JP2005515977A - 発光性化合物に関する組成物、方法並びにキット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のもう一つの局面においては、上記式(XII)において、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり;R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり;R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり;R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり;かつR11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基である化合物を提供する。22℃における、F12媒体および10%牛胎児血清を含む混合物中の該式(XII)で表される化合物の濃度は、45分後に50%未満だけ低下する。
更に別の本発明の局面においては、以下の式(XIII)または(XIV)で表される化合物を提供する:
本発明の更に別の局面においては、上記化合物の一つを、溶液状態で含む組成物を提供する。
更に別の本発明の局面においては、保護された発光団を提供し、これは変性されたセレンテラジンであり、そのエノール基は酵素-離脱性基を含むエステルまたはエーテルに転化されており、該酵素-離脱性基の除去は、原セレンテラジンを与える。22℃において、F12媒体および10%牛胎児血清を含む混合物中の、該変性セレンテラジンの濃度を50%だけ低下するのに要する時間は、22℃において、F12媒体および10%牛胎児血清を含む混合物中の、該原セレンテラジンの濃度を50%だけ低下するのに要する時間よりも長い。
更に別の本発明の局面では、保護された発光団および脱保護酵素を含むキットを提供する。該発光団および該脱保護酵素は、別々の容器内に収容されている。
本発明の更に別の局面では、発光性タンパク質の酵素活性を測定する方法を提供し、この方法は、溶液中で発光性タンパク質、脱保護酵素、および保護された発光団を接触させて、組成物を生成する工程と、この組成物の発生する光を検出する工程とを含む。
更に別の本発明の局面では、ルシフェラーゼを含有する生細胞内で、ルミネッセンスを発生させる方法を提供し、この方法は、溶液内で該細胞と保護された発光団とを接触させる工程を含む。
本発明の更に別の局面では、非-発光性酵素の酵素活性を測定する方法を提供し、該方法は、非-発光性酵素と、発光性タンパク質および保護された発光団を含む液状混合物とを接触させて、組成物を生成する工程と、この組成物の発生する光を検出する工程とを含む。
本発明にとって有用な上記発光団は、セレンテラジン類と呼ばれる一群の化合物を含む。セレンテラジンなる用語は、イミダゾピラジン構造を持つ分子として定義され、溶液中で所定の発光性タンパク質と接触した際に、ルミネッセンスを生じる能力を持つことによって特徴付けられる。セレンテラジン類は、広範囲に渡る発光性タンパク質、具体的には海洋性ルシフェラーゼに作用した際にルミネッセンスを生じることが知られている。海洋性ルシフェラーゼの例は、レニラルシフェラーゼ、エクオリン、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ、オプロフォルス(Oplophorus)ルシフェラーゼ、およびシプリジナ(Cypridina)ルシフェラーゼを包含する。
セレンテラジンの例は、以下の構造式I-IIIによって与えられる:
好ましくは、R1は-CH2-C6H5、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、-CH(CH3)CH2CH3、またはナフチル基(以下の構造IV-A)である。
好ましくは、R2は-CH2C6H5、-(CH2)3NHC(=N)NH2、-CH2C6H11(以下の構造IV-B);または-CH2C5H9(以下の構造IV-C)である。
好ましくは、R5およびR6は夫々独立にHまたはOHを表す。
ここで使用する用語「アルキル」とは、1〜20個の炭素原子、好ましくは1〜15個の炭素原子を含み、直鎖、分岐、または環式であり得る炭化水素鎖であり、例えば-CH3、-CH2(CH2)nCH3、-(CH2)nCH(CH3)2、-(CH2)nC(CH3)3(ここでnは整数である)、アダマンチル、および上記構造IV-BおよびIV-Cである。
「ヘテロアルキル」なる用語は、1またはそれ以上のヘテロ原子、例えばO、N、Sおよびハロゲンをも含むアルキル基であり、例えば-(CH2)n-O-(CH2)mCH3、-(CH2)n-C(=O)-N(CH3)2、-(CH2)3NHC(=N)NH2、および-(CH2)nC(=O)OH(ここでnおよびmは整数である)を意味する。
天然のセレンテラジンおよび変性セレンテラジンを含む、セレンテラジン類は、WI、マディソンのプロメガ社(PROMEGA CORPORATION)およびOR、ウジェーヌのモレキュラープローブズ社(MOLECULAR PROBES INC.)から入手できる。セレンテラジン類は、また例えばShimomura等, Biochem. J., 1989, 261: 913-20; Inouye等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 233: 349-53;およびTeranishi等, Anal. Biochem., 1997, 249: 37-43に記載されているようにして、合成することも可能である。
