JP2001510190A - 蛍光ジベンザゾール誘導体及びこれに関連する方法 - Google Patents

蛍光ジベンザゾール誘導体及びこれに関連する方法

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Abstract

(57)【要約】 一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示される構造を有するジベンザゾール化合物。 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は独立してＨ又は化合物の溶解性を補助するか、又は化合物を別部分に結合するリンカーアームを提供する置換基であり、ＹはＨ又は切断可能な部分であり、Ｘは水素、ハロゲン、ＣＦ3又はＳＯ3Ｈであり、Ｖ及びＷは酸素又はイオウであり、Ｚは−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ−又は芳香族環部分であり、ｎは０、１又は２である）ｎ＝０のとき、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の中の少なくとも１つは化合物の溶解性を補助する又は化合物を別の部分に結合するリンカーアームを提供する置換基であり、又はＸはハロゲン、ＣＦ3又はＳＯ3Ｈである。これらの化合物は高い蛍光性を有し、蛍光計を使用して容易に検出することができる。Ｙ基がＨ以外の置換基である誘導体は、除去されたときに化合物の蛍光を回復する蛍光阻害性化学部分を含んでいる。これらの合成方法及び応用が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の属する技術分野 本発明は、蛍光化合物及び蛍光を基本とする基質並びに生物学的アッセイ分野
におけるこれらの使用に関する。
【０００２】 発明の背景 蛍光は、与えられたエネルギー（波長）の光の吸収を経た分子の電子状態の励
起、続く特定の電子過程を経た基底状態、これにより生じる低エネルギー（低波
長）の光の発光に関連する特定の化学物質が示す性質である。この性質は、生物
学的及びその他の種類の分析物の高感度検出を含む種々の応用に利用されてきた
。
【０００３】 この現象の１つの一般的な応用は、化学的部分（chemical moiety）を有する 蛍光化合物（フルオロホア（fluorophore））を誘導体化することにより製造さ れる人工酵素基質を使用しての、対応の酵素の存在の検出において見いだされる
。成功した応用は、基質が下記のいくつかの特徴を有していることを要求する。
【０００４】 ・アッセイ条件下において、未反応の基質に由来するバックグラウンドの蛍光を
ほとんど示さないこと又は全く示さないこと。
【０００５】 ・種々の水性環境及びｐＨ範囲、典型的には酵素アッセイに用いる条件下で、化
学的に安定であること。
【０００６】 ・標的酵素により触媒される反応時に、高い蛍光性の生成物を放出すること。
【０００７】 ・有用なアッセイ時間を許容するのに十分なターンオーバー数（変換した基質分
子数／秒／酵素分子）を示すこと。
【０００８】 ・０次反応の達成を許容する、水性溶液中における十分な溶解性を有すること。
すなわち、反応速度と酵素濃度との直接相関を許容すること。
【０００９】 ・酵素濃度のいくつかの大きさの次数（several orders of magnitude）におい て、直線的な動力学を示すこと（概要は、A. Lehninger, D. Nelson及びM. Cox,
Principles of Biochemistry, New York, Worth Publishers, 1993を参照）。
【００１０】 人工基質の使用により、疾患の診断について定量的に測定される多数の酵素の
中の一つの例は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）ＥＣ３．１．３．１である
。この存在は、肝胆道系疾患の有用な指標となる（Mass, "Alkaline Phosphatas
e Isoenzymes", Clin. Chem. 28: 2007-2016, 1982）。更にＡＬＰは、ミルクの
低温殺菌の完了を評価するために測定されてきた（Rocco, Anal. Chem., 73(6):
842-849）。
【００１１】 更に、酵素に直接関連することができる全ての分析物を検出することができる
。例えば、酵素は、生物学的サンプルに存在する特定の生物学的分子を標的とす
るポリクローナル又はモノクローナル抗体に化学的にコンジュゲートすることが
できる。問題となる分析物は、しばしば、タンパク質又は疾患状態に直接結合す
るその他の化学物質である。一般的技術は、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ
）と称される。特に蛍光を利用するＥＩＡの広範囲の概説は、Ilkka A. Hemmila
, Applications of Fluorescence in Immunoassays, John Wiley & Sons, Inc.,
New York, 1991に示されている。
【００１２】 アルカリホスファターゼ（R.H. Yolken及びP.J. Stopa, J. Clin. Microbiol.
10:317, 1979）及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Hosliら, Clin. Chem., 24:13
25, 1978）を含むいくつかの酵素が、蛍光を基本とするＥＩＡ応用において広範
囲の使用を見いだしてきた。蛍光を基本とするＥＩＡを利用する推進力は、比色
法と比較して１００倍又はそれ以上の感度の改善である（Ishikawaら, "Methods
for Enzyme-labeling of Antigens, Antibodies, and Their Fragments", T. T
. Ngo, Ed., Non-Isotopic Immunoassay, Plenum Press, New York, 1988）。
【００１３】 これら同一の酵素を、その他の分子、例えばＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオ
チドに結合し、蛍光が再び生成するハイブリダイゼーションを基本とする検出ア
ッセイに使用することができる。一例は、ハイブリダイゼーション技術によるナ
イセリア・ゴノロエエ（Neiseseria gonorrhoeae）の検出における、蛍光基質（
アトホス（Attophos））のＡＬＰへの使用（アルカリホスファターゼ−ストレプ
トアビジンコンジュゲートを経て組み込む）である（Canoら, Eur. J. Clin. Mi
crobiol. Infect. Dis. 11(7): 602-609, 1992）。別の応用においては、アルカ
リフォスファターゼを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によるＨＩＶ−１
ゲノムの検出に使用する。ここでは、再びアルカリフォスファターゼ−ストレプ
トアビジンコンジュゲートを使用する（Gerardら, "Fluorometric detection of
HIV-1 genome through use of an internal control, inosine-substituted pr
imers, and microtiter plate format", Clinical Chemistry 42(5): 696-703(1
996)）。
【００１４】 蛍光化合物の第二の主要な応用は、検出系におけるある成分の直接標識におけ
る使用である。一つの重要な応用は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（
ＦＩＳＨ）として知られる技術である（Baumanら, "A new method for fluoresc
ence microscopical localization of specific DNA sequence by in situ hybr
idization of fluorochrome-labeled RNA", Exp. Cell Res., 138: 485-90, 198
0）。この技術においては、特定の遺伝子標的に対するＤＮＡ又はＲＮＡプロー ブをフルオロホアで標識し、サンプルと混合する。プローブが特定の配列とハイ
ブリダイズするとき、結合した蛍光標識の発光により、標的の存在が検出される
。多標的ＦＩＳＨは、複数の蛍光プローブを使用することにより達成することが
できる（Foxら, "Fluorescence in situ hybridization: powerful molecular t
ool for cancer prognosis", Clin. Chem. 41(11): 1554-1559, 1995）。
【００１５】 直接標識についての別の応用は、ＤＮＡ配列決定における使用のためのＰＣＲ
技術と関連するプライマーを製造するための、フルオロホア標識ジデオキシヌク
レオチドトリホスフェートの使用である。一つの典型的な応用においては、使用
するフルオロホアはフルオレセインであった（Pastinenら, "Multiplex, fluore
scent, solid-phase minisequencing for efficient screening of DNA sequenc
e variation", Clin. Chem. 42(9): 1391-1397, 1996）。
【００１６】 検出試薬に直接組み込むか又は酵素基質を介して間接的に用いるフルオロホア
の性質は、高感度及び／又は迅速な分析の達成に対して重要である。これらの性
質のいくつかは、Hemmila, 前出, p. 109に要約されており、下記のものが含ま れる。
【００１７】 ・高い相対蛍光（［ε×Ｑ］＞１００００。式中、εはフルオロホアに対するモ
ル吸光定数であり、Ｑは量子収量（吸収された光子に対する発光した光子の比）
である）。
【００１８】 ・スペクトル分解能：ストークスシフト（最大励起の波長と最大発光の波長との
間の差異）が大きく、したがって、光の励起ビームと関連するバックグラウンド
ノイズを回避すること。
【００１９】 ・光安定性（光脱色過程を最小化するため）。
【００２０】 ・結合の容易性及び小さいサイズ（標識試薬、例えば抗体又はオリゴヌクレオチ
ドの反応性を維持するため）。
【００２１】 特定の応用におけるフルオロホアの有用性に有意な価値を加える更なる性質は
下記の通りである。
【００２２】 ・近年導入されたレーザー出力付近の励起波長。より広範に使用されているもの
の一つはアルゴン４８８ｎｍレーザー。狭い帯域の出力を有するレーザーの使用
は、全スペクトルランプの使用と比較して、生物学的サンプルに存在する種々の
その他の物質の励起によるバックグラウンドノイズを実質的に減少させる。更に
、レーザーの高強度ビームは、多くの光子を小容積に供給（pump）することがで
きるので、利用可能な全てのフルオロホアを最大限に励起することにより測定感
度を増強することができる。両方の性質はアッセイ感度の増強に寄与する。
【００２３】 ・生物学的サンプル中のその他のソースにより引き起こされる妨害バックグラウ
ンド（水に対する強力なラマン発光（６０５〜６３５ｎｍ）、血漿及び血清サン
プル中の内在性蛍光成分（６００ｎｍまで拡がる）を含む。特に血清サンプルに
ついては４３０〜５４０ｎｍの強放射帯域を有する。Hemmila, 前出, p.63-6。 ）を減少させる長波長（＞５４０）の蛍光発光。
【００２４】 ・構造の調整による複数の発光波長の利用可能性。
【００２５】 ・環境（例えば、ｐＨ）の指標となる蛍光レベルを引き起こす、フルオロホア内
の部分の存在。
