JPH09149797A - 酵素、抗原又は抗体の定量方法及び酵素活性測定用の基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検出感度の高い酵素活性測定用の基質及びそ
れを用いた酵素、特にアルカリホスファターゼ、スルフ
ァターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又は抗原もしく
は抗体の定量方法の提供。 【解決手段】 式 【化１】 （式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）をその構造中に
有するビフェニル化合物を−ＯＺ部位で加水分解して対
応する２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめる
酵素の存在下に、該ビフェニル化合物を加水分解して該
２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめ、該２−
ヒドロキシビフェニル化合物を検出する工程を有するこ
とを特徴とする前記酵素、又は抗原もしくは抗体の定量
方法、また前記構造を有するビフェニル化合物である酵
素活性測定用の基質である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビフェニル化合物
を加水分解して２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成
せしめる酵素、特にアルカリホスファターゼ、スルファ
ターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又は抗原もしくは
抗体の定量方法、及び前記ビフェニル化合物である酵素
活性測定用の基質に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、組織標本中の酵素、構造蛋白質、
微生物等の抗原性物質を、酵素で標識した抗体を用いて
検出する方法が、臨床検査等において一般に用いられて
いる。標識酵素としては、アルカリホスファターゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ等が用いられている。現在、例えばアル
カリホスファターゼ定量用の基質としては、アルカリホ
スファターゼの存在下に分解して蛍光物質となる４−メ
チルウンベリフェリルホスフェート（以下、ＭＵＰとい
う）が用いられている。しかしながら、ＭＵＰ自身、蛍
光を発する物質であり、感度の高い検出が困難であると
いう問題があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】現在、臨床検査等にお
いて、さらに検出感度の高い基質の開発が望まれてい
る。

【０００４】本発明の目的は、検出感度の高い酵素活性
測定用の基質及びそれを用いた酵素、特にアルカリホス
ファターゼ、スルファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、又は抗原もしくは抗体の定量方法を提供することに
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を行った結果、蛍光物質であ
る２−ヒドロキシビフェニル化合物は、その水酸基が保
護されることによって非蛍光物質となることを見出し、
本発明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明は、以下の通りである。 (1) 式

【０００７】

【化９】

【０００８】（式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）を
その構造中に有するビフェニル化合物を−ＯＺ部位で加
水分解して対応する２−ヒドロキシビフェニル化合物を
生成せしめる酵素の存在下に、該ビフェニル化合物を加
水分解して該２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せ
しめ、該２−ヒドロキシビフェニル化合物を検出する工
程を有することを特徴とする前記酵素の定量方法。 (2) ビフェニル化合物が

【０００９】

【化１０】

【００１０】をその構造中に有するものである (1)記載
の酵素の定量方法。 (3) 酵素がアルカリホスファターゼである (1)記載の酵
素の定量方法。 (4) 式

【００１１】

【化１１】

【００１２】（式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）を
その構造中に有するビフェニル化合物を−ＯＺ部位で加
水分解して対応する２−ヒドロキシビフェニル化合物を
生成せしめる酵素で標識した抗体を抗原と反応させて、
抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体に結合した前記
酵素の存在下に、該ビフェニル化合物を加水分解して該
２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめ、該２−
ヒドロキシビフェニル化合物を検出する工程を有するこ
とを特徴とする抗原の定量方法。 (5) ビフェニル化合物が

【００１３】

【化１２】

【００１４】をその構造中に有するものである (4)記載
の抗原の定量方法。 (6) 酵素がアルカリホスファターゼである (4)記載の抗
原の定量方法。 (7) 式

【００１５】

【化１３】

【００１６】（式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）を
その構造中に有するビフェニル化合物を−ＯＺ部位で加
水分解して対応する２−ヒドロキシビフェニル化合物を
生成せしめる酵素で標識した抗原を抗体と反応させて、
抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体に結合した前記
酵素の存在下に、該ビフェニル化合物を加水分解して該
２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめ、該２−
ヒドロキシビフェニル化合物を検出する工程を有するこ
とを特徴とする抗体の定量方法。 (8) ビフェニル化合物が

【００１７】

【化１４】

【００１８】をその構造中に有するものである (7)記載
の抗体の定量方法。 (9) 酵素がアルカリホスファターゼである (7)記載の抗
体の定量方法。 (10)式

