JPH0372898A - クマリン化合物による核酸等の検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、核酸配列等を蛍光により効率良く検出するこ
とができる。核酸等の検定方法に関する。

〔従来技術〕

医学、生物学の分野においては、近年、核酸断片検出法
により、核酸配列を検定する方法が多用されている。

この検定方法においては３例えばＤＮＡ　（又はＲＮＡ
）プローブを放射性同位元素を用いて１ｍし、これと標
的核酸とをハイブリダイズさせ　しかる後にオートラジ
オグラフティーにより標的核酸の検出を行うという手段
が、現在広く行われている。

しかして、この核酸配列を検定する方法において、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡの標識としては、従来から放射性アイソトー
プが最も良く用いられてきた。

（解決しようとする課題） しかしアイソトープ法には、多くの欠点があり。

この分野の技術の応用と発展にとって著しい障害となっ
ている。

アイソトープ法の欠点は次の通りである。

（ａ）　　核酸ハイブリダイゼーシヨンにおいて、近接
した遺伝子間（核酸配列間）の相対的位置関係を明らか
にするだけの空間的解像力がない。

〜）アイソトープを用いた実験操作は、特別の設備をそ
なえたアイソトープ実験室の中でしか行うことが出来な
い、このことは、特にハイブリダイゼーシッン法の臨床
検査への応用を妨げる原因となっている。

（Ｃ）　　アイソトープを用いることは、たとえ実験室
の中であっても実験者にとって危険が伴い　また廃棄物
等による一般人への危険も常に存在する。

（ｄ）　　検出のために非常な長時間（数週間〜数ケ月
）を要する場合があり、迅速臨床診断への応用が難しい
。

（ｅ）　　放射活性は、一定の半減期をもって減衰する
ため、アイソトープの購入予定口に合わせた実験計画を
立てねばならず、わずかな日程のずれにより、アイソト
ープや大規模な実験成果をむだにする危険がある。

（ｆ）　　検出感度を高めるためにはプローブとする核
酸に、できるだけ高い放射性を付与する必要があるが、
放射性を高める程標識した核酸は放射崩壊し易くなると
いう矛盾がある。

（Ｑ　アイソトープは、一般にきわめて高価であり、１
回の実験で数十万円骨に相当するアイソトープを消費す
ることも珍しくない、この事が、ハイブリダイゼーシッ
ン法の一般的普及を妨げている。

このような背景から放射性アイソトープに代わるＤＮＡ
、ＲＮＡ標識法がこれまでにもいくつか開発されている
９例えば、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社（ＢＲ
Ｌ社）より市販されているブルージン（Ｂｌｕ　　Ｇｅ
ｎｅ）キットがある。

また、特開昭６０−２２６８８８号公報に記載のｒ核酸
標識物質及びその使用法」がある。

しかし、これらの技術は、上記の欠点の一部のみを解消
したものにとどまり、特に検出感度はアイソトープ法に
まさるものとは言えない。

即ち１例えば上記標識においては、検出感度がｒｔｏ−
目ｇＤＮＡＪであり、アイソトープ検出感度のｒｌ　Ｏ
−”　ｇＤＮＡ、に比して若干劣っている。

本発明は、かかる問題点に鑑み、前記アイソトープ法の
安全上等の欠点を解決し、検出感度に優れた。核酸等の
検定方法を提供しようとするものである。

（ｉ１題の解決手段〕 本発明は、核酸などの被検体にホスファターゼを結合さ
せ１次いで該ホスファターゼにクマリン化合物を反応さ
せ、その後これらに励起光を照射してこれにより発生す
る蛍光を検出することを特徴とする核酸等の検定方法に
ある。

本発明において最も注目すべきことは、ホスファターゼ
に結合させる被検体としてクマリン化合物を用い、励起
光によって発生する蛍光を検出することにある。

上記ホスファターゼとしては、アルカリホスファターゼ
、アシッドホスファターゼなどがある。

また、”本発明において対象とする被検体の検出法とし
ては、、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の検出。

