CN104059376B - 一种不对称菁染料化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种不对称菁染料化合物(I)，及其作为淬灭剂的应用。本发明提供的不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭ROX通道的荧光，同时可以对稳定DNA双链，使PCR过程中解链温度增加2～3℃，不但可以应用于常规的实时荧光定量PCR检测方法，而且可以有效地使用在针对单核苷酸多态性分析领域。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种不对称菁染料化合物，及其作为荧光淬灭剂尤其是ROX通道荧光淬灭剂的应用。
(二)背景技术
核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一，可以用来对遗传疾病进行诊断，人体鉴定，微生物鉴定，亲子鉴定，近年来正逐渐用于病毒的特异，敏感和快速诊断。
核酸杂交技术一个很重要的方面是对杂交的探测，一个经常使用的工具是荧光寡核苷酸探针，一种特别有用的荧光探针类型是自淬灭探针，此探针包括了报告染料和淬灭染料，二者之间通过荧光共振能量转移(FRET)过程发生作用。尽管使用该基序的不同探针的设计可能在细节上存在差异，FRET探针含有连接到寡核苷酸上的荧光团和淬灭剂。
实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光信号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
荧光染料广泛用于生物学研究和诊断，荧光染料优于常规的放射性材料，因为荧光染料通常具有足够的检测灵敏度，廉价并且无毒，具有可区分颜色范围的各种荧光团使得能平行检测多种生物学靶标的多重实验更加可行，在体外和体内描述不同生物学靶标之间在空间和时间上的关系常要求能平行显示多个靶标。此外，大量荧光染料为进行高通量和自动化试验打开了新的通道。
ROX荧光染料现有技术中一般用于调整PCR加样误差所引起的PCR管与管之间的差异，目前还未有ROX通道淬灭剂被广泛使用。
(三)发明内容
本发明的目的是提供新的淬灭剂，其具有低背景信号和/或高淬灭功效。本发明提供一种不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭ROX的荧光。
本发明采用的技术方案是：
一种不对称菁染料化合物，其结构如式(I)所示：
式(I)中：
R1为-H、-NO2、-OH或C1～C4烷基；
R2为-H、C1～C4烷基、苯基或卤素取代苯基；
R3、R4为-H、C1～C4烷基或活性基团，并且R3、R4中至少一个为活性基团。
所述活性基团是指可以与其它化学基团反应而形成共价化学键的基团，在合适的反应条件下具有共价活性，是与其它底物连接的点，包括亲电、亲核和光活性基团。
本发明化合物是具有化学活性和可以被至少一个活性基团取代的，活性基团的功能是作为连接其它部分的位点，此处活性基团与载体或者固相支撑物上的合适的活性基团进行化学反应。
典型的，本发明化合物包含的活性基团，可以是丙烯酰胺，羧酸的活化酯，酰基叠氮，酰腈，醛，酮，烷基卤，烷基磺酸酯，酸酐，苯胺，氨基，芳基卤，叠氮，氮丙碇，硼酸酯，重氮烷，环氧化物，卤代乙酰胺，卤代三嗪，亚胺基酯，异氰酸酯，异硫氢酸酯，马来酰亚胺，亚磷酰胺，磺酸酯，磺酰氯，顺铂等。一般而言，活性基团可以为羧基，羧酸的丁二酰亚胺酯，肼，氨基或马来酰亚胺。
本发明化合物至少含有一个活性基团选择性的与氨基反应，这个具有氨基反应活性的基团可以是琥珀酰亚胺酯，磺酰卤，四氟苯酯或异硫氰酸酯。因此，本发明化合物可以与样品中含有氨基的分子形成共价键。或者，本发明化合物也可以至少含有一个可以与硫醇基团反应的活性基团，具有硫醇基团反应活性的基团可以是马来酰亚胺，卤代烷或卤代乙酰胺酯。又或者，所述活性基团还可以是可以与羟基基团反应的基团，例如亚磷酰胺。
优选的，所述活性基团为下列之一：羧酸(-COOH)，羧酸的丁二酰亚胺酯()，肼(-NH-NH2)，氨(-NH2)，马来酰亚胺亚磷酰胺
所述化合物(I)更优选为下列之一：
合成本发明不对称箐染料化合物的通用方法如下式所述(其中用R5表示)：
具体方法如下：季胺化的苯并噻唑衍生物(III)与4-甲基喹啉季胺盐例如化合物(II)，在吡啶中回流，反应完毕后，将DMF倒入搅拌的水中，加入盐酸酸化，过滤，用稀盐酸洗涤，干燥，即得。