保護された発光団は、ルミネッセンスアッセイの有用性を高める可能性がある。「保護された発光団」とは、最早、発光性タンパクと相互作用して、ルミネッセンスを引起すことのないように、変性(修飾)されているセレンテラジンとして定義される。この変性が、該セレンテラジンに対する酵素-離脱性基の付加である場合、該保護された発光団と適当な酵素との相互作用は、ルミネッセンスを生じ得る、活性なセレンテラジンを生成する。該保護された発光団を発光団に転化する該酵素は、好ましくは非-発光性の酵素である。上記セレンテラジンの全てが、保護された発光団に転化できる。用語「基」とは、化学的な化合物の任意の部分を意味する。
この誘導体化方法の一例は、セレンテラジンVIからの保護された発光団IXの合成である。保護された発光団IXは、3個のアセチル保護基が存在することから、トリアセチル-セレンテラジンとしても知られている。
好ましくは、R7はR1について記載したものと同一であり、あるいは-CH2-C6H4OR14である。
好ましくは、R8はR2について記載したものと同一であり、またR10はR4について記載したものと同一である。
好ましくは、R9はR3について記載したものと同一または-C6H4OR15である。
保護された発光団の具体的な例は、トリアセチル-セレンテラジン(IX)、トリブチリル-セレンテラジン(XV)、ジアセチルセレンテラジン-h(XVI)、アセトキシメチルジアセチル-セレンテラジン(XVII)、アセトキシメチルアセチルセレンテラジン-h(XVIII)、ピバロイルオキシメチルセレンテラジン-h(XIX)、およびアセトキシメチルジデオキシセレンテラジン(XX)を含む。
該保護された発光団は、その対応する発光団と比較して、正常な使用条件下で高い安定性を示す。セレンテラジン類は、典型的に溶媒和された際に、特に中性pH以上にて水性溶液中で(例えば、細胞培養倍地中で)溶媒和された場合に、不安定となり、またこの不安定性が、自己ルミネッセンスに導く可能性がある。自己ルミネッセンスは、この系について測定されるバックグラウンドに寄与し、この測定の感度を低下する。また、この不安定性は、このシグナルの持続時間を比較的短いものとする可能性がある。この期間は、該シグナルの半減期として定量化でき、これは該シグナルが、その元の強度の半分に減衰されるのに要する時間として、定義される。
発光アッセイにおける保護された発光団の使用は、このアッセイのシグナル/バックグラウンド比の増大および該ルミネッセンスシグナルの安定性改善を含む、多くの他の利点をもたらす可能性がある。
本発明の幾つかの態様において、該保護された発光団は、アッセイ用の試薬として使用できる。ルシフェラーゼを用いたアッセイは、当分野において周知である。このようなアッセイは、遺伝子発現および調節等の生物学的なメカニズムを分析するのに、特に有用である。典型的には、細胞を、ルシフェラーゼをコードする核酸でトランスフェクションし、次いでタンパク抽出物を生成するために溶解する。このタンパク抽出物におけるルシフェラーゼの存在は、基質を含む試薬の添加によって測定される。
好ましい態様では、保護された発光団は、レニラルシフェラーゼを含むアッセイで使用する。レニラルシフェラーゼは、このアッセイにおける唯一の光発生タンパク質であり得(Srikantha等, J. Bacteriol., 1996, 178(1): 121-9; Liu & Escher, Gene, 1999, 237(1): 153-9)、1種またはそれ以上の光発生タンパク質と共に存在でき(Skarpidi等, Blood, 2000, 96(1): 321-6; Parsons等, Anal. Biochem., 2000, 281(2): 187-92; Stables等, J. Recept. Signal Transduct. Res., 1999, 19(1-4): 395-410; Grentzmann等, RNA, 1998, 4(4): 479-86)、または他の光発生タンパク質を含む融合タンパクの一部であり得る(Liu等, Luminescence, 2000, 15(1): 45-9)。
本発明の化合物は、細胞を分析するための、その場で行われる方法において、特に有用である。ルシフェラーゼを用いて、その場で細胞を分析する方法は、当分野において公知である(米国特許第5,998,204号参照)。本発明の保護された発光団は、その保護基を除去して、該ルシフェラーゼの基質とする必要がある。しかし、一旦保護基を除去すると、ルシフェラーゼは、該化合物を基質として直ぐに利用することができる。従って、その場でのイメージングにより、該脱保護酵素が細胞中に存在する位置を決定することができる。これは、ルシフェラーゼ、例えばレニラルシフェラーゼを発現する細胞と、保護された発光団とを接触させることによって、行うことができる。該保護された発光団を脱保護できる酵素が、該細胞内に存在する場合には常に、成長があるであろう。この成長は、イメージングシステムによって検出できる。保護された発光団は、またリポータ遺伝子発現の分析においても有用である。該保護された発光団を発光団に転化するのに必要な、該脱保護酵素の製造は、様々な因子によって影響される可能性がある。該脱保護酵素の存在およびその量は、該保護された発光団の利用によって決定できるので、該酵素の発現を検討することができる。
生化学的な過程のこの分析は、インビトロまたはその場の環境に制限されず、インビボでの研究に拡張することが可能である。該保護された発光団のインビボ発光分析への応用は、当業者には容易に明らかになるであろう。
