CN101336248A - 与pea-15相互作用的新型化合物 - Google Patents

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CN101336248A CNA2006800524123A CN200680052412A CN101336248A CN 101336248 A CN101336248 A CN 101336248A CN A2006800524123 A CNA2006800524123 A CN A2006800524123A CN 200680052412 A CN200680052412 A CN 200680052412A CN 101336248 A CN101336248 A CN 101336248A
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Abstract

本发明涉及能够与PEA－15蛋白相互作用的、确定的式的新型假肽化合物，和涉及其在筛选方法中的用途，和涉及可能牵涉PEA－15的病理学状况的诊断方法。

Description

与PEA-15相互作用的新型化合物
本发明涉及能够与PEA-15蛋白(星形胶质细胞中富含的磷蛋白，其具有15kDa的分子量)相互作用的化合物，它们的荧光衍生物，和这些化合物在筛选和诊断方法中的应用，以及药物组合物。
PEA-15是具有130个氨基酸的小的细胞质蛋白质，所述蛋白质在脑中，特别是星形胶质细胞中大量表达，并且普遍地在许多其他组织中表达，但表达程度较低。
该蛋白质的结构(在脊椎动物动物中非常保守)在N-末端包含具有80个氨基酸的死亡效应结构域(DED)和NES(核输出信号)结构域以及在C-末端包含低组织化结构，所述低组织化结构包含通过蛋白激酶C(PKC)和通过II型依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶进行的磷酸化的位点。
PEA-15的基因组序列是由4个外显子组成并在基因组DNA的大约10.2kb上延伸(Wolford等人，2000，Gene，241：143)。
PEA-15在体内以不同的形式存在：非磷酸化形式、单和二磷酸化形式；每一种形式表现出不同的生物学活性。
PEA-15是可通过其不同功能结构域以及根据其磷酸化程度与许多伙伴相互作用的多功能蛋白质(Renault等人，Biochem.Pharmacol，2003，66：1581)。迄今为止，已鉴定了参与由该蛋白质执行的多种功能的PEA-15的7个伙伴，即FADD、胱天蛋白酶8、Omi/HtraA2、ERK1/2、Akt、Rsk2和磷脂酶D1。通过这些多种相互作用，PEA-15似乎在许多生理学和/或病理学细胞过程中起着至关重要的作用。
已显示，该蛋白质尤其具有下列性质：抑制凋亡、抑制细胞进入细胞周期、参与由H-Ras癌基因的表达所抑制的整联蛋白信号传导的重建、抑制细胞增殖以及参与葡萄糖的运输和胰岛素的分泌(Renault等人，Biochem.Pharmacol.，2003，66：1581)。
例如，已观察到，星形胶质细胞中PEA-15的表达的抑制导致星形胶质细胞对由TNFα诱导的细胞凋亡的敏感性增加(Kitsberg等人，J.Neurosci.，1999，19：8244)，以及该蛋白质的表达的减少引起不同的细胞系例如星形胶质细胞、淋巴细胞和肝细胞的增殖增加(Formstecher等人，Dev.Cell.，2001，1：239)。还观察到，该蛋白质的表达还抑制细胞迁移。
此外，该蛋白质还能够参与脑原发性肿瘤的发生和/或发展，以及参与转移过程。
例如，在不同肿瘤例如神经胶质瘤、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、肝细胞癌、淋巴瘤或黑素瘤中已观察到PEA-15的表达增加(Hwang等人，Genomics，1997，42：540；Bera等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：9789)。
此外，该蛋白质在转基因小鼠中的过量表达增加了它们对于化学诱导的皮肤癌的敏感性(Formisano等人，Oncogene，2005，24：7012)。
相反地，PEA-15在组织中的表达引起抑制该组织对于肿瘤细胞侵袭的容许。
还显示了，通过减少PEA-15的表达可使乳腺癌细胞对化学疗法敏感(Stassi等人，Cancer Res.，2005，65：6668)。
WO 2004/108961提出了PEA-15作为乳头状瘤的标记物和治疗靶标的用途。
此外，已在患有II型糖尿病的患者的成纤维细胞、横纹肌和脂肪组织中观察到PEA-15的过量表达(Condorelli等人，EMBO.J.，1997，17：3858)，并且显示了，对该蛋白质的表达的抑制使得能够恢复响应于葡萄糖的胰岛素分泌。
还在某些炎症过程中观察到该蛋白质的过量表达。
EP 1,189,060提出了PEA-15作为神经变性疾病中的标记物和治疗靶标的用途。
因此，PEA-15似乎可用作许多病理学状况的治疗靶标。然而，迄今为止，不存在能够调节该蛋白质的活性的容易获得的化合物。
此外，也不存在能够允许容易地筛选此类化合物的工具。
因此，对于容易地获得能够与PEA-15相互作用并调节其活性的化合物存在需要。
还对于拥有能够调节PEA-15的生物学活性的化合物的筛选工具存在需要。
还对于拥有用于治疗病理学状况例如癌症和II型糖尿病的新型化合物存在需要。
还对于拥有用于病理学状况的诊断和/或预后的工具存在需要，所述病理学状况牵涉PEA-15，尤其是其表达和甚至其生物学活性的改变，所述病理学状况例如为II型糖尿病，癌症，特别是神经胶质瘤，癌，或牵涉细胞凋亡或细胞增殖的过度或缺乏的病理学状况。
本发明的目的是满足这些需要。
本发明者出乎意外地观察到下述通式(I)的化合物可以与PEA-15相互作用并且调节其活性：
Figure A20068005241200131
其中n、p、r、R1、R2、R3、R4和A如下文中所定义的。
因此，本发明者已观察到，本发明的化合物，例如荧光化合物6D6-1(在下文中详细描述)，能够以特异的方式与PEA-15蛋白相互作用并且调节其生物学活性。
此外，本发明者还观察到，可能将本发明的化合物特别是荧光化合物与荧光融合蛋白GFP-PEA-15(绿色荧光蛋白)相组合地用于开发施行荧光共振能量转移(FRET)的方法，所述方法允许例如筛选能够与PEA-15相互作用的试剂以及诊断和/或预后牵涉PEA-15的病理学状况。
还可能将此类化合物(特别是荧光化合物)与融合蛋白GST-PEA 15相组合地用于施行通过竞争进行的筛选方法，所述筛选方法使得能够鉴定能够与PEA 15相互作用的试剂。
因此，根据本发明的主要方面之一，本发明涉及下式(I)的化合物：
Figure A20068005241200141
其中：
-n可以等于0或1，
-p可以表示1至6的整数，特别是2至4的整数，
-r可以表示1至12的整数，特别是2至6的整数，特别地等于4，
-R1可以表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-R2可以表示氨基酸或氨基酸衍生物的侧链，
--COR3可以表示携带碱性实体R3的酰基，所述碱性实体R3特别地选自具有下式的基团：
其中，*表示与酰基的共价键，Y可以表示N或N+R7，以及R6和R7可以相互独立地表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-R4可以表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C10烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-A可以表示源自呫吨残基(特别是9-苯基呫吨残基)、吖啶残基(特别是9-苯基吖啶残基)或4-硼-3a，4a-二氮杂引达省(4-bora-3a，4a-diaza indacène)残基的基团，
以及其衍生物。
在本发明的范围内，就给定的分子而言，“残基”意指以基团形式存在的分子。
有利地，A可以表示荧光标记物。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂的方法，所述方法至少包括下列步骤：
a)将至少一种携带荧光标记物D的PEA-15蛋白或其类似物之一与至少一种本发明的化合物特别是荧光化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
b)A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对，
c)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤a)中获得的集合体(ensemble)所特征性的第一信号S1，
d)将步骤a)中获得的集合体与据推测包含至少一种待筛选的试剂的介质在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
e)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
