WO2007071874A2 - Nouveaux composes interagissant avec pea-15 - Google Patents

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WO2007071874A2
WO2007071874A2 PCT/FR2006/051367 FR2006051367W WO2007071874A2 WO 2007071874 A2 WO2007071874 A2 WO 2007071874A2 FR 2006051367 W FR2006051367 W FR 2006051367W WO 2007071874 A2 WO2007071874 A2 WO 2007071874A2
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pea
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Marcel Hibert
Hadjila Chabane
Dominique Bonnet
Jacques Haiech
François RENAULT-MIHARA
Hervé CHNEIWEISS
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the present invention is compounds capable of interacting with the protein PEA-15 (Enzyme Enriched Phosphoprotein in Astrocytes with a Molecular Weight of 15 kDa), their fluorescent derivatives, and the use of these compounds in screening and diagnostic methods, and pharmaceutical compositions.
  • PEA-15 Enzyme Enriched Phosphoprotein in Astrocytes with a Molecular Weight of 15 kDa
  • PEA-15 is a small, 130-amino acid cytoplasmic protein abundantly expressed in the brain, particularly in astrocytes, and, more weakly, ubiquitously in many other tissues.
  • DED Death Effector Domain
  • the genomic sequence of PEA-15 is composed of four exons and spans about 10.2 kb of genomic DNA (Wolford et al., 2000, Gene, 241: 143).
  • PEA-15 is present in vivo in various forms: non-phosphorylated, mono- and bi-phosphorylated, each having a different biological activity.
  • PEA-15 is a multifunctional protein capable of interacting with many partners by means of its different functional domains, and according to its degree of phosphorylation (Renault et al., Biochem, Pharmacol, 2003, 66: 1581). To date, seven partners of PEA-15 have been identified, participating in the multiple functions fulfilled by this protein, namely FADD, caspase 8, Omi / HtraA2, ERK1 / 2, Akt, Rsk2, and phospholipase D1. Through these multiple interactions, PEA appears to play a central role in many physiological and / or pathological cellular processes.
  • this protein possesses, in particular, the properties of inhibiting apoptosis, of inhibiting the entry of cells into the cell cycle, of being involved in the recovery of integrin signaling inhibited by expression.
  • H-Ras oncogene to inhibit cell proliferation, and to be involved in glucose transport and insulin secretion (Renault et al., Biochem Pharmacol., 2003, 66: 1581).
  • deletion of PEA-15 expression in astrocytes results in an increase in sensitivity of these cells to apoptosis induced by TNF alpha (Kitsberg et al., J.
  • PEA-15 expression has been observed in various tumors such as gliomas, ovarian cancer, kidney cancer, breast cancer, in hepatocellular carcinomas, lymphomas or tumors.
  • melanomas Hwang et al., Genomics, 1997, 42: 540, Bera et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 9789).
  • PEA-15 overexpression has been observed in fibroblasts, striated muscles and adipose tissue of patients with type II diabetes (Condorelli et al., EMBO J., 1997, 17: 3858), and suppressing the expression of this protein has been shown to restore insulin secretion in response to glucose.
  • EP 1 189 060 proposes the use of PEA-15 as a marker and a therapeutic target in neurodegenerative diseases. Therefore, it appears that PEA-15 could serve as a therapeutic target in many pathological conditions. However, to date, there are no easily accessible compounds capable of modulating the activity of this protein. Moreover, there are also no tools that can easily screen such compounds.
  • the present invention aims to give satisfaction in these terms.
  • n, p, r, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and A are as defined below, are capable of interacting with and modulating the activity of PEA-15.
  • a compound according to the invention such as, for example, the fluorescent compound 6D6-1, detailed below, is capable of specifically interacting with a PEA-15 protein and of modulating its biological activity.
  • a compound of the invention in particular fluorescent in combination with a fluorescent fusion protein GFP-PEA-15 (Green Fluorescent Protein) to develop processes implementing a fluorescence resonance energy transfer (FRET) allowing, for example, the screening of agents likely to interact with PEA-15 as well as the diagnosis and / or prognosis of disease states involving PEA-15.
  • GFP-PEA-15 Green Fluorescent Protein
  • the present invention relates to a compound of formula (I) below:
  • n can be 0 or 1
  • p can represent an integer ranging from 1 to 6, and in particular ranging from 2 to 4
  • r can represent an integer ranging from 1 to 12, and in particular varying from 2 to 6, and in particular is equal to 4
  • R 1 may represent a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated C 1 to C 20 alkyl radical, a saturated or unsaturated C 3 to C 10 cycloalkyl radical or a C 6 to C 6 aryl radical; 10 , optionally substituted with one or more halogen atoms, one or more C 1 -C 6 alkoxy radicals or one or more C 1 -C 10 alkyl radicals,
  • R 2 may represent an amino acid side chain or an amino acid derivative
  • -COR 3 may represent an acyl radical bearing a basic entity R 3, chosen in particular from the radicals of the following formulas: in which * symbolizes a covalent bond with the acyl radical, Y may represent N or N + R 7 , and R 6 and R 7 may represent, independently of one another, a hydrogen atom, an alkyl radical or C 1 to C 20 , saturated or unsaturated, linear or branched, a saturated or unsaturated C 3 to C 10 cycloalkyl radical, a C 6 to C 10 aryl radical, optionally substituted with one or more halogen atoms, a or more C 1 -C 6 alkoxy radical (s), or one or more C 1 -C 10 alkyl radicals,
  • R 4 can represent a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated C 1 to C 10 alkyl radical, a saturated or unsaturated C 3 to C 10 cycloalkyl radical or a C 6 to C 6 aryl radical; 10 , optionally substituted with one or more halogen atoms, one or more C 1 -C 6 alkoxy radicals or one or more C 1 -C 10 alkyl radicals,
  • A may represent a radical derived from a xanthene residue, in particular a 9-phenylxanthene residue, an acridine residue, in particular a 9-phenyl acridine residue, or a 4-bora-3a, 4a-diaza indacene residue, and its derivatives.
  • the term “remainder” refers to a given molecule, the molecule in the form of a radical.
  • A may represent a fluorescent marker.
  • the present invention relates to a method for screening an agent capable of interacting with a PEA-15 protein, or an analogue thereof, comprising at least the steps of: (a) bringing together at least one PEA-15 protein carrying a fluorescent marker D, or one of its analogues, and at least one particularly fluorescent compound according to the invention, under conditions conducive to an interaction with said protein,
  • a and D being such as to define an acceptor-donor pair of fluorescence energy, suitable for carrying out a fluorescence resonance energy transfer
  • step a) measuring a first signal S 1 , characteristic of the assembly obtained in step a) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor, (d) putting the assembly obtained in step a) in the presence of a medium presumed to contain at least one agent to be screened under conditions conducive to an interaction with said protein,
  • step c) measuring a second signal S 2 , of the same nature as S 1 , characteristic of the assembly obtained in step c) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor,
  • PEA-15 protein analog is intended to denote a peptide-type compound having sequence homology with
  • PEA-15 and a similar biological activity, as well as variants likely to result from the alternative splicing of the mRNA encoding this protein, such as that described by Underhill et al. (Genome Mamm., 2001, 12: 172), as well as fragments of this protein or peptide-like compounds having the ability to bind a compound of the formula according to the invention.
  • biological activity is meant the biological properties of the PEA-15 protein, especially as indicated above.
  • Sequence homology is intended to denote a sequence identity of at least 85%, in particular at least 90% and more particularly at least 95% of the analogue with the PEA-15 protein, and in particular the characteristic sequences of
  • PEA-15 (Renault et al., Biochem Pharmacol 2003, 66: 1581), namely the DED domain, and in particular the conserved sequence RxDLF, the NES (Nuclear Export Signal) domain, the peptide sequences involved in the interaction of PEA-15 protein with its different protein partners (eg ERK1 / 2, Akt, FADD, caspase 8) and peptide sequences including phosphorylation sites by protein kinase C (PKC) or the calcium / camodulin-dependent protein kinase type II, namely respectively the motifs LTRIPSAKK (S 104) and DIRQPSEEIIK (S 116) (S: phosphorylated serine).
  • PKC protein kinase C
  • S 116 DIRQPSEEIIK
  • the subject of the present invention is a method for screening an agent capable of interacting with a PEA-15 protein, or one of its analogues, comprising at least the steps consisting in:
  • step c) bringing together the assembly obtained in step a) with an agent to be screened under conditions conducive to an interaction with said protein, (d) measuring a second signal S 2 , of the same nature as S 1 , characteristic of the set obtained in step c),
  • the present invention relates to a method of diagnosis and / or prognosis of a pathological condition likely to involve PEA-15 by detection and, possibly, by quantification of PEA-15 in a sample biological system taken from an individual comprising at least the steps of:
  • step a) measuring a first signal S 1 characteristic of the assembly obtained in step a) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor,
  • step a) bringing the assembly obtained in step a) in the presence of a presumed biological sample comprising at least one PEA-15 protein under conditions conducive to the interaction of said PEA-15 protein of the biological sample with said compound according to the invention
  • step c) measuring a second signal S 2 , of the same nature as S 1 , characteristic of the assembly obtained in step c) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor,
  • the present invention also relates to an isolated complex comprising at least one PEA-15 protein and at least one compound of formula according to the invention.
  • the present invention also relates to a kit for screening an agent capable of interacting with a PEA-15 protein, or one of its analogues, comprising: at least one PEA-bearing protein a fluorescent marker D or a purification marker, and - at least one compound according to the invention, where appropriate, A and D being such as to define a fluorescence energy acceptor-donor pair, suitable for use in implementation of a fluorescence resonance energy transfer.
  • the compounds of the invention have the following general formula (I): (I)
  • n may be 0 or 1
  • - P may represent an integer ranging from 1 to 6, and in particular ranging from 2 to 4
  • r may represent an integer ranging from 1 to 12, and in particular varying from 2 to 6, and in particular equal to 4
  • R 1 may represent a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated C 1 to C 20 alkyl radical, a saturated or unsaturated C 3 to C 10 cycloalkyl radical or a C 6 to C 6 aryl radical; 10 substituted by one or more atom (s) halogen, one or more radical (s) alkoxy, C 1 -C 6, or one or more radical (s) C 1 to
  • R 2 may represent an amino acid side chain or an amino acid derivative
  • -COR 3 may represent an acyl radical bearing a basic entity R 3, chosen in particular from the radicals of the following formulas:
  • Y may represent N or N + - R 7
  • R 6 and R 7 may represent, independently of one another, a hydrogen atom, an alkyl radical C 1 to C 20 , saturated or unsaturated, linear or branched, a saturated or unsaturated C 3 to C 10 cycloalkyl radical, a C 6 to C 10 aryl radical, optionally substituted by one or more halogen atoms, one or more C 1 -C 6 alkoxy radicals or one or more C 1 -C 10 alkyl radicals,
  • R 4 can represent a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated C 1 to C 10 alkyl radical, a saturated or unsaturated C 3 to C 10 cycloalkyl radical or a C 6 to C 6 aryl radical; 10 , optionally substituted with one or more halogen atoms, one or more C 1 -C 6 alkoxy radicals or one or more C 1 -C 10 alkyl radicals,
  • A may represent a radical derived from a xanthene residue, in particular from a 9-phenylxanthene residue, from an acridine residue, in particular from a 9-phenyl acridine residue, or from a 4-bora-3a, 4a residue. -diaza indacene, and its derivatives.
  • A may represent a fluorescent marker.
  • the term “remainder” refers to a given molecule, the molecule in the form of a radical.
  • derivative is intended to denote tautomeric forms, stereoisomeric forms, polymorphic forms, pharmaceutically acceptable salts and pharmaceutically acceptable solvates.
  • the term “tautomeric form” is intended to mean one of the isomers whose structures differ by the position of an atom, generally hydrogen, and one or more multiple bonds and which are able to transform themselves easily and reversibly into one another.
  • the term “stereoisomeric form” is intended to denote isomers of molecules of identical constitution, which differ only in one or more arrangements (s) different from their atoms in space.
  • the term "pharmaceutically acceptable salts” means compounds obtained by reaction of a compound of general formula (I) with a base or an acid.
  • a base suitable for the invention mention may be made of sodium hydroxide, sodium methoxide, sodium hydride, potassium t-butoxide, calcium hydroxide and magnesium hydroxide. and the like, and mixtures thereof, in solvents such as THF (tetrahydrofuran), methanol, t-butanol, dioxane, isopropanol, ethanol, their analogs, and mixtures thereof.
  • solvents such as THF (tetrahydrofuran), methanol, t-butanol, dioxane, isopropanol, ethanol, their analogs, and mixtures thereof.
  • Organic bases such as lysine, arginine, diethanolamine, choline, tromethamine, guanidine and their derivatives can also be used.
  • acid addition salts which are suitable for the invention, mention may be made of those which may be prepared by reaction of a compound of general formula (I) with an acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, acetic acid, citric acid, maleic acid, acid salicylic acid, hydroxynaphthoic acid, ascorbic acid, palmitic acid, succinic acid, benzoic acid, benzenesulfonic acid, tartaric acid, and the like, and mixtures thereof, in solvents such as ethyl acetate, ether, alcoholic solvents, acetone,
  • polymorphic form is intended to mean compounds obtained by crystallization of a compound of general formula (I) under different conditions, such as, for example, the use of various solvents, generally used for crystallization.
  • Crystallization at different temperatures involves, for example, different cooling modes, for example very fast to very slow cooling involving heating or compound melting steps followed by gradual or rapid cooling.
  • polymorphic forms can be determined by means of NMR spectroscopy, IR spectroscopy (infrared), DSC (Différenciai Scaning) analysis.
  • alkyl radical is intended to mean a linear or branched, saturated or unsaturated hydrocarbon radical containing from 1 to 20 carbon atoms, in particular from 2 to 18 carbon atoms, in particular from 3 to to 16 carbon atoms, in particular from 4 to 12 atoms and more particularly from 6 to 10 carbon atoms, may be substituted by radicals as defined below.
  • radicals such as methyl, ethyl, isopropyl, n-butyl, t-butyl, t-butylmethyl, n-propyl, pentyl, n-hexyl, 2-ethylbutyl, heptyl, octyl , nonyl, or decyl.
  • cycloalkyl radical means an alkylene ring, optionally branched, saturated or unsaturated, of 3 to 10 carbon atoms, in particular C 4 to C 8 and more particularly C 6 , such cyclopropyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexylmethyl, cycloheptyl.
  • aryl radical means an aromatic ring comprising from 1 to 3 aromatic rings, optionally fused, of 6 to 20 carbon atoms, in particular of 10 to 14 carbon atoms, optionally comprising one or more heteroatoms chosen from O, N and S, and where appropriate being substituted by radicals as defined above and hereinafter.
  • aryl radicals suitable for the implementation of the invention, it is possible to mention the phenyl radical, the benzyl radical, the phenethyl radical, the naphthyl radical, the anthryl radical, and all the aromatic rings comprising a several heteroatoms chosen from O, N and S, such as for example pyridine, thiophene, pyrrole, furan, quinoline, acridine, xanthene, 4-bora-3a, 4a diaza indacene.
  • alkoxy radical means a radical -
  • alkyl radical is a linear, branched or cyclic, condensed or unsaturated, saturated or unsaturated hydrocarbon radical containing from 1 to 20 carbon atoms, in particular from 2 to 18 carbon atoms, in particular from 3 to 16 carbon atoms , in particular from 4 to 12 atoms and more particularly from 6 to 10 carbon atoms.
  • the hydrocarbon-based chain of the abovementioned radicals may, if appropriate, be interrupted by one or more heteroatoms chosen, for example, from O, N and S, to form, for example, a heteroalkyl radical such as an alkyl ether radical, an alkyl ester radical or a heterocyclic.
