JP6241014B2 - 新規化合物及び該化合物を含む脂肪滴及び／又は脂肪組織検出用試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、新規化合物並びに該化合物を含む脂肪滴及び／又は脂肪組織検出用試薬に関する。
脂肪は、生命活動に必要なエネルギー源になると同時に、体を構築する材料として重要な役割を果たしている。哺乳動物の脂肪の主な貯蔵部位は、脂肪細胞の細胞質である。脂肪細胞は、脂肪酸やコレステロールを取り込み、脂肪合成のための酵素類を生産するようになると、脂肪滴（脂肪の液滴）を蓄積し始める。脂肪滴は、徐々に融合して大きくなり、脂肪細胞の内部は、一個の大きな脂肪滴でほとんど埋め尽くされている（非特許文献１）。脂肪滴は、小胞体膜の酵素によって脂肪酸から合成されるトリアシルグリセロールや、コレステロールから合成されるコレステロールエステルなど中性脂肪から成る単分層の小滴である。
脂肪滴は、脂肪の蓄積・分解・放出を通じて個体レベルでのエネルギーバランスに重要な役割を担っている（非特許文献２）。脂肪滴の分解は、トリアシルグリセロールがリパーゼにより加水分解を受けることによって起こる。トリアシルグリセロールの加水分解で遊離した脂肪酸は、β酸化によるエネルギー生産、膜新生、リポタンパク質合成などに動員される。
自然環境に生息する動物は、得られる食べ物が多様で予測ができない状態と折り合いをつけなければならない。したがって、脂肪細胞は、環境変化によって脂肪の貯蓄・放出をする。脂肪組織に求められるのは、一生を通じ、栄養分の供給量に応じて組織の量を加減する機能である。この機能は我々の祖先にとっては、極めて重要であった。しかしながら、現在の食事事情に恵まれた先進国では、肥満の原因として問題になっている。肥満はメタボリックシンドロームの最大の危険因子である。肥満の二次的な結果として、あるいはそれ以外の原因で、脂肪組織以外の組織に脂肪が異常蓄積すると、それらの組織の機能不全を招くとともに、糖尿病や動脈硬化などの発症につながる。また、脂肪滴は、Ｃ型肝炎ウイルスなどの複製、クラミジアなどの増殖に関与している。脂肪滴の形成・成長・分解のメカニズムが詳細に解明されることによって、これらの疾患の診断・治療に寄与する新たな研究展開が期待されることから、現在も、細胞レベルから個体レベルにわたって脂肪滴研究が、精力的に展開されている。そのため、生きた細胞内や個体内の脂肪滴の動態を観察できる分子プローブの開発は重要である。
蛍光イメージング法は、生きた細胞内や個体内の脂肪滴の動態を観察するために、広く用いられる重要なツールとなっている。脂肪滴は機能的および形態学的に多様性のある亜集団を形成するので、すべての脂肪滴を染色するための単一のマーカーはない。それゆえ、脂肪滴を視覚化するための信頼できる唯一の方法は脂肪親和性の強い分子で脂肪滴の核部分（脂質エステル）を染色することである。現在汎用されている脂肪滴検出用試薬（脂肪滴検出用プローブ）としては、ナイルレッドおよびＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３等が挙げられる（非特許文献３〜６）。
しかしながら、ナイルレッドは、強いソルバトクロミズム（溶媒の極性に応じて最大吸収波長が異なる現象）により吸収波長領域が４５０〜５６０ｎｍと大きく変化するため不確定になる。また、脂肪滴の形成等、動態を詳細に観察するために、しばしば脂肪滴核以外にも脂肪滴膜や細胞核等の多重染色を用いる必要があるが、ナイルレッドは広い蛍光波長（グリーン、イエロー、オレンジ、レッド）をもつため、このような多重染色観察が難しい。また、ナイルレッドは、水溶液下において蛍光強度が低く、疎水性環境下において高い蛍光強度を示すオフ／オン型蛍光試薬であるが、細胞内でバックグラウンド蛍光を発することも問題となる。
一方、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３は、ナイルレッドと異なり、環境応答性ではなく、常に約５００ｎｍ付近に安定した蛍光を与える。また、その疎水性構造のため細胞内において脂肪滴などの疎水性部分に分布しやすい。そのため、オフ／オン機能がなくても脂肪滴検出試薬としての機能を果たすことができる。しかしながら、一般的に、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３は、その染色のために、細胞或いは組織を固定し洗浄操作を行う必要がある。そのため、生きた個体のイメージング等に応用できない。
従って、従来の化合物よりも脂肪滴及び／又は脂肪細胞を特異的に検出することのできる化合物に対する大きな需要が存在する。
一方、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３は、ナイルレッドと異なり、環境応答性ではなく、常に約５００ｎｍ付近に安定した蛍光を与える。また、その疎水性構造のため細胞内において脂肪滴などの疎水性部分に分布しやすい。そのため、オフ／オン機能がなくても脂肪滴検出試薬としての機能を果たすことができる。しかしながら、一般的に、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３は、その染色のために、細胞或いは組織を固定し洗浄操作を行う必要がある。そのため、生きた個体のイメージング等に応用できない。
従って、従来の化合物よりも脂肪滴及び／又は脂肪細胞を特異的に検出することのできる化合物に対する大きな需要が存在する。
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本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、脂肪滴及び／又は脂肪組織を特異的に検出することのできる新規化合物を提供することを目的とする。
本発明者は、鋭意検討の結果、一般式（Ｉ）で表される化合物を用いることにより、従来の脂肪滴検出用蛍光試薬よりも脂肪滴及び／又は脂肪細胞を特異的に検出することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
＜１＞ 下記一般式（Ｉ）で表される化合物：
式中、
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ1は、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ2は、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ3は、Ｒ1が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；
Ｒ4は、Ｒ2が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；且つ
Ｘは下記式（ＩＩ）で表される基である：
式中、
Ｒ5はそれぞれ独立して、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-4アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-4アルキル基、又はＣＮを表し； ｎは、１〜５の整数を表し；
但し、式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が、−０．２４０〜−０．１９０の範囲内にあることを条件とする。
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ1は、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ2は、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ3は、Ｒ1が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；
Ｒ4は、Ｒ2が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；且つ
Ｘは下記式（ＩＩ）で表される基である：
Ｒ5はそれぞれ独立して、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-4アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-4アルキル基、又はＣＮを表し； ｎは、１〜５の整数を表し；
但し、式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が、−０．２４０〜−０．１９０の範囲内にあることを条件とする。
＜２＞ Ｘが下記式（ＩＩＩ）で表される基である、上記＜１＞に記載の化合物：
（式中、
Ｒ6は、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-2アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-2アルキル基、又はＣＮを表し、
Ｒ7は、水素原子又はＮＯ2を表し、
但し、Ｒ6及びＲ7の両方が共にＮＯ2ではないことを条件とする）。
＜３＞ Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立して、Ｃ1-4アルキル基を表し、Ｒ3及びＲ4が水素原子を表す、上記＜１＞又は＜２＞に記載の化合物。
＜４＞ Ｘが下記からなる群から選択される基である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の化合物。
＜５＞ Ｘが下記の基である、上記＜４＞に記載の化合物。
＜６＞ 上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の化合物を含む、脂肪滴及び／又は脂肪組織の検出用試薬。
＜７＞ 上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程を含む、細胞内の脂肪滴を検出する方法。
＜８＞ 上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の化合物を、生きている生物個体内（ヒトを除く）に投与する工程を含む、生物個体内に存在する脂肪組織を検出する方法。
＜９＞ 脂肪滴形成阻害剤の候補化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程、及び
上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の化合物を、該細胞に添加する工程、
を含む、脂肪滴形成阻害剤を探索する方法。
Ｒ6は、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-2アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-2アルキル基、又はＣＮを表し、
Ｒ7は、水素原子又はＮＯ2を表し、
但し、Ｒ6及びＲ7の両方が共にＮＯ2ではないことを条件とする）。
＜３＞ Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立して、Ｃ1-4アルキル基を表し、Ｒ3及びＲ4が水素原子を表す、上記＜１＞又は＜２＞に記載の化合物。
＜４＞ Ｘが下記からなる群から選択される基である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の化合物。
＜７＞ 上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程を含む、細胞内の脂肪滴を検出する方法。
＜８＞ 上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の化合物を、生きている生物個体内（ヒトを除く）に投与する工程を含む、生物個体内に存在する脂肪組織を検出する方法。
＜９＞ 脂肪滴形成阻害剤の候補化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程、及び
上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の化合物を、該細胞に添加する工程、
を含む、脂肪滴形成阻害剤を探索する方法。
本発明によれば、細胞内に含まれる脂肪滴を特異的に検出することのできる新規化合物を提供することができる。
また、該化合物は、生物個体中での脂肪組織をも特異的に検出することができる。
さらには、該化合物は、長時間蛍光シグナルが維持されるため、脂肪滴形成阻害剤の効果を継時的に観察することもでき、脂肪滴形成阻害剤のスクリーニングに利用することができる。
また、該化合物は、生物個体中での脂肪組織をも特異的に検出することができる。
さらには、該化合物は、長時間蛍光シグナルが維持されるため、脂肪滴形成阻害剤の効果を継時的に観察することもでき、脂肪滴形成阻害剤のスクリーニングに利用することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜＜定義＞＞
本明細書及び特許請求の範囲において、脂肪滴とは、脂肪を蓄積した涙滴状の細胞内構造物をする（図１参照）。
本明細書及び特許請求の範囲において、脂肪細胞とは、細胞質内に脂肪滴を含む細胞を意味する。
本明細書及び特許請求の範囲において、脂肪滴形成阻害剤とは、脂肪滴の形成を阻害することのできる物質を意味する。例えば、脂肪滴の構成成分であるトリグリセライドの形成を阻害する物質、細胞への脂肪酸の吸収を阻害する物質、及び脂肪酸の合成を阻害する物質などが挙げられる。
本明細書及び特許請求の範囲において、アルキル基は直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。また、例えば、Ｃ1-4アルキル基とは、炭素数１〜４のアルキル基を意味する。
本明細書及び特許請求の範囲において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を含む概念である。
＜＜定義＞＞
本明細書及び特許請求の範囲において、脂肪滴とは、脂肪を蓄積した涙滴状の細胞内構造物をする（図１参照）。
本明細書及び特許請求の範囲において、脂肪細胞とは、細胞質内に脂肪滴を含む細胞を意味する。
本明細書及び特許請求の範囲において、脂肪滴形成阻害剤とは、脂肪滴の形成を阻害することのできる物質を意味する。例えば、脂肪滴の構成成分であるトリグリセライドの形成を阻害する物質、細胞への脂肪酸の吸収を阻害する物質、及び脂肪酸の合成を阻害する物質などが挙げられる。
本明細書及び特許請求の範囲において、アルキル基は直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。また、例えば、Ｃ1-4アルキル基とは、炭素数１〜４のアルキル基を意味する。
本明細書及び特許請求の範囲において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を含む概念である。
＜＜化合物＞＞
本発明の第１の態様は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。後に詳述するように、該化合物は、脂肪滴及び／又は脂肪組織を検出する試薬として非常に有用である。
本発明の第１の態様は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。後に詳述するように、該化合物は、脂肪滴及び／又は脂肪組織を検出する試薬として非常に有用である。
式中、
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ1は、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ2は、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ3は、Ｒ1が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；
Ｒ4は、Ｒ2が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；且つ
Ｘは下記式（ＩＩ）で表される基である：
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ1は、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ2は、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ3は、Ｒ1が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；
Ｒ4は、Ｒ2が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；且つ
Ｘは下記式（ＩＩ）で表される基である：
式中、
Ｒ5はそれぞれ独立して、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-4アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-4アルキル基、又はＣＮを表し； ｎは、１〜５の整数を表し；
但し、式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子（一般式（Ｉ）の−ＳＯ2基と結合する炭素原子）の電子密度が、−０．２４０〜−０．１９０の範囲内にあることを条件とする。
Ｒ5はそれぞれ独立して、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-4アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-4アルキル基、又はＣＮを表し； ｎは、１〜５の整数を表し；