本発明の重要な局面の一つは、本発明による該保護された発光団を含むキットを包含する。ここにおいて詳細に記載する好ましい方法を包含する、発光団を利用する本質的に任意のアッセイにおいて、このキットを使用できる。好ましい態様において、特定のアッセイ用の必須の試薬が、このキットにより与えられる。このような試薬は、チオウレアまたはチオウレア誘導体、1種またはそれ以上の水性バッファーおよび酵素を含むことができる。試薬は、また該保護された発光団の溶解を助けるための、DMSOおよび/またはアルコールをも含むことができる。各試薬は、夫々独自の容器を持つか、あるいは幾つかの試薬を予め混合し、一つの容器に一緒に収容することができる。幾つかの態様において、該キットは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。他の態様においては、該ルシフェラーゼタンパク自体が与えられる。
本発明は、また式XII、XIIIおよびXIVで示される、新規な化合物をも提供する。化合物XIIに関して、R7は-CH2-C6H4OC(=O)CH3であり、R9は-C6H4OC(=O)CH3であり、R10はHであり、およびR8は-CH2-C6H5であり、この場合R11は-C(=O)CH3ではない。好ましくは、本発明は、式XII、XIIIおよびXIVで示される、新規な化合物を提供し、ここで該化合物は、更に22℃における、F12媒体(培地)および10%牛胎児血清を含む混合物中で、少なくとも45分なる半減期を持つ。好ましくは、保護された式XII、XIIIおよびXIVで示される発光団は、水性環境内での、該化合物の半減期により測定した場合に、その原化合物よりも高い安定性を示す。具体的に、本発明は、式XV、XVI、XVII、XVIII、XIXおよびXXで示される新規化合物を提供する。
本例においては、3個のアセチル保護基を持つ、保護された発光団を、上記構造VIを持つセレンテラジンから合成した。無水ピリジン(20ml)に分散させたこの化合物VI(ストップ&グロ(STOP AND GLOTM)基質、PROMEGA社製)(500mg;1.2mM)に、無水酢酸(1.1ml;12mM)を添加し、この反応系を室温にて、不活性雰囲気下に維持した。1時間後に、30mlの塩化メチレンをこの反応系に添加し、次いで80mlの水を添加した。この混合物を5分間撹拌し、次いで相を分離した。得られた有機相を、蒸発乾固させ、次いで以下のようにして、カラムクロマトグラフィーにより精製した。順相シリカ(20g)を、塩化メチレン中で溶媒和させ、適当なサイズのガラスカラムに収容した。抽出した反応混合物を、最少量の塩化メチレンにとり、このカラムの上部に適用した。段階的な勾配を利用した。即ち、酢酸エチル(EtOAc)の1%塩化メチレン溶液から出発して、極性を所定の化合物が溶出されるまで増大(EtOAcの10%CH2Cl2溶液)させた。HPLC(>95%)によって純粋であると考えられる画分をプールし、蒸発乾固して、410mgの純粋な化合物IXを得た。
本例においては、3個のブチリル保護基を持つ、保護された発光団を、上記構造VIを持つセレンテラジンから合成した。無水ピリジン(30ml)に分散させたこの化合物VI(300mg;0.7mM)に、無水酪酸(1.12ml;7mM)を添加し、この反応系を室温にて、不活性雰囲気下に維持した。1時間後に、この反応混合物を、真空下において、シロップが生成するまで該溶媒を除去した。このシロップに30mlの塩化メチレンを、次いで80mlの水を添加した。この混合物を5分間撹拌し、次いで相を分離した。次に、得られた有機相を蒸発乾固し、更に以下のようにしてカラムクロマトグラフィーにより精製した。順相シリカ(20g)を、EtOAcの2%塩化メチレン溶液中で溶媒和させ、適当なサイズのガラスカラムに収容した。抽出した反応混合物を、最少量の塩化メチレンにとり、このカラムの上部に適用した。その移動相はアイソクラチックであり、所定の化合物全ては、酢酸エチルの2%塩化メチレン溶液で溶出させた。HPLC(>95%)によって純粋であると考えられる画分をプールし、蒸発乾固して、225mgの純粋な化合物XVを得た。
本例においては、構造VIIを持つセレンテラジンを合成した。その合成手順は、Inoue等によって報告されている手順(Inoue & Kakoi, Heterocycles, 1998, 48(8): 1669)を改良したものであった。2-アミノ-3-ベンジル-5-(4-ヒドロキシフェニル)ピラジン(2g;7.2mM)をキシレン(80ml)に溶解した溶液に、一度に、フェニルピルビンサン(8.3g;50.5mM)を添加し、この反応混合物を1時間還流加熱し、次いで室温まで冷却させた。この混合物を、減圧下で、暗色の固体状の泡状物となるまで蒸発させた。この泡状物を、N.P.シリカ300g上での、塩化メチレン中のメタノールの段階的勾配を用いたクロマトグラフィーによって分離した。所定の生成物は、メタノールの5%塩化メチレン溶液で溶出され、2gの化合物VIIを与え、これはHPLCにより純度80%であることが確認された。このクロマトグラフィーを繰り返して、900mgの化合物VII(「セレンテラジン-h」;HPLCによれば純度>95%)を、褐色固体として得た。