f)比较第一信号S1和第二信号S2，以便就所述PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能的相互作用作出结论。
在本发明的范围内，“PEA-15蛋白的类似物”意指呈现出与PEA-15的序列同源性和相似的生物学活性的肽类型的化合物，以及可由编码该蛋白质的mRNA的选择性剪接产生的变体(例如由Underhill等人(Mamm.Genome，2001，12：172)描述的)，以及具有结合本发明的式的化合物的能力的该蛋白质或这些肽类型化合物的片段。“生物学活性”意指PEA-15蛋白特别是先前指出的蛋白质的生物学性质。
“序列的同源性”意指下列序列之间至少85％，特别地至少90％和更特别地至少95％的的序列同一性：类似物与PEA-15蛋白，特别是PEA-15所特征性的序列(Renault等人，Biochem.Pharmacol.2003，66：1581)，即DED结构域，和特别是RxDLF保守序列，NES结构域(核输出信号)，参与PEA-15蛋白与其不同的蛋白质伙伴(例如ERK1/2、Akt、FADD、胱天蛋白酶8)相互作用的肽序列，以及包含通过蛋白激酶C(PKC)或II型依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶进行的磷酸化的位点的肽序列，即分别地LTRIPSAKK(S104)和DIRQPSEEIIK(S116)(S：磷酸化的丝氨酸)基元。
可导入至蛋白质中以获得上面定义的类似物的修饰的种类和实施它们的方法属于本领域技术人员的知识和常规实践的范围。
根据本发明的另一个方面，本发明的目标为用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂的方法，所述方法至少包括下列步骤：
(a)将至少一种连接至支持物的PEA-15蛋白与本发明的化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触
(b)测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
(c)将步骤a)中获得的集合体与待筛选的试剂在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
(d)测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
(e)比较S1和S2，以便就所述PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能的相互作用作出结论。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及通过检测和任选地通过定量在采自个体的生物样品中的PEA-15来诊断和/或预后可能牵涉PEA-15的病理学状况的方法，所述方法至少包括下列步骤：
(a)将至少一种携带荧光标记物D的PEA-15蛋白或其类似物之一与至少一种本发明的化合物特别是荧光化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
(b)A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对，
(c)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
(d)将步骤a)中获得的集合体与据推测包含至少一种PEA-15蛋白的生物样品在适合于本发明的所述化合物与生物样品中的所述PEA-15蛋白相互作用的条件下进行接触，
(e)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
(f)比较S1和S2，以便就在所述生物样品中PEA-15蛋白的可能存在作出结论，和任选地就所述蛋白质的量作出结论。
根据本发明的另外一个方面，本发明还涉及分离的复合物，其包含至少一种PEA-15蛋白和至少一种本发明的式的化合物。
根据本发明的另外一个方面，本发明还涉及用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂的试剂盒，所述试剂盒包含：
-至少一种携带荧光标记物D或纯化标记物的PEA-15蛋白，和
-至少一种本发明的化合物，
如果需要，A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对。
化合物
本发明的化合物是下述通式(I)的化合物：
Figure A20068005241200181
其中：
-n可以等于0或1，
-p可以表示1至6的整数，特别是2至4的整数，
-r可以表示1至12的整数，特别是2至6的整数，特别地等于4，
-R1可以表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-R2可以表示氨基酸或氨基酸衍生物的侧链，
--COR3可以表示携带碱性实体R3的酰基，所述碱性实体R3特别地选自具有下式的基团：
Figure A20068005241200191
其中，*表示与酰基的共价键，Y可以表示N或N+-R7，以及R6和R7可以相互独立地表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-R4可以表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C10烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-A可以表示源自呫吨残基(特别是9-苯基呫吨残基)、吖啶残基(特别是9-苯基吖啶残基)或4-硼-3a，4a-二氮杂引达省(4-bora-3a，4a-diaza indacène)残基的基团，
以及其衍生物。
根据一个实施方案，A可表示荧光标记物。
在本发明的范围内，就给定的分子而言，“残基”意指以基团形式存在的分子。
在本发明的范围内，“衍生物”意指互变异构体形式、立体异构体形式、多晶型形式、药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂化物。
在本发明的范围内，“互变异构体形式”意指这样的异构体之一，所述异构体的结构的差异在于原子(通常为氢原子)的位置以及一个或多个重键的位置，并且其能够容易且可逆地从一种形式转变成另一种形式。
在本发明的范围内，“立体异构体形式”意指组成(constitution)相同且差异仅在于它们的原子在空间上的不同排列的分子的异构体。
在本发明的范围内，“药学上可接受的盐”意指通过通式(I)的化合物与碱或酸的反应而获得的化合物。
作为适于本发明的碱的实例，可提及在溶剂例如THF(四氢呋喃)、甲醇、叔丁醇、二噁烷、异丙醇、乙醇、其类似物和其混合物中的氢氧化钠、甲醇钠、氢化钠、叔丁醇钾、氢氧化钙、氢氧化镁和类似物以及其混合物。
还可使用有机碱例如赖氨酸、精氨酸、二乙醇胺、胆碱、氨丁三醇、胍及其衍生物。
作为适于本发明的酸加成盐的例子，可提及可通过通式(I)的化合物与酸(例如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、对甲基苯磺酸、甲磺酸、乙酸、柠檬酸、马来酸、水杨酸、羟基萘甲酸、抗坏血酸、棕榈酸、琥珀酸、苯甲酸、苯磺酸、酒石酸和类似物以及其混合物)在溶剂(例如乙酸乙酯、醚、醇溶剂、丙酮、THF、二噁烷、其类似物和其混合物)中的反应而制备的酸加成盐。
“多晶型形式”意指在不同的条件(例如使用不同的通常用于结晶的溶剂)下通过通式(I)的化合物的结晶而获得的化合物。在不同温度下的结晶包括，例如，不同的冷却模式，例如非常快至非常慢的冷却，包括化合物的加热或熔化步骤，然后逐渐或快速冷却。可借助于通过NMR光谱学、IR(红外)光谱学、DSC(差示扫描量热法)、X-射线衍射或其他相似的技术进行的分析来确定多晶型形式的存在。
在本发明的范围内，“烷基”意指线性或支化的、饱和或不饱和的烃基(radical hydrocarboné)，其具有1至20个碳原子，特别地2至18个碳原子，特别地3至16个碳原子，特别地4至12个碳原子和更特别地6至10个碳原子，并可用下文中定义的基团取代。
作为实例，该定义包括诸如甲基、乙基、异丙基、正丁基、叔丁基、叔丁基甲基、正丙基、戊基、正己基、2-乙基丁基、庚基、辛基、壬基或癸基的基团。
在本发明的范围内，“环烷基”意指任选地支化的、饱和或不饱和的、具有3至10个碳原子(特别地C4-C8和更特别地C6)的亚烷基环，例如环丙基、环戊基、环己基、环己基甲基、环庚基。
在本发明的范围内，“芳基”意指芳族环，其包含1至3个任选稠合的、具有6至20个碳原子特别地10至14个碳原子的芳族核，所述芳族核任选地包含一个或多个选自O、N和S的杂原子，并且如果需要，用上文和下文中定义的基团进行取代。
作为适于实施本发明的芳基的实例，可提及苯基、苄基、苯乙基、萘基、蒽基，和包含一个或多个选自O、N和S的杂原子的所有芳香环，例如吡啶、噻吩、吡咯、呋喃、喹啉、吖啶、呫吨、4-硼-3a，4a-二氮杂引达省。