蛋白質の検出、抗体を用いた化学物質の免疫学的検出技
術などがある。

また、クマリン化合物としては２例えば下記の式〔Ｉ〕
。

〔■〕。

（Ｉｆｆ）を基本骨格とするもの がある。

式（１） 式（Ｉ［） 上記の式（１）において、Ｒ７はリン酸エステル、Ｘは
ヒドロキシ基、Ｙはアルコキシ基を表す。

式（ＩＩ）において、Ｒ３はリン酸エステル、　　Ｒｔ
は芳香族環式基、芳香族複素環式基又はアルキル基を表
す０式（ＩＩＩ）において、Ｒ１はリン酸エステル、Ｒ
２は芳香族環式基又は芳香族複素環式基を表す。

また、これらのクマリン化合物の各種誘導体は。

下記の実施例に示されている。

また、クマリン化合物の製法としては１例えば次の（Ａ
）〜（Ｃ）の３種類がある。

（Ａ） ×１ＣＨ２ＣＯＯＨ ×２−ｃＨ２ＣＧＯＨ 式（［Ｉ［） で表さ・れるジカルボンｒｌｉ（式中、Ｘ＋、Ｘｓは。

４−ヒドロキシ−３−メ、トキシフェニル基であで表さ
れるアルデヒドとを。

無水酢酸存在下で縮合させて。

トリエチルアミン。

中でオキシ塩化リンと反応させて、第２請求項で示した
弐（１）で表されるクマリン化合物を製造する方法。

（Ｂ）　　Ｒ，−ｃＨｔ　Ｃ０ＯＨで表されるカルボン
酸化合物（式中、Ｒ５は３，４．５−トリメトキシフェ
ニルｉ、ａ、４−ジメトキシフェニル基、２−ナフチル
基、３−ナフチル基、３−インドール基、１−アダマン
チル基、又は３−アントラセン基を表す）と式： で示される化合物を得１次いでこれをエタノール中で炭
酸カリウムと反応させて２式：で表されるアルデヒド（
式中、Ｘ３は水素又は。

メチル基を表す）をトリエチルアミン、無水酢酸存在下
で縮合させて式： で示される化合物を得。

次いでこれをピリジン で示される化合物を得１次いで、これをエタノール中で
炭酸カリウムと反応させて式：のカルボン酸と式： で示される化合物を得１次いで、これをピリジン中でオ
キシ塩化リンと反応させて、前記第４請求項の式〔■〕
、又は第１０請求項の式（Ｔｌｌ）で表されるクマリン
化合物を製造する方法。

（Ｃ） で表されるアルデヒドとを、トリエチルアミン。

無水酢酸存在下で縮合させて２式： で表され名カルボン酸と１式； Ｃ）ｂＣＣＨ２Ｃ００（？ａＨう で表されるエチルアセトアセテートとを濃硫酸存在下で
縮合させて１式： で表される化合物を得１次いでこれをエタノール中で炭
酸カリウムと反応させて式： で表されるクマリンカルボン酸を得１次し）でこで表さ
れる化合物を得３次いでこれをピリジン中でオキシ塩化
リンと反応させて第６請求項で示したクマリン化合物を
製造する方法。

〔作用及び効果〕

本発明の検定方法においては、前記ホスファターゼにク
マリン化合物を結合（反応）させ１次いで励起光を照射
する。これにより１上記クマリン化合物のＯＨ体が蛍光
を発する。そこで、この蛍光を検出する。

しかして１本発明においては、上記クマリン化合物を用
いることにより強力な蛍光が得られるため、上記検出の
感度が向上し１例えば１Ｑ−１４ｇＤＮＡが検出可能と
なる。

また、前記従来の検定方法（ＢＲＬ社法）では。

ピコグラムオーダの微１１ＤＮＡを検出する場合。

メンブレンフィルターがナイロン製であると、バックグ
ランｉ′が高いため、ニトロセルローズ製のものを用い
なければならなかった。しかし、ニトロセルローズ製の
ものは物理的強度、耐薬品性が低く１異なったプローブ
を用いた反復使用に耐えられない。

これに対して１本発明では、クマリン化合物を用いて可
視光によらず強度の大きい蛍光を標識とするため、Ｓ／
Ｎ比が向上する。そのため、ナイロン製のメンブレンフ
ィルターを用いることが可能である。また、ナイロン製
のものが使用できるので、核酸パイプリダイゼーシッン
の全自動化を行うこともできる。