本例においては、構造VIIを持つセレンテラジンから、2つのアセチル保護基を有する、保護された発光団を合成した。無水ピリジン(15ml)に分散させたこの化合物VII(300mg;0.74mM)に、無水酢酸(1ml;11mM)を添加し、この反応系を室温にて、不活性雰囲気下に維持した。1時間後に、この反応混合物を、粘稠なシロップとなるまで蒸発させ、このシロップを以下のようにして、カラムクロマトグラフィーにより精製した。順相シリカ(40g)を、EtOAcとヘプタンとの1:3混合物で溶媒和させ、適当なサイズのカラムに投入した。該シロップを、最少量の塩化メチレンにとり、該カラムの上部に適用した。その移動相は、アイソクラチックであり、所定の化合物全ては、1:3EtOAc/ヘプタンで溶出した。HPLCにより純粋であると考えられる(>95%)全ての画分をプールし、蒸発乾固して、170mgの純粋な化合物XVIを得た。
本例では、実施例4で合成した、保護された発光団(XVI)から、1個のアセチル保護基を(フェノール基上に)持つ保護された発光団を合成した。化合物XVIを、ピリジンと塩化メチレンとの1:1混合物に溶解した1%溶液を、0℃に冷却した。この溶液に、予備冷却した、1%のメタノール性アンモニア溶液を滴下した。このアンモニア溶液の体積は、化合物XVIを溶解するのに使用したピリジン/塩化メチレン1:1混合物の体積と等しいものであった。数分間反応させた後、アリコートをHPLCで検査して、脱保護の完了の程度を決定した。HPLCにより、該出発物質よりも高い極性をもつが、化合物VIよりも親油性の高い、新たなピークが生成(即ち、C18シリカ上でより早期に溶出される、溶出液)した。HPLCによって、これ以上の化合物XVIが検出されなくなったら、この反応混合物を、蒸発乾固し、次いで以下のようにして、カラムクロマトグラフィーにより精製した。シリカ対化合物の比75:1にて、順相シリカを、EtOAcとヘプタンとの1:2混合物で溶媒和させた。その移動相は、段階的勾配相であり、この溶媒系の極性を、完全に所定の生成物が溶出されるまで、該EtOAc濃度を高めることにより増大させた。HPLCにより純粋であると考えられる(>95%)全ての画分をプールし、濃縮して、純粋な化合物XXIを得た。化合物XXIは、構造Iを有しており、そこでR1は-CH2-C6H5であり、R2は-CH2C6H5であり、R3は-C6H4-O-C(=O)-CH3であり、R4はHである。
従って、化合物XXIは脱保護されたエノール/カルボニルであり、このものを保護することにより、非対称の保護された発光団を得ることができる。例えば、ブロモメチル酢酸との反応は、保護された発光団XVIIIを生成するであろう。
本例では、(フェノール基上に)2個のアセチル保護基を持ち、かつ1個のアセトキシメチル保護基を持つ、保護された発光団を、実施例1で合成した、保護発光団(IX)から合成した。化合物IXの1%無水ピリジン溶液に、NaH(5.0当量)を添加し、この溶液を室温にて不活性雰囲気内で撹拌した。10分後に、ブロモメチル酢酸(5.0eq.)を、この混合物に滴添し、この反応混合物を、室温にて更に30分間撹拌した。この反応系に、該ピリジン体積の2倍に相当する量の塩化メチレンを添加し、次いで該ピリジン体積に等しい量の水を添加した。この混合物を5分間混合し、次いで得られた相を分離し、そのうちの有機相を蒸発乾固させた。得られた物質を、移動相としてEtOAc/ヘプタンを用い、順相シリカを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物XVIIを得ることができる。
本例では、構造XIXを持つ保護発光団を、Aungst等(Pharmaceutical Research, 1995, 12(5): 763)による手順の改良を利用して、構造VIIを持つセレンテラジンから合成した。KI(0.122g; 0.74mM)、K2CO3(0.031g; 0.44mM)およびクロロメチルピバレート(1.1g; 7.3mM)を、無水DMF(3ml)に分散させた混合物に、化合物VII(0.3g; 0.73mM)を添加し、この反応系を室温にて不活性雰囲気下で、一夜撹拌した。HPLCによる分析は、化合物VIIの完全な消費および化合物XIXに関連する極性の低いピークの出現を示した。該DMFを減圧下で蒸発させた。得られた固体を塩化メチレンに溶解し、50gのN.P.シリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、255mgの化合物XIX(HPLCによる純度98%)を得た。
本例では、構造VIIIを持つセレンテラジン(ジデオキシセレンテラジン)を、2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジンおよび2-アセトキシ-3-フェニルプロペナールから合成した。該化合物2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジンは、以前に記載された方法に従って調製した(Kishi, Y.等, Tet. Lett., 1972, 2747; Cormier, M.等, Biochemistry, 1979, 18(11): 2204; Hirano, T.等, Tetrahedron, 1997, 53(38): 12903-12916)。該化合物2-アセトキシ-3-フェニルプロペナールは、以下のようにして合成した。無水ピリジン(250ml)に溶解した、フェニルピルビンサン(25g; 152mM)の溶液に、無水酢酸(170ml)を添加した。この溶液を、不活性雰囲気下で、一夜撹拌し、メタノールの10%塩化メチレン溶液を用いた、薄層クロマトグラフィー(TLC)によって追跡した。該ピリジンを、減圧下で蒸発させ、得られたシロップを塩化メチレン(700ml)にとり、各200mlの0.1N水性HCl溶液で3回洗浄した。得られた有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、得られた濾液を、粘稠な琥珀色のシロップとなるまで濃縮した。このシロップを、塩化メチレンを用いた、N.P.シリカ上でのクロマトグラフィーにより精製し、24gの2-アセトキシ-3-フェニルプロペン酸を得た。このエノールアセテート中間体を、150mlのTHFに溶解し、0℃に冷却した。
