SE449004B - Bioluminiscensbestemning av nadh och/eller nadph - Google Patents
Bioluminiscensbestemning av nadh och/eller nadphInfo
- Publication number
- SE449004B SE449004B SE8103980A SE8103980A SE449004B SE 449004 B SE449004 B SE 449004B SE 8103980 A SE8103980 A SE 8103980A SE 8103980 A SE8103980 A SE 8103980A SE 449004 B SE449004 B SE 449004B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- nadh
- nadph
- oxidoreductase
- amount
- nad
- Prior art date
Links
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 title claims description 38
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 title claims 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 29
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 20
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 18
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 16
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 claims description 15
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- -1 aliphatic aldehyde Chemical class 0.000 claims description 7
- 108010014531 FMN Reductase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 6
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims 2
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims 1
- YTNIXZGTHTVJBW-SCRDCRAPSA-L FMNH2(2-) Chemical compound [O-]P(=O)([O-])OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2NC2=C1NC(=O)NC2=O YTNIXZGTHTVJBW-SCRDCRAPSA-L 0.000 claims 1
- 101001059390 Homo sapiens Formin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- YTNIXZGTHTVJBW-SCRDCRAPSA-N FMNH2 Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2NC2=C1NC(=O)NC2=O YTNIXZGTHTVJBW-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 5
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N decanal Chemical compound CCCCCCCCCC=O KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000204914 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Give Species 0.000 description 1
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 description 1
- 101000862377 Vibrio harveyi NADPH-flavin oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000007128 oxidoreductase reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
gi
10
15
20-
25
30
35
449 004 2
är baserade på enzymen_luciferas och NAD(P)H-FMN oxidoreduktas samt
flavinmonomukleotid (FMN) och alifatisk långkedjad (C8-C14) aldehyd,
till vilket NAD(P)H måste tillföras för att ljusemission skall
kunna ske. När NAD(P)H bringas i kontakt med reagenset, sker
en reaktion, eller snarare en följd av enzymkatalyserade reaktioner.
Reaktionerna har studerats i detalj för enzymer från flera olika
luminiscerande bakterier, och dessa reaktioner representerar sålunda
grunden för tekniken. Flera översiktsartiklar har publicerats
under senare âr; (se DeLuca, M. (1978), "Methods in Enzymology,
Bioluminescence and Chemiluminescence", (S. Colowick and N.
Kaplan ed., Vol. 57, 125-236, Academic Press, New York and
Hastings, J. och Nealson, K. (1977), Annual Review of Microbiology,
31, 549-595).
Bestämningen av NAD(P)H har vanligen utförts på ett sådant sätt
att provet med okänd NAD(P)H-koncentration blandats med biolumini-
scensreagenset innehållande luciferas, NAD(P)H-FMN oxidoreduktas,
FMN och alifatisk aldehyd. Ofta har orena luciferaspreparat använts,
vilka innehåller både luciferas och oxidoreduktas varvid ingen
(1976).
Bioelectrochem. Bioenerg. 5, 257-262 och Golden, S. och Katz, J.
(1980), Biochem. J. l§§, 799-805). Renade enzymer har dock börjat
användas (se Jablonski, E. och DeLuca, M. (1979) Clin.Chem. gå,
1622-1627, och Ford, J. och DeLuca, M. (l98l) Anal. Biochem. lig,
43-48). Tillsats av NAD(P)H till bioluminiscensreagenset ger
tillsats av oxidoreduktas har gjorts (se t.ex. Brolin, S.
upphov till en ljusemission vars intensitet avtar relativt snabbt
eftersom NAD(P)H förbrukas och en konstant reaktionshastighet
inte kan uppnås (se Thore, A. (1979) Ann.Clin. Biochem. lg,
359-369). NAD(P)H halten har därför bestämts antingen genom att
använda reaktionens initialhastighet, den maximala reaktionshastig-
heten eller genom att integrera reaktionshastigheten (ljusintensi-
teten) under en bestämd tid, vilket har gjort det svårt att
uppnå reproducerbara resultat.
