JPH03500654A - 分析で使用するジオキセタン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析で使用するジオキセタン （発明の背景） 本発明は試料中の物質の検出のだめのジオキセタン（ｄｉｏｘｅｔａｎｅｓ）の 使用に関する。

ジオキセタンはお互いに結合する酸素原子２個を員として含む四員環を有する化 合物である。ジオキセタンは、熱的または光化学的に分解され、カルボニル生成 物、例えばケトン類またはアルデヒド類を形成することができる。光の形態での エネルギーの放出（即ち、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ））が分解に伴う。

（発明の要旨） 本発明の特徴は式（１）を有するジオキセタンに存する：［式中、Ｔはジオキセ タンの３位の炭素におけるスピロ結合基であって、置換された（例えば、一種以 上のＣ，−Ｃ，アルキル基、ヘテロ原子含有基、例えばカルボニル基または酵素 分裂可能基、即ち酵素によって分裂しジオキセタンに結合する電子の豊富部分を 生ずることが可能な結合を有する基、例えばホスフェートを含有する）または非 置換アリール基（環に６〜１２個の炭素原子を有する、例えばフェニル）、ポリ アリール（２個以上の環を有する、例えばす７チル）、シクロアルキリデン（環 に６〜１２個の炭素原子を有する）またはポリシクロアルキリデン（２個以上の 融合環を有し、それぞれの環は独立して５〜１２個の炭素原子を有する）である ；ＸはＣＲ，Ｒ，、ＯｌＳまたはＮ−Ｒ（但し、それぞれＲ７、Ｒ，およびＲは 独立してＨ；１〜２０個の炭素原子を有する分岐状または直鎖状アルキル基、例 えばメチル：１〜７個の炭素原子を有する分岐状または直鎖状ヘテロアルキル、 例えばメトキシ、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル；ｌまたは２個の 環を有するアリール、例えばフェニル；ｌまたは２個の環を有するヘテロアリー ル呟例えばピロリルまたはピラゾリル：環に３〜７個の炭素原子を有するシクロ アルキル、例えばジオキサン：１または２個の環を有するアラルキル、例えばベ ンジル：１または２個の環を有するアルカリール、例えばトリル；または上記の ような酵素分裂可能基）であり；Ｒ３、Ｒ３、Ｒ１、ＲいＲ６およびＲ６は各々 独立して、Ｈ；電子求引性基（例えば１〜７個の炭素原子を有するパーフルオロ アルキル、例えばトリフルオロメチル；ハロゲン；ｃｏ２Ｈ，ＺＣＯｘＨｓ　５ ＯｓＨ％ＺＳＯｓＨｓ　Ｎｏｔ、ＺＮＯ，、Ｃ−ＮｔたはＺＣ−Ｎ（：の場合、 Ｚ　はｌ−７個の炭素原子を有する分岐状または直鎖状アルキル基、例えばメチ ル）または１まＩ；は２個の環を有するアリール基、例えばフェニル）；電子供 与性基（例えば分岐状または直鎖状Ｃ，−Ｃ，アルコキシ、例えばメトキシまｌ ：はエトキシ；ｌまたは２個の環を有するアラルコキシ、例えばフェノキシ：分 岐状または直鎖状Ｃ，−Ｃ，ヒドロキシアルキル、例えばヒドロキシメチルまた はヒドロキシエチル：１または２個の環を有するヒドロキシアリール、例えばヒ ドロキシフェニル；分岐状または直鎖状Ｃ，−Ｃ，アルキルエステル、例えばア セテート：または１または２個の環を有するアリールエステル、例えばベンゾニ ート）：ｌまたは２個の環を有するヘテロアリール、例えばベンゾキサゾール、 ベンズチアゾール、ベンズイミダゾールまたはベンズトリアゾール：または上記 のような酵素分裂可能基である。なお、基Ｒ＋Ｒｉは一緒になって環を形成して もよく、環は置換されていてもいなくてもよい。基Ｔがアリールまたはポリアリ ール基である場合、明らかにアリール基はスピロ結合可能な構造のものでなけれ ばならず、スピロ結合できない基（例えば、フェニル）は除去する。］さらに、 以下の本文から明らかになるように、ジオキセタンの分解がジオキセタン環のｏ −０結合の分裂により開始する場合、基Ｔまたは基Ｒ１Ｒ＊を含有する発光部分 のどちらも酵素分裂可能基を含む必要はない。分解が酵素分裂可能基の分裂によ り開始する場合、Ｔまたは発光部分のどちらかがそのような基を含まなければな らない。

ジオキセタンは分解して、式（２）を有する発光物質（即ち、光の形態でエネル ギーを放射する物質）を形成することができる。

本発明はまた、ジオキセタンの合成における中間物として有用な種々の化合物を も特徴とする。

好ましい態様において、基Ｘは０、基Ｒ，−Ｒ，およびＲ６はＨ１基Ｒ４および Ｒ１は、各々独立してホスフェートまたはＨである。ジオキセタンの基Ｔは好ま しくはアダマンチリデン基である。ジオキセタンはまた好ましくは基Ｔまたはジ オキセタンの蛍光性発色基部分（好ましくはＲ５）に結合可能な酵素分裂可能基 を含む。

ジオキセタンは特異的結合をしている組（即ち、お互いに特異的に結合している 二つの物質）の部分が光学的検出可能な反応によって検出される分析方法におい て使用される。この方法によって、ジオキセタンはジオキセタンに分解を引き起 こし発光物質（即ち、光の形態でエネルギーを発する物質）を形成させる酵素と 接触させら主要な物質の存在の表示として検出される。発光の強度の測定によっ て、主要な物質の濃度を決定できる。

