CN102964863A - 吲哚类半菁染料的合成与应用 - Google Patents
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Abstract
一类吲哚类半菁染料的合成与应用，属于精细化工领域中一类功能染料的合成及其作为荧光染料的应用。这类化合物由吲哚季铵盐与相应的醛缩合而成，具有摩尔消光系数大，光稳定性好，易于合成等优点。该类分子根据其取代基、阴离子的不同，可以具有pH探针性质、固态荧光性质和与生物大分子结合的性能。作为pH探针时，可根据取代基的不同调节探针的pKa，并且可用于双色活细胞成像；作为固态发射染料时，根据取代基与阴离子的不同，可以调节其固态发射波长；作为生物分子探针时，对生物分子有很好的反应，且具有活细胞细胞膜通透能力，可用于细胞染色，而且由于其吸收和发射波长较长，可以避免生物质自荧光的干扰，还能降低激发光对细胞或生物组织的损伤。
Description
技术领域
本发明涉及一类吲哚类半菁染料的合成与应用，属于精细化工领域中一类功能染料的合成及其作为荧光染料的应用。
背景技术
细胞内质子在许多细胞过程中都扮演一个重要的角色，如：细胞的成长、 钙的调节、 细胞内吞作用、细胞粘连等。研究细胞内pH的动力学对理解许多细胞内生理机能的调节机制是至关重要的。检测细胞内pH的方法很多，如微电极、核磁共振等，而荧光显微镜比这些方法更灵敏、更方便，因此近几年荧光pH探针被广泛用于监控细胞内pH的变化。 一般来说，细胞内存在两个较宽的pH范围：一个是大约6.8–7.4，如细胞质；另一个是大约4.5–6.0，即所谓的酸性细胞器，如溶酶体。以各种荧光团为母体的pH探针已经被报道，有些已被用于组织或活细胞成像，有些也已经商品化。但是具有双发射的pH探针已见报道的很少。特别是酸性pH探针，几乎都是基于光诱导电子转移（PET）机理，因此没有波长的变化。虽然商品化探针DND160是具有双发射的酸性pH探针（Diwu Z, Chen CS, Zhang C Chem. Biol. 1999, 6 (7): 411-418），但其缺点明显: 探针的吸收和发射波长都很短，容易对细胞造成损伤，而且还会产生生物质自荧光的干扰。因此合成较长波长的双发射、低pKa的探针，将会有更好的应用前景。
苯乙烯类吲哚菁染料具有良好的光稳定性，合适的水溶性，很好的细胞膜通透性以及在细胞内具有较强的荧光，而且这类染料的合成非常简单，收率也很高，但是通常对pH不敏感。羟基是一个重要的pH探针官能团，许多含有羟基的pH探针已经被报道（Tang B, Liu X, Xu KH, Huang H, Yang GW, An LG. Chem. Comm. 2007,3726-3728）。而应用于细胞酸泡成像的pH探针需要具有较低的pKa，在染料分子中引入吸电基团可以降低分子的pKa。
近几年，具有固体荧光的有机化合物已经受到广泛关注，因为它们不仅可以用来进行基础研究，而且还可能应用于光电领域，如有机发光二极管，光电转换系统。理解它们的发光行为和固态的性能是非常重要的，因为在实际应用中，这些材料一般是以薄膜的形式应用的。然而，具有固态发射的有机化合物很少。这主要是因为在晶体形态或者无定形的固相（例如薄膜），荧光团之间堆积得非常紧密，即使具有最亮发射的荧光团，也会导致严重的淬灭。另外，固态的激发光和发射光具有很强的消光系数，这对固体荧光是非常有害的(Ozdemir T,Atilgan S, Kutuk I, Yildirim,LT, Tulek A, BayindirM, Akkaya E U.Org. Lett. 2009, 11 (10): 2105-2107)，特别当荧光团的斯托克斯位移很小的时候。因此，高效的固态荧光分子的开发是一个具有挑战的课题。最近几年，有很多文献 (OoyamaY, Mamura T, Yoshida K. E. J. Org. Chem. 2007, 5010–5019; Shimizu M, Takeda Y, Higashi M. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48 (20): 3653-3656; Shimizu M, Takeda Y, Higashi M, Hiyama T. Angew. Chem. Int. Ed.2009, 48 (20): 1-5) 报道固体发射的荧光团结构，阐述其发光机理，它们都是带有较大侧链的共轭体系，这样可以抑制分子间的聚集；而且多数分子是供-受体形式，有较强的分子内质子转移（ICT）效应，可以增大荧光团的斯托克斯位移，减少荧光自淬灭。
上述许多研究在X-射线单晶衍射的基础上，阐述了固体荧光性质和分子堆积结构的关系。研究表明：分子间的强π-π作用和邻近的荧光团之间连续的分子内氢键是导致固态荧光淬灭的主要因素。因此，设计新型的强固态发射的荧光团首先要减少引起荧光淬灭的分子间作用。当前消除分子间聚集的方法主要是引入大体积取代基或者引入具有位阻的取代基构建非平面结构，以此来解决聚集淬灭荧光的问题。苯乙烯类染料具有较强的ICT效应，通过引入较大的取代基也可以使其具有较强的固态荧光，这类染料的光稳定性好，易于合成与纯化，适于光电领域的研究。
荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO) 等商品化荧光染料在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域中都起到了重要的作用。然而，这些染料都各自存在着应用的局限性。其一主要表现在大多荧光染料受限于固定细胞样品。例如TOPRO 、TOTO家族染料、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通过增大细胞膜的通透性或类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细胞和生物组织真实形态的观察有负面影响 [Kozubek S, Lukasova E, Amrichova J, Kozubek M, Liskova A, Slotova J. Anal Biochem 2000;282:29–38]。同时，溴乙锭等吖啶，菲啶类染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相当一部分荧光染料的激发光处在紫外光区，如能够专一识别脱氧核糖核酸(DNA)的荧光染料4’, 6-二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、Hoechst33258，Hoechst34580等，与DNA结合后，在紫外光激发放下产生蓝色荧光。由于紫外光对细胞内的核酸、蛋白等组分会造成严重的损伤，因此这类荧光在荧光显微技术中的使用受到光激发时间的限制[Davis SK, Bardeen CJ. Photochem Photobiol 2003;77:675–679]。因此，研究开发出具有良好荧光光谱性能，毒性小，活细胞通透性的新型荧光染料仍然是推动荧光分析技术和生命科学等领域发展的关键和核心。
在众多种类的荧光染料中，菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用。不对称菁类化合物中最典型的为TOTO及其类似物(YOYO)和衍生物类(TOPRPO)。TOTO (噻唑橙二聚体)、YOYO (恶唑黄二聚体)是由Glazer 研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链的长度和两端的芳香母核(噻唑、恶唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的结构可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液中几乎无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰，与核酸结合后荧光增强。此类染料中的有些品种已经商品化，如：SYTOX Blue，TOTO，POPO， BOBO，YO-PRO 等。但这些商品化的染料大部分分子较大，结构复杂，属活细胞非通透性，只能应用于活体外核酸的识别与检测。
近几年，一些苯乙烯类半菁染料已经逐渐被用于DNA的测试，其中包括吡啶类、苯并噻唑类、喹啉类以及吲哚类等。虽然前三类半菁染料中出现了由柔性链（带电荷或不带电荷）连接的双染料，但是用于生物分子检测的吲哚类的双半菁染料非常少，而用于蛋白检测的吲哚类双半菁染料未见报道。值得注意的是，上述所有的双菁染料中具有活细胞通透性的结构鲜见报道，可能因为报道的双菁染料多以含有正电荷的碳链作为连接基团，增加了染料的水溶性，降低了细胞膜通透能力，阻碍了这些具有优越性能的染料在活细胞细胞器可视化方面的应用。适当的亲脂性可以使探针穿过细胞膜而不会在膜表面堆积(J Colston, RW Horobin, F Rashid-Doubell, J Pediani, KK Johal. Biotechnic & Histochemistry 2003, 78(6): 323-332)；同时，不含水溶性基团的吲哚类菁染料具有良好的活细胞膜通透性。另一方面，长波长的染料不但可以避开生物体自身的吸收和荧光，而且在应用时还能降低激光对细胞的损伤。
因此，以吲哚类半菁染料为荧光团，通过不同连接臂的连接，降低其背景荧光，使其在生物分子识别方面具有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一类结构简单、光稳定性好、易于合成的新的化合物。根据取代基的不同，此类化合物可以用于不同领域的功能荧光染料。
本发明采用的技术方案是：一类吲哚类半菁染料分子具有结构通式I：
其中：R1 = H、卤素、硝基、磺酸基，R2= H；或R1R2 组成萘吲哚环
；
R3和R4各自独立选自H、羟基、卤素、硝基、C1-4烷基；
R5为H、羟基、N((CH2)mR7)2,其中：R7 = H、OH、OAc、COOH、COOCH3、苯基；
R6为(CH2)pR8, 其中：R8 = H、OH、C=C、炔基、OAc、COOH、COOCH3、COOC2H5、p-(C6H4)R9，其中：R9 = H、CH3、卤素、NO2、CN、COOH、L-A；
Y- = 卤素离子、ClO4 -、PF6 - 或TsO-；
L = -C1-18烷基-、p-(CH2)q(C6H4) (CH2)q-；
m = 1～18， n = 1或2，p = 0～18，q = 1-6。
当n=1、R5 为羟基时, 具有结构式II：
其中：R1 = H、卤素、硝基、磺酸基，R2= H；或R1R2 组成萘吲哚环
；
R3和R4各自独立选自H、羟基、卤素、硝基、C1-4烷基；
R6 为(CH2)pR8, 其中：R8 = H、OH、C=C、炔基、OAc、COOH、COOCH3、COOC2H5、p-(C6H4)R9，其中：R9 = H、CH3、卤素、NO2、CN、COOH；
Y- = 卤素离子、ClO4-、PF6- 或TsO-，其中：P= 1～18。
当R2= H、n=1时, 组成结构式III：
其中：R1 = H、卤素、硝基、磺酸基。
R3和R4各自独立选自H、羟基、卤素、硝基、C1-4烷基；
R5 为H、羟基、N((CH2)mR7)2, 其中：R7 = H、OH、OAc、COOH、COOCH3、苯基；
R6 为 (CH2)pR8, 其中：R8 = H、OH、OAc、COOH、COOCH3、COOC2H5、p-(C6H4)R9，其中：R9 = H、CH3、卤素、NO2、CN、COOH；
Y- = 卤素离子、ClO4-、PF6- 或TsO-；
m = 1～18；P= 0～18。
当R6 = L-A时，具有结构通式IV：
其中：R1 = H、卤素、硝基、磺酸基，R2= H；或R1R2 组成萘吲哚环；
R3和R4各自独立选自H、羟基、卤素、硝基、C1-4烷基；
R5 为H、N((CH2)mR7)2, 其中：R7 = H、OH、OAc、COOH、COOCH3、苯基；
Y- = 卤素离子、ClO4-、PF6- 或TsO-；
L = -C1-18烷基-、或p-(CH2)q(C6H4) (CH2)q-；
