JP2017176182A - オキヒオドシエビ属由来ルシフェラーゼ、新規セレンテラジン基質、及び使用法 - Google Patents
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-
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Abstract
Description
本出願は、2010年11月2日に出願された米国仮出願番号第61/409,422号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
式中、R3およびR4は共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは、−S−、−O−または−NR22−であり;
Yは、−H、−OH、または−OR11であり;
Zは、−CH−または−N−であり;
各R11は独立して−C(O)R’’または−CH2OC(O)R’’であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R’’は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し、;
ただし、R2が
R2が、
R6がNH2であるとき、R2は、
あるいは、R8は
種々の態様において、本発明は、新規化合物、新規ルシフェラーゼ、およびそれらの組み合わせに関する。本発明は、新規化合物、新規ルシフェラーゼ、および/またはそれらの組み合わせを含む、方法、組成物、およびキットを包含する。
であり、
いくつかの実施形態では、本発明は、式(Ia)または(Ib):
式中、R2は、
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
式中、R3およびR4は共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは、−S−、−O−または−NR22−であり;
Yは、−H、−OH、または−OR11であり;
Zは、−CH−または−N−であり;
各R11は独立して−C(O)R’’または−CH2OC(O)R’’であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R’’は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、R2が
R2が、
R6がNH2であるとき、R2は、
または、R8は
式中、XはOまたはSであり、R6はHまたはOHであり、R11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。
式中、R12はC2-5直鎖アルキル、フリルまたはチエニルであり、R6はHまたはOHであり、R11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。
式中、XはOまたはSであり、R6はHまたはOHであり、R18はH、
式中、R8はベンジルであり、R11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。
式中、R2は、
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
式中、R3およびR4は、共にH、または共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは、−S−、−O−または−NH−であり;
Yは、−H、−OH、または−OR11であり;
Zは、−CH−または−N−であり;
各R11は、独立して、−C(O)R’’または−CH2OC(O)R’’であり;
各Rは、独立して、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R’’は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は任意の環の存在を表し、これは飽和であっても不飽和であってもよく;
ただし、R2が
R2が、
R6がNH2であるとき、R2は、
または、R8は
ある化合物は、一つまたは複数の特定の幾何学的形態、光学的形態、鏡像異性形態、ジアステレオ異性形態、エピマー形態、立体異性形態、互変異性形態、高次構造形態、またはアノマー形態で存在している場合があり、例えば、シス型およびトランス型;E型およびZ型;c型、t型、およびr型;エンド型およびエキソ型;R型、S型、およびメソ型;D型およびL型;d型およびl型;(+)型および(−)型;ケト型、エノール型、およびエノラート型;シン型およびアンチ型;向斜型および背斜型;α型およびβ型;アキシャル型およびエクアトリアル型;舟型、いす型、ねじれ型、エンベロープ型、および半いす型;並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされず、これ以後は、集合的に「異性体」と称する。
本発明によるセレンテラジン誘導体は、実施例1〜16に詳細に記載された方法に従って合成することができる。