酵素がオキシド−リダクターゼ（好ましくはペルオキシダーゼ、例えば、ホース ラディツシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ）またはマイクロペルオキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））ノ場 合、ジオキセタンの四員環部分の０−Ｏ結合を分裂させることによって、ジオキ セタンを分解する。酵素はジオキセタン基質に直接作用するかペルオキシドの付 加を通して間接的に作用させてよい。

この方法は式（１）のジオキセタンの分解だけでなく、一般式（４）を有するジ オキセタンの分解にも使用され得る：０□０ ［式中、■はジオキセタンの４位の炭素にスピロ結合しているかまたは非スピロ 結合によってジオキセタンの４位の炭素に結合している蛍光性発色基である。］ ジオキセタンが酵素分裂可能基（例えばホスフェ、ト）を含む場合、酵素（例え ばホスファターゼ）がジオキセタンから酵素分裂可能基を分裂させてジオキセタ ンを分解させる。分裂はジオキセタンに結合する負電荷を帯びた原子（例えば酸 素原子）を生じ、次にジオキセタンを不安定にして分解および放射線の放射をひ き起こし、次に蛍光性発色基を含有する分子部分によって吸収され、結果として 発光する。

上述の分析方法が有用な好ましい特異的結合の組としては抗原−抗体および核酸 と核酸の全体または部分と結合可能なプローベから成る組が挙げられる。ジオキ セタンはまた試料中の酵素を検出するための分析方法にも有用である。

本発明は筒車でたいへん感度の高い、試料中（例えば生物学的試料）の物質の検 出方法を提供し、低濃度に存在する物質に対して特に有用である。なぜならば、 ジオキセタンの分解はクマリン発色基に対する励起エネルギー源として働き、外 部励起エネルギー源（例えば光）は必要ない。

酵素開始分解は高い感度を与える。なぜならば１つの酵素分子かたくさんのジオ キセタン分子を発光させる増幅効果を生み出すことができるからである。さらに 、Ｔ基および蛍光性発色基を適当に変性してジオキセタンの溶解性およびジオキ セタン分解の動態を変化させられる。ジオキセタンはまた様々の分子、例えばた んばく質、ハプテン、または固定化基質、例えばポリマー膜に付着させてもよく 、またはホモポリマーまたはコポリマーの側基としてもよい。

ジオキセタンの四員環部分に発色基を結合させているスピロ結合は酵素活性化の 前にジオキセタンを安定させ長期間ジオキセタンを貯蔵することを容易にする。

蛍光性発色基としてクマリンを使用することにより、発光のよい量比が得られる （ここで使われる“量比（ｑｕａｎｔｕｍ　ｙｉｅｌｄ）”とは分解されるジオ キセタンのモル散光たりの発光生成物から放射される光子の数をいう）。クマリ ン−置換されたジオキセタン分子はまた容易に高収率で合成される。

さらに利点としては、酵素が厘接Ｏ−Ｏ結合に作用する場合、発色基（基■）の 取り扱いが必要ないことである。

本発明の他の特徴および利点は以下の好ましい態様の記載および請求の範囲から 明らかになろう。

（好ましい態様の記載） 本発明の好ましい態様における、構造、合成および使用について本発明は式 を有するジオキセタンを用いる。

基Ｔの目的はジオキセタンの安定化にあり、即ち、時期の早まった分解を防ぐこ とにある。大きい、かさばった、立体障害となる分子、例えば融合した多環系分 子は最も有効な安定剤である。さらに、Ｔは好ましくはＣ−ＣおよびＣ−Ｈの一 重結合のみ含有する。最も好ましい分子は３つの融合したシクロヘキシル環から なるアダマンチリデン基である。アダマンチリデン基はジオキセタンの３位の炭 素でスピロ結合している。

基Ｖはジオキセタンの４位の炭素でスピロ結合しているかジオキセタンの４位の 炭素に非スピロ結合で結合している蛍光性発色基である。それは基Ｔまたは基Ｖ に結合する酵素分裂可能基または４員のジオキセタン環の０−Ｏ結合のどちらか の酵素的分裂がジオキセタンの分解をひき起こす時、発光性となる。分解は２つ の独立したカルボニル含有化合物を生成し、その１つは基Ｔを含み、他方は基Ｖ を含む。ジオキセタン分解から放出されたエネルギーは発色基をを放射するため に所有しなければならないエネルギー）は発光を基Ｖに限るためにケトン含有基 Ｔの励起状態エネルギーよりも低い。

好ましいジオキセタンは式 を有し、式中Ｒ４およびＲ６は各々独立してＨまたはホスフェート、Ａｄはアダ マンチリデン基である。分解は式を有するクマリン分子を生じ、その励起状態エ ネルギーはスビロアダマンタノン（他方の分解生成物）のそれよりも低い。

ジオキセタンは一般に２つの方法で分解される。１つの方法はオキシド−リダク ターゼ酵素、例えばペルオキシダーゼ（好ましくはホースラディツシュまたはマ イクロオキシダーゼ）を添加することであり、酵素は四員環の０−Ｏ結合を分裂 させ、それによって発光分子を生じさせる。

２番目の方法としては基Ｔまたは、より好ましくは基Ｖに酵素分裂可能基を結合 させることである。適当な酵素との接触は酵素分裂可能基を分裂させ、基Ｖまた は基Ｔに結合する電子豊富部分を生ずる。この部分は２つの別のカルボニル含有 化合物へのジオキセタンの分解を起こす。電子豊富部分の例としては、酸素、硫 黄およびアミンまたはアミド陰イオンが挙げられる。最も好ましい部分は酸素陰 イオンである。好適な酵素分裂可能基およびこれらの基に特異的な酵素は以下の 表１に挙げる。矢印は酵素分裂可能結合を示す。最も好ましい基はホスフェート エステルであり、アルカリまたは酸ホスファターゼ酵素によって分裂させられる 。

