JP2506396B2 - ジオキセタン類の酵素的に誘導される分解を使用する物質検出法 - Google Patents

ジオキセタン類の酵素的に誘導される分解を使用する物質検出法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は試料中の物質をジオキセタン類を使用して検
出することに関する。
ジオキセタン類は、環の中の２員がお互いに結合した
酸素原子である４員環を有する化合物である。ジオキセ
タン類を熱的または光化学的に分解してカルボニル生成
物、すなわちケトン類またはアルデヒド類を形成しう
る。この分解には、光の形でのエネルギーの放出（すな
わち、ルミネセンス）が伴う。
発明の要約 本発明は一般的に第一の態様として、特異的な結合対
（すなわち、お互いに特異的な結合をする２つの物質）
の１つを光学的に検出可能な反応を用いて検出する検定
の改良法を提供する。該改良法は、式 〔式中、 Ｔは置換されている（すなわち、１つもしくはそれ以上
のC1−C7アルキル基またはカルボニル基のようなヘテロ
原子基を含む）が、または非置換シクロアルキル（環の
炭素数６〜12）であるか、またはジオキセタンの４員環
部にスピロ結合で結合しているポリシクロアルキル（２
つもしくはそれ以上の縮合環を有し、各環は独立して５
から12までの炭素原子を有する）基であり:Vは水素また
は酵素により切断可能な基、すなわち酵素で切断してジ
オキセタンに結合する電子密度の高い部位を得ることが
可能な結合を有する基（例、ホスフェート、ここでのリ
ン−酸素結合は酸性ホスファターゼもしくはアルカル性
ホスファターゼのような酵素で切断できジオキセタンに
結合する負に荷電した酸素を得ることができる）であ
り;Yは蛍光発色団であり（すなわち、Ｙはエネルギーを
吸収して励起、すなわち高エネルギー状態を形成でき、
この状態から光を放出してもとのエネルギー状態に戻
る）;Xは水素、直鎖もしくは分岐鎖のアルキル（炭素数
１〜７、例、メチル）、直鎖もしくは分岐鎖のヘテロア
ルキル（炭素数１〜７、例、メトキシ、ヒドロキシエチ
ル、もしくはヒドロキシプロピル）、アリール（少なく
とも１つの環を有する、例、フェニル）、ヘテロアリー
ル（少なくとも１つの環を有する、例、ピロリルもしく
はピラゾリル）、シクロアルキル（環の炭素数３〜７、
例、シクロヘキシル）、シクロヘテロアルキル（環の炭
素数２〜７、例、ジオキサン）、アラルキル（少なくと
も１つの環を有する、例、ベンジル）、アルキルアリー
ル（少なくとも１つの環を有する、例、トリル）、また
は酵素で切断可能な基であり；そしてＺは水素、水酸
基、または酵素で切断可能な基（上記の定義の通り）で
あって、Ｖ、Ｘ、またはＺのうち少なくとも１つの酵素
で切断可能な基でなければならない。〕 を有するジオキセタンと酵素との反応を含み、この反応
では、ジオキセタンに結合した負に荷電した置換基
（例、酸素陰イオン）を形成するように酵素で切断可能
な基を酵素が切断して、負に荷電した置換基はジオキセ
タンの分解を引き起こしてＹ基を含む発光性物質（すな
わち、光の形でエネルギーを放出する物質）を形成す
る。発光性物質は最初の物質の存在の指標として検出さ
れる。ルミネンスの強度を測定することによって最初の
物質の濃度を求めうる。
好適な具体例では、Ｔ、Ｘ、またはＹ基の１つもしく
はそれ以上は可溶化置換基（例、カルボン酸、スルホン
酸もしくは４級アミノ塩）を含む；ジオキセタンのＴ基
はポリシクロアルキル基、好ましくはアダマンチルであ
る；酵素で切断可能な基はリン酸を含む；そして酵素は
ホスファターゼを含む。
本発明は試料中の最初の物質を検出するためのキット
の特徴を述べている。
本発明は第２の態様として、試料中の酵素の検出法を
提供する。この方法には、検出される酵素によって決断
可能なＶ、Ｘ、またはＺ基を有する上記のジオキセタン
と試料とを接触させることが含まれる。酵素は基を切断
してジオキセタンに結合する負に荷電した置換基（例、
酸素陰イオン）を形成する。この置換基はジオキセタン
を不安定化し、これによりジオキセタンは分解してジオ