本発明の実施形態では、本明細書に記載される種々の技術が、改良された合成OgLucポリペプチドを生成するために、アミノ酸置換部位を特定するのに使用された。追加の技術が、ポリペプチドの発現を増強させるために、種々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化するのに使用された。一つまたは複数のアミノ酸置換を、単独でまたは組み合わせて行うことにより、増強された発光(例えば、増強された輝度、増強されたシグナル安定性、増強された酵素安定性、および/または相対的基質特異性の変化)を有する合成OgLuc型ポリペプチドが生成されることが発見された。さらに、種々の合成OgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに一つまたは複数のコドン最適化置換を含むことにより、種々の真核生物および原核生物の発現系において、増強されたポリペプチド発現がもたらされた。本発明の一実施形態は、原核細胞および/または真核細胞で発現された場合に、単量体型で可溶性であり且つ活性を有する合成OgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明は、野生型OgLucと比較した場合に、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するOgLuc変異体またはそのタンパク質断片、例えば、欠失、例えば1〜約5個残基の欠失、およびそのキメラ(融合体)(米国特許出願第2009/0253131号およびWIPO出願第WO2007/120522号、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)を有するものを含み、該置換によって、増強された安定性、増強された発光、例えば、増加された発光、発光動態のより大きな安定性、および/または変更された発光色を有するOgLuc変異体がもたらされる。OgLuc変異体の配列は、対応する野生型OgLucのアミノ酸配列と実質的に同一である。実質的に同一な配列を有するポリペプチドまたはペプチドとは、アミノ酸配列が完全にではないが大部分において、同一であり、それが関連する配列の機能活性を保持していることを意味する。通常、2つのアミノ酸配列は、それらが少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%、ただし100%未満のアミノ酸配列同一性である場合に、実質的に同一である。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は組換えポリヌクレオチドにコードされる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体、またはその機能性断片は、多くて5つまでの差異を有し、またはより好ましくは多くて4、3、2、もしくは1つまでの差異を有し、または最も好ましくは差異を含まず、それらの差異は、表4に記載の式(VII)のパターン位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17、または18に対応する位置に生じる。差異には、表4のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。
本発明の化合物およびタンパク質は、ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジンが使用されている、いかなる方法においても使用することができる。例えば、それらは、試料中の一つもしくは複数の分子、例えば酵素、酵素反応のための補助因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤、もしくはOHラジカルを検出するために、または一つもしくは複数の条件、例えば酸化還元条件を検出するためにセレンテラジンの類似体を使用する生物学的発光法(bioluminogenic method)において、使用することができる。試料としては、動物(例えば、脊椎動物)、植物、真菌、生理液(例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物等)、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または細胞の精製画分(例えば、細胞成分分画)が含まれ得る。かかる分子の存在、量、スペクトル分布、発光動態、または比活性を検出または定量することができる。その分子は、多相溶液(multiphasic solution)(例えば、乳剤または懸濁剤)を含む溶液中においてでも、固体支持体(例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ容器(assay vessel))上ででも、検出または定量することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、目的酵素、例えば、CYP450酵素、MAO A酵素またはMAO B酵素、カスパーゼ等を検出するために、発光に基づくアッセイで使用することができる。新規セレンテラジンは、エクオリン、オベリン、またはiPhotina等の発光タンパク質と一緒に使用することができる。いくつかの実施形態では、OgLuc変異体は、別の分子(例えば、フルオロフォア、発色団、またはナノ粒子)に対するエネルギー供与体として使用することができる。