  • a heteroalkyl radical such as an alkyl ether radical, an alkyl ester radical or a heterocyclic.
  • heterocyclic radical is understood to mean, for example, and without limitation, a furanyl radical, a thiophenyl radical, a pyrrolyl radical, an oxazolyl radical, an isoxazolyl radical, a thiazolyl radical or a radical.
  • radicals defined above may optionally be substituted with one or more halogen atoms.
  • halogen atom is understood to mean an F, Cl, Br or I atom.
  • the halogen atoms advantageously used in the present invention are fluorine and chlorine.
  • alkylhalogenated radicals can be perfluoroalkyl radicals of general formula C n F 2 IVf 1 in which n can vary from 1 to 10, in particular from 2 to 8 and more particularly from 3 to 6.
  • R 1 may especially represent a hydrogen atom, a C 1 -C 18 alkyl radical or a C 2 -C 16 alkyl radical, for example a C 6 to C 10 aryl radical, for example. examples optionally substituted with one or more halogen atoms.
  • R 1 may especially represent a hydrogen atom, a methyl radical, an ethyl radical, an isopropyl radical, an n-propyl radical, a benzyl radical, a phenethyl radical, or a perfluoroalkyl radical of formula C n F 2n + ! in which n can vary from 1 to 10, in particular from 2 to 8 and more particularly from 3 to 6.
  • R 1 may be a methyl radical or a benzyl radical.
  • R 2 may represent a side chain of an amino acid or amino acid derivative chosen, for example, from alanine, glutamine, leucine, glycine, tryptophan, ⁇ -alanine phenylalanine, 4-chlorophenylalanine, isonipecotinic acid, 4-aminomethylbenzoic acid, 3-tetrahydroisoquinoline acid and free or benzylated histidine.
  • an amino acid or amino acid derivative chosen, for example, from alanine, glutamine, leucine, glycine, tryptophan, ⁇ -alanine phenylalanine, 4-chlorophenylalanine, isonipecotinic acid, 4-aminomethylbenzoic acid, 3-tetrahydroisoquinoline acid and free or benzylated histidine.
  • amino acid or amino acid derivative may, for example, be chosen from:
  • R 2 may be of formula (VI) below: in which
  • R 5 may represent a hydrogen atom, a linear or branched, saturated or unsaturated C 1 to C 20 alkyl radical, a radical saturated or unsaturated C 3 to C 10 cycloalkyl, a C 6 to C 10 aryl radical, optionally substituted with one or more halogen atoms.
  • the alkyl or cycloalkyl radicals which may be present in the radical R 5 may also be substituted with the radicals as defined above or have their hydrocarbon chains interrupted by one or more heteroatoms as defined above.
  • R 5 may represent a hydrogen atom, a C 1 -C 18 alkyl radical, a C 2 -C 16 alkyl radical or a C 6 to C 10 aryl radical, optionally substituted by one or more atomic groups. (s) halogen.
  • R 5 may represent a hydrogen atom, a methyl radical, an ethyl radical, an isopropyl radical, an n-propyl radical, a benzyl radical, a phenethyl radical or a perfluoroalkyl radical of formula C n F 2 IVf 1 in which n can vary from 1 to 10, in particular from 2 to 8 and more particularly from 3 to 6.
  • R 5 can be a methyl radical or a benzyl radical.
  • R 2 may especially be a histidine or a histidine derivative such as a benzylated histidine.
  • -COR 3 may be an acyl radical, in particular an acetyl radical, substituted with a basic entity R 3 as defined above.
  • this basic entity R 3 can be a radical of formula (VII) below:
  • Y may represent N or N + R 7
  • - R e and R 7 may represent, independently of one another, a hydrogen atom or a C 1 alkyl radical; -C 18 , a C 2 -C 16 alkyl radical, a C 6 -C 10 aryl radical, optionally substituted by one or more halogen atom (s).
  • R 6 and R 7 may represent, independently of one another, a hydrogen atom, a methyl radical, an ethyl radical, an isopropyl radical, an n-propyl radical, a benzyl radical or a phenethyl radical.
  • n can vary from 1 to 10, in particular from 2 to 8 and more particularly from 3 to 6.
  • R 6 and R 7 may be independently of one another a methyl radical or a benzyl radical
  • the radical A may represent a radical of general formula (Va):
  • R 12 * -NHSO 2 - or * -NHCO-, with * symbolizing a covalent bond with the remainder of the compound of formula (I) -
  • R 13 H, HSO 3 - or COOH.
  • radical A of formula (Va) may be such that R 12 may be in the ortho, meta or para position.
  • R 12 * -NHSO 2 -, it can be advantageously in the ortho position.
  • A may represent a radical of general formula (Vb):
  • R 14 may represent a C 2 -C 4 acyl residue
  • R 15 may represent a C 5 to C 7 heterocycle radical, and in particular a thiophenyl radical, and
  • the radicals of formula (Va) and (Vb) may be fluorescent marker groups.
  • fluorescent markers examples include rhodamine and its derivatives such as tetramethylrhodamine, rhodamine Red-X (lissamine), and Bodipy and its derivatives. , Texas Red ® and its derivatives, fluorescein and its derivatives, Alexa ® and its derivatives, and Oregon Green ® and its derivatives.
  • the radical A may represent a fluorescent marker chosen from fluorescent markers of the following formula (s):
  • the fluorescent marker A may be chosen from fluorescent markers derived from rhodamine, for example a derivative of sulfonylrhodamine B.
  • the remainder of the compound of general formula (I) may be bonded ortho to the derivative of sulfonylrhodamine (lissamine).
  • radical derived from lissamine may be represented by the radical of the following formula:
  • a compound according to the invention may be of general formula (I) in which n may be equal to 0.
  • a compound according to the invention can be represented, for example, by the following general formula (II):
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , A and p may be, for example, as defined above.
  • a compound according to the invention may be of general formula (I) in which n may be equal to 0, p may be equal to 4, R 1 may represent a methyl radical, R 2 may represent a radical of the following formula:
  • R 3 may represent an acyl radical, especially acetyl, substituted by a basic entity R 3 , of the following formula:
  • a compound according to the invention may have the following general formula (III):
  • a compound in accordance with the invention may be a compound of general formula (III) as defined above in which the fluorescent marker A may be, for example, a sulphonylrhodamine radical as defined above, and in particular such that the remainder of the compound of formula (III) is ortho of the sulphonylrhodamine radical, R 5 may be a benzyl radical, Y may be N and R e may be a methyl radical.
  • a compound in accordance with the invention is not a compound of general formula (I) as defined above in which the fluorescent marker A is a sulphonylrhodamine (lissamine) radical such that the remainder of the compound of formula (I) is in para of the sulfonylrhodamine radical.
  • a compound in accordance with the invention is not a compound of general formula (III) as defined previously in which the fluorescent marker A is a sulphonylrhodamine (lissamine) radical such that the remainder of the compound of formula (III) is in para of the sulfonylrhodamine radical, and R 5 is a benzyl radical, Y is N and R 6 is a methyl radical.
  • a compound according to the invention may be represented by the following formula (IV):
  • Compounds according to the invention can be obtained either in the form of a library of compounds of various formulas, or in the form of isolated compounds in pure form or in a mixture of stereoisomers.
  • the synthesis process can be carried out on a REM type polystyrene resin (REgenerated Michael), consisting of a hydroxymethylpoylstyrene resin functionalized with a Michael acceptor acrylic ester.
  • REgenerated Michael a polystyrene resin
  • the REM type resin is particularly suitable for the synthesis of tertiary amine libraries, via an initial Michael-type addition of an amine in order to fix the amine to the support followed by the synthesis of the molecule on support and finally its cleavage of the support. according to a process of quaternization of the amine and then an elimination of type
  • the other residues can be introduced using conventional peptide coupling methods, using DIC / HOBt (1,3-diisopropylcarbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole) activation.
  • a radical A for example of the sulforhodamine type (lissamine, for example), can be grafted directly onto an amine function, for example the 8-NH 2 radical of a lysine or on a spacer grafted onto the 8-NH 2 radical.
  • lysine such as a diamino-butane spacer, by means of a urethane linkage.
  • the release of the compound (s) from the resin may be carried out after alkylation of the secondary amine in the presence, for example, of an alkyl halide such as methyl iodide, or benzyl bromide, followed by treatment with presence of a basic Amberlite ion exchange resin IRA-95.
  • an alkyl halide such as methyl iodide, or benzyl bromide
  • IRA-95 a basic Amberlite ion exchange resin
  • a compound according to the invention can be obtained according to a solid support preparation process comprising at least the steps of: a. couple on a solid support of formula
  • R 4 may be as defined above.
  • R 2 may be as defined above, c. deprotecting the compound of formula (2), then coupling said deprotected compound with the compound of the following formula:
  • p can be as defined above, d. deprotecting from the Fmoc group the compound of formula (3), then coupling said deprotected compound with a compound R 3 COOH to obtain a compound of formula (4) below:
  • COR 3 can be as defined above, e. deprotecting the compound of formula (4), to obtain a compound of formula (5) below:
  • r can be as defined above, g. reacting the compound of formula (5) or the compound of formula (6) with an electrophilic tracer, in particular with A-Cl, to obtain a compound of formula (7) below:
  • R 2 , R 3 , A, n, p and r being as defined above. h. cleaving the compound of formula (7) with a compound of formula R1X, R1 being as defined above, and X may represent a halogen atom, especially I or Br, to obtain a compound of formula (I) such than previously defined.
  • the present invention also relates to a method for screening an agent capable of interacting with a PEA-15 protein or one of its analogues, comprising at least the steps of:
  • step a) measuring a first signal S 1 characteristic of the assembly obtained in step a) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor,
  • step c) bringing the assembly obtained in step a) in the presence of a medium presumed to contain at least one agent to be screened under conditions conducive to an interaction with said protein, (d) measuring a second signal S 2 , of same nature as S 1 , characteristic of the assembly obtained in step c) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor,
  • a and D is intended to mean that they define an acceptor-donor pair of fluorescence energy, suitable for the implementation of a resonance energy transfer.
  • a pair of fluorescent markers whose emission spectrum of one (fluorescence energy donor) covers all or part of the excitation spectrum of the other (fluorescence energy acceptor).
  • the excitation spectrum of the donor does not overlap, or that in very small part, the excitation spectrum of the acceptor, avoiding or reducing the appearance of false positives.
  • the first and second signals may be fluorescent signals of the acceptor and / or the energy donor.
  • a compound carrying a fluorescence energy acceptor capable of interacting with a fluorescent energy donor compound irradiating the assembly at a length of the donor energy spectrum Fluorescence can produce a fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • fluorescence energy transfer is understood to mean a physical process, dependent on distance, by which energy is transmitted, in a non-radiative manner, from an excited chromophore, the fluorescence energy donor, to another chromophore, the fluorescence energy acceptor, by dipole-dipole interaction.
  • the manifestation of such a transfer may be detected by a modulation of the fluorescent signal of the donor and / or the fluorescent signal of the acceptor, such as, for example, the decrease in the amplitude of the fluorescent signal of the fluorescence donor and / or an increase in amplitude of the fluorescent signal of the acceptor.
  • the amplitude variations of the fluorescent signal of the donor may be concomitant with the amplitude variations of the fluorescent signal of the acceptor.
  • one of the fluorescent signals may vary without variation of the other fluorescent signal being detected.
  • the comparison of the first and second signals can make it possible to detect an amplitude modulation of a fluorescent signal.
  • amplitude modulation of a fluorescent signal is intended to mean, in the context of fluorescence resonance energy transfer, any modulation of the amplitude of the fluorescence signal of the donor, of the the amplitude of the excitation spectrum or the amplitude of the donor transmission signal as defined above. Modulation of these fluorescence signals may reflect a possible interaction of the agent to be screened with a PEA-15 protein bearing a fluorescent marker D. Such an interaction being capable of causing the dissociation of a PEA-15 protein complex carrying a fluorescent marker D / compound according to the invention.
  • a screening method according to the invention may comprise, in addition, a step of preparing at least one control sample in which said medium added in step c), of the method according to the invention defined above , is devoid of agent to be screened.
  • control sample or samples may be prepared, according to a method according to the invention, simultaneously or independently of the implementation of such a method for the screening of an agent capable of interacting with PEA-15.
  • a method according to the invention may comprise a step of comparing a signal S 3 measured from a control sample with the signals S 1 and S 2 as defined above to derive information on said agent to be screened.
  • a difference between the signals thus compared may be informative of the presence, amount, and / or interaction with PEA-15 of an agent to be screened in a sample.
  • the fluorescent marker D carried by the PEA-15 protein may be chosen, in a non-limiting manner, from a protein, such as a fluorescent protein, a fluorescent marker, for example chosen from a derivative of fluorescein. , a derivative of rhodamine, a derivative of Alexa ® 532, a Bodipy derivative or derivative Oregon Green ®, provided that D and a are as defined above.
  • the fluorescent protein may be chosen, in a non-exhaustive manner, from the Green Fluorescent Protein, or one of its fluorescent variants, such as the Yellow Fluorescent Protein (YFP), the Cyan Fluorescent Protein (GFP) or the Red Fluorescent Protein (RFP) or DS Red or one of its variants.
  • YFP Yellow Fluorescent Protein
  • GFP Cyan Fluorescent Protein
  • RFP Red Fluorescent Protein
  • the PEA-carrying a fluorescent marker may be in particular a fusion protein, for example GFP-PEA-15.
  • a fusion protein for example GFP-PEA-15.
  • Such a protein may be obtained by any molecular biology technique known to those skilled in the art. , and in particular those described in "Molecular Cloning: A Laboratory
  • expression vector containing a fusion protein such as, for example, GFP-PEA-15 is a matter of familiarity and practice with those skilled in the art.
  • sequences coding for these proteins are for example available in databases, on the website www.ncbi.nlm.nih.gov or on the ca.expasy.org website, and also commercially.
  • Expression vectors containing a nucleic acid sequence encoding GFP (or a variant thereof) or DS Red may be commercially available, particularly from companies such as Invitrogen or Clontech.
  • Such vectors can be carried out in any suitable host cell, and the recovery of the fusion protein or, if appropriate, of the nucleic acid encoding such a protein, such as mRNA or cDNA, can be carried out by any suitable means known to those skilled in the art.
  • a GFP-PEA-15 fusion protein has been described by KITSBERG et al. (J. Neurosci., 1999, 19: 8244).
  • a screening method according to the invention can be implemented, for example, using a compound according to the invention of formula (IV).
  • the PEA-carrying a fluorescent marker D can be a GFP-PEA-15 fusion protein.
  • a screening method according to the invention can be carried out ex vivo or in vivo. vitro.
  • a method according to the invention implemented can be carried out ex vivo from a tissue taken from a genetically modified laboratory animal so that its cells express, in a tissue-specific or non-specific manner, a protein GFP-PEA-15 melting point.
  • a method according to the invention can be carried out in vitro, in particular in cellulo from intact cells, or ex cellulo, for example in a cell lysate or after separation of the elements of interest, such as the GFP-PEA fusion protein. -15.
  • a screening method according to the invention can be carried out in cellulo in cells expressing the fusion protein according to the invention, either after transfection of cells, primary or in lines, using an expression vector as defined.
  • a fusion protein according to the invention or a nucleic acid sequence coding for this fusion protein.
  • the present invention relates to a method for screening an agent capable of interacting with a PEA-15 protein, or an analogue thereof, comprising at least the steps of:
  • step a) bringing together the assembly obtained in step a) with an agent to be screened under conditions that are conducive to an interaction with said protein
  • step c) measuring a second signal S2, of the same nature as Sl, characteristic of the assembly obtained in step c), (e) comparing Sl and S2 in order to draw a conclusion relating to a possible interaction of said protein PEA-15 with the agent to be screened.