【００２６】 ・生理学的条件下（例えば、ｐＨ６〜８）における蛍光の完全な発達。
【００２７】 ・フルオロホアの溶解性を調節する能力（沈殿を要求する応用については低い溶
解性。均一溶液の測定を含む応用においては高い溶解性）。
【００２８】 多数のフルオロホアが既知であり、近年、多数のものが種々の応用における使
用に導入されている。しかしながら、「所望の性質を有する新規蛍光化合物」の
開発は、蛍光過程の複雑性により妨げられてきている。現在利用可能なデータは
、分子構造と蛍光との間の関係に関して一般化を定義することを許容するには十
分ではない（Hemmila, Applications of Fluorescence in Immunoassays, John
Wiley & Sons, Inc. 1991, volume 117, p.109）。GuilbaultはHemmilaの結論を
支持し、巨大分子の電子分光学は非常に複雑であるので、経験的な一般化又は基
本理論論争は、複雑な分子の蛍光特性の予想を可能にすることについて必ずしも
信頼できるものではないことを述べている（Guibault, Practical Fluorescence
, Marcel Dekker, Inc., 2d ed., Revised and Expanded, 1990）。それゆえ、 現在利用可能ないくつかの代表的フルオロホアの概説は、下記の検討に示される
ように１以上の好ましい性質において有意な欠点を示すことは驚くべきことでは
ない。
【００２９】 ４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は、酵素基質としての使用における
最も古いフルオロホアの１つである（Yolken及びStopa,前出）。これの蛍光特性
は、３６７ｎｍのλEX、４４９ｎｍのλEM及び８２ｎｍのストークスシフト（λ EX 及びλEMはそれぞれ、最大励起及び発光の波長を示す）を含んでいる。残念な
がら、このλEMは短すぎるので、生物学的サンプル中のバックグラウンド妨害に
由来する有意な妨害を回避することができない。これを直接標識に転換する手段
は存在しない。また、これはアルゴン４８８ラインにより効率的に励起すること
ができず、ＵＶ光を用いた効率的な励起は高価な石英レンズを必要とする。
【００３０】 フルオレセインは、４９２ｎｍのλEX及び５２０ｎｍのλEM（２８ｎｍのスト
ークスシフト）を有する広範囲に使用されるフルオロホアである（Hemmila, 前 出, p112）。フルオレセインは高い量子収量を有し、アルゴンレーザーにより効
率的に励起される。しかし、ストークスシフトは極めて小さい。更にλEMが非常
に短いので、典型的な生物学的サンプルにおけるいくらかのバックグランド妨害
を回避することができない。ガラクトシド及び類似の基質誘導体を可溶化し、前
記誘導体を実用的にするフルオレセイン分子上の官能基は存在しない。最後に、
フルオレセインは極めて感光性であり、フルオロホアを多数の応用において使用
することを困難にしていることが知られている。
【００３１】 ローダミン（ＴＲＩＴＣ）は、５４０ｎｍのλEX及び５７５ｎｍのλEM（３５
ｎｍのストークスシフト）を有する広範囲に使用されるフルオロホアである（He
mmilra, 前出）。この発光波長は最大のバックグラウンド源よりも長いが、スト
ークスシフトは極めて小さい。更に、酵素基質製造用に誘導体化することができ
る官能基を有していない。
【００３２】 近年導入されたシアニン色素であるＣｙ２（Southwickら、Cytometry II: 418
, 1990）は４８９ｎｍのλEX及び５０６ｎｍのλEM（１８ｎｍのストークスシフ
ト）を有している。このフルオロホアのλEMは、アルゴンレーザーを用いた使用
に最適であるが、ストークスシフトは極めて小さい。更にＣｙ２は、フルオロホ
アを酵素基質へ転換する部分を有していない。
【００３３】 ２’−（２−ベンゾチアゾリル）−６’−ヒドロキシ−ベンゾチアゾール（Ｂ
ＢＴ）は、４１９ｎｍのλEX、５６１ｎｍのλEM及び１４２ｎｍのストークスシ
フトを有する（米国特許明細書第５，４２４，４４０号明細書。参照することに
より本明細書に組み込まれる）。ジベンゾチアゾール誘導体であるＢＢＴは、フ
ルオロホアとして望ましい性質をいくつか有する。これは非常に大きいストーク
スシフト（１４２ｎｍ）及び酵素基質、例えばホスフェート（AttoPhos（登録商
標）, JBL Scientific Inc., San Luis Obispo, CA）への転換のハンドル（hand
le）として役立つ部分（フェノール性ヒドロキシル基）を有する。しかしながら
、この物質は多数の有意な欠点を有する。第一に、λEXが短すぎるので、アルゴ
ン４８８ｎｍレーザーにより最大限に励起することができない。第二に、λEMが
、血清サンプル中に存在する前記の最も強いバックグラウンド蛍光になるには十
分に長い（５６１ｎｍ）が、短すぎるので、５４０〜５８０ｎｍの帯域における
弱いバックグラウンド妨害のいくつかにはなることができない（Hemmila, 前出,
p.65）。第三に、いくつかの重要な酵素、例えばガラクトシダーゼ、エステラ ーゼ及びリパーゼ等に特異的な基質として役立つことができるＢＢＴの誘導体は
実用的価値がない。なぜなら、得られる化合物極めて制限された溶解性（例えば
、ＢＢＴのガラクトシドに対する１ｍＭよりはるかに低い値は、広範囲の酵素濃
度における０次反応の達成を不可能にする）のためである。第四に、ＢＢＴは、
アルカリフォスファターゼ誘導体（AttoPhos（登録商標））としての使用に適切
なフルオロホアであることである。なぜなら、ｐＫａが８．５であり、十分にイ
オン化されるため、ＡＬＰアッセイに典型的に用いられるｐＨ（ｐＨ１０．３）
下で十分に蛍光性であるからである。しかしながら、多数の酵素用、例えばＤ−
ガラクトシダーゼ、エステラーゼ及びリパーゼ等のアッセイは、好ましくは６．
０〜８．０のｐＨ範囲で行われる。このｐＨ範囲において、ＢＢＴは一部がイオ
ン化するだけで、蛍光は極めて小さい。このことが、このタイプの応用における
ＢＢＴ使用の更なる障壁である。第五に、ＢＢＴを直接標識として使用すること
ができる手段が存在しない。なぜなら、利用可能な唯一の官能基はフェノール性
ヒドロキシル部分であり、これの誘導体化は５６０ｎｍにおける蛍光を妨げるか
らである。最後に、ＢＢＴは、唯一の特別の波長を導入したフルオロホアであり
、追加の波長をどのように達成するかということの表示は存在しない。２以上の
標的を同時検出を含み、２以上のフルオロホアの利用可能性を要求するいくつか
の興味深い応用が存在する。
【００３４】 ２−フェニル−６−ヒドロキシベンゾキサゾール（Habenstein, 米国特許第５
，５８５，２４７号明細書）は、３７０ｎｍのλEX及び４６０ｎｍのλEM及び１
１０ｎｍのストークスシフトを有する。この物質は有用なストークスシフト（１
１０ｎｍ）よりも大きいが、アルゴンレーザーではなくＵＶ光により最適に励起
されるベンゾオキサゾール誘導体である。発光は、典型的な生物学的サンプルの
妨害バックグラウンド蛍光を避けるのに十分に長くはない。更に、溶解性及び蛍
光のｐＨに対する依存性に作用する手段は存在しない。したがって、このフルオ
ロホアから製造した誘導体は、リパーゼ、エステラーゼ及び糖分解酵素の測定と
しての応用についての基質としては制限された実用性を有する。更に、このフル
オロホアを直接標識として利用する手段は存在しない。
【００３５】 発明の要約 本発明の１つの側面において、蛍光ジベンザゾール化合物（ベンゾチアゾール
及びベンゾオキサゾール）は下記の構造を有する。
【００３６】
【００３７】 及び
【００３８】
【００３９】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は独立して−Ｈ又は化合物の溶解性を
補助するか、又は化合物を別部分に結合するリンカーアーム（linker arm）を提
供する置換基であり、
【００４０】 ＹはＨ又は切断可能な部分であり、
【００４１】 Ｘは独立して水素、ハロゲン、−ＣＦ3又は−ＳＯ3Ｈであり、
【００４２】 Ｖ及びＷは独立して酸素又はイオウであり、
【００４３】 Ｚは−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ−又は芳香族環部分であり、
【００４４】 ｎは０、１又は２である）
【００４５】 好ましくは、ｎ＝０のとき、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の中の少なくとも１ つは化合物の溶解性を補助する又は化合物を別の部分に結合するリンカーアーム
を提供する置換基であり及び／又はＸはハロゲン、−ＣＦ3又は−ＳＯ3Ｈである
。
【００４６】 特に、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5又はＲ6は独立してＨ又は溶解性を補助する置
換基、例えば−ＳＯ3、−ＣＯ2又は−ＰＯ4 -2である。溶解性を補助する置換基 が−ＰＯ4 -2である場合、Ｙは好ましくはホスホリルではない。１つの好ましい 態様において、Ｒ1及びＲ2又はＲ2及びＲ3又はＲ3及びＲ4は一緒になって芳香族
環、例えばベンゼン又はナフタレンを形成する。別の好ましい態様において、Ｒ 1 、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の中の少なくとも１つは−ＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3Ｈである。
別の好ましい態様において、Ｒ5は水素である。
【００４７】 別の好ましい態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4の内の少なくとも１つは式
：−（ＣＨ2）n−Ｒ10（式中、ｎは０、１、２、３、４及び５から選ばれる値で
あり、かつ各場合（occurrence）において独立して選ばれ、Ｒ10は−ＯＨ、−Ｓ
Ｏ3Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）mＲ11、−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ2ＣＨ 2 ＣＮ）（Ｎ（Ｒ9）2）、
【００４８】
【００４９】 （式中、Ｒ11は、−ＯＨ、ＳＯ3Ｈ及び−ＣＯＯＨの中から選ばれ、ｍは１、２ 、３、４及び５から選ばれる値であり、Ｒ9はＣ1−Ｃ6のアルキル基であり、Ｂ はプリン又はピリミジン部分であり、各変数は各場合において独立して選ばれる
）の中から選ばれる。
【００５０】 Ｙは、−Ｈ、ホスホリル、例えば−ＰＯ3Ｈ2、グリコシル部分、例えばガラク
トシル、グルコシル又はグルコロノイル（glucoronoyl）、炭素数約１２〜２４ の直鎖脂肪酸、例えばＲ8−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、Ｒ8は炭素数１２〜約２４の直
鎖又は分岐したアルキル又はアルケニル基、好ましくは炭素数約１６〜約２４の
直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニル基、最も好ましくは炭素数約１６〜約
２０の直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニル基、例えばオレオイルである）
、又は炭素数１〜約１２の短鎖脂肪酸、例えばＲ7−Ｃ（＝Ｏ）（式中、Ｒ7は炭
素数１〜約１０の直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニル基、例えばラウロイ
ル及びヘプタノイル、好ましくは炭素数１〜約５の直鎖又は分岐したアルキル又
はアルキレン基、例えばプロピオニル又はイソ−ブチリルである）。
【００５１】 特に好ましいジベンザゾール化合物には、図１及び２に示される構造を有する