m = 1～18，n = 1、2，p = 1～18，q = 1-6。
所述具有结构式II的化合物用作pH荧光探针。
所述具有结构式III的化合物用作固体荧光化合物。
所述具有结构式IV的化合物用作生物荧光探针。
由于采用了以上技术方案，使本发明中的新化合物用作生物分子探针时具备的有益效果在于：
(1) 本发明的新双染料分子形成分子内聚集，降低染料自身荧光，并且使染料与生物分子的结合能力增强，提高了检测灵敏度。并且在一定范围内可对生物分子定量检测。
(2) 本发明的部分新染料化合物增加了一个共轭甲川链，使最大吸收波长可增加约100nm，发射波长范围宽，可达650nm～900nm的近红外区，可避免生物自身的荧光背景干扰。染料的摩尔消光系数大，灵敏度高，光稳定性好，可应用于生物分子识别、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
(3) 本发明的部分双染料分子具有活细胞细胞膜通透性，可用于活细胞荧光成像。
(4) 本发明的新染料产品毒副性小，原料易得，结构简单，一般通过2到4步反应即可合成目标分子，易于产业化。
附图说明
图1是实施例2的化合物A随pH变化时，吸收光谱的变化趋势图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对吸收强度。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；pH计，型号：LEICI。化合物A的浓度为2μM。
图2是实施例2的化合物A随pH变化时，荧光光谱的变化趋势图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500；pH计，型号：LEICI。化合物A的浓度为2μM。
图3是化合物A的酸碱平衡机理及存在的共振结构。
图4是实施例3的化合物B随pH变化时，吸收光谱的变化趋势图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对吸收强度。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；pH计，型号：LEICI。化合物B的浓度为2μM。
图5是实施例3的化合物B随pH变化时，荧光光谱的变化趋势图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500；pH计，型号：LEICI。化合物B的浓度为2μM。
图6是实施例3中化合物B在570nm处荧光强度与pH的拟合曲线，可以估算化合物B的pKa。
图7是实施例4、5、6中化合物C、D、E和已知化合物S1的固态发射光谱。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。
图8是实施例8的化合物G和已知化合物S1 在pH 7.4、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，与小牛胸腺DNA结合前后吸收、发射光谱变化对比图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对吸收、荧光强度。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物G和S1 的浓度均为2μM，小牛胸腺DNA的浓度为100μM。
图9是实施例8的化合物G 在pH 7.4、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，与不同浓度的小牛胸腺DNA结合后发射光谱变化趋势图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物G 的浓度为2μM，小牛胸腺DNA的浓度为0-50μM。
图10是实施例8中的化合物G的荧光强度与DNA浓度的变化趋势（插图）和线性关系。
图11是实施例9中化合物H和已知化合物S2分别在pH 7.0、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，与牛血清白蛋白BSA结合前后的吸收、荧光变化对比图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对吸收、荧光强度。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物H和S2的浓度均为2μM，牛血清白蛋白BSA的浓度为50μM。
图12是实施例9中化合物H在pH 7.0、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，随牛血清白蛋白BSA浓度升高荧光变化趋势图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物H的浓度为2μM，牛血清白蛋白BSA的浓度为0-10μM。
图13是化合物H的荧光强度与BSA浓度的变化趋势（插图）和线性关系。
具体实施方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文中使用的术语“苄基”是指-CH2-Ph基团。当用“任选取代”修饰苄基时，指该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于H、C1-18烷基、CN、COOH、NH2、NO2、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6酰氨基、卤素、或C1-6卤代烷基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基由COOH、NH2、OH、C1-6烷氧基、卤素任选取代。
本文中使用Y-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负离子或有机负离子，例如卤素离子、ClO4-、PF6- 、BF4 -、CH3COO-或OTs-。