在本发明的范围内，“烷氧基”意指-OR基团，其中烷基残基是线性、支化或环状的、稠合或非稠合的、饱和或不饱和的烃基，其具有1至20个碳原子，特别地2至18个碳原子，特别地3至16个碳原子，特别地4至12个碳原子和更特别地6至10个碳原子。
作为实例，可提及甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、仲戊氧基、叔戊氧基、己氧基、甲氧乙氧基、甲氧丙氧基、乙氧乙氧基、乙氧丙氧基和类似物。
在本发明的范围内，“酰基”意指线性、支化或环状的、稠合或非稠合的、饱和或不饱和的烃基，其包含C＝O官能团和具有1至10个碳原子，特别地2至8个碳原子和优选地3至6个碳原子以及更特别地具有4个碳原子，例如甲酰基、乙酰基、琥珀酰基、苯甲酰基、1-萘甲酰基或2-萘甲酰基。
如果需要，可用一个或多个例如选自O、N和S的杂原子间断上述基团的烃链，从而形成例如杂烷基，例如烷基醚基团、烷基酯基团或杂环。
在本发明的范围内，“杂环基”，例如但非限定性地意指呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、吡唑基、呋咱基、吡喃基、吡啶基、radical pyridadinyle、嘧啶基或radical pyradinyle、呋喃基、喹啉基。
如果需要，上面定义的基团可用一个或多个卤素原子进行取代。
在本发明的范围内，“卤素原子”意指F、Cl、Br或I的原子。本发明中有利地使用的卤素原子是氟和氯。
特别地，烷基卤化的基团(radicaux alkylhalogénés)可以是通式CnF2n+1的全氟烷基，其中n可以为1至10，特别地2至8和更特别地3至6。
根据一个实施方案，R1尤其可以表示氢原子、C1-C18烷基、C2-C16烷基，例如任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基。
特别地，R1尤其可以表示氢原子、甲基、乙基、异丙基、正丙基、苄基、苯乙基或式CnF2n+1的全氟烷基，其中n可以为1至10，特别地2至8和更特别地3至6。
特别地，R1可以是甲基或苄基。
根据一个实施方案，R2可表示氨基酸或氨基酸衍生物的侧链，所述氨基酸或氨基酸衍生物选自丙氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甘氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、苯丙氨酸、4-氯-苯丙氨酸、哌啶-4-羧酸(acideisonipécotinique)、4-氨基甲基苯甲酸、3-四氢异喹啉酸以及游离的或苄基化的组氨酸。
所述氨基酸或氨基酸衍生物可以例如选自：
Figure A20068005241200231
                   
Figure A20068005241200232
4-氨基-甲基苯甲酸                  3-四氢异喹啉酸               甘氨酸
Figure A20068005241200233
                                    
Figure A20068005241200235
哌啶-4-羧酸                       4-氯-苯丙氨酸                   谷氨酰胺
Figure A20068005241200236
Figure A20068005241200237
                            苯丙氨酸    β-丙氨酸
Figure A20068005241200239
色氨酸             亮氨酸
Figure A200680052412002310
Figure A200680052412002311
             丙氨酸
根据一个实施方案，R2可以是下式(VI)的化合物：
Figure A20068005241200241
其中：
-*表示与通式(I)的化合物的残基的共价键，和
-R5可以表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基。
根据一个实施方案，可塑造R5基团的烷基或环烷基还可以用前面定义的基团进行取代，或者甚至它们的烃链被一个或多个前面定义的杂原子间断。
特别地，R5可以表示氢原子、C1-C18烷基、C2-C16烷基、任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基。
特别地，R5可以表示氢原子、甲基、乙基、异丙基、正丙基、苄基、苯乙基、式CnF2n+1的全氟烷基，其中n可以为1至10，特别地2至8和更特别地3至6。
特别地，R5可以是甲基或苄基。
R2尤其可以是组氨酸或组氨酸衍生物例如苄基化的组氨酸。
根据一个实施方案，-COR3可以是用前面定义的碱性实体R3取代的酰基，特别是乙酰基。特别地，该碱性实体R3可以是下式(VII)的基团：
Figure A20068005241200242
其中：
-*表示与酰基的键，
-Y可以表示N或N+R7，和
-R6和R7可以相互独立地表示氢原子、C1-C18烷基、C2-C16烷基、任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基。
特别地，R6和R7可以相互独立地表示氢原子、甲基、乙基、异丙基、正丙基、苄基、苯乙基、式CnF2n+1的全氟烷基，其中n可以为1至10，特别地2至8和更特别地3至6。
特别地，R6和R7可以相互独立地是甲基或苄基。
根据一个实施方案，基团A可以表示通式(Va)的基团：
Figure A20068005241200251
其中：
-*表示与式(I)的化合物的残基的共价键，
-Z＝O或NH，
-R8＝R9＝N(R′)2，其中R′可以表示C1-C6烷基，特别地C2-C4烷基，或者R8＝OH和R9＝O，
-R10＝R11＝H或X，其中X＝F、Cl、Br，特别地X＝F，
-或者，一方面R8和R10和/或另一方面R9和R11可以分别形成5或6元杂环，其与吖啶或呫吨残基稠合，如果需要用1、2、3个或甚至更多个甲基取代，并且其中杂原子置于吖啶或呫吨残基的α位并选自N或O，
-R12＝*-NHSO2-或*-NHCO-，其中*表示与式(I)的化合物的残基的共价键，
-R13＝H，HSO3 -或COOH。
特别地，式(Va)的基团可以是例如R8＝R9＝NMe2或NEt2，
特别地，式(Va)的基团A可以是这样的，即R12可以位于邻位、间位或对位。
特别地，当R12＝*-NHSO2-时，其可以有利地位于邻位。
根据一个实施方案，A可以表示通式(Vb)的基团：
Figure A20068005241200261
其中：
-*表示与式(I)的化合物的残基的共价键，
-R14可以表示C2-C4酰基，
-R15可以表示C5-C7杂环基，尤其是噻吩基，和
-R16＝R17＝X，其中X＝F、Cl或Br，尤其是F。
根据一个实施方案，式(Va)和(Vb)的基团可以是荧光标记物的基团。
作为可适于实施本发明的荧光标记物的实例，可提及罗丹明及其衍生物例如四甲基罗丹明、Red-X罗丹明(丽丝胺)、Bodipy及其衍生物、Texas
Figure A20068005241200262
及其衍生物、荧光素及其衍生物、
Figure A20068005241200263
及其衍生物以及Oregon
Figure A20068005241200264
及其衍生物。
根据一个实施方案，基团A可以表示选自下式的荧光标记物的荧光标记物：
Figure A20068005241200271
磺酰基罗丹明(丽丝胺)                荧光素              Oregon
Figure A20068005241200273
四甲基罗丹明                        Alexa
Figure A20068005241200274
Figure A20068005241200275
Bodipy
其中，*表示与根据本发明的式(I)的化合物残基的共价键。
根据一个实施方案，荧光标记物A可选自从罗丹明衍生的荧光标记物，例如磺酰基罗丹明B的衍生物。
特别地，可将通式(I)的化合物的残基在邻位与磺酰基罗丹明(丽丝胺)的衍生物相结合。
尤其是，所述从丽丝胺衍生的基团可由下式的基团表示：
Figure A20068005241200281
丽丝胺
其中，*表示与根据本发明的式(I)的化合物残基的共价键。
根据一个实施方案，本发明的化合物可以具有通式(I)，其中n可以等于0。
根据一个实施方案，本发明的化合物可以例如由下述通式(II)表示：
其中：
-R1、R2、R3、R4、A和p可以例如如前面所定义的。
根据一个实施方案，本发明的化合物可以具有通式(I)，其中n可以等0，p可以等于4，R1可以表示甲基，R2可以表示下式的基团：
Figure A20068005241200283
其中，*和R5可以如前面所定义的，和-COR3可以表示用下式的碱性实体R3取代的酰基，尤其是乙酰基：
Figure A20068005241200291
其中，*表示与酰基的共价健，以及Y和R6可以如前面所定义的，和R4可以是氢原子。
根据-个实施方案，本发明的化合物可以具有下述通式(III)：
Figure A20068005241200292
