CN101555246A - 含卤素不对称菁类化合物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类含卤素不对称菁类化合物及其制备方法。该化合物发射波长长，摩尔消光系数大，灵敏度高，光稳定性好，可以用作荧光染料，尤其适于小型廉价的红色半导体激光器作为光源，可用于核酸分子识别、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及精细化工领域中一类新的化合物，特别是涉及一类含卤素的不对称菁类化合物、其制备方法以及作为荧光染料的应用。
背景技术
荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其作为分子探针在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。最早应用于生物分析的荧光染料有新亚甲兰(NMB)、吖啶橙(AO)、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)、碱性黄7(CPO)等。但这些染料都各自存在着应用的局限性，主要表现在染料自身的荧光会造成高的荧光背景，干扰检测；溴乙锭等吖啶，菲啶类染料有很大的毒性和致癌性。为满足日新月异的生物分析应用的需求，研究开发出具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料仍然是荧光分析技术发展的关键和核心。目前，使用比较多的有罗丹明、荧光素类、BODIPY类和菁类荧光染料。其中菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光检测探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用。其中作为荧光探针在超敏核酸定量检测、基因组学技术、蛋白分析中应用尤为关注的焦点。
菁类荧光染料从由Williams发现至今已有150年的历史，结构特点为甲川链两端连接着含N芳香母核。该芳香母核的种类包括噻唑、噻吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等，按其相同与否可分为对称和不对称两类。其中，不对称菁染料主要应用于物理结合荧光标示，与核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结合方式取决于染料的结构及染料与核酸浓度的比例。不对称菁染料中最典型的一类为TOTO及其类似物和衍生物类。TOTO(噻唑橙二聚体)、YOYO(恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链两端的染料分子可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液中无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰，与核酸结合后荧光增强。Jason等用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了TOTO和YOYO与DNA的双嵌入作用[J.A.Bordelon，K.J.Feierabend，S.A.Siddiqui，L.L.Wright.J.Phys.Chem.B，2002，106，4838-3843]。Fürstenberg等利用超快速荧光转换和时间相关单光子计数法进一步阐述了荧光增强的动力学机理。[A.Fürstenberg，M.D.Julliard，T.G.Deligeorgiec，N.I.Gadjev.J.AM.CHEM.SOC.，2006，128，7661-7669]此类染料中的有些品种已经商品化了，如：SYTOX Blue，TOTO-1，POPO-1，BOBO-1，YO-PRO-1等。但这些商品化的染料大部分光谱都处在紫外可见光区(490～530nm)、而生物样品在这个区域有很强的吸收和一定强度的荧光发射，造成强的荧光背景，从而使荧光检测效率大大降低。尽管通过增加共轭链数可以使染料的吸收和发射波长产生红移达到近红外区(650～1000nm)，如TOTAB、TOTIN、TO-PRO-3、PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M.Sovenyhazy，J.A.Bordelon，J.T.Petty.Nucleic Acids Res，2003，31，2561]，但这类染料一般分子较大，细胞通透性差，合成复杂，步骤多。或者，即使现有的一些染料其吸收和发射波长处于近红外区，但其与核酸的结合能力不足，检测灵敏性不够理想。
目前，对结构简单，性能优良的荧光染料需求量仍然很大，因此研究和开发出低检测线，高灵敏度，长波长，光稳定性好的化合物用作荧光染料对生物荧光标示技术的发展至关重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一类结构简单、具备高灵敏性、长波长、光稳定性好的新的化合物。
本发明的另一目的在于提供一种上述化合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述化合物作为荧光染料的应用。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种含卤素不对称菁类化合物，其具有如下结构通式I
其中，
m为1～18的整数；
n为1或2；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1、R2为相同或不同的H、C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5或卤素；