【００１９】

【化１５】

【００２０】（式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）を
その構造中に有するビフェニル化合物からなる酵素活性
測定用の基質。 (11)ビフェニル化合物が

【００２１】

【化１６】

【００２２】をその構造中に有するものである(10)記載
の酵素活性測定用の基質。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明に用いられるビフェニル化
合物とは、

【００２４】

【化１７】

【００２５】（式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）を
その構造中に有することを特徴とする。ここで、加水分
解可能な基とは、−ＯＺから−ＯＨへと加水分解され得
るものであれば特に限定されないが、特定の酵素の存在
下で加水分解されて−ＯＺから−ＯＨとなり得るものが
好ましい。このような基を有する化合物及びそれを加水
分解する酵素の組合せとしては、例えばリン酸エステル
に対してアルカリホスファターゼ及び酸性ホスファター
ゼ、β−Ｄ−グルコシドに対してβ−Ｄ−グルコシダー
ゼ、α−Ｄ−グルコシドに対してα−Ｄ−グルコシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシドに対してβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシドに対してα−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、硫酸エステルに対してスルファターゼ、酢
酸エステルに対してエラスターゼ、１−ホスホ−２，３
−ジアシルグリセリドに対してホスホリパーゼ、β−Ｄ
−キシロイドに対してβ−Ｄ−キシロシダーゼ、β−Ｄ
−フコシドに対してβ−Ｄ−フコシダーゼ等が挙げられ
る。

【００２６】さらに該ビフェニル化合物は、そのビフェ
ニル環上に１個又は複数個の置換基を有していてもよ
い。該置換基は特に限定されないが、２−ヒドロキシビ
フェニル化合物の蛍光強度を著しく低下させないものが
好ましい。具体的には、フェニル、ピリジル、メチル、
エチル、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、トリフ
ルオロメチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒ
ドロキシ、アミノ、アセトアミド、アセチル、アセトキ
シ、ベンゾイル、メトキシカルボニルアミノ、エトキシ
カルボニルアミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメ
チルアミノ、アミドカルボニルジエチルアミノ、メトキ
シカルボニルメチルアミノ、ジメチルアミノカルボニ
ル、メトキシカルボニル、メチレンジオキシ、フェノキ
シ、シアノ、イミダゾリル、カルボキシ、トリメチルア
ンモニウム、ホルミル、トリメチルシリルオキシ、ジメ
チルアミノスルホニル、メチルスルホニル、ベンゼンス
ルホニル等が挙げられる。

【００２７】本発明に用いられるビフェニル化合物とし
て、具体的には、次に示す酵素に対してそれぞれ以下の
ものが例示される。アルカリホスファターゼに対して
は、２，２’−ジヒドロキシビフェニル モノ（ジハイ
ドロジェンホスフェート）、ｏ−フェニルフェノール
ジハイドロジェンホスフェート、２−ヒドロキシ−５−
メトキシカルボニルメチルアミノビフェニル ジハイド
ロジェンホスフェート、２−ヒドロキシ−５−ジメチル
アミノビフェニル ジハイドロジェンホスフェート、２
−ヒドロキシ−５−メトキシカルボニルアミノビフェニ
ル ジハイドロジェンホスフェート、２−ヒドロキシ−
４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニル ジハイ
ドロジェンホスフェート、２−ヒドロキシ−５−アセト
アミドビフェニル ジハイドロジェンホスフェート、２
−ヒドロキシ−４，５−メチレンジオキシビフェニル
ジハイドロジェンホスフェート、２−ヒドロキシ−３−
フルオロビフェニル ジハイドロジェンホスフェート、
２−ヒドロキシ−５−ジメチルアミノカルボニルビフェ
ニル ジハイドロジェンホスフェート、２−ヒドロキシ
−３−フェニルビフェニル ジハイドロジェンホスフェ
ート、２−ヒドロキシ−２’−クロロビフェニル ジハ
イドロジェンホスフェート、２−ヒドロキシ−４’−ブ
ロモビフェニル ジハイドロジェンホスフェート、２−
ヒドロキシ−５−フェニルビフェニル ジハイドロジェ
ンホスフェート、２−ヒドロキシ−３−フェニル−５−
アセトアミドビフェニル ジハイドロジェンホスフェー
ト、２−ヒドロキシ−４，４’−ビス（アセトアミド）
ビフェニル ジハイドロジェンホスフェート等が例示さ
れる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対しては、２−フェ
ニルフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−
（２’−クロロフェニル）フェニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド、２−フェニル−４−ジメチルアミノカルボ
ニルフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が例示さ
れる。スルファターゼに対しては、２−フェニルフェニ
ル硫酸、２−（２’−クロロフェニル）フェニル硫酸、
２−フェニル−４−ジメチルアミノカルボニルフェニル
硫酸、２，４−ジフェニル硫酸等が挙げられる。