グループ２　酵素 ｌ）　アルカリ性および酸性 リン酸エステル アセテートエステル カルボキシル ｌ−７オスフオー２−ジアシル　グリセリド５）　β−キシロシダーゼ ｌ−チオ−Ｄ−グルコシド アデノジン　シフオス７エート　アナログアデノシン　モノフォスフェート　ア ナログアデノシン　アナログ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ １２）　σ−Ｄ−ガラクトシダーゼ Ｈ σ−Ｄ−ガラクトシダーゼ １３）　ａＤ−グルコシダーゼ σ−Ｄ−グルコシダーゼ １４）　β−Ｄ−グルコシダーゼ σ−Ｄ−マンノシダーゼ １７）　β−Ｄ−７ラクトフラノシダーゼβ−Ｄ−７ラクト７ラコシダーゼ １８）　β−Ｄ−グルコシドユロナーゼＨ β−Ｄ−グルコシドユロネート ｐ−トルエンスルホニル−し−アルジニン　エステルｐ−トルエンスルホニル− し−アルジニン　アミド２］）　ＡＴペーゼ＋ アデノシン　トリ７オスフエート　アナログ好ましくは、酵素は検出されるべき 物質に特異的親和性を有する物質に共有的に結合している。特異的親和性物質の 例としては、検出される物質が抗原、例えばｈＣＧの場合は抗体、例えば抗−ｈ ｃｃ。

検出される物質が抗体、例えば抗−ｈＣＧである場合は抗原、例えばｈＣＧ、ま たは検出される核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの全部または一部分に結合可能 なブローベが挙げられる。結合は好ましくはアミド結合による。

一般に、本発明のジオキセタンは２段階で合成される。最初の段階は式 ［式中、ＴおよびＶは上記に記載の通り］を有する適当に置換されたオレフィン の合成を包含する。■がオレフィン二重構造に対して非スピロ結合を介して結合 しているオレフィンは本出願と同じ日に出願され、同じ譲受人に譲渡された米国 出願第１４０．１９７号、エドワーズ（ここに引用文として挿入する）に記載の 方法によって合成される。

発色基Ｖがオレフィン二重結合のところでスピロ結合しているオレフィンは一般 に以下の２つの合成方法の一つを使って合成される。

一番めの合成は以下の反応経路の使用を包含する。

［式中、ＲはＨ，Ｃ，〜Ｃ，アルキル、アセチルまたはホスフェートである。］ 反応はＲがメチル基である場合について、以下の様に行った。

７フーカシユ（Ｆ　ａｒｃａｓ　ｉｕ）　［合成（Ｓ　ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、　 １９７２　、６１５コの工程に従って調製したアダマンタン−２−カルボン酸（ １，５１ｇ、８　、３８　ｗｏｌ）を３５ｔｎＱＣＨ２ＣＱｘに溶解させた。溶 液ヲ水浴−ｃ−冷却し、希薄な懸濁液を作った。オキサリルクロライド（０，８ ８ｍ１２．１０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。２滴のＤＭＦ添加後すぐにガ スの放出を生じた。１５分後、混合物を室温まであたため、２時間撹拌を続けた 。揮発物はその時減圧下で除去した。水浴で冷却しなから粗酸クロライドを２５ １１１ｆｆのシーブ（３人）乾燥させたピリジンで希薄し、わずかにくもった、 黄色の溶液を得た。

５ｍＱｍジピリジン中′−ヒドロキシ−４′−メトキシアセトフェノン（１−１ ８９，７、１２ｍｍｏｌｅ）を溶液に滴下して加えた。混合物を０℃で３０分間 撹拌し、さらに２時間室温にまであたためた。混合物を飽和ＮａＨＣＯ，溶液（ １５０＋ｍ１２）に注ぎ、２５％酢酸エチルのヘキサン溶液２０ｍ０で３回抽出 した。合わせた有機層を１ＮＨＣＱ、飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯｓおよび水で洗い、Ｎ ａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、２．５ｇの黄色油を得た。１．Ｒ，（ フィルム）は、２９００ｃｔｓ−’（エステルＣ−０）、ｌ　６７２ｃｒａ−’ ＣケトンＣ−０）。薄層クロマトグラフィー分析はエステル生成物、２’−（ア ダマンタン−２−カルボニロキシ）−４′−メトキシアセトフェノンが続いて使 用するのに十分に純粋であることを示した。

上記で得られたエステル（１−５３９，４、５ｍｍｏｌ）を次に１０１１０１１ １２Ｄに溶解させ、３５＋ｚｆｆＤＭＳＯ中のＮａＨ懸濁液（６０％分散−０． ５６ｇ、１３　、９７　ｍｍｏｌｅ）へ滴下した。あわ立ちがやんだ後、かっ色 の混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を飽和シュウ酸溶液に注ぎ、５０ｍ ４酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を水で数回洗い、最後に飽和Ｎａ ＣＱで洗つＩ；。濃縮し、１０％酢酸エチルのヘキサン溶液を使用し短いシリカ ゲルプラグを通してクロマトグラフィー操作をし、１．５８ｇのわずかに１色の 固体を得た。Ｉ。

Ｒ、（ＣＨＣ（２ｓ）は、２９００ｃ＋＊−’、１６９５ｃｍ−’（Ｃ−０）。

生成物、１．３−ジケトン、２−（アダマンタン−２−カルボニル）−２′−ヒ ドロキシ−４′−メトキシアセトフェノンをヘキサンから再結晶させだ分析試料 は融点１０５〜１０８°Ｃを示した。