化合物が含まれる。
【００５２】 更に本発明は、新規蛍光化合物の応用を含んでいる。
【００５３】 好ましい態様の詳細な説明 明細書の理解を助けるために、本明細書で使用する用語の意味を下記に示す。
これらは、別言のない限り前記の意味を有する。
【００５４】 「サンプル」とは、生物学的ソースから取り除いた液体のアリコート（例えば
、血液、血清、血漿、尿、細胞、細胞抽出物であるが、これらに限定されない）
又は非生物学的ソースから得た液体のアリコート（例えば、化学反応生成物又は
生物由来材料、例えば酵素及び抗体とコンジュゲート又は複合（complex）した 化学物質であるが、これらに限定されない）を意味する。
【００５５】 「薬剤（agent）」とは、分析の標的となるサンプルの成分を意味し、例えば タンパク質、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、化学反応生成物又は生物由来材料、例え
ば酵素及び抗体とコンジュゲート又は複合した化学物質であるが、これらに限定
されるものではない。
【００５６】 「バイオポリマー」とは、結合した生化学単位の配列から構成される高分子量
の物質を意味し、例えばペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又は結合した
アミノ酸生化学単位から構成されるタンパク質、オリゴヌクレオチド、結合した
デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチ
ド及びオリゴ糖及び結合した糖分子から構成される多糖であるが、これらに限定
されるものではない。
【００５７】 「ポリマー」とは、複数の結合した化学単位から構成される高分子量の物質を
意味し、例えばナイロン、ポリビニリデンジフルオライド及びポリスチレンが含
まれる。
【００５８】 「無機マトリックス」とは、無機化学組成物の固体表面を意味し、例えばケイ
素、二酸化ケイ素及びアルミナであるが、これらに限定されるものではない。薬
剤で誘導体化することができる。
【００５９】 「切断可能な部分」とは、酵素的又は非酵素的加水分解によりフルオロホアか
ら分離することができる化学単位である。
【００６０】 「芳香環部分」とは、ベンザゾール環の電子共鳴の非局在化を拡大することが
できる環構造を意味し、例えばベンゼン、ピロール、ピリジン、フラン及びチオ
フェンである。
【００６１】 「リンカーアーム」とは、本発明の化合物を別の化合物、例えば酵素、抗体、
オリゴヌクレオチド、ポリマー、バイオポリマー又は無機マトリックスへ化学的
に結合する手段を提供する２以上の原子からなる鎖を意味する。
【００６２】 「グリコシル」とは、Ｏ−グリコシド結合を介して本発明の化合物へ結合する
ことができる単糖又はオリゴ糖を意味する。
【００６３】 「フルオロホア」とは、異なる波長の光により励起されたとき、１つの波長の
光の発光を誘導することができる化学的部分を意味する。
【００６４】 フルオロホアの合成 本発明のフルオロホアは下記一般式で示すことができる。
【００６５】
【００６６】 又は
【００６７】
【００６８】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は独立して−Ｈ、化合物の溶解性を補
助する置換基、又は化合物を別部分に結合するリンカーアームであり、
【００６９】 Ｙは−Ｈ又は切断可能な部分であり、
【００７０】 Ｘは独立して水素、ハロゲン、−ＣＦ3又は−ＳＯ3Ｈであり、
【００７１】 Ｖ及びＷは独立して酸素又はイオウであり、
【００７２】 Ｚは−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ−又は芳香族部分であり、
【００７３】 ｎは０、１又は２である）
【００７４】 好ましくは、ｎ＝０のとき、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の中の少なくとも１ つは化合物の溶解性を補助する置換基、又は化合物と別の部分を結合するリンカ
ーアームを提供する置換基であり及び／又はＸはハロゲン、−ＣＦ3又は−ＳＯ3 Ｈである。
【００７５】 Ｘは同一又は異なってもよく、−Ｈ又は陰性置換基、例えばハロゲン、例えば
−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ又は−ＣＦ3又は−ＳＯ3Ｈであり、フェノール性ヒ
ドロキシル基のｐＫａの低下を補助する。
【００７６】 本発明の１つの態様は、誘導体化ＢＢＴ又はＨＢＯ（６−ヒドロキシベンゾオ
キサゾール）化合物であるフルオロホアを提供する。これらの誘導体化ＢＢＴ及
びＨＢＯ化合物は構造的に新規であり、異なる蛍光特性及び／又は新規な用途を
有する。例えば、Ｘが−Ｃｌ又は−Ｆであるとき、ハロゲン化化合物は、非常に
低いｐＨ（７〜８）下において、ＢＢＴ自体（ｐＨ９〜１０）よりも十分な蛍光
を発する。低ｐＨ（７〜８）下における十分な蛍光特性は、多くの生物学的アッ
セイにとって望ましいものである。
【００７７】 Ｒ置換基の１つ、好ましくはＲ2が官能基化部分（「リンカーアーム」）、例 えばアルキルホスホラミダイト又はカルボキシル基を有するＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルであるとき、得られるＢＢＴ誘導体は、オリゴヌクレオチド
の直接標識又はタンパク質の直接標識に使用することができる。本明細書に記載
するＢＢＴ及びＨＢＯ誘導体の製造は説明的なものであり、限定的なものではな
い。
【００７８】 ハロゲン化ＢＢＴ化合物は、当業者に周知の化学により、塩化スルフリルを使
用したＢＢＴの直接のハロゲン化により、又は米国特許第５，４２４，４４０号
明細書に記載の手順を使用して、最初に中間体２−シアノ−６−ヒドロキシベン
ゾチアゾールをハロゲン化し、次いで２−アミノチオフェノールとカップリング
することにより製造することができる。
【００７９】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4又はＲ5置換基を有するＢＢＴ誘導体は、置換２−アミノ チオフェノールから合成する。置換２−アミノチオフェノールと２−シアノ−６
−ヒドロキシベンゾチアゾールとの縮合により、置換ＢＢＴを与える。
【００８０】 表１は、下記式を有する本発明の代表的ＢＢＴフルオロホア誘導体及びこれら
の蛍光特性を列挙している。
【００８１】
【００８２】 表１*
【００８３】* 蛍光は、ｐＨ約１０下、AttoPhos緩衝液（JBL Scientific、San Luis Obispo,
CA）中で測定した。
【００８４】 本発明の別の態様は、一般構造（式中、ｎは１であり、Ｖ及びＷが−Ｓ又はＯ
である）で示される、２つのベンザゾールがこれらの２位において−Ｃ＝Ｃ−又
は−Ｃ≡Ｃ−により結合しているものから構成されるフルオロホアを提供する。
驚くべきことに、これらの誘導体はＢＢＴよりもわずか約３０〜４０ｎｍ高い最
大励起を示すが、最大発光はＢＢＴのλEMより６５ｎｍ程度長い。このファミリ
ーのフルオロホアについてのλEXは、アルゴンレーザーラインの４８８ｎｍより
も僅かに低いが、これらに対応の基質誘導体の存在下における前記フルオロホア
についての実際に好ましい励起波長は、未反応基質に由来する妨害バックグラン
ド蛍光を避けるために４４０ｎｍよりも僅かに長い。したがって、この構造的修
飾は、アルゴン４８８ｎｍラインによる励起にほぼ理想的なフルオロホアを予想
外に生成した。更に、このファミリーのフルオロホアのストークスシフトは例外
的に大きく、発光は５８０ｎｍよりも大きく、好ましいことに、ある場合では６
２４ｎｍであった。表２は、本発明のこのシリーズの好ましいフルオロホア及び
これらの蛍光特性を列挙している。
【００８５】 表２*
【００８６】* 蛍光は、ｐＨ約１０下、AttoPhos緩衝液（JBL Scientific、San Luis Obispo,
CA）中で測定した。
【００８７】 本発明の別の態様は、一般構造（式中、ｎは１であり、Ｖ及びＷが−Ｓ又は−
Ｏである）で示される、２つのベンザゾールがこれらの２位において芳香族部分
により結合しているものから構成されるフルオロホアを提供する。種々の芳香族
部分は、２つのベンザゾールを結合している。好ましい芳香族部分はベンゼン、
ピロール、ピリジン、フラン又はチオフェンである。本発明の別の態様は、一般
構造（式中、ｎは１であり、Ｖ及びＷが−Ｓ又は−Ｏである）で示される、２つ
のベンザゾールがこれらの２位において芳香族部分により結合しているものから
構成されるフルオロホアを提供する。種々の芳香族部分は、２つのベンザゾール
を結合していてもよく、好ましい芳香族部分はベンゼン、ピロール、ピリジン、
フラン又はチオフェンである。これらの化合物の合成は、２つのシアノ基（又は
１つのシアノ基及び続いてシアノ基に転換可能な１つのシントン）で置換された
芳香族部分と適切なアミノチオフェノールとの段階的縮合によりアプローチする
。例えば、下記の通りである。
【００８８】
【００８９】 （式中、Φはベンゼン、ピロール、ピリジン、フラン又はチオフェン部分である
）
【００９０】 請求の範囲の化合物のこれらの例において、アルゴン４８８ｎｍ光で励起する
ことができ、ストークスシフトはかなり大きく（１００〜１６０ｎｍ）、長波長
（６００〜６６０ｎｍ）で発光が起こる。
【００９１】 一連のフルオロホアの合成は、６−メトキシベンゾチアゾール−２−アルデヒ
ドから出発する。この物質は、Sandler及びKaro, Organic Functional Group Pr
eparations, 2nd Ed., 189, (1983), Academic Pressに記載の方法により、トリ
アルコキシアルミニウムリチウム水素化物を使用して２−シアノ−６−メトキシ
ベンゾチアゾールを還元することにより得ることができる。ベンゾチアゾールと
２−メチルベンゾチアゾールとをＺｎＣｌ2触媒下で反応させ、２’−（２−ベ ンゾチアゾリルエテニル）−６’−メトキシベンゾチアゾールを形成する（Mull
erら, J. Prakt. Chem. 327:698-704, 1985）。ヨウ化トリメチルシリル又は三 臭化ホウ素で脱メチル化後、２’−（２−ベンゾチアゾリルエテニル）−６’−
ヒドロキシベンゾチアゾール（ＢＥＢＴ）を得る。
【００９２】 前記の製造法において、２−メチルベンゾチアゾールを２−メチルベンゾオキ
サゾールで置換する場合、最終生成物は２’−（２−ベンゾオキサゾリルエテニ
ル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＢＥＢＯ）になるだろう。表２に列
挙したその他全ての化合物を、類似の化学を使用して当業者により製造すること
ができる。
【００９３】 酵素基質の合成 酵素的に切断可能な部分を有する本発明の全ての化合物「酵素基質」は、前記
フルオロホアのフェノール性ヒドロキシル基をブロックすることにより生成され
るが、後述するように、異なる酵素用の酵素基質は、その製造に対して異なる化
学を要求する。
【００９４】 ホスファターゼ基質は、フルオロホアのフェノール性ＯＨをジメチルクロロホ
スフェートでリン酸化し、続いて得られたジメチルホスフェートエステルを臭化
トリメチルリシルを使用して脱メチル化することにより製造する（米国特許第５
，４２４，４４０号明細書）。
【００９５】 本発明における炭水化物加水分解酵素用の基質としてのフルオロホアのグリコ
シドは、フルオロホアと臭素−糖とを周知のケーニッヒス-クノール化学を使用 してカップリングすることにより製造する。
【００９６】 本発明のエステラーゼ及びリパーゼ基質はカルボン酸エステルであり、フルオ
ロホアと対応の塩化アシルとを有機三級アミンの存在下で反応させることにより
都合よく製造することができる。