在本发明的通式I化合物中， 优选R1和R2各自独立选自R1, R2 为H、卤素、硝基、磺酸基；或R1R2 = 
（组成萘吲哚环）；最优选R1和R2均为H。
优选R3和R4各自独立选自H或羟基、甲氧基、卤素、硝基、C1-4烷基；更优选R3和R4各自独立选自H或C1-2烷基；最优选R3和R4均为H。
优选R5 为H、羟基、N((CH2)mR7)2；最优选R5为羟基、N(CH3)2。
优选R6为(CH2)pR8, R8 = H、OH、OAc、COOH、COOCH3、COOC2H5、p-(C6H4)R9、A，R9 = H、CH3、卤素、NO2、CN、COOH；最优选R6为CH3、C=C、炔基、羧基取代苯环、A；。
优选L 为C1-18烷基或p-(CH2)q(C6H4) (CH2)q，q = C1-6烷基；更优选L 为C1-14烷基或p-(CH2)q(C6H4)(CH2)q，q = C1-4烷基；再更优选L 为C1-12烷基或p-(CH2)q(C6H4)(CH2)q，q = C1-2烷基；最优选L 为C1-10烷基或p-(CH2)(C6H4)(CH2)。
优选Y-为卤素离子、ClO4-、PF6- 、BF4-、CH3COO-或OTs-，最优选Y-为Cl-、Br-。
本发明提供上述通式Ⅱ化合物的pH探针性质及其生物应用。
本发明还提供上述通式Ⅲ化合物固态荧光性质。
本发明还提供一种利用上述通式Ⅳ化合物、其缀合物或其组合物在生物染色方面的应用。
本发明的化合物用作荧光染料时具备的有益效果在于：
-部分化合物具有双发射性质，可以用于双色细胞成像。
-新化合物分子中形成分子内聚集，使染料与核酸的结合前荧光显著降低，结合后荧光强度和荧光量子产率增大，提高了检测灵敏度。
-新化合物分子具有良好的细胞膜通透性，应用范围增大。
-部分新染料化合物通过增长甲川链，使荧光发射波长可达650nm以上，避免生物自身的荧光背景干扰。
-新化合物可应用廉价、体积小、性能稳定的红色半导体激光器作为光源，大大降低使用成本。
-新化合物产品毒副性小，原料易得，结构简单，一般通过4到5步反应即可合成目标分子，易产业化。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
本发明化合物可以以本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。另外，本发明化合物的衍生物也可以用于生物样品的染色，所述衍生物包括但不限于缀合物。
典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明荧光染料通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物温育一段时间，使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该荧光缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。
本发明还提供包含式Ⅱ化合物或其缀合物的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。
本发明的组合物除包含式Ⅱ化合物或其缀合物外，还可包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、表面活性剂等。这些组分都是本行业内已知的。
本发明的组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
在再一个方面，本发明还提供使用上述式Ⅱ化合物、或其缀合物、或包含式Ⅱ化合物的组合物以染色生物样品的方法，该方法包括使上述式Ⅱ化合物或其缀合物或包含式Ⅱ化合物的组合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
为了说明本发明的化合物在应用性能上的优化改进，实施例14、15、17中已知化合物S1、S2作为参照物，进行对比说明。其中化合物S1和S2结构如下：
实施例1
染料中间体1-甲基-5-硝基-2，3，3-三甲基-3H吲哚季铵盐的合成：
将20mmol 5-硝基-2，3，3-三甲基-3H吲哚和40mmol碘甲烷加入到100ml含20ml甲苯的圆底烧瓶中，氩气保护。反应加热回流持续反应20h后停止。混合物冷却后过滤沉淀并用乙醚洗涤滤饼。干燥后得到淡黄色的固体粉末，粗收率85%。
实施例2
化合物A的制备：
将5mmol1-甲基-5-硝基-2，3，3-三甲基-3H吲哚季铵盐与6mmol对羟基苯甲醛加入到25ml含10ml乙醇的圆底烧瓶中，氮气保护，常温搅拌24h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到橙黄色固体粉末，收率85%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 1.87 (s, 6H, C(CH3)2), 4.12 (s, 3H, CH3-N+), 7.00 (d, 2H, J = 8.4, Ar-H), 7.52 (d, 1H, J = 16, CH=CH), 8.06 (d, 1H, J= 8.8, Ar-H), 8.23 (d, 2H, J = 8.4, Ar-H), 8.50(d, 1H, J = 8.8, Ar-H), 8.56 (d, 1H, J = 16, CH=CH), 8.83(s, 1H, Ar-H), 11.09(s, 1H, OH). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 25.45, 34.44, 52.02, 109.29,115.36, 116.67, 118.63, 125.14, 126.09, 134.65, 144.20, 146.59, 147.00, 156.89, 154.39, 184.64. HRMS (TOFMS ES+) calcd. for C19H19N2O3 [M-I-]+ 323.1390, found323.1394.
