JP2583327B2 - 分析で使用するジオキセタン - Google Patents

分析で使用するジオキセタン

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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 本発明は試料中の物質の検出のためのジオキセタン
（dioxetanes）の使用に関する。
ジオキセタンはお互いに結合する酸素原子２個を員と
して含む四員環を有する化合物である。ジオキセタン
は、熱的または光化学的に分解され、カルボニル生成
物、例えばケトン類またはアルデヒド類を形成すること
ができる。光の形態でのエネルギーの放出（即ち、発光
（luminescence））が分解に伴う。
（発明の要旨） 本発明の特徴は式（１）を有するジオキセタンに存す
る： ［式中、Ｔはジオキセタンの３位の炭素におけるスピロ
結合基であって、置換された（例えば、一種以上のC1−
C7アルキル基、ヘテロ原子含有基、例えばカルボニル基
または酵素分裂可能基、即ち酵素によって分裂しジオキ
セタンに結合する電子の豊富部分を生ずることが可能な
結合を有する基、例えばホスフェートを含有する）また
は非置換アリール基（環に６〜12個の炭素原子を有す
る、例えばフェニル）、ポリアリール（２個以上の環を
有する、例えばナフチル）、シクロアルキリデン（環に
６〜12個の炭素原子を有する）またはポリシクロアルキ
リデン（２個以上の融合環を有し、それぞれの環は独立
して５〜12個の炭素原子を有する）である;XはCR7R8、
Ｏ、ＳまたはＮ−Ｒ（但し、それぞれR7、R8およびＲは
独立してH;1〜20個の炭素原子を有する分岐状または直
鎖状アルキル基、例えばメチル;1〜７個の炭素原子を有
する分岐状または直鎖状ヘテロアルキル、例えばメトキ
シ、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル;1また
は２個の環を有するアリール、例えばフェニル;1または
２個の環を有するヘテロアリール、例えばピロリルまた
はピラゾリル；環に３〜７個の炭素原子を有するシクロ
アルキル、例えばジオキサン;1または２個の環を有する
アラルキル、例えばベンジル;1または２個の環を有する
アルカリール、例えばトリル；または上記のような酵素
分裂可能基）であり;R1、R2、R3、R4、R5およびR6は各
々独立して、H;電子求引性基（例えば１〜７個の炭素原
子を有するパーフルオロアルキル、例えばトリフルオロ
メチル；ハロゲン;CO2H、ZCO2H、SO3H、ZSO3H、NO2、ZN
O2、Ｃ＝ＮまたはZC＝Ｎ（この場合、Ｚは１〜７個の炭
素原子を有する分岐状または直鎖状アルキル基、例えば
メチル）または１または２個の環を有するアリール基、
例えばフェニル）；電子供与性基（例えば分岐状または
直鎖状C1−C7アルコキシ、例えばメトキシまたはエトキ
シ;1または２個の環を有するアラルコキシ、例えばフェ
ノキシ；分岐状また直鎖状C1−C7ヒドロキシアルキル、
例えばヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチル;1また
は２個の環を有するヒドロキシアリール、例えばヒドロ
キシフェニル；分岐状または直鎖状C1−C7アルキルエス
テル、例えばアセテート；または１または２個の環を有
するアリールエステル、例えばベンゾエート）;1または
２個の環を有するヘテロアリール、例えばベンゾキサゾ
ール、ベンズチアゾール、ベンズイミダゾールまたはベ
ンズトリアゾール；または上記のような酵素分裂可能基
である。なお、基R1−R6は一緒になって環を形成しても
よく、環は置換されていてもいなくてもよい。基Ｔがア
リールまたはポリアリール基である場合、明らかにアリ
ール基はスピロ結合可能な構造のものでなければなら
ず、スピロ結合できない基（例えば、フェニル）は除去
する。］ さらに、以下の本文から明らかになるように、ジオキ
セタンの分解がジオキセタン環のＯ−Ｏ結合の分裂によ
り開始する場合、基Ｔまたは基R1−R6を含有する発光部
分のどちらも酵素分裂可能基を含む必要はない。分解が
酵素分裂可能基の分裂により開始する場合、Ｔまたは発
光部分のどちらかがそのような基を含まなければならな
い。
ジオキセタンは分解して、式（２）を有する発光物質
（即ち、光の形態でエネルギーを放射する物質）を形成
することができる。
本発明はまた、ジオキセタンの合成における中間物と
して有用な種々の化合物をも特徴とする。
好ましい態様において、基ＸはＯ、基R1−R3およびR6
はＨ、基R4およびR5は、各々独立してホスフェートまた
はＨである。ジオキセタンの基Ｔは好ましくはアダマン