【００２８】本発明に用いられるビフェニル化合物は、
例えば以下に示す方法によって合成できる。

【００２９】自体既知の方法で製造された２−ヒドロキ
シビフェニル化合物の水酸基に対して、例えばオキシ
塩化リンを反応させた後、アルカリ処理することにより
リン酸エステルを、三酸化いおうトリメチルアミン錯
塩を反応させることにより硫酸エステルを、α−Ｄ−
アセトブロムガラクトースを反応させた後、ナトリウム
メトキシド処理することによりβ−Ｄ−ガラクトシドを
それぞれ製造することができる。

【００３０】本発明の定量方法は、例えば次のようにし
て実施される。

【００３１】本発明に用いられるビフェニル化合物は、
前記のような酵素の存在下、−ＯＺ部位で加水分解し、
対応する２−ヒドロキシビフェニル化合物となる。２−
ヒドロキシビフェニル化合物は、該酵素の量に対して１
次関数的に生成する。ここで、該ビフェニル化合物は非
蛍光物質であるが、これを加水分解することによって波
長２５０〜４００ｎｍの光により励起され、波長３５０
〜５００ｎｍの蛍光を発する蛍光物質である２−ヒドロ
キシビフェニル化合物となる。

【００３２】本発明に用いられるビフェニル化合物の加
水分解反応は、通常行われる、対象となる酵素の至適条
件下で行われる。

【００３３】即ち、各種既知量の該酵素の存在下に、上
記ビフェニル化合物を加水分解させて、２−ヒドロキシ
ビフェニル化合物を生成せしめる。該２−ヒドロキシビ
フェニル化合物を検出する工程として、蛍光光度計を用
いてその蛍光強度より２−ヒドロキシビフェニル化合物
量を測定する。これら酵素量とその蛍光強度より検量線
を作成し、該検量線を用いて未知量の酵素の定量を行う
ことができる。

【００３４】また、抗原の定量は次のようにして行うこ
とができる。先ず、自体既知の方法を用いて、前記のよ
うな酵素で標識した抗体を抗原と反応させて抗原−抗体
複合体を形成させる。次いで、該複合体に結合した該酵
素の存在下に、上記のようにビフェニル化合物を加水分
解させて、２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せし
める。既知量の抗原を用い、前記と同様にして作成した
検量線を用いて、該２−ヒドロキシビフェニル化合物か
らの蛍光強度より、当該酵素を定量、即ち抗原を定量す
ることができる。同様にして、酵素で標識した抗原を用
い、抗体の定量を行うことができる。

【００３５】本発明の酵素活性測定用の基質は、上記し
たようなビフェニル化合物からなる。該ビフェニル化合
物は、酵素、特にアルカリホスファターゼ、スルファタ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの定量、及びそれを利
用した抗原又は抗体の定量に有用である。