また９本発明はアイソトープは用いないため前記従来技
術の問題点も解決できる。

したがって１本発明によれば、使用安全で、検出感度に
優れた核酸等の検定方法を提供することができる。

〔実施例〕

第１実施例 ビオチンＩＩ２されたＤＮＡプローブを、ナイロン膜フ
ィルター又はニトロセルロース膜フィルターに固定化し
た試料ＤＮＡと雑種交雑させた＋１Ｖｉいて、ペセスダ
・リサーチ・ラボラトリ−社（ＢＲＬ社）より市販され
ているブルージーン（登録商標ＢＬＵ　　ＧＥＮＥ）キ
ットを用いて、アビジンを介して酵素アルカリホスファ
ターゼを、ビオチン標識ＤＮＡプローブに結合させる。

即ち、酵素アルカリホスファターゼの基質として、以下
に記載のクマリン化合物としての、クマリン誘導体のリ
ン酸体を用いる０例えば１００ｍＭトリス！ｌ衝液、１
００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化マグネシウムｐ
Ｈ９，５の反応液中にクマリン誘導体リン酸体（トリメ
トキシ・ヘンシル　クマリン・リン酸体）を２５〜１０
０μｇ／ｍｌとなるように溶解する８次いで、上記方法
により、クマリン化合物と、前記ＤＮＡに結合させた酵
素アルカリホスファクーゼとを反応させる。

反応は１通常、室温（または３５〜５５°（：の高温）
で、５分から２時間程度行い、蒸留水等でフィルターを
洗浄する。その後、紫外線励起光照射下で、蛍光シグナ
ルを検出する。

その結果、少なくとも０．０２ｐｇ（ピコグラム−２Ｘ
１０−１ｇ）のＤＮＡが確認された。

第２実施例 文献Ａｃｔａ、Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、１９１８５４　
（１９６５）に基づいてホモバニリン酸５００■を１４
％アンモニア水６ｄに溶かし１次いでフェリシアン化カ
リウム９７８■を力ｎえ、室温で５分間撹拌し１次いで
Ｌ−アスコルビン１ｌ１６３■を加え、室温で１時間撹
拌する。

その後、溶液を塩酸で酸性にし酢酸エチルで抽出する０
次いで、ロータリーエバポレーターで酢酸エチルを除去
し２残さをカラムクロマト精製し。

式： で表される１００■の２．２′−ジヒドロキシ−３，３
’−ジメトキシビフェニル−５，５゛ジ酢酸が得られた
。

次いで１文献Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｒｅａｃｔｉ。

ｎ　土、２１０　（１９４２）に基づいて２，２゛−ジ
ヒドロキシ−３，３′−ジメトキシビフェニル−５，５
′−ジ酢酸１００■と、２，４−ジヒドロキシベンズア
ルデヒド１１４■と、トリエチルアミン２００．ｃｒｆ
と、無水酢酸２００μ乏とからなる混合物を窒素雰囲気
下１．５時間還汰の下にかきまぜる。

その後１反応物にトルエンを混ぜ、トリエチルアミン等
の溶媒を除く、これにより、シリカゲルカラムクロマト
精製により式： 酸性にすると沈澱が生じた。これをエタノールで溶出し
、該エタノールで蒸発さ七ると式：で表される４６ｇの
クマリン化合物のアセチル体が得られた。

次いで、このクマリンアセチル体４６ｍｇをエタノール
２ｄに溶かし、炭酸カリウム７００ｍｇとの混合物を室
温で２時間撹拌する。その後、ろ過して沈澱物を除き、
ロータリーエバポレーターによりエタノールを除く、こ
の残さにＩＮ塩酸を加えで表される１５１ｍｇのクマリ
ン化合物が得られた。

次いで、このクマリン化合物１５■をピリジン４００μ
２に溶かし０°Ｃで、３０分撹拌後、同様に冷却したオ
キシ塩化リン３２．５ｍｇを加えた。

０℃で４時間撹拌後、水を加えて反応を止めた。

濾過したのち、水を加え、エーテル抽出し、水層をロー
タリーエバポレーターにより蒸発させた。

次いで、・逆相シリカゲルカラム精製を行い式：で表さ
れるクマリン化合物のリン酸体をた。

第３実施例 文献Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　　上。

２１０　（１９４２）に基づいて、２，４−ジヒドロキ
シベンズアルデヒド５０ｈｇと、３，４．５−トリメト
キシフェニル酢酸８３０■と、トリエチルアミン１．７
−と、無水酢酸５Ｉｄとからなる混合物を、窒素雰囲気
下、１時間還流の下でかきまぜる。