【００９７】 直接標識フルオロホアの合成 オリゴヌクレオチド及びＤＮＡの直接の標識化、すなわち「直接標識フルオロ
ホア」に使用することができる本発明のフルオロホア化合物は、いわゆる「リン
カーアーム」を有し、フルオロホア化合物をオリゴヌクレオチドへ直接コンジュ
ゲートしている。このような化合物は、ホスホラミダイト化学を経て対応のアル
キルアルコール誘導体から製造することができる（Kosterら, Natural Products
Chemistry, Elsevier, Amsterdam, 227-237, 1984）。
【００９８】 本発明のフルオロホアのカルボン酸誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルは、酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとをカップリングすることにより
製造する。これらのエステルは、タンパク質の直接の標識に使用することができ
る。
【００９９】 蛍光のｐＨ依存性 フェノール性フルオロホアを低ｐＨ（７〜８）下で十分に蛍光を発生させ、あ
る酵素学的及び生物学的アッセイについての最高のパフォーマンスを達成するた
めに、陰性置換基、例えば塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、トリフルオロメチル、
−ＳＯ3Ｈ等を用いていくつかのフルオロホアを合成した。これらの置換誘導体 を、その蛍光能力について異なるｐＨ下で分析した。本発明のいくつかの好まし
い化合物及び比較化合物について、ｐＨに対する蛍光強度の依存性を図３に示す
。未置換化合物ＢＢＴ（グラフにも示す。米国特許第５，４２４，４４０号明細
書）と比較して、陰性的に置換したＢＢＴ誘導体、特にＣＩＢＢＴは、生理学的
条件（ｐＨ７〜８）に非常に近いｐＨ下において最大の蛍光に達することができ
た。これらのフルオロホアの蛍光強度のｐＨ依存特性変化は、ｐＨ滴定蛍光指示
薬としての応用を見いだすことができる。
【０１００】 用途 本発明の別の側面においては、前記ジベンザゾール化合物を使用した生物学的
サンプル中の薬剤を検出する方法であって、化合物を生物学的サンプルへ添加す
る工程、及び前記化合物の加水分解を蛍光により検出する工程を含むことを特徴
とする方法が提供される。前記の用途の例には、例えば生物学的サンプル中の酵
素の検出、適切な酵素にコンジュゲートした特異的な分析物に対する抗体の検出
（エンザイムイムノアッセイ）、酵素で直接又は間接的に標識したタンパク質、
ＤＮＡ又はＲＮＡサンプルの、分離及び可視化用ゲル及び膜を使用した検出が含
まれる。更に、コンジュゲートした酵素を有する非生物学的サンプルを、本明細
書に記載のジベンザゾール化合物を組み込んだ適切な基質を使用して検出するこ
とができる。
【０１０１】 更に、前記化合物をある分子へ直接コンジュゲートする方法であって、リンカ
ーアームをＲ1、Ｒ2、Ｒ3又はＲ4の中の１以上の部位へ結合する工程、前記リン
カーを前記分子に結合する官能基へコンジュゲートする工程を含むことを特徴と
する方法が提供される。このようなコンジュゲートする標的分子には、オリゴヌ
クレオチド、ＤＮＡ、アミノ化合物、ペプチド、タンパク質、ポリマー及びバイ
オポリマーが含まれる。
【０１０２】 したがって、本発明は下記の利点を提供する。
【０１０３】 ・化学部分の結合時には、アッセイの波長において蛍光を発しないか又は僅かし
か発しないが、一方、適切な酵素作用を用いて化学部分を除去したときは、強い
蛍光を発する蛍光化合物。
【０１０４】 ・種々の水性環境下で安定性を維持する蛍光化合物及びこれらの誘導体。
【０１０５】 ・種々の応用に適切な溶解特性を有する蛍光化合物及びこれらの誘導体。
【０１０６】 ・種々のｐＨ範囲において使用する蛍光化合物。
【０１０７】 ・バックグラウンド妨害をこえて容易に検出可能な蛍光化合物。
【０１０８】 ・大きなストークスシフトを示す蛍光化合物。
【０１０９】 ・アルゴンレーザー４８８ｎｍラインにより効率的に使用することができるλEX を有する蛍光化合物。
【０１１０】 ・λEM＞５４０ｎｍ、好ましくはλEM≧５４０ｎｍを有する蛍光化合物。
【０１１１】 ・直接の標識の応用に使用することができる蛍光化合物及びこれらの誘導体。
【０１１２】 ・蛍光性酸−塩基指示薬として使用することができる蛍光化合物及びこれらの誘
導体。
【０１１３】 下記実施例は説明目的で提供されるものであり、限定目的で提供されるもので
はない。
【０１１４】 下記実施例において、ＮＭＲデータは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ−３００ ３００
ＭＨｚ装置により測定した。マススペクトルはＶＧプラットフォーム、Ｆｉｓｏ
ｎ装置で得た。蛍光データは、パーキンエルマー発光分光計モデルＬＳ５０Ｂよ
り得た。
【０１１５】 実施例１ ＢＥＢＴＰの合成 ６−メトキシベンゾチアゾール−２−アルデヒドの合成 ２−シアノ−６−メトキシベンゾチアゾール（１０．０ｇ、５２．６ｍｍｏｌ
）を、無水エーテル（４００ｍｌ）及び２−プロパノール（３６ｍｌ）の混合物
中で懸濁した。懸濁液をドライアイス浴により約−３０℃に冷却した。水素化ア
ルミニウムリチウム（７．０ｇ、１８４．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、
反応温度を−３０℃未満に維持しながらゆっくりと添加した。水素化アルミニウ
ムリチウム添加後、反応混合物を１時間攪拌し、２Ｎ硫酸（９００ｍｌ）及び酢
酸エチル（５００ｍｌ）の混合物へゆっくりと注いだ。１０分間攪拌後、有機層
を分離し、水性層を酢酸エチル（２００ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機層
を水（２００ｍｌ）で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム（５０ｇ）で一晩乾燥
した。乾燥した溶液を濃縮し、続いてシリカゲル中のフラッシュクロマトグラフ
ィーに付し、３．１ｇ（３０．５％）の黄色がかった固体を得た。
【０１１６】1 H NMR(300MHz, CDCl3):δ10.10(1H, s, CHO), 8.10(1H, d, J=9.3Hz), 7.38(1H
, d, J=2.6Hz), 7.22(1H, dd, J1=2.3, J2=9.0), 3.93(3H, s) MS:m/z 193(M+)
【０１１７】 ２’−（２−ベンゾチアゾリルエテニル）−６’−メトキシベンゾチアゾールの
合成 ６−メトキシベンゾチアゾール−２−アルデヒド（１．０ｇ、５．２ｍｍｏｌ
）、２−メチルベンゾチアゾール（５ｍｌ）及び塩化亜鉛（１．０ｇ）の混合物
をアルゴン下、１８０℃で１０分間加熱し、次いで室温まで冷却した。メタノー
ル（３０ｍｌ）を添加した。１０分間攪拌した後、得られた沈殿物をろ過し、メ
タノールで洗浄し、乾燥した。収率は、０．９５（８１％）であった。
【０１１８】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ8.04(1H, d, J=8.07Hz), 7.93(1H, d, J=9.54Hz),
7.88(1H, d, 8.07Hz), 7.78(1H, d, 16.17), 7.70(1H, d, 15.45Hz), 7.46(2H,
m), 7.32(1H, d, 2.22Hz), 7.10(1H, dd, J1=8.82Hz, J2=2.94Hz), 3.89(3H,s) MS: m/z 324(M+)
【０１１９】 ２’−（２−ベンゾチアゾリルエテニル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾール
の合成 ２’−（ベンゾチアゾリル−エテニル）−６’−メトキシベンゾチアゾール（
１．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍｌ）中に溶解した。三臭化
ホウ素（１．３ｍｌ）を添加した。反応混合物を室温下で４時間攪拌し、次いで
ヘプタン（２０ｍｌ）で希釈した。沈殿物をろ過し、５％水酸化アンモニウム水
溶液で洗浄し、次いで乾燥した。収率は０．６ｇ（６２％）であった。
【０１２０】1 H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ8.16(1H, d, J=8.07Hz), 8.05(1H, d, J=8.07Hz)
, 7.87(1H, d, J=8.82), 7.87(1H, d, J=15.42Hz), 7.78(1H, d, J=16.17Hz), 7
.53(2H, m), 7.43(1H, d, J=2.94Hz), 7.02(1H, dd, J1=8.82Hz, J2=2.22Hz) MS: m/z 310(M+), 309(M-))
【０１２１】 ２’−（２−ベンゾチアゾリルエテニル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾー
ルジメチルホスフェートの合成 ２’−（２−ベンゾチアゾリルエテニル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾー
ル（１．１２ｇ、３．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍｌ）中に懸濁し、カリウム
ｔ−ブトキシド（０．８１ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温下で
４０分間攪拌した後、ジメチルクロロホスフェート（０．４５ｍｌ、０．６ｇ、
４．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温下で２時間攪拌し、次いでヘプ
タン（３００ｍｌ）へ注いだ。得られた沈殿物を集め、ヘプタンで洗浄し、乾燥
した。収率は１．４６ｇ（９６％）であった。フラッシュシリカゲルクロマトグ
ラフィーによる更なる精製により、、黄色がかった固体を得た。
【０１２２】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ8.07(1H, d, J=7.35Hz), 8.00(1H, d, J=8.82Hz),
7.91(1H, d, J=7.35Hz), 7.80(1H, m), 7.78(2H, m), 7.45(2H, m), 7.36(1H, m
), 3.91(6H, d) MS: m/z 418(M+)
【０１２３】 ２’−（２−ベンゾチアゾリルエテニル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾール
ホスフェート ジ（２−アミノ−２−メチル １，３−プロパンジオール）塩（
図２Ｊ、酸形態） ２’−（２−ベンゾチアゾリルエテニル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾー
ルジメチルホスフェート（０．５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）をジオキサン（１０ｍｌ
）に懸濁した。この懸濁液に、臭化トリメチルシリル（０．５ｍｌ）を添加した
。反応混合物を７０〜８０℃で１．５時間攪拌した。更に臭化トリメチルシリル
（０．２５ｍｌ）を添加した。同一条件下で更に３０分間攪拌後、反応混合物を
、２−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオール（０．７５ｇ）及びエタノ
ール（２０ｍｌ）からなる溶液へ注いだ。１０分間攪拌後、混合物を冷蔵庫中で
一晩冷却した。得られた沈殿物をろ過し、エタノールで３回洗浄し、乾燥した。
収率は０．６４ｇ（８９％）であった。
【０１２４】1 H NMR (300MHz, D2O): δ7.31(1H, s), 7.26(1H, d, J=8.82Hz), 7.13(2H, m),