【００３６】

【実施例】以下、製造例、実施例を挙げて、本発明を更
に具体的に説明する。

【００３７】製造例１ ２，２’−ジヒドロキシビフェニル モノ（ジハイドロ
ジェンホスフェート）・ジアンモニウム塩の製造 （１）２，２’−ジヒドロキシビフェニル モノ（ジベ
ンジルホスフェート）２，２’−ジヒドロキシビフェニ
ル（５０ｍｍｏｌ，９．３ｇ）を無水アセトニトリル
（２００ｍｌ）に溶解し、溶液を５００ｍｌ丸底フラス
コに入れた。四塩化炭素（２５０ｍｍｏｌ，２４ｍｌ）
を加え、氷上でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
（１００ｍｍｏｌ，１７．５ｍｌ）をゆっくり加えた
後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（５ｍｍｏｌ，
０．６ｇ）を一度に加えた。次いで、ジベンジルホスフ
ァイト（７７．５ｍｍｏｌ，１６ｍｌ）を内部温度が上
昇しないよう徐々に加えた。窒素気流下、氷上で３時間
攪拌した。反応終了後、溶液を濃縮し、０．１Ｎ塩酸
（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（２００ｍｌ×２）で
抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して
黄色油状化合物を得、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーで精製することにより表題化合物１９．８ｇ（４
４．４ｍｍｏｌ，収率８８．８％）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ）δ：４．７３
（ｓ，２Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），７．２５（ｍ，
８Ｈ） ＩＲ（ＫＢｒ）：３２６７，１２５７ｃｍ^-1

【００３８】（２）２，２’−ジヒドロキシビフェニル
モノ（ジハイドロジェンホスフェート）・ジアンモニ
ウム塩 上記（１）で得られた２，２’−ジヒドロキシビフェニ
ル モノ（ジベンジルホスフェート）（２２．５ｍｍｏ
ｌ，１０ｇ）をテトラヒドロフラン−メタノール（１：
１）溶液（１００ｍｌ）に溶解し、２００ｍｌ丸底フラ
スコに入れた。１０％パラジウム−炭素（１ｇ）を加
え、容器内を減圧にし、水素ガスを導入し、室温常圧下
で３時間攪拌した。反応終了後、触媒を濾別し、濾液を
濃縮した。２８％アンモニア水（５０ｍｌ）を加え、更
に濃縮し、得られた残渣を逆相クロマトグラフィー（リ
クロプレップＲＰ−１８，メルク製）で精製することに
より表題化合物５．３ｇ（１７．６ｍｍｏｌ，収率７
８．２％）を得た。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３１４２，１２７５ｃｍ^-1 融点：１７６〜１７７℃ ＦＡＢ−ＭＳ：Ｍ⁺ ２６７

【００３９】製造例２ ｏ−フェニルフェノール ジハイドロジェンホスフェー
トの製造 ｏ−フェニルフェノール（１０ｍｍｏｌ，１．７ｇ）を
トルエン（３０ｍｌ）に溶解し、１００ｍｌナスフラス
コに入れた。ピリジン（１２ｍｍｏｌ，９５０ｍｇ）、
オキシ塩化リン（１２ｍｍｏｌ，１．８４ｇ）を冷却下
に加え、３時間還流した。反応終了後、エバポレーター
で溶媒を留去し、トルエン（１５ｍｌ）、１Ｎ−ＮａＯ
Ｈ（１５ｍｌ）を加え、１時間還流した。反応終了後、
エバポレーターで溶媒を留去し、残渣を１Ｎ−ＨＣｌと
酢酸エチルで分液した。有機層を濃縮後、２８％アンモ
ニア水を加え、更に濃縮乾固し、残渣をアセトンで洗浄
し、濾過することにより表題化合物１．７４ｇ（７ｍｍ
ｏｌ，収率７０％）を得た。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３０２６，１４７９，１０９５ｃｍ^-1 融点：１３８〜１４５℃ ＦＡＢ−ＭＳ：Ｍ⁺ ２５１

【００４０】製造例３ ２−ヒドロキシ−２’−メトキシビフェニルの製造 ２，２’−ジヒドロキシビフェニル（５３．７ｍｍｏ
ｌ，１０ｇ）をアセトニトリル（１００ｍｌ）に溶解
し、３００ｍｌ丸底フラスコに入れた。これに、４Ｎ−
ＮａＯＨ（１５ｍｌ）とヨウ化メチル（７．７ｇ）を加
え、１時間還流した。反応終了後、溶液を濃縮し、１０
％炭酸ナトリウムと酢酸エチルで分液した。酢酸エチル
層を乾燥し、濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーで精製することにより表題化合物３．８ｇ（１
９ｍｍｏｌ，収率３５．４％）を得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆ ）δ：３．
７０（ｓ，３Ｈ），７．１０（ｍ，８Ｈ） ＩＲ（ＫＢｒ）：３３９０，１４８０，１２３２ｃｍ^-1