チリデン基である。ジオキセタンはまた好ましくは基Ｔ
またはジオキセタンの蛍光性発色基部分（好ましくは
R5）に結合可能な酵素分裂可能基を含む。
ジオキセタンは特異的結合をしている組（即ち、お互
いに特異的に結合している二つの物質）の部分が光学的
検出可能な反応によって検出される分析方法において使
用される。この方法によって、ジオキセタンはジオキセ
タンに分解を引き起こし発光物質（即ち、光の形態でエ
ネルギーを発する物質）を形成させる酵素と接触させら
れる。発光物質は式（３）を有し、 主要な物質の存在の表示として検出される。発光の強度
の測定によって、主要な物質の濃度を決定できる。
酵素がオキシド−リダクターゼ（好ましくはペルオキ
シダーゼ、例えば、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（horseradish peroxidase）またはマイクロペルオキ
シダーゼ（microperoxidase））の場合、ジオキセタン
の四員環部分のＯ−Ｏ結合を分裂させることによって、
ジオキセタンを分解する。酵素はジオキセタン基質に直
接作用するかペルオキシドの付加を通して間接的に作用
させてよい。この方法は式（１）のジオキセタンの分解
だけでなく、一般式（４）を有するジオキセタンの分解
にも使用され得る： ［式中、Ｖはジオキセタンの４位の炭素にスピロ結合し
ているかまたは非スピロ結合によってジオキセタンの４
位の炭素に結合している蛍光性発色基である。］ ジオキセタンが酵素分裂可能基（例えばホスフェー
ト）を含む場合、酵素（例えばホスファターゼ）がジオ
キセタンから酵素分裂可能基を分裂させてジオキセタン
を分解させる。分裂はジオキセタンに結合する負電荷を
帯びた原子（例えば酸素原子）を生じ、次にジオキセタ
ンを不安定にして分解および放射線の放射をひき起こ
し、次に蛍光性発色基を含有する分子部分によって吸収
され、結果として発光する。
上述の分析方法が有用な好ましい特異的結合の組とし
ては抗原−抗体および核酸と核酸の全体または部分と結
合可能なプローベから成る組が挙げられる。ジオキセタ
ンはまた試料中の酵素を検出するための分析方法にも有
用である。
本発明は簡単でたいへん感度の高い、試料中（例えば
生物学的試料）の物質の検出方法を提供し、低濃度に存
在する物質に対して特に有用である。なぜならば、ジオ
キセタンの分解はクマリン発生基に対する励起エネルギ
ー源として働き、外部励起エネルギー源（例えば光）は
必要ない。
酵素開始分解は高い濃度を与える。なぜならば１つの
酵素分子かたくさんのジオキセタン分子を発光させる増
幅効果を生み出すことができるからである。さらに、Ｔ
基および蛍光性発色基を適当に変性してジオキセタンの
溶解性およびジオキセタン分解の動態を変化させられ
る。ジオキセタンはまた様々の分子、例えばたんぱく
質、ハプテン、または固定化基質、例えばポリマー膜に
付着させてもよく、またはホモポリマーまたはコポリマ
ーの側基としてもよい。
ジオキセタンの四員環部分に発色基を結合させている
スピロ結合は酵素活性化の前にジオキセタンを安定させ
長期間ジオキセタンを貯蔵することを容易にする。蛍光
性発色基としてクマリンを使用することにより、発光の
よい量出が得られる（ここで使われる“量出（quantum
yield）”とは分解されるジオキセタンのモル数当たり
の発光生成物から放射される光子の数をいう）。クマリ
ン−置換されたジオキセタン分子はまた容易に高収率で
合成される。
さらに利点としては、酵素が直接Ｏ−Ｏ結合に作用す
る場合、発色基（基Ｖ）の取り扱いが必要ないことであ
る。
本発明の他の特徴および利点は以下の好ましい態様の
記載および請求の範囲から明らかになろう。
（好ましい態様の記載） 本発明の好ましい態様における、構造、合成および使
用について述べる。
構造 本発明は式 を有するジオキセタンを用いる。
基Ｔの目的はジオキセタンの安定化にあり、即ち、時
期の早まった分解を防ぐことにある。大きい、かさばっ
た、立体障害となる分子、例えば融合した多環系分子は
最も有効な安定剤である。さらに、Ｔは好ましくはＣ−
ＣおよびＣ−Ｈの一重結合のみ含有する。最も好ましい
分子は３つの融合したシクロヘキシル環からなるアダマ
ンチリデン基である。アダマンチリデン基はジオキセタ
ンの３位の炭素でスピロ結合している。
基Ｖはジオキセタンの４位の炭素でスピロ結合してい
るかジオキセタンの４位の炭素に非スピロ結合で結合し
ている蛍光性発色基である。それは基Ｔまたは基Ｖに結
合する酵素分裂可能基または４員のジオキセタン環のＯ
−Ｏ結合のどちらかの酵素的分裂がジオキセタンの分解
をひき起こす時、発光性となる。分解は２つの独立した