このように、化合物VIIIは、脱保護されたエノール/カルボニルを有し、これは保護して、保護発光団を与えることができる。例えば、ブロモメチルアセテートとの反応は、保護発光団XXを生成するであろう。
実施例9:様々な保護発光団の安定性
セレンテラジンまたは保護発光団のサンプルを、約3mMなる濃度にて、メタノールに溶解した。これらの原液を、F12培地;F12培地+10%牛胎児血清;またはF12培地+0.01%ツイーン(Tween)20中に、1μMまで希釈した。サンプルを様々な時点において採取し、サンプル中に残留する化合物(セレンテラジンまたは保護発光団)の量を、HPLCを利用して測定した。各溶液における該化合物の半減期は、吸光度対時間の対数プロットにより得られる線形関数の、回帰分析を行うことによって決定した。次に、この化合物の濃度を、初期濃度の50%まで低下するのに要する時間を算出した。
これら実施例においては、発光団および保護発光団の挙動を、様々な培養細胞において、その場で検討した。細胞を、レニラルシフェラーゼをコードするプラスミドによって、一時的にまたは安定的にトランスフェクションした。ルミネッセンスを、セレンテラジン(VIまたはVII)または保護発光団(IX、XV、またはXVI)と接触させた細胞同士で比較した。経時のルミネッセンスを測定し、かつこのルミネッセンスを細胞が存在しない場合のものと比較することによって、該細胞と保護発光団との接触が、長い半減期で、一般にルミネッセンスを低下し、かつ未変性のセレンテラジンと接触させた細胞よりも、高いシグナル対バックグラウンド比に導くことを立証する。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、10%の牛胎児血清(FBS)を補充した、ハムF-12培地内に維持した。HeLaおよび293細胞を、10%の子牛血清(FCS)を補充したDMEM培地に維持した。全細胞系を、5%CO2の存在下で、37℃にて成長させた。細胞を、Tfx-20(PROMEGA社、E2391)またはトランスファースト(TransFastTM)トランスフェクション試薬(Transfection Reagent (PROMEGA社、E2431))を使用して、10cmのプレート当り、7.5×105細胞なる濃度にて、15μgのpUC19またはpRL-Controlプラスミド(PROMEGA社、E6271)によって、一時的にトランスフェクションした。翌日、トランスフェクション体をプールし、白色のDYNEX96-ウエルルミノメータプレートの48ウエルに分割した。
次に、このようにして調製した細胞を、様々なアッセイにかけた。これらアッセイ用の反応バッファーを、DMEMまたはF12培地を、FBSまたはFCS(10容量%)と共に使用して調製した。セレンテラジンVI、セレンテラジンVIIまたは保護発光団IX、XV、またはXVIの一つを、次に添加して、60μM濃度とした。次いで、これらバッファーを、以下のアッセイにおけるルミネッセンスの測定のために使用した。ルミネッセンスは、ORIONルミノメータを使用して測定した。
トランスフェクションに続く24または48時間後に、該細胞から、該培地を吸引除去した。これら細胞を、ウエル当り100μlの1×の燐酸緩衝塩水で洗浄した。VIまたはIXを含有する反応バッファーを、ハーフログ(half-logs)によって、完全培地に滴下し(titrated)、これら溶液を空のウエルおよびトランスフェクションされた細胞を含むウエルに添加した。ルミネッセンスを、培地交換後5分の時点で測定した。最初の測定の直後に、タージトール(TERGITOL) NP-9 (SIGMA CHEMICALS)を、最終濃度1%まで添加した。サンプルを約15秒間混合し、ルミネッセンスを、ウエル当り1秒間に渡り積分した。細胞サンプルから測定したルミネッセンスは、タージトールNP-9を、セレンテラジンVIまたはVIIを含有するサンプルに添加した後に、増大した。細胞サンプルから測定したルミネッセンスは、タージトールNP-9を、セレンテラジンIX、XVまたはXVIもしくはXIXを含有するサンプルに添加した後に、殆ど自己ルミネッセンスのレベルまで低下した。
自己ルミネッセンスは、培地と血清のみを含むサンプルについて測定したルミネッセンスとして定義した。この自己ルミネッセンスで割った該ルミネッセンスを、シグナル対バックグラウンド比(S/B)とした。pHRL CMV, E6271でトランスフェクション下CHO細胞に関する結果を、以下の表Dに与える。