Det har emellertid vid undersökningen av bakteriebioluminiscens-
system framkommit att den ljuskinetik som erhålles vid mätning av
NAD(P)H halter i stort varierar beroende på enzympreparatens
renhet och aktivitet (se Duane, W. och Hastings, J. (1975), Molec.
10
15
20
25
-w-
30
35
449 004
Cell. Biochem. Q, 53-64, Jablonski, E. och DeLuca, M. (l979),
Clin.Chem. gå, 1622-1627 och Tu, S-H. och Hastings, J. (1980)
Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. ll, 249-252). Svårigheterna att
på ett kontrollerbart sätt bereda reagens har emellertid medfört
att bakterieluciferassystemet inte tills vidare erhållit stor
uppmärksamhet trots en del kommersiella reagens som förekommer
på marknaden.
Enligt uppfinningen uppnår man med tillsatser till NAD(P)H-
beroende bioluminiscensreagens en ljusemission, som under hela
mättiden har samma proportionalitetsfaktor till NAD(P)H-
koncentrationen. Då bioluminiscensreagenset i sig förbrukar försum-
bara mängder NAD(P)H erhålles med prover, vars NAD(P)H-koncentra-
tion är konstant, en stabil och konstant ljusemission vilket
underlättar reagensets användning för NAD(P)H bestämning.
Reagensets egenskaper gör det möjligt att utföra en intern kalibre-
ring av systemet genom att tillföra en känd mängd NAD(P)H, varefter
ökningen i ljusintensitet används för uträkning av analysens
slutliga resultat. Vidare kan reagens med ovanstående egenskaper
sättas till andra NAD(P)H-omsättande system för att på ett enkelt
sätt följa förändringen i NAD(P)H-koncentrationen genom kontinuer-
lig mätning av ljusintensitet. NAD(P)H-omsättande system kan
t.ex. vara kombinationer av enzymer och eventuellt substrat som
vid sin reaktion ger upphov till bildning eller förbrukning av
NAD(P)H..En'intern kalibrering med en känd halt av NAD(P)H kan
utföras även i dessa tillämpningar. Den analytiska användningen
av reagenset innefattar bestämning av NAD(P)H samt substanser
och enzym som deltar i NAD(P)H-omsättande reaktioner inom
klinisk kemi och klinisk mikrobiologi samt inom biokemisk och
biologisk forskning.
Uppffnningen kommer närmare att förklaras under hänvisning till
bifogad ritning på vilken
Fig. l schematiskt visar en sekvens av enzymkatalyserande reak-
tioner som erhâlles när NAD(P)H bringas i kontakt med ett bakterie-
luminiscensreagens;
Pig. 2 visar inverkan av oxidoreduktasreaktionen på bakterie-
luciferasreaktionens ljuskinetik;
Fig. 3 visar en standardkurva för NADH erhållen med bakterie-
luciferasreagens med stabil ljusintensitet;
10
15
20
25
30
449 004 4
Fig. 4 visar bestämning av NADHfhalter genom användning av
intern kalibrering; och
Fig. 5 visar en kinetisk bestämning av alkoholdehydrogenas-
aktivitet med användning av intern kalibrering med hjälp av en
känd mängd NADH.
Vid reaktion l i Fig. l reagerar reducerat pyridinkoenzym (NADH
eller NADPH) med FM varvid reaktionen katalyseras av en specifik
NAD(P)H-FM oxidoreduktas varvid det som slutprodukter bildas
reducerat flavinkoenzym FMNH2 och oxiderat pyridinkoenzym (NAD
eller NADP). Oxidoreduktaser, vilka är specifika för de två
förekommande pyridinkoenzymerna, har påvisats och isolerats_,
från den luminiscerande bakterien Beneckea harveyi (se
Jablonski, E. och DeLuca, M. (1977), Biochemistry, lg, 2932-2936
och Gerlo, E. och Charlier, J. (1975), Eur. J. Biochem, ål,
461-467).
I reaktion 2 binds FMNH2 snabbt och kraftigt av luciferas.