前述の反応の粗ジケトン生成物（１，５８ｇ）を４０１Ｒ１２酢酸に懸濁させ、 １５滴の濃ＨＣｌ２で処理した。混合物を３０分間１００〜１１０℃で加熱した 。混合物をＮａＨＣＯ，溶液で注意深く中和させ、酢酸エチルで数回抽出した。

合わせた有機層を水および飽和ＮａＣＱで洗った。溶液をすばや＜Ｎａ２５Ｏ， で乾燥させ、濃縮し、１．５９のわずかに褐色の固体を生じた。この固体を酢酸 エチルから再結晶させ０．９２９のクロメノン、２−（アダマント−２−イル） −７−メドキシー４Ｈ−クロメン−４−オンが明るい淡黄色の結晶として得られ た。Ｉ　、Ｒ，（ＣＨＣ１２ｇ）は２９００ｃｔｎ−’、１６３０ｃπ−’（Ｃ −０）、１５９５ｃ＋ｎ−’、１４３５Ｃ＋ｌ−’、融点１６０−１６２℃。

上記で調製したクロメノン（０，６２９，２ｍｍｏｌ）の１３ｍ１２無水メタノ ール溶液をメタノール（５ｒｎＱ、　２　ｍｍｏり中の０．４ｍＣｅＣＱ、　・ ７Ｈ２０で処理した。ＮａＢ　Ｈ４（７６ｍ９．２ｍｍｏｌ）を撹拌しながら少 しずつ加えた。室温で６０分後、５０較の水を加え混合物を酢酸エチル２０ｍＱ で２回抽出した。合わせた有機層を初め水で、それから飽和ＮａＣＱで洗った。

溶液をＮａ、ＳＯ，で乾燥させ真空下で濃縮し、粗アリル系アルコールを得た。

明るいわら色のオイルは、赤外吸収スペクトルで出発物質に帰するカルボニル吸 収（１６３０ｃ＋＋＋−’）を示さなかった。オイルをアルゴン下で２５１１Ｑ ＣＨＩＣＱ、に溶かし、溶液を一２０℃に冷却した。トリエチルアミン（０−６ １９，５ｏ＋ｏ＋ｏｌｅ）を撹拌しながら注射器によって加えた。メタンスルホ ニルクロライド（０，２５９，２−２ｍｍｏｌｅ）をその後滴下した。混合物を ゆっくりと室温にまでし、その後撹拌を一晩続けた。混合物を水で数回抽出し、 Ｎａ２５Ｏ，で乾燥させ、溶媒および過剰トリエチルアミンを剥離させて取り除 いた。生成物、７−メドキシー２−アダマンチリデン−３−クロメンは０．５ｇ の収量で得られた。ホスホリル化したものを調製するため、クロメンをＤＭＦ中 ナトナトリウムエタンチオレートメチル化し、先に記したエドワーズ米国出願第 １４０．１９７号に記載のように２−クロロ−２−オキソ−１，３−ジオキサホ スホランでホスホリル化した。

２番目の合成方法は以下の反応経路によりパルトン（Ｂ　ａｒｔｏｎ）反応の使 用を包含する。

反応は以下のようにＲがメチルの場合において行なった。

エフ、チー”７（Ｆ　、Ｔｉｅｍａｎｎ）［ベル、（Ｂｅｒ、）１９，１６６１ ．１８８６］の工程によって得られた７−メトキシ−クマリンー２−チオン（２ ｇ、１．０−４　ｍｍｏｌ）およびヒドラジンモノヒトレート（０，５５ｍＱ、 １１　、３　ｍｍｏｌ）を無水エタノール中で４時間、還流下で加熱した。混合 物を熱いうちにろ過し、ろ過液を減圧下で蒸発させた。残留物を沸騰した石油エ ーテル（３５−６０℃）で数回抽出した。溶液を乾燥状態になるまで濃縮し、残 留物をエタノールから再結晶させてヒドラゾン、２−ヒドラゾノー７−メトキシ −２Ｈ−ベンゾピランを明るい黄色固体として得た。

上記ヒドラゾン（２ｇ、１０　、５　＋＋＋ｍｏｌ）と２−アダマンタン（１， ６ｇ、１０　、７　ｍｍｏｌ）の５０１１１ｇ無水エタノール溶液を０　、　ｌ 　ｄ　トリエチルアミンと０−１　ｒｇＱ氷酢酸で処理した。混合物を室温で一 晩撹拌し、続いて３時間還流させた。溶媒を途去し、残留物をシリカゲルクロマ トグラフィーにかけ、不純のアジン、７−メドキシー２−Ｎ−ベンゾ−２Ｈ−ピ ラノアダマンチリデンアジンを黄色固体として得た。

アジア（３−２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２００＋ｎＱの１＝１トルエン−ジメトキ シエタン液に溶解させた。この溶液をその後２π９のｐ−トルエンスルホン酸で 処理した。硫化水素をガス分散管を通して勢いよく撹拌しながらゆっくりとあわ 立たせた。反応はＴＬＣによってモニターされ、１８時間後に出発物質の完全な 消失を示した。溶媒を減圧下に除去し残留物をヘキサンで粉砕し、真空下で乾燥 させた。生成物を酢酸エチル−ジクロロメタンを使用してシリカゲルクロマトグ ラフィーにかけ、ヘテロサイクリック生成物、７−メドキシー２Ｈ−ベンゾビラ ンスピロ−２’−（１’、３’、４’−チアジアゾリジン）−５′−スピロアダ マンタンを高収率で得た。