その後９反応物にトルエンを混ぜ、ロータリーエバポレ
ーターにより溶媒を除く０次いでシリカゲルカラムクロ
マト精製により式： で表される１２５■のクマリン化合物のアセチル体が得
られた。

次いで、このクマリンアセチル体２２７ｍｇをエタノー
ル３ｄに溶かし、炭酸カリウム４３０ｍｇとの混合物を
室温で１時間撹拌する。その後、濾過して沈澱物を除き
、ロータリーエバポレーターによりエタノールを除く、
この残さにＩＮ塩酸を加え酸性にすると沈澱が生じた。

これをエタノール溶出し、該エタノールで蒸発させると
式：で表される１４７■のクマリン化合物が得られ尼。

次いで、このクマリン化合物１４７ＩＩ１ｇをピリジン
１．７ｍに溶かし、Ｏ″Ｃで３０分撹拌後、同様に冷却
したオキシ塩化リン３６１ｍｇを加えた。０℃で４時間
撹拌後、氷を加えて反応を止めた。濾過した後、水を加
え、エーテル抽出し、水層をロータリーエバポレーター
により蒸発させた６次いで、逆相シリカゲルカラム精製
を行い式；で表されるクマリン化合物のリン酸体８７ｍ
ｌ？を得た。

第４実施例〜第９実施例 前記第３実施例と同じ処理において、前記の３゜４．５
−トリメトキシフェニル酢酸の代わりに。

第１表のカルボン酸化合物を適用すると同表に記載のク
マリン化合物を得る。

第１０実施例〜第１２実施例 第３実施例と同し処理において、前記の２，４−ジヒド
ロキシベンズアルデヒドの代わりに式：で表される２、
４−ジヒドロキシフェニルメチルケトンを適用し、３，
４．５−１リメトキシフエニル酢酸の代わりに、第２表
のカルボン酸化合物を適用すると同表記載のクマリン化
合物を得る。

第１３実施例 文献Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｒｅａｃｔｔｏｎ　　Ｖｌｌ。

１　　（１９５３）に基づいて１ｍ−ヒドロキシフェニ
ル酢酸にエチルアセトアセテートを溶解し、０°Ｃに冷
却した後、濃硫酸を加えて、−晩装置。

その後、水を加えると沈澱物が生じるため、これを濾取
し、エタノールで再結晶すると式：で表されるカルボン
酸クマリン化合物を得る。

次いで１文献Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｒｅａｃｔｉ。

ｎ　土、２１０　（１９４２）に基づいて、このカルボ
ン酸クマリンと、２．４−ジヒドロキシベンズアルデヒ
ドと、トリエチルアミンと、無水酢酸とからなる混合物
を窒素雰囲気下１時間速波の下にかき混ぜる。

その後１反応物にトルエンを混ぜ、ロータリーエバポレ
ーターにより溶媒を除く１次いでシリカゲルカラムクロ
マト精製により式： で表されるクマリン化合物のアセチル体が得られた。

次いで、このクマリンアセチル体をエタノールに溶かし
、炭酸カリウムを加え、１時間撹拌する。

その後、ろ過して沈澱物を除き、ロータリーエバポレー
ターによりエタノールを除く、この残さに。

１Ｎ塩酸を加え、酸性にすると、沈澱が生した。

これをエタノール溶出し、ロータリーエバポレーターに
よりエタノールを除くと式： で表されるクマリン化合物が得られた。

次いで、このクマリン化合物をピリジンに溶かし、ｏ’
ｃで３０分撹拌後、同様に冷却したオキシ塩化リンを加
えた。０°Ｃで４時間撹拌後、氷を加えて反応を止めた
。濾過した後、水を加え、エーテル抽出し、水層をロー
タリーエバポレーターにより蒸発させた０次いで、逆相
シリカゲルカラム精製を行い式： で表されるクマリン化合物のリン酸体を得た。