  • the PEA-15 protein may be bound to a carrier by means of a so-called "purification marker".
  • purification marker denotes any structure that can be used for binding purposes between the PEA-15 protein and a support.
  • a purification marker may be, for example and without limitation, a FLAG tag, a polyHistidine tag, or a GST (Glutathione S Transferase) protein.
  • a PEA-protein bound to a purification marker as defined above may be a fusion protein obtained by any method of molecular biology known to those skilled in the art, especially as indicated above.
  • a GST-PEA-15 fusion protein may be obtained according to the protocol described by Kitsberg et al. (J. Neurosci, 1999, 19: 8244).
  • a support suitable for putting the invention may be, for example and in a non-exhaustive manner, a surface of a Sepharose ball or a plate for culturing cells coated with glutathione such that 96-well plates marketed by SIGMA (P3233), a nickel column, an anti-FLAG antibody bound to a protein G or protein A column, or to the surface of a Sepharose ball or to the bottom of a well of a cell culture plate.
  • the PEA-15 protein can be linked to the surface of a sensor ship, for an implementation in a method for detecting a surface plasmon resonance signal, according to means known to those skilled in the art.
  • the compound according to the invention may be fluorescent and the first signal S 1 and the second signal S 2 may be fluorescence signals.
  • the measurement of these signals can be obtained by any spectrofluorimetry or fluorescence imaging methods known to those skilled in the art.
  • the excitation and recording conditions of the fluorescence emission are to be adapted according to various factors known to those skilled in the art, such as, for example and in a non-exhaustive manner, the nature of the fluorescent marker A, the support on which is the PEA-15 protein.
  • the first signal S 1 and the second signal S 2 may be the signals obtained by surface plasmon resonance, for example using a Biacore ® type apparatus, according to human protocols known art.
  • the compound according to the invention may not be fluorescent.
  • the PEA-15 protein can be attached to a sensor ship as previously described.
  • a compound according to the invention may be contacted with said protein attached to the sensor ship.
  • the interactions between the compound and the protein can be detected by surface plasmon resonance.
  • a possible interaction of the PEA-15 protein with an agent to be screened resulting in the displacement of the compound of the invention previously bound can be detected by surface plasmon resonance.
  • the subject of the present invention is a method for diagnosing and / or prognosing a pathological condition that may involve
  • PEA-15 by detection and, optionally, quantification of the PEA-15 protein in at least one presumed biological sample comprising said protein comprising at least the steps of:
  • a and D being such as to define an acceptor-fluorescence energy donor pair, suitable for carrying out fluorescence resonance energy transfer, (c) measuring a first S 1 signal characteristic of the assembly obtained in step a) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor,
  • step a) bringing the assembly obtained in step a) in the presence of a presumed biological sample comprising at least one PEA-15 protein under conditions conducive to the interaction of said PEA-15 protein of the biological sample with said compound according to the invention
  • step c) measuring a second signal S 2 , of the same nature as S 1 , characteristic of the assembly obtained in step c) by irradiation at a wavelength for exciting the fluorescence energy donor,
  • step f) comparing S 1 and S 2 in order to draw a conclusion regarding a possible presence of the PEA-15 protein in said biological sample, and possibly a conclusion as to the amount of said protein.
  • a comparison of the first and second signals may allow detection of an amplitude modulation of a fluorescent signal. Such modulation may be informative of the presence, and possibly, the amount of PEA-15 protein possibly present in the sample.
  • PEA-15 optionally compared with reference values obtained, either from a control sample comprising a known quantity of this protein, or from a healthy biological sample, possibly in parallel with the previous measurement, may be informative of a pathological state involving in particular PEA-15 and / or an evolution of such a state.
  • a biological sample can be obtained from biological tissue or body fluid.
  • a method according to the invention may comprise a step of comparing a signal S 3 measured from a control sample with the signals S 1 and S 2 as defined above to derive information from the presence and, possibly, the quantity PEA-15 in a biological sample.
  • the first and second signals may be compared to one or more fluorescent signals detected from one or more control samples.
  • control samples can be obtained by implementing a method according to the invention and by replacing in step c) the biological sample with sample (s) comprising a known amount of PEA-15 protein.
  • control sample or samples may be prepared according to a method according to the invention simultaneously or independently of the implementation of a method according to the invention for the detection and, optionally, the quantification of the PEA-15 protein in a sample. organic. According to one embodiment, it is possible to vary the known amounts of PEA-15 of the control sample (s) or the amount of PEA-15 protein. carrying a fluorescent marker D and or fluorescent compound according to the invention so as to obtain a standard range.
  • a correlation of a fluorescence signal with one of the previously defined variable quantities can thus be achieved.
  • a correlation of a FRET signal can be established with known amounts of PEA-bearing protein carrying a fluorescent marker D, fluorescent compound according to the invention of PEA-15 protein.
  • the PEA-15 protein carrying a fluorescent marker D may, in particular, be as defined above.
  • a PEA-protein carrying a fluorescent marker D may be a GFP-PEA-15 fusion protein.
  • the compound according to the invention may be as defined above, and in particular may be of formula (IV) as specified above.
  • IV formula (IV) as specified above.
  • Numerous variations of a diagnostic method according to the invention can be envisaged and, if appropriate, combined with characteristics of a screening method according to the invention.
  • the invention relates to a method for diagnosis and / or prognosis of a pathological condition likely to involve PEA-15 implemented according to the principles indicated above for the screening method, by example, implementing a surface plasmon resonance detection, in which the agent to be screened is replaced by the biological sample.
  • the PEA-15 possibly present in such a sample can bind to the compound according to the invention and thus modify the recorded signal.
  • the present invention also relates to a kit for screening an agent capable of interacting with a PEA-15 protein, or of one of its analogues, or for the diagnosis and / or prognosis of a pathological condition susceptible of involve PEA-15 comprising: at least one PEA-15 protein carrying a fluorescent marker D or a purification marker, and at least one compound according to the invention, where appropriate, A and D being such that they can define an acceptor-donor pair of fluorescence energy, suitable for the implementation of a resonance energy transfer fluorescence.
  • the PEA-15 protein carrying a fluorescence marker D or a purification marker may be as defined above.
  • kit according to the invention when the kit according to the invention is more particularly used for the diagnosis and / or prognosis of a pathological state, it may further comprise at least one unmarked PEA-15 protein.
  • the protein fusion protein when the kit according to the invention is more particularly used for the diagnosis and / or prognosis of a pathological state, it may further comprise at least one unmarked PEA-15 protein.
  • the protein fusion protein when the kit according to the invention is more particularly used for the diagnosis and / or prognosis of a pathological state, it may further comprise at least one unmarked PEA-15 protein.
  • the protein fusion protein the protein fusion protein
  • PEA-15 with a fluorescent protein or unlabeled PEA-15 protein may be present in a kit according to the invention in the form of a nucleic acid sequence encoding said proteins, such as cDNA, mRNA , or an expression vector.
  • the subject of the present invention is also a compound according to the invention for use as an active agent in a pharmaceutical composition.
  • pharmaceutical composition is intended to mean a composition or substance presented as possessing curative or preventive properties with regard to human or animal diseases, as well as a substance or composition intended to be used. in order to establish a diagnosis and / or prognosis of a pathological state or not, or to restore, correct or modify the organic functions of an individual.
  • the diagnostic and / or prognostic method that can be implemented by a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in vitro or ex vivo.
  • a pharmaceutical composition according to the invention may comprise a compound according to the invention of general formula (I), or a derivative thereof such as a tautomeric form, a stereoisomeric form, a polymorphic form, a pharmaceutically acceptable salt, or a pharmaceutically acceptable solvate, combination with vehicles, diluents, or excipients usually used in pharmacy.
  • a compound according to the invention of general formula (I) or a derivative thereof such as a tautomeric form, a stereoisomeric form, a polymorphic form, a pharmaceutically acceptable salt, or a pharmaceutically acceptable solvate, combination with vehicles, diluents, or excipients usually used in pharmacy.
  • a pharmaceutical composition according to the invention may be presented in a dosage form usually used in the field, such as tablets, capsules, a powder, a syrup, a solution, a suspension.
  • a pharmaceutical composition according to the invention may be presented in a dosage form suitable for administration by other routes, such as the oral route, the nasal route, the sublingual route, the topical route, the ophthalmic route, the route of rectal, etc.
  • a cosmetic composition according to the invention may also be presented in a sterile form suitable for parenteral administration, such as the subcutaneous, transdermal, intramuscular, intravenous, intra-arterial, intracardiac, etc. route.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can also be presented in a freeze-dried form, combined at the time of its use with a sterile aqueous solution or not.
  • the aqueous solution can be sterile if the composition according to the invention is intended for parenteral administration.
  • the amount of compound according to the invention present in a pharmaceutical composition is to be adjusted, for example, according to the route of administration, the type of individual to be treated, the nature of the pathology to be treated.
  • a composition according to the invention generally comprises a sufficient amount of a compound according to the invention.
  • the term "sufficient quantity" is intended to mean the quantity necessary to obtain a desired effect.
  • such an effect can be for example the reduction or the treatment of the symptoms presented by an alleged individual suffering from a pathology such as cancer or type II diabetes.
  • the cancer may be for example glioma, kidney cancer, breast cancer, or melanoma.
  • the subject of the present invention is the use of a compound according to the invention for the manufacture of a pharmaceutical composition intended for the treatment of a pathological condition likely to involve PEA-15.
  • the PEA-15 protein may be implicated either by an alteration of its expression, for example, overexpression or lack of expression, or by an alteration of its biological activity, resulting, for example, in an increase in its activity.
  • treatment is intended to mean reducing the severity of a disease, such as, for example, reducing symptoms or preventing these symptoms.
  • a compound according to the invention can be administered before the development of the pathological state.
  • the pathological conditions targeted by the present invention may be in particular those defined above, such as cancer, and in particular gliomas, kidney cancers, breast cancers, ovarian cancers, melanomas, and also diabetes mellitus. type II.
  • the term "individual” is intended to mean humans, non-human primates, and laboratory animals such as rodents (for example mouse, rat, guinea pig or hamster), particularly economically valuable animals such as poultry, cattle, sheep, pigs, goats and fish, and particularly those producing products suitable for human consumption such as meat, eggs and milk. This term also refers to domestic animals such as cats and dogs.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition as defined above.
  • the present invention also relates to an isolated complex comprising at least one PEA-15 protein carrying a fluorescent marker D or a purification marker and at least one compound of formula according to the invention, A and D being such that they can define an acceptor-donor pair of fluorescence energy, suitable for the implementation of a fluorescence resonance energy transfer.
  • a complex according to the invention may comprise as a PEA-protein carrying a fluorescent marker D, a GFP-PEA-15 fusion protein and, as a compound of formula according to the invention, a compound of formula (IV), as defined above.
  • FIG. 1 shows images obtained by confocal imaging of the localization of the intracellular compound of the ERK and PEA-15 proteins before and after treatment with 50 ⁇ M 6D6-1. Treatment of the cells with the 6D6-1 compound results in relocation of the ERK protein into the nucleus while the PEA-15 protein remains cytoplasmic.
  • the scale bar corresponds to 40 ⁇ m.
  • Figure 2 represents the mean fluorescence intensity of glutathione-coated Sepharose bead, carrying a GST-PEA-15 fusion protein, incubated in the presence of 1 and 5 ⁇ M of 6D6-1.
  • the REM resin (regenerated Michael, polystyrene resin) (5 g, 4 mmol, 0.8 mmol.g .mol "1 theoretical loading) is swollen in a minimum quality of dimethylformamide (DMF).
  • DMF dimethylformamide
  • the resin (2.3 g, 1.5 mmol) is foamed in 20 ml of DMF and the methyl iodide (3.81 ml, 61 mmol) is added. for 24 hours, the resin is filtered, washed with 3 DMF / DCM sequences Under the same conditions a second alkylation step with methyl iodide is repeated The cleavage of the piperidine on the resin is carried out in a flask with 40 mL of DCM and in the presence of the IRA-95 resin (3.16 g, 1.5 mmol).
  • reaction mixture is then diluted with 50 ml of DCM, washed twice with 10% HCl (10 ml), and then the organic phase is dried over sodium sulphate. evaporated to dryness.
  • the purification and separation of the two isomers of position is obtained on silica gel (dichloromethane / methanol / acetic acid: 94/5/1) and leads to two violet powders.
  • the 1-methyl-piperidin-4-His (Bzl) -NHBoc (0.03 g, 0.08 mmol) is treated with a solution of TFA / DCM (ImL / ImL) for 1H30. The solution is then evaporated to dryness under reduced pressure and the product is dried under vacuum for 18 hours. The amine thus obtained is dissolved in 0.5 ml of DMF and are successively added Fmoc-Lys (o-Lissamine) -OH (0.06 g, 0.07 mmol), PyBop (0.03 g, 0.07 mmol) and TEA (0.01 ml). 0.07 mmol). After a magnetic stirring of 4h at room temperature, the reaction is evaporated to dryness and then purified by HPLC and conducted after lyophilization to a violet powder.
  • TFA / DCM ImL / ImL
  • 1-methyl-piperidin-4-His (Bzl) -Lys (o-Lissamine) -NHFmoc (0.01 mmol, 0.01 mmol) is treated with 0.12 ml of piperidine in 0.5 ml of DMF for 1 hour at room temperature. ambient temperature. The solution is then directly injected on semi-preparative HPLC and leads to the deprotected product on the terminal amine with a yield of 40%.
  • the amine (0 .004 g, 0.004 mmol) thus obtained is engaged in a last coupling step with 1-methyl-4-imidazole acetic acid hydrochloride (0.001 g, 0.007 mmol) in the presence of PyBop (0.003 g, 0.007 mmol). ) and DIEA (0.005 mL, 0.033 mmol) in 0.3 mL of DMSO. After stirring for 30 minutes at room temperature, the solution is directly injected on semi-preparative HPLC and after lyophilization is conducted to a violet powder.
  • the 3T3 cell line expressing GFP-PEA-15 (3T3 -GFP-PEA-15 cell) was obtained as described by FORMSTECHER et al. (Dev., CeIl., 2001, 1: 239) by transfection of NIH3T3 cells with a pEGFP-PEA-15 plasmid obtained as described by KITSBERG et al. (J. Neurosci., 1999, 19: 8244).
  • Neomycin resistant clones were selected and cultured in DMEM (Roche) supplemented with 10% fetal calf serum, 2mM glutamine, penicillin (5 IU / ml) and streptomycin (5mg). g / ml).
  • the expression of the GFP-PEA-15 protein was verified by measuring the fluorescence of the living cells and a Western blot analysis with an anti-GFP antibody (Roche, Cat No. 1,814,460 mixture of two monoclonal antibodies made in the mouse (clone 7.1 and clone 13.1)) and an anti-PEA-15 (rabbit polyclonal antibody,
  • the 3T3 -GFP-PEA-15 cells are then cultured to confluence in a HAM-F 12 medium comprising penicillin (10,000 U / ml) / streptomycin (10,000 ⁇ g / ml), 7% calf serum fetal (BIOWHITTAKER) before fluorescence resonance energy transfer (FRET) experiments.
  • a HAM-F 12 medium comprising penicillin (10,000 U / ml) / streptomycin (10,000 ⁇ g / ml), 7% calf serum fetal (BIOWHITTAKER) before fluorescence resonance energy transfer (FRET) experiments.