キセタンのＹ基を含む発光性物質を形成する。発光性物
質は酵素の存在の指標として検出される。ルミネセンス
の強度を測定することによって酵素の濃度も求めうる。
本発明は、試料（例、生成試料）中の物質を検出する
ための簡便で非常に感度の良い方法を提供し、特に低濃
度で存在する物質に有用である。ジオキセタンの分解が
発色団Ｙの励起エネルギー源となるので、外部からの励
起エネルギー源（例、光）は不必要である。さらに、ジ
オキセタン分子はすでに分解に適した酸化状態にあるの
で、外部から酸化体（例、過酸化水素または酸素）を添
加する必要はない。酸素で誘発される分解は、１つの酸
素分子が多数のジオキセタン分子をルミネス（Iuminesc
e）にして増幅効果をつくるので、高い感度を示す。さ
らに、発光の波長（またはエネルギー）およびルミネセ
ンスの量子収量はジオキセタンのＹ置換基の選択によっ
て変えうる（この中で使用されているように、『量子収
量』は分解されたジオキセタンのモル数当たりの発光性
生成物から放出される光子数をさす）。加えて、ジオキ
セタンのＴ、Ｘ、およびＹ基を適宜修飾することによっ
て、ジオキセタンの溶解性およびジオキセタン分解反応
の速度を変えうる。ジオキセタン類の多種類の分子
（例、タンパク質もしくはハプテン）または固定支持体
（例、高分子膜）に付着させることも、あるいは単独重
合体もしくは共重合体中の側鎖基として含ませることも
可能である。
本発明の他の特色および長所は、下記の好適具体例の
記述および請求の範囲に明示される。
好適具体例の記述 我々はここに、本発明の好適具体例の構造、合成およ
び用途を記述する。
構 造 本発明は上記の発明の要約に列挙された構造を有する
ジオキセタン類を使用する。Ｔ基の目的はジオキセタン
を安定化する、すなわち酵素で切断可能なＺ基が切断さ
れる以前にジオキセタンが分解することを防止すること
である。大きく、かさばって、立体障害のある分子
（例、縮合多環分子）が最も効果的な安定剤である。さ
らに、ＴはＣ−ＣおよびＣ−Ｈ単純結合のみを含むこと
が好ましい。最も好ましい分子は３つの縮合シクロヘキ
シル環からなるアダマンチル基である。アダマンチル基
はジオキセタンの４員環部スピロ結合によって結合す
る。
Ｙ基はＺ基に結合した蛍光性発色団である。酵素が
Ｖ、Ｘ、あるいはＺ基を切断し、これによりジオキセタ
ンを不安定化させる電子密度の高い部位をつくってジオ
キセタンの分解を引き起こす時点で、Ｙは発光性とな
る。分解によって２つの個々のケトンが生成され、その
うちの１つはＴ基を含み、もう１つはＸ、Ｙ、およびＺ
基を含む；ジオキセタンの分解で放出されるエネルギー
は後者のケトンのＹ基をルミネスにする（Ｘ基が水素の
場合、アルデヒドが生成される）。
発色団Ｙの励起状態エネルギー（すなわち、発色団Ｙ
が光を放出するために所有すべきエネルギー）は、ルミ
ネセンスをＹ基に限定するためにはＴ基を有するケトン
の励起状態エネルギーより小さいことが好ましい。例え
ば、Ｔがアダマンチルの場合、発色団Ｙの励起状態エネ
ルギーはスピロアダマンタノンの励起状態エネルギーよ
り小さいことが好ましい。
本発明によればいかなる発色団Ｙも使用しうる。一般
的には、感度を増加させるために量子収量を最大とす発
色団を使用することが好ましい。
適当な発色団の例には下記のものが含まれる。： １） アントラセンおよびアントラセン誘導体、例、9,
10−ジフェニルアントラセン、９−メチルアントラセ
ン、９−アントラセンカルボキシアルデヒド、アントリ
ルアルコール類および９−フェニルアントラセン； ２） ローダミンおよびローダミン誘導体、例、ロドー
ル類、テトラメチルローダミン、テトラエチルローダミ
ン、ジフェニルジメチルローダミン、ジフェニルジエチ
ルローダミン、およびジナフチルローダミン； ３） フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、
例、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、６−ヨー
ドアセトアミドフルオレセイン、およびフルオレセイン