R3为卤素；
R4为C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5、取代或未取代的苄基；
R5为H或C1-18烷基；
Y-为卤素离子、ClO4 -、PF6 -或OTs-。
当R4为取代的苄基时，苄基的取代基团为H、C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5、COORs、NO2、CN或卤素。
本发明还公开了上述化合物的制备方法，所述方法包括：
分别制备第一中间体及第二中间体，所述第一中间体为4-甲基喹啉的季铵盐中间体，第二中间体为2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并恶唑、2-甲基苯并硒唑或2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉的芳香杂环季铵盐中间体；
将第一或第二中间体中的一个与缩合剂反应，之后再与另一中间体在三乙胺或吡啶的作用下反应得到所述化合物。
所述缩合剂优选为N，N-二苯甲脒或者丙二醛缩苯胺盐酸盐。
本发明的上述新化合物可以用作荧光染料。
由于采用了以上技术方案，使本发明中的新化合物用作荧光染料时具备的有益效果在于：
(1)本发明的新染料化合物分子通过引入卤素基团，使染料与核酸的结合能力增强，提高了检测灵敏度。
(2)本发明的新染料化合物分子中引入的Cl、Br和I反应活性基团，可进一步与其它功能性小分子结合，从而可预计实现染料对生物分子的选择性识别。
(3)本发明的新染料化合物一端引入喹啉杂环，与甲川链相同的对称苯并噻唑和吲哚啉类菁染料相比，最大吸收波长可增加约80nm，发射波长范围宽，可达650nm～900nm的近红外区，可避免生物自身的荧光背景干扰。染料摩尔消光系数大，灵敏度高，光稳定性好，可应用于核酸分子识别、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
(4)本发明的新染料化合物可应用廉价、体积小、性能稳定的红色半导体激光器作为光源，大大降低使用成本。
(5)本发明的新染料产品毒副性小，原料易得，结构简单，一般通过4到5步反应即可合成目标分子，易产业化。
附图说明
图1是化合物A、B和C在乙醇中的光稳定性比照图。横坐标为光照时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光源为500W碘钨灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda 35。
图2是化合物A在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：PTI-700。
图3是化合物B在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：PTI-700。
图4是化合物C在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：PTI-700。
图5是化合物B在含不同浓度pBR322质粒DNA的PH 7.82，浓度20mM的Tris-HCl缓冲液中荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。化合物B的浓度为2μM。箭头表示DNA的浓度(μg/mL)变化从小到大依次为0，0.33，0.67，1，1.33，1.67，2.33，3，3.67，4.33。所用仪器为荧光分光光度计，型号：PTI-700。
图6是化合物M在含不同浓度pBR322质粒DNA的PH 7.82，浓度20mM的Tris-HCl缓冲液中荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。化合物B的浓度为2μM。箭头表示DNA的浓度(μg/mL)变化从小到大依次为0，0.33，0.67，1，1.33，1.67，2.33，3，3.67，4.33。所用仪器为荧光分光光度计，型号：PTI-700。
图7是相同浓度的化合物B和M在PH 7.82，浓度20mM的Tris-HCl缓冲液中与等量的pBR322质粒DNA结合后荧光增强的对比图。化合物B和M的浓度均为2μM。
具体实施方式
本发明结合现有的各类菁染料的优点，且在其基础上改进，设计的一类含卤素不对称菁类化合物，其具有下列结构通式(I)，并可用作荧光染料：
通式I中，
m为1～18的整数；
n为1或2；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1、R2为相同或不同的H、C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5或卤素；
R3为卤素；
R4为C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5、取代或未取代的苄基；
R5为H或C1-18烷基；
Y-为卤素离子、ClO4 -、PF6 -或OTs-。
当R4为取代的苄基时，苄基的取代基团为H、C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5、COOR5、NO2、CN或卤素。
该含卤素不对称菁类化合物的合成，首先是制备中间体，即取代或未取代的4-甲基喹啉芳香杂环与卤代化合物反应。所述卤代化合物为烷基卤代物，其中的烷基可以是直链的或者具有支链的。4-甲基喹啉芳香杂环与卤代化合物两者的摩尔比为1∶1～2，在甲苯中回流12-36小时，可制得季铵盐中间体(II)：
其次，将制得的4-甲基喹啉的季铵盐中间体与缩合剂缩合可得到具有通式的化合物(III)。其中缩合剂优选用N，N-二苯甲脒或者丙二醛缩苯胺盐酸盐。