  • a stock solution of compound 6D6-1, dissolved in DMSO at a concentration of about 20 mM is diluted before use in PBS at a concentration of 10 times the final concentration.
  • Compound 6D6-1 is tested at 10 ⁇ M and 10 -5 M.
  • the cells are gently shaken (100 rpm) for 60 minutes before reading the fluorescence to allow the compounds to diffuse and enter the cells.
  • the cells are irradiated at an excitation length of 465 nm.
  • the GFP protein excited at 465 nm emits a fluorescence signal at 535 nm.
  • the binding of the compound 6D6-1 to the GFP-PEA-15 protein allows a fluorescence resonance energy transfer (FRET) resulting in the emission of a fluorescence signal at 590 nm.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • astrocytes Primary cultures of astrocytes were prepared from cortex and striatum of mouse embryos (day 16) as described by ARAUJO et al. (J. Biol Chem., 1993, 268: 5911). Primary cultures of astrocytes were maintained for 24 hours in the absence of serum, a condition known to induce a predominantly cytoplasmic localization of ERK.
  • the cells were then treated or not with 50 ⁇ M of compound 6D6-1 for 2 hours.
  • ERK and PEA-15 The subcellular localization of ERK and PEA-15 was observed by confocal microscopy after labeling the cells with fluorescent antibodies.
  • the cells were washed twice with PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, without CaCl 2 or MgCl 2 , Sigma), and fixed with 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.5), for 15 minutes, then washed twice with PBS comprising 0.1 M glycine, at room temperature.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffered saline, without CaCl 2 or MgCl 2 , Sigma
  • Non-specific sites were blocked with PBS containing 10% normal goat serum (NGS) for one hour at room temperature.
  • NGS normal goat serum
  • the cells were then incubated overnight at 4 ° C with antibodies specific for PEA-15 (rabbit polyclonal antibody, Sharif et al, Neuroscience, 2004) or ERK (polyclonal rabbit antibody, Santa Cruz K-23 ( ref sc-94)), diluted in PBS containing 1.5% NGS. After three washes in PBS, the cells are incubated for one hour at room temperature with an Alexa-488 labeled anti-rabbit antibody (Molecular Probes).
  • PEA-15 rabbit polyclonal antibody, Sharif et al, Neuroscience, 2004
  • ERK polyclonal rabbit antibody, Santa Cruz K-23 ( ref sc-94)
  • the cell nuclei were labeled with TOPRO 2 iodide according to the manufacturer's specifications (HOECHST).
  • the coverslips were mounted on glass slides in a medium
  • FLUOROMOUNT Southern Biotechnology
  • TCS SP2, LEICA confocal microscopy
  • the excitation wavelengths were 488 nm for Alexa 488 and 633 nm for TOPRO, the emission wavelengths were 510-525 nm for Alexa-488 and 647 nm for TOPRO.
  • the GST-PEA-15 fusion protein was obtained according to the protocol described by Kitsberg et al. (J. Neurosci, 1999, 19: 8244).
  • the GST-PEA-15 fusion proteins were recovered after bacteria and incubated in the presence of glutathione-coated Sepharose bead.
  • the beads thus obtained are incubated in the presence of 1 or 5 ⁇ M of 6D6-1, in 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.4; 100 mM NaCl; 1 mM MgCl 2 ; Triton X-100 1%). After a series of three washings, the beads are dried on a cellulose membrane and the fluorescence is quantified by means of a phospholmager (Biorad), by measuring the fluorescence of lissamine by excitation at 543 nm and measuring the emission at 590 nm.
  • a phospholmager Biorad
  • results are the average of three independent experiments.
  • the results indicate that the average fluorescence intensity depends on the concentration of the compound and thus suggest a specific interaction between the 6D6-1 compound and the PEA-15 protein.

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Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux composés pseudo-peptidiques de formule définie, aptes à interagir avec la protéine PEA- 15 et leur utilisation dans des procédés de criblage et un procédé de diagnostic d'états pathologiques susceptibles d'impliquer PEA-15.

Description

Nouveaux composés interagissant avec PEA- 15
La présente invention a pour objet des composés susceptibles d'interagir avec la protéine PEA- 15 (Phosphoprotéine Enrichie dans les Astrocytes, d'un poids moléculaire de 15 kDa), leurs dérivés fluorescents, ainsi que la mise en œuvre de ces composés dans des procédés de criblage et de diagnostic, et des compositions pharmaceutiques.
PEA- 15 est une petite protéine cytoplasmique de 130 acides aminés abondamment exprimée dans le cerveau, en particulier dans les astrocytes, et, plus faiblement, de manière ubiquitaire dans de nombreux autres tissus.
La structure de cette protéine, très conservée parmi les vertébrés, comprend à l'extrémité N-terminale un domaine effecteur de mort (Death Effector Domain, DED) de
80 acides aminés, et un domaine NES (Nuclear Export Signal), et une extrémité C- terminale de structure peu organisée contenant des sites de phosphorylation par la protéine kinase C (PKC), et par la protéine kinase calcium/calmoduline-dépendante de type II.
La séquence génomique de PEA- 15 est composée de quatre exons et s'étend sur environ 10,2 kb d'ADN génomique (Wolford et al, 2000, Gène, 241:143).
PEA- 15 est présente in vivo sous différentes formes : non phosphorylée, mono- et bi-phosphorylée, présentant chacune une activité biologique différente.
PEA- 15 est une protéine multifonctionnelle susceptible d'interagir avec de nombreux partenaires au moyen de ses différents domaines fonctionnels, et selon son degré de phosphorylation (Renault et a\., Biochem. Pharmacol, 2003, 66:1581). A ce jour, sept partenaires de PEA- 15 ont été identifiés, intervenant dans les multiples fonctions remplies par cette protéine, à savoir FADD, caspase 8, Omi/HtraA2, ERKl /2, Akt, Rsk2, et la phospholipase Dl. Par ces multiples interactions, PEA- 15 paraît jouer un rôle central dans de nombreux processus cellulaires physiologiques et/ou pathologiques. II a été montré que cette protéine possède, notamment, les propriétés d'inhiber l'apoptose, d'inhiber l'entrée des cellules dans le cycle cellulaire, d'être impliquée dans le rétablissement de la signalisation des intégrines inhibée par l'expression de l'oncogène H- Ras, d'inhiber la prolifération cellulaire, et d'être impliquée dans le transport du glucose et la sécrétion d'insuline (Renault et al, Biochem. Pharmacol., 2003, 66 :1581). Par exemple, il a été observé que la suppression de l'expression de PEA- 15 dans les astrocytes se traduit par une augmentation de la sensibilité de ces derniers à l'apoptose induite par le TNF alpha (Kitsberg et al., J. Neurosci., 1999, 19:8244) et que la réduction de l'expression de cette protéine entraîne une augmentation de la prolifération de différentes lignées cellulaires telles que les astrocytes, les lymphocytes et les hépatocytes (Formstecher et al., Dev. CeIl., 2001, 1:239). Il a également été observé que l'expression de la protéine inhibe également la migration cellulaire. Par ailleurs, cette protéine pourrait également être impliquée dans la genèse et/ou le développement des tumeurs primitives cérébrales, ainsi que dans les processus métastatiques.
Par exemple, une augmentation de l'expression de PEA- 15 a été observée dans différentes tumeurs telles que les gliomes, le cancer de l'ovaire, le cancer du rein, le cancer du sein, dans les carcinomes hépatocellulaires, les lymphomes ou les mélanomes (Hwang et al, Genomics, 1997, 42 :540 ; Bera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91 :9789).
De même, la surexpression de cette protéine dans des souris transgéniques augmente leur sensibilité aux cancers de la peau induits chimiquement (Formisano et al, Oncogene, 2005, 24:7012). Par contre, l'expression de PEA- 15 dans un tissu induit une inhibition de la permissivité de ce dernier vis-à-vis de l'invasion par des cellules tumorales.
Il a également été montré que des cellules du cancer du sein pouvaient être sensibilisées à la chimiothérapie par diminution de l'expression de PEA-15 (Stassi et al., Cancer Res., 2005, 65:6668). WO 2004/108961 propose l'utilisation de PEA- 15 à titre de marqueur et de cible thérapeutique pour les papillomes.
En outre, une surexpression de PEA- 15 a été observée dans les fibroblastes, les muscles striés et le tissu adipeux de patients affectés par le diabète de type II (Condorelli et al., EMBO. J., 1997, 17 :3858), et il a été montré que la suppression de l'expression de cette protéine permettait de restaurer la sécrétion d'insuline en réponse au glucose.
Une surexpression de cette protéine est également observée dans certains processus inflammatoire.
EP 1 189 060 propose l'utilisation de PEA- 15 à titre de marqueur et de cible thérapeutique dans les maladies neurodégénératrices. Par conséquent, il apparaît que PEA- 15 pourrait servir de cible thérapeutique dans de nombreux états pathologiques. Or, à ce jour, on ne dispose pas de composés aisément accessibles susceptibles de moduler l'activité de cette protéine. Par ailleurs, on ne dispose pas non plus d'outils susceptibles de permettre de cribler aisément de tels composés.
Par conséquent, il existe un besoin d'accéder facilement à des composés susceptibles d'interagir avec PEA- 15 et de moduler son activité. II existe également un besoin de disposer d'outils de criblage de composés susceptibles de moduler l'activité biologique de PEA-15.
Il existe également un besoin de disposer de nouveaux composés pour le traitement d'état pathologique tel que le cancer et le diabète de type II.
Il existe également un besoin de disposer d'outils pour le diagnostic et/ou le pronostic d'états pathologiques impliquant PEA- 15, et notamment une altération de son expression voire de son activité biologique, tels que le diabète de type II, le cancer, notamment les gliomes, les carcinomes, ou des états pathologiques impliquant un excès ou un défaut d'apoptose ou de prolifération cellulaire, par exemple.
La présente invention a pour but de donner satisfaction en ces termes.
De manière inattendue, les inventeurs ont observé que des composés de formule générale (I) suivante :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle n, p, r, R1, R2, R3, R4 et A sont tels que définis par la suite, sont susceptibles d'interagir avec PEA- 15 et d'en moduler l'activité.
Ainsi, les inventeurs ont observé qu'un composé conforme à l'invention, comme par exemple le composé fluorescent 6D6-1, détaillé par la suite, est capable d'interagir de manière spécifique avec une protéine de PEA- 15 et de moduler son activité biologique.
Par ailleurs, les inventeurs ont également observé qu'il était possible d'utiliser un composé de l'invention notamment fluorescent en combinaison avec une protéine de fusion fluorescente GFP-PEA- 15 (Green Fluorescent Protein) pour développer des procédés mettant en oeuvre un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) permettant, par exemple, le criblage d'agents susceptibles ά" interagir avec PEA- 15 ainsi que le diagnostic et/ou le pronostic d'états pathologiques impliquant PEA- 15.
Il est également possible d'utiliser un tel composé notamment fluorescent en combinaison avec une protéine de fusion GST-PEA 15 pour mettre en œuvre un procédé de criblage par compétition permettant d'identifier des agents suceptibles d'interagir avec PEAl 5.
Ainsi, selon un de ses premiers aspects, la présente invention se rapporte à un composé de formule (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle : n peut être égal à 0 ou 1 , p peut représenter un nombre entier variant de 1 à 6, et en particulier variant de 2 à 4, r peut représenter un nombre entier variant de 1 à 12, et en particulier variant de 2 à 6, et en particulier est égal à 4,
R1 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C20, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 à C10,
R2 peut représenter une chaîne latérale d'acide aminé ou d'un dérivé d'acide aminé,
-COR3 peut représenter un radical acyle porteur d'une entité basique R3 notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes :
Figure imgf000006_0001
dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y peut représenter N ou N+R7, et R6 et R7 peuvent représenter, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C20, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 à C10,
R4 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C10, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 à C10,
A peut représenter un radical dérivé d'un reste xanthène, notamment un reste phényl-9 xanthène, d'un reste acridine, notamment un reste phényl-9 acridine, ou d'un reste 4-bora-3a,4a-diaza indacène, et ses dérivés.
Au sens de l'invention, on entend désigner par « reste » au regard d'une molécule donnée, la molécule sous la forme d'un radical. Avantageusement, A peut représenter un marqueur fluorescent.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte à un procédé de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15, ou un de ses analogues, comprenant au moins les étapes consistant à : (a) mettre en présence, au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé notamment fluorescent conforme à l'invention, dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence,
(c) mesurer un premier signal S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence, (d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un milieu présumé contenir au moins un agent à cribler dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(e) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence,
(f) comparer les premier et second signaux S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « analogue de protéine PEA- 15 » un composé de type peptidique, présentant une homologie de séquences avec
PEA- 15 et une activité biologique similaire, ainsi que des variants susceptibles de résulter de l'épissage alternatif de l'ARNm codant pour cette protéine, comme par exemple celui décrit par Underhill et al. (Mamm. Génome, 2001, 12:172), ainsi que des fragments de cette protéine ou de ces composés de type peptidique présentant la capacité de lier un composé de formule conforme à l'invention. Par « activité biologique », on entend désigner les propriétés biologiques de la protéine PEA- 15, notamment telles qu'indiquées précédemment.
Par « homologie de séquences », on entend désigner une identité de séquence d'au moins 85 %, en particulier d'au moins 90 % et plus particulièrement d'au moins 95 % de l'analogue avec la protéine PEA- 15, et en particulier les séquences caractéristiques de
PEA- 15 (Renault et al., Biochem. Pharmacol. 2003, 66 : 1581), à savoir le domaine DED, et notamment la séquence conservée RxDLF, le domaine NES (Nuclear Export Signal), les séquences peptidiques impliquées dans l'interaction de la protéine PEA- 15 avec ses différents partenaires protéiques (par exemple ERKl /2, Akt, FADD, caspase 8) et les séquences peptidiques comprenant les sites de phosphorylation par la protéine kinase C (PKC) ou la protéine kinase calcium/camoduline-dépendante de type II, à savoir respectivement les motifs LTRIPSAKK (S 104) et DIRQPSEEIIK (S 116) (S : serine phosphorylée).
La nature des modifications susceptibles d'être introduites dans une protéine pour obtenir des analogues tels que définis ci-dessus et les procédés pour les mettre en œuvre relèvent des connaissances et de la pratique de routine de l'homme de l'art. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15, ou un de ses analogues, comprenant au moins les étapes consistant à :
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA- 15 liée à un support avec un composé conforme à l'invention, dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(b) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a),
(c) mettre en présence l'ensemble obtenu à l'étape a) avec un agent à cribler dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, (d) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c),
(e) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte à un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique susceptible d'impliquer PEA- 15 par détection et, éventuellement, par quantification de PEA- 15 dans un échantillon biologique prélevé chez un individu comprenant au moins les étapes consistant à :
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé, notamment fluorescent, conforme à l'invention dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, (b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence,
(c) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence,
(d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un échantillon biologique présumé comprendre au moins une protéine PEA- 15 dans des conditions propices à l'interaction de ladite protéine PEA- 15 de l'échantillon biologique avec ledit composé selon l'invention,
(e) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence,
(f) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle présence de la protéine PEA- 15 dans ledit échantillon biologique, et éventuellement une conclusion relative à la quantité de ladite protéine.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte également à un complexe isolé comprenant au moins une protéine PEA- 15 et au moins un composé de formule conforme à l'invention. Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention concerne également une trousse pour criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA-15, ou l'un de ses analogues, comprenant : au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification, et - au moins un composé conforme à l'invention, le cas échéant, A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence.