−５−マレイミド； ４） エオシンおよびエオシン誘導体、例、ヒドロキシ
エオシン類、エオシン−５−ヨードアセトアミド、およ
びエオシン−５−マレイミド； ５） クマリンおよびクマリン誘導体、例、７−ジアル
キルアミノ−４−メチルクマリン、４−ブロモメチル−
７−メトキシクマリン、および４−ブロモメチル−７−
ヒドロキシクマリン； ６） エリスロシンおよびエリスロシン誘導体、例、ヒ
ドロキシエリスロシン類、エリスロシン−５−ヨードア
セトアミドおよびエリスロシン−５−マレイミド； ７） アクリジンおよびアクリジン誘導体、例、ヒドロ
キシアクリジン類および９−メチルアクリジン； ８） ピレンおよびピレン誘導体、例、Ｎ−（１−ピレ
ン）ヨードアセトアミド、ヒドロキシピレン類、および
１−ピレンメチルヨードアセテート； ９） スチルベンおよびスチルベン誘導体、例、6,6′
−ジブロモスチルベンゼンおよびヒドロキシスチルベン
類； 10） ナフタレンおよびナフタレン誘導体、例、５−ジ
メチルアミノナフタレン−１−スルホン酸およびヒドロ
キシナフタレン； 11） ニトロベンゾキサジアゾール類およびニトロベン
ゾキサジアゾール誘導体、例、ヒドロキシニトロベンゾ
キサジアゾール類、４−クロロ−７−ニトロベンツ−２
−オキサ−1,3−ジアゾール、２−（７−ニトロベンツ
−２−オキサ−1,3−ジアゾール−４−イル）メチルア
ミノアセトアルデヒド、およビ６−（７−ニトロベンツ
−２−オキサ−1,3−ジアゾール−４−イル−アミノヘ
キサノイックアンド； 12） キノリンおよびキノリン誘導体、例、６−ヒドロ
キシキノリンおよび６−アミノキノリン； 13） アクリジンおよびアクリジン誘導体、例、Ｎ−メ
チルアクリジンおよびＮ−フェニルアクリジン； 14） アシドアクリジンおよびアシドアクリジン誘導
体、例、９−メチルアシドアクリジンおよびヒドロキシ
−９−メチルアシドアクリジン； 15） カルバゾールおよびカルバゾール誘導体、例、Ｎ
−メチルカルバゾールおよびヒドロキシ−Ｎ−メチルカ
ルバゾール； 16） 蛍光性シアニン類、例、DCM（レーザー色素）、
ヒドロキシシアニン類、1,6−ジフェニル−1,3,5−ヘキ
サトリエン、１−（４−ジメチルアミノフェニル）−６
−フェニルヘキサトリエン、および対応する1,3−ブタ
ジエン類； 17） カルボシアニンおよびカルボシアニン誘導体、
例、フェニルカルボシアニンおよびヒドロキシカルボシ
アニン類； 18） ピリジウム塩、例、４（４−ジアルキルジアミノ
スチリル）Ｎ−メチルピリジニウムイオデートおよびヒ
ドロキシ−置換ピリジニウム塩； 19） オキソノール類；および 20） レゾロフィン類およびヒドロキシレゾロフィン
類。
最も好適な発色団はアントラセンまたはナフタレンの
ヒドロキシ誘導体である；水酸基はＺ基への結合を促進
する。
Ｚ基は酵素で切断可能な結合を介して発色団Ｙに結合
することが好ましい。適当な酵素との接触により酵素で
切断可能な結合が切断され、発色団Ｙに結合した電子密
度の高い部位が得られる；この部位が、２つの個々のケ
トン類への、またはＸ基が水素の場合にはケトンとアル
デヒドへのジオキセタンの分解を開始する。電子密度の
高い部位の例には、酸素、イオウ、およびアミンまたは
アミド陰イオンが含まれる。最も好適な部位は酸素陰イ
オンである。酵素で切断可能な基の適当な例およびこれ
らの基に特異的な酵素類は下記の表１に示されている；
矢印は酵素で切断可能な結合を示す。最も好適な基は、
アルカリ性または酸素ホスファターゼ酵素で切断される
リン酸エステルである。
適当なＸ基は上記の発明の要約に記述されている。Ｘ
は１つまたはそれ以上の可溶化置換基、すなわち水溶液
中でのジオキセタンの溶解性を上昇させる置換基を含む
ことが好ましい。可溶化置換基の例には、カルボン酸
（例、酢酸）、スルホン酸（例、メタンスルホン酸）、
および４級アミノ塩（例、臭化アンモニウム）が含まれ
る；最も好適な可溶化置換基はメタン−またはエタンス
ルホン酸である。
Ｖ、Ｘ、またはＺ基を切断する酵素は検出される物質