次に、シーブ乾燥させたベンゼン（５０ｍＱ）をアルゴン下、ＣａＣ０゜（３， ５ｇ、３５　ｍｍｏｌ）を添加しながら撹拌した。酢酸鉛（ＩＶＸ３．５．．７ 　、９　ｍｍｏｌ）を白い懸濁液に少しずつ加え、その後室温で３０分間撹拌さ せた。前述のチアジアゾリジン（２，１ｇ、５ｍｍｏｌ）の５０ＩｌｌΩベンゼ ン溶液を１時間かけて滴下した。混合物をその後−晩撹拌させた。

水（２００ｕＱ）を勢いよく撹拌させながら加えた。水層を３０ＴＲｏ、ベンゼ ンで３回抽出し、合わせた有機層を４０ｉの水で２回、４０ｒｒｒＱ飽ｎ　Ｎ　 ａ　ＣＱで１回洗い、Ｎａ２５Ｏ，で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、残留 物をジクロロメタン−ヘキサンでシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、３ｇの オフホワイトの結晶のチアジアジンＳ７−メドキシー２Ｈ−ベンゾビランスピロ −２’−（１’、３’、４’−チアジアジン）−５′−スピロアダマンタンを高 収率で得た。

上記チアジアジン（１，７７ｇ、５ｍｍ＋ｏｌｅ）およびトリフェニルホスフィ ン（３，１ｇ、ｌ　ｌ　、　７　ｍｍｏｌｅ）の混合物を封管内でアルゴン下、 １５０℃で１８時間加熱した。内容物を少量のメチレンクロライドに溶かし、フ ラッシュクロマトグラフィーにおけるシリカゲルカラムに５％ＣＨ，ＣＱ、−ヘ キサンを使用してかけ、７−ノドキシ−２−アダマンチリデン−３−クロメンを 得た。生成物は１番目の合成経路によって得られたクロメンとすべての点で同一 であった。それはまた上記のようにホスホリル化することもできた。

ジオキセタンの合成の２番目の段階は上記のオレフィンをジオキセタンに転換す ることを包含する。好ましくは、転換は光の存在下、オレフィンをシングレット 酸素Ｃ５Ｉｎｇ１ｅｔ　ＯｘｙｇｅｎＸ’Ｏｚ）で処理することによって光化学 的にもたらされる６１０．は二重結合を渡って付加し、以下のようにジオキセタ ンを形成スル。

反応は好ましくはハロゲン化されている溶媒、例えばメチレンクロライド中、１ ５℃で行なわれる。ＩＯ７は光増感剤の使用で生ずる。

光増感剤の例としてはポリマー結合ローズベンカル（Ｒｏｓｅ　Ｂｅｎｇａｉ） （商業的にセンシトツクス（Ｓ　ｅｎｓ　ｉ　ｔｏｘ）　Ｋとして知られポリサ イエンス（Ｐ　ｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）から入手できる）およびメチレンブルー （公知の染料およびｐＨ指示薬）が挙げられる。最も好ましい光増感剤はメチレ ンブルーである。

式、 Ｏ□０ ［式中、Ｒ４はホスフェート基］ を有するジオキセタンの合成を以下に示す。

大きな培養管中で、上述のように調製したクロメンフォスフェート塩、０．０７ ５ｇ（０，２１ｍ＋ａｏｌｅ）を２５　ｍＱｃ　ＨＣＱｓで溶かした。シリカゲ ル（０，００２６９ｄｙｅ／ｇｓ　１ｏｎ）上のメチレンブルーを０．２１０ｇ 増感剤として加えた。管を２５０ワツトの高圧ナトリウをランプと内側に水冷却 浸漬溜めを儂えた黒めつきジュワーフラスコ（Ｄｅｗａｒ　’ｆｌａｓｋ）に設 置した。溜めの内側に設置した５ミルカプトン（ＫａｐｔｏｎＸデュポン（Ｄｕ ｐｏｎｔ））は紫外線フィルターとしてはたらいた。氷水を装置を通して注入さ せ、試料温度を１５℃以下に維持しｔ：。乾燥酸素の連続的な流れが毛細管を通 して反応容器内に通過した。気体は、固体状態の増感剤の均質な懸濁を維持する ように調節された。２５分の照射時間後、出発物質の紫外線吸収がみえなくなっ た。明るい黄緑色の溶液をろ過し、蒸発させ、水１０ｒａＱで再び溶液とした。

水性試料をその後０−４５ミクロンのナイロンフィルターでろ過し、水／アセト ニトリル勾配使用の逆相Ｃ１８ブレバラテイブＨＰＬＣカラムによるクロマトグ ラフィーにかけた。適切なフラクションをいっしょにして凍結乾燥しジオキセタ ン、ジスピロ（アダマンタン−２）−３’−（１’、２’−ジオキセタン）−４ ’、２″−（７″−ホスホリロキシー３″−クロメン）ナトリウム塩を白色の吸 湿性の固体として得た。

闘 試料中の特定の物質の存在または濃度を決定する視覚的に検出可能な方法を使用 する種々の分析がある。上記のジオキセタンはこれらの分析に使用することがで きる。このような分析の例としては、抗体または抗原、例えばαまたはβ−ｈＣ Ｇの検出のための免疫分析：酵素分析：例えばカリウムまたはナトリウムイオン 検出の化学分析：例えばウィルス（例えば、ＨＴＬＶＩまたは■またはサイトメ ガＤ　ウィル／Ｃ（ｅｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、またはバクテリア（例 えば、Ｅ。

