm 내지 450 nm의 파장에서 여기될 수 있는 형광 염료.
  13. 하기 화학식을 갖는 염료-접합체.
    Figure 112017087975121-pct00137

    상기 식에서,
    X1 및 X2는 독립적으로 S 또는 O이고;
    Y1 및 Y2는 개별적으로 할로겐을 나타내고;
    여기서, 각각의 W는 독립적으로 H 또는 알킬이고;
    Z1은 H 또는 알킬이고;
    여기서, W 기 중 하나 및 Z1은 부재할 수 있고, 부재하는 경우 이는 고리 C에서 C4와 C5 사이의 추가의 결합으로 대체되고;
    L은 독립적으로 결합 또는 연결기이고, 여기서 연결기는 C, N, O, S, P 및 할로겐 원자로부터 선택된 1 내지 50개의 비-수소 원자를 포함하는 공유 연결을 포함하고, 임의의 조합의 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 질소-질소 결합으로 구성되고; 및
    CM은 펩티드, 단백질, 폴리사카라이드, 효소, 지질, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 접합된 분자이다.
  14. 제13항에 있어서, 접합된 분자가 펩티드 또는 단백질인 염료-접합체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 접합된 분자가 항체 또는 항체의 단편인 염료-접합체.
  16. a) 특이적 결합 쌍의 상보적 구성원에 특이적으로 결합하는 제13항 또는 제14항의 염료-접합체를 샘플과 혼합하는 단계; 및
    b) 상기 혼합에 의해 형성된 복합체를 검출하여, 상보적 구성원을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플에서 특이적 결합 쌍의 상보적 구성원을 검출하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상보적 구성원이 단백질 또는 펩티드인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상보적 구성원이 박테리아, 바이러스 또는 동물 세포에 존재하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 복합체를 그의 형광 반응에 의해 검출하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 형광 반응을 유동 세포측정기, 형광계, 형광 현미경 또는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 검출하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 형광 반응을 검출가능하게 상이한 광학 특성을 갖는 제2 형광단의 형광 반응과 구별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 형광 반응을 기반으로 하여 상기 복합체를 다른 샘플 구성성분으로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure 112017087975121-pct00138

    상기 식에서,
    Y1 및 Y2는 독립적으로 할로겐이거나, 또는 Y1 또는 Y2 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로알킬 기이다.
  24. 삭제
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