本发明化合物优选将羧基转化为其活性形式，例如琥珀酰亚胺酯与氨基反应。例如染料I-2，I-3溶解在DMF中加入2-琥珀酰亚胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯与DIEA.产品用稀盐酸析出，洗涤然后干燥。
在具体的使用中，带有活性基团(例如琥珀酰亚胺酯)的本发明化合物与经过氨基改性的寡核苷酸(经标准固相寡核苷酸步骤合成并脱掉氨基保护)在DMF中，加入弱碱(例如NEt3，DIEA等)反应30min～1h后用乙醇沉淀寡核苷酸，洗涤出去多余的本发明化合物，然后对标记上本发明化合物的寡核苷酸进行纯化，即得到荧光寡核苷酸探针。
本发明还涉及所述的不对称菁染料化合物作为荧光淬灭剂的应用。
优选的，所述淬灭剂为ROX通道淬灭剂。本发明化合物可有效淬灭ROX的荧光，同时可以对稳定DNA双链，使PCR过程中解链温度增加，即Tm值升高，提示其在荧光定量PCR分子检测领域将有较好的应用前景。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭ROX通道(610nm)的荧光，同时可以对稳定DNA双链，使PCR过程中解链温度增加2～3℃，不但可以应用于常规的实时荧光定量PCR检测方法，而且可以有效地使用在针对单核苷酸多态性分析领域。
(四)附图说明
图1为实施例8扩增的实时荧光曲线(Fluorescencehistory)图；1为不加淬灭基团的ROX探针，2为加入淬灭剂化合物I-3的ROX探针，3为加入淬灭基团BHQ2的ROX探针，纵坐标为荧光值(Fluorescence)，横坐标为循环数(cycles)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：化合物(III)的合成
2，3-二甲基苯并恶唑对甲苯磺酸盐(180mg，0.52mmol)，二苯甲脒(160mg，0.8mmol)和醋酸酐2ml回流30分钟，冷却后将其滴入乙醚中得到产品170mg。
产物核磁数据1HNMR:1.82(s，3H)，2.34(s，3H)，6.06(m，1H)，7.7(m，1H)，4.39(s，3H)，7.5-8.6(m，13H)。
实施例2：化合物(II)的合成
4-甲基喹啉(4.8ml，0.0363mol)与2-(4-(溴甲基)-2-硝基苯基)丙酸甲酯(根据NaokiYamakawaetal.，Bioorganic&MedicinalChemistry19(2011)3299-3311制备)(16.44g，0.05445mol)混合，在110℃下反应过夜，冷却后，加入甲醇20ml溶解后悬蒸得到粘稠状固体，然后加入丙酮200ml搅拌，搅拌2h后有产物析出，过滤，干燥得到产品化合物(II)6.4g。
产物核磁数据1HNMR:1.51(s，3H)，2.66(s，3H)，3.6(d，3H)，3.7(m，1H)，5.95(s，2H)，7.5-8.6(m，9H)。
实施例3：化合物(I-1)的合成
化合物III(58mg，0.13mmol)与化合物(II)(89mg，0.2mmol)溶解在2ml吡啶中，加热回流30分钟后，反应结束后，旋蒸除去吡啶，剩余物倒入水中，滴加5％盐酸，产物析出后进行过滤，将过滤得到的产物溶解在30ml的甲醇和水(体积比1:1)中，加入80mg的氢氧化钠水解，水解后，再次滴入浓盐酸，产物析出后，过滤，干燥得最终产品。
产物核磁数据1HNMR:(1.56(m，3H)，3.82(m，1H)，4.39(s，3H)，5.5(m，3H)，6.65(m，1H)，6.71(m，1H)，8.54(m，1H)，7.3-8.6(m，12H)。
实施例4：化合物(I-2)的合成
化合物(I-1)(35.9mg，0.056mmol)溶解在0.5mlDMF中，加入0.05mlDIEA后加入TSTU(34mg，0.12mmol)。混合物在室温下搅拌2～3h，TLC监控反应，反应结束后，加入2ml5％HCl，析出物用稀盐酸洗涤过滤后干燥得产品XXmg。
核磁数据1HNMR:1.56(m，3H)，2，46(m，4H)，3.82(m，1H)，4.39(s，3H)，5.5(m，3H)，6.65(m，1H)，6.71(m，1H)，8.54(m，1H)，7.3-8.6(m，12H)。
实施例5：化合物(I-3)的合成