最后将(III)与制备(II)同样方法得到的取代或未取代的2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并恶唑、2-甲基苯并硒唑或2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉等芳香杂环季铵盐中间体在三乙胺或吡啶的作用下反应即可得到这类含卤素不对称菁类化合物。
或者，本发明的含卤素的不对称菁类化合物，也可以采用先合成取代或未取代的2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并恶唑、2-甲基苯并硒唑或2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉等芳香杂环季铵盐中间体，然后将该中间体与缩合剂反应，之后再与4-甲基喹啉的季铵盐中间体在三乙胺或吡啶的作用下反应得到。
本发明含卤素不对称菁类化合物至少具备如下特点：
(1)新化合物分子中引入卤素基团，用作荧光染料时，其与核酸的结合能力增强，提高了检测灵敏度。
(2)新化合物分子中引入的Cl、Br和I反应活性基团，用作荧光染料时，可进一步与其它功能性小分子结合，从而可预计实现染料对生物分子的选择性识别。
(3)新化合物一端引入喹啉杂环，与甲川链相同的对称苯并噻唑和吲哚啉类菁染料相比，最大吸收波长可增加约80nm，发射波长范围宽，可达650nm～900nm的近红外区，用作荧光染料时，可避免生物自身的荧光背景干扰，且摩尔消光系数大，灵敏度高，光稳定性好，可应用于核酸分子识别、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
(4)新化合物用作荧光染料时可应用廉价、体积小、性能稳定的红色半导体激光器作为光源，大大降低使用成本。
(5)新化合物用作荧光染料，其毒副性小，原料易得，结构简单，一般通过4到5步反应即可合成目标分子，易产业化。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
新化合物中间体1-乙基-4-甲基喹啉季铵盐的合成：
将20mmol 4-甲基喹啉和40mmol碘乙烷加入到100ml含20ml甲苯的圆底烧瓶中，氩气保护。反应加热回流持续反应24h后停止，加热以反应体系开始回流为标准，温度约为110度。混合物冷却后过滤沉淀并用乙醚洗涤滤饼。干燥后得到淡黄色的固体粉末，粗收率85％。
实施例2
化合物A的制备：
将10mmol 1-乙基-4-甲基喹啉季铵盐与30mmolN，N’-二苯基甲脒在50ml醋酐中，于100℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的黄褐色油状物倒入乙醚中析出黄色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，收集黄色组分，收率41％。向其中加入1-氟乙基-2-甲基苯并噻唑季铵盐4mmol及三乙胺1ml，在25ml乙二醇单甲醚中回流搅拌1.5小时。其中，1-氟乙基-2-甲基苯并噻唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到。再向反应液中加入4mmol NaClO4溶于2mlDMF中得到的溶液，继续加热搅拌10分钟，将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶乙醇＝200∶15，收集蓝色组分，收率60％。1H-NMRδ(400MHz，CD3Cl，TMS)δ＝1.23(t，3H)，3.68(t，2H)，4.27(t，2H)，4.66(tetra，2H)，6.61(d，1H)，7.07(d，1H)，7.21-7.77(m，8H)，7.92(t，1H)，8.38(d，1H)，8.87(d，1H)。MS(EI)C23H22ClFN2O4Sm/z：377.15[M-ClO4]+。
实施例3
化合物B的制备：
将10mmol 1-乙基-4-甲基喹啉季铵盐与30mmolN，N’-二苯基甲脒在50ml醋酐中，于100℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的黄褐色油状物倒入乙醚中析出黄色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，收集黄色组分，收率41％。向其中加入1-氯乙基-2-甲基苯并噻唑季铵盐4mmol及三乙胺1ml，在25ml乙二醇单甲醚中常温搅拌12小时。其中，1-氯乙基-2-甲基苯并噻唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到。将反应液倒入乙醚中，析出蓝绿色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶5，收集蓝色组分，收率62％。1H-NMRδ(400MHz，CD3Cl，TMS)δ＝1.23(t，3H)，3.62(t，2H)，4.27(t，2H)，4.66(tetra，2H)，6.61(d，1H)，7.07(d，1H)，7.21-7.77(m，8H)，7.92(t，1H)，8.38(d，1H)，8.87(d，1H)。MS(EI)C23H22ClIN2S m/z：393.12[M-I]+。
实施例4
化合物C的制备：