实施例3
化合物B的制备：
将5mmol 1-炔丙基-2，3，3-三甲基-3H吲哚季铵盐与5mmol 3-Br-4-羟基苯甲醛加入到25ml含10ml甲醇的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流4h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到橙色固体粉末，收率88%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 1.73 (s, 6H, C(CH3)2), 3.31（t，1H，J = 2.38，Alkyne-H） 5.41 (s, 2H, CH2-N+), 6.82 (d, 2H, J = 8.8, Ar-H), 7.19 (d, 1H, J= 15.6, CH=CH), 7.46 (t, 1H, J = 7.2, Ar-H), 7.54(t, 1H, J = 7.6, Ar-H), 7.67 (d, 1H, J = 8.0, Ar-H), 7.75 (d, 1H, J = 7.2, Ar-H), 7.99 (d, 1H,J = 8.8, Ar-H), 8.19 (d, 1H, J = 15.6, CH=CH), 8.45 (s, 1H, Ar-H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm):26.09, 33.92, 51.16, 72.24，81.35，113.8, 114.68, 119.45, 123.05, 125.24, 127.79, 129.14, 133.73, 137.06, 142.66, 142.92, 151.49, 165.83, 179.00. HRMS (TOF MS EI+) calcd. for C19H18BrNO [M-Br-+H+]（100 %） 380.0645,found 380.0650; [M-Br-+H++2] (100 %) : 382.0630，found: 382.0636
实施例4
化合物C的制备：
将5mmol 1-（4-羧苄基）-2，3，3-三甲基-5-溴-3H苯并吲哚季铵盐与5.5mmol 4-N,N-二甲胺基苯甲醛加入到25ml含10ml乙醇的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流2h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到黄绿色固体粉末，收率92%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 1.83 (s, 6H, C(CH3)2), 3.18 (s, 6H, N(CH3)2), 5.91 (s, 2H, CH2-N+), 6.89 (d, 2H, J = 8.8, Ar-H), 7.35 (d, 1H, J = 15.2, CH=CH), 7.43-7.45 (m, 3H, Ar-H), 7.56 (d, 2H, J= 6.8, Ar-H), 7.81 (d, 1H, J = 6.4, Ar-H), 7.95 (d, 2H, J = 8.0, Ar-H), 8.06 (d, 2H, J = 8.0, Ar-H), 8.43 (d, 1H, J = 15.2, CH=CH). HRMS (TOF MS EI+) calcd. for C28H27BrN2O2 [M-Cl--H+] 502.2151, found502.2162.
实施例5
化合物D的制备：
将5mmol 1-乙基-2，3，3-三甲基-3H吲哚季铵盐与6mmol 4-N,N-二羟乙基胺基苯甲醛加入到25ml含10ml乙醇的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流2h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到绿色固体粉末，收率95%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 1.40 (t, 3H, J =7.2, CH3CH2), 1.77 (s, 6H, C(CH3)2), 3.39 (s, 4H, NCH2CH2OH), 3.67 (s, 4H, NCH2CH2OH), 4.56 (q, 2H, J= 7.2, CH2-N+), 4.91 (s, 2H, NCH2CH2OH), 6.96 (d, 2H, J = 8.8, Ar-H), 7.26 (d, 1H, J = 15.6, CH=CH),7.48 (s, 1H, Ar-H), 7.56 (d, 1H, J = 7.2, Ar-H),7.80 (d, 1H, J = 6.8, Ar-H), 8.10 (d, 2H, J =8.8, Ar-H), 8.34 (d, 1H, J = 15.6, CH=CH). MS: [M-I-]+ = 379.2; HRMS (TOF MS EI+) calcd. for C24H30N2O2 [M-I--H+] 378.2307, found 378.2299.