に対して特異的親和性を有する物質に共有結合している
ことが好ましい。特異的親和性物質の例には、抗hCGの
ような抗体（この場合検出される物質はhCGのような抗
原）、hCGをような抗原（この場合検出される物質は抗h
CGのような抗体）、あるいは検出される核酸（例、DNA
もしくはRNA）の全体または一部に結合できるプローブ
が含まれる。結合はアミド結合を介することが好まし
い。
合 成 一般に本発明のジオキセタン類は２段階で合成され
る。第１の段階は式 （式中、Ｔ、Ｘ、Ｙ、およびＺは上記の通り） を有する適当に置換されたオレフィンの合成を含む。こ
れらのオレフィン類はウィッティヒ反応を用いて合成す
ることが好ましい。この反応ではＴ基を含むケトンを
Ｘ、Ｙ、およびＺ基を含むリンイリド（好ましくはトリ
フェニルホスフィンに基づく）と下記のように反応させ
る： 反応は好ましくは−78℃でテトラヒドロフランTHF）な
どのエーテル性溶媒中で実施する。
リンイリドは、トリフェニルホスフィンをＸ、Ｙ、お
よびＺ基を含むハロゲン化化合物と塩基の存在下反応さ
せることによって調製する；好適な塩基の例には、ｎ−
ブチルリチウム、ナトリウムアミド、水素化ナトリウ
ム、およびナトリウムアルコキシドが含まれる；最も好
適な塩基はｎ−ブチルリチウムである。反応過程は下記
の通りである： （式中、Ｑは塩素、臭素、またはヨウ素などのハロゲン
である）。最も好適なハロゲンは臭素である。反応は好
ましくは−78℃でTHF中で実施する。
Ｔがアダマンチル（Ad）、Ｘがメトキシ（OCH3）、Ｙ
がアントラセン（An）、そしてＺがリン酸（PO4）であ
るオレフィンは、下記のように合成しうる。
は、塩化水銀の存在下Ｎ−メチルイミダゾールと反応さ
せたリン酸の生成物で処理することによって加リン酸反
応させる；正味の結果としてAnの水酸基がリン酸基に置
換されるはずである。加リン酸反応生成物は次に−78
℃、THF中でトリフェニルホスフィンと反応させ、式 を有するリンイリドを形成させる。反応は乾燥アルゴン
気体中で実施する。スピロアダマンタノン（Ad＝酸素）
を次に温度を−78℃に保ちながらイリドを含む溶液に加
え、式 を有するオレフィンを形成させる。次にオレフィンはク
ロマトグラフィーの常法を用いて精製する。
ジオキセタン類の合成の第２段階は、上記のオレフィ
ンのジオキセタンへの変換を含む。変換は光存在下にオ
レフィンを一重項酸素（1O2）で処理することによって
光化学的に実施することが好ましい。1O2は二重結合し
て下記のようにジオキセタンを形成する： 反応は−78℃、ハロゲン化溶媒（例、塩化メチレン）中
で実施することが好ましい。1O2は光増感剤を用いて発
生させる。光増感剤の例には高分子結合ローズベンガル
〔センシトックスＩ（Sensitox I）として市販されてお
りハイドロン研究所（Hydron Laboratories,New Brunsw
ick,N,J.）から入手可能〕およびメチレンブルー（有名
な色素かつpH指示薬）が含まれる。最も好適な増感剤は
ローズベンガルである。
式 を有するジオキセタンの合成は下記の通りである。
式 を有するオレフィンを塩化メチレンに溶解させ、溶媒を
ガラス製の櫂を装備した2cm2のパイレックス試験官に入
れる；櫂は付属のガラスでおおった棒磁石によって上か
ら運転する。溶液は−78℃に冷却し、高分子結合ローズ
ベンガル1gを撹拌しながら加える。それから反応試験管
にUV−遮断フィルター（商品名コーニング（Corn−in
g）3060:365nmでの透過率＝0.5％）を取り付けた500Wの
タングステン−ハロゲンランプ（GE Q500 Cl）からの光
を当てながら、撹拌溶液の表面に酸素を流す。オレフィ
ンの消失とそれにともなったジオキセタンの出現を監視
するために薄層グロマトグラフィー（tlc）を用いる。
反応の完了後（tlc示されるように）溶媒を除去しジオ
キセタンを単離する。
用 途 試料中の特定の物質の存在またな濃度を求めるために
視覚的に検出可能な方法を使用する検定法は広範囲に存
在する。上記のジオキセタン類はこれらの検定法のいず
れにも使用しうる。こうした検定法の例には、抗体また