COMPOSES
Les composés de l'invention sont de formule générale (I) suivante : (I)
Figure imgf000010_0001
dans laquelle : n peut être égal à 0 ou 1 , - P peut représenter un nombre entier variant de 1 à 6, et en particulier variant de 2 à 4, r peut représenter un nombre entier variant de 1 à 12, et en particulier variant de 2 à 6, et en particulier égal à 4,
R1 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C20, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10 substitué par un ou plusieurs atome(s) d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 à
C10,
R2 peut représenter une chaîne latérale d'acide aminé ou d'un dérivé d'acide aminé,
-COR3 peut représenter un radical acyle porteur d'une entité basique R3 notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes :
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000011_0001
dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y peut représenter N ou N+- R7, et R6 et R7 peuvent représenter, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C20, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 à C10,
R4 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C10, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 à C10,
A peut représenter un radical dérivé d'un reste xanthène, notamment d'un reste phényl-9 xanthène, d'un reste acridine, notamment d'un reste phényl-9 acridine, ou d'un reste 4-bora-3a,4a-diaza indacène, et ses dérivés.
Selon un mode de réalisation, A peut représenter un marqueur fluorescent. Au sens de l'invention, on entend désigner par « reste » au regard d'une molécule donnée, la molécule sous la forme d'un radical.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « dérivé », des formes tautomères, des formes stéréoisomères, des formes polymorphes, des sels pharmaceutiquement acceptables et des solvates pharmaceutiquement acceptables.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « forme tautomère », l'un des isomères dont les structures diffèrent par la position d'un atome, en général d'hydrogène, et d'une ou de plusieurs liaisons multiples et qui sont capables de se transformer facilement et réversiblement l'un dans l'autre. Au sens de la présente invention, on entend désigner par « forme stéréoisomère » des isomères de molécules de constitution identique, et qui ne diffèrent que par un ou des arrangement(s) différents de leurs atomes dans l'espace.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « sels pharmaceutiquement acceptables » des composés obtenus par réaction d'un composé de formule générale (I) avec une base ou un acide.
A titre d'exemple de base convenant à l'invention on peut mentionner l'hydroxyde de sodium, le méthoxyde de sodium, l'hydrure de sodium, le t-butoxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, et analogues, et leurs mélanges, dans des solvants tels que le THF (tétrahydrofurane), le méthanol, le t-butanol, le dioxane, Fisopropanol, l'éthanol, leurs analogues, et leurs mélanges.
Les bases organiques comme la lysine, l'arginine, la diéthanolamine, la choline, la trométhamine, la guanidine et leurs dérivés peuvent également être utilisés.
A titre d'exemple de sels d'addition d'acide convenant à l'invention, on peut citer ceux susceptibles d'être préparés par réaction d'un composé de formule générale (I) avec un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide nitrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide méthanesulfonique, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide salycilique, l'acide hydroxynapthoïque, l'acide ascorbique, l'acide palmitique, l'acide succinique, l'acide benzoïque, l'acide benzènesulfonique, l'acide tartrique, et analogues, et leurs mélanges, dans les solvants tels que l'acétate d'éthyle, l'éther, des solvants alcooliques, l'acétone, le
THF, le dioxane, leurs analogues et leurs mélanges.
On entend désigner par « forme polymorphe », des composés obtenus par cristallisation d'un composé de formule générale (I) dans différentes conditions, telles que par exemple l'utilisation de différents solvants, généralement utilisés pour la cristallisation.
La cristallisation à différentes températures impliquent, par exemple, différents modes de refroidissement, par exemple des refroidissements très rapides à très lents impliquant des étapes de chauffage ou fusion de composés suivi par un refroidissement graduel ou rapide.
La présence de formes polymorphes peut être déterminée au moyen d'analyses par spectroscopie RMN, par spectroscopie IR (infrarouge), par DSC (Différenciai Scaning
Calorimetry), par diffraction de rayons X ou d'autres techniques analogues. Au sens de la présente invention, on entend désigner par « radical alkyle », un radical hydrocarboné linéaire, ou ramifié, saturé ou insaturé, de 1 à 20 atomes de carbone, en particulier de 2 à 18 atomes de carbone, en particulier de 3 à 16 atomes de carbone, en particulier de 4 à 12 atomes et plus particulièrement de 6 à 10 atomes de carbone, susceptible d'être substitué par des radicaux tels que définis ci-après.
A titre d'exemple, sont inclus dans cette définition des radicaux tels que méthyle, éthyle, isopropyle, n-butyle, t-butyle, t-butylméthyle, n-propyle, pentyle, n- hexyle, 2-éthylbutyle, heptyle, octyle, nonyle, ou décyle.
Au sens de la présente invention, on entend par « radical cycloalkyle », un cycle alkylène, optionnellement ramifié, saturé ou insaturé, de 3 à 10 atomes de carbone, en particulier en C4 à C8 et plus particulièrement en C6, tel que le cyclopropyle, le cyclopentyle, le cyclohexyle, le cyclohexylméthyle, le cycloheptyle.
Au sens de la présente invention, on entend par « radical aryle », un cycle aromatique comprenant de 1 à 3 noyaux aromatiques, éventuellement fusionnés, de 6 à 20 atomes de carbone, notamment de 10 à 14 atomes de carbone, comprenant optionnellement un plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et le cas échéant étant substitués par des radicaux tels que définis ci-dessus et ci-après.
A titre d'exemple de radicaux aryle convenant à la mise en œuvre de l'invention il est possible de mentionner le radical phényle, le radical benzyle, le radical phenétyle, le radical naphtyle, le radical anthryle, et tous les cycles aromatiques comprenant un plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, tel que par exemple la pyridine, le thiophène, le pyrrole, le furanne, la quinoléine, l'acridine, le xanthène, le 4-bora-3a,4a diaza indacène.
Au sens de la présente invention, on entend par « radical alkoxy », un radical -
OR dans lequel le reste alkyle est un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé de 1 à 20 atomes de carbone, en particulier de 2 à 18 atomes de carbone, en particulier de 3 à 16 atomes de carbone, en particulier de 4 à 12 atomes et plus particulièrement de 6 à 10 atomes de carbone.
On peut citer, à titre d'exemple, les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy, butoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, n-pentoxy, isopentoxy, sec-pentoxy, t-pentoxy, hexyloxy, méthoxyéthoxy, méthoxypropoxy, éthoxyéthoxy, éthoxypropoxy et analogues.
Au sens de la présente invention, on entend par « radical acyle », un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, comprenant une fonction C=O et ayant de 1 à 10 atomes de carbone, en particulier de 2 à 8 atomes de carbone et de préférence de 3 à 6 atomes de carbone et plus particulièrement de 4 atomes de carbone par exemple, un radical formyle, un radical acétyle, un radical succinyle, un radical benzoyle, un radical 1-naphtoyle ou 2-naphtoyle.
La chaîne hydrocarbonée des radicaux précités peut être, le cas échéant, interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis, par exemple, parmi O, N et S, pour former, par exemple, un radical hétéroalkyle comme un radical alkyléther, un radical alkylester ou un hétérocycle. Au sens de la présente invention, on entend par « radical hétérocyclique », par exemple, et de manière non limitative, un radical furanyle, un radical thiophènyle, un radical pyrrolyle, un radical oxazolyle, un radical isoxazolyle, un radical thiazolyle, un radical isothiazolyle, un radical imidazolyle, un radical pyrazolyle, un radical furazanyle, un radical pyranyle, un radical pyridinyle, un radical pyridadinyle, un radical pyrimidinyle ou un radical pyradinyle, un radical furannyle, un radical quinoléinyle.
Les radicaux définis ci-dessus peuvent le cas échéant être substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène.
Au sens de la présente invention, on entend par « atome d'halogène », un atome de F, Cl, Br ou I. Les atomes d'halogène avantageusement mis en œuvre dans la présente invention sont le fluor et le chlore.
En particulier, les radicaux alkylhalogénés peuvent être des radicaux perfluoroalkyles de formule générale CnF2IVf1 dans laquelle n peut varier de 1 à 10, en particulier de 2 à 8 et plus particulièrement de 3 à 6.
Selon un mode de réalisation, R1 peut représenter notamment un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, par exemple un radical aryle en C6 à C10, par exemple optionnellement substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène.
En particulier, R1 peut représenter notamment un atome d'hydrogène, un radical méthyle, un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phénétyle, ou un radical perfluoroalkyle de formule CnF2n+! dans laquelle n peut varier de 1 à 10, en particulier de 2 à 8 et plus particulièrement de 3 à 6. En particulier, R1 peut être un radical méthyle ou un radical benzyle.
Selon un mode de réalisation, R2 peut représenter une chaîne latérale d'un acide aminé ou dérivé d'acide aminé choisi, par exemple, parmi l'alanine, la glutamine, la leucine, la glycine, le tryptophane, la β-alanine, la phénylalanine, la 4-chloro- phénylalanine, l'acide isonipécotinique, l'acide 4-aminométhylbenzoïque, l'acide 3- tétrahydroisoquinoléinique et l'histidine libre ou benzylée.
L'acide aminé ou dérivé d'acide aminé peut, par exemple, être choisi parmi :
Figure imgf000016_0001
acide 4-amino-méthylbenzoique acide 3-tétrahydroisoquinoléinique glycine
hi
Figure imgf000016_0002
Selon un mode de réalisation, R2 peut être de formule (VI) suivante :
Figure imgf000017_0001
dans laquelle
* symbolise une liaison covalente avec le reste d'un composé de formule générale (I), et R5 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C20, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atome(s) d'halogène.
Selon un mode de réalisation, les radicaux alkyle ou cycloalkyle susceptibles de figurer le radical R5 peuvent être également substitués par les radicaux tels que définis précédemment ou voir leurs chaînes hydrocarbonées interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes tels que définis précédemment.
En particulier, R5 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitués par un ou plusieurs atome(s) d'halogène.
En particulier, R5 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical méthyle, un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phénétyle, un radical perfluoroalkyle de formule CnF2IVf1 dans laquelle n peut varier de 1 à 10, en particulier de 2 à 8 et plus particulièrement de 3 à 6. En particulier, R5 peut être un radical méthyle ou un radical benzyle.
R2 peut notamment être une histidine ou un dérivé d'histidine tel qu'une histidine benzylée.
Selon un mode de réalisation, -COR3 peut être un radical acyle, notamment un radical acétyle, substitué par une entité basique R3 telle que définie précédemment. En particulier, cette entité basique R3 peut être un radical de formule (VII) suivante :
Figure imgf000018_0001
(VII) dans laquelle :
* symbolise une liaison avec le radical acyle, Y peut représenter N ou N+R7, et - Ré et R7 peuvent représenter, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitués par un ou plusieurs atome(s) d'halogène.
En particulier, R6 et R7 peuvent représenter, indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical méthyle, un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phénétyle, un radical perfluoroalkyle de formule
CnF2IVf1 dans laquelle n peut varier de 1 à 10, en particulier de 2 à 8 et plus particulièrement de 3 à 6.
En particulier, R6 et R7 peuvent être indépendamment l'un de l'autre un radical méthyle ou un radical benzyle
Selon un mode de réalisation, le radical A peut représenter un radical de formule générale (Va) :
Figure imgf000018_0002
dans laquelle :
* symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I), - Z = O ou NH, R8 = Rg = N(R')2 avec R pouvant représenter un radical alkyle en C1 à C6, en particulier un radical alkyle en C2-C4 ou R8 = OH et R9 = O,
- R10 = R11 = H ou X, avec X = F, Cl, Br, en particulier X = F ou d'une part R8 et R10 et/ou d'autre part R9 et R11 peuvent respectivement former un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons condensé avec le reste acridine ou xanthène, le cas échéant substitué par un, deux, trois, voire plus de groupements méthyle et dont l'hétéroatome est placé en α du reste acridine ou xanthène et est choisi parmi N ou O,
R12 = *-NHSθ2- ou *-NHCO-, avec * symbolisant une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I) - R13 = H, HSO3- ou COOH.
En particulier, le radical de formule (Va) peut être tel que R8 = R9 = NMe2 ou NEt2,
En particulier, le radical A de formule (Va) peut être tel que R12 peut être en position ortho, meta ou para. En particulier, lorsque R12 = *-NHSO2-, il peut être avantageusement en position ortho.
Selon un mode de réalisation, A peut représenter un radical de formule générale (Vb) :
Figure imgf000019_0001
dans laquelle :
* symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I), R14 peut représenter un reste acyle en C2 à C4,
R15 peut représenter un radical hétérocy clique en C5 à C7, et notamment un radical thiophenyl, et
R16 = R17 = X, avec X = F, Cl ou Br, et notamment F. Selon un mode de réalisation, les radicaux de formule (Va) et (Vb) peuvent être des radicaux de marqueurs fluorescents.
A titre d'exemples de marqueurs fluorescents susceptibles de convenir à la mise en œuvre de la présente invention, il est possible de mentionner la rhodamine et ses dérivés tels que la tetraméthylrhodamine, la rhodamine Red-X (lissamine), le Bodipy et ses dérivés, le Texas Red® et ses dérivés, la fluoresceine et ses dérivés, l'Alexa® et ses dérivés ainsi que l'Oregon Green® et ses dérivés.
Selon un mode de réalisation, le radical A peut représenter un marqueur fluorescent choisi parmi des marqueurs fluorescents de formule(s) suivante(s) :
Figure imgf000020_0001
Sulfonylrhodamine (lissamine) Fluoresceine Oregon Green®
Figure imgf000020_0002
Tetraméthylrhodamine Alexa 532®
Figure imgf000020_0003
Bodipy dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I) selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le marqueur fluorescent A peut être choisi parmi des marqueurs fluorescents dérivés de la rhodamine, comme par exemple un dérivé de la sulfonylrhodamine B.
En particulier, le reste du composé de formule générale (I) peut être lié en position ortho au dérivé de la sulfonylrhodamine (lissamine).
Notamment, le radical dérivé de lissamine peut être représenté par le radical de formule suivante :
Figure imgf000021_0001
Lissamine dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I) selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être de formule générale (I) dans laquelle n peut être égal à 0.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être représenté, par exemple, par la formule générale (II) suivante :
Figure imgf000021_0002
dans laquelle : R1, R2, R3, R4, A et p peuvent être, par exemple, tels que définis précédemment.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être de formule générale (I) dans laquelle n peut être égal à 0, p peut être égal à 4, R1 peut représenter un radical méthyle, R2 peut représenter un radical de formule suivante :
Figure imgf000022_0001
dans laquelle * et R5 peuvent être tels que définis précédemment, et -COR3 peut représenter un radical acyle, notamment acétyle, substitué par une entité basique R3, de formule suivante :
Figure imgf000022_0002
dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, et Y et R6 peuvent être tels que définis précédemment, et R4 peut être un atome d'hydrogène.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être de formule générale (III) suivante :
Figure imgf000022_0003
dans laquelle A, R5 , Y et R6 peuvent être tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être un composé de formule générale (III) telle que définie précédemment dans laquelle le marqueur fluorescent A peut être, par exemple, un radical sulfonylrhodamine tel que défini précédemment, et notamment tel que le reste du composé de formule (III) soit en ortho du radical sulfonylrhodamine, R5 peut être un radical benzyle, Y peut être N et Ré peut être un radical méthyle.
Avantageusement, un composé conforme à l'invention n'est pas un composé de formule générale (I) telle que définie précédemment dans laquelle le marqueur fluorescent A est un radical sulfonylrhodamine (lissamine) tel que le reste du composé de formule (I) soit en para du radical sulfonylrhodamine.
Avantageusement, un composé conforme à l'invention n'est pas un composé de formule générale (III) telle que définie précédemment dans laquelle le marqueur fluorescent A est un radical sulfonylrhodamine (lissamine) tel que le reste du composé de formule (III) soit en para du radical sulfonylrhodamine, et R5 est un radical benzyle, Y est N et R6 est un radical méthyle.