其中，A、R5、Y和R6可以如前面所定义的。
根据一个实施方案，本发明的化合物可以是前面定义的通式(III)的化合物，其中荧光标记物A可以是例如前面定义的磺酰基罗丹明基团，并且尤其是这样的，即式(III)的化合物的该残基位于磺酰基罗丹明基团的邻位，R5可以是苄基，Y可以是N，以及R6可以是甲基。
有利地，本发明的化合物不是如此的前面定义的通式(I)的化合物，其中荧光标记物A是这样的磺酰基罗丹明基团(丽丝胺)，即式(I)的化合物的残基位于磺酰基罗丹明基团的对位。
有利地，本发明的化合物不是如此的前面定义的通式(III)的化合物，其中荧光标记物A是这样的磺酰基罗丹明基团(丽丝胺)，即式(III)的化合物的残基位于磺酰基罗丹明基团的对位，以及R5是苄基，Y是N，和R6是甲基。
根据实施方案的变化形式，本发明的化合物可由下式(IV)表示：
Figure A20068005241200301
合成方法
可以以各种不同的式的化合物的文库的形式，或者以作为纯的形式或作为立体异构体的混合物而分离的化合物的形式，来获得本发明的化合物。
可在REM型的聚苯乙烯树脂(REgenerated Michael)上进行合成方法，所述树脂由通过Michael受体丙烯酸酯官能化的羟甲基聚苯乙烯树脂组成。
REM型树脂特别适于通过下述步骤来合成叔胺文库：进行胺的Michael类型的初始加成以将胺固定至支持物，随后在支持物上进行分子的合成，并最后按照胺的季铵化过程将其从支持物上切离，然后进行HOFMANN类型的消除。
在将仲胺固定在固体支持物上后，可使用DIC/HOBt(1，3-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑)激活，通过常规的肽偶联方法引入其他残基。
例如，可将磺基罗丹明类型(例如，丽丝胺)的基团A直接接枝在胺官能团例如赖氨酸的ε-NH2基团之上，或者接枝在通过氨基甲酸酯键(liaison uréthane)而接在赖氨酸的ε-NH2基团上的间隔物例如二氨基丁烷间隔物之上。
可在例如烷基卤如甲基碘或苄基溴存在下进行仲胺的烷基化，随后在Amberlite IRA-95型离子交换碱性树脂存在下进行处理之后，从树脂上释放化合物。
根据一个实施方案，可在平板例如96孔平板上，通过使用FLEXCHEM设备(Robbins Scientific)平行地进行本发明的这样的合成方法。
根据一个实施方案，可按照在固体支持物上的制备方法获得本发明的化合物，所述方法至少包括下列步骤：
a.将下式的化合物
Figure A20068005241200311
偶联在下式的固体支持物上，
从而获得下式(1)的化合物：
Figure A20068005241200313
R4可以如上所定义的；
b.使式(1)的化合物去保护，然后将所述去保护的化合物与下式的化合物偶联：
Figure A20068005241200314
从而获得下式(2)的化合物：
R2可以如上所定义的；
c.使式(2)的化合物去保护，然后将所述去保护的化合物与下式的化合物偶联：
Figure A20068005241200321
从而获得下式(3)的化合物：
Figure A20068005241200322
p可以如上所定义的；
d.使式(3)的化合物脱去Fmoc保护基团，然后将所述去保护的化合物与R3COOH化合物偶联，从而获得下式(4)的化合物：
Figure A20068005241200323
COR3可以如上所定义的；
e.使式(4)的化合物去保护，从而获得下式(5)的化合物：
f.任选地，使式(5)的化合物与对硝基苯基氯甲酸酯(p-nitrophénylchloroformate)反应，然后与下式的二胺反应，
Figure A20068005241200325
从而获得下式(6)的化合物：
Figure A20068005241200326
r可以如上所定义的；
g.使式(5)的化合物或式(6)的化合物与亲电示踪物，特别是与A-Cl反应，从而获得下式(7)的化合物：
Figure A20068005241200331
R2、R3、A、n、p和r如前面所定义的；
h.用式R1X的化合物切割式(7)的化合物(R1可以如上所定义的，并且X可以表示卤素原子，尤其是I或Br)，从而获得前面所定义的式(I)的化合物。
筛选和诊断方法
本发明的目标还在于用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂的方法，所述方法至少包括下列步骤：
(a)将至少一种携带荧光标记物D的PEA-15蛋白或其类似物之一与至少一种本发明的荧光化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，其中A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对，
(b)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
(c)将步骤a)中获得的集合体与据推测包含至少一种待筛选的试剂的介质在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
(d)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
(e)比较第一信号S1和第二信号S2，以便就所述PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能的相互作用作出结论。
在本发明的范围内，“A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对”这一表述意指这样的荧光标记物对，其中的一种荧光标记物(荧光能量给体)的发射光谱覆盖另一种荧光标记物(荧光能量受体)的激发光谱的全部或部分。特别地，给体的激发光谱不覆盖受体的激发光谱，或只覆盖其很小部分，从而避免或减少假阳性的出现。
根据一个实施方案，第一和第二信号可以是能量受体和/或给体的荧光信号。
在能够与携带荧光能量给体的化合物相互作用的、携带荧光能量受体的化合物存在的情况下，在荧光能量给体的激发光谱的波长处对集合体进行辐照可产生荧光共振能量转移(FRET)。
在本发明的范围内，“荧光能量的转移”意指依赖于距离的物理过程，通过该物理过程，能量通过偶极-偶极相互作用以非辐射的方式从激发的生色团(荧光能量给体)传输至另一个生色团(荧光能量受体)。
这样的转移的表现可通过调制给体的荧光信号和/或受体的荧光信号，例如通过减少荧光给体的荧光信号的振幅和/或通过增加受体的荧光信号的振幅来检测。
给体的荧光信号的振幅变化可伴随着受体的荧光信号的振幅变化。备选地，荧光信号之一可在未能检测到另一个荧光信号的变化的情况下发生变化。
为进行荧光能量的转移而进行调整的条件和参数属于本领域技术人员的实践的范围，这可参考例如Sekar和Periasamy(J.Cell.Biol.，2003，160：629)。
根据一个实施方案，第一和第二信号的比较可允许检测荧光信号的振幅的调制(modulation)。
在本发明的范围内，“荧光信号的振幅的调制”，在荧光共振能量转移的情况下，意指给体荧光信号的振幅、激发光谱的振幅或前面定义的给体发射信号的振幅的任何调制。
这些荧光信号的调制可表明待筛选的试剂与携带荧光标记物D的PEA-15蛋白的可能的相互作用。这样的相互作用可引起携带荧光标记物D的PEA-15蛋白/本发明的化合物这种复合物的解离。
根据一个实施方案，本发明的筛选方法可进一步包括下列步骤：制备至少一个对照样品，其中在前面定义的本发明方法的步骤c)中加入的所述介质不含待筛选的试剂。
可以与用于筛选能够与PEA-15相互作用的试剂的这种方法的实施同时或独立地，按照本发明的方法来制备对照样品。
本发明的方法还可以包括下列步骤：将从对照样品测量的信号S3与信号S1和S2(如前面所定义的)进行比较，以获得关于所述待筛选的试剂的信息。
如此比较的信号之间的差异可提供关于待筛选的试剂在样品中的存在、量和/或与PEA-15的相互作用的信息。
根据一个实施方案，PEA-15蛋白所携带的荧光标记物D可以以非限定性的方式选自下列物质：蛋白质例如荧光蛋白；荧光标记物，其例如选自荧光素衍生物、罗丹明衍生物、Alexa
Figure A20068005241200351
衍生物、Bodipy衍生物或Oregon
Figure A20068005241200352
衍生物，条件是D和A为如上所定义的。
根据一个实施方案，荧光蛋白可以以非穷尽的方式选自绿色荧光蛋白或其荧光变体之一，例如黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)或红色荧光蛋白(RFP)，或DS红或其变体之一。
根据一个实施方案，携带荧光标记物的PEA-15蛋白可以尤其是融合蛋白，例如GFP-PEA-15。可通过本领域技术人员已知的任何分子生物学技术，尤其是在″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor，Laboratory Cold Spring Harbor，NY，1989，第2版中描述的技术，来获得这样的蛋白质。