は抗原（例、αもしくはβ−hCG）を検出する免疫検定
法；酸素検定法；カリウムまたはナトリウムイオンなど
を検出する化学検定法；およびウィルス（例、HTLV III
もしくはサイトメガロウィルス）または細菌（例、大腸
菌）などを検出する核酸検定法が含まれる。
検出される物質が抗体、抗原または核酸である場合に
は、ジオキセタンのＺ基を切断可能な酵素が、検出され
る物質に特異的な親和性を有する物質（すなわち検出さ
れる物質に特異的に結合する物質）（例、それぞれ抗
原、抗体、または核酸プローブ）に結合することが好ま
しい。酵素を特異的親和性物質に結合させるために常法
（例、カルボジイミドカップリング）が使用される；結
合はアミド結合を介することが好ましい。
一般的に検定法は下記のように実施する。検出させる
物質を含むと思われる試料を、検出される物質に特異的
親和性を有する物質に結合した酵素（以下、特異的親和
性−酵素化合物と称する）を含む緩衝液に接触させる。
得られた溶液を、検出される物質が特異的親和性一酵素
化合物の特異的親和性を有する部分に結合するように培
養する。それから過剰の特異的親和性−酵素化合物を洗
い流し、特異的親和性−酵素化合物の酵素部分によって
切断されうるＺ基を有するジオキセタンを添加する。酵
素はＺ基を切断してジオキセタンを２つのケトン（また
はＸ基が水素の場合の場合にはアルデヒドとケトン）に
分解する；ケトンの１つに結合している発色団Ｙはこう
し励起されてルミネスとなる。ルミネンスはキュベット
またはカメラルミノメーターなどを用いて、試料中に検
出される物質が存在することの指標として検出される。
物質の濃度を求めるためにルミネセンス強度を測定す
る。
検出される物質が酵素である場合には、特異的親和性
物質は不必要である。その代わりに検出される酵素によ
って切断されうるＺ基を有するジオキセタンを使用す
る。そこで、酵素の検出法は、酵素−含有試験へのジオ
キセタンの添加、および酵素の存在と濃度の指標として
得られるルミネセンスの検出を含む。
特定の検定法の例を以下に述べる。
A.ヒトIgGの検定法 96−穴ミクロタイタープレートをヒツジ抗ヒトIgG
（Ｆ（ab）２断片特異的）でコートする。それからヒト
IgGを含む血清試料をウェル（Well）に添加し、ウェル
を室温で１時間培養する。培養期間後、血清試料をウェ
ルから除去し、そしてウェルを0.15M塩化ナトリウム、
0.01Mリン酸、および0.1％牛血清アルブミンを含む緩衝
水溶液（pH7.4）で４回洗浄する。
抗ヒトIgGに結合したアルカリ性ホスファターゼを各
ウェルに加え、ウェルを１時間培養する。それからウェ
ルを上記の緩衝液で４回洗浄し、リン酸−含有ジオキセ
タンの緩衝液を添加する。酵素によるジオキセタンの分
解で得られたルミネセンスは、ルミノメーターまたはカ
メラルミルメーターの写真フィルムによって検出する。
B.hCGの検定法 ウサギ抗αhCGはナイロンメッシュ膜の上に吸着させ
る。hCGを含む試料溶液（例、妊娠女性の尿）を膜に取
り取らせ、その後0.15M塩化ナトリウム、0.01Mリン酸、
および0.1％牛血清アルブミンを含む緩衝液（pH7.4）1m
lで膜を洗浄する。
アルカリ性ホスファターゼ標識抗βhCGを膜に加え、
膜を上記の緩衝液で再び洗浄する。それから膜をルミノ
メーターのキュベットまたはカメラルミノメーター中に
置き、リン酸−含有ジオキセタンに接触させる。それか
ら酵素によるジオキセタンの分解によって生じるルミネ
センスを検出する。
C.血清アルカリ性ホスファターゼの検定法 0.84M2−メチル−２−アミノプロパノールを含む緩衝
水溶液2.7mlを12×75mmパイレックス試験官に入れ、ア
ルカリ性ホスファターゼを含む血清試料0.1mlを加え
る。溶液をそれから30℃まで平衡化させる。リン酸−含
有ジオキセタン0.2mlを加え、得られるルミネセンスを
記録するためにただちに試験管をルミノメーターに設置
する。発光量はアルカリ性ホスファターゼ活性速度に比
例するであろう。
D.各酸のハイブリッド形成検定法 サイトメガロウィルスを含むと思われる脳脊髄液（CS