【００４１】製造例４ ２−メトキシビフェニルの製造 ２−ヒドロキシビフェニル（５８．８ｍｍｏｌ，１０
ｇ）をアセトニトリル（１００ｍｌ）に溶解し、３００
ｍｌ丸底フラスコに入れた。これに４Ｎ−ＮａＯＨ（１
５ｍｌ）とヨウ化メチル（７．７ｇ）を加え、１時間還
流した。反応終了後、溶液を濃縮し、１０％炭酸ナトリ
ウムと酢酸エチルで分液した。酢酸エチル層を乾燥し、
濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精
製することにより表題化合物３．５７ｇ（１９．４ｍｍ
ｏｌ，収率３３％）を得た。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３０２６，１４８３，１２５９ｃｍ^{-1 1} Ｈ−ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ）δ：３．８
（ｓ，３Ｈ），７．４（ｍ，９Ｈ）

【００４２】製造例５ ２−ヒドロキシ−３−フェニルビフェニル ジハイドロ
ジェンホスフェートの製造 ２，６−ジフェニルフェノール（１０ｍｍｏｌ，２．４
ｇ）をトルエン（３０ｍｌ）に溶解し、１００ｍｌナス
フラスコに入れた。ピリジン（１２ｍｍｏｌ，９５０ｍ
ｇ）、オキシ塩化リン（１２ｍｍｏｌ，１．８４ｇ）を
冷却下に加え、一昼夜還流した。反応終了後、エバポレ
ーターで溶媒を留去し、トルエン（１５ｍｌ）、１Ｎ−
ＮａＯＨ（１５ｍｌ）を加え、１時間還流した。エバポ
レーターで溶媒を留去し、残渣を１Ｎ−ＨＣｌと酢酸エ
チルで分液した。有機層を濃縮後、２８％アンモニア水
を加え、更に濃縮乾固し、残渣をクロロホルムで洗浄
し、濾過することにより表題化合物１．３３ｇ（４．２
ｍｍｏｌ，収率４２％）を得た。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３０３２，１４１７，１０８６ｃｍ^-1 融点：１４３〜１４５℃ ＦＡＢ−ＭＳ：Ｍ⁺ ３１７

【００４３】製造例６ ２−ヒドロキシ−２’−クロロビフェニル ジハイドロ
ジェンホスフェートの製造 ２−（２−クロロフェニル）フェノール（１０ｍｍｏ
ｌ，２．０５ｇ）をトルエン（３０ｍｌ）に溶解し、１
００ｍｌナスフラスコに入れた。ピリジン（１２ｍｍｏ
ｌ，９５０ｍｇ）、オキシ塩化リン（１２ｍｍｏｌ，
１．８４ｇ）を冷却下に加え、３時間還流した。反応終
了後、エバポレーターで溶媒を留去し、トルエン（１５
ｍｌ）、１Ｎ−ＮａＯＨ（１５ｍｌ）を加え、１時間還
流した。反応終了後、エバポレーターで溶媒を留去し、
残渣を１Ｎ−ＨＣｌと酢酸エチルで分液した。有機層を
濃縮後、２８％アンモニア水を加え、更に濃縮乾固し、
残渣をアセトンで洗浄し、濾過することにより表題化合
物１．８２ｇ（６．４ｍｍｏｌ，収率６４％）を得た。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３０６１，１４７９，１０７６ｃｍ^-1 融点：１０４〜１０６℃ ＦＡＢ−ＭＳ：Ｍ⁺ ２８５．６

【００４４】実施例１：励起波長及び蛍光波長 製造例１の化合物、製造例１の化合物の分解生成物、製
造例３の化合物及び製造例３の化合物の分解生成物は、
０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）を用
いて１．５μＭとなるように溶解して基質液とした。製
造例２の化合物、製造例２の化合物の分解生成物、製造
例４の化合物及び製造例４の化合物の分解生成物は、
０．１Ｎ−ＮａＯＨを用いて４．７μＭとなるように溶
解して基質液とした。製造例５の化合物及び製造例５の
化合物の分解生成物は、０．１Ｎ−ＮａＯＨを用いて
２．５μＭとなるように溶解して基質液とした。製造例
６の化合物及び製造例６の化合物の分解生成物は、０．
１Ｎ−ＮａＯＨを用いて０．５５μＭとなるように溶解
して基質液とした。上記各基質液の蛍光スペクトルを、
蛍光光度計（島津製作所製，ＲＦ−５１０）（バンド
巾：１０ｎｍ）を用いて測定した。その励起及び蛍光波
長スペクトルを図１〜６に示す。以上のように、本発明
のビフェニル化合物である製造例１〜６の化合物は蛍光
を発しないが、これらの加水分解生成物は図のような波
長スペクトルを有する蛍光物質であった。