但し、式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子（一般式（Ｉ）の−ＳＯ2基と結合する炭素原子）の電子密度が、−０．２４０〜−０．１９０の範囲内にあることを条件とする。
一般式（Ｉ）において、Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは、Ｒ1は、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員（好ましくは５〜６員）の環を形成していてもよい。
これらのなかでも、Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基であることが好ましく、Ｃ1-2アルキル基であることがより好ましく、エチル基であることがさらにより好ましい。
これらのなかでも、Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基であることが好ましく、Ｃ1-2アルキル基であることがより好ましく、エチル基であることがさらにより好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは、Ｒ2は、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよい。
これらのなかでも、Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基であることが好ましく、Ｃ1-2アルキル基であることがより好ましく、エチル基であることがさらにより好ましい。
Ｒ1が、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していないとき、Ｒ3は水素原子である。Ｒ3は水素原子であることが好ましい。
Ｒ2が、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していないとき、Ｒ4は水素原子である。Ｒ4は水素原子であることが好ましい。
これらのなかでも、Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基であることが好ましく、Ｃ1-2アルキル基であることがより好ましく、エチル基であることがさらにより好ましい。
Ｒ1が、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していないとき、Ｒ3は水素原子である。Ｒ3は水素原子であることが好ましい。
Ｒ2が、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していないとき、Ｒ4は水素原子である。Ｒ4は水素原子であることが好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｘは下記式（ＩＩ）で表される基である。
式中、
Ｒ5はそれぞれ独立して、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-4アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-4アルキル基、又はＣＮを表し； ｎは、１〜５の整数を表し；
但し、式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が、−０．２４０〜−０．１９０の範囲内にあることを条件とする。
Ｒ5はそれぞれ独立して、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-4アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-4アルキル基、又はＣＮを表し； ｎは、１〜５の整数を表し；
但し、式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が、−０．２４０〜−０．１９０の範囲内にあることを条件とする。
式（ＩＩ）中、Ｒ5はそれぞれ独立して、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-2アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-2アルキル基、又はＣＮであることが好ましく、ＮＯ2、ハロゲン原子、ＣＦ3、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3基、又はＣＮであることがより好ましい。
また、Ｒ5は、式（ＩＩ）のベンゼン環の２位及び／又は４位に結合していることが好ましく、４位に結合していることがより好ましい。
式（ＩＩ）中、ｎは、１〜３が好ましく、１〜２がより好ましく、１が最も好ましい。
また、Ｒ5は、式（ＩＩ）のベンゼン環の２位及び／又は４位に結合していることが好ましく、４位に結合していることがより好ましい。
式（ＩＩ）中、ｎは、１〜３が好ましく、１〜２がより好ましく、１が最も好ましい。
式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度は、−０．２４０〜−０．１９０である。なかでも、−０．２２０〜−０．１９５が好ましく、−０．２１５〜−０．１９５がより好ましく、−０．２１０〜−０．２００が特に好ましい。
式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が、上記範囲内になるようにＲ5の各置換基の種類及び結合位置を選択することにより、得られる化合物は、脂肪滴及び／又は脂肪細胞に対して特異的に蛍光を発しやすくなり、脂肪滴及び／又は脂肪細胞の特異的に検出することができる。
また、Ｘは、下記式（ＩＩＩ）で表される基であることが好ましい。
式（ＩＩ）におけるベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が、上記範囲内になるようにＲ5の各置換基の種類及び結合位置を選択することにより、得られる化合物は、脂肪滴及び／又は脂肪細胞に対して特異的に蛍光を発しやすくなり、脂肪滴及び／又は脂肪細胞の特異的に検出することができる。
また、Ｘは、下記式（ＩＩＩ）で表される基であることが好ましい。
式（ＩＩＩ）中、Ｒ6は、ＮＯ2、ハロゲン原子、少なくとも水素原子の１部がハロゲン原子に置換されたＣ1-2アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ1-2アルキル基、又はＣＮを表し、Ｒ7は、水素原子又はＮＯ2を表す。但し、Ｒ6及びＲ7の両方が共にＮＯ2ではないことを条件とする。
Ｒ6は、好ましくはＮＯ2、ハロゲン原子、ＣＦ3、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3、又はＣＮであり、より好ましくはＮＯ2、ハロゲン原子、又はＣＦ3であり、最も好ましくはＮＯ2である。
Ｒ7は、好ましくは水素原子である。
Ｘは、より好ましくは下記からなる群から選択される基である。
Ｒ6は、好ましくはＮＯ2、ハロゲン原子、ＣＦ3、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3、又はＣＮであり、より好ましくはＮＯ2、ハロゲン原子、又はＣＦ3であり、最も好ましくはＮＯ2である。
Ｒ7は、好ましくは水素原子である。
Ｘは、より好ましくは下記からなる群から選択される基である。
これらの中でも、Ｘは、下記からなる群から選択される基であることがより好ましい。
Ｘは、さらにより好ましくは、下記からなる群から選択される基である。
＜＜脂肪滴及び又は脂肪組織検出用試薬＞＞
本発明の第２の態様は、上記第１の態様の化合物を含む、脂肪滴及び／又は脂肪組織の検出用試薬（プローブ）である。
該検出用試薬は、第１の態様の化合物のみから構成されていてもよく、脂肪滴及び又は脂肪組織検出用試薬として用いられ得る本発明の化合物以外の化合物との混合物の形態であってもよい。
本発明の化合物以外の化合物としては、ナイルレッド、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＬＤ４５０、リピッドグリーン（Ｌｉｐｉｄ Ｇｒｅｅｎ）、ＳＦ４４などが挙げられる。
本発明の第２の態様は、上記第１の態様の化合物を含む、脂肪滴及び／又は脂肪組織の検出用試薬（プローブ）である。
該検出用試薬は、第１の態様の化合物のみから構成されていてもよく、脂肪滴及び又は脂肪組織検出用試薬として用いられ得る本発明の化合物以外の化合物との混合物の形態であってもよい。
本発明の化合物以外の化合物としては、ナイルレッド、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＬＤ４５０、リピッドグリーン（Ｌｉｐｉｄ Ｇｒｅｅｎ）、ＳＦ４４などが挙げられる。
＜＜脂肪滴の検出方法＞＞
本発明の第３の態様は、上記第１の態様の化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程を含む、細胞内の脂肪滴を検出する方法である。
本発明の化合物は、細胞内に存在する脂肪滴を特異的に検出することが出来る。したがって、脂肪滴を検出するための試薬として非常に有用である。
本発明における細胞内に存在する脂肪滴を検出する方法は、第１の態様の化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程を含む。その後、本発明の化合物の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡等により観測することにより、細胞内に含まれる脂肪滴を検出することができる。
本発明の化合物又はその塩の添加量は、使用する細胞や脂肪滴の割合などによっても変化し得るが、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭの終濃度で細胞に添加することができる。
本発明の化合物を溶媒に溶解させてから細胞に添加する場合、該溶媒として、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）用いることが出来る。
本発明の化合物を添加する細胞としては、脂肪滴を含む細胞であれば特に制限はなく、例えば３Ｔ３−Ｌ１細胞、単離脂肪細胞が挙げられる。また、脂肪滴を含まない細胞又は脂肪滴の含有量が少ない細胞中に人為的に脂肪滴を形成させた細胞を用いてもよい。脂肪滴を含まない細胞又は脂肪滴の含有量が少ない細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＵＥＥＴ−１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。また、脂肪滴を形成させる方法としては、例えば、オレイン酸を細胞に添加する方法、インスリン、ＩＢＭＸ，ＤＥＸのカクテルを細胞に添加することにより脂肪滴を誘導する方法が挙げられる。
本発明の第３の態様は、上記第１の態様の化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程を含む、細胞内の脂肪滴を検出する方法である。
本発明の化合物は、細胞内に存在する脂肪滴を特異的に検出することが出来る。したがって、脂肪滴を検出するための試薬として非常に有用である。
本発明における細胞内に存在する脂肪滴を検出する方法は、第１の態様の化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程を含む。その後、本発明の化合物の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡等により観測することにより、細胞内に含まれる脂肪滴を検出することができる。
本発明の化合物又はその塩の添加量は、使用する細胞や脂肪滴の割合などによっても変化し得るが、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭの終濃度で細胞に添加することができる。
本発明の化合物を溶媒に溶解させてから細胞に添加する場合、該溶媒として、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）用いることが出来る。
本発明の化合物を添加する細胞としては、脂肪滴を含む細胞であれば特に制限はなく、例えば３Ｔ３−Ｌ１細胞、単離脂肪細胞が挙げられる。また、脂肪滴を含まない細胞又は脂肪滴の含有量が少ない細胞中に人為的に脂肪滴を形成させた細胞を用いてもよい。脂肪滴を含まない細胞又は脂肪滴の含有量が少ない細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＵＥＥＴ−１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。また、脂肪滴を形成させる方法としては、例えば、オレイン酸を細胞に添加する方法、インスリン、ＩＢＭＸ，ＤＥＸのカクテルを細胞に添加することにより脂肪滴を誘導する方法が挙げられる。
＜＜脂肪組織の検出方法＞＞
本発明の第４の態様は、上記第１の態様の化合物を、生きている生物個体内に投与する工程を含む、生きている生物個体に存在する脂肪組織を検出する方法である。
本発明の化合物は、生きている生物個体内（生体内）の脂肪組織をも特異的に検出することができる。したがって、生体内の脂肪組織を検出するための試薬として非常に有用である。生体内の脂肪組織としては、皮下脂肪、内臓脂肪、異所性脂肪（例えば、筋肉、肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの臓器に蓄積する脂肪）などが挙げられる。
本発明における生きている生物個体中の脂肪組織を検出する方法は、本発明の化合物を、該生物個体に投与する工程を含む。その後、倒立共焦点顕微鏡を用いた生体分子イメージング手法を用いて本発明の化合物の蛍光シグナルを観測することにより、生物個体を固定化することなく生きた状態で、生体内の脂肪組織を検出することができる。
本発明の化合物の投与形態としては、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与が挙げられる。
また、本発明の化合物の投与量は、投与対象となる動物、投与形態によっても異なるが、例えば、０．０１〜１．０μＭ／ｋｇ体重、好ましくは０．０５〜０．５μＭ／ｋｇ体重の範囲で該化合物を投与することができる。
本発明の化合物を溶媒に溶解させてから生体内に投与する場合、該溶媒としては、例えば、ＤＭＳＯなどを用いることが出来る。
投与対象となる生物個体としては、特に限定されず、例えば、哺乳動物（マウス、ヒト、ブタ、イヌ、ウサギなど）を含む脊椎動物や無脊椎動物が挙げられる。また、投与対象にはヒトが含まれていても含まれていなくてもよい。
本発明の第４の態様は、上記第１の態様の化合物を、生きている生物個体内に投与する工程を含む、生きている生物個体に存在する脂肪組織を検出する方法である。
本発明の化合物は、生きている生物個体内（生体内）の脂肪組織をも特異的に検出することができる。したがって、生体内の脂肪組織を検出するための試薬として非常に有用である。生体内の脂肪組織としては、皮下脂肪、内臓脂肪、異所性脂肪（例えば、筋肉、肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの臓器に蓄積する脂肪）などが挙げられる。
本発明における生きている生物個体中の脂肪組織を検出する方法は、本発明の化合物を、該生物個体に投与する工程を含む。その後、倒立共焦点顕微鏡を用いた生体分子イメージング手法を用いて本発明の化合物の蛍光シグナルを観測することにより、生物個体を固定化することなく生きた状態で、生体内の脂肪組織を検出することができる。
本発明の化合物の投与形態としては、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与が挙げられる。
また、本発明の化合物の投与量は、投与対象となる動物、投与形態によっても異なるが、例えば、０．０１〜１．０μＭ／ｋｇ体重、好ましくは０．０５〜０．５μＭ／ｋｇ体重の範囲で該化合物を投与することができる。
本発明の化合物を溶媒に溶解させてから生体内に投与する場合、該溶媒としては、例えば、ＤＭＳＯなどを用いることが出来る。
投与対象となる生物個体としては、特に限定されず、例えば、哺乳動物（マウス、ヒト、ブタ、イヌ、ウサギなど）を含む脊椎動物や無脊椎動物が挙げられる。また、投与対象にはヒトが含まれていても含まれていなくてもよい。
＜＜脂肪滴形成阻害剤の候補化合物の探索方法＞＞
本発明の第５の態様は、脂肪滴形成阻害剤の候補化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程、及び第１の態様に記載の本発明の化合物を、該細胞に添加する工程を含む、脂肪滴形成阻害剤を探索する方法である。
本発明の化合物は、脂肪滴を特異的に検出することができ、且つ、長時間にわたって蛍光シグナルを維持することができる。したがって、脂肪滴の形成を阻害する化合物及び／又は組成物（すなわち、脂肪滴形成阻害剤）を探索するために好適に用いることができる。
本発明の探索方法は、脂肪滴形成阻害剤の候補化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程、及び第１の態様の化合物を、該細胞に添加する工程を含む。その後、蛍光顕微鏡等を用いて、本発明の化合物の蛍光シグナルを観測する。脂肪滴形成阻害能のある化合物を添加した細胞では、脂肪滴が形成されにくくなるため、第１の態様の化合物は添加するが脂肪滴形成阻害剤の候補化合物は添加しない場合（コントロール）よりも、本発明の化合物による脂肪滴部分からの蛍光シグナルが低減される。したがって、候補化合物を添加していないコントロールの細胞の蛍光シグナルに対して、候補化合物を添加した細胞の蛍光シグナルがどの程度低減したかを指標として、脂肪滴形成阻害剤の候補化合物群の中から脂肪滴形成阻害剤を探索することができる。
脂肪滴形成阻害剤の候補化合物としては、特に制限はなく、他の実験結果から脂肪滴形成阻害能を有すると予想される化合物を用いてもよく、脂肪滴形成阻害能を有するか否か不明な化合物を用いてもよい。例えば、市場で入手可能な化合物ライブラリーに含まれる種々の化合物を用いて、新規脂肪滴形成阻害剤を探索することができる。