カルボニル含有化合物を生成し、その１つは基Ｔを含
み、他方は基Ｖを含む。ジオキセタン分解から放出され
たエネルギーは発色基を発光させる。好ましくは、基Ｖ
の励起状態のエネルギー（即ち、光を放射するために所
有しなければならないエネルギー）は発光を基Ｖに限る
ためにケトン含有基Ｔの励起状態エネルギーよりも低
い。好ましいジオキセタンは式 を有し、式中R4およびR5は各々独立してＨまたはホスフ
ェート、Adはアダマンチリデン基である。分解は式 を有するクマリン分子を生じ、その励起状態エネルギー
はスピロアダマンタノン（他方の分解生成物）のそれよ
りも低い。
ジオキセタンは一般に２つの方法で分解される。１つ
の方法はオキシド−リダクターゼ酵素、例えばペルオキ
シダーゼ（好ましくはホースラディッシュまたはマイク
ロオキシダーゼ）を添加することであり、酵素は四員環
のＯ−Ｏ結合を分裂させ、それによって発光分子を生じ
させる。
２番目の方法としては基Ｔまたは、より好ましくは基
Ｖに酵素分裂可能基を結合させることである。適当な酵
素との接触は酵素分裂可能基を分裂させ、基Ｖまたは基
Ｔに結合する電子豊富部分を生ずる。この部分は２つの
別のカルボニル含有化合物へのジオキセタンの分解を起
こす。電子豊富部分の例としては、酸素、硫黄およびア
ミンまたはアミド陰イオンが挙げられる。最も好ましい
部分は酸素陰イオンである。好適な酵素分裂可能基およ
びこれらの基に特異的な酵素は以下の表１に挙げる。矢
印は酵素分裂可能結合を示す。最も好ましい基はホスフ
ェートエステルであり、アルカリまたは酸ホスファター
ゼ酵素によって分裂させられる。
好ましくは、酵素は検出されるべき物質に特異的親和
性を有する物質に共有的に結合している。特異的親和性
物質の例としては、検出される物質が抗原、例えばhCG
の場合は抗体、例えば抗−hCG、検出される物質が抗
体、例えば抗−hCGである場合は抗原、例えばhCG、また
は検出される核酸、例えばDNAまたはRNAの全部または一
部分に結合可能なプローベが挙げられる。結合は好まし
くはアミド結合による。
合成 一般に、本発明のジオキセタンは２段階で合成され
る。最初の段階は式 ［式中、ＴおよびＶは上記に記載の通り］ を有する適当に置換されたオレフィンの合成を包含す
る。Ｖがオレフィン二重構造に対して非スピロ結合を介
して結合しているオレフィンは本出願と同じ日に出願さ
れ、同じ譲受人に譲渡された米国出願第140,197号、エ
ドワーズ（ここに引用文として挿入する）に記載の方法
によって合成される。
発色基Ｖがオレフィン二重結合のところでスピロ結合
しているオレフィンは一般に以下の２つの合成方法の一
つを使って合成される。
一番めの合成は以下の反応経路の使用を包含する。
［式中、ＲはＨ、C1〜C5アルキル、アセチルまたはホス
フェートである。］ 反応はＲがメチル基である場合について、以下の様に
行った。
ファーカシュ（Farcasiu）［合成（Synthesis）,197
2,615］の工程に従って調製したアダマンタン−２−カ
ルボン酸（1.51g、8.38mmol）を35ml CH2Cl2に溶解させ
た。溶液を氷浴で冷却し、希薄な懸濁液を作った。オキ
サリルクロライド（0.88ml、10mmol）を攪拌しながら加
えた。２滴のDMF添加後すぐにガスの放出を生じた。15
分後、混合物を室温まであたため、２時間攪拌を続け
た。揮発物はその時減圧下で除去した。氷浴で冷却しな
がら粗酸クロライドを25mlのシーブ（３Å）乾燥させた
ピリジンで希薄し、わずかにくもった、黄色の溶液を得
た。
5mlピリジン中の２′−ヒドロキシ−４′−メトキシ
アセトフェノン（1.18g、7.12mmole）を溶液に滴下して
加えた。混合物を０℃で30分間攪拌し、さらに２時間室
温にまであたためた。混合物を飽和NaHCO3溶液（150m
l）に注ぎ、25％酢酸エチルのヘキサン溶液20mlで３回
抽出した。合わせた有機層を1N HCl、飽和NaHCO3および
水で洗い、Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮し、2.5gの
黄色油を得た。I.R.（フィルム）は、2900cm-1（エステ
ルＣ＝０）、1672cm-1（ケトンＣ＝０）。薄層クロマト
グラフィー分析はエステル生成物、２′−（アダマンタ
ン−２−カルボニロキシ）−４′−メトキシアセトフェ
ノンが続いて使用するのに十分に純粋であることを示し
た。
上記で得られたエステル（1.53g、4.6mmol）を次に10
ml DMSOに溶解させ、35ml DMSO中のNaH懸濁液（60％分
散−0.56g、13.97mmole）へ滴下した。あわ立ちがやん
だ後、かっ色の混合物を室温で30分間攪拌した。混合物
