JP7204728B2 - 血清中で安定なプロセレンテラジン類似体 - Google Patents
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Description
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの2017年7月6日出願の米国特許仮出願第62/529,152号の利益を主張する。
(I)、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される[式中、Ar1、Ar2、及びAr3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar1、Ar2、及びAr3は、場合によりそれぞれ置換され、RAは、C2~C10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、Rx1、Rx2は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される1つ以上の置換基で場合により置換されたC1~C6の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される]。
(II)、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される[式中、Ar1、Ar2、及びAr3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar1、Ar2、及びAr3は、場合によりそれぞれ置換され、Ar4は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される1つ以上の置換基で場合により置換された、アリール、フラン、またはチオフェンである]。
(III)
[式中、Ar1、Ar2、及びAr3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar1、Ar2、及びAr3は、場合によりそれぞれ置換され、RCは、C1~C9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される]。
別段の定義がなされないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。矛盾が生じる場合、定義を含む本文書が優先するものとする。下記では好ましい方法及び材料を記載するが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料を本発明の実施及び試験において用いることが可能である。本明細書で触れるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献はそれらの全容を参照により援用するものとする。本明細書に開示される材料、方法、及び実施例はあくまで説明のためのものであって、限定することを目的としない。
式(I)の化合物:
(I)、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される[式中、Ar1、Ar2、及びAr3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar1、Ar2、及びAr3は、場合によりそれぞれ置換され、RAは、C2~C10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、Rx1、Rx2は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される1つ以上の置換基で場合により置換されたC1~C6の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される]。
(II)、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される[式中、Ar1、Ar2、及びAr3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar1、Ar2、及びAr3は、場合によりそれぞれ置換され、Ar4は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される1つ以上の置換基で場合により置換された、アリール、フラン、またはチオフェンである]。
(III)、
または、その互変異性体、またはその塩が開示される[式中、Ar1、Ar2、及びAr3は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar1、Ar2、及びAr3は、場合によりそれぞれ置換され、RCは、C1~C9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される]。
[式中、Ry1、Ry2、Rz1、及びRz2は、それぞれの場合において、水素と、ハロ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される1つ以上の置換基で場合により置換されたC1~C6アルキルとからなる群からそれぞれ独立して選択され、nは0~10の任意の数であり、RCは、C1~C9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルから選択される]。
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル3-メトキシ-2,2-ジメチルプロパノエート(WZ-0323)、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル3-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)-2,2-ジメチルプロパノエート(WZ-0324)、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル3-(2-メトキシエトキシ)-2,2-ジメチルプロパノエート(WZ-0333)、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル13,13-ジメチル-2,5,8,11-テトラオキサテトラデカン-14-エート(WZ-0336)、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル16,16-ジメチル-2,5,8,11,14-ペンタオキサヘプタデカン-17-エート(WZ-0364)、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル2-メトキシ-2-メチルプロパノエート(WZ-0451)、及び