本発明の第５の態様は、脂肪滴形成阻害剤の候補化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程、及び第１の態様に記載の本発明の化合物を、該細胞に添加する工程を含む、脂肪滴形成阻害剤を探索する方法である。
本発明の化合物は、脂肪滴を特異的に検出することができ、且つ、長時間にわたって蛍光シグナルを維持することができる。したがって、脂肪滴の形成を阻害する化合物及び／又は組成物（すなわち、脂肪滴形成阻害剤）を探索するために好適に用いることができる。
本発明の探索方法は、脂肪滴形成阻害剤の候補化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程、及び第１の態様の化合物を、該細胞に添加する工程を含む。その後、蛍光顕微鏡等を用いて、本発明の化合物の蛍光シグナルを観測する。脂肪滴形成阻害能のある化合物を添加した細胞では、脂肪滴が形成されにくくなるため、第１の態様の化合物は添加するが脂肪滴形成阻害剤の候補化合物は添加しない場合（コントロール）よりも、本発明の化合物による脂肪滴部分からの蛍光シグナルが低減される。したがって、候補化合物を添加していないコントロールの細胞の蛍光シグナルに対して、候補化合物を添加した細胞の蛍光シグナルがどの程度低減したかを指標として、脂肪滴形成阻害剤の候補化合物群の中から脂肪滴形成阻害剤を探索することができる。
脂肪滴形成阻害剤の候補化合物としては、特に制限はなく、他の実験結果から脂肪滴形成阻害能を有すると予想される化合物を用いてもよく、脂肪滴形成阻害能を有するか否か不明な化合物を用いてもよい。例えば、市場で入手可能な化合物ライブラリーに含まれる種々の化合物を用いて、新規脂肪滴形成阻害剤を探索することができる。
＜＜製造方法＞＞
本発明の化合物は、例えば、市販あるいは自ら合成した下記構造のナイルブルーを出発物質として、ジイソピルエチルアミン存在下、本発明のＲ5の置換基を有する芳香族スルホニル塩化物で処理することにより製造することができる。
本発明の化合物は、例えば、市販あるいは自ら合成した下記構造のナイルブルーを出発物質として、ジイソピルエチルアミン存在下、本発明のＲ5の置換基を有する芳香族スルホニル塩化物で処理することにより製造することができる。
次に、実施例により、本発明を具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
ナイルブルー（ＮＢ）の５位のアミノ基に求電子性が段階的に低くなる芳香族スルホニル制御ユニットとして、それぞれジニトロベンゼンスルホニル基（ＤＮｓ基）、モノニトロベンゼンスルホニル基（ＭＮｓ基）およびトシル基（Ｔｓ基）を導入した化合物（ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢ）をそれぞれ合成した（合成例１〜３）。
［合成例１］
＜ＤＮｓ−ＮＢ（比較例１の化合物）の合成＞
無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中で０℃に冷却されたナイルブルーＡ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、アルゴン雰囲気下でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）及び２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロライド（３８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。２０分後、該溶液を７０℃の周囲温度に温め、該温度で２時間攪拌した。この反応混合液をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ｉｎ ｖａｃｕｏエバポレート（真空内蒸発）させた。フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、青色の固体として下記構造式のＤＮｓ−ＮＢを得た（９．５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、１４％）。融点>400℃;1H NMR (500 MHz, ピリジン-d5): δ 9.13 (1H, s) 8.87-8.85 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.59-8.76 (1H, d, J = 9.0 Hz), 8.39-8.40 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.31-8.29 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.90 (1H, s), 7.90-7.89 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.79-7.76 (1H, dd, J = 8.5, 8.0 Hz), 7.70-7.67 (1H, dd, J = 8.0, 7.5 Hz), 7.00-6.98 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.69 (1H, s), 3.46-3.3.41 (4H, q, J = 7.0 Hz), 1.18-1.15 (6H, t, J = 7.0 Hz). 13C NMR (100 MHz, C5D5N-d5): δ 164.17, 153.28, 151.18, 147.90, 132.56, 132.24, 131.73, 131.44, 130.70, 129.77, 129.32, 129.19, 126.61, 120.73, 114.08, 101.28, 96.34, 79,79, 55.05, 45.74, 29.98, 28.81, 12.58. HRMS (ESI) m/z: 計算値C26H21N5O7SNa+ ([M+Na]+) 570.1083, 測定値570.1081.
［合成例１］
＜ＤＮｓ−ＮＢ（比較例１の化合物）の合成＞
無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中で０℃に冷却されたナイルブルーＡ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、アルゴン雰囲気下でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）及び２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロライド（３８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。２０分後、該溶液を７０℃の周囲温度に温め、該温度で２時間攪拌した。この反応混合液をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ｉｎ ｖａｃｕｏエバポレート（真空内蒸発）させた。フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、青色の固体として下記構造式のＤＮｓ−ＮＢを得た（９．５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、１４％）。融点>400℃;1H NMR (500 MHz, ピリジン-d5): δ 9.13 (1H, s) 8.87-8.85 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.59-8.76 (1H, d, J = 9.0 Hz), 8.39-8.40 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.31-8.29 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.90 (1H, s), 7.90-7.89 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.79-7.76 (1H, dd, J = 8.5, 8.0 Hz), 7.70-7.67 (1H, dd, J = 8.0, 7.5 Hz), 7.00-6.98 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.69 (1H, s), 3.46-3.3.41 (4H, q, J = 7.0 Hz), 1.18-1.15 (6H, t, J = 7.0 Hz). 13C NMR (100 MHz, C5D5N-d5): δ 164.17, 153.28, 151.18, 147.90, 132.56, 132.24, 131.73, 131.44, 130.70, 129.77, 129.32, 129.19, 126.61, 120.73, 114.08, 101.28, 96.34, 79,79, 55.05, 45.74, 29.98, 28.81, 12.58. HRMS (ESI) m/z: 計算値C26H21N5O7SNa+ ([M+Na]+) 570.1083, 測定値570.1081.
［合成例２］
＜ＭＮｓ−ＮＢ（実施例１の化合物）の合成＞
無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中で０℃に冷却されたナイルブルーＡ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、アルゴン雰囲気下でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）及び４−ニトロベンゼンスルホニルクロライド（３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、該溶液を周囲温度に温め、該温度で１０分間攪拌した。この反応混合液をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ｉｎ ｖａｃｕｏエバポレート（真空内蒸発）させた。フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、青色の固体として下記構造式のＭＮｓ−ＮＢを得た（９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１５％）。融点（Ｍｐ）：272 ℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) : δ 8.688.66 (1H, d, J = 8 Hz), 8.40-8.39 (1H, d, J = 8 Hz), 8.308.29 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.248.22 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.70 (1H, s), 7.697.67 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.587.55 (2H, dd, J = 8 Hz, 8 Hz), 6.82-6.81 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.55 (1H, s), 3.503.46 (4H, q, J = 6.5 Hz), 1.261.24 (6H, t, 6.5 Hz). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 164.23, 150.67, 149.56, 148.83, 147.25, 148.29, 132.01, 131.56, 131.52, 130.99, 130.76, 129.56, 128.07, 126.21, 123.99, 123.83, 112.87, 101.31, 96.92, 65.66, 46.08. HRMS (ESI) m/z: 計算値 C26H23N4O5S+ ([M+H]+) 503.1389, 測定値 503.1404.
＜ＭＮｓ−ＮＢ（実施例１の化合物）の合成＞
無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中で０℃に冷却されたナイルブルーＡ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、アルゴン雰囲気下でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）及び４−ニトロベンゼンスルホニルクロライド（３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、該溶液を周囲温度に温め、該温度で１０分間攪拌した。この反応混合液をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ｉｎ ｖａｃｕｏエバポレート（真空内蒸発）させた。フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、青色の固体として下記構造式のＭＮｓ−ＮＢを得た（９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１５％）。融点（Ｍｐ）：272 ℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) : δ 8.688.66 (1H, d, J = 8 Hz), 8.40-8.39 (1H, d, J = 8 Hz), 8.308.29 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.248.22 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.70 (1H, s), 7.697.67 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.587.55 (2H, dd, J = 8 Hz, 8 Hz), 6.82-6.81 (1H, d, J = 7.5 Hz), 6.55 (1H, s), 3.503.46 (4H, q, J = 6.5 Hz), 1.261.24 (6H, t, 6.5 Hz). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 164.23, 150.67, 149.56, 148.83, 147.25, 148.29, 132.01, 131.56, 131.52, 130.99, 130.76, 129.56, 128.07, 126.21, 123.99, 123.83, 112.87, 101.31, 96.92, 65.66, 46.08. HRMS (ESI) m/z: 計算値 C26H23N4O5S+ ([M+H]+) 503.1389, 測定値 503.1404.
［合成例３］
＜Ｔｓ−ＮＢ（比較例２）の合成＞
無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中で０℃に冷却されたナイルブルーＡ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、アルゴン雰囲気下でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）及び４−メチルベンゼンスルホニルクロライド（３４ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。１５分後、該溶液を８０℃の周囲温度に温め、該温度で３０分間攪拌した。この反応混合液をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ｉｎ ｖａｃｕｏエバポレート（真空内蒸発）させた。フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、青色の固体として下記構造式のＴｓ−ＮＢを得た（12 mg, 0.025 mmol, 21%）。融点（Ｍｐ）：246 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8.618.59(1H, d, J = 8.1 Hz), 8.448.41 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.957.92 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.267.23 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.667.49 (4H, m), 6.736.70 (1H, d, J = 8.7 Hz), 6.46 (1H, s), 3.473.30 (4H, q, J = 7.2 Hz), 2.35 (3H, s), 1.241.19 (6H, t, J = 6.9 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) : δ 163.52, 150.33, 147.16, 142.58, 140.24, 138.82, 131.76, 131.61, 131.29, 131.14, 131.11, 129.87, 129.38, 126.96, 126.35, 123.76, 112.29, 96.71, 45.91, 29.86, 21.59, 12.75. HRMS (ESI) m/z: 計算値 C27H26N3O3S+ ([M+H]+) 471.1171, 測定値 471.1695.