I reaktion 3 reagerar enzym-FMNH2komplexet med 02 för att bilda
en oxygenerad form av reducerat flavin som förblir bundet till
enzym. Denna oxygenerade mellanprodukt har en lång livstid och
den har t.o.m. isolerats vid låg temperatur.
I reaktion24 binds den långkedjade alifatiska aldehyden till
enzymet, oxideras utav peroxid mellanprodukter till motsvarande
fettsyra som frigörs (reaktion 5). Aldehyder med olika lång kol-
vätekedja har använts (se Hastings, J., Spudich, J. och Malnic,G.
(1963), J. Biol. Chem. Zåâ, 3100-3105). Då fettsyran frigörs i
reaktion 5 bildas hydroxylerat FMNH som är enzymbundet och anses
utgöra den elektroniskt exiterade= molekylen.
I reaktion 6 övergår det exiterade tillståndet till grundtill-
ståndet under utsändande av en foton. I det sista steget (reaktion
7) dissocieras slutprodukterna från enzymet som därefter kan delta
i en ny katalytisk cykel.
Reaktionerna 7 och 8 utgör sidoreaktioner till bakterieluciferas-
systemet. Av dessa är det speciellt reaktion 8, den snabba auto-
oxidationen av FMNH2, som stör bestämningen av NAD(P)H genom att
10
15
20
.25
s 449 D04
oxidera bildat FMNH2. Den enzymatiska sidoreaktionen (reaktion 7)
verkar inte störande på bestämningen i närvaro av alifatisk
aldehyd. Förekomsten av sidoreaktioner, bristen på rena enzymer
samt okontrollerade reatkionsbetingelser har varit de främsta
orsakerna till att bakterieluciferassystemet vid bestämning av
NAD(P)H givit upphov till en ljusblixt med varierande halveringstid
i stället för en konstant ljusemission.
Enligt föreliggande uppfinning har det visats att det är
möjligt att kontrollera luciferassystemets ljuskinetik genom att
använda renat luciferas och NAD(P)H-FMN oxidoreduktas i varierande
förhållanden. Det har tidigare visats att ljusintensiteten ßreak-
tionshastigheten) vid användningen av luciferas och oxidoreduktas
är proportionell mot produkten av de ingående enzymernas kon-
centration (se Hastings, J., Riley, W. och Marsa, J. (1965), J.
Biol. Chem. ggg, 1473-1480), men dessutom påverkas ljuskinetiken.
Genom att omsorgsfullt kontrollera de tillsatta enzymmängderna,
speciellt oxidoreduktaskoncentrationen, har det blivit möjligt
att bereda ett reagens med önskade egenskaper, d.v.s. ett bakterie-
luciferasreagens, innehållande luciferas, NAD(P)H-FMN oxidoreduktas,
FMN och alifatisk aldehyd, med stabil ljusnivå.
Detta illustreras av Fig. 2 som visar ett karakteristiskt
experiment där bakterieluciferassystemet använts för bestämning
av NADH.:På abskissan anges därvid tiden i minuter och på
koordinatan ljusintensiteten i mV för ett antal försök (l-5) vilka
utförts 1 0,1 M feefetbuffert pa 7 innehållande 0,5 mm næm, 0,1 %
BSA, 2 x 10-6 M FMN och 2 x 10-5 dekanal. Reaktionerna initierades
genom ett tillföra 5 X 10'l2 M NADH till 0,5 m1 reekcieneblenaning.