を飽和シュウ酸溶液に注ぎ、50ml酢酸エチルで３回抽出
した。合わせた有機層を水で数回洗い、最後に飽和NaCl
で洗った。濃縮し、10％酢酸エチルのヘキサン溶液を使
用し短いシリカゲルプラグを通してクロマトグラフィー
操作をし、1.58gのわずかに橙色の固体を得た。I.R.（C
HCl3）は、2900cm-1、1695cm-1（Ｃ＝０）。生成物、1,
3−ジケトン、２−（アダマンタン−２−カルボニル）
−２′−ヒドロキシ−４′−メトキシアセトフェノンを
ヘキサンから再結晶させた分析試料は融点105〜108℃を
示した。
前述の反応の粗ジケトン生成物（1.58g）を40ml酢酸
に懸濁させ、15滴の濃HClで処理した。混合物を30分間1
00〜110℃で加熱した。混合物をNaHCO3溶液で注意深く
中和させ、酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機層
を水および飽和NaClで洗った。溶液をすばやくNa2SO4で
乾燥させ、濃縮し、1.5gのわずかに褐色の固体を生じ
た。この固体を酢酸エチルから再結晶させ0.92gのクロ
メノン、２−（アダマント−２−イル）−７−メトキシ
−4H−クロメン−４−オンが明るい淡黄色の結晶として
得られた。I.R.（CHCl3）は2900cm-1、1630cm-1（Ｃ＝
０）、1595cm-1、1435cm-1、融点160〜162℃。
上記で調製したクロメノン（0.62g、2mmol）の10ml無
水メタノール溶液をメタノール（5ml、2mmol）中の0.4m
CeCl3・7H2Oで処理した。NaBH4（76mg、2mmol）を攪拌
しながら少しずつ加えた。室温で60分後、50mlの水を加
え混合物を酢酸エチル20mlで２回抽出した。合わせた有
機層を初め水で、それから飽和NaClで洗った。溶液をNa
2SO4で乾燥させ真空下で濃縮し、粗アリル系アルコール
を得た。明るいわら色のオイルは、赤外吸収スペクトル
で出発物質に帰するカルボニル吸収（1630cm-1）を示さ
なかった。オイルをアルゴン下で25ml CH2Cl2に溶か
し、溶液を−20℃に冷却した。トリエチルアミン（0.61
g、6mmole）を攪拌しながら注射器によって加えた。メ
タンスルホニルクロライド（0.25g、2.2mmole）をその
後滴下した。混合物をゆっくりと室温にまでし、その後
攪拌を一晩続けた。混合物を水で数回抽出し、Na2SO4で
乾燥させ、溶媒および過剰トリエチルアミンを剥離させ
て取り除いた。生成物、７−メトキシ−２−アダマンチ
リデン−３−クロメンは0.5gの収量で得られた。ホスホ
リル化したものを調製するため、クロメンをDMF中ナト
リウムエタンチオレートでジメチル化し、先に記したエ
ドワーズ米国出願第140、197号に記載のように２−クロ
ロ−２−オキソ−1,3−ジオキサホスホランでホスホリ
ル化した。
２番目の合成方法は以下の反応経路によりバルトン
（Barton）反応の使用を包含する。
反応は以下のようにＲがメチルの場合において行なっ
た。
エフ．チーマン（F.Tiemann）［ベル．（Ber.）19,16
61,1886］の工程によって得られた７−メトキシ−クマ
リン−２−チオン（2g、10.4mmol）およびヒドラジンモ
ノヒドレート（0.55ml、11.3mmol）を無水エタノール中
で４時間、還流下で加熱した。混合物を熱いうちにろ過
し、ろ過液を減圧下で蒸発させた。残留物を沸騰した石
油エーテル（35−60℃）で数回抽出した。溶液を乾燥状
態になるまで濃縮し、残留物をエタノールから再結晶さ
せてヒドラゾン、２−ヒドラゾノ−７−メトキシ−2H−
ベンゾピランを明るい黄色固体として得た。
上記ヒドラゾン（2g、10.5mmol）と２−アダマンタノ
ン（1.6g、10.7mmol）の50ml無水エタノール溶液を0.1m
lトリエチルアミンと0.1ml氷酢酸で処理した。混合物を
室温で一晩攪拌し、続いて３時間還流させた。溶媒を除
去し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、
不純のアジン、７−メトキシ−２−Ｎ−ベンゾ−2H−ピ
ラノアダマンチリデンアジンを黄色固体として得た。
アジン（3.2g、10mmol）を200mlの1:1トルエン−ジメ
トキシエタン液に溶解させた。この溶液をその後2mgの
ｐ−トルエンスルホン酸で処理した。硫化水素をガス分
散管を通して勢いよく攪拌しながらゆっくりとあわ立た
せた。反応はTLCによってモニターされ、18時間後に出
発物質の完全な消失を示した。溶媒を減圧下に除去し残
留物をヘキサンで粉砕し、真空下で乾燥させた。生成物
を酢酸エチル−ジクロロメタンを使用してシリカゲルク
ロマトグラフィーにかけ、ヘテロサイクリック生成物、