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル2-アセトアミド-2-メチルプロパノエート(WZ-0467)。
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルフラン-2-カルボキシレート(WZ-0420)、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルフラン-3-カルボキシレート(WZ-0461)、及び
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルベンゾエート(WZ-0416)。
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルメチルカーボネート(WZ-0419)。
式(I)、式(II)及び式(III)の化合物は、細胞内に存在するか、細胞外培地に加えられるか、または試料中の非ルシフェラーゼ酵素の作用によって発光を生じるためのルシフェラーゼのプロ基質となることで、所定の時間にわたってルシフェラーゼ基質(セレンテラジンまたはフリマジンなど)を放出することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、脱保護酵素(エステラーゼなど)と反応してルシフェラーゼ基質を放出することができる。化合物は、向上した安定性、向上した水溶性、向上した細胞透過性、低減された自家発光、及び/または低減された毒性を有しうる。いくつかの実施形態では、開示される化合物は、他のセレンテラジン及びフリマジンエステル類似体と比較して予想外に優れた血清中安定性を示しうる。詳細な実施形態では、開示される化合物は、血清を含有する培地中で安定であり、これによりさまざまな生細胞アッセイで24時間以上にわたり安定したシグナルを与える。
スキーム1a.血清中で安定なプロフリマジンエステルの例
スキーム1b.血清中で不安定な、または安定性の低い化合物の例
式(I)、式(II)及び式(III)の化合物、ならびに他のフリマジン-O-メチルカルボキシルエステルは、スキーム2a及びスキーム2bに示されるようにして合成することができる。
スキーム2a.フリマジン-O-メチル Me-PEGn-OCH2-ジメチルプロパノエート:WZ-0323、WZ-0333、WZ-0324、WZ-0336及びWZ-0364、ならびにフリマジン-O-メチル Me-PEGn-OCH2-プロパノエート:WZ-0308、WZ-0310及びWZ-0315の合成
スキーム2b.プロフリマジンWZ-0451、WZ-0467、WZ-0420、WZ-0461、WZ-0416、WZ-0419、WZ-0415、WZ-0429、WZ-0439、WZ-0454、WZ-0441、WZ-0440及びWZ-0430の合成
本化合物は、これまでにルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジン類似体が使用されてきたあらゆる方法で使用することができる。詳細には、本化合物は、レポーターアッセイ、NanoBiT(商標)アッセイ及びNanoBRET(商標)アッセイ、Annexinアッセイなどを含む生細胞アッセイで使用することができる。安定なプロセレンテラジンまたはプロフリマジンが生細胞アッセイで使用される場合、発光団の脱安定化によって発生する光が低減されることからアッセイの精度は大幅に高められる。
実施例1:フリマジンメチルMe-PEG0-OCH2-ジメチルプロパノエート(WZ-0323)の合成
Me-PEG0-OCH2-ジメチル-COOCH2Cl(0c)の合成:Me-PEG0-OCH2-ジメチルプロパン酸(1.0g、7.57mmol)を、ジクロロメタン/水の20mL/20mL混合物中に希釈した。混合物を氷水浴中で冷却し、炭酸水素ナトリウム(2.54g、30.27mmol、4当量)及びn-テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩(0.128g、0.378mmol、0.05当量)を加えた。5分間攪拌した後、クロロスルホン酸クロロメチル(1.37g、8.32mmol、1.1当量)を0℃で加えた。溶液を一晩、激しく攪拌した。混合物をさらなるジクロロメタンとともに分液漏斗に移し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去して粗生成物を73.2%の収率(1.37g)で得た。この化合物をさらなる精製を行わずに次の工程で直接使用した。
メチルMe-PEG1-OCH2-ジメチルプロパノエート(1a)の合成:水素化ナトリウム(油中、60重量%)(6.28g、mmol)を、0℃の20ml DMF中のメチル3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルプロパノエート(10.40g、78.69mmol)の攪拌溶液に加え、5分後に、1-ブロモ-2-メトキシエタン(10.94g、78.69mmol)を滴下し、反応混合物を3時間攪拌した。反応を冷たい飽和NH4Cl(水溶液)(30mL)で停止し、水層をDCM(2x50mL)で抽出し、加え合わせた有機層をNa2SO4で乾燥した。溶媒を除去した後、溶離剤としてヘプタン/酢酸エチルを使用したESCOフラッシュクロマトグラフィーにより化合物を精製して33%の生成物(5.0g)を得た。
試験化合物を、20mMの濃度でDMSOストック中に溶解した。このストック溶液を、DMSOコントロールまたはFBSを添加した/添加しないDMEM培地中に40μMにさらに希釈した。各化合物の3つの40uMの希釈液を、特定の溶出溶媒/緩衝液(例えば、0.1%TFA及びアセトニトリル)を使用し、同じ条件下で24時間にわたってHPLCにより測定した。特定の時点における純度のパーセンテージを、対応する保持時間における260nmでの試験化合物のピーク面積を、試験化合物及び分解化合物を含むすべての化合物の総ピーク面積で割ることによって計算した。試験化合物の純度の経時的な変化は、10%のFBSの存在下/非存在下における特定の環境中での化合物の不安定度を示した。図1A~1Hは、化合物WZ-0308、WZ-0310、WZ-0315、WZ-0429、WZ-0454、WZ-0439及びWZ-0441では、10%FBSを含むDMEM培地中での5時間後の分解率はおよそ50%以上であり、低い血清中安定性を示したことを示している。WZ-0415は、10%FBSの存在下で10時間後におよそ50%の分解率であり、血清中安定性の向上を示した。これに対して、化合物WZ-0323、WZ-0324、WZ-0336、WZ-0451、WZ-0467、WZ-0420、WZ-0461、WZ-0416、及びWZ-0419は、10%FBSを含むDMEM培地中で10時間またはそれ以降に分解したのは20%未満であり、改善された血清中安定性を示した(図2A~2I)。