6.88(1H, m), 6.78(2H, m), 6.67(2H, m), 3.41(8H, m), 0.98(6H, m) MS: m/z 389((M-1)-)
【０１２５】 実施例２ ＢＥＢＴＥＳＧの合成 ４−アセトアミドフェネチルアセテートの合成 ４−アミノフェネチルアルコール（１０．０ｇ、７２．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ
（１００ｍｌ）中に溶解した。無水酢酸（３５ｍｌ、３７．９ｇ、７２．９ｍｍ
ｏｌ）及びトリエチルアミン（１００ｍｌ、７２．６ｇ、７１．７ｍｍｏｌ）を
添加した。反応混合物を室温下で２時間攪拌した。水（５０ｍｌ）を添加し、過
剰の無水酢酸を分解した。１０分間攪拌後、反応溶液を濃縮し、溶媒を除去した
。残渣を水（４００ｍｌ）で処理し、所望の生成物を沈殿させた。沈殿物をろ過
し、水で洗浄し、減圧下で乾燥した。収率は８．２ｇ（５１％）であった。
【０１２６】 t), 2.01(3H,s), 1.97(3H, s)
【０１２７】 ４−チオアセトアミドフェネチルアセテートの合成 ４−アセトアミドフェネチルアセテート（１０．０ｇ、４５．２ｍｍｏｌ）及
び５硫化リン（１０．０ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）をトルエン（２００ｍｌ）中に
懸濁した。懸濁液を４０分間還流した。冷却後、上清を分液漏斗へデカントし、
５０％水性Ｎａ2ＣＯ3溶液（７０ｍｌ）次いで水（７０ｍｌ）で洗浄した。有機
トルエン層を無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。乾燥したトルエン溶液を乾燥
物にまで濃縮し、黄色がかった固体（７．６ｇ、７１％）を得た。この固体を更
なる精製なしに次の反応に使用した。
【０１２８】 ２−メチル−６−アセトキシエチルベンゾチアゾールの合成 Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6（７．６ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）を水（１８ｍｌ）に溶解し
、次いで５０ｍｌの２％ＮａＯＨ水溶液と混合した。４−チオアセトアミドフェ
ネチルアセテート（１．０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍｌ）
中に溶解し、次いでＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6溶液へ添加した。反応混合物を室温下で１
時間攪拌した。有機層を分液漏斗により分離し、水で洗浄し、次いで無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した。乾燥した溶液を濃縮し、フラッシュシリカゲルクロマトグ
ラフィーにより精製した。収率は０．６ｇ（６１％）であった。
【０１２９】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ7.82(1H, d), 7.62(1H, d), 7.24(1H, dd), 4.27(2
H, t), 2.99(1H, t), 2.77(3H, s), 1.99(3H, s)
【０１３０】 ２’−（（６−アセトキシエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’−
メトキシベンゾチアゾールの合成 ６−メトキシベンゾチアゾール−２−アルデヒド（５００ｍｇ、２．６ｍｍｏ
ｌ）及び２−メチル−６−アセトキシエチルベンゾチアゾール（５３０ｍｇ、２
．３ｍｍｏｌ）を、無水酢酸（４ｍｌ）及び酢酸（１ｍｌ）の混合物中に溶解し
た。反応溶液を一晩還流した。室温まで冷却した後、反応溶液を最初にメチルｔ
−ブチルエーテル（５ｍｌ）と混合し、次いでヘプタン（１０ｍｌ）と混合した
。得られた沈殿物を集め、ヘプタンで洗浄し、減圧下で乾燥した。収率は０．６
ｇ（６５％）であった。
【０１３１】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ7.91(1H, d), 7.87(1H, d), 7.72-7.59(3H, m), 7.
32-7.27(2H, m), 7.05(1H, dd), 4.29(2H, t), 3.84(3H, s), 3.02(2H, t), 1.9
9(3H, s).4 MS: m/z 411(M+)
【０１３２】 ２’−（（６−ヒドロキシエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’−
ヒドロキシベンゾチアゾールの合成（図２ｂ） ２’−（（６−アセトキシエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’
−メトキシベンゾチアゾール（４．７ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）を１Ｍ ＢＢｒ3 のジクロロメタン溶液（４０ｍｌ、４０．０ｍｍｏｌ）と混合し、混合物を室温
下で４時間攪拌した。ヘプタン（１２０ｍｌ）を添加し、混合物を１０分間攪拌
した。得られた沈殿物をろ過し、ヘプタンで洗浄し、減圧下で乾燥した。乾燥し
た固体を水（５０ｍｌ）に懸濁し、懸濁液のｐＨを濃縮ＮＨ4ＯＨで７〜８に調 節した。固体をろ過により集め、水で２回洗浄し、メタノール（１５０ｍｌ）に
再溶解した。メタノール溶液を６Ｎ ＮａＯＨ（１０ｍｌ）と混合し、室温下で
３．５時間攪拌した。水（５００ｍｌ）の添加後、反応混合物を６Ｎ ＨＣｌで
ｐＨ５に中和した。得られた沈殿物を集め、水で洗浄し、減圧下で乾燥した。収
率は２．９ｇ（７６％）であった。
【０１３３】 MS: m/z 354(M+)
【０１３４】 ２’−（（６−ブロモエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’−ヒド
ロキシベンゾチアゾールの合成 ２’−（（６−ヒドロキシエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’
−ヒドロキシベンゾチアゾール（１．０ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を濃縮臭化水素酸
（２０ｍｌ）に懸濁した。懸濁液を８時間還流し、次いで濃縮ＮＨ4ＯＨでｐＨ ７〜８に中和した。沈殿物を集め、水で洗浄し、減圧下で乾燥した。収率は１．
１ｇ（９３％）であった。
【０１３５】 MS: m/z 416及び418(M+)
【０１３６】 ２’−（（６−スルホエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’−ヒド
ロキシベンゾチアゾール β−Ｄ−ガラクトシドの合成（図２ｌ） ２’−（（６−ブロモエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’−ヒ
ドロキシベンゾチアゾール（１．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を飽和亜硫酸水素ナト
リウム水性溶液（２５ｍｌ）に懸濁し、テトラブチルアンモニウムハイドロジェ
ンサルフェート（０．５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間
還流し、次いで室温に冷却した。上清をデカントし、残りの沈殿物を水で洗浄し
た。沈殿物を水（３０ｍｌ）に懸濁した。懸濁液のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで１０
に調節した。３０分間の攪拌後、溶液をろ過し、ろ液を酢酸でｐＨ５〜６に中和
した。中和した溶液を約２０ｍｌに濃縮し、次いで１Ｎ ＮａＯＨ（４０ｍｌ）
及びジクロロメタン（４０ｍｌ）と組み合わせた。α−Ｄ−テトラアセチルガラ
クトシルブロミド（２．０ｇ、４．８ｍｍｏｌ）及びテトラブチルアンモニウム
ハイドロジェンサルフェート（０．５ｇ）を添加した。反応混合物を室温下で一
晩激しく攪拌した。有機層を分離し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製
し、２’−（（６−スルホエチル−２−ベンゾチアゾリル）エテニル）−６’−
ヒドロキシベンゾチアゾール β−Ｄ−テトラアセチルガラクトシド（１４０ｍ
ｇ）を得た。テトラアセチルガラクトシドを、室温下、ＴＨＦ（１５ｍｌ）中の
２５％ナトリウムメトキシド（３ｍｌ）により脱保護した。反応混合物を酢酸で
ｐＨ６〜７に中和し、乾燥物まで濃縮した。残渣を、Ｃ１８逆相カラムクロマト
グラフィーにより精製し、黄色がかった固体（３６ｍｇ）を得た。
【０１３７】 MS: m/z 580(M-)
【０１３８】 実施例３ ＢＢＴカルボン酸エステルの合成 ２’−（２−ベンゾチアゾリル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾールプロピオ
ネートの合成（図１ｏ） ２’−（２−ベンゾチアゾリル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾール（０．
５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍｌ）に懸濁した。懸濁液に、ジイソプ
ロピルエチルアミン（２ｍｌ）及び塩化プロピオニル（０．４ｇ、０．４ｍｌ、
４．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温下で３０分攪拌し、次いで１時
間還流した。反応溶液を乾燥物まで濃縮した。水（１０ｍｌ）を添加した。得ら
れた沈殿物をろ過により集め、水で２回洗浄した。生成物を減圧下で乾燥した。
収率は０．５ｇ（８３％）であった。
【０１３９】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ8.16(1H, d), 8.14(1H, d), 7.99(1H, d), 7.75(1H
, d), 7.53(2H, m), 7.29(1H, dd), 2.66(2H, q), 1.30(3H, t) MS: m/z 340(M+)
【０１４０】 ２’−（２−ベンゾチアゾリル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾール オレエ
ート（図１ｓ）の合成 ２’−（２−ベンゾチアゾリル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾール（１．
０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に懸濁した。懸濁液に、ジイソプ
ロピルエチルアミン（４ｍｌ）及び塩化オレオイル（３．９ｇ、４．３ｍｌ、１
３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０〜６０℃で２時間攪拌した。形成し
た沈殿物をろ過により除去した。ろ液を濃縮し溶媒を除去した。油残渣を２００
ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム水性溶液と共に１０分間攪拌した。得られた沈殿
物をろ過により集め、０．５Ｍ炭酸ナトリウム、水、最後にメタノールで洗浄し
た。生成物を減圧下で乾燥した。粗生成物をＴＨＦ及びメタノールから再結晶化
した。収率は１．１ｇ（５８％）であった。
【０１４１】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ8.16(1H, d), 8.14(1H, d), 7.99(1H, d), 7.75(1H