該CMVプロモータ(PROMEGA、商品リスト)の制御の下で、合成レニラルシフェラーゼ遺伝子により安定的にトランスフェクションされた、CHO細胞を、10%FBSを含むF12培地内で、37℃にて、5%CO2の存在下で成長させた。細胞を96-ウエルプレートの3列(列A-C)に接種し、一夜生育させた。セレンテラジンVIまたはアセトキシメチルジアセチルセレンテラジンXVIIを、F12+10%FBSに60μMとなるように希釈した。セレンテラジンXVIIを含有する該F12を使用して、列Aの培地を交換し、(自己ルミネッセンスの測定を可能とするために)列Eにおける空のウエルにも添加した。該セレンテラジン含有F12を使用して、列Cの培地を交換し、また列Gにおける空のウエルにも添加した。列Bを利用して、セレンテラジンまたはアセトキシメチルジアセチルセレンテラジンが存在しない状態では、ルミネッセンスが全く発生しないことを確認した。このプレート上のウエル由来のルミネッセンスを、3時間に渡り、10分毎に測定し、経時の各化合物に関する、ルミネッセンス(発光性タンパク質-依存性ルミネッセンス)および自己ルミネッセンス(細胞を含まないウエルについて測定した、発光性タンパク質-独立性ルミネッセンス)としてグラフ化した。時間の関数として測定したルミネッセンスを、図1のグラフに示す。シグナル対バックグラウンド比を、図2のグラフに示す。
本例は、タンパク質合成経路の2つの部分を遮断する効果を示す。プロマイシンおよびシクロヘキシミド両者は、タンパク質合成を阻害するが、これらは該合成経路の異なる点において、異なった仕方で阻害する。インビトロでは、該酵素は、強度において100倍以上も低下し、また22℃において3-5分なる半減期を持つであろう。
CHO細胞を、該CMVプロモータ(PROMEGA、商品リスト)の制御の下で、合成ヒト化レニラルシフェラーゼ遺伝子により安定的にトランスフェクションし、96-ウエルプレートにて、10%牛胎児血清を含むF12培地内で、37℃にて、5%CO2の存在下で成長させた。一連の12-16プレートの列Aのみに接種し、一夜生育させた。該培地を除去し、600μMのPOMセレンテラジン-h(XIX)を含有する、F12培地+10%FBSで置換した。1プレート上の細胞由来のルミネッセンスを測定し、全てのプレートをインキュベータに戻した。1プレート上の細胞由来のルミネッセンスを、培地置換後の各時間に、即ち1、2および3時間後に測定した。
A. POM-h (XIX)対セレンテラジン-h (VII)
CHO hRL25細胞(ルシフェラーゼを発現する) (4.5mlの(7.5x105細胞)/(プレート/5x109細胞/ml))を、5.5mlの培地に再懸濁し、96-ウエルプレートに入れた。翌日、細胞を吸引し、100μlのPBSで洗浄し、次いで再度吸引した。次に、基質を含まない(バックグラウンド)100μlの培地(F12)を、細胞を含まないウエルに添加した。次いで、これらウエルを、オリオン(ORION)ルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、1秒/ウエルについて読み取った(表E、B kg)。
同様に、100μMのPOM-hまたはセレンテラジン-h何れかを含む培地100μlづつを、細胞を含むウエルまたはウエルのみに入れた。次いで、オリオンルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、直後に(セレンテラジン)および添加後10分の時点(POM-h)にて、1秒/ウエルについて読み取った(表E、Subs)。
その後、0.5μlの精製レニラルシフェラーゼ(3.96x10-5M/反応(ケミコン(Chemicon))を、各ウエルに添加した。次いで、全てのウエルを、1秒/ウエルについて読み取った(表E、RL)。
これらデータは、更に(殆どエステラーゼを含まない)培地のみにおいて、POM-hが、hRL25細胞-含有培地と比較して、低いルミネッセンスを持つことを明らかにし(3641 v. 35349)、このことは、このセレンテラジン誘導体が、ルシフェラーゼによって発光団に転化される前に、まずエステラーゼによって転化される必要があることを示す。これとは対照的に、セレンテラジン-hは培地のみおよびhRL25細胞-含有培地両者について、匹敵するルミネッセンスを示し(278467 v. 331381)、このことは、外因性のルシフェラーゼと反応できる前には、細胞媒介転化が全く不要であることを示唆している。
トランスフェクションされていないCHO細胞(自然にルシフェラーゼを生産することはない)および(ルシフェラーゼを発現する)CHO hRL25細胞(4.5mlの(7.5x105細胞)/(プレート/5x109細胞/ml))を、5.5mlの培地に再懸濁し、96-ウエルプレートに入れた。翌日、細胞を吸引し、100μlのPBSで洗浄し、次いで再度吸引した。次に、基質を含まない(バックグラウンド)100μlの培地(F12)を、細胞を含まないウエルに添加した。次いで、これらウエルを、オリオン(ORION)ルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、1秒/ウエルについて読み取った(表F、B kg)。
同様に、100μMのセレンテラジンまたはトリアセチルセレンテラジン何れかを含む培地100μlづつを、細胞を含むウエルまたはウエルのみに入れた。次いで、オリオンルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、直後に(セレンテラジン)および添加後4分の時点(トリアセチルセレンテラジン)にて、1秒/ウエルについて読み取った(表F、Subs)。
その後、0.5μlの精製レニラルシフェラーゼ(3.96x10-5M/反応(ケミコン(Chemicon))を、各ウエルに添加した。次いで、全てのウエルを、1秒/ウエルについて読み取った(表F、RL)。
Claims (78)