【００４５】実施例２：アルカリホスファターゼ濃度と
蛍光強度 製造例１の化合物を０．３ｍＭとなるように、１ｍＭ−
ＭｇＣｌ₂ 及び０．１ｍＭ−ＺｎＣｌ₂ を含む０．１Ｍ
グリシン緩衝液（ｐＨ９．５）で溶解し、基質液とし
た。基質液（１．５ｍｌ）を蛍光測定用石英セル（１０
×１０ｍｍ）に入れ、１〜１３ａｍｏｌの牛小腸由来の
アルカリホスファターゼを含む酵素液２０μｌを入れ、
室温で反応させた。酵素液を加えてから、３分後から１
分間の蛍光強度変化（反応速度）を蛍光光度計（島津製
作所製，ＲＦ−５１０）（励起波長３１７ｎｍ、蛍光波
長３９７ｎｍ）を用いて測定した。製造例１の化合物を
用いた場合のアルカリホスファターゼ量と反応速度の関
係を図７に示す。

【００４６】実施例３：アルカリホスファターゼ濃度と
蛍光強度 基質液として１ｍＭの製造例２及び製造例６の化合物、
１Ｍジエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．
９）、１ｍＭ−ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ−ＺｎＣｌ ₂ を
用いた。また、酵素液として、０．２〜１０００ａｍｏ
ｌの牛小腸由来のアルカリホスファターゼを含む０．１
Ｍ−Ｇｌｙ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）、１ｍＭ−
ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ−ＺｎＣｌ₂ 、２００ｍｇ／１
ＢＳＡ（２０μｌ）を用いた。基質液３００μｌに各濃
度の酵素液２０μｌを加え、それぞれ３７℃×９分間保
持した。その後、０．１Ｎ−ＮａＯＨ（１ｍｌ）で反応
を停止し、蛍光光度計（島津製作所製，ＲＦ−５１０）
を用い、相対蛍光強度をそれぞれ至適波長で測定した
（製造例２の化合物：励起波長３１９ｎｍ、蛍光波長４
１９ｎｍ、製造例６の化合物：励起波長３２４ｎｍ、蛍
光波長４２３ｎｍ）。製造例２及び製造例６の化合物を
用いた場合のアルカリホスファターゼ量と相対蛍光強度
の関係を図８〜９に示す。

【００４７】実験例４：ＣＥＡ（がん胎児性抗原）濃度
と蛍光強度 抗ＣＥＡヤギＩｇＧを感作したポリスチレン製試験管
（１２×７５ｍｍ，ヌンク社製，マキシソープチュー
ブ）に、０．５％牛血清アルブミンを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ及びＣＥＡ標準液
（０．２ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ）２０μｌを加
え、室温で１時間保持した。０．１％トリトンＸ１００
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄
後、牛小腸由来アルカリホスファターゼを標識した。抗
ＣＥＡヤギＩｇＧ（１０ｍＵ／ｍｌ）を０．３ｍｌ加
え、室温で１時間保持した。０．１％トリトンＸ１００
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で４回洗浄
後、１ｍＭの製造例２の化合物、１ｍＭ−ＭｇＣｌ₂ 及
び０．１ｍＭ−ＺｎＣｌ₂ を含む１Ｍジエタノールアミ
ン緩衝液（ｐＨ９．９）０．３ｍｌを加え、３７℃で５
分間保持した。その後、０．１Ｎ−ＮａＯＨ（１ｍｌ）
で反応を停止し、蛍光光度計（島津製作所製，ＲＦ−５
１０）を用いて、相対蛍光強度を励起波長３１９ｎｍ、
蛍光波長４１９ｎｍで測定した。ＣＥＡ濃度と相対蛍光
強度の関係を表１に示す。