合成したプロセレンテラジン及びプロフリマジン化合物を生細胞レポーター遺伝子アッセイで評価した。図3A~Cに示されるように、3つの代表的なプロセレンテラジン類似体、例えば、血清中で不安定な化合物WZ-0308、従来の生細胞プロ基質PBI-4377、及び開示される血清中で安定な化合物WZ-0324と共に、外因性のエステラーゼであるブタ肝臓エステラーゼ(PLE)を添加し/添加せずに、10ng/ウェルのCMVプロモーター-NanoLuc(登録商標)遺伝子をトランスフェクトした、10%FBSを含むDMEM培地中のHEK293細胞で、発光シグナルの減衰を経時的にモニタリングした。これらの評価は以下のプロトコールにより行った。
プレート読み取りルミノメーターを用いたリアルタイムでのアポトーシスの検出用に、ルシフェラーゼの小さなフラグメント及び大きなフラグメントが、アネキシンVと結合させた融合タンパク質として遺伝子操作によって作製されている。個々のアネキシンV-ルシフェラーゼフラグメント融合体のペアは、互いに対して低い固有の親和性を有しており、そのため、培地中または非アポトーシス細胞の存在下では発光を生じないかまたは生じる発光は低いが、アネキシンV-ルシフェラーゼフラグメント融合タンパク質がアポトーシス細胞の表面に露出したホスファチジルセリンに近接して結合すると、ルシフェラーゼフラグメントは活性酵素を再構成して発光シグナルを発生する。アネキシンV-ルシフェラーゼフラグメント融合タンパク質とルシフェラーゼ基質とを組み合わせることにより、培養中の細胞に直接加えることで、蛍光アネキシンV結合アッセイで一般的に用いられている細胞洗浄工程を必要としない均質なアッセイを与える試薬が形成される。発光の経時的なモニタリングによって、非透過性の蛍光発生DNA結合色素と複合体化させて膜の完全性を示すことにより、アポトーシスの開始が同じ試料から測定される二次壊死よりも先に生じることが示される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕式(I)の化合物:
(I)、
または、その互変異性体、またはその塩[式中、
Ar 1 、Ar 2 、及びAr 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar 1 、Ar 2 、及びAr 3 は、それぞれ置換されていてもよく、
R A は、C 2 ~C 10 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択され、
R x1 、R x2 は、それぞれの出現において、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいC 1 ~C 6 の直鎖または分枝鎖のアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される]。
〔2〕Ar 1 がフェニルであり、Ar 2 がフリルであり、Ar 3 がフェニルである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔3〕R x1 、R x2 がメチルである、前記〔1〕に記載の化合物。
〔4〕R A がR B CH 2 -であり、R B が、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミド、アセトキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシ、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔3〕に記載の化合物。
〔5〕R A がR C O-であり、R C が、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔3〕に記載の化合物。
〔6〕R A がR C C(O)NH-であり、R C が、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔3〕に記載の化合物。
〔7〕R A がR C C(O)O-であり、R C が、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔3〕に記載の化合物。
〔8〕R A がR B CH 2 -であり、R B がCH 3 (OCH 2 CH 2 ) n O-であり、nが0~10の任意の数である、前記〔4〕に記載の化合物。
〔9〕R C が直鎖または分枝鎖のC 1 ~C 5 アルキル、またはCH 3 (OCH 2 CH 2 ) n -であり、nが0~10の任意の数である、前記〔5〕に記載の化合物。
〔10〕R C が直鎖または分枝鎖のC 1 ~C 5 アルキルである、前記〔6〕に記載の化合物。
〔11〕R C が直鎖または分枝鎖のC 1 ~C 5 アルキルである、前記〔7〕に記載の化合物。
〔12〕Ar 1 がフェニルであり、Ar 2 がフリルであり、Ar 3 がフェニルである、前記〔8〕に記載の化合物。
〔13〕Ar 1 がフェニルであり、Ar 2 がフリルであり、Ar 3 がフェニルである、前記〔9〕に記載の化合物。
〔14〕Ar 1 がフェニルであり、Ar 2 がフリルであり、Ar 3 がフェニルである、前記〔10〕に記載の化合物。
〔15〕Ar 1 がフェニルであり、Ar 2 がフリルであり、Ar 3 がフェニルである、前記〔11〕に記載の化合物。
〔16〕R A -C(R x1 R x2 )-が下式である、前記〔1〕に記載の化合物:
〔17〕前記式(I)の化合物が下式(I-d)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-d)
〔18〕前記式(I)の化合物が下式(I-e)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-e)
〔19〕R A -C(R x1 R x2 )-が下式である、前記〔1〕に記載の化合物:
〔20〕前記式(I)の化合物が下式(I-f)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-f)
〔21〕前記式(I)の化合物が下式(I-g)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-g)
〔22〕前記式(I)の化合物が下式(I-h)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-h)
〔23〕前記式(I)の化合物が下式(I-i)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-i)
〔24〕前記式(I)の化合物が下式(I-j)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-j)