- R7が、-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり;R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2;およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項1記載の化合物。
- R11、R14およびR15がエステルである、請求項1記載の化合物。
- R11がアセチル基であり、かつR14およびR15が夫々独立に、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項1記載の化合物。
- R11がブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基であり、かつR14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項1記載の化合物。
- R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2であり、およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項6記載の化合物。
- R11、R14およびR15がエステルである、請求項6記載の化合物。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項6記載の化合物。
- 以下の式(XII)で表され:
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり;
R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり;
R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり;かつ
R11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基であり;また
少なくとも1つの該酵素-離脱性基の除去により、原化合物を与え、しかも
22℃における、F12媒体および10%牛胎児血清を含む混合物中の該式(XII)で表される化合物の濃度を、50%だけ低下するのに要する時間が、22℃における、F12媒体および10%牛胎児血清を含む混合物中の該原化合物の濃度を、50%だけ低下するのに要する時間よりも長いことを特徴とする、該化合物。 - 少なくとも2つの該酵素-離脱性基の除去が、該原化合物を与える、請求項10記載の化合物。
- 全ての該酵素-離脱性基の除去が、該原化合物を与える、請求項10記載の化合物。
- R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2であり、およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項10記載の化合物。
- R11、R14およびR15がエステルである、請求項10記載の化合物。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項10記載の化合物。
- R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、かつR8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2である、請求項16記載の化合物。
- R11、R14およびR16がエステルである、請求項16記載の化合物。
- R11、R14およびR16が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項16記載の化合物。
- nが1である、請求項16記載の化合物。
- 請求項1記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
- 該溶液が、水性溶液である、請求項21記載の組成物。
- 該溶液が、DMSOまたはアルコールを含む、請求項21記載の組成物。
- 請求項6記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
- 該溶液が、水性溶液である、請求項24記載の組成物。
- 該溶液がDMSOまたはアルコールを含む、請求項24記載の組成物。
- 請求項10記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
- 該溶液が、水性溶液である、請求項27記載の組成物。
- 該溶液がDMSOまたはアルコールを含む、請求項27記載の組成物。
- 請求項16記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
- 該溶液が、水性溶液である、請求項30記載の組成物。
- 該溶液がDMSOまたはアルコールを含む、請求項30記載の組成物。
- 保護された発光団であって、変性されたセレンテラジンであり、
そのエノール基が酵素-離脱性基を含むエステルまたはエーテルに転化されており、該酵素-離脱性基の除去が、原セレンテラジンを与え、かつ
22℃における、F12媒体および10%牛胎児血清を含む混合物中の該変性セレンテラジンの濃度を、50%だけ低下するのに要する時間が、22℃における、F12媒体および10%牛胎児血清を含む混合物中の該原セレンテラジンの濃度を、50%だけ低下するのに要する時間よりも長いことを特徴とする、上記発光団。 - 保護された発光団および発光性タンパク質を含むことを特徴とするキット。
- 該発光団から離れた、脱保護用酵素をも含む、請求項34記載のキット。