【００４８】

【表１】

【００４９】

【発明の効果】以上のように、本発明の定量方法は、ビ
フェニル化合物を加水分解して２−ヒドロキシビフェニ
ル化合物を生成せしめる酵素、特にアルカリホスファタ
ーゼ、スルファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、或
いは抗原又は抗体の定量に有用であり、また該ビフェニ
ル化合物は検出感度の高い酵素活性測定用の基質として
有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】製造例１の化合物及びその加水分解生成物を用
いた場合の励起及び蛍光波長スペクトルを示す図であ
る。

【図２】製造例２の化合物及びその加水分解生成物を用
いた場合の励起及び蛍光波長スペクトルを示す図であ
る。

【図３】製造例３の化合物及びその加水分解生成物を用
いた場合の励起及び蛍光波長スペクトルを示す図であ
る。

【図４】製造例４の化合物及びその加水分解生成物を用
いた場合の励起及び蛍光波長スペクトルを示す図であ
る。

【図５】製造例５の化合物及びその加水分解生成物を用
いた場合の励起及び蛍光波長スペクトルを示す図であ
る。

【図６】製造例６の化合物及びその加水分解生成物を用
いた場合の励起及び蛍光波長スペクトルを示す図であ
る。

【図７】製造例１の化合物を用いた場合のアルカリホス
ファターゼ量と反応速度の関係を示す図である。

【図８】製造例２及び製造例６の化合物を用いた場合の
アルカリホスファターゼ量と相対蛍光強度の関係を示す
図である。

【図９】製造例２及び製造例６の化合物を用いた場合の
アルカリホスファターゼ量と相対蛍光強度の関係を示す
図である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 【化１】 （式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）をその構造中に
   有するビフェニル化合物を−ＯＺ部位で加水分解して対
   応する２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめる
   酵素の存在下に、該ビフェニル化合物を加水分解して該
   ２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめ、該２−
   ヒドロキシビフェニル化合物を検出する工程を有するこ
   とを特徴とする前記酵素の定量方法。
2. 【請求項２】 ビフェニル化合物が 【化２】 をその構造中に有するものである請求項１記載の酵素の
   定量方法。
3. 【請求項３】 酵素がアルカリホスファターゼである請
   求項１記載の酵素の定量方法。
4. 【請求項４】 式 【化３】 （式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）をその構造中に
   有するビフェニル化合物を−ＯＺ部位で加水分解して対
   応する２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめる
   酵素で標識した抗体を抗原と反応させて、抗原−抗体複
   合体を形成させ、該複合体に結合した前記酵素の存在下
   に、該ビフェニル化合物を加水分解して該２−ヒドロキ
   シビフェニル化合物を生成せしめ、該２−ヒドロキシビ
   フェニル化合物を検出する工程を有することを特徴とす
   る抗原の定量方法。
5. 【請求項５】 ビフェニル化合物が 【化４】 をその構造中に有するものである請求項４記載の抗原の
   定量方法。
6. 【請求項６】 酵素がアルカリホスファターゼである請
   求項４記載の抗原の定量方法。
7. 【請求項７】 式 【化５】 （式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）をその構造中に
   有するビフェニル化合物を−ＯＺ部位で加水分解して対
   応する２−ヒドロキシビフェニル化合物を生成せしめる
   酵素で標識した抗原を抗体と反応させて、抗原−抗体複
   合体を形成させ、該複合体に結合した前記酵素の存在下
   に、該ビフェニル化合物を加水分解して該２−ヒドロキ
   シビフェニル化合物を生成せしめ、該２−ヒドロキシビ
   フェニル化合物を検出する工程を有することを特徴とす
   る抗体の定量方法。
8. 【請求項８】 ビフェニル化合物が 【化６】 をその構造中に有するものである請求項７記載の抗体の
   定量方法。
9. 【請求項９】 酵素がアルカリホスファターゼである請
   求項７記載の抗体の定量方法。
10. 【請求項１０】 式 【化７】 （式中、Ｚは加水分解可能な基を示す）をその構造中に
    有するビフェニル化合物からなる酵素活性測定用の基
    質。
11. 【請求項１１】 ビフェニル化合物が 【化８】 をその構造中に有するものである請求項１０記載の酵素
    活性測定用の基質。