７−メトキシ−2H−ベンゾピランスピロ−２′−
（１′,3′,4′−チアジアゾリジン）−５′−スピロア
ダマンタンを高収率で得た。
次に、シーブ乾燥させたベンゼン（50ml）をアルゴン
下、CaCO3（3.5mg、35mmol）を添加しながら攪拌した。
酢酸鉛（IV）（3.5g、7.9mmol）を白い懸濁液に少しず
つ加え、その後室温で30分攪拌させた。前述のチアジア
ゾリジン（2.1g、6mmol）の50mlベンゼン溶液を１時間
かけて滴下した。混合物をその後一晩攪拌させた。水
（200ml）を勢いよく攪拌させながら加えた。水層を30m
lベンゼンで３回抽出し、合わせた有機層を40mlの水で
２回、40ml飽和NaClで１回洗い、Na2SO4で乾燥させた。
溶媒を真空下で除去し、残留物をジクロロメタン−ヘキ
サンでシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、3gのオフ
ホワイトの結晶のチアジアジン、７−メトキシ−2H−ベ
ンゾピランスピロ−２′−（１′,3′,4′−チアジアジ
ン）−５′−スピロアダマンタンを高収率で得た。
上記チアジアジン（1.77g、5mmole）およびトリフェ
ニルホスフィン（3.1g、11.7mmole）の混合物を封管内
でアルゴン下、150℃で18時間加熱した。内容物を少量
のメチレンクロライドに溶かし、フラッシュクロマトグ
ラフィーにおけるシリカゲルカラムに５％CH2Cl2−ヘキ
サンを使用してかけ、７−メトキシ−２−アダマンチリ
デン−３−クロメンを得た。生成物は１番目の合成経路
によって得られたクロメンとすべての点で同一であっ
た。それはまた上記のようにホスホリル化することもで
きた。
ジオキセタンの合成の２番目の段階は上記のオレフィ
ンをジオキセタンに転換することを包含する。好ましく
は、転換は光の存在下、オレフィンをシングレット酸素
（Singlet Oxygen）（1O2）で処理することによって光
化学的にもたらされる。1O2は二重結合を渡って付加
し、以下のようにジオキセタンを形成する。
反応は好ましくはハロゲン化されている溶媒、例えば
メチレンクロライド中、15℃で行なわれる。1O2は光増
感剤の使用で生ずる。光増感剤の例としてはポリマー結
合ローズベンガル（Rose Bengal）（商業的にセンシト
ックス（Sensitox）IIとして知られたポリサイエンス
（Polyscience）から入手できる）およびメチレンブル
ー（公知の染料およびpH指示薬）が挙げられる。最も好
ましい光増感剤はメチレンブルーである。
式、 ［式中、R4はホスフェート基］ を有するジオキセタンの合成を以下に示す。
大きな培養管中で、上述のように調製したクロメンフ
ォスフェート塩、0.075g（0.21mmole）を25ml CHCl3で
溶かした。シリカゲル（0.0026g dye/g SiO2）上のメチ
レンブルーを0.210g増感剤として加えた。管を250ワッ
トの高圧ナトリウをランプと内側に水冷却浸漬溜めを備
えた銀めっきジュワーフラスコ（Dewar flask）に設置
した。溜めの内側に設置した５ミルカプトン（Kapton）
（デュポン（Dupont））は紫外線フィルターとしてはた
らいた。氷水を装置を通して注入させ、試料温度を15℃
以下に維持した。乾燥酸素の連続的な流れが毛細管を通
して反応容器内に通過した。気体は、固体状態の増感剤
の均質な懸濁を維持するように調節された。25分の照射
時間後、出発物質の紫外線級数がみえなくなった。明る
い黄緑色の溶液をろ過し、蒸発させ、水10mlで再び溶液
とした。水性試料をその後0.45ミクロンのナイロンフィ
ルターでろ過し、水／アセトニトリル勾配使用の逆相C1
80プレパラティブHPLCカラムによるクロマトグラフィー
にかけた。適切なフラクションをいっしょにして連結乾
燥しジオキセタン、ジスピロ（アダマンタン−２）−
３′−（１′,2′−ジオキセタン）−４′,2″−（７″
−ホスホリロキシ−３″−クロメン）ナトリウム塩を白
色の吸湿性の固体として得た。
使用 試料中の特定の物質の存在または濃度を決定する視覚
的に検出可能な方法を使用する種々の分析がある。上記
のジオキセタンはこれらの分析に使用することができ
る。このような分析の例としては、抗体または抗原、例
えばαまたはβ−hCGの検出のための免疫分析；酵素分
析；例えばカリウムまたはナトリウムイオン検出の化学
分析；例えばウイルス（例えば、HTLV IまたはIIIまた
はサイトメガロウイルス（cytomegalovirus）、または
バクテリア（例えば、E.Coli））の検出のための核酸分
析が挙げられる。
検出可能な物質が抗体、抗原、または核酸の時、酵素