〔25〕前記式(I)の化合物が下式(I-k)を有する、前記〔1〕に記載の化合物:
(I-k)
〔26〕式(II)の化合物:
(II)
[式中、Ar 1 、Ar 2 、及びAr 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar 1 、Ar 2 、及びAr 3 は、それぞれ置換されていてもよく、Ar 4 は、アルキル、アルコキシ、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい、アリール、フラン、またはチオフェンである]。
〔27〕Ar 1 がフェニルであり、Ar 2 がフリルであり、Ar 3 がフェニルである、前記〔26〕に記載の化合物。
〔28〕Ar 4 が、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである、前記〔26〕に記載の化合物。
〔29〕前記式(II)の化合物が下式(II-a)を有する、前記〔26〕に記載の化合物:
(II-a)
[式中、Ar 1 、及びAr 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar 4 は、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである]。
〔30〕前記式(II)の化合物が下式(II-b)を有する、前記〔26〕に記載の化合物:
(II-b)
[式中、Ar 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ar 4 は、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである]。
〔31〕前記式(II)の化合物が下式(II-c)を有する、前記〔26〕に記載の化合物:
(II-c)
[式中、Ar 4 は、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである]。
〔32〕式(III)の化合物:
(III)
[式中、Ar 1 、Ar 2 、及びAr 3 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar 1 、Ar 2 、及びAr 3 は、それぞれ置換されていてもよく、R C は、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、メチルエーテルポリエチレングリコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルポリエチレングリコキシアルキル、カルボキシアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される]。
〔33〕Ar 1 がフェニルであり、Ar 2 がフリルであり、Ar 3 がフェニルである、前記〔32〕に記載の化合物。
〔34〕R C が、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される、前記〔32〕に記載の化合物。
〔35〕前記式(III)の化合物が下式(III-a)を有する、前記〔32〕に記載の化合物:
(III-a)
[式中、Ar 1 、及びAr 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、R C は、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される]。
〔36〕前記式(III)の化合物が下式(III-b)を有する、前記〔32〕に記載の化合物:
(III-b)
[式中、Ar 2 は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、R C は、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される]。
〔37〕前記式(III)の化合物が下式(III-c)を有する、前記〔32〕に記載の化合物:
(III-c)
[式中、R C は、C 1 ~C 9 の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される]。
〔38〕((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル3-メトキシ-2,2-ジメチルプロパノエート、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル3-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)-2,2-ジメチルプロパノエート、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル3-(2-メトキシエトキシ)-2,2-ジメチルプロパノエート、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル13,13-ジメチル-2,5,8,11-テトラオキサテトラデカン-14-エート、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル16,16-ジメチル-2,5,8,11,14-ペンタオキサヘプタデカン-17-エート、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル2-メトキシ-2-メチルプロパノエート、及び
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチル2-アセトアミド-2-メチルプロパノエート
からなる群から選択される、前記〔1〕に記載の化合物。
〔39〕((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルフラン-2-カルボキシレート、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルフラン-3-カルボキシレート、及び
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルベンゾエート
からなる群から選択される、前記〔26〕に記載の化合物。
〔40〕((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルメチルカーボネートからなる群から選択される、前記〔32〕に記載の化合物。
〔41〕10%ウシ胎児血清(FBS)の存在下で少なくとも12時間の血清中安定性を示す、前記〔1〕~〔40〕のいずれか1項に記載の化合物。
〔42〕前記〔1〕~〔33〕のいずれか1項に記載の化合物を含むキット。