＜Ｔｓ−ＮＢ（比較例２）の合成＞
無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中で０℃に冷却されたナイルブルーＡ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、アルゴン雰囲気下でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）及び４−メチルベンゼンスルホニルクロライド（３４ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。１５分後、該溶液を８０℃の周囲温度に温め、該温度で３０分間攪拌した。この反応混合液をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ｉｎ ｖａｃｕｏエバポレート（真空内蒸発）させた。フラッシュカラムクロマトグラフィーで残渣を精製し、青色の固体として下記構造式のＴｓ−ＮＢを得た（12 mg, 0.025 mmol, 21%）。融点（Ｍｐ）：246 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8.618.59(1H, d, J = 8.1 Hz), 8.448.41 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.957.92 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.267.23 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.667.49 (4H, m), 6.736.70 (1H, d, J = 8.7 Hz), 6.46 (1H, s), 3.473.30 (4H, q, J = 7.2 Hz), 2.35 (3H, s), 1.241.19 (6H, t, J = 6.9 Hz). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) : δ 163.52, 150.33, 147.16, 142.58, 140.24, 138.82, 131.76, 131.61, 131.29, 131.14, 131.11, 129.87, 129.38, 126.96, 126.35, 123.76, 112.29, 96.71, 45.91, 29.86, 21.59, 12.75. HRMS (ESI) m/z: 計算値 C27H26N3O3S+ ([M+H]+) 471.1171, 測定値 471.1695.
上記合成例１〜３により得られた実施例１及び比較例１〜２の化合物、並びに市販の化合物としてナイルブルー（ＮＢ）（シグマアルドリッチ社）、ナイルレッド（シグマアルドリッチ社）、下記構造のＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３（インビトロジェン社）を用いて、種々の試験を行った。
なお、各試験例における試験方法は下記の通りである。
なお、各試験例における試験方法は下記の通りである。
［試験方法］
＜量子収量の測定＞
ＮＢ，ＤＮｓ−ＮＢ（比較例１）、ＭＮｓ−ＮＢ（実施例１）及びＴｓ−ＮＢ（比較例２）の１ｍＭ・ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）ストック溶液を調製した。１ｍＭ・ＤＭＳＯストック溶液の適切な希釈により調節された、所望の濃度における各化合物の各溶液の吸収スペクトルを得た（６１０ｎｍにおける吸光度＜０．０２）。蛍光の量子効率(φfl)を決定するために、蛍光スタンダードとして、メタノール（ＭｅＯＨ）中のクレシル・バイオレットを用いた(φ = 0.66)。以下の方程式から、蛍光の量子効率を得た（式中、Ｆは、各波長における蛍光強度を表し、Σ [F]は、蛍光強度の合計により求められる。）
φfl サンプル= φfl スタンダード Abs スタンダード Σ [F サンプル] / Abs サンプル Σ [F スタンダード]
＜量子収量の測定＞
ＮＢ，ＤＮｓ−ＮＢ（比較例１）、ＭＮｓ−ＮＢ（実施例１）及びＴｓ−ＮＢ（比較例２）の１ｍＭ・ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）ストック溶液を調製した。１ｍＭ・ＤＭＳＯストック溶液の適切な希釈により調節された、所望の濃度における各化合物の各溶液の吸収スペクトルを得た（６１０ｎｍにおける吸光度＜０．０２）。蛍光の量子効率(φfl)を決定するために、蛍光スタンダードとして、メタノール（ＭｅＯＨ）中のクレシル・バイオレットを用いた(φ = 0.66)。以下の方程式から、蛍光の量子効率を得た（式中、Ｆは、各波長における蛍光強度を表し、Σ [F]は、蛍光強度の合計により求められる。）
φfl サンプル= φfl スタンダード Abs スタンダード Σ [F サンプル] / Abs サンプル Σ [F スタンダード]
＜吸光度測定＞
１０μＭの試薬を含む各溶液において反応を行った。ＵＶ／ＶＩＳ分光法により吸光度スペクトルを観察した（V-550; JASCO）。４５０〜７５０ｎｍのスキャン範囲で吸光度を得た。
１０μＭの試薬を含む各溶液において反応を行った。ＵＶ／ＶＩＳ分光法により吸光度スペクトルを観察した（V-550; JASCO）。４５０〜７５０ｎｍのスキャン範囲で吸光度を得た。
＜蛍光測定＞
１μＭの試薬を含む各溶液において反応を行った。蛍光分光法により蛍光スペクトルを観察した（FP-6500; JASCO）。６２０〜７２０ｎｍのスキャン範囲で、６１０ｎｍの励起を有する蛍光を得た（励起バンド幅（excitation band）：３ｎｍ、蛍光バンド幅（emission band）：３ｎｍ、感度：中間（medium））。
１μＭの試薬を含む各溶液において反応を行った。蛍光分光法により蛍光スペクトルを観察した（FP-6500; JASCO）。６２０〜７２０ｎｍのスキャン範囲で、６１０ｎｍの励起を有する蛍光を得た（励起バンド幅（excitation band）：３ｎｍ、蛍光バンド幅（emission band）：３ｎｍ、感度：中間（medium））。
＜蛍光寿命測定＞
室温で、ＮＢ，ＤＮｓ−ＮＢ，ＭＮｓ−ＮＢ又はＴｓ−ＮＢを含む各溶液において、寿命測定を行った（吸収強度（absorbance intensity）< 0.02）（標準物質はLUDOXを使用した）。蛍光寿命測定装置（HORIBA TemPro-01, Nano LED-561）により蛍光寿命を観察した。
室温で、ＮＢ，ＤＮｓ−ＮＢ，ＭＮｓ−ＮＢ又はＴｓ−ＮＢを含む各溶液において、寿命測定を行った（吸収強度（absorbance intensity）< 0.02）（標準物質はLUDOXを使用した）。蛍光寿命測定装置（HORIBA TemPro-01, Nano LED-561）により蛍光寿命を観察した。
＜ＨｅＬａ細胞における脂肪滴の導入＞
（オレイン酸−ＢＳＡコンジュゲート）
ＨｅＬａ細胞に脂肪滴形成を誘導するために、オレイン酸−ＢＳＡ溶液の４ｍＭのストック溶液を調製した。０．１Ｍ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液１０ｍＬに、１．４ｇのＢＳＡを添加した。清潔なスクリューキャップのついたチューブに、オレイン酸を加え、これに１０ｍＬのＢＳＡ溶液を添加し、回転式振とう器を用いて混合した。ＢＳＡ溶液を添加すると曇りが生じたが、複合体形成が完了すると曇りは消失した。得られた複合体（コンジュゲート）を０．２２μｍのフィルターユニットに通し、４℃で保存した。
（脂肪滴の導入）
１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及びペニシリン／ストレプトマイシン（１×濃度）を含むＤＭＥＭ−低グルコース培地中でＨｅＬａ細胞を維持した。脂肪滴の導入のために、２４時間、３７℃、５％の二酸化炭素条件下で、２４ウェルプレートにＨｅＬａ細胞を２×１０4細胞の濃度で播いた。その後、２００μＭのオレイン酸−ＢＳＡコンジュゲートを該細胞に添加し、２４時間培養した。ネガティブコントロールの細胞は、オレイン酸−ＢＳＡコンジュゲートで処理していないＨｅＬａ細胞であった。指し示された時間後、ＮＢ、ＭＮｓ、ＭＮｓ、ＮＢ，ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３などの試薬で細胞を染色した。
（オレイン酸−ＢＳＡコンジュゲート）
ＨｅＬａ細胞に脂肪滴形成を誘導するために、オレイン酸−ＢＳＡ溶液の４ｍＭのストック溶液を調製した。０．１Ｍ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液１０ｍＬに、１．４ｇのＢＳＡを添加した。清潔なスクリューキャップのついたチューブに、オレイン酸を加え、これに１０ｍＬのＢＳＡ溶液を添加し、回転式振とう器を用いて混合した。ＢＳＡ溶液を添加すると曇りが生じたが、複合体形成が完了すると曇りは消失した。得られた複合体（コンジュゲート）を０．２２μｍのフィルターユニットに通し、４℃で保存した。
（脂肪滴の導入）
１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及びペニシリン／ストレプトマイシン（１×濃度）を含むＤＭＥＭ−低グルコース培地中でＨｅＬａ細胞を維持した。脂肪滴の導入のために、２４時間、３７℃、５％の二酸化炭素条件下で、２４ウェルプレートにＨｅＬａ細胞を２×１０4細胞の濃度で播いた。その後、２００μＭのオレイン酸−ＢＳＡコンジュゲートを該細胞に添加し、２４時間培養した。ネガティブコントロールの細胞は、オレイン酸−ＢＳＡコンジュゲートで処理していないＨｅＬａ細胞であった。指し示された時間後、ＮＢ、ＭＮｓ、ＭＮｓ、ＮＢ，ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３などの試薬で細胞を染色した。
＜フローサイトメトリー＞
サイトミックスＬＳＲ装置（Cytomics LSR instrument）(Beckman Coulter)を用いて、洗浄工程を経ることなく生ＨｅＬａ細胞懸濁液を直接分析した。以下の条件で蛍光シグナルを観察した。ＢＤ／ＬＳＲによる励起；アルゴン４８８ｎｍ／５３０／２８ＢＰ（BODIPY及びナイルレッド）、ヘリウム−ネオン６３３ｎｍ／６６０・１６ＢＰ（ＮＢ試薬）。
前方散乱（forward angle light scatter）（ＦＳＣ）、側方散乱（side angle light scatter）（ＳＳＣ）及び蛍光データを記録した。各測定について、１００００イベントよりも多く保存した。（脂肪滴を用いてあるいは用いずに）０．５μＭの試薬を用いて、１５分間３７℃でＨｅＬａ細胞の中で反応を行った。FLOWJOソフトウェア(FLOWJO)を用いてデータを分析した。
サイトミックスＬＳＲ装置（Cytomics LSR instrument）(Beckman Coulter)を用いて、洗浄工程を経ることなく生ＨｅＬａ細胞懸濁液を直接分析した。以下の条件で蛍光シグナルを観察した。ＢＤ／ＬＳＲによる励起；アルゴン４８８ｎｍ／５３０／２８ＢＰ（BODIPY及びナイルレッド）、ヘリウム−ネオン６３３ｎｍ／６６０・１６ＢＰ（ＮＢ試薬）。
前方散乱（forward angle light scatter）（ＦＳＣ）、側方散乱（side angle light scatter）（ＳＳＣ）及び蛍光データを記録した。各測定について、１００００イベントよりも多く保存した。（脂肪滴を用いてあるいは用いずに）０．５μＭの試薬を用いて、１５分間３７℃でＨｅＬａ細胞の中で反応を行った。FLOWJOソフトウェア(FLOWJO)を用いてデータを分析した。
＜ＵＥＥＴ−１２細胞の脂肪組織への分化＞
１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（１×濃度）を含むＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ−低グルコース培地（以下、間葉性幹細胞拡大培地（mesenchymal stem cell expansion medium）と呼ぶことがある）中で、３７℃、５％ＣＯ２濃度でＵＥＥＴ−１２細胞を培養した。脂肪組織に分化する前に、２４ウェルプレートに細胞を２×１０4cell/wellで播き、細胞がコンフルエントになるまで培養した。細胞がコンフルエントに達した後、脂質生成導入培地（adipogenesis induction medium）（１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭの３−イソブチル-１-メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及び１０μＭのインスリン）を含む１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ低グルコース培地）に置き換え、２日毎に培地交換しながら７日間培養した。７日後、脂質生成導入培地を脂質生成維持培地（１０μＭのインスリンを含む１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ低グルコース培地）に置き換え、さらに２日間培養した。再度脂質生成導入培地に置き換え、６日間培養した（２日毎に培地交換を行った）。その後、脂質生成維持培地に置き換え、さらに２日間培養した。脂肪滴を検出するために、ＮＢ，ＭＮｓ−ＮＢ，ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３の各試薬を用いて、細胞を染色した。ネガティブコントロールは、未分化の細胞を用いた。