F）の試料を集めてニトロセルロース膜上に置く。それ
から試料を尿素またはグアニジウムイソチオシアネート
で化学的に処理して細胞壁を破壊しかつウィルスDNA以
外の細胞全成分を分解する。こうして作ったウィルスDN
A鎖を分離してニトロセルロース濾紙に付着させる。ウ
ィルスDNAに特異的にアルカリ性ホスファターゼで標識
されたDNAプローブをそれから濾紙に加える；プローブ
は相補的なウィルスDNA鎖とハイブリッド形成する。ハ
イブリッド形成後、濾紙を0.2M塩化ナトリウムおよび0.
1mMトリス−塩酸（pH＝8.0）を含む緩衝水溶液で洗浄し
て過剰のプローブ分子を除去する。リン酸−含有ジオキ
セタンを添加して、ジオキセタンの酵素による分解によ
って得られたルミネセンスをルミノメーターで測定する
かまたは写真用フィルムで検出する。
他の具体例も下記の請求の範囲に述べる。
例えば、酵素で切断可能なＺ基は、Ｙ基ではなくジオ
キセタンのＸ基に結合しうる。特異的親和性物質は酵素
ではなくＸ、Ｙ、またはＴ基（好ましくはＸ基）を介し
てジオキセタンに結合しうる。この場合、特異的親和性
物質が結合する基には、結合を促進するためにカルボン
酸、アミノ、またはマレイミド置換基などが提供され
る。
ジオキセタンのＸ、Ｙ、またはＴ基は、重合して単独
重合体もしくは共重合体を形成しうる重合性基（例、ビ
ニル基）と結合しうる。
ジオキセタンのＸ、Ｙ、またはＴ基は、免疫検定法ま
たは核酸検定法に使用するために膜、フィルム、ビー
ズ、または重合体などに結合しうる。基には結合を促進
するためにカルボン酸、アミノ、またはマレイミド置換
基などが提供される。
ジオキセタンのＸ、Ｙ、またはＴ基は、電子密度の高
い部位（例、メトキシ）などのジオキセタンの酵素によ
る分解の速度を高める置換基を含有しうる。
ジオキセタンのＹおよびＴ基ならびにＸ基は、可溶化
置換基を含有しうる。
適宜に置換されたジオキセタン類は化学的ならびに光
化学的に合成しうる。例えば、ウィッティヒ反応で調製
したオレフィンは過酸（例、ｐ−ニトロ過安息香酸）を
用いてエポキシ化しうる。エポキシ化オレフィンはそれ
から、アンモニウム塩（例、エトラメチルアンモニウム
ヒドロキシド）で処理することによってジオキセタンへ
と変換しうる。
化学合成の別の例には、ウィッティヒ反応で調製した
オレフィン過酸化水素およびジブロマンチン（1,3−ジ
ブロモ−5,5−ジメチルヒダントイン）と反応させるこ
とによって1,2−ブロモヒドロペルオキシドへと変換さ
せる反応が含まれる。1,2−ブロモヒドロペルオキシド
を水酸基または銀塩（例、臭化銀）などの塩基で処理す
ることによってジオキセタンが形成される。
ジオキセタンのオレフィン前駆体は、ケトンを塩化チ
タンおよび水酸化リチウムアルミニウム（LAH）の存在
下過酸エステルと反応させることによって合成しうる。
例えば、Ｔがマダマンテル（Ad）、Ｘがメトキシ（OC
H3）、Ｙがアントラセン（An）、そしてＺがリン酸であ
るオレフィン合成するには、下記の反応過程が使用され
る： 発色団Ｙ（例、アントラセン）を加リン酸反応させる
には、発色団の水酸化誘導体（例、水酸化アントラセ
ン）を下式： を有する環状アシルリン酸と反応させうる。反応生成物
を水で加水分解してリン酸化発色団を得る。環状アシル
リン酸は2,2,2−トリメトキシ−4,5−ジメチル−1,3−
ジオキサホスフォレンをホスゲンと０℃で反応させた後
に120℃で２時間加熱することによって調製する。

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の物質を光学的に検出可能な反応に
    よって検出する方法であって： （ａ）検出される物質を含むと思われる試料を、検出さ
    れる物質に特異的親和性を有する物質に結合した酵素に
    接触させ； （ｂ）得られた溶液を、検出される物質が、特異的親和
    性−酵素化合物の特異的親和性を有する部分に結合する
    ようにインキュベートし； （ｃ）過剰の特異的親和性−酸素化合物を洗い流し、 （ｄ）次式 〔式中、 Ｔは、１つもしくはそれ以上のC1−C7アルキル基または