Ｃｏｌ　ｉ））の検出のだめの核酸分析が挙げられる。

検出可能な物質が抗体、抗原、または核酸の時、酵素は好ましくは検出可能な物 質に対して特異的親和性を有する物質（即ち・検出可能な物質に特異的に結合し ている物質）、例えば、それぞれ、抗原、抗体または核酸プローベに結合してい る。常套の方法、例えばカルボジイミドカップリングを用いて、特異的親和性を 有する物質に酵素を結合させる。結合は好ましくはアミド結合を介する。

一般に、分析は以下のように行なう。検出可能な物質を含有すると思われる試料 を検出可能な物質に対して特異的親和性を有する物質に結合している酵素を含有 する緩衝溶液と接触させる。結果として得られる溶液を温室し、検出可能な物質 を特異的親和性酵素化合物の特異的親和性部分に結合させる。過剰の特異的親和 性酵素化合物を洗って除去し、ジオキセタンを加える。酸化−還元酵素の場合、 ジオキセタンのＯ−○ペルオキシ結合が分裂し、ジオキセタンを２つのケトン、 １つは発色基、例えばクマリンを含有するものに分解させる一発色基は従って励 起し発光する。発光は例えば光電子増倍管検出器またはカメラルミノメータ−（ ｃａｍｅｒａｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使って、試料中の検出可能な物質の存 在の示度として検出される。発光強度を測定し、物質の濃度を決定する。

基Ｔまたは基Ｖが酵素分裂可能基、例えばホスフェートを含有する場合、酵素、 例えばホスファターゼが上記のようにこの基を分裂させ、発光をひき起こす。

検出可能な物質が酵素である時、特異的親和性物質は必要ない。

代わりにジオキセタンを使用する。それ故、酵素に対する分析は酵素含有試料へ のジオキセタンの添加、および酵素の存在と濃度の示度として、結果として生じ た発光の検出を包含する。

以下に特定の分析例を示す。

Ａ８人ＩｇＧ分析 ９６−穴マイクロタイタープレート（９６−ｗｅｌｌ　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　 ｐｌａｔｅを羊抗人Ｉ　ｇＧ（Ｆ　（ａｂ）ｚフラグメントに特異的な）で被覆 する。人ＩｇＧ含有血清試料を穴に加え、穴を室温で１時間汲置する。墨−零期 間の後、血清試料を穴から取り除き、穴を０　、１５　ＭＮａＣＩ２．０゜０１ Ｍホスフェートおよび０．１％牛血清アルブミン（ｐＨ７，４）を含有する水性 緩衝溶液で４回洗う。

抗−人ＴｇＧに結合したホースラディツシュペルオキシダーゼをそれぞれの穴に 加え、穴を１時間インキュベート（１ｎｃｕｂａｔｅ）させる。

穴を４回上記の緩衝溶液で洗い、ジオキセタンの緩衝溶液を茄える。

ジオキセタンの酵素的分解によってひきおこされる発光をルミノメータ−まＩ； はカメラルミノメータ内の写真フイムによって検出する。

ホスフェート含有ジオキセタンとホースラディツシュペルオキシダーゼの代わり にアルカリホスファターゼを使用しても同様の結果が得られる。

Ｂ、ｈＣＧ分析 うさぎ抗−σｈＣＧをナイロン−メツシュ膜の上に吸着させる。

ｈＣＧ含有試料溶液、例えば妊娠女性からの尿を膜に吸い取らせ、ソノ後膜を０ ．１５ＭＮａＣＬ　Ｏ−Ｏ１Ｍホスフェートおよび０．１％牛血清アルブミン（ ｐＨ７，４）を含有する緩衝溶液１ｒａＱで洗う。

マイクロペルオキシダーゼで標識した抗−β−ｈＣＧを膜に加え、膜を再び上記 緩衝溶液２＋ＩＩＱで洗う。膜をルミノメータ−の吸収管（ｃｕｖｅｔｔｅ）ま たはカメラルミノメータ−の中に設置し、ジオキセタンと接触させる。ジオキセ タンの酵素的分解による発光を検出する。

アルカリホスファターゼで標識した抗体−β−ｈＣＧおよびホスフェート含有ジ オキセタンを使用しても同様の結果が得られる。

Ｃ２血清マイクロペルオキシダーゼ分析０．８４Ｍ２−メチル−２−アミノプロ パツール含有水性緩衝液の２．７ｒｎＱを１２Ｘ７５ｗバイレックス試験管内に 設置し、マイクロペルオキシダーゼ含有血清試料Ｑ　、　ｌ　ｍＱを加える。溶 液を３０℃にする。Ｑ、２ｒａＱのジオキセタンを加え、試験管を直ちにルミノ メータ−に設置し、生じる発光を記録する。光放出のレベルはマイクロペルオキ シダーゼ活性の割合に比例する。

上記の分析はホスフェート含有ジオキセタンの使用によって血清アルカリホスフ ァターゼを検出するのに使用してもよい。

Ｄ、核酸混成（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）分析サイトメガロウィルス（ｃｙ ｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）を含有していると思われる脳を髄液（Ｃ３Ｆ）の 試料を集めニトロセルロース膜上に設置する。試料は尿素またはグアニジニウム インチオシアネートで化学的に処理し、細胞膜をこわし、ウィルスＤＮＡを除い て全ての細胞成分を崩壊させる。このようにして作られたウィルスＤＮＡのスト ランドラ分離しニトロセルロースフィルターに付ける。ウィルスＤＮＡ１：ｅｘ 的で、ホースラディツシュペルオキシダーゼで標識したＤＮＡプローベをフィル ターにつける。プローベは補足的なウィルスのＤＮＡと混成をなす。混成の後、 フィルターを０．２ＭＮａＣｆｆおよびＱ　、　ｌ　ｍＭ　トリス−Ｈ（４（ｐ Ｈ８−０）を含有する水性緩衝溶液で洗い、過剰のプローベ分子を除去する。ジ オキセタンを加えジオキセタンの酵素機能退化によって生ずる発光をルミノメー タ−で測定まｔ：は写真フィルムで検出する。