实施例6
化合物E的制备：
将5mmol 1-羧戊基-2，3，3-三甲基-5-甲氧基-3H吲哚季铵盐与5.5mmol 4-N,N-二丁基胺基苯甲醛加入到25ml含10ml乙二醇单甲醚的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流1.5h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到墨绿色固体粉末，收率92%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 0.9 (t，6H，J = 7.2, CH3), 1.32-1.54 (m, 13H, CH2), 1.57 (m, 2H, CH2),1.76 (s, 6H, C(CH3)2), 1.80 (m, 2H, CH2), 2.20 (t,2H, J = 7.2, CH2COOH), 3.28 (s, 4H, NCH2), 4.52 (t, 2H, J = 7.2, CH2-N+), 6.90 (d, 2H, J = 9.2, Ar-H), 7.26 (d,1H, J = 15.6, CH=CH), 7.48 (d, 1H, J= 7.2, Ar-H), 7.55 (d, 1H, J = 7.2, Ar-H), 7.72 (d, 1H, J = 8.0, Ar-H), 7.79 (d, 1H, J = 7.2, Ar-H), 8.10 (s, 1H, Ar-H), 8.35 (d, 1H, J = 15.6, CH=CH), 12.00 (s, 1H, COOH). HRMS (TOF MS EI+) calcd.for C33H47N2O3 [M-Br-]+ 519.3581, found 519.3590.
实施例7
化合物F的制备：
将5mmol 1，1’-（1,4-丁二基）-双2，3，3-三甲基-3H吲哚季铵盐与11mmol 4-N,N-二甲胺基苯甲醛加入到25ml含10ml乙醇的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流2h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到紫色固体粉末，收率90%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 1.68 (s, 12H, C(CH3)2), 2.01 (s, 4H, CH2CH2N+), 3.17 (s, 12H, N(CH3)2),4.65 (s, 4H, CH2CH2-N+), 6.79 (d, 4H, J = 9.2, Ar-H), 7.30 (d, 2H, J = 15.6, CH=CH), 7.46 (t, 2H,J = 7.6, Ar-H), 7.52 (t, 2H, J = 7.6, Ar-H), 7.77(d, 2H, J = 7.2, Ar-H), 7.81 (d, 2H, J = 7.2,Ar-H), 8.12 (d, 4H, J = 8.8, Ar-H), 8.32 (d, 2H,J = 15.6, CH=CH). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm):24.91, 26.45, 44.40, 50.81, 104.63, 112.11, 113.58, 122.34, 122.81, 127.46, 128.72, 134.45, 141.05, 142.56,154.56, 154.72, 179.38. HRMS (TOF MS ES+) calcd. for C44H52N42+ [M-2Br-]2+ 636.4181, found 636.4168.
实施例8
化合物G的制备：
将5mmol 1，1’-（1,6-己二基）-双2，3，3-三甲基-5-溴-3H吲哚季铵盐与12mmol 4-N,N-二甲胺基苯甲醛加入到25ml含10ml乙醇的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流2h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到粉红色固体粉末，收率83%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 1.51 (m, 4H, CH2CH2CH2N+), 1.75 (s, 12H, C(CH3)2), 1.77 (m, 4H, CH2CH2CH2N+), 3.17 (s, 12H, N(CH3)2), 4.54 (t, 4H, J = 6.6, CH2CH2CH2-N+), 6.87 (d, 4H, J = 8.8, Ar-H), 7.27(d, 2H, J = 15.6, CH=CH), 7.49 (m, 4H, Ar-H), 7.70 (t, 2H, J = 6.8, Ar-H), 7.78 (d, 2H, J = 6.8,Ar-H), 8.12 (s, 2H，Ar-H), 8.34(d, 2H, J = 15.2, CH=CH). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 25.68, 26.58, 27.68, 45.04, 50.91, 104.57,111.08, 112.24, 113.57, 122.28, 122.86, 127.52, 128.79, 131.58, 141.07, 142.72, 154.59, 179.34. HRMS (TOFMS ES+) calcd. for C46H54Br2N42+ [M-2Br-]2+ 820.2704,found 820.2706.
实施例9
化合物H的制备：
将5mmol 1，1’-（1,4-苯乙二基）-双2，3，3-三甲基-3H吲哚季铵盐与12mmol 4-N,N-二甲胺基苯乙烯醛加入到25ml含10ml乙醇的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流4h后，将反应液置于-20 °C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到蓝色固体粉末，收率75%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 1.77 (s, 12H, C(CH3)2), 2.84 (t, 4H, J = 7.2, CH2CH2N+), 3.09 (s, 12H, N(CH3)2), 5.10 (t, 4H, J = 7.2, CH2-N+), 6.81 (d, 4H, J = 8.0, Ar-H), 7.06 (d, 2H, J = 14.4, CH=CH), 7.25 (t, 2H, J = 12.8, CH=CH), 7.35-7.84 (m,18H, Ar-H + CH=CH), 8.48 (t, 2H, J = 12.8, CH=CH).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 26.47, 30.85, 47.68, 48.56, 50.96, 110.16, 112.44, 113.68, 122.943, 123.77, 127.31, 127.66, 128.86, 132.14, 133.82, 141.12,142.53, 153.27, 153.9, 157.83, 179.66. HRMS (TOF MSES+) calcd. for C54H60N42+ [M-2I-]2+ 764.4807, found764.4801.