包含融合蛋白例如GFP-PEA-15的表达载体的构建和获得属于本领域技术人员的知识和常规实践的范围。这些蛋白质的编码序列例如可在www.ncbi.nlm.nih.gov网站或ca.expasy.org网站上的数据库中获得，也可以商购获得。
包含编码GFP(或其变体之一)或DS红的核酸序列的表达载体可商购获得，尤其是从公司例如Invitrogen或Clontech商购获得。
此类载体的表达可在任何合适的宿主细胞中进行，并可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行融合蛋白的回收，或如果需要，进行该蛋白质的编码性核酸例如mRNA或cDNA的回收。
例如，KITSBERG等人(J.Neurosci.，1999，19：8244)已描述了GFP-PEA-15融合蛋白。
根据一个实施方案，可以例如通过使用式(IV)的本发明化合物来进行本发明的筛选方法。
根据一个实施方案，携带荧光标记物D的PEA-15蛋白可以是GFP-PEA-15融合蛋白。
根据一个实施方案，可离体或在体外进行本发明的筛选方法。
例如，可用采自实验室动物(所述动物经遗传改造，从而其细胞以组织特异性或非组织特异性的方式表达GFP-PEA-15融合蛋白)的组织来离体进行所使用的本发明方法。
可以在体外，尤其是用完整的细胞在细胞内，或者在细胞外例如在细胞裂解物中或在分离了目的成分例如GFP-PEA-15融合蛋白之后，进行本发明的方法。
可在借助于表达载体(如前面所定义的)转染原代细胞或细胞系之后，或者通过培养采自实验室动物(所述动物经遗传改造，从而表达如上定义的构建体)的细胞，或者通过例如借助于微量移液器或本领域技术人员已知的任何其他工具输注原代细胞或细胞系、本发明的融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸序列，来在表达本发明的融合蛋白的细胞中细胞内地进行本发明的筛选方法。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂的方法，所述方法至少包括下列步骤：
(a)将至少一种连接至支持物的PEA-15蛋白与本发明的化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触
(b)测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
(c)将步骤a)中获得的集合体与待筛选的试剂在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
(d)测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
(e)比较S1和S2，以便就所述PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能的相互作用作出结论。
根据一个实施方案，可借助于称为“纯化标记物”的标记物将PEA-15蛋白结合至支持物。
在本发明的范围内，“纯化标记”意指可用于将PEA-15蛋白与支持物相结合的任何结构。
以非限定性的方式，纯化标记物可以是例如FLAG标签、多组氨酸标签或GST蛋白(谷胱甘肽S转移酶)。
与前面定义的纯化标记物结合的PEA-15蛋白可以是通过本领域技术人员已知的任何分子生物学方法，尤其是上面指出的方法，而获得的融合蛋白。
例如，可按照由Kitsberg等人(J.Neurosci，1999，19：8244)描述的方案来获得GST-PEA-15融合蛋白。
根据所考虑的纯化标记物，适于实施本发明的支持物例如且以非穷尽的方式可以是Sepharose小珠或用谷胱甘肽包被的细胞培养板(例如由SIGMA(ref.P3233)销售的96孔平板)的表面、镍柱、与G蛋白或A蛋白柱结合或者与Sepharose小珠的表面结合或者与细胞培养板的小孔的底部结合的抗FLAG抗体。
此外，为了进行本发明的方法，可将PEA-15蛋白与传感器芯片(sensor ship)的表面结合，以便按照本领域技术人员已知的方法在通过表面等离子体共振进行的信号检测方法中实施。
根据一个实施方案，本发明的化合物可以是发荧光的，并且第一信号S1和第二信号S2可以是荧光信号。
可通过本领域技术人员已知的分光荧光法或荧光成像的任何方法获得这些信号的测量。根据本领域技术人员已知的不同的因素，例如且非穷尽地，荧光标记物A的类别、PEA-15蛋白所位于其上的支持物，来调整荧光的激发条件和发射的记录条件。
可通过两个信号S1和S2之间的荧光强度的差异来检测PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能相互作用，该相互作用引起预先结合的本发明化合物的置换。
根据另一个实施方案，第一信号S1和第二信号S2可以是按照本领域技术人员已知的方案，例如借助于
Figure A20068005241200381
型装置，通过表面等离子体共振而获得的信号。
这些信号不依赖于本发明的化合物的荧光类型或非荧光类型。
因此，在前述方法的这种实施中，本发明的化合物可以不是发荧光的。
可将PEA-15蛋白固定在前面描述的传感器芯片上。
可将本发明的化合物与固定在传感器芯片上的所述蛋白质相接触。可通过表面等离子体共振来检测该化合物与该蛋白质之间的相互作用。可通过表面等离子体共振来检测PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能相互作用，所述相互作用引起预先结合的本发明化合物的置换。
根据另一个实施方案，本发明的目标在于通过检测和任选地定量在至少一种据推测包含PEA-15蛋白的生物样品中的PEA-15蛋白来诊断和/或预后可能牵涉PEA-15的病理学状况的方法，所述方法至少包括下列步骤：
(a)将至少一种携带荧光标记物D的PEA-15蛋白或其类似物之一与至少一种本发明的荧光化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
(b)A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对，
(c)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
(d)将步骤a)中获得的集合体与据推测包含至少一种PEA-15蛋白的生物样品在适合于本发明的所述化合物与生物样品中的所述PEA-15蛋白相互作用的条件下进行接触，
(e)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
(f)比较S1和S2，以便就在所述生物样品中PEA-15蛋白的可能存在作出结论，和任选地就所述蛋白质的量作出结论。
第一和第二信号的比较可以允许检测荧光信号的振幅的调制。这样的调制可以提供关于可能存在于样品中的PEA-15蛋白的存在和任选地其量的信息。
任选地与从包含已知量的该蛋白质的对照样品中或者从健康生物样品中获得的参照值相比较，任选地平行地与前面的测量相比较，PEA-15蛋白的存在和任选地其量的测定，可以提供关于尤其牵涉PEA-15的病理学状况和/或该病理学状况的发展的信息。
作为可用本发明的方法进行诊断和/或预测的病理学状况的实例，可提及癌症，尤其是神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、黑素瘤，以及还有II型糖尿病。
可从生物组织或体液中获得生物样品。
本发明的方法可包括下列步骤：将从对照样品中测量的信号S3与前面定义的信号S1和S2进行比较，从而获得关于PEA-15在生物样品中的存在和任选地其量的信息。
根据一个实施方案，可将第一和第二信号与从一个或多个对照样品中检测的一个或多个荧光信号进行比较。可通过实施本发明的方法并且在步骤c)中用包含已知量的PEA-15蛋白的样品代替生物样品来获得此类对照样品。
可以与用于检测和任选地定量在生物样品中的PEA-15蛋白的本发明方法的实施同时或独立地，按照本发明的方法来制备对照样品。
根据一个实施方案，可以改变对照样品中PEA-15的已知量或者携带荧光标记物D的PEA-15蛋白和/或本发明的荧光化合物的量，以便获得标准系列。
因而，可获得荧光信号与前面定义的可变的量之一的相关性。
因此，可建立FRET信号与已知量的携带荧光标记物D的PEA-15蛋白、PEA-15蛋白的本发明荧光化合物的相关性。
根据一个实施方案，携带荧光标记物D的PEA-15蛋白尤其可以是前面所定义的那些。
根据一个实施方案，携带荧光标记物D的PEA-15蛋白可以是GFP-PEA-15类型的融合蛋白。
根据一个实施方案，本发明的化合物可以是如前面所定义的，尤其可以具有上面指定的式(IV)。
可以考虑本发明的诊断方法的许多变化形式，并且如果需要，将其与本发明的筛选方法的特征相结合。
因此，根据一个实施方案，本发明涉及根据上面对于筛选方法而指出的原理(例如通过表面等离子体共振进行检测)施行的用于诊断和/或预后可能牵涉PEA-15的病理学状况的方法，其中用生物样品代替待筛选的试剂。
可能存在于这样的样品中的PEA-15将能够与本发明的化合物结合，并因而改变所记录的信号。
用于筛选或诊断的试剂盒
本发明的目标还在于用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂或者用于诊断和/或预后可能牵涉PEA-15的病理学状况的试剂盒，所述试剂盒包含：