アルカリホスファターゼで標識したＤＮＡプローベおよびホスフェート含有ジオ キセタンを使用しても同様の結果が得られる。

他の態様は以下の請求の範囲に示す。

例えば、特異的親和性物質は酵素の代わりに基Ｔまたは基Ｖを通してジオキセタ ンに結合してもよい。この場合、特異的親和性物質が結合している基は結合を容 易にするために例えば、カルボン酸、アミンまたはマレイミド置換基を供給され る。

ジオキセタンの基Ｔまたは基Ｖは重合してホモポリマーまたはコポリマーを形成 してもよい重合可能基、例えばビニル基に結合してもよい。

ジオキセタンの基Ｔまたは基Ｖは免疫または核酸分析での使用のため例えば膜、 フィルム、ビーズに結合していてもよい。基は結合を容易にするため例えば、カ ルボン酸、アミノまたはマレイミド置換基を供給される。

ジオキセタンの基Ｔまたは基Ｖはジオキセタンのペルオキシダーゼによって引き 起こされた分解の動態を高める置換基、例えば電子豊富部分（例えば、メトキシ ）を含有することができる。

さらに化学合成の例としてはオレフィンをＨ，Ｏ，およびジブロマンチン（ｌ、 ３−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントイン）と反応させてオレフィン先駆体 を１．２−ブロモヒドロペルオキシドに転換させることが挙げられる。１．２− ブロモヒドロペルオキシドを塩基、例えば、ＮａＯＨ，銀塩、例えば臭化銀で処 理してジオキセタンを形成する。

オレフィンを光化学的に発生させたシングレット酸素で処理するよりむしろ、ポ スナー（Ｐ　ｏｓｎｅｒ）等のジェイ、アム、ケム、ツク。

（Ｊ　、Ａｍ−Ｃｈｅｍ、５ｏｃ−）上０９：２７８−７９（１９８７）に記載 のようにジオキセタンはオレフィンをトリフェニルホスファイトオシニドまたは トリエチルシリルヒドロトリオキシドで処理することによって調製される。

オレフィン先駆体の合成のもう一つの方法としては発色基及び基Ｔオレフィンの カルボニル型をＴ　ｉ　ＣＱｓ／　Ｌ　Ａ　Ｈと反応させてオレフィンを形成さ せるマクマリ−（ＭｃＭｕｒｒｙ）反応が挙げられる。変形されたマクマリ−反 応、例えば、Ｔ　ｉ　ＣＱｓ／　Ｌ　Ａ　Ｈの代わりにＴｉＣＬ／ＴＭＥＤＡ／ Ｚｎを使うものもまた使用されてよい。