Enzymkoncentrationerna i försöken var följande:
Försök Oxidoreduktas Luciferas
nr U/l kV/l
l 25 45
2 16 40
3 ll 40
4 3 45
5 0,6 ll0
10
15
20
25
gi
30
449 004 6
Luciferashalten i försök 5 var högre enbart för att erhålla
tillräcklig ljusintensitet. Som framgår av figuren ger en hög
oxidoreduktashalt i systemet en relativt snabbt avtagande
ljuskinetik. Ifall en mindre oxidoreduktasmängd används avtar
ljusintensiteten allt långsammare tills halten når en nivå
(försök 4) som ger enii stort sätt stabil ljusintensitet. En
ytterligare minskning i oxidoreduktasmängder ger en reagens-
blandning där ljusintensiteten stiger allt långsammare tills en
konstant nivå till slut uppnås. Att ljusintensiteten är olika i _
de fem försöken beror ju på att den är proportionell mot produkten
av de ingående enzymernas koncentration. Den använda luciferas-
mängden påverkar ljusintensiteten, men har inte någon större in-
verkan på ljuskinetiken, medan oxidoreduktasmängden påverkar'
både ljusintensiteten och ljuskinetiken. Den avtagande ljusintensi-
teten kan förklaras utav att oxidoreduktasen förbrukar det NADH som
finns i systemet varvid det bildas en ekvivalent mängd FMNH2 som
delvis deltar i luciferasreaktionen och delvis auto-oxideras. Då
oxidoreduktashalten minskas och en stabil ljusnivå uppnås har det
ifrågavarande enzymet en aktivitetsnivå som åstadkommer en kon-
tinuerlig konstant oxidation av NADH och en motsvarande konstant
reduktion av en ekvivalent mängd FMN. Slutresultatet blir ett
reaktionssystem där den i provet förekommande NADH mängden
bestämmer intensiteten på det stabila ljuset. Motsvarande
reaktionssystem kan uppbyggas för bestämning av NADPH.
Bakterieluciferassystemet följer Michaelis-Menten kinetik. Vid
låg substratkoncentration är ljusintensiteten proportionell mot
mängden NAD(P)H förutsatt att koncentrationen ligger väl under
Km för substratet. Förhållande uttrycks i följande formel:
V: I = Vmax + S 2% vmax X S
Km + S SQ
Reaktionshastigheten (ljusintensiteten = I) kommer dessutom
att vara konstant ifall omvandhmgenär tillräckligt långsam så att
substratkoncentrationen inte väsentligt förändras under mätningen,
vilket i princip uppfylls utav det utvecklade bakterieluciferas-
reagenset.
10
15
20
30
35
1 449 004 å
I Fig. 3 där på abskissan anges NADH koncentrationen i molar
och koordinatan den erhållna ljusintensiteten i Volt visas en
standardkurva för NADH-bestämning med bakterieluciferasreagenset
innehållande NADH-FMN oxidoreduktas. Motsvarande standardkurva
erhålles för NADPH ifall reagenset innehåller NADPH-FMN
oxidoreduktas. Reagenset kan användas inom en mycket stor koncentra-
'tionsintervall. Känsligheten för systemet kan dessutom ökas antingen
genom att minska på reaktionsvolymen medan enzymmängderna förblir
konstanta eller genom att öka mängden luciferas i reagenset.
Fig. 4 visar ett typiskt förfarande vid bestämning av NADH (eller
NADPH) halter 1 ett prov. vid försöket tiilfördee s X 1o"1l_M
NADH ett reagens innehållande 0,1 M fosfatbuffert pH 7,0, 0,5 mM
DTT, o,1 % BsA, 2 X 1o"6 M FMN, 2 X 1o'5 M aekenei, 4 U/1 oX1ae-
reduktas och ll0 kV/1 luciferas. Pilarna anger tidpunkten för
ytterligare tillsats av 5 x 10-11 mol NADH. Då ett prov tillförs
stiger ljusintensiteten till en konstant nivå och hålls konstant
i cza l minut, varefter den avtar långsamt med tiden (I = 5 %/min)
beroende på den använda oxidoreduktashalten i reagenset. Det ut-
vecklade bakterieluciferasreagenset gör det möjligt att utföra
analysen genom att använda en intern kalibrering med en känd å
mängd NADH. Ljusintensiteten stiger till en ny konstant nivå,
vilken är beroende av tillsatt mängd NADH.
Det optimerade bakterieluciferasreagenset kan användas för änd-
punktsanalyser av metaboliter som enzymatiskt omvandlas till ekvi-
valent mängd NADH, till kinetiska analyser av motsvarande meta-
boliter och till kinetiska bestämningar av enzymaktiviteter.