Selon une variante de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être représenté par la formule (IV) suivante :
Figure imgf000023_0001
PROCEDE DE SYNTHESE
Des composés conformes à l'invention peuvent être obtenus soit sous forme d'une bibliothèque de composés de formules variées, soit sous forme de composés isolés sous une forme pure ou en mélange de stéréoisomères. Le procédé de synthèse peut être effectué sur une résine de polystyrène de type REM (REgenerated Michael), constitué d'une résine hydroxyméthylpoylstyrène fonctionnalisée par un ester acrylique accepteur de Michael.
La résine de type REM convient particulièrement à la synthèse de bibliothèque d'aminés tertiaires, via une addition initiale de type Michael d'une aminé afin de fixer cette dernière au support suivie de la synthèse de la molécule sur support et enfin sa coupure du support selon un processus de quaternisation de l'aminé puis une élimination de type
HOFMANN.
Après fixation d'une aminé secondaire sur le support solide, les autres résidus peuvent être introduits au moyen de méthodes de couplage de peptides classiques, utilisant l'activation DIC/HOBt (1 ,3-diisopropylcarbodiimide/l -hydroxybenzotriazole).
Un radical A, par exemple, de type sulforhodamine (lissamine, par exemple), peut être greffé directement sur une fonction aminé, par exemple du radical 8-NH2 d'une lysine ou sur un espaceur greffé sur le radical 8-NH2 de la lysine, tel qu'un espaceur diamino-butane, au moyen d'une liaison uréthane.
La libération du ou des composés de la résine peut être effectuée après alkylation de l'aminé secondaire en présence par exemple d'un halogenure d'alkyle tel qu'un iodure de méthyle, ou un bromure de benzyle, suivi d'un traitement en présence d'une résine basique échangeuse d'ions de type Amberlite IRA-95. Selon un mode de réalisation, un tel procédé de synthèse conforme à l'invention peut être réalisé en parallèle sur des plaques, par exemple des plaques de 96 puits, en utilisant un équipement FLEXCHEM (Robbins Scientific).
Selon un mode de réalisation, un composé selon l'invention peut être obtenu selon un procédé de préparation sur support solide comprenant au moins les étapes consistant à : a. coupler sur un support solide de formule
Figure imgf000024_0001
un composé de formule :
Figure imgf000024_0002
pour obtenir un composé de formule (1) suivante
Figure imgf000025_0001
R4 peut être tel que défini ci-dessus. b. déprotéger le composé de formule (1), puis de coupler ledit composé déprotégé avec le composé de formule :
Figure imgf000025_0002
pour obtenir un composé de formule (2) suivante :
, NHBoc
I H o . N N
R2 pouvant être tel que défini ci-dessus, c. déprotéger le composé de formule (2), puis coupler ledit composé déprotégé avec le composé de formule suivante:
Figure imgf000025_0003
pour obtenir un composé de formule (3) suivante :
NHFmoc , NHBoc
Figure imgf000025_0004
p pouvant être tel que défini ci-dessus, d. déprotéger du groupe Fmoc le composé de formule (3), puis coupler ledit composé déprotégé avec un composé R3COOH pour obtenir un composé de formule (4) suivante :
Figure imgf000026_0001
COR3 pouvant être tel que défini ci-dessus, e. déprotéger le composé de formule (4), pour obtenir un composé de formule (5) suivante :
Figure imgf000026_0002
f. optionnellement, faire réagir le composé de formule (5) avec le p- nitrophénylchloroformate puis avec une diamine de formule
Figure imgf000026_0003
pour obtenir un composé de formule (6) suivante :
Figure imgf000026_0004
r pouvant être tel que défini ci-dessus, g. faire réagir le composé de formule (5) ou le composé de formule (6) avec un traceur électrophile, notamment avec A-Cl, pour obtenir un composé de formule (7) suivante :
Figure imgf000026_0005
R2, R3, A, n, p et r étant tels que définis précédemment. h. cliver le composé de formule (7) avec un composé de formule RlX, Rl pouvant être tel que défini ci-dessus, et X pouvant représenter un atome d'halogène, notamment I ou Br, pour obtenir un composé de formule (I) tel que défini précédemment.
PROCEDE DE CRIBLAGE ET DE DIAGNOSTIC
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15 ou un de ses analogues, comprenant au moins les étapes consistant à :
(a) mettre en présence, au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé fluorescent, conforme à l'invention, dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence,
(b) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence,
(c) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un milieu présumé contenir au moins un agent à cribler dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, (d) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence,
(e) comparer le premier et second signal S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par l'expression « A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence », un couple de marqueurs fluorescents dont le spectre d'émission de l'un (donneur d'énergie de fluorescence) recouvre tout ou partie du spectre d'excitation de l'autre (accepteur d'énergie de fluorescence). En particulier, le spectre d'excitation du donneur ne recouvre pas, ou qu'en très faible partie, le spectre d'excitation de l'accepteur, évitant ou réduisant ainsi l'apparition de faux positifs.
Selon un mode de réalisation, les premier et second signaux peuvent être des signaux fluorescents de l'accepteur et/ou du donneur d'énergie. En présence d'un composé portant un accepteur d'énergie de fluorescence susceptible d'interagir avec un composé portant un donneur d'énergie de fluorescence, l'irradiation de l'ensemble à une longueur du spectre d'excitation du donneur d'énergie de fluorescence peut produire un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET).
Au sens de l'invention, on entend désigner par « transfert d'énergie de fluorescence », un processus physique, dépendant de la distance, par lequel de l'énergie est transmise, de manière non radiative, d'un chromophore excité, le donneur d'énergie de fluorescence, à un autre chromophore, l'accepteur d'énergie de fluorescence, par interaction dipole-dipole.
La manifestation d'un tel transfert peut se détecter par une modulation du signal fluorescent du donneur et/ou du signal fluorescent de l'accepteur, comme par exemple la diminution d'amplitude du signal fluorescent du donneur de fluorescence et/ou par une augmentation d'amplitude du signal fluorescent de l'accepteur.
Les variations d'amplitude du signal fluorescent du donneur peuvent être concomitantes avec les variations d'amplitude du signal fluorescent de l'accepteur. Alternativement, un des signaux fluorescents peut varier sans qu'une variation de l'autre signal fluorescent puisse être détectée.
Les conditions et les paramètres à ajuster pour effectuer un transfert d'énergie de fluorescence relèvent de la pratique de l'homme du métier qui peut se référer par exemple à Sekar and Periasamy (J. CeIl. Biol., 2003, 160:629). Selon un mode de réalisation, la comparaison des premier et second signaux peut permettre de détecter une modulation d'amplitude d'un signal fluorescent.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « modulation d'amplitude d'un signal fluorescent », dans le contexte du transfert d'énergie par résonance de fluorescence, toute modulation de l'amplitude du signal de fluorescence du donneur, de l'amplitude du spectre d'excitation ou l'amplitude du signal d'émission du donneur tel que défini précédemment. Une modulation de ces signaux de fluorescence peut traduire une éventuelle interaction de l'agent à cribler avec une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D. Une telle interaction étant susceptible d'entraîner la dissociation d'un complexe protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D/composé selon l'invention. Selon un mode de réalisation, un procédé de criblage selon l'invention peut comprendre, en outre, une étape consistant à préparer au moins un échantillon contrôle dans lequel ledit milieu ajouté à l'étape c), du procédé selon l'invention définie précédemment, est dépourvu d'agent à cribler.
Le ou les échantillons contrôles peuvent être préparés, selon un procédé conforme à l'invention, simultanément ou indépendamment de la mise en œuvre d'un tel procédé pour le criblage d'un agent susceptible d'interagir avec PEA- 15.
Un procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à comparer un signal S3 mesuré à partir d'un échantillon contrôle avec les signaux S1 et S2 tels que définis précédemment pour en tirer une information sur ledit agent à cribler.
Une différence entre les signaux ainsi comparés peut être informatif de la présence, de la quantité, et/ou d'une interaction avec PEA- 15, d'un agent à cribler dans un échantillon.
Selon un mode de réalisation, le marqueur fluorescent D porté par la protéine PEA- 15 peut être choisi, de manière non limitative, parmi une protéine, telle qu'une protéine fluorescente, un marqueur fluorescent, par exemple choisi parmi un dérivé de la fluoresceine, un dérivé de la rhodamine, un dérivé de l'Alexa 532®, un dérivé du Bodipy ou un dérivé de l'Oregon Green®, sous réserve que D et A soient tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la protéine fluorescente peut être choisie, de manière non exhaustive, parmi la Green Fluorescent Protein, ou un de ses variants fluorescents, tels que la Yellow Fluorescent Protein (YFP), la Cyan Fluorescent Protein (GFP) ou la Red Fluorescent Protein (RFP) ou le DS Red ou un de ses variants.
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent peut être notamment une protéine de fusion, par exemple GFP-PEA- 15. Une telle protéine peut être obtenue par toute technique de biologie moléculaire connue de l'homme du métier, et notamment celles décrites dans « Molecular Cloning : A Laboratory
Manual », CoId Spring Harbor, Laboratory CoId Spring Harbor , NY, 1989, 2d Ed. La construction et l'obtention de vecteur d'expression contenant une protéine de fusion, telle que par exemple GFP-PEA- 15 relève des connaissances et de la pratique habituelles de l'homme du métier. Les séquences codant pour ces protéines sont par exemple disponibles dans des banques de données, sur le site www.ncbi.nlm.nih.gov ou sur le site ca.expasy.org, et également commercialement.
Des vecteurs d'expression, contenant une séquence d'acides nucléiques codant pour la GFP (ou un de ses variants) ou le DS Red peuvent être disponible commercialement, notamment auprès de sociétés telles que Invitrogen ou Clontech.
L'expression de tels vecteurs peut se faire dans toute cellule hôte adaptée, et la récupération de la protéine de fusion ou le cas échéant de l'acide nucléique codant par une telle protéine, comme l'ARNm ou l'ADNc, peut se faire par tout moyen adapté connu de l'homme de l'art.
Par exemple, une protéine de fusion GFP-PEA- 15 a été décrite par KITSBERG ét al. (J. Neurosci., 1999,19:8244). Selon un mode de réalisation, un procédé de criblage conforme à l'invention peut être mis en œuvre, par exemple, en utilisant un composé conforme à l'invention de formule (IV).
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D peut être une protéine de fusion GFP-PEA- 15. Selon un mode de réalisation, un procédé de criblage conforme à l'invention peut être effectué ex vivo ou in vitro.
Par exemple, un procédé conforme à l'invention mis en œuvre peut être effectué ex vivo à partir d'un tissu prélevé à partir d'un animal de laboratoire modifié génétiquement pour que ses cellules expriment, de manière tissu spécifique ou non, une protéine de fusion GFP-PEA- 15.
Un procédé conforme à l'invention réalisé peut être effectué in vitro notamment in cellulo à partir de cellules intactes, ou ex cellulo, par exemple dans un lysat de cellules ou après séparation des éléments d'intérêts, comme la protéine de fusion GFP- PEA-15. Un procédé de criblage conforme à l'invention peut être effectué in cellulo dans des cellules exprimant la protéine de fusion selon l'invention, soit après transfection de cellules, primaires ou en lignées, au moyen d'un vecteur d'expression tel que défini précédemment, soit par mise en culture de cellules prélevées chez un animal de laboratoire modifié génétiquement de manière à exprimer une construction comme défini ci-dessus, soit par perfusion de cellules primaires ou en lignées, par exemple au moyen d'une micropipette ou de tout autre moyen connu de l'homme de l'art, d'une protéine de fusion selon l'invention, ou d'une séquence d'acide nucléique codant pour cette protéine de fusion.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte à un procédé de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15, ou un de ses analogues, comprenant au moins les étapes consistant à :
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA- 15 liée à un support avec un composé conforme à l'invention, dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(b) mesurer un premier signal Sl caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a),
(c) mettre en présence l'ensemble obtenu à l'étape a) avec un agent à cribler dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(d) mesurer un second signal S2, de même nature que Sl, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c), (e) comparer Sl et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA- 15 peut être liée à un support au moyen d'un marqueur dit « marqueur de purification ».
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « marqueur de purification », toute structure susceptible d'être utilisée à des fins de liaison entre la protéine PEA- 15 et un support.
Un marqueur de purification peut être, par exemple et de manière non limitative, une étiquette FLAG, une étiquette polyHistidine, ou une protéine GST(Glutathion S Transferase). Une protéine PEA- 15 liée à un marqueur de purification tel que défini précédemment peut être une protéine de fusion obtenue par toutes méthodes de biologie moléculaire connues de l'homme de l'art, notamment comme indiqué ci-dessus. Par exemple une protéine de fusion GST-PEA- 15 peut être été obtenue selon le protocole décrit par Kitsberg et al. (J. Neurosci, 1999, 19 : 8244).
Selon le marqueur de purification considérée, un support convenant à la mise de l'invention peut être, par exemple et de manière non exhaustive, une surface d'une bille de Sepharose ou d'une plaque pour culture de cellules recouverte de glutathion tel que des plaques 96 puits commercialisées par SIGMA (réf. P3233), une colonne de nickel, un anticorps anti-FLAG lié à une colonne de protéine G ou de protéine A, ou à la surface d'une bille de Sepharose ou au fond d'un puits d'une plaque de culture de cellules.
Par ailleurs pour une mise en œuvre d'un procédé selon, la protéine PEA- 15 peut être liée à la surface d'une sensor ship, pour une mise en œuvre dans un procédé de détection d'un signal par résonance plasmonique de surface, selon des moyens connus de l'homme de l'art.
Selon un mode de réalisation, le composé selon l'invention peut être fluorescent et le premier signal S1 et le second signal S2 peuvent être des signaux de fluorescence.
La mesure de ces signaux peut être obtenue par toutes méthodes de spectrofluorimétrie ou d'imagerie par fluorescence, connues de l'homme de l'art. Les conditions d'excitation et d'enregistrement de l'émission de fluorescence sont à adapter selon différents facteurs connus de l'homme de l'art, tels que, par exemple et de manière non exhaustive, la nature du marqueur fluorescent A, le support sur lequel est la protéine PEA-15.
Une éventuelle interaction de la protéine PEA- 15 avec un agent à cribler entraînant le déplacement du composé selon l'invention préalablement lié peut être détectée par une différence d'intensité de fluorescence entre les deux signaux S1 et S2. Selon un autre mode de réalisation, le premier signal S1 et le second signal S2 peuvent être des signaux obtenus par résonance plasmonique de surface, par exemple au moyen d'un appareil de type Biacore®, selon des protocoles connus de l'homme de l'art.
Ces signaux sont indépendants de la nature fluorescente ou non d'un composé selon l'invention. Ainsi dans cette mise en œuvre du procédé précédemment décrit, le composé conforme à l'invention peut ne pas être fluorescent. La protéine PEA- 15 peut être fixée sur une sensor ship comme décrit précédemment.