は好ましくは検出可能な物質に対して特異的親和性を有
する物質（即ち、検出可能な物質に特異的に結合してい
る物質）、例えば、それぞれ、抗原、抗体または核酸プ
ローベに結合している。常套の方法、例えばカルボジイ
ミドカップリングを用いて、特異的親和性を有する物質
に酵素を結合させる。結合は好ましくはアミド結合を介
する。
一般に、分析は以下のように行なう。検出可能な物質
を含有すると思われる試料を検出可能な物質に対して特
異的親和性を有する物質に結合している酵素を含有する
緩衝溶液と接触させる。結果として得られる溶液を温置
し、検出可能な物質を特異的親和性酵素化合物の特異的
親和性部分に結合させる。過剰の特異的親和性酵素化合
物を洗って除去し、ジオキセタンを加える。酸化−還元
酵素の場合、ジオキセタンのＯ−Ｏペルオキシ結合が分
裂し、ジオキセタンを２つのケトン、１つは発色基、例
えばクマリンを含有するものに分解させる；発色基は従
って励起し発光する。発光は例えば光電子増倍管検出器
またはカメラ ルミノメータ（cameraluminometer）を
使って、試料中の検出可能な物質の存在の示度として検
出される。発光強度を測定し、物質の濃度を決定する。
基Ｔまたは基Ｖが酵素分裂可能基、例えばホスフェー
トを含有する場合、酵素、例えばホスファターゼが上記
のようにこの基を分裂させ、発光をひき起こす。
検出可能な物質が酵素である時、特異的親和性物質は
必要ない。代わりにジオキセタンを使用する。それ故、
酵素に対する分析は酵素含有試料へのジオキセタンの添
加、および酵素の存在と濃度の示度として、結果として
生じた発光の検出を包含する。
以下に特定の分析例を示す。
A.人IgG分析 96−穴マイクロタイタープレート（96−well microti
ter plateを羊抗人IgG（Ｆ（ab）２フラグメントに特異
的な）で被覆する。人IgG含有血清試料を穴に加え、穴
を室温で１時間温置する。温置期間の後、血清試料を穴
から取り除き、穴を0.15M NaCl、0.01Mホスフェートお
よび0.1％牛血清アルブミン（pH7.4）を含有する水性緩
衝溶液で４回洗う。
抗−人IgGに結合したホースラディッシュペルオキシ
ダーゼをそれぞれの穴に加え、穴を１時間インキュベー
ト（incubate）させる。穴を４回上記の緩衝溶液で洗
い、ジオキセタンの緩衝溶液を加える。ジオキセタンの
酵素的分解によってひきおこされる発光をルミノメータ
ーまたはカメラルミノメータ内の写真フィルムによって
検出する。
ホスフェート含有ジオキセタンとホースラディッシュ
ペルオキシダーゼの代わりにアルカリホスファターゼを
使用しても同様の結果が得られる。
B.hCG分析 うさぎ抗−αhCGをナイロン−メッシュ膜の上に吸着
させる。hCG含有試料溶液、例えば妊娠女性からの尿を
膜に吸い取らせ、その後膜を0.15M NaCl、0.01Mホスフ
ェートおよび0.1％牛血清アルブミン（pH7.4）を含有す
る緩衝溶液1mlで洗う。
マイクロペルオキシダーゼで標識した抗−β−hCGを
膜に加え、膜を再び上記緩衝溶液2mlで洗う。膜をルミ
ノメーターの吸収管（cuvette）またはカメラルミノメ
ーターの中に設置し、ジオキセタンと接触させる。ジオ
キセタンの酵素的分解による発光を検出する。
アルカリホスファターゼで標識した抗体−β−hCGお
よびホスフェート含有ジオキセタンを使用しても同様の
結果が得られる。
C.血清マイクロペルオキシダーゼ分析 0.84M2−メチル−２−アミノプロパノール含有水性緩
衝液の2.7mlを12×75mmパイレックス試験管内に設置
し、マイクロペルオキシダーゼ含有血清試料0.1mlを加
える。溶液を30℃にする。0.2mlのジオキセタンを加
え、試験管を直ちにルミノメーターに設置し、生じる発
光を記録する。光放出のレベルはマイクロペルオキシダ
ーゼ活性の割合に比例する。
上記の分析はホスフェート含有ジオキセタンの使用に
よって血清アルカリホスファターゼを検出するのに使用
してもよい。
D.核酸混成（Hybridization）分析 サイトメガロウイルス（cytomegalovirus）を含有し
ていると思われる脳脊髄液（CSF）の試料を集めニトロ
セルロース膜上に設置する。試料は尿素またはグアニジ
ニウムイソチオシアネートで化学的に処理し、細胞膜を
こわし、ウイルスDNAを除いて全ての細胞成分を崩壊さ
せる。このようにして作られたウイルスDNAのストラン
ドを分離しニトロセルロースフィルターに付ける。ウイ
ルスDNAに特異的で、ホースラディッシュオキシダーゼ
で標識したDNAプローベをフィルターにつける。プロー
ベは補足的なウイルスのDNAと混成をなす。混成の後、
フィルターを0.2M NaClおよび0.1mMトリス−HCl（pH8.