, d), 7.53(2H, m), 7.28(1H, dd), 5.36(2H, m), 2.62(2H, t), 2.03(4H, m),
1.79(2H, m), 1.31(26H, m), 0.88(3H, t) MS: m/z 548(M+)
【０１４２】 実施例４ ＢＢＴＥの合成 ２’−（６−ヒドロキシエチルベンゾチアゾール−２−イル）−６’−ヒドロキ
シベンゾチアゾールの合成（図１ｄ） ４−アミノフェンエタノール（６０．０ｇ、４４０．０ｍｍｏｌ）及びアンモ
ニウムチオシアナート（６７．０ｇ、８８０ｍｍｏｌ）を、氷酢酸（６００ｍｌ
）に溶解した。溶液を氷浴中０〜１０℃まで冷却した。臭素（７０．０ｇ、４４
０．０ｍｍｏｌ）を酢酸（１００ｍｌ）に溶解し、次いで添加用漏斗により前記
に冷却溶液へ１時間かけて滴下した。反応混合物を約１０℃でさらに３５分間攪
拌した。形成した沈殿物をろ過し、水（２００ｍｌ）に再溶解した。ろ液を乾燥
物まで濃縮し、残渣を水（１０００ｍｌ）に再溶解した。２つの水性溶液を組み
合わせ、濃縮水酸化アンモニウムでｐＨ８に中和した。得られた沈殿物を集め、
減圧下で乾燥した。
【０１４３】 乾燥した物質を、ＫＯＨ水性溶液（４８０ｍｌの水中の２１３．８ｇのＫＯＨ
）に溶解した。溶液を８０分間還流し、次いで室温まで冷却した。反応溶液を４
５０ｍｌの水で希釈し、次いで酢酸でｐＨ６に中和した。この溶液を更に水（１
３００ｍｌ）で希釈した。２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（２３
．４ｇ、１３０ｍｍｏｌ）をメタノール（９６０ｍｌ）に溶解し、これを希釈し
た水性溶液へ一度に添加した。得られた黄色の沈殿物をろ過し、水、次いでメタ
ノールで洗浄し、減圧下で乾燥した。収率は３６．６ｇ（８４％）であった。
【０１４４】 MS: m/z 328(M+)
【０１４５】 実施例５ ＢＢＴＥＰＡの合成 ２’−（６−アセトキシベンゾチアゾール−２−イル）−６’−ベンゾチアゾリ
ルエチルアルコールの合成 ２’−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−６’−ベンゾチアゾ
リルエチルアルコール（１．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの無水ピリジン
に溶解し、十分な減圧下で同時蒸発した。フラスコをアルゴン下で解放し、内容
物を２０ｍｌの無水ピリジンに溶解し、次いでフラスコをゴムストッパーで封止
した。溶液を４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（１．０ｇ、３．０ｍｍ
ｏｌ）で一度に処理し、室温下で一晩、磁気的に攪拌した。反応混合物をＨＰＬ
Ｃにより翌朝チェックしたところ、所望のモノ−ＤＭＴを主に含んでいた。次い
で反応混合物をＩＰＡ／Ｈ2０乾燥氷浴中で冷却し、塩化アセチル（３２０μｌ 、４．５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を氷浴から取りだし、室温まで暖め
、ＨＰＬＣが反応の完了を示すまで１．５時間攪拌を続けた。反応混合物をロー
タリーエバポレータ中で乾燥物まで濃縮し、５０ｍｌのアセトニトリルで摩砕し
た。明るい黄色の固体を集め、アセトニトリルで濯いだ。次いで固体を２０ｍｌ
のジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、磁気的に攪拌しながら、ＤＣＭ：ＭｅＯ
Ｈ（７：３）中の０．２Ｍベンゼンスルホン酸の１５ｍｌで処理した。１５分後
、反応混合物をトリエチルアミン（５ｍｌ）でクエンチし、直ちに−１５℃で一
晩保存し、結晶化を促進した。翌朝、結晶を集め、ＤＣＭで濯ぎ、次いで減圧下
で乾燥し、最終重量０．５２ｇ（４５％）の明るい褐色の固体を得た。
【０１４６】1 H NMR (300MHz, DMSO-D6): δ8.21(1H, d, J=8.8Hz), 8.10(3H, m), 7.52(1H,
d, J=9.1Hz), 7.42(1H, d=6.9Hz), 3.71(2H, t, J=6.7Hz), 2.92(2H, t, J=6.7H
z), 2.35(3H, s, CH3CO)
【０１４７】 ２’−（６−アセトキシベンゾチアゾール−２−イル）−６’−ベンゾチアゾリ
ルエチルホスホラミダイトの合成（１ｔ） ２’−（６−アセトキシベンゾチアゾール−２−イル）−６’−ベンゾチアゾ
リルエチルアルコール（０．５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１０ｍｌ
と共に同時蒸発させ、次いでアルゴンを用いて減圧から解放した。乾燥固体を１
０ｍｌのＤＣＭに懸濁し、次いでトリエチルアミン（４５０μｌ）で処理した。
磁気的に攪拌しながら、２’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノク
ロロホスホラミダイト（０．３３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を室温
下で２時間攪拌した。次いで反応混合物を濃厚な黄色の油になるまで濃縮し、最
小容積のＤＣＭ中に集め、２：１の酢酸エチル：２％トリエチルアミンを有する
ヘプタンを用いたシリカゲル中で精製し、０．４１ｇ（５５％）の明るい黄色の
固体（ＴＬＣにおいて単一のスポット）を得た。
【０１４８】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ8.15(1H, d, J=8.9Hz), 8.06(1H, d, J=8.5Hz), 7.
85(1H, d, J=1.1Hz), 7.74(1H, d, J=2.2), 7.43(1H, m), 7.28(1H, m), 3.75(6
H, m), 3.09(2H, d, J=13.3Hz), 2.59(2H, d, J=12.8Hz), 2.36(3H, s), 1.14(1
2H, m), 31P NMR (300MHz, CDCl3, PO4, STD.)δ147.45(s)
【０１４９】 実施例６ ＢＢＴＡＡＳｕの合成 ２’−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−ベンゾチアゾール−６
’−酢酸の合成（図１ｆ）
【０１５０】 ４−アミノフェニル酢酸（５．０ｇ、３３．０ｍｍｏｌ）及びアンモニウムチ
オシアナート（５．０ｇ、６６．０ｍｍｏｌ）を、氷酢酸（５０ｍｌ）に溶解し
た。溶液を氷浴で０〜１０℃に冷却した。臭素（５．３ｇ、３３．０ｍｍｏｌ）
を酢酸（８ｍｌ）に溶解し、次いで添加用漏斗により前記冷却溶液へ２０分かけ
て滴下した。反応混合物を約１０℃下で更に４５分攪拌した。形成した沈殿物を
ろ過し、酢酸エチルで濯ぎ、減圧下で乾燥した。乾燥した物質を、ＫＯＨ水性溶
液（６０ｍｌの水中の２６．９ｇのＫＯＨ）に溶解した。溶液を２時間還流し、
次いで室温まで冷却した。反応溶液を１５ｍｌの水で希釈し、次いで酢酸でｐＨ
６に中和した。２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（２．５ｇ、１４
ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍｌ）に溶解し、これを中和反応溶液へ一度に
添加した。反応混合物を１時間攪拌し、次いで室温下で一晩静置した。得られた
黄色の沈殿物をろ過し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥した。収率は４．０ｇ
（８２％）であった。
【０１５１】1 H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ7.88(1H, d, J=8.46Hz), 7.83(1H, s), 7.77(1H,
d, J=9.18), 7.44(1H, dd, J1=8.46Hz; J2=1.47Hz), 7.10(1H, d, J=2.19), 6.
95(1H, dd, J1=8.82Hz; J2=2.19Hz), 3.42(2H, s) MS: m/z 341(M-)
【０１５２】 ２’−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−ベンゾチアゾール−６
’−酢酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成（図１ｕ） ２’−（２−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−ベンゾチアゾール−６’−酢酸
（１．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７ｇ、
６．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール
（４．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温下で９０分間攪拌し
、次いで２００ｍｌのメチルｔ−ブチルエーテルへ注いだ。得られた沈殿物をろ
過し、減圧下で乾燥した。収率は１．３ｇであった。
【０１５３】 MS: m/z 439(M-)
【０１５４】 実施例７ ＣＬＢＢＴの合成 ２’−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７’−クロロ−６’−ヒドロキシベ
ンゾチアゾール（図１ｂ） 還流冷却器にを取り付けた３リットルの三口丸底フラスコ中の細粉ＢＢＴ（１
０．０ｇ、３５．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１Ｌ）中の懸濁液に、塩化ス
ルフリル（２１．２ｍｌ、２６３．８ｍｍｏｌ）をメスシリンダーを用いて一度
の添加した。得られたオレンジ色の懸濁液を、アルゴン雰囲気下、１２時間還流
した。追加の塩化スルフリル（１０．０ｍｌ、１２４．５ｍｍｏｌ）を反応混合
物に添加し、更に１２時間還流を続けた。反応混合物を室温まで冷却し、氷水（
約５００ｍｌ）へ注いだ。黄色の沈殿物をろ過により分離した。黄色の固体物質
を風乾し、次いで減圧下で一晩乾燥し、４．０ｇ（３６％）の掲題化合物を得た
。
【０１５５】1 H NMR (300MHz, CD3OD, DMSO-d6): δ8.08(m, 2H), 7.88(d, J=8.8Hz, 1H), 7.
55(m, 2H), 7.22(d, J=8.8Hz, 1H) MS: m/z 317(M-H)
【０１５６】 ７−クロロ−２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール
【０１５７】 ２５０ｍｌの丸底フラスコ中の２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール
（１．０ｇ、５．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍｌ）中の懸濁液に、
周囲温度下、塩化スルフリル（０．４６ｍｌ、５．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合
物を周囲温度下で２時間攪拌した。追加の塩化スルフリル（０．１５ｍｌ、１．
８７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１２時間攪拌した。反応混合物を分液漏
斗に移し、水（３×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、濃縮し、淡い黄色の固体（１．１６ｇ、９７％）を得た。
【０１５８】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ8.05(d, J=9.0Hz, 1H), 7.37(d, J=9.2Hz, 1H), 6.