6-硝基-3-甲基-2-甲氧基苯并噻唑对甲苯磺酸盐(5.2g，0.014mol)与化合物(II)(4.45g，0.01mol)溶解在20mlDMF中，在室温下滴加3.9ml的三乙胺，然后搅拌过夜，反应结束后，将产品倒入水中，滴加5％盐酸，产物析出后进行过滤，将过滤得到的产物溶解在30ml1:1的甲醇和水中，加入5.6g的氢氧化钠水解，水解后，再次滴入浓盐酸使产物析出后，过滤，干燥后的产物取(32.4mg，0.056mmol)溶解在0.5mlDMF中，加入0.05mlDIEA后加入TSTU(34mg，0.12mmol)。混合物在室温下搅拌2～3h，TLC监控反应，反应结束后，加入2ml5％HCl，析出物用稀盐酸洗涤过滤后干燥得最终产品。
产物核磁数据1HNMR:1.56(m，3H)，2，46(m，4H)，3.82(m，1H)，4.39(s，3H)，5.5(m，3H)，6.65(m，1H)，6.71(m，1H)，8.54(m，1H)，7.3-8.6(m，11H)。
实施例6：化合物(I-4)的合成
100mg化合物(I-3)溶解在10ml二甲基乙酰胺中，降温到0℃，加入100mg肼，反应化合物在0℃下搅拌1h，反应结束后真空下除去溶解，剩余物经柱层析纯化后得到产品。
产物核磁数据1HNMR:1.56(m，3H)，3.82(m，1H)，4.39(s，3H)，5.5(m，3H)，6.65(m，1H)，6.71(m，1H)，8.54(m，1H)，7.3-8.6(m，11H)。
实施例7：化合物(I-5)的合成
200mg化合物(I-3)溶解在10ml二甲基乙酰胺中，降温到0℃，加入180mgN-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐，然后加入0.2ml三乙胺，反应混合物在0℃下搅拌1h后，真空蒸出溶剂，剩余物经柱层析得产品。
产物核磁数据1HNMR:1.56(m，3H)，3.46(t，2H)，3.73(t，2H)，3.82(m，1H)，4.39(s，3H)，5.5(m，3H)，6.65(m，1H)，6.71(m，1H)，6.94(d，2H)，8.54(m，1H)，7.3-8.6(m，11H)。
实施例8：验证淬灭基团作用
使用仪器：ABI7500
实验方案：选取一套工作正常的探针标记ROX荧光基团，一条合成时加入淬灭剂化合物I-3，一条合成时不加入淬灭基团，一条合成时加入BHQ2淬灭基团，具体序列如下：
InfA-FP：5’-GACCRATCYTGTCACCTCTGAC-3’
InfA-RP：5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’
InfA-P1：5’-ROX-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-3’
InfA-P2：5’-ROX-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-化合物I-3-3’
InfA-P3：5’-ROX-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-BHQ2-3’
然后使用同样的试剂，同样的流感病毒核酸模板、同样的扩增程序进行PCR反应。
PCR反应液配制(25μl反应体系)：
| 试剂组分(初始浓度) | 加入量(μl) | 终浓度 |
| RT Reaction Buffer | 7.5 | |
| Enzyme Mix | 5 | 1× |
| FP(上游引物)(10pM) | 1 | 400nM |
| RP(下游引物)(10pM) | 1 | 400nM |
| InfA-P1、InfA-P2或InfA-P3探针(10pM) | 0.5 | 200nM |
| 待检样品 | 1～5μl | 5copies～100ng |
| ddH2O | 补至25μl体积 |
PCR反应条件(HRRT-PCRMasterMix)：
由图可见，由于infA-P1探针未加入淬灭基团，ROX荧光不能被淬灭，所以荧光背景很高，在扩增时没有扩增信号，而加入本发明淬灭基团的infA-P2探针和加入BHQ2淬灭基团的infA-P3，ROX荧光被淬灭基团淬灭，在反应开始时荧光背景很低，随着PCR扩增的进行，探针被酶切后不能被淬灭基团淬灭，荧光慢慢释放出来，就有了明显的扩增曲线，而本发明淬灭基团的淬灭效果较BHQ2好故背景更低。
Claims (2)
1.一种不对称菁染料化合物，其特征在于所述化合物结构式为下列之一：
2.如权利要求1所述的不对称菁染料化合物作为荧光淬灭剂的应用。
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