    ヘテロ原子基で置換されていてもよいシクロアルキル
    （環の炭素数６〜12）であるか、またはジオキセタンの
    ４員環部にスピロ結合で結合しているポリシクロアルキ
    ル（２つもしくはそれ以上の縮合環を有し、各環は独立
    して５から12までの炭素原子を有する）基であり:Vは水
    素、または酵素により切断可能な基（すなわち酵素で切
    断してジオキセタンに結合する電子密度の高い部位を得
    ることが可能な結合を有する基）であり;Yは蛍光発色団
    （エネルギーを吸収して励起され高エネルギー状態を形
    成でき、この状態から光を放出してもとのエネルギー状
    態に戻る）であり;Xは水素、直鎖もしくは分岐鎖のアル
    キル基（炭素数１〜７）、直鎖もしくは分岐鎖のヘテロ
    アルキル（炭素数１〜７）、少なくとも１つの環を有す
    るアリール、少なくとも１つの環を有するヘテロアリー
    ル、シクロアルキル（環の炭素数３〜７）、シクロヘテ
    ロアルキル（環の炭素数２〜７）、少なくとも１つの環
    を有するアラルキル、少なくとも１つの環を有するアル
    キルアリール、または上記定義の酵素で切断可能な基で
    あり；そしてＺは水素、水酸基、または酵素で切断可能
    な基（上記の定義の通り）であって、Ｖ、Ｘ、またはＺ
    のうち少なくとも１つは上記定義の酵素で切断可能な基
    でなければならない。〕のジオキセタンを添加して酵素
    によりＺ基を切断してジオキセタンを２つのケトン、ま
    たはＸ基が水素の場合には、アルデヒドとケトン、に分
    解し；（ｅ）ケトンの１つに結合している発色団Ｙはこ
    うして励起されて発行し；そして（ｅ）ルミネセンスを
    測定することからなるが、ただし、 検出される物質が酵素である場合には、特異的親和性物
    椎は不必要であり、その代わりに、検出される酵素によ
    って切断されうるＺ基を有するジオキセタンを使用する
    ことからなる方法。
  2. 【請求項２】Ｔ、Ｘ、またはＹ基がさらに可溶化置換基
    を独立して含む、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】特異的な結合対が抗原と抗体よりなる、請
    求項１の方法。
  4. 【請求項４】特異的な結合対が核酸と核酸の全体または
    一部に結合可能なプローブよりなる、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】ジオキセタンのＴ基がポリシクロアルキル
    基である、請求項１の方法。
  6. 【請求項６】Ｔ基がアダマンチル基てせある、請求項１
    の方法。
  7. 【請求項７】酵素で切断可能な基がホスフェートよりな
    り、酵素がホスファターゼよりなる、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】Ｘ基がメトキシである、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】試料中の酵素を検出する方法であって、 （ａ）式 〔式中、 Ｔは、１つもしくはそれ以上のC1−C7アルキル基または
    ヘテロ原子基で置換されていてもよいシクロアルキル
    （環の炭素数６〜12）であるか、またはジオキセタンの
    ４員環部にスピロ結合で結合しているポリシクロアルキ
    ル（２つもしくはそれ以上の縮合環を有し、各環は独立
    して５から12までの炭素原子を有する）基であり:Vは水
    素、または酵素により切断可能な基（すなわち酵素で切
    断してジオキセタンに結合する電子密度の高い部位を得
    ることが可能な結合を有する基）であり;Yは蛍光発色団
    （エネルギーを吸収して励起され高エネルギー状態を形
    成でき、この状態から光を放出してもとのエネルギー状
    態に戻る）であり;Xは水素、直鎖もしくは分岐鎖のアル