発光活性を有するもの、もしくは別の分子に補完されて発光活性がもたらされ得るもの、または発光活性を有するその融合体等の、OgLuc変異体またはその断片をコードする望ましい核酸分子が調製されると、OgLuc変異体もしくはその断片、例えば、補完のためのもの、または発光活性を有するその融合体をコードする発現カセットが調製され得る。例えば、OgLuc変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、転写制御配列、例えば、一つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはそれらの組み合わせに所望により機能的に連結されて、発現カセットを形成することができる。核酸分子または発現カセットは、選択マーカー遺伝子を所望により含むベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターに導入され得、該ベクターは、目的細胞、例えば、大腸菌(E. coli)、ストレプトマイセス種(Streptomyces spp.)、炭疽菌種(Bacillus spp.)、ブドウ球菌種(Staphylococcus spp.)等の原核細胞、並びに植物(双子葉類または単子葉類)、真菌(酵母、例えば、ピキア属(Pichia)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)またはシゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)を含む酵母)、もしくは哺乳類細胞を含む真核細胞、それらの溶解物、またはin vitro転写/翻訳混合物に導入され得る。哺乳類細胞としては、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞、およびヒト細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。哺乳類細胞株としては、限定なしで、CHO、COS、HEK293、HeLa、CV−1、SH−SY5Y、およびNIH3T3細胞が挙げられるが、多数の他の細胞株も使用可能である。
本発明のOgLuc変異体、その機能性断片またはその融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子(ポリヌクレオチド)も提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも1つの選択された宿主中での発現に最適化された核酸配列を含む。最適化された配列は、コドン最適化された配列、すなわち、別の生物、例えば遠縁生物と比較した場合に、ある生物でより頻繁に使用されるコドン、並びにコザック配列および/もしくはイントロンを付加もしくは改変するための改変、並びに/または望ましくない配列、例えば、潜在的転写因子結合部位を取り除くための改変、を含む。そのような最適化された配列は、宿主細胞に導入された場合に、増強された発現、例えば、増加されたタンパク質発現レベルを提供することができる。最適化された配列の例は、米国特許第7,728,118号および米国特許出願公開第2008/0070299号、第2008/0090291号、および第2006/0068395号に開示されており、そのそれぞれが参照によって本発明に組み込まれる。
方法A:(以下の化合物が方法Aで合成できる:化合物PBI−3840、PBI−3886、PBI−3857、PBI−3887、PBI−3913、PBI−3894、PBI−3896、PBI−3897、PBI−3841およびPBI−3842)
方法C:新規セレンテラジンの合成(以下の化合物を方法Cによって合成することができる:PBI−3939、PBI−3945、PBI−3889、PBI−4002)
2−((3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン−2−イル)アミノ)ペンタン酸。4−(5−アミノ−6−ベンジルピラジン−2−イル)フェノール(100mg、0.36mmol)を、エタノール(20mL)中の2−オキソ吉草酸(84mg、0.72mmol)と混合した。Pd/C(活性炭中の10%パラジウム、40mg)を加え、反応混合物を65℃に加熱した。空気をN2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を4時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー(溶出溶媒:ヘプタン中50% EtOAc)で精製して、生成物を黄色粉末(70mg、52%)として得た。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2, δ): 8.31 (s, 1H), 7.82 (d, 2H, J = 9.0Hz), 7.31 (m, 5H), 6.92 (d, 2H, J = 9.0Hz), 5.34 (s, 2H), 4.20 (m, 1H), 1.10 (m, 2H), 0.98 (m, 2H), 0.87 (t, 3H); MS (ESI) m/z 378.3 (M+1)。