-至少一种携带荧光标记物D或纯化标记物的PEA-15蛋白，和
-至少一种本发明的化合物，
如果需要，A和D是这样的，即它们可以确定适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对。
根据一个实施方案，携带荧光标记物D或纯化标记物的PEA-15蛋白可以是如前面所定义的。
根据一个实施方案，当本发明的试剂盒更特别地用于诊断和/或预后病理学状况时，其还可以包含至少一种未标记的PEA-15蛋白。
根据一个实施方案，由PEA-15蛋白与荧光蛋白形成的融合蛋白或未标记的PEA-15蛋白可以以编码所述蛋白质的核酸序列(例如cDNA、mRNA或表达载体)的形式存在于本发明的试剂盒中。
药物组合物
根据一个实施方案，本发明的目标还在于用作药物组合物中的活性剂的本发明的化合物。
在本发明的范围内，“药物组合物”是指以对于人或动物的疾病具有治疗或预防性质的形式提供的组合物或物质，以及用于建立病理学状况或非病理学状况的诊断和/或预后或者恢复、修正或改变个体的器官功能的物质或组合物。
可以在体外或离体地进行可通过本发明的药物组合物来施行的诊断和/或预后方法。
本发明的药物组合物可包含通式(I)的本发明的化合物或其衍生物之一，例如互变异构体形式、立体异构形式、多晶型形式、药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，以及在药学中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。
可以以在该领域中通常使用的盖仑氏形式例如片剂、胶囊、粉剂、糖浆剂、溶液、混悬剂提供本发明的药物组合物。
可以以适于通过其他途径例如口服、鼻、舌下、局部、眼、直肠途径等施用的盖仑氏形式提供本发明的药物组合物。
还可以以适于通过胃肠外途径(例如皮下、经皮、肌内、静脉内、动脉内、心内途径等)施用的无菌形式提供本发明的美容组合物。
还可以以冻干的形式提供本发明的药物组合物，使用时将其与无菌或非灭菌的水溶液相混合。
特别地，如果本发明的组合物用于胃肠外施用，则水溶液可以是无菌的。
例如根据施用途径、待治疗的个体的类型以及待治疗的病理学状况的种类来调整药物组合物中存在的本发明化合物的量。
根据这些参数的量和剂量的调整对于本领域技术人员来说是已知的。
本发明的组合物通常包含足够量的本发明的化合物。
“足够量”意指对于获得所寻求的效应所必需的量。在本发明的范围内，这样的效应可以例如是由据推测患有病理学状况例如癌症或II型糖尿病的个体所表现的症状的减轻或治疗。
癌症可以例如为神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌或黑素瘤。
根据本发明的另一个方面，本发明的目标在于本发明的化合物在制备用于治疗牵涉PEA-15的病理学状况的药物组合物中的用途。
PEA-15蛋白可以通过其表达的改变，即例如过表达或表达的缺乏，或者通过其生物学活性的改变而被牵涉，所述生物学活性的改变例如表现为其活性的增加或其活性的减少，并且可能是PEA-15蛋白序列中的突变(例如置换、插入或缺失)的结果或者是由于调节PEA-15蛋白的生物学活性和/或表达的细胞信号的改变而引起的。
关于可能牵涉PEA-15的病理学状况，术语“治疗”意指疾病的严重度的减轻，例如症状的减轻或这些症状的预防。
因此，在该最后的情况下，可在病理学状况形成之前施用本发明的化合物。
本发明所考虑的病理学状况可以尤其是前面定义的那些，例如癌症，尤其是神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤以及还有II型糖尿病。
在本发明的范围内，“个体”意指人，非人灵长类动物以及实验室动物例如啮齿类动物(例如小鼠、在鼠、豚鼠或仓鼠)，农场动物，特别是在经济上有益的动物例如家禽、牛、绵羊、猪、山羊和鱼，特别是生产适于人消费的产品例如肉、蛋和奶的动物。该术语还指家畜例如猫和狗。
本发明的目标还在于前面定义的药物组合物。
根据一个实施方案，本发明的目标还在于分离的复合物，其包含至少一种携带荧光标记物D或纯化标记物的PEA-15蛋白和至少一种本发明的式的化合物，其中A和D是这样的，即它们可以确定适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对。
根据实施方案的一个变化形式，本发明的复合物可以包含GFP-PEA-15融合蛋白作为携带荧光标记物D的PEA-15蛋白，以及包含前面定义的式(IV)的化合物作为本发明的式的化合物。
可由本领域技术人员考虑上面公开的本发明的许多修饰而不背离本发明的范围。
本申请包括此类修饰。
通过下列实施例来举例说明本发明，所述实施例不应当解释为限定了本发明的范围。
附图说明
图1：显示了在用50μM 6D6-1处理之前和之后通过共聚焦成像获得的ERK和PEA-15蛋白的细胞内化合物定位。使用6D6-1化合物处理细胞表现为ERK蛋白在细胞核中的重新定位，然而PEA-15蛋白仍保持在细胞质中。
标度尺相应于40μm。
图2：显示了在1和5μM 6D6-1存在下温育的、携带GST-PEA-15融合蛋白的、用谷胱甘肽包被的Sepharose小珠的平均荧光强度。
实施例
实施例1
6D6-1化合物的合成
(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure A20068005241200431
在反应器中，使REM树脂(REgenerated Michael，聚苯乙烯树脂)(5g，4mmol，0.8mmol.g.mol-1的理论负荷)在最低量的二甲基甲酰胺(DMF)中膨胀。将在DMF(50ml)中的三丁氧基羰基氨基哌啶(8g，40mmol)的溶液加热至80℃，然后将其加至悬浮的树脂中。在80℃下搅拌混合物16小时，然后过滤，并按照DMF、CH2Cl2、MeOH顺序洗涤三次。在Supelco注射器中，将树脂(2.3g，1.5mmol)在20mL DMF中进行膨胀，并加入甲基碘(3.81mL，61mmol)。通过旋转搅拌混合物24小时，过滤树脂，用3个系列的DMF/DCM进行洗涤。在相同的条件下，重复进行使用甲基碘的烷基化的第二步骤。在具有40mL DCM的球形瓶中和在IRA-95树脂(3.16g，1.5mmol)存在下，切割树脂上的哌啶。在用磁力棒搅拌24小时后，过滤树脂，用DCM/MeOH洗涤。收集滤液，并在减压下干燥。通过在硅胶上的快速色谱法(DCM/MeOH：9/1)进行的纯化产生以白色粉末形式存在的(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基甲酸叔丁酯。
产率＝100％；1H NMR(CDCl3，200MHz)：4.43(m，1H)，2.77(m，2H)，2.26(s，3H)，2.13-1.87(m，4H)，1.53-1.46(m，2H)，1.42(s，9H).13C NMR(CDCl3，50MHz)155.60，110.00，54.86，46.47，32.90，28.80。
1-甲基-哌啶-4-His(Bzl)-NHBoc的合成
Figure A20068005241200441
在环境温度和磁力搅拌下，用TFA/DCM(1mL/1mL)溶液处理(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基甲酸叔丁酯(0.07g，0.34mmol)90分钟。然后在减压下蒸发干燥溶液，并将获得的产物真空干燥18小时。将去保护的N-甲基哌啶溶解在1mL DMF中，并相继加入Boc-His(Bzl)-OH(0.12g，0.32mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻[PyBop](0.17g，0.32mmol)和二异丙基乙基胺[DIEA](0.27mL，1.6mmol)。在环境温度下磁力搅拌3小时后，蒸发干燥反应体系，然后用HPLC纯化，并在冷干后产生半透明的油。
产率＝100％；tr＝15.74分钟；λ＝220nm；梯度t＝0分钟：0％的溶剂B，至t＝5分钟：0％的溶剂B，至t＝35分钟：100％的溶剂B.MS(ESI-TOF)m/z(M+H)：根据[C24H35N5O3+H]的计算值为442；测定值为442。
Fmoc-Lys(o-丽丝胺)-OH的合成
Figure A20068005241200451
在环境温度和磁力搅拌下，用TFA/DCM(5mL/5mL)溶液处理Fmoc-lys(Boc)-OH(0.57g，1.23mmol)2小时。然后在减压下蒸发干燥溶液，并使所获得的产物真空干燥18小时。然后，将Fmoc-lys-OH溶解在17mL DCM中，随后加入三乙胺[TEA](1.38mL，9.84mmol)以将pH调节至大约8-9，从而观察到凝胶的形成，该凝胶当于0℃下在30分钟内添加丽丝胺(0.78g，1.35mmol)时消失。回到环境温度，将反应体系在磁力搅拌下放置5小时。然后，用50mL DCM稀释反应混合物，用10％HCl(10mL)洗涤两次，随后用硫酸钠干燥有机相，蒸发干燥。在硅胶(二氯甲烷/甲醇/乙酸：94/5/1)上获得两种位置异构体的纯化和分离，从而产生两种紫罗兰色粉末。