１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（１×濃度）を含むＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ−低グルコース培地（以下、間葉性幹細胞拡大培地（mesenchymal stem cell expansion medium）と呼ぶことがある）中で、３７℃、５％ＣＯ２濃度でＵＥＥＴ−１２細胞を培養した。脂肪組織に分化する前に、２４ウェルプレートに細胞を２×１０4cell/wellで播き、細胞がコンフルエントになるまで培養した。細胞がコンフルエントに達した後、脂質生成導入培地（adipogenesis induction medium）（１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭの３−イソブチル-１-メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及び１０μＭのインスリン）を含む１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ低グルコース培地）に置き換え、２日毎に培地交換しながら７日間培養した。７日後、脂質生成導入培地を脂質生成維持培地（１０μＭのインスリンを含む１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ低グルコース培地）に置き換え、さらに２日間培養した。再度脂質生成導入培地に置き換え、６日間培養した（２日毎に培地交換を行った）。その後、脂質生成維持培地に置き換え、さらに２日間培養した。脂肪滴を検出するために、ＮＢ，ＭＮｓ−ＮＢ，ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３の各試薬を用いて、細胞を染色した。ネガティブコントロールは、未分化の細胞を用いた。
＜脂肪滴の生細胞染色＞
ＮＢ，ＭＮｓ−ＮＢ，ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を用いてＨｅＬａ細胞及びＵＥＥＦ−１２細胞を染色した。３７℃、５％ＣＯ2条件下、試薬（５μＭ）を細胞に添加し、で１５分間、インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した後、蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Gottingen, Germany）により細胞内脂肪滴を観察した。
ＮＢ，ＭＮｓ−ＮＢ，ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を用いてＨｅＬａ細胞及びＵＥＥＦ−１２細胞を染色した。３７℃、５％ＣＯ2条件下、試薬（５μＭ）を細胞に添加し、で１５分間、インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した後、蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Gottingen, Germany）により細胞内脂肪滴を観察した。
＜動物モデル＞
Charles River JapanからオスのC57BL/6Jマウスを得た。全てのマウスは１２時間の光と闇のサイクル下で育てられ、いつでも餌を食べることが出来る状態であった。マウスには、標準的な固形飼料（chow diet）（6%脂肪, Oriental Yeast）又は高脂肪食（D12492, 60 Kcal%脂肪, Research Diets）を与えた。全ての実験は東京大学動物実験倫理委員会（University of Tokyo Ethics Committee for Animal Experiments）により承認され、東京大学の動物実験ガイドラインに厳密に従った。
Charles River JapanからオスのC57BL/6Jマウスを得た。全てのマウスは１２時間の光と闇のサイクル下で育てられ、いつでも餌を食べることが出来る状態であった。マウスには、標準的な固形飼料（chow diet）（6%脂肪, Oriental Yeast）又は高脂肪食（D12492, 60 Kcal%脂肪, Research Diets）を与えた。全ての実験は東京大学動物実験倫理委員会（University of Tokyo Ethics Committee for Animal Experiments）により承認され、東京大学の動物実験ガイドラインに厳密に従った。
＜生肝臓／筋肉／脂肪組織イメージング＞
生肝臓、大腿四頭筋骨格筋（quadriceps skeletal muscles）及び精巣上体脂肪組織のイメージング方法のために、２５週齢の高脂肪食負荷肥満マウス（diet-induced-obese）及び同じ年齢の通常食痩せ型マウス（lean control mice）を用いた。
ｉｎ ｖｉｖｏの細胞動力学を視覚化するために、ウレタン（１．５ｇ／ｋｇ）を注射することによりマウスに麻酔をかけた。適度な深さの麻酔が得られた後、小さな切り込みを入れ、サリンで湿らせた。その後、この窓をラップで覆った。組織を体外に出すことなく、小さな窓（３ｍｍ以下）を介して生体内イメージングを行った。３７℃の体温を維持するために加熱パッドを用いた。
血液の流れ及び血球を視覚化するために、尾静脈を介してＦＩＴＣ−デキストラン（5 mg/kg体重、分子量150,000, Sigma）をマウスに注入し血球を視覚化した。さらに、核をｉｎ ｖｉｖｏで視覚化するため、Hoechst 33342 (1mM/kg体重, Invitrogen)を注入した。注入から１５分後、イメージングを行った。脂肪滴をｉｎ ｖｉｖｏで視覚化するために、ＤＭＳＯに溶かしたＭＮｓ−ＮＢを注入した(0.1 uM/kg体重)。レゾナンス共焦点スキャナー（resonance-scanning confocal microscopy (Nikon A1R)）用に備わっている倒立顕微鏡（Ti, Nikon）を用いて、高時空間解像度（high time and spatialresolution（160 nm/pixel））を有するイメージを得た。
各イメージにつき１秒あたり３０フレームで全ての連続イメージを得ている。使用したシステムは、405, 488, 561, 又は640nmの励起波長用の４種のレーザーラインを備えており、同時４波長励起、同時４波長測光により観察を行なった。
生肝臓、大腿四頭筋骨格筋（quadriceps skeletal muscles）及び精巣上体脂肪組織のイメージング方法のために、２５週齢の高脂肪食負荷肥満マウス（diet-induced-obese）及び同じ年齢の通常食痩せ型マウス（lean control mice）を用いた。
ｉｎ ｖｉｖｏの細胞動力学を視覚化するために、ウレタン（１．５ｇ／ｋｇ）を注射することによりマウスに麻酔をかけた。適度な深さの麻酔が得られた後、小さな切り込みを入れ、サリンで湿らせた。その後、この窓をラップで覆った。組織を体外に出すことなく、小さな窓（３ｍｍ以下）を介して生体内イメージングを行った。３７℃の体温を維持するために加熱パッドを用いた。
血液の流れ及び血球を視覚化するために、尾静脈を介してＦＩＴＣ−デキストラン（5 mg/kg体重、分子量150,000, Sigma）をマウスに注入し血球を視覚化した。さらに、核をｉｎ ｖｉｖｏで視覚化するため、Hoechst 33342 (1mM/kg体重, Invitrogen)を注入した。注入から１５分後、イメージングを行った。脂肪滴をｉｎ ｖｉｖｏで視覚化するために、ＤＭＳＯに溶かしたＭＮｓ−ＮＢを注入した(0.1 uM/kg体重)。レゾナンス共焦点スキャナー（resonance-scanning confocal microscopy (Nikon A1R)）用に備わっている倒立顕微鏡（Ti, Nikon）を用いて、高時空間解像度（high time and spatialresolution（160 nm/pixel））を有するイメージを得た。
各イメージにつき１秒あたり３０フレームで全ての連続イメージを得ている。使用したシステムは、405, 488, 561, 又は640nmの励起波長用の４種のレーザーラインを備えており、同時４波長励起、同時４波長測光により観察を行なった。
＜脂肪組織の間質血管フラクション（stromal vascular fraction）の培養＞
精巣上体の脂肪組織由来の間質血管（ＳＶ）フラクションを集め、コンフルエントになるまで培養した。過去に記載された方法（Am J Physiol Cell Physiol December 2006 vol. 291 no. 6 C1232-C1239）を若干修正した上で用いて、間質血管（ＳＶ）細胞を単離している。全身ヘパリン化後、一般的な麻酔条件下でマウスを犠牲にした。その後、精巣上体及び皮下の脂肪組織を取り出し、小さな断片に切り刻み、穏やかに攪拌しながら、コラゲナーゼ溶液（Tyrodeバッファー中の2 mg/mlコラゲナーゼtype 2 [Worthington]）中で２０分間培養した。消化処理された組織を遠心分離し、得られたＳＶフラクションを含むペレットをＰＢＳ中に再懸濁した後、７０μｍメッシュのフィルターでろ過した。その後、回収された細胞を、１０％ＦＢＳを加えたダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM））で２回洗浄した。デキサメタゾン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）及びインスリンを含む標準的な脂肪生成混合液中で該細胞を培養した。その状態で、脂肪滴の蓄積を観察するために、共焦点顕微鏡を用いて観察を行なった。
精巣上体の脂肪組織由来の間質血管（ＳＶ）フラクションを集め、コンフルエントになるまで培養した。過去に記載された方法（Am J Physiol Cell Physiol December 2006 vol. 291 no. 6 C1232-C1239）を若干修正した上で用いて、間質血管（ＳＶ）細胞を単離している。全身ヘパリン化後、一般的な麻酔条件下でマウスを犠牲にした。その後、精巣上体及び皮下の脂肪組織を取り出し、小さな断片に切り刻み、穏やかに攪拌しながら、コラゲナーゼ溶液（Tyrodeバッファー中の2 mg/mlコラゲナーゼtype 2 [Worthington]）中で２０分間培養した。消化処理された組織を遠心分離し、得られたＳＶフラクションを含むペレットをＰＢＳ中に再懸濁した後、７０μｍメッシュのフィルターでろ過した。その後、回収された細胞を、１０％ＦＢＳを加えたダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM））で２回洗浄した。デキサメタゾン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）及びインスリンを含む標準的な脂肪生成混合液中で該細胞を培養した。その状態で、脂肪滴の蓄積を観察するために、共焦点顕微鏡を用いて観察を行なった。
［試験例１］
これまでの報告された脂肪滴検出試薬の機能は、疎水性環境下でのオフ／オン機能を有するものか（ナイルレッドなど）、或いは生体中・細胞内において疎水性部分への分布が優位に起こる機能をもつもの（ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３など）に大別できる。この２つの機能を同時に併せ持つ試薬は、極めて有用であることが予想される。脂肪滴は、トリアシルグリセロールなどの疎水性の高い生体分子が集合した液滴である。そのため、試薬は、疎水性環境下でのみ蛍光が増強する性質が有効である。表１に示すように、各種トリアシルグリセロールが形成する脂肪滴の誘電率が報告されている。誘電率が低いほどその媒質の疎水性が高いことになる。各種トリアシルグリセロールの誘電率は、５以下の値を示している。一方、各種有機溶媒及び水の誘電率については表１に示す通りであり、クロロホルム、メタノール、エチレングリコール、アセトニトリルおよび水の誘電率は、それぞれ、４．８９、３２．３５、３１，６９、３６．００及び８０．１０である。つまり、脂肪滴に近い誘電率を示す溶媒は、クロロホルムとなる。そこで、脂肪滴検出蛍光試薬は、誘電率が低いクロロホルムで蛍光を増強し、他の誘電率が高いメタノールなどの溶媒で蛍光を増強しないものが高い特異性を示すと考えた。試薬のオフ／オン型機能を評価する際の一つの指針とした。