Figur 5 visar ett försök där bakterieluciferasreagenset använts
för bestämning av alkoholdehydgenasaktivitet. Försöksbetingelserna
är följande: 0,9 (l) och 0,25 (2) mU alkoholdehydrogenas till-
fördes 0,5 ml reagensblandning innehållande 0,1 M fosfatbuffert
pa 7,0, 0,5 mM DTT, 0,1 % Bsn, 2 X 1o"6 M EMM, 2 X 1o'5 M aekenei,
s X 1o'5 M NAD, 8 X 1o'5 M etanol, 4 U/1 eX1aereauktee een 110 kv/1
luciferas. Pilarna anger tidpunkten för intern kalibrering med en
känd mängd NADH, l,5 x 10-10 mol i reaktion l och 7,5 x 10-11 mol
i reaktion 2. Ökningen i ljusintensitet i mV/min är ett mått på
enzymaktiviteten, vilken dessutom kan uträknas genom att använda
den relativt snabba ökning i mV som erhålles vid en intern kali-
brering med en känd mängd NADH.
449 004 8
De beskrivna försöken (Fig. 2-5) skall betraktas som icke-
begränsande exempel.
73
I:
Claims (5)
- l. Förfarande för bestämning av NADH- och/eller NADPH- koncentrationer, t.ex. i NADH- eller NADPH omsättande system, varvid man bringar det prov, på vilket bestämningen skall utföras, i kontakt med ett bioluminiscensreagens baserat på bakterieluciferas, NAD(P)H-FMN oxidoreduktas, FMN och ali- fatisk aldehyd, varigenom en reaktion sker, där NAD(P)H oxi- deras och FMN reduceras, vilken reaktion katalyseras av oxido- ïreduktasen, varefter det bildade FMNH2 och aldehyden binds till luciferaset och ljus emitteras, och.varvid man mäter intensiteten hos det emitterade ljuset vilken intensitet är ett mått på NADH- eller NADPH-koncentrationen, k ä n n e- t e c k n a t d ä r a v, att vid bestämningen användes ett renat bakterieluciferas i huvudsak fritt från oxidoreduktas samt för varje ml analysvolym 0.4 - 40 mU oxidoreduktas (U= mängden enzym som katalyserar oxidationen av 1 pmol NADH eller NADPH per minut), varvid en stabil ljusintensitet er- hålles i närvaro av en konstant mängd NADH eller NADPH och en intern kalibrering kan utföras i NADH eller NADPH omsättande system med tillsats av en känd mängd NADH eller NADPH och en efterföljande mätning av ljusintensitetens ökning. . - _ -a-ye- -u-Q»
- 2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att mängden bakterieluciferas vid bestämningen är 0,8 - 80/ug.
- 3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att den alifatiska aldehyden har en kolvätekedja på 8-14 kol- atOmeI .
- 4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att mängden aldehyd vid bestämningen är 2 x 10-7 - 2 x 10-9 mol.