产率：40％的对位异构体和5％的邻位异构体。MS(ESI-TOF)m/z(M+H)：根据[C48H52N4O10S2+H]的计算值为909；测定值为909。
1-甲基-哌啶-4-His(Bzl)-Lys(o-丽丝胺)-NHFmoc的合成
Figure A20068005241200461
在环境温度和磁力搅拌下，用TFA/DCM(1mL/1mL)溶液处理1-甲基-哌啶-4-His(Bzl)-NHBoc(0.03g，0.08mmol)90分钟。然后在减压下蒸发干燥溶液，并将产物真空干燥18小时。将如此获得的胺溶解在0.5mL DMF中，并相继加入Fmoc-Lys(o-丽丝胺)-OH(0.06g，0.07mmol)、PyBop(0.03g，0.07mmol)和TEA(0.01mL，0.07mmol)。在环境温度下磁力搅拌4小时后，蒸发干燥反应体系，然后用HPLC纯化，并在冷干后产生紫罗兰色粉末。
产率＝15％；tr＝18.97分钟；λ＝220nm；梯度t＝0分钟：5％的溶剂B，至t＝30分钟：100％的溶剂B。MS(ESI-TOF)m/z(M+H)：根据[C67H77N9O10S2+H]的计算值为1232；测定值为1232。
1-甲基-哌啶-4-His(Bzl)-Lys(o-丽丝胺)-1-甲基-1H-咪唑-4-基)-乙酰胺的合成
Figure A20068005241200471
在第一步骤中，在环境温度下用在0.5mL DMF中的0.12mL哌啶处理1-甲基-哌啶-4-His(Bzl)-Lys(o-丽丝胺)-NHFmoc(0.01mg，0.01mmol)1小时。然后，将溶液直接注射至半制备型HPLC上，并导致获得在末端胺上去保护的产物，产率为40％。在最后一个偶联步骤中，在0.3mL DMSO中，在PyBop(0.003g，0.007mmol)和DIEA(0.005mL，0.033mmol)存在下，将如此获得的胺(0.004g，0.004mmol)与1-甲基-4-咪唑乙酸盐酸化物(0.001g，0.007mmol)连接在一起。在环境温度下搅拌90分钟后，将溶液直接注射至半制备型HPLC上，并在冷干后产生紫罗兰色粉末。
产率30％；tr＝17.70分钟；λ＝220nm；梯度t＝0分钟：5％的溶剂B，至t＝35分钟：100％的溶剂B。MS(ESI-TOF)m/z(M+H)：根据[C58H73N11O9S+H]的计算值为1132；测定值为1132。
实施例2
通过FRET检测6D6-1化合物与PEA-15-GFP的相互作用
如FORMSTECHER等人(Dev.Cell.，2001，1：239)所描述的，通过用pEGFP-PEA-15质粒(根据KITSBERG等人(J.Neurosci.，1999，19：8244)的描述而获得的)转染NIH3T3细胞而获得表达GFP-PEA-15的细胞系3T3(3T3-GFP-PEA-15细胞)。
选择抗新霉素(G418)的克隆，并且将基培养在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、青霉素(5IU/ml)和链霉素(5g/ml)的DMEM培养基(Roche)中。
通过测量活细胞的荧光和使用抗-GFP抗体(Roche，目录号1,814,460，获自小鼠的两种单克隆抗体(克隆7.1和克隆13.1)的混合物)和抗-PEA-15抗体(兔多克隆抗体，Sharif等人，Neuroscience，126：263，2004)经WESTERN转移进行分析来检查GFP-PEA-15蛋白的表达。
然后，在经历荧光共振能量转移(FRET)之前，将3T3-GFP-PEA-15细胞在包含青霉素(10000U/ml)/链霉素(10000μg/ml)、7％胎牛血清(BIOWHITTAKER)的HAM-F12培养基中培养至汇合。
在以10倍于终浓度的浓度于PBS中使用之前，对以大约20mM的浓度溶解在DMSO中的6D6-1化合物的储液进行稀释。
于10-4M和10-5M检测6D6-1化合物。
在加入6D6-1化合物后，在读取荧光之前，轻轻地搅动(100rpm)细胞60分钟，以使得化合物能够扩散和进入细胞中。
在465nm的激发波长处对细胞进行辐照。
在465nm处激发的GFP蛋白在535nm处发射荧光信号。
6D6-1化合物与GFP-PEA-15蛋白的结合使得能够进行荧光共振能量转移(FRET)，从而导致在590nm处发射荧光信号。
实施例3
6D6-1化合物对于ERK的定位的影响
如ARAUJO等人(J.Biol.Chem.，1993，268：5911)所描述的，从小鼠胚胎(16天)的皮层和纹状体制备原代星形胶质细胞培养物。
将原代星形胶质细胞培养物在血清不存在下以及在已知诱导ERK主要在细胞质中定位的条件下维持24小时。
然后，用50μM 6D6-1化合物处理或不处理细胞2小时15分钟。
在用荧光抗体标记细胞后，使用共聚焦显微镜观察ERK和PEA-15的亚细胞定位。
用PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，不含CaCl2和MgCl2，Sigma)洗涤细胞两次，用4％的在PBS(pH 7.5)中的多聚甲醛固定15分钟，然后在环境温度下用包含0.1M甘氨酸的PBS洗涤两次。
然后，将细胞在包含0.2％Triton X-100的PBS中温育5分钟。
在环境温度下，用包含10％正常山羊血清(NGS)的PBS封闭非特异性位点1小时。
然后，在4℃下将细胞与PEA-15的特异性抗体(兔多克隆抗体，Sharif等人，Neuroscience，2004)或ERK的特异性抗体(兔多克隆抗体，Santa Cruz K-23(ref.Sc-94))一起温育过夜，在包含1.5％NGS的PBS中进行稀释。
在PBS中进行3次洗涤后，将细胞在环境温度下与用Alexa-488(Molecular Probes)标记的抗-兔抗体一起温育1小时。
按照厂商(HOECHST)的说明书，用TOPRO2的碘化物标记细胞核。
将薄片置于在FLUOROMOUNT培养基(Southern Biotechnology)中的载玻片上，并使用具有合适的滤光片的共聚焦显微镜(TCS SP2，LEICA)进行检查。
关于共聚焦分析，激发波长对于Alexa 488为488nm，和对于TOPRO为633nm，发射波长对于Alexa-488为510-525nm，和对于TOPRO为647nm。
使用50μM 6D6-1化合物处理星形胶质细胞导致ERK在细胞核中的重新定位，然而PEA-15仍然在细胞质中(图1)。
实施例4
6D6-1/PEA-15蛋白相互作用
按照Kitsberg等人(J.Neurosci，1999，19：8244)描述的方案获得GST-PEA-15融合蛋白。
在裂解细菌后回收GST-PEA-15融合蛋白，并将其在用谷胱甘肽包被的Sepharose小珠存在下进行温育。
在20mM Tris-HCl，pH 7.4；100mM NaCl；1mM MgCl2；1％TritonX-100缓冲液中，在1或5μM 6D6-1存在下，温育如此获得的小珠。
在一系列的三次洗涤后，在纤维素膜上干燥小珠，并借助于磷光成像仪(phosphoImager)(Biorad)，通过测量经在543nm处激发而引起的丽丝胺的荧光和测量在590nm处的发射来定量荧光。
结果是3个独立实验的平均值。
结果表明荧光的平均强度依赖于化合物的浓度，并因而暗示了6D6-1化合物和PEA-15蛋白之间的特异的相互作用。

Claims (31)

1.下述通式(I)的化合物：
Figure A2006800524120002C1
其中：
-n等于0或1，
-p表示1至6的整数，特别是2至4的整数，
-r表示1至12的整数，特别是2至6的整数，特别地等于4，
-R1表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-R2表示氨基酸或氨基酸衍生物的侧链，
--COR3表示携带碱性实体R3的酰基，所述碱性实体R3特别地选自具有下式的基团：
其中，*表示与酰基的共价键，Y表示N或N+R7，以及R6和R7相互独立地表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-R4可以表示氢原子，饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C10烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基，一个或多个C1-C6烷氧基，或者一个或多个C1-C10烷基，
-A表示源自呫吨残基、吖啶残基或4-硼-3a，4a-二氮杂引达省残基的基团，
以及其衍生物。
2.权利要求1的化合物，其中A表示荧光标记物。
3.权利要求1或2的化合物，其中R1表示氢原子、C1-C18烷基、C2-C16烷基、任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基。
4.权利要求1至3中任一项的化合物，其中R1表示甲基、乙基、异丙基、正丙基、苄基、苯乙基或式CnF2n+1的全氟烷基，其中n可以为1至10。