07(s, 1H) MS: m/z 209, 211(M-H)
【０１５９】 ２’−（７−クロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−ベンゾチ
アゾール−６’−酢酸（図１ｈ） １００ｍｌの丸底フラスコに、２−アミノベンゾチアゾール−６−酢酸（０．
７２ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）及び５０％水性水酸化カリウム溶液を添加した。フ
ラスコを還流冷却器に取り付け、油浴を使用して反応混合物を１００〜１０５℃
で２時間加熱した。反応物を氷浴中で冷却し、５．０ｍｌの水で希釈し、氷酢酸
の添加によりｐＨ６に中和した。得られた混合物に、７−クロロ−２−シアノ−
６−ヒドロキシベンゾチアゾール（０．３６ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）のメタノー
ル溶液（２０ｍｌ）を一度に添加した。黄色の沈殿物が直ちに形成した。反応混
合物を周囲温度下で１２時間攪拌した。沈殿物をろ過により分離し、アセトンで
洗浄した。固体物質を風乾し、次いで減圧下で乾燥し、０．２８ｇ（４３％）の
所望生成物を黄褐色のフレークとして得た。
【０１６０】1 H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ7.93(d, J=8.4Hz, 1H), 7.72(s, 1H), 7.43(d, J
=7.9Hz, 2H), 6.75(d, J=8.8Hz, 1H), 3.57(s, 2H) MS: m/z 375, 377(M-H)
【０１６１】 実施例８ ＦＢＢＴ合成 ２−シアノ−７−フルオロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール ２５０ｍｌの丸底フラスコ中の２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール
（２．０ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍｌ）中の懸濁液に、
３，５−ジクロロ−１−フルオロピリジニウムトリフレート（６．１ｇ、１９．
３ｍｍｏｌ）を添加した。反応フラスコを還流冷却器に取り付け、混合物をアル
ゴン雰囲気下で５３時間の還流に付した。追加の３，５−ジクロロ−１−フルオ
ロピリジニウムトリフレート（１．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応を更
に２２時間続けた。追加の３，５−ジクロロ−１−フルオロピリジニウムトリフ
レート（１．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応を更に２７時間続けた。更
に追加の３，５−ジクロロ−１−フルオロピリジニウムトリフレート（１．０ｇ
、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、更に７２時間反応を続けた。反応混合物を回転蒸
発（rotoevaporation）により濃縮し、褐色の残渣を得た。これを、１００ｇの シリカゲル及び溶離溶媒として塩化メチレンを用いたフラッシュシリカゲルクロ
マトグラフィーにより精製した。掲題化合物を白色固体として得た。収率は０．
９７ｇ（４４％）であった。
【０１６２】1 H NMR (300MHz, CDCl3): δ7.94(d, J=8.8Hz, 1H), 7.37(t, J=8.7Hz, 1H);19 F NMR (282MHz, CDCl3): δ-138.83; MS(ESI-) m/z 193(M-H)
【０１６３】 ２’−（２−ベンゾチアゾリル）−７’−フルオロ−６’−ヒドロキシベンゾチ
アゾール（図１ａ） メタノール（５ｍｌ）及び水（２ｍｌ）中の２−シアノ−７−フルオロ−６−
ヒドロキシベンゾチアゾール（０．４３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）溶液に、２−アミ
ノチオフェノール（０．３６ｍｌ、３．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温
度下で１２時間攪拌した。黄色の沈殿物をろ過により分離し、アセトンで洗浄し
た。黄色の固体物質を風乾し、次いで減圧下で乾燥し、０．４５ｇ（６７％）の
掲題化合物を得た。
【０１６４】1 H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ10.72(br s, 1H), 8.22(d, J=8.6Hz, 1H), 8.16(
d, J=7.6Hz, 1H), 7.88(d, J=8.9Hz, 1H), 7.59(m, 2H), 7.29(t, J=8.8Hz, 1H)
;19 F NMR (282MHz, DMSO-d6): δ-135.10;
【０１６５】 MS(ESI-) m/z 301(M-H)
【０１６６】 実施例９ ＢＥＢＯの合成 ２’−（２−ベンズオキサゾリルエテニル）−６’−ヒドロキシベンゾチアゾー
ルの合成（図２ａ）
【０１６７】 ６−メトキシベンゾチアゾール−２−アルデヒド（１００ｍｇ、０．７ｍｍｏ
ｌ）、２−メチルベンゾオキサゾール（０．５ｍｌ）及び塩化亜鉛（１００ｇ）
の混合物を、アルゴン下、１８０℃で１０分間加熱し、次いで室温まで冷却した
。メタノール（７ｍｌ）を添加した。得られた沈殿物を集め、メタノールで洗浄
し、減圧下で乾燥した。乾燥した物質をクロロホルム（５ｍｌ）に溶解した。三
臭化ホウ素（０．３ｍｌ）を添加した。反応混合物を室温下で４時間攪拌し、次
いでヘプタン（１０ｍｌ）で希釈した。沈殿物をろ過し、５％水酸化アンモニウ
ム水溶液で洗浄し、次いで乾燥した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。収率は４４ｍｇ（２９％）であった。
【０１６８】1 H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ7.95(1H, d), 7.90(1H, d), 7.80(2H, m), 7.50-
7.40(4H, m), 7.04(1H, dd)
【０１６９】 実施例１０ 酵素活性試験 （１）アルカリホスファターゼ １ｍｇのＢＥＢＴＰを、１０ｍｌのAttoPhos緩衝液（JBL Scientific Inc., S
an Luis Obispo, カリフォルニア）に溶解した。少量のアルカリホスファターゼ
（子牛の腸、Calzyme, San Luis Obispo, CA）を添加した。オレンジ赤色の蛍光
が直ちに発生した。
【０１７０】 （２）β−ガラクトシダーゼ １ｍｇのＢＥＢＴＥＳＧを、１０ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む １０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、少量のβ−ガラ
クトシダーゼ（カタログ番号104939、E. coli, ICN Biomedicals, Inc.）を添加
した。オレンジ赤色の蛍光が直ちに発生した。
【０１７１】 （３）エステラーゼ及びリパーゼ 緩衝液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ８．０。 基質ストック溶液：２ｍＭアシルＢＢＴジオキサン溶液。 酵素：全ての酵素はSigmaより入手した。ブタ肝臓由来のエステラーゼ（Ｅ３ １２８）。シュードモナス（Pseudomonas）種由来のリパーゼ（Ｌ９５１８）。 カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）（Ｌ１７５４）。緩衝液で 酵素を所望の濃度に希釈した後に使用した。
【０１７２】 装置：Squoia-Turner蛍光計モデル４５０。４４０ｎｍで励起、５５０ｎｍで 発光。
【０１７３】 手順： １．蛍光計ゲイン（gain）を２００にセットする工程。
【０１７４】 ２．Ｔｒｉｓ緩衝液で蛍光計ゼロを０にセットする工程。
【０１７５】 ３．ＪＢＬ １０ｎｇＢＢＴ（ＦＥＹ）標準溶液を用いて蛍光計スパン（span
）を１０００にセットする工程。
【０１７６】 ４．９８０μｌの緩衝液をガラス製試験管（Baxter, カタログ番号Ｔ1２９０ −３）へピペットで移す工程。
【０１７７】 ５．１０μｌの基質ストック溶液を添加し、十分に混合する工程。
【０１７８】 ６．ブランクの示数を測定し記録する工程。
【０１７９】 ７．１０μｌの酵素溶液を添加する工程。
【０１８０】 ８．１分毎で計３分間、蛍光の示数を採取し、記録する工程。
【０１８１】 ９．２分間の示数から１分間の示数を引くことにより、蛍光単位変化（fluore
scence unit change）（ＦＵ／分）を計算する工程。
【０１８２】 10．ＦＵ／分 対 酵素濃度、μ／ｌをプロットする工程（図４及び図５）。
【０１８３】 リパーゼ及びエステラーゼに対する新規合成アセチルＢＢＴ化合物の酵素活性
は、酵素による加水分解時に、これらの基質は極短時間で高感度の蛍光を与える
ことを示している。しかしながら、これらの新規基質、特にプロピオニルＢＢＴ
及びオレオイルＢＢＴは、リパーゼとエステラーゼとの間で強い選択性を示した
。プロピオニルＢＢＴは、ブタ肝臓エステラーゼに対しては非常に効果的な基質
であるが、リパーゼに対しては非常に効果の低い基質である。逆に、オレオイル
ＢＢＴは、シュードモナス由来リパーゼに対しては高い活性を示したが、エステ
ラーゼに対しては低活性であった（図４及び５）。
【０１８４】 実施例１１ オリゴヌクレオチド標識 （１）標識されたオリゴヌクレオチドの合成 ２’−（２−アセトキシベンゾチアゾリル）−６’−ベンゾチアゾリルエチル
ホスホアミダイトを、ＤＮＡ合成機中、標準自動化ＤＮＡ合成法を使用して、オ
リゴヌクレオチドの５’末端に組み込んだ。
【０１８５】 以下の配列（BBTE-TCTCCCAGCGTGCGCCAT（配列番号１））は標識したものの一 例である。
【０１８６】
【０１８７】 （２）標識オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析 標識したオリゴヌクレオチドを、DIONEX Nucleopac (PA-100)分析用HPLC陰イ オン交換カラムにより分析した。前記の標識した配列は９．６２分の保持時間を
有していたが、未標識の同一配列は９．１０の保持時間を示した。
【０１８８】 （３）ＵＶスペクトル 標識したオリゴヌクレオチドのＵＶスペクトルは、３８５ｎｍに最大吸収ピー
クを示した。これは２’−（２−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−６’−ベンゾ
チアゾール構造に典型的なものである。一方、未標識の同一オリゴヌクレオチド
は、この波長においてこのピークを示さなかった。
【０１８９】 （４）蛍光 標識したBBTE-TCTCCCAGCGTGCGCCAT（配列番号１）を、未標識TCTCCCAGCGTGCGC
CAT（配列番号１）と一緒に、標準ＤＮＡ電気泳動ゲル中で分離した。標識した オリゴヌクレオチドはゲル中に強い黄色の蛍光バンドを示したが、、未標識オリ
ゴヌクレオチドは示さなかった。
【０１９０】 実施例１２ タンパク質標識 標識したアミノ含有物質に対する、２’−（２−ヒドロキシベンゾチアゾリル
）−ベンゾチアゾール−６−酢酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの試
験 ２’−（２−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−ベンゾチアゾール−６−酢酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ
（７ｍｌ）に溶解した。タウリン（２．０ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ１０下
、水（１０ｍｌ）に溶解した。２つの溶液を組み合わせ、反応混合物を室温で一
晩攪拌した。溶液を、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ７〜８に中和し、次いで乾燥物まで濃
縮した。残渣を水に溶解し、Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。
収率は０．５ｇであった。
【０１９１】 MS: m/z 448(M-)
【０１９２】 標識したタンパク質に対する、２’−（２−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−ベ
ンゾチアゾール−６−酢酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの試験 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、５ｍｇ）を水（０．５ｍｌ）に溶解し、２’−
（２−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−ベンゾチアゾール−６−酢酸 Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルのＤＭＦ溶液（０．１ｍｌ中の１０ｍｇ）を添加
した。反応混合物のｐＨを、飽和炭酸ナトリウムでｐＨ９〜１０に調節した。室
温で３０分間の攪拌後、標識したＢＳＡサンプルを、未標識ＢＳＡサンプルと一
緒に標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した。標識したＢＳＡレーン