また、前記第２実施例〜第１３実施例で得られた各クマ
リン化合物は、第１実施例と同様にＤＮＡ検定のテスト
に供した。その結果、いずれのクマリン化合物も１０−
１〜１０””　ＤＮＡという高い検出感度を発揮した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）核酸などの被検体にホスファターゼを結合させ、
   次いで該ホスファターゼにクマリン化合物を反応させ、
   その後これらに励起光を照射してこれにより発生する蛍
   光を検出することを特徴とする核酸等の検定方法。 （２）第１請求項において、クマリン化合物は下記の式
   で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はリン酸エステル、Ｘはヒドロキシ基、
   Ｙはアルコキシ基を表す。） （３）第２請求項において、式〔 I 〕のＹはメトキシ
   基を表すことを特徴とする核酸等の検定方法。 （４）第１請求項において、クマリン化合物は下記の式
   で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ・・・・・式〔II〕 （式中、Ｒ＿１はリン酸エステル、Ｒ＿２は芳香族環式
   基、芳香族複素環式基又はアルキル基を表す。 （５）第４請求項において、式〔II〕のＲ＿２は３，４
   ，５−トリメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフ
   ェニル基、ナフチル基を表すことを特徴とする核酸等の
   検定方法。（６）第４請求項において、クマリン化合物
   は下記の式で表されることを特徴とする核酸等の検定方
   法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はリン酸エステルを表す。） （７）第４請求項において、クマリン化合物は下記の式
   で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はリン酸エステルを表す。） （８）第４請求項において、クマリン化合物は下記の式
   で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はリン酸エステルを表す。） （９）第４請求項において、クマリン化合物は下記の式
   で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はリン酸エステルを表す。） （１０）第１請求項において、クマリン化合物は下記の
   式で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・式〔III
   〕 （式中、Ｒ＿１はリン酸エステル、Ｒ＿３は芳香族環式
   基又は芳香族複素環式基を表す。） （１１）第１０請求項において、式〔III〕のＲ＿３は
   ナフチル基を表すことを特徴とする核酸等の検定方法。 （１２）第１０請求項において、クマリン化合物は下記
   の式で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はリン酸エステルを表す。） （１３）第１０請求項において、クマリン化合物は下記
   の式で表されることを特徴とする核酸等の検定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はリン酸エステルを表す。） （１４） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるジカルボン酸（式中、Ｘ＿１、Ｘ＿２は、４
   −ヒドロキシ−３−メトキシフェニル基である）と、 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるアルデヒドとを、トリエチルアミン、無水酢
   酸存在下で縮合させて、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物を得、次いでこれをエタノール中で炭
   酸カリウムと反応させて、式： で示される化合物を得、次いでこれをピリジン中でオキ
   シ塩化リンと反応させて、第２請求項で示した式〔 I
   〕で表されるクマリン化合物を製造する方法。 （１５）Ｒ＿１−ＣＨ＿２ＣＯＯＨで表されるカルボン
   酸化合物（式中、Ｒ＿１は３，４，５−トリメトキシフ
   ェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−ナフチ
   ル基、３−ナフチル基、３−インドール基、１−アダマ
   ンチル基、又は３−アントラセン基を表す）と式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるアルデヒド（式中、Ｘ＿３は水素又は、メチ
   ル基を表す）をトリエチルアミン、無水酢酸存在下で縮
   合させて式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物を得、次いで、これをエタノール中で
   炭酸カリウムと反応させて式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物を得、次いで、これをピリジン中でオ
   キシ塩化リンと反応させて、前記第４請求項の式〔II〕
   、又は第１０請求項の式〔III〕で表されるクマリン化
   合物を製造する方法。 （１６） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるカルボン酸と、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるエチルアセトアセテートとを濃硫酸存在下で
   縮合させて、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるクマリンカルボン酸を得、次いでこのカルボ
   ン酸と式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるアルデヒドとを、トリエチルアミン、無水酢
   酸存在下で縮合させて、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物を得、次いでこれをエタノール中で炭
   酸カリウムと反応させて式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物を得、次いでこれをピリジン中でオキ
   シ塩化リンと反応させて第６請求項で示したクマリン化
   合物を製造する方法。