将10mmol 1-溴丁基-2-甲基苯并噻唑季铵盐(该1-溴丁基-2-甲基苯并噻唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)与15mmol N，N’-二苯基甲脒在40ml醋酸中，于90℃油浴上加热搅拌2小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3.5，收集黄色组分，收率37％。向其中加入1-乙基-4-甲基喹啉季铵盐3mmol及三乙胺1ml，在25ml乙二醇单甲醚中常温搅拌12小时。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶乙醇＝100∶20，收集蓝色组分，收率74％。1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)δ＝1.23(t，3H)，2.05(m，2H)，2.18(m，2H)，3.56(t，2H)，4.27(t，2H)，4.67(tetra，2H)，6.60(d，1H)，7.07(d，1H)，7.21-7.77(m，8H)，7.92(t，1H)，8.38(d，1H)，8.87(d，1H)。MS(EI)C25H26BrIN2S m/z：465.1[M-I]+。
实施例5
化合物D的制备：
将10mmol 1-溴丁基-2-甲基-4-氯苯并恶唑季铵盐(该1-溴丁基-2-甲基-4-氯苯并恶唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)与15mmol N，N’-二苯基甲脒在40ml醋酸中，于90℃油浴上加热搅拌2小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶6，收集黄色组分，收率33％。向其中加入1-羟基异丙基-4，7-二甲基喹啉季铵盐(该1-羟基异丙基-4，7-二甲基喹啉季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)3mmol及吡啶1ml，在20ml乙二醇单甲醚中常温搅拌12小时。再向反应液中加入4mmol NaClO4溶于2mlDMF中得到的溶液，继续加热到100℃搅拌10分钟，将反应液倒入乙醚中，析出蓝绿色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶10，收集蓝色组分，收率75％。1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)δ＝1.22(d，3H)，2.05(m，2H)，2.18(m，2H)，2.35(s，3H)，3.56(t，2H)，3.80(m，1H)，4.27(t，2H)，4.63(m，2H)，6.57(d，1H)，6.98(d，1H)，7.19-7.80(m，6H)，7.97(t，1H)，8.48(d，1H)，8.87(d，1H)。MS(EI)C27H29BrCl2N2O6 m/z：527.11[M-ClO4]+。
实施例6
化合物E的制备：
将8mmol 1-氯乙基-2-甲基-4-甲氧基苯并-1，3-硒唑季铵盐(该1-氯乙基-2-甲基-4-甲氧基苯并-1，3-硒唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)与12mmolN，N’-二苯基甲脒在30ml醋酸中，于90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的红色油状物用正己烷悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶4，收集黄色组分，收率38％。向其中加入1-(4-硝基)-苄基-4-甲基喹啉季铵盐(该1-(4-硝基)-苄基-4-甲基喹啉季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)3mmol及吡啶1ml，20ml乙醇中常温搅拌18小时。再向反应液中加入4mmol NaBr溶于2mlDMF中得到的溶液，继续加热到100℃搅拌10分钟。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶12，收集蓝色组分，收率47％。1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)δ＝3.57(t，2H)，3.73(s，3H)，4.27(t，2H)，5.72(s，2H)，6.48(d，1H)，7.02(d，1H)，7.22-7.85(m，11H)，8.29(t，1H)，8.38(d，1H)，8.85(d，1H)。MS(EI)C29H25BrClN3O3Se：m/z：578.07[M-Br]+。
实施例7
化合物F的制备：
将10mmol 1-氟甲基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉季铵盐(该1-氟甲基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)与丙二醛缩苯胺盐酸盐在20ml溶剂(醋酸∶醋酸酐＝1∶1)中加热到120℃，反应1小时后，冷却，加入乙酸乙酯析出固体。过滤，乙酸乙酯洗涤3次，除去未反应的过量的缩合剂。干燥，得棕黄色粉末，粗收率76％。向其中加入1-甲氧基乙基-4-甲基喹啉季铵盐(该1-甲氧基乙基-4-甲基喹啉季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)4mmol及醋酐8ml，90℃油浴上加热搅拌2小时。再向反应液中加入4mmol NaI溶于2mlDMF中得到的溶液，继续加热到100℃搅拌10分钟将反应液倒入乙醚中，析出蓝绿色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶22，收集蓝色组分，收率66％。1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)δ＝1.73(s，6H)，3.24(s，3H)，3.82(t，2H)，4.64(t，2H)，4.78(s，2H)，6.24(d，1H)，6.37(d，1H)，6.48(t，2H)，7.22-7.85(m，8H)，8.29(t，1H)8.38(d，1H)，8.45(d，1H)。MS(EI)C28H30FIN2O m/z：429.23[M-I]+。