Un composé selon l'invention peut être mis en contact avec ladite protéine fixée au sensor ship. Les interactions entre le composé et la protéine peuvent être détectées par résonance plasmonique de surface. Une éventuelle interaction de la protéine PEA- 15 avec un agent à cribler entraînant le déplacement du composé selon l'invention préalablement lié peut être détectée par résonance plasmonique de surface.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique susceptible d'impliquer
PEA- 15 par détection et, éventuellement, quantification de la protéine PEA- 15 dans au moins un échantillon biologique présumé comprendre ladite protéine comprenant au moins les étapes consistant à :
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé fluorescent conforme à l'invention dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence, (c) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence,
(d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un échantillon biologique présumé comprendre au moins une protéine PEA- 15 dans des conditions propices à l'interaction de ladite protéine PEA- 15 de l'échantillon biologique avec ledit composé selon l'invention,
(e) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence, (f) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle présence de la protéine PEA- 15 dans ledit échantillon biologique, et éventuellement une conclusion relative à la quantité de ladite protéine. Une comparaison du premier et du second signal peut permettre une détection d'une modulation d'amplitude d'un signal fluorescent. Une telle modulation peut être informatif de la présence, et éventuellement, de la quantité de protéine PEA- 15 éventuellement présente dans l'échantillon. La détermination de la présence et éventuellement de la quantité de la protéine
PEA- 15, éventuellement comparée à des valeurs de références obtenues, soit à partir d'un échantillon contrôle comprenant une quantité connue de cette protéine, soit à partir d'un échantillon biologique sain, éventuellement en parallèle avec la mesure précédente, peut être informatif d'un état pathologique impliquant notamment PEA- 15 et/ou une évolution d'un tel état.
A titre d'exemple d'état pathologique susceptible d'être diagnostiqué et/ou pronostiqué par un procédé selon l'invention, on peut mentionner le cancer, et notamment les gliomes, les cancers des ovaires, les cancers du sein, les cancers du rein, les mélanomes, et également le diabète de type II. Un échantillon biologique peut être obtenu à partir d'un tissu biologique ou d'un fluide corporel.
Un procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à comparer un signal S3 mesuré à partir d'un échantillon contrôle avec les signaux S1 et S2 tels que définis précédemment pour en tirer une information la présence et, éventuellement, la quantité de PEA- 15 dans un échantillon biologique.
Selon un mode de réalisation, le premier et le second signal peuvent être comparé à un ou plusieurs signaux fluorescents détectés à partir d'un ou plusieurs échantillon(s) contrôle(s). De tels échantillons contrôles peuvent être obtenus en mettant en œuvre un procédé selon l'invention et en remplaçant à l'étape c) l'échantillon biologique par un ou des échantillon(s) comprenant une quantité connue de protéine PEA- 15.
Le ou les échantillons contrôles peuvent être préparés selon un procédé conforme à l'invention simultanément ou indépendamment de la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention pour la détection et, éventuellement, la quantification de la protéine PEA- 15 dans un échantillon biologique. Selon un mode de réalisation, il est possible de faire varier les quantités connues de PEA- 15 du ou des échantillon(s) contrôle(s) ou la quantité de protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D et ou de composé fluorescent conforme à l'invention de façon au pouvoir obtenir une gamme étalon.
Une corrélation d'un signal de fluorescence à l'une des quantités variables précédemment définies peut être ainsi réalisée. Ainsi, une corrélation d'un signal de FRET peut être établie avec des quantités connues de protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, de composé fluorescent conforme à l'invention de protéine PEA- 15.
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D peut, notamment, être telle que définie précédemment. Selon un mode de réalisation, une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D peut être une protéine de fusion de type GFP-PEA- 15.
Selon un mode de réalisation, le composé conforme à l'invention peut être tel que défini précédemment, et notamment peut être de formule (IV) tel que précisé ci- dessus. De nombreuses variations d'un procédé de diagnostic selon l'invention peuvent être envisagées et le cas échéant combinées à des caractéristiques d'un procédé de criblage selon l'invention.
Ainsi, selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique susceptible d'impliquer PEA- 15 mis en œuvre selon les principes indiqués ci-dessus pour le procédé de criblage, par exemple, mettant en œuvre une détection par résonance plasmonique de surface, dans lequel, l'agent à cribler est remplacé par l'échantillon biologique.
La PEA- 15 éventuellement présente dans un tel échantillon pourra se lier au composé conforme à l'invention et modifier ainsi le signal enregistré.
TROUSSE POUR CRIBLAGE OU DIAGNOSTIC
La présente invention a également pour objet une trousse pour criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15, ou d'un de ses analogues ou pour le diagnostic et/ou le pronostic d'un état pathologique susceptible d'impliquer PEA- 15 comprenant : au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification, et au moins un composé conforme à l'invention, le cas échéant, A et D étant tels qu'ils peuvent définir un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence. Selon un mode de réalisation, la protéine PEA- 15 portant un marqueur de fluorescence D ou un marqueur de purification peut être telle que définie précédemment.
Selon un mode de réalisation, lorsque la trousse selon l'invention est plus particulièrement mise en œuvre pour le diagnostic et/ou pronostic d'un état pathologique, elle peut comprendre en outre au moins une protéine PEA- 15 non marquée. Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion formée d'une protéine
PEA- 15 avec une protéine fluorescente ou la protéine PEA- 15 non marquée peuvent être présentes dans une trousse conforme à l'invention sous la forme d'une séquence d'acides nucléiques codant pour lesdites protéines, telle qu'un ADNc, un ARNm, ou un vecteur d'expression.
COMPOSITION PHARMACEUTIQUE
Selon un mode de réalisation, la présente invention a également pour objet un composé conforme à l'invention pour une utilisation à titre d'agent actif dans une composition pharmaceutique. Au sens de la présente invention, on entend désigner par « composition pharmaceutique », une composition ou une substance présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard de maladies humaines ou animales, ainsi qu'une substance ou composition destinée à être utilisée afin d'établir un diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique ou non, ou de restaurer, corriger ou modifier les fonctions organiques d'un individu.
La méthode de diagnostic et/ou de pronostic susceptible d'être mise en œuvre par une composition pharmaceutique selon l'invention peut être effectuée in vitro ou ex vivo.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut comprendre un composé conforme à l'invention de formule générale (I), ou un de ses dérivés tels qu'une forme tautomère, une forme stéréoisomère, une forme polymorphe, un sel pharmaceutiquement acceptable, ou un solvate pharmaceutiquement acceptable, en combinaison avec des véhicules, des diluants, ou des excipients usuellement utilisés en pharmacie.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut être présentée sous une forme galénique usuellement utilisée dans le domaine, telle que des comprimés, des gélules, une poudre, un sirop, une solution, une suspension.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut être présentée sous une forme galénique convenant à l'administration par d'autres voies, telles que la voie orale, la voie nasale, la voie sublinguale, la voie topique, la voie ophtalmique, la voie rectale, etc. Une composition cosmétique conforme à l'invention peut également être présentée sous une forme stérile convenant à une administration par voie parentérale, telle que la voie sous-cutanée, transdermique, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intra-cardiaque, etc.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut également être présentée sous une forme lyophilisée, combinée au moment de son utilisation avec une solution aqueuse stérile ou non.
En particulier, la solution aqueuse peut être stérile si la composition conforme à l'invention est destinée à une administration parentérale.
La quantité de composé conforme à l'invention présente dans une composition pharmaceutique est à ajuster, par exemple, selon la voie d'administration, le type d'individu à traiter, la nature de la pathologie à traiter.
L'ajustement des quantités et des posologies en fonction de ces paramètres est connu de l'homme de l'art.
Une composition conforme à l'invention comprend généralement une quantité suffisante d'un composé conforme à l'invention.
On entend désigner par « quantité suffisante », la quantité nécessaire à l'obtention d'un effet recherché. Au sens de la présente invention, un tel effet peut être par exemple la réduction ou le traitement des symptômes présentés par un individu présumé atteint d'une pathologie telle qu'un cancer ou un diabète de type II. Le cancer peut être par exemple un gliome, un cancer du rein, un cancer du sein, ou un mélanome. Selon encore un autre de ses objets, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé conforme à l'invention pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'un état pathologique susceptible d'impliquer PEA-15. La protéine PEA- 15 peut être impliquée soit par une altération de son expression, à savoir par exemple une surexpression ou un manque d'expression, soit par une altération de son activité biologique, se traduisant, par exemple, par une augmentation de son activité ou une diminution de son activité, et pouvant être le résultat soit d'une mutation (par exemple substitution, insertion ou délétion) dans la séquence de la protéine PEA- 15, soit résultant d'une altération des signaux cellulaires modulant l'activité biologique et/ou l'expression de la protéine PEA-15.
En relation avec un état pathologique susceptible d'impliquer PEA- 15, le terme « traitement » vise à désigner la réduction de la sévérité d'une maladie, telle que par exemple la réduction des symptômes ou la prévention de ces symptômes. Ainsi, et dans ce dernier cas, un composé conforme à l'invention peut être administré avant le développement de l'état pathologique.
Les états pathologiques visés par la présente invention peuvent être notamment ceux définis précédemment, tels que le cancer, et notamment les gliomes, les cancers du rein, les cancers du sein, les cancers de l'ovaire, les mélanomes, et également le diabète de type II.
On entend désigner par « individu » au sens de la présente invention l'homme, des primates non humains, ainsi que des animaux de laboratoire tels que les rongeurs (par exemple souris, rat, cochon d'inde ou hamster), des animaux de ferme, en particulier des animaux économiquement intéressants tels que la volaille,les bovins, les ovins, les porcs, les chèvres et les poissons, et particulièrement ceux produisant des produits convenant à la consommation humaine tels que la viande, les œufs et le lait. Ce terme vise également à désigner les animaux domestiques tels que les chats et les chiens.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique telle que définie précédemment. Selon un mode de réalisation, la présente invention a également pour objet un complexe isolé comprenant au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification et au moins un composé de formule conforme à l'invention, A et D étant tels qu'ils peuvent définir un couple accepteur- donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence.
Selon une variante de réalisation, un complexe selon l'invention peut comprendre à titre de protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, une protéine de fusion GFP-PEA- 15 et à titre de composé de formule conforme à l'invention, un composé de formule (IV), tel que défini précédemment.
De nombreuses modifications de l'invention telle qu'exposée ci-dessus peuvent être envisagées par l'homme de l'art sans s'écarter de la portée de celle-ci. De telles modifications sont couvertes par la présente demande. L'invention est illustrée par les exemples suivants, qui ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : représente des images obtenues par imagerie confocale de la localisation du composé intracellulaire des protéines ERK et PEA- 15 avant et après traitement avec 50 μM 6D6-1. Le traitement des cellules avec le composé 6D6-1 se traduit par une relocalisation de la protéine ERK dans le noyau alors que la protéine PEA- 15 reste cytoplasmique.
La barre d'échelle correspond à 40 μm.
Figure 2 : représente l'intensité moyenne de la fluorescence de bille de Sépharose recouverte de glutathion, portant une protéine de fusion GST-PEA- 15, incubées en présence de 1 et 5 μM de 6D6-1.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Synthèse du composé 6D6-1 Synthèse de (l-Méthyl-pipéridin-4-yl)-carbamic acid fert-butyl ester
— N ) NHBoc Dans un réacteur, la résine REM (REgenerated Michael, résine de polystyrène) (5 g, 4 mmol, 0,8 mmol.g .mol"1 de charge théorique) est gonflée dans une qualité minimale de diméthyleformamide (DMF). Une solution de tertiobutyloxycarbonylaminopipéridine (8 g, 40 mmol) dans le DMF (50 ml) est portée à 80 °C puis ajoutée à la résine en suspension. Le mélange est agité pendant 16 heures à 80 °C, puis filtré, et lavé trois fois selon la séquence DMF, CH2CI2 MeOH. Dans une seringue Supelco, la résine (2.3g, 1.5 mmol) est expansée dans 20 mL de DMF et l'iodure de méthyle (3.81 mL, 61 mmol) est ajouté. Le mélange est agité par rotation pendant 24 h, la résine est filtrée, lavée avec 3 séquences de DMF/ DCM. Dans les mêmes conditions une deuxième étape d'alkylation par l'iodure de méthyle est répétée. Le clivage de la pipéridine sur la résine est réalisé dans un ballon avec 40 mL de DCM et en présence de la résine IRA-95 (3.16 g, 1.5 mmol). Après 24 h d'agitation par un barreau aimanté, la résine est filtrée, lavée DCM/MeOH. Le filtrat est collecté et amené à sec sous pression réduite. Une purification par flash chromatographie sur gel de silice (DCM/ MeOH : 9/1) conduit au (1- Methyl-piperidin-4-yl)-carbamic acid tert-butyl ester sous forme d'une poudre blanche.
Rdt = 100 % ; 1H NMR (CDCl3, 200 MHz): 4.43 (m, IH), 2.77 (m, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.13-1.87 (m, 4H), 1.53-1.46 (m, 2H), 1.42 (s, 9H). 13C NMR (CDCl3, 50 MHz) 155.60, 110.00, 54.86, 46.47, 32.90, 28.80.
Synthèse de la l-méthyl-pipéridin-4- His(Bzl)-NHBoc
Figure imgf000040_0001
A température ambiante et sous agitation magnétique, la (1-Methyl-piperidin- 4-yl)-carbamic acid tert-butyl ester (0.07 g, 0.34 mmol) est traitée par une solution de
TFA/DCM (ImL /ImL) pendant 1H30. La solution est ensuite évaporée à sec sous pression réduite et le produit obtenu est séché sous vide pendant 18 h. La JV-méthyl pipéridine déprotégée est dissout dans 1 mL de DMF et sont successivement additionnés la Boc-His(Bzl)-OH (0.12 g, 0.32 mmol), le benzotriazol-1-yl- oxytrispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate [PyBop] (0.17 g, 0.32 mmol) et la diisopropyléthylamine [DIEA] (0.27 mL, l.όmmol). Après une agitation magnétique de 3h à température ambiante, la réaction est évaporée à sec puis purifié par HPLC et conduit après lyophilisation à une huile translucide.
Rdt?= 100 % ; tr = 15.74 min ; λ = 220 nm ; gradient t = 0 min : 0 % solvant B à t = 5 min : 0 % solvant B à t = 35 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calculé pour [C24H35N5O3 +H ] 442 trouvé 442.
Synthèse de la Fmoc-Lys(o-Lissamine)-OH
Figure imgf000041_0001
A température ambiante et sous agitation magnétique, la Fmoc-lys(Boc)-OH
(0.57 g, 1.23 mmol) est traitée par une solution de TFA/DCM (5mL /5mL) pendant 2H. La solution est ensuite évaporée à sec sous pression réduite et le produit obtenu est séché sous vide pendant 18 h. La Fmoc-lys-OH est ensuite mis en solution dans 17 mL de DCM puis de la triéthylamine [TEA] (1.38 mL, 9.84 mmol) est additionné pour ajusté le pH au environ de 8-9, on observe alors la formation d'un gel qui disparaît lors de l'addition en une demi-heure à 0°C de la lissamine (0.78 g, 1.35 mmol). Ramené à température ambiante, la réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 5 H. Le mélange réactionnel est ensuite dilué avec 50 mL de DCM, lavé deux fois avec HCl 10% (10 mL), puis la phase organique est séchée sur sulfate de soduim, évaporée à sec. La purification et la séparation des deux isomères de position est obtenue sur gel de silice (dichlorométhane/méthanol/acide acétique : 94/5/1) et conduit à deux poudres violettes.
Rdt : isomère para 40 % et isomère ortho 5 %. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calculé pour [C48H52N4O10S2+^ 909, trouvé 909. Synthèse de la l-méthyl-pipéridin-4- FHs(BzI)- Lys(o-Lissamine)-NHFmoc
Figure imgf000042_0001
A température ambiante et sous agitation magnétique, la l-methyl-piperidin-4- His(Bzl)-NHBoc (0.03 g, 0.08 mmol) est traitée par une solution de TFA/DCM (ImL /ImL) pendant 1H30. La solution est ensuite évaporée à sec sous pression réduite et le produit est séché sous vide pendant 18 h. L'aminé ainsi obtenue est dissout dans 0.5 mL de DMF et sont successivement additionnés la Fmoc-Lys(o-Lissamine)-OH (0.06 g, 0.07 mmol), le PyBop (0.03 g, 0.07 mmol) et la TEA (0.01 mL, 0.07 mmol). Après une agitation magnétique de 4h à température ambiante, la réaction est évaporée à sec puis purifié par HPLC et conduit après lyophilisation à une poudre violette.