〔43〕脱保護酵素をさらに含む、前記〔42〕に記載のキット。
〔44〕前記脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記〔43〕に記載のキット。
〔45〕ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼをさらに含む、前記〔42〕に記載のキット。
〔46〕緩衝試薬をさらに含む、前記〔42〕に記載のキット。
〔47〕試料中の発光を検出するための方法であって、試料を前記〔1〕~〔40〕のいずれか1項に記載の化合物と接触させることと、前記試料中に脱保護酵素が存在しない場合、前記試料を脱保護酵素と接触させることと、前記試料中にセレンテラジン利用ルシフェラーゼが存在しない場合、前記試料をセレンテラジン利用ルシフェラーゼと接触させることと、発光を検出することと、を含む、前記方法。
〔48〕前記試料が生細胞を含む、前記〔47〕に記載の方法。
〔49〕前記試料が、セレンテラジン利用ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを含む、前記〔47〕に記載の方法。
〔50〕前記脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記〔47〕に記載の方法。
〔51〕トランスジェニック動物の発光を検出するための方法であって、前記〔1〕~〔40〕のいずれか1項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与することと、発光を検出することとを含み、前記トランスジェニック動物がセレンテラジン利用ルシフェラーゼを発現する、前記方法。
Claims (14)
- Ar1がフェニルであり、Ar2がフリルであり、Ar3がフェニルである、請求項1に記載の化合物。
- Ar4が、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである、請求項1又は2に記載の化合物。
- 前記式(II)の化合物が下式(II-a)を有するか
(II-a)
[式中、Ar1、及びAr2は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ar4は、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである];又は、
前記式(II)の化合物が下式(II-b)を有するか
(II-b)
[式中、Ar2は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、Ar4は、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである];又は、
前記式(II)の化合物が下式(II-c)を有する
(II-c)
[式中、Ar4は、1つ以上のアルコキシで置換されていてもよい、フェニル、フラン、チオフェンである]、請求項1に記載の化合物。 - ((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルフラン-2-カルボキシレート、
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルフラン-3-カルボキシレート、及び
((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルベンゾエート
からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。 - Ar1がフェニルであり、Ar2がフリルであり、Ar3がフェニルであり、及び/又は、任意に、RCが、C1~C9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択されてもよい、請求項6に記載の化合物。
- 前記式(III)の化合物が下式(III-a)を有するか
(III-a)
[式中、Ar1、及びAr2は、アリール及びヘテロアリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、RCは、C1~C9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される];又は、
前記式(III)の化合物が下式(III-b)を有するか
(III-b)
[式中、Ar2は、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、RCは、C1~C9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される];又は、
前記式(III)の化合物が下式(III-c)を有する
(III-c)
[式中、RCは、C1~C9の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、及び複素環式アルキルからなる群から選択される]、請求項6に記載の化合物。 - ((8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イル)オキシ)メチルメチルカーボネートからなる群から選択される、請求項6に記載の化合物。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の化合物を含むキットであって、任意に前記キットがルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼをさらに含み、及び/又は、任意に、緩衝試薬をさらに含む、キット。
- 脱保護酵素をさらに含み、かつ、任意に、前記脱保護酵素がエステラーゼを含んでもよい、請求項10に記載のキット。
- 試料中の発光を検出するための方法であって、試料を請求項1~9のいずれか1項に記載の化合物と接触させることと、前記試料中に脱保護酵素が存在しない場合、前記試料を脱保護酵素と接触させることと、前記試料中にセレンテラジン利用ルシフェラーゼが存在しない場合、前記試料をセレンテラジン利用ルシフェラーゼと接触させることと、発光を検出することと、を含み、任意に脱保護酵素がエステラーゼを含む、前記方法。
- 前記試料が生細胞を含み、任意に、前記試料が、セレンテラジン利用ルシフェラーゼまたはフラグメント相補性ルシフェラーゼを含んでもよい、請求項12に記載の方法。
- トランスジェニック動物の発光を検出するための方法であって、請求項1~9のいずれか1項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与することと、発光を検出することとを含み、前記トランスジェニック動物がセレンテラジン利用ルシフェラーゼを発現する、前記方法。
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