2−((3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン−2−イル)アミノ)ヘキサン酸。4−(5−アミノ−6−ベンジルピラジン−2−イル)フェノール(200mg、0.72mmol)を、エタノール(20mL)中の2−ケトヘキサン酸ナトリウム塩(220mg、1.44mmol)と混合した。Pd/C(活性炭中の10%パラジウム、100mg)を、数滴の酢酸と共に加え、反応混合物を65℃に加熱した。空気をN2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を4時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー(溶出溶媒:ヘプタン中50% EtOAc)で精製して、生成物を黄色粉末(130mg、46%)としてを得た。MS (ESI): m/z 392.2 (M+1)。
2−((3−ベンジル−5−フェニルピラジン−2−イル)アミノ)ブタン酸。3−ベンジル−5−フェニルピラジン−2−アミン(200mg、0.77mmol)を、エタノール(20mL)中の2−オキソ酪酸(157mg、1.54mmol)と混合した。Pd/C(活性炭中の10%パラジウム、100mg)を加え、反応混合物を65℃に加熱した。空気をN2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を4時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー(溶出溶媒:ヘプタン中50%EtOAc)で精製し、生成物を黄色粉末(90mg、34%)として得た。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2, δ): 7.72 (s, 1H), 7.32-7.48 (m, 10H), 4.46 (s, 2H), 4.20 (m, 2H), 2.25 (q, 2H), 0.99 (t, 3H); MS (ESI): m/z 348.3 (M+1)。
8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3(7H)−オン:
3−(フラン−2−イル)−2−オキソプロパン酸および3−ベンジル−5−フェニルピラジン−2−アミンを出発物質として用いて、方法Cから合成した。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 8.88 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.9, 2H), 7.61 − 7.38 (m, 6H), 7.37 − 7.14 (m, 3H), 6.38 (s, 1H), 6.26 (d, J = 3.2, 1H), 4.64 (s, 3H), 4.40 (s, 3H);C24H20N3O2 +の計算による正確な質量m/z+ 382.16, 実測値m/z+ 382。
8−ベンジル−6−フェニル−2−(チオフェン−2−イルメチル)イミダゾ[1,2−a]ピラジン−3(7H)−オン:
2−オキソ−3−(チオフェン−2−イル)プロパン酸および3−ベンジル−5−フェニルピラジン−2−アミンを出発物質として用いて方法Cから合成した。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 8.85 (s, 1H), 7.99 (d, J = 6.8, 2H), 7.63 − 7.02 (m, 10H), 6.94 (dd, J = 3.5, 5.1, 1H), 4.62 (s, 2H), 4.58 (s, 2H), 2.69 (混入);C24H20N3OS+の計算された正確な質量 m/z+ 398.13, 実測値 m/z+ 398。
8−シクロプロピル−2−(4−ヒドロキシベンジル)−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3(7H)−オン:
3−シクロプロピル−5−フェニルピラジン−2−アミンおよび3−(4−ヒドロキシフェニル)−2−オキソプロパン酸を出発物質として用いて方法Aにより合成した。C22H18N3O2の計算による正確な質量 m/z- 356.14, 実測値 m/z- 356。
8−ベンジル−2−メチル−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3(7H)−オン:
1,1−ジメトキシプロパン−2−オンおよび3−ベンジル−5−フェニルピラジン−2−アミンを出発物質として用いて方法Bによって合成した。C20H18N3O+の算出による正確な質量m/z+ 316.14, 実測値 m/z+ 316。
2−(4−ヒドロキシベンジル)−8−メチル−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3(7H)−オン:
3−メチル−5−フェニルピラジン−2−アミンおよび3−(4−ヒドロキシフェニル)−2−オキソプロパン酸を出発物質として用いて方法Aによって合成した。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 8.84 (s, 1H), 8.00 (d, J = 7.6, 2H), 7.47 (dd, J = 8.6, 16.2, 3H), 7.17 (d, J = 7.3, 2H), 6.69 (d, J = 8.4, 2H), 6.26 (s, 4H), 4.17 (s, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.48 (s, 1H)。
8−ベンジル−2−(4−ヒドロキシベンジル)−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3(7H)−オン:
3−(4−ヒドロキシフェニル)−2−オキソプロパン酸および3−ベンジル−5−フェニルピラジン−2−アミンを出発物質として用いて方法Aを使用して合成した。C26H22N3O2 +の算出による正確な質量m/z+ 408.17, 実測値 m/z+ 408。
ジメチルホルムアミド(DMF)中のPBI−3939、炭酸カリウム(1.1等量)およびヨウ化カリウム(1.1等量)の混合物に、アルゴン雰囲気下、室温で、1等量のピバル酸クロロメチルを加えた。反応の進行を薄層クロマトグラフィーでモニターし、完了後すぐに、反応混合物を数分間氷浴中で冷却し、その後、反応物体積と等量の水を添加した。得られた混合物を適切な有機溶媒(例えば、EtOAc)で抽出し、抽出物を濃縮し、粗生成物を得た。物質をシリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製した。
新規セレンテラジンのPBI−3939、PBI−3889、PBI−3945、PBI−4002、またはPBI−3896の安定性および自己発光の特徴付けを決定した。より高い安定性およびより少ない自己発光は、基質/試薬において魅力的な技術的特徴である。
t=ln(A/A0)÷(−k)
式中、A=時間tでの強度、A0=時間0での強度、およびk=減衰速度、である。表1に示されるように、既知のセレンテラジン−hおよびセレンテラジン−hh、新規セレンテラジンPBI−3939、PBI−3889、PBI−3945、PBI−4002、およびPBI−3896のT90値は、天然セレンテラジンよりも高かったが、これは、これらのセレンテラジンが天然セレンテラジンよりもより安定な化合物であったことを示している。
表1:種々のセレンテラジンを用いた、IVの安定性実験および自己発光特徴付け
新規セレンテラジンの毒性をHEK293細胞において調査した。HEK293細胞を、DMEM+10%FBS+ピルビン酸塩中、15,000/ウェルで、一晩増殖させた。培地を除去し、CO2独立培地+10%FBSに希釈された新規セレンテラジン化合物(またはDMSO対照)と置き換えた。化合物添加から24時間後に、CELLTITER−GLO(登録商標)アッセイ試薬(プロメガ社)を用い、製造業者の取扱説明書に従って、細胞生存率を測定し、発光はGLOMAX(登録商標)ルミノメーター(1秒/ウェル)で測定した。表2は、HEK293細胞における、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−hおよびセレンテラジン−hh、並びに新規セレンテラジンPBI−3939、PBI−3889、PBI−3841、PBI−3897、PBI−3945、PBI−4002、およびPBI−3840の毒性を示している。PBI−3840を例外として、新規セレンテラジンは少なくともセレンテラジン−hhと同じ毒性を有していた。新規セレンテラジンのいくつかは、天然セレンテラジンおよびセレンテラジン−hと同じ毒性を有していた。
表2:CELLTITER−GLO(登録商標)に基づく、HEK293細胞における種々のセレンテラジンの毒性
PBI−3939のKmを決定するため、OgLuc変異体L27V(実施例26に記載)を、HaloTag(登録商標)タンパク質精製系を用いて、HaloTag(登録商標)融合によって、製造業者の取扱説明書に従って精製し、フェノールレッドおよび0.1%PRIONEX(登録商標)を含まないDMEMに希釈した。様々な量のPBI−3939を含有する50μLのアッセイ緩衝液(100mM MES(pH6)、35mM チオ尿素、0.5% TERGITOL(登録商標)NP−9(v/v)、1mM CDTA、2 mM DTTおよび150mM KCl)を、50μLの希釈酵素(およそ20pM 最終酵素濃度)に加え、発光を22℃、3分後に測定した。図3のデータが示すように、PBI−3939のKmはおよそ10μMであった。