Rdt = 15 %; tr = 18.97 min ; λ = 220 nm ; gradient t = 0 min : 5 % solvant B à t = 30 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calculé pour [C67H77N9O10S2+^ 1232, trouvé 1232.
Synthèse de la l-méthyl-piperidin-4-His(Bzl)-Lys(o-Lissamine)- 1-méthyl- lH-imidazol-4-yl)-acctamidc
Figure imgf000043_0001
Dans une première étape la l-méthyl-piperidin-4- His(Bzl)-Lys(o-Lissamine)- NHFmoc (O.Olmg, 0.01 mmol) est traitée par 0.12 mL de pipéridine dans 0.5 mL de DMF pendant 1 H à température ambiante. La solution est ensuite directement injectée sur HPLC semi-préparative et conduit au produit déprotégé sur l'aminé terminale avec un rendement de 40 %. L'aminé (0 .004 g, 0.004 mmol) ainsi obtenue est engagée dans une dernière étape de couplage avec la l-methyl-4-imidazoleacetic acid hydrochloride (0.001 g, 0.007 mmol) en présence de PyBop (0.003 g, 0.007 mmol) et de DIEA ( 0.005 mL, 0.033 mmol) dans 0.3 mL de DMSO. Après lh30 d'agitation à température ambiante, la solution est directement injectée sur HPLC semi-préparative et conduit après lyophilisation à une poudre violette.
Rdt 30 % tr = 17.70 min ; λ = 220 nm ; gradient t = 0 min : 5 % solvant B à t = 35 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calculé pour [C58H73N1 iO9S+H ] 1132, trouvé 1132.
EXEMPLE 2
Détection par FRET de l'interaction du composé 6D6-1 avec la PEA-15-GFP La lignée cellulaire 3T3 exprimant la GFP-PEA-15 (cellule 3T3 -GFP-PEA- 15) a été obtenue comme décrit par FORMSTECHER et al. (Dev. CeIl., 2001, 1: 239) par transfection des cellules NIH3T3 avec un plasmide pEGFP-PEA-15 obtenu comme décrit par KITSBERG et al. (J. Neurosci., 1999, 19:8244). Des clones résistants à la néomycine (G418) ont été sélectionnés et cultivés dans un milieu DMEM (Roche) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, 2mM de glutamine, de la pénicilline (5 IU/ml) et de la streptomycine (5 g/ml).
L'expression de la protéine GFP-PEA- 15 a été vérifiée par mesure de la fluorescence des cellules vivantes et une analyse par transfert WESTERN avec un anticorps anti-GFP (Roche, cat n° 1 814 460 mélange de deux anticorps monoclonaux faits chez la souris (clone 7.1 et clone 13.1)) et un anti-PEA-15 (anticorps polyclonal de lapin,
Sharif et al, Neuroscience, 126 :263, 2004).
Les cellules 3T3 -GFP-PEA- 15 sont ensuite cultivées jusqu'à confluence dans un milieu HAM-F 12 comprenant de la pénicilline (10 000 U/ml)/stréptomycine (10 000 μg/ml), 7 % de sérum de veau fœtal (BIOWHITTAKER) avant les expériences de transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET).
Une solution stock du composé 6D6-1, dissous dans du DMSO à une concentration d'environ 20 mM est diluée avant utilisation dans du PBS à une concentration de 10 fois la concentration finale.
Le composé 6D6-1 est testé à 10^ M et 10"5 M.
Après addition du composé 6D6-1, les cellules sont agitées doucement (100 rpm) pendant 60 minutes avant la lecture de la fluorescence afin de permettre aux composés de diffuser et de rentrer dans les cellules. Les cellules sont irradiées à une longueur d'excitation à 465 nm.
La protéine GFP excitée à 465 nm émet un signal de fluorescence à 535 nm.
La liaison du composé 6D6-1 à la protéine GFP-PEA- 15, permet un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) se traduisant par l'émission d'un signal de fluorescence à 590 nm.
EXEMPLE 3
Effet du composé 6D6-1 sur la localisation de ERK
Des cultures primaires d'astrocytes ont été préparées à partir de cortex et de striatum d'embryons de souris (jour 16) comme décrit par ARAUJO et al. (J. Biol. Chem., 1993, 268:5911). Les cultures primaires d'astrocytes ont été maintenues pendant 24 heures en absence de sérum, une condition connue pour induire une localisation principalement cytoplasmique d'ERK.
Les cellules ont ensuite été traitées ou non par 50 μM du composé 6D6-1 pendant 2 heures 15.
La localisation sub-cellulaire d'ERK et de PEA- 15 a été observée par microscopie confocale après marquage des cellules par des anticorps fluorescents.
Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS (tampon salin phosphate de Dulbecco, sans CaCl2 ni MgCl2, Sigma), et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS (pH 7,5), pendant 15 minutes, puis lavées deux fois avec du PBS comprenant 0,1 M de glycine, à température ambiante.
Ensuite, les cellules ont été incubées pendant 5 minutes dans du PBS contenant 0,2 % de triton X-100.
Les sites non spécifiques ont été bloqués avec du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) pendant une heure à température ambiante.
Puis les cellules ont été incubées sur la nuit à 4 °C avec des anticorps spécifiques de PEA- 15 (anticorps polyclonal de lapin, Sharif et al, Neuroscience, 2004) ou de ERK (anticorps polyclonal de lapin, Santa Cruz K-23 (ref sc-94)), dilués dans du PBS contenant 1,5 % de NGS. Après trois lavages dans du PBS, les cellules sont incubées pendant une heure à température ambiante avec un anticorps anti-lapin marqué par Alexa-488 (Molecular Probes).
Les noyaux cellulaires ont été marqués avec de l'iodure de TOPRO2 selon les spécifications du fabricant (HOECHST). Les lamelles ont été montées sur des lames de verre dans un milieu
FLUOROMOUNT (Southern Biotechnology) et examinées par microscopie confocale (TCS SP2, LEICA) avec les filtres appropriés.
Pour l'analyse confocale, les longueurs d'ondes d'excitation étaient 488 nm pour Alexa 488 et 633 nm pour TOPRO, les longueurs d'ondes d'émission étaient 510-525 nm pour Alexa-488 et 647 nm pour TOPRO.
Le traitement des astrocytes par 50 μM du composé 6D6-1 conduit à la relocalisation d'ERK dans le noyau, alors que PEA- 15 reste cytoplasmique (Figure 1). EXEMPLE 4
Interaction 6D6-1 /protéine PEA-15
La protéine de fusion GST-PEA- 15 a été obtenue selon le protocole décrit par Kitsberg et al. (J. Neurosci, 1999, 19 : 8244). Les protéines de fusion GST-PEA- 15 ont été récupérées après Iy se des bactéries et incubées en présence de bille de Sépharose recouverte de gluthation.
Les billes ainsi obtenues sont incubées en présence de 1 ou 5 μM de 6D6-1, dans un tampon Tris-HCl 20 mM pH7,4 ; NaCl 100 mM ; MgCl2 1 mM ; Triton X-100 1 %). Après une série de trois lavages, les billes sont séchés sur une membrane de cellulose et la fluorescence est quantifiée au moyen d'un phospholmager (Biorad), en mesurant la fluorescence de la lissamine par excitation à 543 nm et mesure de l'émission à 590 nm.
Les résultats sont la moyenne de trois expériences indépendantes. Les résultats indiquent que l'intensité moyenne de fluorescence dépend de la concentration du composé et suggèrent ainsi une interaction spécifique entre le composé 6D6-1 et la protéine PEA- 15.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé de formule générale (I) suivante :
Figure imgf000047_0001
dans laquelle : n est égal à 0 ou 1, p représente un nombre entier variant de 1 à 6, et en particulier variant de 2 à 4, r représente un nombre entier variant de 1 à 12, et en particulier variant de 2 à 6, et en particulier est égal à 4,
R1 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C20, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 à C10,
R2 représente une chaîne latérale d'acide aminé ou d'un dérivé d'acide aminé,
-COR3 représente un radical acyle porteur d'une entité basique R3 notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes :
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000048_0001
dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y représente N ou N+ R7, et R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C20, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radicaux alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radicaux alkyle en C1 à C10,.
R4 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1 à C10, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou plusieurs radicaux alkoxy en C1 à C6, ou un ou plusieurs radicaux alkyle en C1 à C10,
A représente un radical dérivé d'un reste xanthène, d'un reste acridine ou d'un reste 4-bora-3a,4a-diaza indacène, et ses dérivés.
2. Composé selon la revendication 1, dans lequel A représente un marqueur fluorescent.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel R1 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en
C6 à C10, optionnellement substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène.
4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel R1 représente un radical méthyle, un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n- propyle, un radical benzyle, un radical phénétyle ou un radical perfluoroalkyle de formule CnF2n+1 dans laquelle n peut varier de 1 à 10.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel R2 représente une chaîne latérale d'un acide aminé ou dérivé d'acide aminé choisi parmi l'alanine, la glutamine, la leucine, la glycine, le tryptophane, la β-alanine, la phénylalanine, la 4-chloro-phénylalanine, l'acide isonipécotinique, l'acide 4-aminométhylbenzoïque, l'acide 3-tétrahydroisoquinoléinique et l'histidine libre ou benzylée.
6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel R2 est de formule (VI) suivante :
Figure imgf000049_0001
dans laquelle
* symbolise une liaison covalente avec le reste d'un composé de formule générale (I), et
R5 représente un radical alkyle en C1-C20 saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3-C10, saturé ou insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène.
7. Composé selon la revendication précédente, dans lequel R5 représente un radical méthyle, un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phénétyle, un radical perfluoroalkyle de formule CnF2n+1 dans laquelle n peut varier de 1 à 10.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel -COR3 est un radical acyle substitué par une entité basique R3 de formule (VII) suivante :
Figure imgf000049_0002
dans laquelle :
* symbolise une liaison avec le radical acyle,
Y peut représenter N ou N+R7, et
R6 et R7 représentent, indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène.
9. Composé selon la revendication précédente, dans lequel R6 et R7 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un radical méthyle, un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phénéthyle, un radical perfluoroalkyle de formule CnF2IVf1 dans laquelle n peut varier de 1 à 10.
10. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel A représente un radical de formule générale (Va) :
Figure imgf000050_0001
dans laquelle : . * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I),
- Z = O ou NH,
R8 = R9 = N(R)2 avec R' représentant un radical alkyle en C1 à C6, en particulier C2 à C4 ou R8 = OH et R9 = O,
- R10 = R11 = H Ou X, avec X = F, Cl, Br, - ou, d'une part R8 et R10 et/ou d'autre part R9 et R11 forment respectivement un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons, condensé avec le reste acridine ou xanthène, le cas échéant substitué par un, deux, trois groupements méthyle et dont l'hétéroatome est placé en α du reste acridine ou xanthène et est choisi parmi N ou O,
R12 = *-NHSO2- ou *-NHCO-, avec * symbolisant une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I)
- Ri3 = H, HSO3 " ou COOH,
ou un radical de formule générale (Vb) :
Figure imgf000051_0001
dans laquelle :
* symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I), R14 représente un reste acyle en C2 à C4, R15 représente un radical hétérocyclique en C5 à C7, et
- R16 = R17 = X, avec X = F, Cl ou Br.
11. Composé selon la revendication précédente, dans lequel R12 est en position ortho.
12. Composé selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, dans lequel le radical A représente un marqueur fluorescent choisi parmi le Bodipy et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, le Texas Red® et ses dérivés, la fluorescéine et ses dérivés, l'Alexa® et ses dérivés et l'Oregon Green® et ses dérivés.
13. Composé selon la revendication précédente, dans lequel le marqueur fluorescent A est choisi parmi les marqueurs fluorescents de formules suivantes :
Figure imgf000052_0001
Sulfonylrhodamine (lissamine) Fluoresceine Oregon Green®
Figure imgf000052_0002
Tetraméthylrhodamine Alexa 532®
Figure imgf000052_0003
Bodipy dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule générale (I).
14. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel n est égal à O.
15. Composé selon la revendication précédente, représenté par la formule générale (II) suivante :
Figure imgf000053_0001
dans laquelle :
R1, R2, R3, R4, A et p sont tels que définis selon l'une des revendications 1 à 13.
16. Composé selon la revendication 9, représenté par la formule générale (III) suivante :
Figure imgf000053_0002
dans laquelle A, R5, Y et Ré, sont tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 6 à 13.
17. Composé selon la revendication précédente, représenté par la formule (IV) suivante :
Figure imgf000053_0003
18. Procédé de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15 ou un de ses analogues, comprenant au moins les étapes consistant à : a) mettre en présence au moins une protéine PEA- 15 liée à un support avec un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, b) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a), c) mettre en présence l'ensemble obtenu à l'étape a) avec un agent à cribler dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, d) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c), e) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
19. Procédé de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15 ou un de ses analogues, comprenant au moins les étapes consistant à : a) mettre en présence, au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 2 à 17, dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence, c) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence, d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un milieu présumé contenir au moins un agent à cribler dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, e) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence, f) comparer les premier et second signaux S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
20. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel le marqueur fluorescent D est choisi parmi une protéine, telle qu'une protéine fluorescente, un marqueur fluorescent choisi parmi un dérivé de la fluorescéine, un dérivé de la rhodamine, un dérivé de l'Alexa 532®, un dérivé du Bodipy ou un dérivé de l'Oregon Green®.
21. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la protéine fluorescente est choisie parmi la Green Fluorescent Protein, ou un de ses variants fluorescents tels que la Yellow Fluorescent Protein (YFP), la Cyan Fluorescent Protein (GFP) ou la Red Fluorescent Protein (RFP) ou le DS Red ou un de ses variants.
22. Procédé selon la revendication 20 ou 21, dans lequel la protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D est une protéine de fusion GFP-PEA- 15.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisée en ce qu'il est effectué in cellulo.
24. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il est effectué dans des cellules exprimant une protéine de fusion GFP-PEA- 15.
25. Procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique susceptible d'impliquer PEA- 15 par détection et, éventuellement, quantification de la protéine PEA- 15 dans au moins un échantillon biologique présumé comprendre ladite protéine comprenant au moins les étapes consistant à : a) mettre en présence au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 2 à 17, dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine, b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence, c) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence, d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un échantillon biologique présumé comprendre au moins une protéine PEA- 15 dans des conditions propices à l'interaction de ladite protéine PEA- 15 de l'échantillon biologique avec ledit composé selon l'invention, e) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'énergie de fluorescence, f) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle présence de la protéine PEA- 15 dans ledit échantillon biologique, et éventuellement une conclusion relative à la quantité de ladite protéine.
26. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D est telle que définie selon l'une quelconque des revendications 20 à 22.
27. Complexe isolé comprenant au moins une protéine PEA- 15 et au moins un composé de formule telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
28. Trousse pour criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA- 15, ou d'un de ses analogues, ou pour le diagnostic et/ou pronostic d'un état pathologique susceptible d'impliquer PEA- 15, comprenant : - au moins une protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification, et au moins un composé de formule telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, le cas échéant, A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en œuvre d'un transfert d'énergie par résonance de fluorescence.
29. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour une utilisation à titre d'agent actif dans une composition pharmaceutique.
30. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
31. Utilisation d'un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'un état pathologique impliquant PEA- 15.
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