- 5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, lo mol. att mängden FM vid bestämningen är 2 x 10-8 - 2 x 10- 61 Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att reagenset innehåller bovint serum albumin, tiolföreningar och/eller kalium fosfat.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8103980A SE449004B (sv) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | Bioluminiscensbestemning av nadh och/eller nadph |
| US06/390,710 US4501813A (en) | 1981-06-25 | 1982-06-21 | Bioluminescence method for determining NADH or NADPH |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8103980A SE449004B (sv) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | Bioluminiscensbestemning av nadh och/eller nadph |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8103980L SE8103980L (sv) | 1982-12-26 |
| SE449004B true SE449004B (sv) | 1987-03-30 |
Family
ID=20344143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8103980A SE449004B (sv) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | Bioluminiscensbestemning av nadh och/eller nadph |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4501813A (sv) |
| SE (1) | SE449004B (sv) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4906565A (en) * | 1986-03-21 | 1990-03-06 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method for the selective detection of microbial nucleotides |
| JPH02234698A (ja) * | 1989-03-08 | 1990-09-17 | Toyobo Co Ltd | 細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法 |
| JP2818696B2 (ja) * | 1991-01-25 | 1998-10-30 | 財団法人野田産業科学研究所 | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 |
| JP2818695B2 (ja) * | 1991-01-25 | 1998-10-30 | 財団法人野田産業科学研究所 | Ｎａｄｈキナーゼ及びその製造法 |
| US7268229B2 (en) * | 2001-11-02 | 2007-09-11 | Promega Corporation | Compounds to co-localize luminophores with luminescent proteins |
| CN1800852B (zh) * | 2005-01-06 | 2012-04-18 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 一种改进速率法检测临床诊断试剂 |
| FR2935003A1 (fr) * | 2008-08-14 | 2010-02-19 | Novocib | Nouvelle methode ultrasensible et rapide pour mesurer par bioluminescence le degre de fraicheur de la chair animale |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4234681A (en) * | 1978-07-21 | 1980-11-18 | The Regents Of The University Of California | Immobolized light emitting systems |
| DE2833723A1 (de) * | 1978-08-01 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung eines oxidierten pyridincoenzyms |
| US4278761A (en) * | 1979-12-26 | 1981-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Enzyme assay and kit therefor |
-
1981
- 1981-06-25 SE SE8103980A patent/SE449004B/sv not_active IP Right Cessation
-
1982
- 1982-06-21 US US06/390,710 patent/US4501813A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8103980L (sv) | 1982-12-26 |
| US4501813A (en) | 1985-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blum | Bio-and chemi-luminescent sensors | |
| Whitehead et al. | Analytical luminescence: its potential in the clinical laboratory. | |
| Blum et al. | Luminescence fiber-optic biosensor | |
| Gautier et al. | Fibre‐optic biosensor based on luminescence and immobilized enzymes: Microdetermination of sorbitol, ethanol and oxaloacetate | |
| US4357420A (en) | Bioluminescence methods for enzymatic determinations | |
| EP0156204B1 (en) | Apparatus for measuring velocity of enzyme reaction | |
| Wienhausen et al. | Bioluminescent assays of picomole levels of various metabolites using immobilized enzymes | |
| Jablonski et al. | Properties and uses of immobilized light-emitting enzyme systems from Beneckea harveyi. | |
| Rogers et al. | Respiratory development in Saccharomyces cerevisiae grown at controlled oxygen tension | |
| GB2055200A (en) | Enhancement of the sensitivity of bioluminescent and chemiluminescent assays with enzymatic cycling | |
| Blouin et al. | Characterization of in vivo reporter systems for gene expression and biosensor applications based on luxAB luciferase genes | |
| Holzman et al. | Reversible inhibition of the bacterial luciferase catalyzed bioluminescence reaction by aldehyde substrate: kinetic mechanism and ligand effects | |
| SE449004B (sv) | Bioluminiscensbestemning av nadh och/eller nadph | |
| Tu et al. | Uncoupling of the substrate monooxygenation and reduced pyridine nucleotide oxidation activities of salicylate hydroxylase by flavins | |
| Duley et al. | A spectrophotometric procedure for determining the activity of various rat tissue oxidases | |
| US4278760A (en) | Method and composition for determining an oxidized pyridine co-enzyme | |
| JP2528457B2 (ja) | 過酸化水素の定量法 | |
| Coulet et al. | Bioluminescence/chemiluminescence based sensors | |
| Nyrén | Apyrase immobilized on paramagnetic beads used to improve detection limits in bioluminometric ATP monitoring | |
| Davis | A spectrophotometric method for the assay of threonine dehydratase | |
| Blum et al. | Design of bioluminescence-based fiber optic sensors for flow-injection analysis | |
| Roda et al. | [14] Continuous-flow assays with nylon tube-immobilized bioluminescent enzymes | |
| Coulet et al. | Chemiluminescence and photobiosensors | |
| SWAIN et al. | Denitrification during growth of Pseudomonas aeruginosa on octane | |
| CA1179929A (en) | Process and reagent for determination of glycerol |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8103980-2 Effective date: 19930109 Format of ref document f/p: F |