田際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｔはジオキセタンの３位の炭素でスビロ結合した、置換または非置換ア リール、ポリアリール、シクロアルキリデン、またはポリシクロアルキリテン基 ；ＸはＣＲ７Ｒ８、Ｏ、ＳまたはＮ−Ｒ（但し、Ｒ７、Ｒ８およびＲは各々独立 してＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキ ル、シクロヘテロアルキル、アラルキル、アルカリール、または酵素分裂可能基 である。）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々独立してＨ、電子 求引性基、電子供与性基、ヘテロアリール、または酵素分裂可能基、または基Ｒ １−Ｒ６は共に環を形成する。］を有し、分解して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する発光物質を形成することが可能なジオキセタン。 ２．基Ｔ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少くとも一つが各々独立 して酵素分裂可能基を含む請求の範囲第１項記載のジオキセタン。 ３．酵素分裂可能基がホスフェートを含む請求の範囲第２項記載のジオキセタン 。 ４．基ＸがＯ、基Ｒ１−Ｒ３よびＲ６がＨ、基Ｒ４およびＲ５が各々独立してＨ または酵素分裂可能基である請求の範囲第１項記載のジオキセタン。 ５．基Ｔがポリシクロアルキリデン基である請求の範囲第１項記載のジオキセタ ン。 ６．基Ｔがアダマンチリデンである請求の範囲第５項記載のジオキセタン。７． 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、アセチルまたはＰＯ４である。］ を有する化合物。 ８．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、アセチルまたはＰＯ４である］ を有する化合物。 ９．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、アセチルまたはＰＯ４である］ を有する化合物。 １０．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、アセチルまたはＰＯ４である〕 を有する化合物。 １１．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（４）［式中、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ５アルキル 基、アセチルまたはＰＯ４である］ を有する化合物。 １２．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々独立してＨ、電子求引 性基、電子供与性基、ヘテロアリール、または酵素分裂可能基、または基Ｒ１− Ｒ６は共に環を形成する。］を有する化合物。 １３．特異的綜合をしている組の部分が光学的に検出可能な反応によって検出さ れる分析方法において、該光学的に検出可能な反応が式、 ▲数式、化学式、表等があります▼（４）［式中、Ｖは蛍光性発色基、Ｔはジオ キセクンの３位の炭素でスビロ結合している置換または非置換アリール、ポリア リール、シクロアルキリデン、またはポリシクロアルキリデン基である。］を有 するジオキセタンと酵素との反応を包含し、該酵素が該ジオキセタンの四員環部 分のＯ−Ｏ結合を分裂させることによってジオキセタンを分解して基Ｖを含む発 光物質を形成させる方法。 １４．酵素がオキシドーリダクターゼを含む請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．酵素がベルオキシダーゼを含む請求の範囲第１３項記載の方法。 １６．特異的結合をしている組が、抗原および抗体を含む請求の範囲第１３項記 載の方法。 １７．特異的結合をしている組が、核酸および核酸の全部または部分に結合可能 なプローブである請求の範囲第１３項記載の方法。 １８．酵素がホースラデッシュベルオキシダーゼである請求の範囲第１３項記載 の方法。 １９．酵素がマイクロベルオキシダーゼである請求の範囲第１３項記載の方法。 ２０．特異的結合をしている組の部分が光学的に検出可能な反応によって検出さ れる分析方法において、該光学的に検出可能な反応が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｔはジオキセタンの３位の炭素でスビロ結合している置換または非置換 アリール、ポリアリール、シクロアルキリデン、またはポリシクロアルキリデン 基、 ＸはＣＲ７Ｒ８、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ（但し、Ｒ７、Ｒ３およびＲは各々独立 してＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキ ル、シクロヘテロアルキ、アラルキル、アルカリール、または酵素分裂可能基で ある。）、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々独立してＨ、電子求 引性基、電子供与性基、ヘテロアリール、または酵素分裂可能基、または基Ｒ１ −Ｒ５は共に環を形成する。〕 を有するジオキセタンと酵素との反応を包含し、該酵素が該ジオキセタンを分解 して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する発光物質を形成させる方法。 ２１．基ＸがＯ、基Ｒ１−Ｒ３およびＲ６がＨ、基Ｒ４およびＲ６が各々独立し てＨまたは酵素分裂可能基である請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．酵素がオキシドーリダクターゼであり、ジオキセタンの四員環部分のＯ− Ｏ結合を分裂させることによってジオキセタンを分解させる請求の範囲第２０項 記載の方法。 ２３．ジオキセタンが酵素分裂可能基を含み、酵素がジオキセタンから酵素分裂 可能基を分裂させることによってジオキセタンを分解させる請求の範囲第２０項 記載の方法。 ２４．酵素分裂可能基がホスフェートを含み、酵素がホスファターゼを含む請求 の範囲第２３項記載の方法。 ２５．以下の段階、 （ａ）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｖは蛍光性発色基、Ｔはジオキセタンの３位の炭素でスビロ結合した置 換または非置換アリール、ポリアリール、シクロアルキリデンまたはポリシクロ アルキリデン基である。］を有するジオキセタンを供給し、 （ｂ）ジオキセタンを酵素含有試料と接触させ、該酵素は該ジオキセタンの四員 環部分のＯ−Ｏ結合を分裂させることによってジオキセタンを分解し、ジオキセ タンの基Ｖを含む発光物質を形成させ、ついで （ｃ）該発光物質を該酵素の存在の示すものとして検出するから成る試料中の酵 素の検出方法。 ２６．酵素がオキシドーリダクターゼを含む請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．酵素がベルオキシダーゼを含む請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８．酵素がホースラデッシュベルオキシダーゼである請求の範囲第２５項記載 の方法。 ２９．酵素がマイクロベルオキシダーゼである請求の範囲第２５項記載の方法。 ３０．以下の段階、 （ａ）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｔはジオキセクンの３位の炭素でスビロ結合した、置換または非置換ア リール、ポリアリール、シクロアルキリデン、またはポリシクロアルキリデン基 ；ＸはＣＲ７Ｒ８、Ｏ、ＳまたはＮ−Ｒ（但し、Ｒ７、Ｒ８およびＲは各々独立 してＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキ ル、シクロヘテロアルキル、アラルキル、アルカリール、または酵素分裂可能基 である。）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６け各々独立してＨ、電子 求引性基、電子供与性基、ヘテロアリール、または酵素分裂可能基、または基Ｒ １−Ｒ６は共に環を形成する。］ を有するジオキセタンを供給し、 （ｂ）ジオキセタンを酵素含有試料と接触させ、該酵素はジオキセタンを分解し 、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する発光物質を形成させ、 （ｃ）該発光物質を該酵素の存在の示すものとして検出するから成る試料中の酵 素の検出方法。 ３１．基ＸがＯ、基Ｒ１−Ｒ３およびＲ６がＨ、Ｒ６およびＲ５が各々独立して Ｈまたは酵素分裂可能基である請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２．酵素がオキシドーリダクターゼであり、ジオキセタンの四員環部分のＯ− Ｏ結合を分裂させることによってジオキセタンを分解させる請求の範囲第３０項 記載の方法。 ３３．ジオキセタンが酵素分裂可能基を含み、該酵素がジオキセタンから酵素分 裂可能基を分裂させることによってジオキセタンを分解させる請求の範囲第３０ 項記載の方法。 ３４．酵素分裂可能基がホスフェートを含み、該酵素がホスファターゼを含む請 求の範囲第３３項記載の方法。 ３５．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｔはジオキセクンの３位の炭素でスビロ結合した、置換または非置換ア リール、ポリアリール、シクロアルキリデン、またはポリシクロアルキリデン基 ；ＸはＣＲ７Ｒ８、Ｏ、ＳまたはＮ−Ｒ（Ｒ７、Ｒ８およびＲは各々独立してＨ 、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シ クロヘテロアルキル、アラルキル、アルカリール、または酵素分裂可能基である 。）；Ｒ１Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々独立してＨ、電子求引性基 、電子供与性基、ヘテロアリール、または酵素分裂可能基、または基Ｒ１−Ｒ６ は共に環を形成する。］を有するジオキセタン；および 該ジオキセタンを分解させて式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する発光物質を形成させることが可能な酵素を含む試料中の主要物質を検出 するキット。