は、特徴的な２’−（２−ヒドロキシベンゾチアゾリル）−ベンゾチアゾールの
蛍光を示したが、未標識ＢＳＡレーンは示さなかった。
【０１９３】 実施例１３ ブロッティング技術を使用した分析物の検出 Ｃ１ＢＢＴＰを使用したタンパク質のウエスタンブロット検出 電気泳動用緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水及びＳＤＳの混合物であった（ｐＨ
８．３）。電気的移動（electrotranfer）用緩衝液は、Ｔｒｉｓ、グリシン及び
メタノールを含んでいた（ｐＨ８．４）。全てのブロッキング緩衝液及び洗浄用
緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、Tween-20及びハマーシュタインカゼイン（２５
０ｍＭ ＴＡＰＳ及び４％ Ｄ−マンニトールを有する、凍結乾燥した３．０ｍ
ｇのＣ１ＢＢＴＰ）（ｐＨ７）を含んでいた。再構成用緩衝液は、５００ｍＭ
ＤＥＡ（ジエタノールアミン）（ｐＨ９．１）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＺｎＣｌ2、０．０１％ ＮａＮ3を含んでいた。最終の洗浄用緩衝液は２５〜５
０ｍＭのＤＥＡ（ｐＨ９）から構成された。
【０１９４】 手順 １．タンパク質分析物（例えば、β−ガラクトシダーゼ）に連続希釈物を調製
する工程。
【０１９５】 ２．ポリアクリルアミドゲルを横断して分析物を電気泳動させる工程。
【０１９６】 ３．ゲルから膜（例えば、ＰＶＤＦ）へタンパク質分析物を電気的移動する工
程。
【０１９７】 ４．抗体を用いてタンパク質分析物を探査する工程。少なくとも１つの抗体又
はコンジュゲートがアルカリホスファターゼで標識されていることを確認する。
【０１９８】 ５．膜を、５００ｍＭ ＤＥＡ（ｐＨ９）（更に、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１Ｍ ＺｎＣｌ2及び０．０１％ ＮａＮ3を含む）中、再構成した０．２５ｍＭ Ｃ
１ＢＢＴＰの２ｍｌとともに５分間インキュベートする工程。
【０１９９】 膜を、２５〜５０ｍＭ ＤＥＡ（ｐＨ８）で洗浄し、ＵＶ光（３６５ｎｍ）で
可視化した。
【０２００】 前記の記載より、本発明の特定の態様が、説明目的で記載されているが、本発
明の精神及び範囲から離れることなしに種々の修飾を行うことができる。したが
って、本発明は、請求の範囲を除いて限定されるものではないことが理解される
だろう。
【０２０１】
【配列表】
【０２０２】 (2) 配列番号1に関する情報 (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ： 18 塩基対 (B) 配列の型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： cDNA (xi) 配列：配列番号1 TCTCCCAGCG TGCGCCAT 18
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｃは、ｎ＝０であるジベンザゾール化合物の代表的な化学構造を示
している。
【図２】 図２Ａ〜２Ｂは、Ｚ＝−Ｃ＝Ｃ−かつｎ＝１であるジベンザゾール化合物の代
表的な化学構造を示している。
【図３】 図３は、蛍光のｐＨ依存性を示している。
【図４】 図４は、ＢＢＴアシル誘導体に対するブタ肝臓エステラーゼの活性を示してい
る。
【図５】 図５は、ＢＢＴアシル誘導体に対するシュードモナス（Pseudomonas）種のリ パーゼの活性を示している。
【図６】 図６は、ｎ＝１かつＺ＝−Ｃ≡Ｃ−であるジベンザゾール化合物の代表的な化
学構造を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｆ 9/6541 Ｃ０７Ｆ 9/6541 Ｃ０７Ｈ 17/00 Ｃ０７Ｈ 17/00 19/10 19/10 19/20 19/20 21/02 21/02 21/04 21/04 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 33/533 33/533 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＮＺ (72)発明者 シュー チェン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94403 サン マテオ ロス プラドス 3014−＃エイ306 Ｆターム(参考） 4C056 AA01 AB01 AC02 AD03 AE02 CA09 CC01 CD01 CD06 4C057 BB02 BB05 DD01 KK30 LL19 LL21 MM02 MM04 4C063 BB03 CC62 DD52 EE05 4H050 AA01 AB80 AB99 【要約の続き】 溶解性を補助する又は化合物を別の部分に結合するリン カーアームを提供する置換基であり、又はＸはハロゲ ン、ＣＦ3又はＳＯ3Ｈである。これらの化合物は高い蛍 光性を有し、蛍光計を使用して容易に検出することがで きる。Ｙ基がＨ以外の置換基である誘導体は、除去され たときに化合物の蛍光を回復する蛍光阻害性化学部分を 含んでいる。これらの合成方法及び応用が提供される。

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の構造式を有する化合物。 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は独立してＨ又は該化合物の溶解性を補助 するか、又は該化合物を別部分に結合するリンカーアームを提供する置換基であ
    り、 ＹはＨ又は切断可能な部分であり、 Ｘは独立して水素、ハロゲン、ＣＦ3又はＳＯ3Ｈであり、 Ｖ及びＷは独立して酸素又はイオウであり、 Ｚは−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ−又は芳香族環部分であり、 ｎは０、１又は２である）
  2. 【請求項２】 下記の構造式を有する化合物 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は独立してＨ又は該化合物の溶解性を
    補助するか、又は該化合物を別部分に結合するリンカーアームを提供する置換基
    であり、 ＹはＨ又は切断可能な部分であり、 Ｘは独立して水素、ハロゲン、ＣＦ3又はＳＯ3Ｈであり、 Ｖ及びＷは独立して酸素又はイオウであり、 Ｚは−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ−又は芳香族環部分であり、 ｎは０、１又は２である）
  3. 【請求項３】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4又はＲ5がＨである、請求項１記載の化 合物。
  4. 【請求項４】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5又はＲ6がＨである、請求項２記載
    の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5が、−Ｈ、−ＳＯ3 -又は−ＣＯ2 - から独立して選ばれる、請求項１又は２に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 Ｙがホスホリル以外の切断可能な部分であるとき、Ｒ1、Ｒ2 、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5が独立してＰＯ4 -2である、請求項１又は２に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 Ｒ1及びＲ2又はＲ2及びＲ3又はＲ3及びＲ4が一緒になって芳
    香族環を形成する、請求項１又は２に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｒ1及びＲ2又はＲ2及びＲ3又はＲ3及びＲ4が一緒になってベ
    ンゼン又はナフタレンを形成する、請求項７記載の化合物。
  9. 【請求項９】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の中の少なくとも１つが−ＣＨ2 ＣＨ2ＳＯ3Ｈである、請求項１又は２に記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 Ｙが、ガラクトシル、グルコシル及びグルクロノシルから
    なる群より選ばれるグリコシル部分である、請求項１又は２に記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 Ｙが、ガラクトシル、グルコシル及びグルクロノシルから
    なる群より選ばれる、請求項１又は２に記載の化合物。
  12. 【請求項１２】 ＹがＲ8−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、Ｒ8は炭素数約１２〜約２
    ４の直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニル基である）である、請求項１又は
    ２に記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 Ｒ8が炭素数約１６〜約２０の直鎖又は分岐したアルキル 又はアルケニル基である、請求項１０記載の化合物。
  14. 【請求項１４】 Ｒ8がオレオイルである、請求項１３記載の化合物。
  15. 【請求項１５】 ＹがＲ7−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、Ｒ7は炭素数１〜約１２の
    直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニル基である）である、請求項１又は２に
    記載の化合物。
  16. 【請求項１６】 Ｒ7が炭素数１〜約５の直鎖又は分岐したアルキル又はア ルケニル基である、請求項１５記載の化合物。
  17. 【請求項１７】 Ｒ7がヘプタノイル、ラウロイル、プロピオニル又はイソ −ブチリルである、請求項１５記載の化合物。
  18. 【請求項１８】 Ｘが独立してＦ又はＣｌである、請求項１又は２に記載の
    化合物。
  19. 【請求項１９】 Ｚが、ベンゼン、ピロール、ピリジン、フラン及びチオフ
    ェンからなる群より選ばれる芳香族環部分である、請求項１又は２に記載の化合
    物。
  20. 【請求項２０】 図１に示される構造のいずれか一つを有する化合物。
  21. 【請求項２１】 図２に示される構造のいずれか一つを有する化合物。
  22. 【請求項２２】 更にリンカーアームを含む、請求項１又は２に記載の化合
    物。
  23. 【請求項２３】 リンカーアームが、式：−（ＣＨ2）n−Ｒ10（式中、ｎは
    ０、１、２、３、４及び５から選ばれる値であり、かつＲ10は−ＯＨ、−ＳＯ3 Ｈ、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）mＲ11、−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｃ
    Ｎ）（Ｎ（Ｒ9）2）、 （式中、Ｒ11は、−ＯＨ、ＳＯ3Ｈ及び−ＣＯＯＨの中から選ばれ、ｍは１、２ 、３、４及び５から選ばれる値であり、Ｒ9は炭素数１〜約６のアルキル基であ り、Ｂはプリン又はピリミジン部分である）からなる群より選ばれる）である、
    請求項２２記載の化合物。
  24. 【請求項２４】 ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、
    ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はビ
    オチンにコンジュゲートした、請求項１又は２に記載の化合物。
  25. 【請求項２５】 サンプル中の薬剤を検出する方法であって、 （ａ）ゲル電気泳動により、サンプルから薬剤を単離する工程、 （ｂ）該単離した薬剤を膜に移す工程、及び、 （ｃ）該膜上の該単離した薬剤に、薬剤結合性リガンドを添加する工程であっ
    て、該薬剤結合性リガンドが請求項１又は２に記載の化合物にコンジュゲートし
    ている工程、 （ｄ）該薬剤結合性リガンドの該薬剤への結合を許容する条件及び時間で、該
    薬剤結合性リガンドと該膜とをインキュベートする工程、及び （ｅ）蛍光により該化合物の存在を検出する工程、 を含むことを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 薬剤がタンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項２５
    に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 サンプル中の薬剤を検出する方法であって、 （ａ）請求項１又は２に記載の化合物をサンプルに添加する工程、及び （ｂ）蛍光により該化合物の存在を検出する工程 を含むことを特徴とする方法。
  28. 【請求項２８】 サンプル中の２以上の薬剤を同時に検出する方法であって
    、 （ａ）検出する薬剤に結合する２以上の薬剤結合性リガンドにコンジュゲート
    した請求項１又は２に記載の２以上の化合物を添加する工程、及び （ｂ）蛍光により各化合物の存在を検出する工程 を含むことを特徴とする方法。
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