これまでの報告された脂肪滴検出試薬の機能は、疎水性環境下でのオフ／オン機能を有するものか（ナイルレッドなど）、或いは生体中・細胞内において疎水性部分への分布が優位に起こる機能をもつもの（ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３など）に大別できる。この２つの機能を同時に併せ持つ試薬は、極めて有用であることが予想される。脂肪滴は、トリアシルグリセロールなどの疎水性の高い生体分子が集合した液滴である。そのため、試薬は、疎水性環境下でのみ蛍光が増強する性質が有効である。表１に示すように、各種トリアシルグリセロールが形成する脂肪滴の誘電率が報告されている。誘電率が低いほどその媒質の疎水性が高いことになる。各種トリアシルグリセロールの誘電率は、５以下の値を示している。一方、各種有機溶媒及び水の誘電率については表１に示す通りであり、クロロホルム、メタノール、エチレングリコール、アセトニトリルおよび水の誘電率は、それぞれ、４．８９、３２．３５、３１，６９、３６．００及び８０．１０である。つまり、脂肪滴に近い誘電率を示す溶媒は、クロロホルムとなる。そこで、脂肪滴検出蛍光試薬は、誘電率が低いクロロホルムで蛍光を増強し、他の誘電率が高いメタノールなどの溶媒で蛍光を増強しないものが高い特異性を示すと考えた。試薬のオフ／オン型機能を評価する際の一つの指針とした。
［試験例２］
＜脂肪検出試薬の評価（分布特性）＞
次に、脂肪滴への選択的な分布特性を評価した。化合物の疎水性が高くなるほど脂肪滴への分布が有利になる。疎水性のパラメータとして、オクタノール・水分配計数ｌｏｇＰを用いることができる。ｌｏｇＰは、Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎのフラグメーション法を用いてＣｈｅｍＤｒａｗなどのソフトを用いて計算できる。ｌｏｇＰが高いほど脂肪滴への分布選択性が上がることが予想される。
＜脂肪検出試薬の評価（分布特性）＞
次に、脂肪滴への選択的な分布特性を評価した。化合物の疎水性が高くなるほど脂肪滴への分布が有利になる。疎水性のパラメータとして、オクタノール・水分配計数ｌｏｇＰを用いることができる。ｌｏｇＰは、Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎのフラグメーション法を用いてＣｈｅｍＤｒａｗなどのソフトを用いて計算できる。ｌｏｇＰが高いほど脂肪滴への分布選択性が上がることが予想される。
まず、これまでに報告されている脂肪滴検出試薬のｌｏｇＰを計算した（表２左欄）。
その結果、ＬＤ４５０が最も高く、４．３８を示し、ＬｉｐｉｄＧｒｅｅｎは最も低く２．９２を示した。次に、ナイルブルー（ＮＢ）、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢおよびＴｓ−ＮＢのｌｏｇＰを計算したところ、ナイルブルーが３．２を示したのに対して、誘導体であるＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢおよびＴｓ−ＮＢは、それぞれ５．９５、５．９９、５．１３とこれまでの試薬よりも高い値を示した（表２右欄）。ｌｏｇＰ値の計算結果は、これらＮＢ誘導体が脂肪滴への高い分布特異性を有することを支持した。
その結果、ＬＤ４５０が最も高く、４．３８を示し、ＬｉｐｉｄＧｒｅｅｎは最も低く２．９２を示した。次に、ナイルブルー（ＮＢ）、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢおよびＴｓ−ＮＢのｌｏｇＰを計算したところ、ナイルブルーが３．２を示したのに対して、誘導体であるＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢおよびＴｓ−ＮＢは、それぞれ５．９５、５．９９、５．１３とこれまでの試薬よりも高い値を示した（表２右欄）。ｌｏｇＰ値の計算結果は、これらＮＢ誘導体が脂肪滴への高い分布特異性を有することを支持した。
［試験例３］
＜ＮＢ誘導体を用いた光化学特性の解析＞
合成した各ＮＢ誘導体の光化学特性を解析した。第一に、誘電率の異なる各種溶媒中におけるＮＢ試薬（ＮＢ，ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ、Ｔｓ−ＮＢ）の吸収スペクトルを測定した。溶媒は、メタノール、エチレングリコール、アセトニトリル及びクロロホルムを用いた。図２に示すように、ＮＢ、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢは、クロロホルム溶液下を除いて、どれもほとんど同じスペクトルの形状を示した。
＜ＮＢ誘導体を用いた光化学特性の解析＞
合成した各ＮＢ誘導体の光化学特性を解析した。第一に、誘電率の異なる各種溶媒中におけるＮＢ試薬（ＮＢ，ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ、Ｔｓ−ＮＢ）の吸収スペクトルを測定した。溶媒は、メタノール、エチレングリコール、アセトニトリル及びクロロホルムを用いた。図２に示すように、ＮＢ、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢは、クロロホルム溶液下を除いて、どれもほとんど同じスペクトルの形状を示した。
各試薬の最大吸光波長のモル吸光係数を算出した（表３）。各試薬の値を比較したところ、ＭＮｓ−ＮＢが最も低い値を示した。また、クロロホルム溶媒下の試薬の値は、メタノールより高い値を示した。これは、親水性溶液中では、各試薬の基底状態において複数の平衡構造が存在するためであると予想される。極性の高いメタノール中では、カチオン性の平衡構造が溶解するのに有利である。一方、クロロホルム中では電荷のない分子構造のみが存在すると考えられる。いずれの試薬も疎水性の高いクロロホルム溶液中で青色シフトを示しており、特にＭＮｓ−ＮＢとＴｓ−ＮＢにおいて顕著である（図２）。疎水性溶媒の青色シフトは、基底状態構造よりも励起状態構造の双極子遷移モーメントが大きいことを示している。これは、ＮＢがπ−π励起状態を取っているためであると予想される。
次に、ナイルブルー（ＮＢ）、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢおよびＴｓ−ＮＢの各試薬の蛍光スペクトルを解析した（図３）。溶媒は、水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、メタノール、アセトニトリル、エチレングリコール及びクロロホルムを用いた。水中においてはＮＢ、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢのどの試薬もその蛍光強度は低かった。最も極性の低いクロロホルム溶液中においては、ＤＮｓ−ＮＢの蛍光は極めて弱いが、他のＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢの蛍光は強かった。さらに、誘電率３０付近のメタノール、アセトニトリル、エチレングリコール溶液中においては、ＮＢとＴｓ−ＮＢは蛍光を与えるが、ＤＮｓ−ＮＢ及びＭＮｓ−ＮＢはほとんど蛍光を与えなかった。
試験例１の結果から、脂肪滴検出試薬の設計指針として、誘電率の低いクロロホルム溶液でのみ蛍光発光が強くなり、それよりも誘電率の高い溶媒では蛍光発光が弱くなる光化学特性が望まれる。したがって、蛍光スペクトル解析の結果からは、ＭＮｓ−ＮＢがこの設計指針に合致する試薬であるといえる。
試験例１の結果から、脂肪滴検出試薬の設計指針として、誘電率の低いクロロホルム溶液でのみ蛍光発光が強くなり、それよりも誘電率の高い溶媒では蛍光発光が弱くなる光化学特性が望まれる。したがって、蛍光スペクトル解析の結果からは、ＭＮｓ−ＮＢがこの設計指針に合致する試薬であるといえる。
［試験例４］
＜ＮＢ誘導体の蛍光発光特性の解析＞
次に、蛍光発光特性を明らかにするために詳細なスペクトル解析を行った。各試薬の各溶媒における蛍光量子収率（φf）及び蛍光寿命（τf）を測定した（表４）。
＜ＮＢ誘導体の蛍光発光特性の解析＞
次に、蛍光発光特性を明らかにするために詳細なスペクトル解析を行った。各試薬の各溶媒における蛍光量子収率（φf）及び蛍光寿命（τf）を測定した（表４）。
図４に蛍光発光における吸収、発光とエネルギーの関係を概略した。基底状態にある分子（Ｓ0）は、光吸収（ｈｖ）によって電子遷移が起こり、１０-15秒程度の時間で励起状態（Ｓ1）に変化する。その後、励起状態にある分子が、基底状態に戻るときに蛍光発光が起こる。蛍光スペクトルで得られる単位濃度当たりの蛍光強度は、モル吸光係数（ε）と蛍光量子収率（φf）に比例する（蛍光強度∝モル吸光係数（ε）×蛍光量子収率（φf））。この蛍光強度がいわゆる蛍光化合物の感度に当たるものである。蛍光量子収率（φf）は、放射緩和速度定数（ｋr）と無放射緩和速度定数（ｋnr）の関係式（１）において表される。すなわち、放射緩和速度定数が大きくなるほど、また無放射緩和速度定数が小さくなるほど蛍光量子収率は高くなる。さらに、実験で測定できる蛍光寿命（τf）は、放射緩和速度定数（ｋf）と無放射緩和速度定数（ｋnr）と式（２）の関係にある。
蛍光量子収率と蛍光寿命の実験値を用いて、式（１）と式（２）から放射緩和速度定数（ｋr）と無放射緩和速度定数（ｋnr）の値を求めることができる。その結果を表５に示す。
蛍光量子収率と蛍光寿命の実験値を用いて、式（１）と式（２）から放射緩和速度定数（ｋr）と無放射緩和速度定数（ｋnr）の値を求めることができる。その結果を表５に示す。
メタノール中において、各ＮＢ試薬の蛍光強度がクロロホルム中と比べて低い値となっている（図３）。この結果は、蛍光寿命が短いことと、蛍光量子収率が低いことの両方に起因する（表４）。一方、各種有機溶媒において、各ＮＢ試薬の蛍光強度は変化しているが、モル吸光係数はほぼ同じ値を示している。これは、各有機溶媒中において、励起効率はほぼ同じであるが、蛍光量子収率が変化することから起こる。蛍光量子収率の変化は、各有機溶媒において放射緩和速度と無放射緩和速度の割合が変化することから起こっている。例えば、ＭＮｓ−ＮＢの蛍光量子収率はクロロホルム、メタノールで０．２１、０．０３と低下するのに対して、その放射緩和速度定数も０．０５５、０．０３０と低下する。一方、その無放射緩和速度定数は、０．２０３、０．９６０と増加する。特に、ＭＮｓ−ＮＢはメタノール中において無放射緩和の経路が極めて優勢であることがわかる。ＤＮｓ−ＮＢはすべての有機溶媒中で蛍光寿命（τf）が測定不可能であったため、ｋrおよびｋnrの算出はできなかった。しかしながら、モル吸光係数は励起効率が高いことを示している。そのため、ＤＮｓ−ＮＢは、励起状態から高い確率で無放射緩和過程を通じて基底状態に戻ることが明らかである。表５から、まず、より極性の高い溶媒中において、励起状態分子が無放射緩和過程を通じて基底状態に戻る確率が高くなっていることが判る。さらに、芳香族スルホニル制御ユニット上の置換基が求電子性であるほど、無放射緩和過程の確立が高くなっていることが判る。
次に、各種ＮＢ試薬（ＮＢ、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢ）の光学特性及び物理化学特性を、既存の脂肪滴検出試薬（ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３）と比較検討した。励起波長６１０ｎｍで、クロロホルム溶液中の蛍光スペクトルを解析した結果、ＮＢ、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢの最大蛍光波長は、それぞれ、６４４ｎｍ、６５８ｎｍ、６５１ｎｍ及び６４２ｎｍを示した（図３）。一方、ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３の最大蛍光波長は、５９０ｎｍ及び５０３ｎｍを示すことから（図５）、長波長の蛍光シグナルを与えるＮＢ試薬がより生体イメージングには適している。脂肪滴検出試薬のための評価基準として、クロロホルムと水中における輝度の比をＳ／Ｂ（シグナル／バックグラウンド）比とした。これによって、疎水性環境で蛍光を増強するオフ／オン機能を数値で評価できる。輝度の値は、モル吸光係数（ε）の値と蛍光量子収率（Φf）の値の積算により算出した。ＮＢ、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢの値は、それぞれ表６に示した。その結果、ＭＮｓ−ＮＢが９．１と最も高いＳ／Ｂ比を示した。一方、既存のナイルレッドおよびＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３のＳ／Ｂ比は、４．７及び１．０を示した。
以上の結果から、ＭＮｓ−ＮＢは、ｌｏｇＰの値だけでなくＳ／Ｂ比の値も高く、オフ／オン機能及び脂肪滴への高い分布特性のいずれをも兼ね備えていることが判った。したがって、ＭＮｓ−ＮＢは、オフ／オン機能又は疎水性環境に分布しやすいかオフ／オン機能を有するかのいずれか１つを有する従来の化合物よりも、脂肪滴を特異的に検出することができ、脂肪滴検出試薬として優れているといえる。