实施例10
化合物I的制备：
将5mmol 1，1’-（1,10-癸二基）-双2，3，3-三甲基-3H苯并吲哚季铵盐与13mmol 4-N,N-二甲胺基苯乙烯甲醛加入到25ml含10ml乙二醇单甲醚的圆底烧瓶中，氮气保护，加热回流3h后，将反应液置于-20°C下过夜。通过过滤收集析出的固体，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到深蓝色固体粉末，收率72%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 1.39 (m, 8H, CH2),1.54 (m, 4H, CH2CH2CH2N+), 1.71 (s, 12H, C(CH3)2), 1.80 (m, 4H, CH2CH2CH2N+), 3.08 (s, 12H, N(CH3)2), 4.42 (t, 4H, J = 7.2, CH2CH2CH2-N+), 6.82 (d, 4H, J= 8.0, Ar-H), 7.15 (d, 2H, J = 14.8, CH=CH), 7.41(d, 2H, J = 12.8, CH=CH), 7.60 (d, 4H, J = 8.4,Ar-H), 7.71 (t, 2H, J = 8.0, Ar-H ), 7.78 (d, 2H,J = 12.8, CH=CH), 7.82 (t, 2H, J = 8.0, Ar-H),7.93 (d, 2H, J = 8.8, Ar-H), 7.97 (d, 4H, J = 8.4, Ar-H), 8.22 (d, 2H, J = 8.4, Ar-H), 8.35 (t, 2H, J = 12.8, CH=CH). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 25.26, 26.01, 26.74, 27.91, 29.74, 45.69, 51.31,53.34, 110.95, 112.69, 114.07, 123.28, 123.34, 124.21,126.65, 128.34, 129.40, 132.31, 133.50, 137.43, 141.33, 143.14, 145.72, 153.00, 153.41, 157.19, 179.46. HRMS (TOF MS ES+) calcd. for C62H72N42+[M-2Cl-]2+ 872.5746, found 872.5754.
实施例11
不同pH下，化合物A的吸收和发射光谱的测定：
分别配置浓度为1mM的化合物A、B 的DMSO(二甲基亚砜)溶液，分别取40μL，稀释至20 mL，置于双口烧瓶中，用浓的盐酸溶液将溶液调至酸性，然后用稀的氢氧化钠溶液调节溶液的pH，同时记录溶液在此pH下的吸收和发射光谱。随着pH的降低，化合物在465nm处的吸收峰升高，366nm和560nm处的吸收峰下降，存在两个等吸收点，表明有两种酸碱平衡存在。而以465nm和560nm为激发波长的发射峰同时升高。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500；pH计，型号：LEICI。
实施例12
不同pH下，化合物B的吸收和发射光谱的测定以及pKa的估算：
分别配置浓度为1mM的化合物B 的DMSO(二甲基亚砜)溶液，分别取40μL，稀释至20 mL，置于双口烧瓶中，用浓的盐酸溶液将溶液调至酸性，然后用稀的氢氧化钠溶液调节溶液的pH，同时记录溶液在此pH下的吸收和发射光谱。随着pH的降低，化合物在430nm处的吸收峰升高，550nm处的吸收峰下降，475nm处存在一个等吸收点，表明存在一种酸碱平衡。而以430nm和550nm为激发波长的发射峰随着其对应发射波长强度的升高而升高。对化合物的荧光强度与pH做sigmoidal拟合，曲线上1/2最大强度对应的pH即为化合物的pKa。得到化合物B的pKa为5.2，表明化合物适用于活细胞酸性细胞器成像。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500；pH计，型号：LEICI。
实施例13
共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A对活细胞MCF-7的染色：
加配有化合物A、浓度为2μM的PBS缓冲液12μL于培养好MCF-7细胞的六孔板中，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡漂洗5 min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(TCS-SP2, Germany) 观察细胞形态。选取代表性区域，绿色（458nm）、红色 (543)双通道激发，用油镜(1000×)观察，重复三次。
实施例14
化合物C、D、E的固态光谱的测定：
测定化合物固态发射光谱是通过发射的原理进行的。测试时直接将粉末装入到测试槽中，调节样品角度，使反射的光线恰好进入接收器上，记录发射光谱。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。
为了更直观的比较，拍摄了化合物C与已知化合物S1的日光下粉末颜色和紫外灯下固体荧光照片。
实施例15
化合物G和已知化合物S1与小牛胸腺DNA结合前后吸收、发射光谱及荧光增强倍数的测定：