5.权利要求1至4中任一项的化合物，其中R2表示氨基酸或氨基酸衍生物的侧链，所述氨基酸或氨基酸衍生物选自丙氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甘氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、苯丙氨酸、4-氯-苯丙氨酸、哌啶-4-羧酸、4-氨基甲基苯甲酸、3-四氢异喹啉酸以及游离的或苄基化的组氨酸。
6.权利要求1至4中任一项的化合物，其中R2是下式(VI)的化合物：
Figure A2006800524120003C1
其中：
-*表示与通式(I)的化合物的残基的共价键，和
-R5表示饱和或不饱和的、线性或支化的C1-C20烷基，饱和或不饱和的C3-C10环烷基，任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基。
7.前一个权利要求的化合物，其中R5表示甲基、乙基、异丙基、正丙基、苄基、苯乙基、式CnF2n+1的全氟烷基，其中n可以为1至10。
8.前述权利要求中任一项的化合物，其中-COR3是用下式(VII)的碱性实体R3取代的酰基：
Figure A2006800524120004C1
其中：
-*表示与酰基的键，
-Y可以表示N或N+R7，和
-R6和R7相互独立地表示氢原子、C1-C18烷基、C2-C16烷基、任选地用一个或多个卤素原子取代的C6-C10芳基。
9.前一个权利要求的化合物，其中R6和R7相互独立地表示氢原子、甲基、乙基、异丙基、正丙基、苄基、苯乙基、式CnF2n+1的全氟烷基，其中n可以为1至10。
10.前述权利要求中任一项的化合物，其中A表示通式(Va)的基团：
Figure A2006800524120004C2
其中：
-*表示与式(I)的化合物的残基的共价键，
-Z＝O或NH，
-R8＝R9＝N(R′)2，其中R′表示C1-C6，特别地C2-C4烷基，或者R8＝OH和R9＝O，
-R10＝R11＝H或X，其中X＝F、Cl、Br，
-或者，一方面R8和R10和/或另一方面R9和R11分别形成5或6元杂环，其与吖啶或呫吨残基稠合，如果需要用1、2、3个甲基取代，并且其中杂原子置于吖啶或呫吨残基的α位并选自N或O，
-R12＝*-NHSO2-或*-NHCO-，其中*表示与式(I)的化合物的残基的共价键，
-R13＝H，HSO3 -或COOH，
或者通式(Vb)的基团：
Figure A2006800524120005C1
其中：
-*表示与式(I)的化合物的残基的共价键，
-R14表示C2-C4酰基，
-R15表示C5-C7杂环基，和
-R16＝R17＝X，其中X＝F、Cl或Br。
11.前一个权利要求的化合物，其中R12位于邻位。
12.权利要求2至11中任一项的化合物，其中基团A表示选自Bodipy及其衍生物、罗丹明及其衍生物、Texas
Figure A2006800524120005C2
及其衍生物、荧光素及其衍生物、
Figure A2006800524120005C3
及其衍生物和Oregon及其衍生物的荧光标记物。
13.前一个权利要求的化合物，其中荧光标记物A选自下式的荧光标记物：
Figure A2006800524120006C1
其中，*表示与通式(I)的化合物的残基的共价键。
14.前述权利要求中任一项的化合物，其中n等于0。
15.前一个权利要求的化合物，其由下列通式(II)表示：
Figure A2006800524120006C2
其中：
-R1、R2、R3、R4、A和p具有权利要求1至13中任一项之中的定义。
16.权利要求9的化合物，其由下列通式(III)表示：
Figure A2006800524120007C1
其中，A、R5、Y和R6具有权利要求1、2和6至13中任一项之中的定义。
17.前一个权利要求的化合物，其由下式(IV)表示：
18.用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂的方法，所述方法至少包括下列步骤：
a)将至少一种连接至支持物的PEA-15蛋白与权利要求1至17中任一项的化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
b)测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
c)将步骤a)中获得的集合体与待筛选的试剂在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
d)测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
e)比较S1和S2，以便就所述PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能的相互作用作出结论。
19.用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂的方法，所述方法至少包括下列步骤：
a)将至少一种携带荧光标记物D的PEA-15蛋白或其类似物之一与至少一种权利要求2至17中任一项的化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
b)A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对，
c)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
d)将步骤a)中获得的集合体与据推测包含至少一种待筛选的试剂的介质在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
e)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
f)比较第一信号S1和第二信号S2，以便就所述PEA-15蛋白与待筛选的试剂的可能的相互作用作出结论。
20.前一个权利要求的方法，其中荧光标记物D选自下列物质：蛋白质例如荧光蛋白；选自荧光素衍生物、罗丹明衍生物、Alexa
Figure A2006800524120008C1
衍生物、Bodipy衍生物或Oregon
Figure A2006800524120008C2
衍生物的荧光标记物。
21.前一个权利要求的方法，其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白或其荧光变体之一，例如黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)或红色荧光蛋白(RFP)，或DS红或其变体之一。
22.权利要求20或21的方法，其中携带荧光标记物D的PEA-15蛋白是GFP-PEA-15融合蛋白。
23.权利要求19至22中任一项的方法，其特征在于，在细胞内施行该方法。
24.前一个权利要求的方法，其特征在于，在表达GFP-PEA-15融合蛋白的细胞中施行该方法。
25.通过检测和任选地定量在至少一种据推测包含PEA-15蛋白的生物样品中的PEA-15蛋白来诊断和/或预后可能牵涉PEA-15的病理学状况的方法，所述方法至少包括下列步骤：
a)将至少一种携带荧光标记物D的PEA-15蛋白或其类似物之一与至少一种权利要求2至17中任一项的化合物在适合于与所述蛋白相互作用的条件下进行接触，
b)A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对，
c)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤a)中获得的集合体所特征性的第一信号S1，
d)将步骤a)中获得的集合体与据推测包含至少一种PEA-15蛋白的生物样品在适合于本发明的所述化合物与生物样品中的所述PEA-15蛋白相互作用的条件下进行接触，
e)通过在使得能够激发荧光能量给体的波长处进行辐照来测量步骤c)中获得的集合体所特征性的、具有与S1相同的性质的第二信号S2，
f)比较S1和S2，以便就在所述生物样品中PEA-15蛋白的可能存在作出结论，和任选地就所述蛋白质的量作出结论。
26.前一个权利要求的方法，其中携带荧光标记物D的PEA-15蛋白具有权利要求20至22中任一项之中的定义。
27.分离的复合物，其包含至少一种PEA-15蛋白和至少一种权利要求1至17中任一项所定义的式的化合物。
28.用于筛选能够与PEA-15蛋白或其类似物之一相互作用的试剂或者用于诊断和/或预后可能牵涉PEA-15的病理学状况的试剂盒，所述试剂盒包含：
-至少一种携带荧光标记物D或纯化标记物的PEA-15蛋白，和
-至少一种权利要求1至17中任一项所定义的式的化合物，
如果需要，A和D是这样的，即它们确定了适于进行荧光共振能量转移的荧光能量受体-给体对。
29.权利要求1至17中任一项的化合物，所述化合物用作药物组合物中的活性剂。
30.药物组合物，其包含至少一种权利要求1至17中任一项的化合物。
31.权利要求1至17中任一项的化合物在制备用于治疗牵涉PEA-15的病理学状况的药物组合物中的用途。
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