化合物PBI−4525、PBI−4540およびPBI−4541を、それらの発光検出能に関してスクリーニングした。分析のため、20μMのそれぞれの化合物を、アッセイ試薬を作製するために100mM HEPES(pH7)でpH7に調整したアッセイ緩衝液(100mM MES(pH6)、35mM チオ尿素、0.5% TERGITOL(登録商標)NP−9(v/v)、1mM CDTA、2mM DTTおよび150mM KCl)に加えた。その後、アッセイ試薬を、フェノールレッドを含有しないDMEMおよび0.1%PRIONEX(登録商標)中の36pM 精製L27V02酵素(実施例25Bに記載)と混合した。対照として、20μM PBI−3939またはPBI−4528を含有するアッセイ緩衝液を使用した。アッセイ試薬を酵素混合物に加えてから3分後に、発光を前述の通りに測定した。表3は、化合物PBI−4525、PBI−4540およびPBI−4541が、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼからの発光を検出するのに使用できることを示している。
表3
異なるクラスのルシフェラーゼを含む酵素ファミリーは、共通の3次元構造および明確な触媒活性を有することによって、認識できる。酵素ファミリーは他の酵素ファミリーと進化史を共有しているため、それらはそれらの3次元構造において類似性も示す。構造解析および機能解析の様々な手段によって、発明者は、OgLucが、代表的な十脚類ルシフェラーゼとして、進化史の共有性を含めて、脂肪酸結合タンパク質(FABP)に著しく類似した3次元構造を有していることを決定した。従って、十脚類ルシフェラーゼは、FABPに類似した特徴的な3次元構造を有し、セレンテラジンを基質として利用し発光を触媒すると定義することができる。他のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ等は、明らかに異なる3次元構造を有しており、このことは、それらが異なる酵素ファミリーに属しており、進化史を共有していないことを示している。渦鞭毛藻類ルシフェラーゼは、FABPに対しいくらかの類似性を示す3次元構造を有しているが、このことは、進化史は共有しているが、セレンテラジンを基質として利用せず、従って十脚類ルシフェラーゼと同じ酵素ファミリーに属していないことを示している。
・アミノ酸に対しては、標準的なIUPACの1文字コードが使用される。
・あらゆるアミノ酸が許容される位置に対しては、「x」の記号が使用される。
・ある部位における代替的なアミノ酸はアミノ酸を角括弧「[ ]」の間に列挙することによって示される(例えば:[ALT]は、その位置がAla、Leu、またはThrである可能性を表す)。
・ある部位における特定のアミノ酸の欠如は波括弧「{ }」によって示される(例えば:{AM}は、ある位置がAlaおよびMet以外のあらゆるアミノ酸であることを表す)。
・各配列の位置(またはパターン中の構成要素)は、その隣から、「−」によって隔てられている。
・各配列の位置は、「パターン位置」と称され、例えば[GSAIVK]は式(VI)のパターン位置1と見なされ、{FE}は式(VI)のパターン位置2と見なされるなど等である。
であり、
表4:タンパク質配列パターン
特に明記しない限り、無作為置換を有する開始OgLuc変異体配列のさらなる変異体は、製造業者の取扱説明書に従う、誤りがちな、変異誘発性PCRに基づく系であるGeneMorph II無作為変異誘発キット(ストラタジーン社;Daughtery, PNAS USA, 97(5):2029 (2000))、およびNNK部位飽和(Zheng et al., Nucleic Acids Research, 32:e115 (2004))を用いて、生成された。
表5:77位、92位および109位の部位飽和
表6:天然セレンテラジンおよびセレンテラジン−hhと比較した場合の、PBI−3897およびPBI−3841に対するOgLuc変異体の相対的特異性における変化
表7:変異体9B8と比較した場合に同様の発光を有する変異体
表8:PBI−3939に対する向上した相対的特異性を有する変異体
表9:大腸菌(E. coli)、HEK293細胞およびNIH3T3細胞における、9B8opt+K33N+170Gと比較した場合のOgLuc変異体により発せられる発光の増加
表10:大腸菌(E. coli)、NIH3T3細胞およびHEK293細胞における、9B8opt+K33Nと比較した場合のOgLuc組み合わせ変異体により発せられる発光における増加
表12:細菌溶解物における、9B8と比較した場合のOgLuc変異体により発せられる発光の増加、および天然セレンテラジンと比較した場合のPBI−3939に対するOgLuc変異体の特異性における変化
表13
表14
表15