以上の結果から、ＭＮｓ−ＮＢは、ｌｏｇＰの値だけでなくＳ／Ｂ比の値も高く、オフ／オン機能及び脂肪滴への高い分布特性のいずれをも兼ね備えていることが判った。したがって、ＭＮｓ−ＮＢは、オフ／オン機能又は疎水性環境に分布しやすいかオフ／オン機能を有するかのいずれか１つを有する従来の化合物よりも、脂肪滴を特異的に検出することができ、脂肪滴検出試薬として優れているといえる。
＜各置換基の求電子性評価＞
試験例３、４から、蛍光発光特性は芳香族スルホニル制御ユニット（すなわち、一般式（Ｉ）の「−ＳＯ2−Ｘ」基部分）の置換基の求電子性に応じて変化し得ること、並びに、求電子性の低いＤＮｓ−ＮＢ（２，４−ジニトロベンゼン）は各溶媒下において無蛍光を示し、求電子性の高いＴｓ−ＮＢ（４−メチルベンゼン）は逆に全ての溶媒下において高い蛍光強度を示すのに対し、求電子性が両化合物の間にあるＭＮｓ−ＮＢはクロロホルム溶媒にのみ高い蛍光スペクトルを示すことが判った。すなわち、芳香族スルホニル制御ユニットの置換基の電子密度を一定の範囲内にすることが、脂肪滴を特異的に検出する化合物を得るのに重要であると判った。
そこで、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢがそれぞれ有する２，４−ジニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−メチルベンジル基を含む、種々のベンゼン誘導体の電子密度を、計算化学的手法を用いて算出した（表７）。なお、ベンゼンのＣ１の電子密度の値は、密度汎関数法のＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊の計算レベルを用いて算出した。計算ソフトウェアはスパルタン’０８を使用した。
表７から判るように、ベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が低い程、ベンゼン誘導体は求電子性である。例えば、２，４−ジニトロベンゼンの電子密度は、−０．１８６（エレクトロン）と最も低い絶対値を示すことから、最も求電子性であるといえる。一方、４−メチルベンゼンの電子密度は最も高い絶対値を示し、最も求電子性が低いこととなる。他の８種類のベンゼン誘導体の求電子性は、２，４−ジニトロベンゼンと４−メチルベンゼンの間にある。
したがって、本発明の化合物は、２，４−ジニトロベンジル基の電子密度（−０．１８６）よりも求電子性が高く、４−メチルベンジル基の電子密度（−０．２４３）よりも求電子性が高い基を、ＮＢの５位のアミノ基にスルホニル基を介して結合させることが重要であり、これによりクロロホルム溶媒で顕著に高い蛍光スペクトルを示し、脂肪滴の検出に好適に用いることができる化合物を得ることができると理解できる。
試験例３、４から、蛍光発光特性は芳香族スルホニル制御ユニット（すなわち、一般式（Ｉ）の「−ＳＯ2−Ｘ」基部分）の置換基の求電子性に応じて変化し得ること、並びに、求電子性の低いＤＮｓ−ＮＢ（２，４−ジニトロベンゼン）は各溶媒下において無蛍光を示し、求電子性の高いＴｓ−ＮＢ（４−メチルベンゼン）は逆に全ての溶媒下において高い蛍光強度を示すのに対し、求電子性が両化合物の間にあるＭＮｓ−ＮＢはクロロホルム溶媒にのみ高い蛍光スペクトルを示すことが判った。すなわち、芳香族スルホニル制御ユニットの置換基の電子密度を一定の範囲内にすることが、脂肪滴を特異的に検出する化合物を得るのに重要であると判った。
そこで、ＤＮｓ−ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢがそれぞれ有する２，４−ジニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−メチルベンジル基を含む、種々のベンゼン誘導体の電子密度を、計算化学的手法を用いて算出した（表７）。なお、ベンゼンのＣ１の電子密度の値は、密度汎関数法のＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊の計算レベルを用いて算出した。計算ソフトウェアはスパルタン’０８を使用した。
表７から判るように、ベンゼン環の１位の炭素原子の電子密度が低い程、ベンゼン誘導体は求電子性である。例えば、２，４−ジニトロベンゼンの電子密度は、−０．１８６（エレクトロン）と最も低い絶対値を示すことから、最も求電子性であるといえる。一方、４−メチルベンゼンの電子密度は最も高い絶対値を示し、最も求電子性が低いこととなる。他の８種類のベンゼン誘導体の求電子性は、２，４−ジニトロベンゼンと４−メチルベンゼンの間にある。
したがって、本発明の化合物は、２，４−ジニトロベンジル基の電子密度（−０．１８６）よりも求電子性が高く、４−メチルベンジル基の電子密度（−０．２４３）よりも求電子性が高い基を、ＮＢの５位のアミノ基にスルホニル基を介して結合させることが重要であり、これによりクロロホルム溶媒で顕著に高い蛍光スペクトルを示し、脂肪滴の検出に好適に用いることができる化合物を得ることができると理解できる。
［試験例５］
＜脂肪滴形成細胞での検討＞
今回合成したＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢを用いて細胞内脂肪滴のイメージングモデルを実験系で検討した。ＤＮｓ−ＮＢは細胞内でＧＳＨなどのチオールと反応するため、細胞実験には用いなかった。比較としてＮＢを用いて検討した。ＨｅＬａ細胞にオレイン酸（０．２ｍＭ）を添加し、３７℃、２４時間インキュベートすることで、細胞内に脂肪滴を有するモデル細胞を作成した。脂肪滴を内部に形成しているＨｅＬａ細胞（脂肪滴（＋））に、１μＭの各種試薬を添加し、３７℃、１５分間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡を用いてイメージング像を得た（図６）。いずれの試薬も、脂肪滴部分からの蛍光シグナルを観測できたが、そのシグナル・バックグラウンドに違いがあった。ＭＮｓ−ＮＢは脂肪滴部分のみから顕著な蛍光シグナルを与えた。一方で、ＮＢ及びＴｓ−ＮＢでは、脂肪滴以外の細胞質全体からも非特異的な蛍光シグナルが観測された。
＜脂肪滴形成細胞での検討＞
今回合成したＭＮｓ−ＮＢ及びＴｓ−ＮＢを用いて細胞内脂肪滴のイメージングモデルを実験系で検討した。ＤＮｓ−ＮＢは細胞内でＧＳＨなどのチオールと反応するため、細胞実験には用いなかった。比較としてＮＢを用いて検討した。ＨｅＬａ細胞にオレイン酸（０．２ｍＭ）を添加し、３７℃、２４時間インキュベートすることで、細胞内に脂肪滴を有するモデル細胞を作成した。脂肪滴を内部に形成しているＨｅＬａ細胞（脂肪滴（＋））に、１μＭの各種試薬を添加し、３７℃、１５分間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡を用いてイメージング像を得た（図６）。いずれの試薬も、脂肪滴部分からの蛍光シグナルを観測できたが、そのシグナル・バックグラウンドに違いがあった。ＭＮｓ−ＮＢは脂肪滴部分のみから顕著な蛍光シグナルを与えた。一方で、ＮＢ及びＴｓ−ＮＢでは、脂肪滴以外の細胞質全体からも非特異的な蛍光シグナルが観測された。
さらに、脂肪滴を形成していないＨｅＬａ細胞（脂肪滴（−））において、同様のイメージング実験を行ったところ、ＭＮｓ−ＮＢは全く非特異的な蛍光を示さないのに対して、ＮＢ及びＴｓ−ＮＢは細胞質全体に非特異的な蛍光シグナルが観測された（図６）。続いて、市販の試薬のナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を用いて同様に検討した。ナイルレッドは脂肪滴特異性の高い蛍光画像を与えるのに対して、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３は比較的特異性の低い蛍光画像を与えた。脂肪滴を形成していないＨｅＬａ細胞において、ナイルレッドとＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３はいずれも非特異的なシグナルを細胞質全体に与えた。これらの結果は、ＭＮｓ−ＮＢの脂肪滴検出における高い特異性を示している。
続いて、フローサイトメトリーを用いて脂肪滴の相対的量解析を検討した。フローサイトメーターは、蛍光顕微鏡を用いたイメージング解析と異なり局在化情報は得られないが、数万個以上の高速細胞解析を可能とし、一細胞単位ごとの蛍光強度を頻度分布として与える。フローサイトメーターによる解析は、細胞内のすべてのシグナルを一つの蛍光強度として与えるため、特異性の高い検出試薬が必要になる。先ほど同様に、脂肪滴を形成させたＨｅＬａ細胞（脂肪滴（＋））と脂肪滴がない通常のＨｅＬａ細胞（脂肪滴（−））を調整した。脂肪滴検出用試薬は、ＮＢ、ＭＮｓ−ＮＢ、Ｔｓ−ＮＢ、ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を用いた。ＨｅＬａ細胞に０．５μＭ試薬を添加し、３７℃、１５分間インキュベートした後、フローサイトメーターによりそれぞれの試薬の蛍光強度を測定した。図７に解析の結果得られた頻度分布を示した。
脂肪滴存在細胞及び非存在細胞において分布を比較すると、ＭＮｓ−ＮＢにおいて最も優位な蛍光強度の分布差が観察された。また、ＮＢとＴｓ−ＮＢにおいては、ほとんど有意な分布差は観測されなかった。一方、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３においては有意な分布差が観察されたが、ナイルレッドは有意な差は観測されなかった。頻度分布から蛍光強度の中央値を算出した（表８）。脂肪滴存在細胞及び非存在細胞における中央値の比（特異度：脂肪滴（＋）／脂肪滴（−））は、試薬の特異性を示す指標になる。試薬の中では、ＭＮｓ−ＮＢが最も高い特異度１．９４を与えた。以上、蛍光顕微鏡によるイメージング解析とフローサイトメーターによる相対的量解析の結果から、ＭＮｓ−ＮＢが最も脂肪滴特異性の高い試薬と確認した。
［試験例６］
＜脂肪細胞内脂肪滴のイメージング＞
骨髄由来のヒト間葉系細胞株ＵＥＥＴ−１２細胞株は、様々な細胞に分化することが知られている。デキサメタゾン及びインスリンでこの細胞を処理すると、脂肪細胞に分化する。この場合、脂肪細胞に分化すると内部に脂肪滴を生じる。そのため、脂肪滴をイメージングすることでＵＥＥＴ−１２細胞株が脂肪細胞に分化する過程を評価することができる。そこで、ＭＮｓ−ＮＢ試薬を用いてＵＥＥＴ−１２の脂肪細胞への分化を識別できるかを、蛍光顕微鏡を用いて検証した。デキサメタゾン及びインスリンを添加したＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）を用いてＵＥＥＴ−１２を１４日間培養（２日おきに継代）することで、脂肪細胞への分化を誘導した（ＵＥＥＴ−１２（＋））。コントロールとして、何も添加してないＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で培養したＵＥＥＴ−１２も調整した（ＵＥＥＴ−１２（−））。ＵＥＥＴ−１２（＋）に５μＭの各種試薬を添加し、３７℃、１５分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡にて蛍光シグナルを観測した（図８）。ＮＢは、ＵＥＥＴ−１２（＋）とＵＥＥＴ−１２（−）の比較において、特異的なシグナルを与えなかった。また、ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３は、ＵＥＥＴ−１２（＋）とＵＥＥＴ−１２（−）においてもわずかな非特異蛍光シグナルを示した。また、ＵＥＥＴ−１２（＋）において、いずれの試薬も脂肪滴以外からの蛍光シグナルが観測されていることから、ＭＮｓ−ＮＢと比較し特異性が低いといえる。以上の結果から、ＭＮｓ−ＮＢは、脂肪滴を検出するための優れた試薬であることが明らかとなった。
＜脂肪細胞内脂肪滴のイメージング＞
骨髄由来のヒト間葉系細胞株ＵＥＥＴ−１２細胞株は、様々な細胞に分化することが知られている。デキサメタゾン及びインスリンでこの細胞を処理すると、脂肪細胞に分化する。この場合、脂肪細胞に分化すると内部に脂肪滴を生じる。そのため、脂肪滴をイメージングすることでＵＥＥＴ−１２細胞株が脂肪細胞に分化する過程を評価することができる。そこで、ＭＮｓ−ＮＢ試薬を用いてＵＥＥＴ−１２の脂肪細胞への分化を識別できるかを、蛍光顕微鏡を用いて検証した。デキサメタゾン及びインスリンを添加したＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）を用いてＵＥＥＴ−１２を１４日間培養（２日おきに継代）することで、脂肪細胞への分化を誘導した（ＵＥＥＴ−１２（＋））。コントロールとして、何も添加してないＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で培養したＵＥＥＴ−１２も調整した（ＵＥＥＴ−１２（−））。ＵＥＥＴ−１２（＋）に５μＭの各種試薬を添加し、３７℃、１５分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡にて蛍光シグナルを観測した（図８）。ＮＢは、ＵＥＥＴ−１２（＋）とＵＥＥＴ−１２（−）の比較において、特異的なシグナルを与えなかった。また、ナイルレッド及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３は、ＵＥＥＴ−１２（＋）とＵＥＥＴ−１２（−）においてもわずかな非特異蛍光シグナルを示した。また、ＵＥＥＴ−１２（＋）において、いずれの試薬も脂肪滴以外からの蛍光シグナルが観測されていることから、ＭＮｓ−ＮＢと比較し特異性が低いといえる。以上の結果から、ＭＮｓ−ＮＢは、脂肪滴を検出するための優れた試薬であることが明らかとなった。