0）を含有する水性緩衝溶液で洗い、過剰のプローベ分
子を除去する。ジオキセタンを加えジオキセタンの酵素
機能退化によって生ずる発光をルミノメーターで測定ま
たは写真フィルムで検出する。
アルカリホスファターゼで標識したDNAプローベおよ
びホスフェート含有ジオキセタンを使用しても同様の結
果が得られる。
他の態様は以下の請求の範囲に示す。
例えば、特異的親和性物質は酵素の代わりに基Ｔまた
は基Ｖを通してジオキセタンに結合してもよい。この場
合、特異的親和性物質が結合している基は結合を容易に
するために例えば、カルボン酸、アミノまたはマレイミ
ド置換基を供給される。
ジオキセタンの基Ｔまたは基Ｖは重合してホモポリマ
ーまたはコポリマーを形成してもよい重合可能基、例え
ばビニル基に結合してもよい。
ジオキセタンの基Ｔまたは基Ｖは免疫または核酸分析
での使用のための例えば膜、フィルム、ビーズに結合し
ていてもよい。基は結合を容易にするため例えば、カル
ボン酸、アミノまたはマレイミド置換基を供給される。
ジオキセタンの基Ｔまたは基Ｖはジオキセタンのペル
オキシダーゼによって引き起こされた分解の動態を高め
る置換基、例えば電子豊富部分（例えば、メトキシ）を
含有することができる。
さらに化学合成の例としてはオレフィンをH2O2および
ジブロマンチン（1,3−ジブロモ−5,5−ジメチルヒダン
トイン）と反応させてオレフィン先駆体を1,2−ブロモ
ヒドロペルオキシドに転換させることが挙げられる。1,
2−ブロモヒドロペルオキシドを塩基、例えば、NaOH、
銀塩、例えば臭化銀で処理してジオキセタンを形成す
る。
オレフィンを光化学的に発生させたジングレット酸素
で処理するよりむしろ、ポスナー（Posner）等のジェ
イ．アム．ケム．ソク．（J.Am.Chem.Soc.）109:278−7
9（1987）に記載のようにジオキセタンはオレフィンを
トリフェニルホスファイトオゾニドまたはトリエチルシ
リルヒドロトオキシドで処理することによって調製され
る。
オレフィン先駆体の合成のもう一つの方法としては発
色基及び基Ｔオレフィンのカルボニル型をTiCl3/LAHと
反応させてオレフィンを形成させるマクマリー（McMurr
y）反応が挙げられる。変形されたマクマリー反応、例
えば、TiCl3/LAHの代わりにTiCl4/TMEDA/Znを使うもの
もまた使用されてよい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 19/207 Ｃ０７Ｈ 19/207 Ｃ１２Ｑ 1/26 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/26 1/34 7823−4Ｂ 1/34 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｎ (72)発明者 ボイタ、ジョン シー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01864、ノース リーディング、ウィリ アムズ ロード 20番 (72)発明者 クリッカ、ラリー ジェイ アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19312、ベーウィン、ナザン ヘイル ロード 886番

Claims (33)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式 ［式中、Ｔはジオキセタンの３位の炭素でスピロ結合し
    ているアダマンチリデン基;XはＯ、Ｓ、またはCR7R
    8（但し、R7およびR8は各々独立してＨ、アルキル、ヘ
    テロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアル
    キル、シクロヘテロアルキル、アラルキル、アルカリー
    ル、または、以下の表に示す群から選択される酵素分裂
    可能基である。）であり;R1、R2、R3、R4、R5およびR6
    は各々独立してＨ、電子求引性基、電子供与性基、ヘテ
    ロアリール、または該酵素分裂可能基である。］を有
    し、分解して式 を有する発光物質を形成することが可能なジオキセタ
    ン。
  2. 【請求項２】基Ｔ、R1、R2、R3、R4、R5およびR6の少な
    くとも一つが各々独立して前記酵素分裂可能基を含む請
    求の範囲第１項記載のジオキセタン。
  3. 【請求項３】前記酵素分裂可能基がホスフェートを含む
    請求の範囲第２項記載のジオキセタン。
  4. 【請求項４】基ＸがＯ、基R1〜R3およびR6がＨ、基R4お
    よびR5が各々独立してＨまたは前記酵素分裂可能基であ
    る請求の範囲第１項記載のジオキセタン。
  5. 【請求項５】式 ［式中、ＲはＨ、C1〜C5アルキル基、アセチルまたはPO
    3である。］ を有する化合物。
  6. 【請求項６】式 ［式中、ＲはＨ、C1〜C5アルキル基、アセチルまたはPO
    3である。］ を有する化合物。
  7. 【請求項７】式 ［式中、ＲはＨ、C1〜C5アルキル基、アセチルまたはPO
    3である。］ を有する化合物。
  8. 【請求項８】式 ［式中、ＲはＨ、C1〜C5アルキル基、アセチルまたはPO
    3である。］ を有する化合物。
  9. 【請求項９】式 ［式中、ＲはＨ、C1〜C5アルキル基、アセチルまたはPO
    3である。］ を有する化合物。
  10. 【請求項１０】式 ［式中、R1、R2、R3、R4、R5およびR6は各々独立して
    Ｈ、電子求引性基、電子供与性基、ヘテロアリール、ま
    たは、以下の表に示す群から選択される酵素分裂可能基
    である。］ を有する化合物。
  11. 【請求項１１】特異的結合をしている組の部分が光学的
    に検出可能な反応によって検出される分析方法におい
    て、該光学的に検出可能な反応が式、 ［式中、Ｖは蛍光性発色基、Ｔはジオキセタンの３位の
    炭素でスピロ結合しているアダマンチリデン基であ
    る。］ を有するジオキセタンと酵素との反応を包含し、該酵素
    が該ジオキセタンの四員環部分のＯ−Ｏ結合を分裂させ
    ることによってジオキセタンを分解して基Ｖを含む発光
    物質を形成させる方法。
  12. 【請求項１２】酵素がオキシド−リダクターゼを含む請
    求の範囲第11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】酵素がペルオキシダーゼを含む請求の範
    囲第11項記載の方法。