实施例8
化合物A、B、C和M在乙醇中的光稳定性测定：
化合物M为已知化合物。M结构如下：
将化合物A、B、C和M分别配成1×10-5M的乙醇溶液装入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品20cm处，通电光照，计时。每隔1小时后，测量样品光照后的吸光度值。如图1所示，经过7小时光照后，化合物M和A、B、C在乙醇中分别褪色35％、30％、25％、23％。结果显示，化合物A、B、C相比较化合物M，具有较强的光稳定性。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda35。
实施例9
化合物A、B和C在乙醇中的荧光量子产率的测定：
配置一定浓度的化合物A、B和C的乙醇溶液，满足经紫外可见分光光度计测定最大吸收值＜0.1。分别选定激发波长测定荧光强度。平行测定三次，算出荧光量子产率，取平均值。以罗丹明B作为标准物(ΦF＝0.97，乙醇，15℃)计算，在乙醇溶液中化合物A的荧光量子产率ΦF＝0.10；B的荧光量子产率ΦF＝0.12；C的荧光量子产率ΦF＝0.097。如图2、3和4分别为化合物A、B和C在乙醇中的吸收和发射光谱。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：PTI-700。
实施例10
化合物A、B和C在乙醇中的摩尔消光系数的测定：
配置浓度为1×10-5M的化合物A、B和C的乙醇溶液，分别取50μL加乙醇稀释至3mL置于厚度为1cm的比色皿中，测定其吸光度值。每个样品平行测定三次，根据Lambert-Beer定律，算出摩尔消光系数，取平均值。在5℃下，乙醇溶液中，εA＝1.23×105，εB＝1.07×105，εC＝0.63×105。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda35。
实施例11
化合物B在含不同浓度DNA的缓冲液中荧光强度的测定：
配置浓度为1×10-3M的化合物B的DMSO溶液，取6μL加PH7.82，浓度20mM的Tris-HCl缓冲液稀释至3mL置于比色皿中，测定其荧光强度。然后，取浓度为0.5μg/μL的pBR322质粒DNA 2μL滴加到上述比色皿中，稳定后测定其荧光强度。如此继续滴加该DNA并待稳定后测定荧光强度值，结果见图5，随着DNA浓度的增大，荧光逐渐增强；当2μM的化合物B与4.33μg/μL的pBR322质粒DNA结合后，荧光增强7.4倍。与M相比可以发现，化合物B与DNA结合后荧光强度有较大幅度的增加。同时，染料B发射光谱与加入DNA之前相比出现4-5nm左右的红移。本测试温度为10℃；所用仪器为荧光分光光度计，型号：PTI-700。
比较例
化合物M在含不同浓度DNA的缓冲液中荧光强度的测定：
配置浓度为1×10-3M的化合物M的DMSO溶液，取6μL加PH7.82，浓度20mM的Tris-HCl缓冲液稀释至3mL置于比色皿中，测定其荧光强度。然后，取浓度为0.5μg/μL的pBR322质粒DNA 2μL滴加到上述比色皿中，稳定后测定其荧光强度。如此继续滴加该DNA并待稳定后测定荧光强度值，结果见图6，随着DNA浓度的增大，荧光逐渐增强；当2μM的化合物M与4.33μg/μL的pBR322质粒DNA结合后，荧光增强4.9倍。同时，M发射光谱与加入DNA之前相比出现4-5nm左右的红移。本测试温度为10℃；所用仪器为荧光分光光度计，型号：PTI-700。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一类含卤素不对称菁类化合物，其特征在于：所述化合物具有如下结构通式I
其中，
m为1～18的整数；
n为1或2；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1、R2为相同或不同的H、C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5或卤素；
R3为卤素；
R4为C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5、取代或未取代的苄基；
R5为H或C1-18烷基；
Y-为卤素离子、ClO4 -、PF6 -或OTs-。
2、根据权利要求1所述的一类含卤素不对称菁类化合物，其特征在于：当R4为取代的苄基时，苄基的取代基团为H、C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5、COOR5、NO2、CN或卤素。
3、权利要求1或2所述的含卤素不对称菁类化合物的制备方法，所述方法包括：
分别制备第一中间体及第二中间体，所述第一中间体为4-甲基喹啉的季铵盐中间体，第二中间体为2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并恶唑、2-甲基苯并硒唑或2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉的芳香杂环季铵盐中间体；
将第一或第二中间体中的一个与缩合剂反应，之后再与另一中间体在三乙胺或吡啶的作用下反应得到所述化合物。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述缩合剂为N，N-二苯甲脒或者丙二醛缩苯胺盐酸盐。
5、权利要求1或2所述的含卤素不对称菁类化合物作为荧光染料的应用。
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