［試験例７］
＜イメージングを基礎とした創薬スクリーニング法＞
細胞内における脂肪滴形成を阻害できる化合物は、高脂血症治療薬や成人病関連の治療薬として期待できる。今回開発したＭＮｓ−ＮＢは優れた細胞内脂肪滴イメージング試薬であることから、イメージングを基盤とした脂肪滴形成阻害剤のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に応用できると考えた（図９）。そこで、脂肪滴を形成したＮＩＨ３Ｔ３細胞株を用いて、長期的な脂肪滴イメージングが可能か、また、脂肪滴形成阻害剤の効果が蛍光シグナルで相対的量的に観測できるかを検証した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にオレイン酸を添加し、１２時間後、細胞内に脂肪滴形成を顕微鏡明視野にて確認した。その後、オレイン酸を培養液から除去し、ＭＮｓ−ＮＢを添加して１５分後の細胞の蛍光イメージング像を示した（図１０）。細胞株からは、脂肪滴由来の顕著な蛍光シグナルが観測された。さらに、４６時間経過した細胞においてもほぼ同じ強度の蛍光シグナルが維持されていた。このことから、少なくとも４６時間後でも試薬は安定な蛍光シグナルを与えることが確認できた。
＜イメージングを基礎とした創薬スクリーニング法＞
細胞内における脂肪滴形成を阻害できる化合物は、高脂血症治療薬や成人病関連の治療薬として期待できる。今回開発したＭＮｓ−ＮＢは優れた細胞内脂肪滴イメージング試薬であることから、イメージングを基盤とした脂肪滴形成阻害剤のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に応用できると考えた（図９）。そこで、脂肪滴を形成したＮＩＨ３Ｔ３細胞株を用いて、長期的な脂肪滴イメージングが可能か、また、脂肪滴形成阻害剤の効果が蛍光シグナルで相対的量的に観測できるかを検証した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にオレイン酸を添加し、１２時間後、細胞内に脂肪滴形成を顕微鏡明視野にて確認した。その後、オレイン酸を培養液から除去し、ＭＮｓ−ＮＢを添加して１５分後の細胞の蛍光イメージング像を示した（図１０）。細胞株からは、脂肪滴由来の顕著な蛍光シグナルが観測された。さらに、４６時間経過した細胞においてもほぼ同じ強度の蛍光シグナルが維持されていた。このことから、少なくとも４６時間後でも試薬は安定な蛍光シグナルを与えることが確認できた。
次に、細胞レベルで脂肪滴形成阻害剤の効果を観測できるか検証した。阻害剤はトリアクシンＣ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。トリアクシンＣは、真菌の代謝産物で、トリアシルグリセロールの合成過程を阻害することで、脂肪滴の形成を阻害するメカニズムを有する。脂肪滴を形成させたＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して、０．８μＭトリアクシンＣを添加した後、経時的に蛍光イメージングを解析した（図１１）。その結果、４時間後、２４時間後と時間を経るごとに、細胞内の蛍光シグナルが減弱するのを確認できた。本基礎実験から、ＭＮｓ−ＮＢを用いることで細胞レベルでの阻害剤のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が可能であることを確認できた。
［試験例８］
＜生きている生物個体での脂肪組織のイメージング（１）＞
これまでに、蛍光試薬を用いてゼブラフィッシュや線虫における脂肪組織イメージングが報告されている。しかしながら、そのプロトコルは固定化・洗浄を伴うため、生きている生物個体中の脂肪組織のイメージング例は殆ど報告されていない。また、マウスなどの哺乳動物の生体内における脂肪組織イメージングは全く報告されていない。これまでの細胞実験から、ＭＮｓ−ＮＢは脂肪組織への高い分布特性と脂肪組織での特異的蛍光増強が期待できる。そのため、洗浄操作をできないマウス個体深部の脂肪組織イメージングが可能であると考えた。生きたマウス個体の脂肪組織イメージングは世界で初めての例である。本実験のために、痩せ型マウスと高脂肪食負荷の肥満型マウスを調製した。それぞれのマウスの静脈に、ＭＮｓ−ＮＢ（ＤＭＳＯ溶液）を０．１μＭ／ｋｇ体重の量で注射した。この際、フルオレイン修飾デキストランとＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を同時に注射することで、マウス組織中の血管を緑色蛍光で染色し、細胞核を青色蛍光で染色した。１５分後、それぞれのマウスにおける骨格筋、肝臓を蛍光顕微鏡で観測した。
図１２に骨格筋組織像を示した。肥満型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の強い蛍光シグナルが観察された。これは骨格筋内における異所性脂肪（皮下脂肪や内臓脂肪に蓄積されずに、内臓や骨格筋に沈着する脂肪）の存在を示している。一方で、痩せ型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の蛍光シグナルは観察されなかった。図１２に肝臓組織画像を示した。肥満型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の強い蛍光シグナルが観察された。一方で、痩せ型マウスでは、蛍光シグナルが観察されなかった。以上、ＭＮｓ−ＮＢを用いることで、世界で初めての生きているマウスでの脂肪組織イメージングに成功した。ＭＮｓ−ＮＢは、動物個体においても組織浸透性かつ膜透過性を示し、脂肪組織特異的に染色・イメージングできる実用的な試薬であることが明らかとなった。
＜生きている生物個体での脂肪組織のイメージング（１）＞
これまでに、蛍光試薬を用いてゼブラフィッシュや線虫における脂肪組織イメージングが報告されている。しかしながら、そのプロトコルは固定化・洗浄を伴うため、生きている生物個体中の脂肪組織のイメージング例は殆ど報告されていない。また、マウスなどの哺乳動物の生体内における脂肪組織イメージングは全く報告されていない。これまでの細胞実験から、ＭＮｓ−ＮＢは脂肪組織への高い分布特性と脂肪組織での特異的蛍光増強が期待できる。そのため、洗浄操作をできないマウス個体深部の脂肪組織イメージングが可能であると考えた。生きたマウス個体の脂肪組織イメージングは世界で初めての例である。本実験のために、痩せ型マウスと高脂肪食負荷の肥満型マウスを調製した。それぞれのマウスの静脈に、ＭＮｓ−ＮＢ（ＤＭＳＯ溶液）を０．１μＭ／ｋｇ体重の量で注射した。この際、フルオレイン修飾デキストランとＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を同時に注射することで、マウス組織中の血管を緑色蛍光で染色し、細胞核を青色蛍光で染色した。１５分後、それぞれのマウスにおける骨格筋、肝臓を蛍光顕微鏡で観測した。
図１２に骨格筋組織像を示した。肥満型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の強い蛍光シグナルが観察された。これは骨格筋内における異所性脂肪（皮下脂肪や内臓脂肪に蓄積されずに、内臓や骨格筋に沈着する脂肪）の存在を示している。一方で、痩せ型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の蛍光シグナルは観察されなかった。図１２に肝臓組織画像を示した。肥満型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の強い蛍光シグナルが観察された。一方で、痩せ型マウスでは、蛍光シグナルが観察されなかった。以上、ＭＮｓ−ＮＢを用いることで、世界で初めての生きているマウスでの脂肪組織イメージングに成功した。ＭＮｓ−ＮＢは、動物個体においても組織浸透性かつ膜透過性を示し、脂肪組織特異的に染色・イメージングできる実用的な試薬であることが明らかとなった。
［試験例９］
＜生きている生物個体での脂肪組織のイメージング（２）＞
生きたマウス個体の内臓脂肪及び心臓における脂肪組織のイメージングを試みた。本実験のため、痩せ型マウスと高脂肪食負荷の肥満型マウスを調製した。それぞれのマウスの尾静脈に、ＭＮｓ−ＮＢ（ＤＭＳＯ溶液）を０．１μＭ／ｋｇ体重の量で注射した。この際、Ａｌｅｘａ４８８標識レクチンとＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を同時に注射することで、マウス組織中の血管を緑色蛍光で染色し、細胞核を青色蛍光で染色した。３０分後、それぞれのマウスにおける内臓脂肪（精巣上体脂肪）および心臓を摘出し、臓器を倒立共焦点顕微鏡により観察した。
図１３に内臓脂肪画像を示した。肥満型マウスでは、脂肪細胞の肥大化が生じていた。図１３に心臓画像を示した。肥満型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の強い蛍光シグナルが観察された。一方で、痩せ型マウスでは、蛍光シグナルが観察されなかった。このことから、ＭＮｓ−ＮＢを用いることで、痩せ型では見られない、異所性脂肪の心臓での沈着が肥満型マウスによって可視化された。
＜生きている生物個体での脂肪組織のイメージング（２）＞
生きたマウス個体の内臓脂肪及び心臓における脂肪組織のイメージングを試みた。本実験のため、痩せ型マウスと高脂肪食負荷の肥満型マウスを調製した。それぞれのマウスの尾静脈に、ＭＮｓ−ＮＢ（ＤＭＳＯ溶液）を０．１μＭ／ｋｇ体重の量で注射した。この際、Ａｌｅｘａ４８８標識レクチンとＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を同時に注射することで、マウス組織中の血管を緑色蛍光で染色し、細胞核を青色蛍光で染色した。３０分後、それぞれのマウスにおける内臓脂肪（精巣上体脂肪）および心臓を摘出し、臓器を倒立共焦点顕微鏡により観察した。
図１３に内臓脂肪画像を示した。肥満型マウスでは、脂肪細胞の肥大化が生じていた。図１３に心臓画像を示した。肥満型マウスでは、ＭＮｓ−ＮＢ由来の強い蛍光シグナルが観察された。一方で、痩せ型マウスでは、蛍光シグナルが観察されなかった。このことから、ＭＮｓ−ＮＢを用いることで、痩せ型では見られない、異所性脂肪の心臓での沈着が肥満型マウスによって可視化された。
本発明によれば、脂肪滴及び／又は脂肪組織を検出できる新規化合物を提供することができる。したがって、本発明の化合物は産業上極めて有用である。
Claims (6)
- 下記一般式（Ｉ）で表される化合物：
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ1は、Ｒ1に隣接する窒素原子、Ｒ3、並びに該窒素原子及びＲ3と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ2は、Ｃ1-4アルキル基を表し、あるいは
Ｒ2は、Ｒ2に隣接する窒素原子、Ｒ4、並びに該窒素原子及びＲ4と結合するベンゼン環上の２個の炭素原子と共に、５〜７員の環を形成していてもよく；
Ｒ3は、Ｒ1が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；
Ｒ4は、Ｒ2が５〜７員の環を形成していない場合には水素原子であり；且つ
Ｘは下記式で表される基である：
- Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立して、Ｃ1-4アルキル基を表し、Ｒ3及びＲ4が水素原子を表す、請求項１に記載の化合物。
- 請求項１又は２に記載の化合物を含む、脂肪滴及び／又は脂肪組織の検出用試薬。
- 請求項１又は２に記載の化合物を、脂肪滴を含む細胞に添加する工程を含む、細胞内の脂肪滴を検出する方法（ただし、ヒトを手術、治療又は診断する方法を除く）。
- 請求項１又は２に記載の化合物を、生きている生物個体内（ヒトを除く）に投与する工程を含む、生物個体内に存在する脂肪組織を検出する方法。
- 脂肪滴形成阻害剤の候補化合物を、細胞に添加又は生きている生物個体に投与する工程、及び
請求項１又は２に記載の化合物を、該細胞に添加又は該生物個体に投与する工程、
を含む、脂肪滴形成阻害剤を探索する方法（ただし、ヒトを手術、治療又は診断する方法を除く）。
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