  14. 【請求項１４】特異的結合をしている組が、抗原および
    抗体を含む請求の範囲第11項記載の方法。
  15. 【請求項１５】特異的結合をしている組が、核酸および
    核酸の全部または部分に結合可能なプローブである請求
    の範囲第11項記載の方法。
  16. 【請求項１６】酵素がホースラデッシュペルオキシダー
    ゼである請求の範囲第11項記載の方法。
  17. 【請求項１７】酵素がマイクロペルオキシダーゼである
    請求の範囲第11項記載の方法。
  18. 【請求項１８】特異的結合をしている組の部分が光学的
    に検出可能な反応によって検出される分析方法におい
    て、該光学的に検出可能な反応が 式 ［式中、Ｔはジオキセタンの３位の炭素でスピロ結合し
    ているアダマンチリデン基;XはＯ、Ｓ、またはCR7R
    8（但し、R7およびR8は各々独立してＨ、アルキル、ヘ
    テロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアル
    キル、シクロヘテロアルキル、アラルキル、アルカリー
    ル、または、以下の表に示す群から選択される酵素分裂
    可能基である。）であり;R1、R2、R3、R4、R5およびR6
    は各々独立してＨ、電子求引性基、電子供与性基、ヘテ
    ロアリール、または該酵素分裂可能基である。］を有す
    るジオキセタンと酵素との反応を包含し、該酵素が該ジ
    オキセタンを分解して式 を有する発光物質を形成させる方法。
  19. 【請求項１９】基ＸがＯ、基R1〜R3及びR6がＨ、基R4及
    びR5が各々独立してＨまたは前記酵素分裂可能基である
    請求の範囲第18項記載の方法。
  20. 【請求項２０】酵素がオキシド−リダクターゼであり、
    ジオキセタンの四員環部分のＯ−Ｏ結合を分裂させるこ
    とによってジオキセタンを分解させる請求の範囲第18項
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】ジオキセタンが前記酵素分裂可能基を含
    み、酵素がジオキセタンから前記酵素分裂可能基を分裂
    させることによってジオキセタンを分解させる請求の範
    囲第18項記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記酵素分裂可能基がホスフェートを含
    み、酵素がホスファターゼを含む請求の範囲第21項記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】以下の段階、 （ａ）式 ［式中、Ｖは蛍光性発色基、Ｔはジオキセタンの３位の
    炭素でスピロ結合しているアダマンチリデン基であ
    る。］ を有するジオキセタンを供給し、 （ｂ）ジオキセタンを酵素含有試料と接触させ、該酵素
    は該ジオキセタンの四員環部分のＯ−Ｏ結合を分裂させ
    ることによってジオキセタンを分解し、ジオキセタンの
    基Ｖを発光物質を形成させ、ついで （ｃ）該発光物質を該酵素の存在の示すものとして検出
    する から成る試料中の酵素の検出方法。
  24. 【請求項２４】酵素がオキシド−リダクターゼを含む請
    求の範囲第23項記載の方法。
  25. 【請求項２５】酵素がペルオキシダーゼを含む請求の範
    囲第23項記載の方法。
  26. 【請求項２６】酵素がホースラデッシュペルオキシダー
    ゼである請求の範囲第23項記載の方法。
  27. 【請求項２７】酵素がマイクロペルオキシダーゼである
    請求の範囲第23項記載の方法。
  28. 【請求項２８】以下の段階、 （ａ）式 ［式中、Ｔはジオキセタンの３位の炭素でスピロ結合し
    ているアダマンチリデン基;XはＯ、Ｓ、またはCR7R
    8（但し、R7およびR8は各々独立してＨ、アルキル、ヘ
    テロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアル
    キル、シクロヘテロアルキル、アラルキル、アルカリー
    ル、または、以下の表に示す群から選択される酵素分裂
    可能基である。）であり;R1、R2、R3、R4、R5およびR6
    は各々独立してＨ、電子求引性基、電子供与性基、ヘテ
    ロアリール、または該酵素分裂可能基である。］を有す
    るジオキセタンを供給し、 （ｂ）ジオキセタンを酵素含有試料と接触させ、該酵素
    はジオキセタンを分解し、 式 を有する発光物質を形成させ、 （ｃ）該発光物質を該酵素の存在の示すものとして検出
    する から成る試料中の酵素の検出方法。
  29. 【請求項２９】基ＸがＯ、基R1〜R3及びR6がＨ、R4及び
    R5が各々独立してＨまたは前記酵素分裂可能基である請
    求の範囲第28項記載の方法。
  30. 【請求項３０】酵素がオキシド−リダクターゼであり、
    ジオキセタンの四員環部分のＯ−Ｏ結合を分裂させるこ
    とによってジオキセタンを分解させる請求の範囲第28項
    記載の方法。
  31. 【請求項３１】ジオキセタンが前記酵素分裂可能基を含
    み、該酵素がジオキセタンから前記酵素分裂可能基を分
    裂させることによってジオキセタンを分解させる請求の
    範囲第28項記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記酵素分裂可能基がホスフェートを含
    み、該酵素がホスファターゼを含む請求の範囲第31項記
    載の方法。
  33. 【請求項３３】式 ［式中、Ｔはジオキセタンの３位の炭素でスピロ結合し
    ているアダマンチリデン基;XはＯ、Ｓ、またはCR7R
    8（但し、R7およびR8は各々独立してＨ、アルキル、ヘ
    テロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアル
    キル、シクロヘテロアルキル、アラルキル、アルカリー
    ル、または、以下の表に示す群から選択される酵素分裂
    可能基である。）であり;R1、R2、R3、R4、R5およびR6
    は各々独立してＨ、電子求引性基、電子供与性基、ヘテ
    ロアリール、または該酵素分裂可能基である。］を有す
    るジオキセタン；および 該ジオキセタンを分解させて式 を有する発光物質を形成させることが可能な酵素を含む
    試料中の主要物質を検出するキット。
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