    キル基（炭素数１〜７）、直鎖もしくは分岐鎖のヘテロ
    アルキル（炭素数１〜７）、少なくとも１つの環を有す
    るアリール、少なくとも１つの環を有するヘテロアリー
    ル、シクロアルキル（環の炭素数３〜７）、シクロヘテ
    ロアルキル（環の炭素数２〜７）、少なくとも１つの環
    を有するアラルキル、少なくとも１つの環を有するアル
    キルアリール、または上記定義の酵素で切断可能な基で
    あり；そしてＺは水素、水酸基、または酵素で切断可能
    な基（上記の定義の通り）であって、Ｖ、Ｘ、またはＺ
    のうち少なくとも１つは上記定義の酵素で切断可能な基
    でなければならない。〕 を有するジオキセタンを用意し、 （ｂ）該ジオキセタンを上記酵素を含む試料に接触さ
    せ、これにより該酵素が、ジオキセタンの酵素で切断可
    能な基を切断してジオキセタンに結合した負に荷電した
    置換基を形成し、この負に荷電した置換基はジオキセタ
    ンを分解してジオキセタンのＹ基からなる発光性物質を
    形成し；そして （ｃ）酵素の存在の指標として発光性物質を検出する諸
    段階よりなる方法。
  10. 【請求項１０】Ｔ、Ｘ、またはＹ基がさらに可溶化置換
    基を独立して含む、請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】ジオキセタンのＴ基がポリシクロアルキ
    ル基である、請求項９の方法。
  12. 【請求項１２】Ｔ基がアダマンチル基である、請求項９
    の方法。
  13. 【請求項１３】酵素が切断可能な基がホスフェートより
    なり、上記酵素がホスファターゼよりなる、請求項９の
    方法。
  14. 【請求項１４】Ｘ基がメトキシである請求項９の方法。
  15. 【請求項１５】試料中の物質を光学的に検出可能な反応
    によって検出するキットであって、 式 〔式中、 Ｔは、１つもしくはそれ以上のC1−C7アルキル基または
    ヘテロ原子基で置換されていてもよいシクロアルキル
    （環の炭素数６〜12）であるか、またはジオキセタンの
    ４員環部にスピロ結合で結合しているポリシクロアルキ
    ル（２つもしくはそれ以上の縮合環を有し、各環は独立
    して５から12までの炭素原子を有する）基であり:Vは水
    素、または酵素により切断可能な基（すなわち酵素で切
    断してジオキセタンに結合する電子密度の高い部位を得
    ることが可能な結合を有する基）であり;Yは蛍光発色団
    （エネルギーを吸収して励起され高エネルギー状態を形
    成でき、この状態から光を放出してもとのエネルギー状
    態に戻る）であり;Xは水素、直鎖もしくは分岐鎖のアル
    キル基（炭素数１〜７）、直鎖もしくは分岐鎖のヘテロ
    アルキル（炭素数１〜７）、少なくとも１つの環を有す
    るアリール、少なくとも１つの環を有するヘテロアリー
    ル、シクロアルキル（環の炭素数３〜７）、シクロヘテ
    ロアルキル（環の炭素数２〜７）、少なくとも１つの環
    を有するアラルキル、少なくとも１つの環を有するアル
    キルアリール、または上記定義の酵素で切断可能な基で
    あり；そしてＺは水素、水酸基、または酵素で切断可能
    な基（上記の定義の通り）であって、Ｖ、Ｘ、またはＺ
    のうち少なくとも１つは上記定義の酵素で切断可能な基
    でなければならない。〕 を有するジオキセタン、および 該ジオキセタンの酵素で切断可能な基を切断しうる酵素
    よりなるキット。
  16. 【請求項１６】Ｔ基がアダマンチル基である請求項15の
    キット。
  17. 【請求項１７】酵素で切断可能な基がホスフェートより
    なり、酵素がホスファターゼである請求項15のキット。
  18. 【請求項１８】Ｘ基がメトキシである請求項15のキッ
    ト。
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