配置浓度为1mM的化合物G、S1的DMSO(二甲基亚砜)溶液，分别取6μL，加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。配置一定浓度的小牛胸腺DNA的水溶液，通过紫外吸收分光光度计测定其260nm处的吸光度值，标定其浓度为1.5mM。另分别取浓度为1mM的化合物G、S1的DMSO(二甲基亚砜)溶液6μL于比色皿中，再分别向其中加入浓度为1.5mM的小牛胸腺DNA溶液200μL，最后加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。作用后，S1的吸收强度变大，波长没有变化；而G的吸收光谱形状改变。相同条件下（相同底物浓度和DNA浓度），已知染料S1，与小牛胸腺DNA结合后，相对荧光强度增加5.9( I/I0 = 190/32 =5.9 )倍；而化合物G与小牛胸腺DNA结合后，相对荧光强度可增加91(I/I0 =600/6.6 =91)倍。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例16
化合物G与不同浓度的小牛胸腺DNA结合后荧光发射光谱的测定：
配置浓度为1mM的化合物G的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取6μL，加pH7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。配置一定浓度的小牛胸腺DNA的水溶液，通过紫外吸收分光光度计测定其260nm处的吸光度值，标定其浓度为1.5mM。另分别取浓度为1mM的化合物G的DMSO(二甲基亚砜)溶液6μL于比色皿中，再分别向其中加入不同体积的、浓度为1.5mM的小牛胸腺DNA溶液，最后加pH 7.4、10 mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。随着DNA浓度的增加，化合物G的荧光强度不断升高。当DNA浓度超过30μM时，荧光增强趋势变缓。在这一浓度范围内对化合物G荧光强度和DNA浓度进行线性拟合，发现两者这件存在很好的线性关系。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例17
化合物H和已知化合物S2与牛血清白蛋白BSA结合前后吸收、发射光谱及荧光增强倍数的测定：
配置浓度为1mM的化合物H、S2的DMSO(二甲基亚砜)溶液，分别取6μL，加pH 7.4、10 mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。配置5 mM的牛血清白蛋白BSA的水溶液。另分别取浓度为1 mM的化合物H、S2的DMSO(二甲基亚砜)溶液6μL于比色皿中，再分别向其中加入浓度为5 mM的小牛胸腺DNA溶液30μL，最后加pH 7.0、10 mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。作用后，S2的吸收强度变小，波长没有变化；而G的吸收光谱形状改变并且伴有波长红移。相同条件下（相同底物浓度和BSA浓度），已知染料S2，与牛血清白蛋白BSA结合后，相对荧光强度增加1.5( I/I0 = 40.2/26.8 =1.5)倍；而化合物H与牛血清白蛋白BSA结合后，相对荧光强度可增加19(I/I0 =159.6/8.3 =19)倍。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例18
化合物H与不同浓度的牛血清白蛋白BSA结合后荧光发射光谱的测定：
配置浓度为1mM的化合物H的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取6μL，加pH7.0、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。配置5mM的牛血清白蛋白BSA的水溶液。另分别取浓度为1mM的化合物H的DMSO(二甲基亚砜)溶液6μL于比色皿中，再分别向其中加入不同体积的、浓度为5mM的牛血清白蛋白BSA溶液，最后加pH 7.0、10 mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。随着BSA浓度的增加，化合物H的荧光强度不断升高。当BSA浓度超过8.5μM时，荧光增强趋势变缓。在这一浓度范围内对化合物H荧光强度和BSA浓度进行线性拟合，发现两者这件存在很好的线性关系。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例19
化合物F、I的活细胞通透性测试：
加配有化合物F、I，浓度为1.5μM的PBS缓冲液12μL于培养好PC12细胞的六孔板中，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡漂洗5 min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Nikon eclipase TE 2000-5) 观察细胞形态。选取代表性区域，510-570nm激发，成像三次。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一类吲哚类半菁染料，其特征在于：所述染料分子具有如下结构通式IV：
式VI 中R1 = H、卤素、硝基、磺酸基；R2= H或R1R2组成萘吲哚环
；
R3和R4各自独立选自H、羟基、卤素、硝基、C1-4烷基；
R5 为H、N((CH2)mR7)2, 其R7 = H、OH、OAc、COOH、COOCH3、苯基；
Y- = 卤素离子、ClO4 -、PF6 - 或TsO-；
L = -C1-18烷基-、p-(CH2)q(C6H4)(CH2)q-；
m = 1~18；n = 2; q = 1~6。
2.根据权利要求1所述的一类吲哚类半菁染料，其特征在于：所述具有结构通式IV的化合物用作生物荧光探针。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
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