- 該保護された発光団および該発光性タンパク質が、別々の容器内に収容されている、請求項34記載のキット。
- 該保護された発光団および該発光性タンパク質が、同一の容器内に収容されている、請求項34記載のキット。
- 保護された発光団および脱保護用酵素を含み、該発光団および該脱保護用酵素が、別々の容器内に収容されていることを特徴とするキット。
- 発光性タンパク質の酵素学的活性を測定する方法であって、発光性タンパク質、脱保護用酵素および保護された発光団を溶液内で接触させて、組成物を生成し、および該組成物の発生する光を検出する諸工程を含むことを特徴とする、上記方法。
- 該発光性タンパク質が、レニラルシフェラーゼである、請求項39記載の方法。
- R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2であり、およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項41記載の方法。
- R11、R14およびR15がエステルである、請求項41記載の方法。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項41記載の方法。
- R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、かつR8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2である、請求項45記載の方法。
- R11、R14およびR16がエステルである、請求項45記載の方法。
- R11、R14およびR16が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項45記載の方法。
- nが1である、請求項45記載の方法。
- 該組成物が、細胞を含む、請求項39記載の方法。
- 該組成物が、上記脱保護酵素を含有する細胞を含む、請求項39記載の方法。
- 該組成物の発生する光の検出が、細胞中の該脱保護酵素の位置を示す、請求項51記載の方法。
- 該組成物が、細胞溶解物を含む、請求項39記載の方法。
- 該脱保護酵素がエステラーゼである、請求項39記載の方法。
- 該溶液が水性溶液である、請求項39記載の方法。
- 該溶液がDMSOを含む、請求項39記載の方法。
- 該保護された発光団が、変性されたセレンテラジンであり、そのエノール基が酵素-離脱性の基を含むエステルまたはエーテルに転化されている、請求項39記載の方法。
- ルシフェラーゼを含む生細胞内でルミネッセンスを発生させる方法であって、該方法が、溶液中で、該細胞と、保護された発光団とを接触させる工程を含むことを特徴とする、上記方法。
- 該保護された発光団が、変性されたセレンテラジンであり、該エノール基が、酵素-離脱性の基を含むエステルまたはエーテルに転化されている、請求項58記載の方法。
- 非-発光性酵素の酵素活性を測定する方法であって、非-発光性酵素と、発光性タンパク質および保護された発光団を含む液状混合物とを接触させて、組成物を生成する工程と、該組成物の発生する光を検出する工程とを含むことを特徴とする、上記方法。
- 該保護された発光団が、変性されたセレンテラジンであり、該エノール基が、該非-発光性酵素により離脱可能な基を含むエステルまたはエーテルに転化されている、請求項62記載の方法。
- 更に、DMSOまたはアルコールもしくはこれらの混合物をも含む請求項34記載のキット。
- 該保護された発光団と同一の容器内に、更に、DMSOまたはアルコールもしくはこれらの混合物をも含む請求項38記載のキット。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項1記載の化合物。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-15のアルキル基および炭素原子数1-15のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項1記載の化合物。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項1記載の化合物。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項10記載の化合物。
- R11、R14およびR15が、夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項10記載の化合物。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項16記載の化合物。
- R11、R14およびR15が、夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項16記載の化合物。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項41記載の方法。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項41記載の方法。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項45記載の方法。
- R11、R14およびR15が夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項45記載の方法。
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