A. 166位の異なるアミノ酸の、ルシフェラーゼ活性に対する影響を評価するために、166位のアルギニン(R)残基を、pF4Agベクターの背景において(すなわち、野生型OgLuc配列(配列番号1)の背景において)先に記載した通りの部位特異的変異誘発を用いて、その他の19の各アミノ酸に置換した。その後これらの166位変異体を、前に記載した通りに大腸菌(E. coli)において発現させた。
以下のような欠失がL27V変異体に対してなされた:
表16
A. IVおよび9B8
表17:コドン最適化に使用されたコドン
表18:転写結合部位および他の調節要素を除去するために使用された追加のコドン
個々のTFBSを除いて、プロモーターモジュールおよび他の全ての望ましくない配列要素(以下に追加の詳細)をヌクレオチド置換によって除去した。
L27V01を開始配列、すなわち親配列として使用し、高い厳密性の一致基準を用いて、多くのTFBSを可能な限り除去した(より高い厳密性は結合部位へのより良い一致に関与し、従って、より低い厳密性よりもより少ない一致しか発見しない)。L27V02に対して作製された、A(配列番号322)&B((配列番号318))という2つのバージョンがあった。これら2つのバージョンは、望ましくない配列要素を除去するために、各バージョンに対して、異なるコドンを選択することによって作製された。より低い厳密性でTFBSを探索することにより、両方のバージョンを分析した。
L27V02B(配列番号318)を開始配列として使用した。より低い厳密性のTFBS一致を、可能であれば除外した。L27V03を、L27V02Aとはコドンが非常に異なるように、作製した。
表19
表20
A. 15C1、9BおよびIV
表22:細菌溶解物におけるOgLuc変異体のシグナル安定性
A. IV、15C1、9B8、9F6および9A3
表23:OgLuc変異体のVmax(RLU/0.5秒)およびKm(μM)の値
ルシフェラーゼタンパク質の安定性は発光に影響を及ぼす別の因子であるため、変異体のタンパク質安定性、すなわち熱安定性が決定された。
表24:50℃でのOgLuc変異体のタンパク質安定性
表25:9B8optおよび9B8opt+K33Nの熱安定性および発光データ
表26:60℃でのOgLuc変異体の熱安定性
ゲル濾過分析を用いて理論値に基づく精製OgLucタンパク質の予想分子量を検証し、それによりそれらのオリゴマー状態を決定した。OgLuc変異体C1+A4Eおよび9B8の相対的流体力学的体積の比較を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって行った。この分析のために、OgLuc変異体、C1+A4Eおよび9B8のヌクレオチド配列を、HQ−Tagged FLEXI(登録商標)ベクター(プロメガ社)にクローニングし、大腸菌(E. coli)KRX細胞において過剰発現される、N末端にHQHQHQ標識されたタンパク質を生成した。過剰発現されたタンパク質を、HISLINK(商標)タンパク質精製系(プロメガ社)を用い、製造業者の取扱説明書に従って、精製した。個々の標準タンパク質および試料タンパク質の試料を、ゲル濾過クロマトグラフィーで分析した。このゲル濾過クロマトグラフィーは、24℃、アジレント1200HPLC上で、Superdex200 5/150GLカラム(GEヘルスケア社)を用いて、0.25mL/分の流速で行われた(図43A〜B)。移動相(すなわち、泳動緩衝液)は、50mM トリスおよび150mM NaClから構成されていた(pH7.5)。タンパク質の溶出を214nmおよび280nmでモニターした。標準的な検量線を、以下を用いて作成した:1)オボアルブミン、43kDa(GEヘルスケア社)、2)炭酸脱水酵素、29kDa(シグマ社)および3)ミオグロビン、17kDa(ウマ心筋、シグマ社)。精製タンパク質の分子量を検量線から直接算出した。
A. IV、8A3、8F2、9B8、9F6および15C1
A. IVおよび9B8
HEK293細胞で発現された変異体9B8optおよび9B8opt+K33Nの輝度を、実施例31においてHT7を含まない変異体について記載された通りに、測定して比較した。変異体DNAを含有する30ngおよび100ngのプラスミドDNAを、HEK293細胞に形質移入するのに用いた。1mM CTDA、150mM KCl、2mM DTT、100mM MES(pH6.0)、35mM チオ尿素、0.25%TERGITOL(登録商標)NP−9(v/v)、および10mg/mL 2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含有する溶解緩衝液で細胞が溶解されたこと以外は実施例31に記載の通りに、細胞を増殖させて誘導した。溶解物を、20μM PBI−3939を含有する溶解緩衝液を用いてアッセイし、TECAN(登録商標)GENIOS(商標)プロ・ルミノメーターで発光を測定した。図49に示されるように、9B8opt+K33Nは、HEK293細胞において、9B8optと比較してより大きな発光を有し、これは、表25および図29における細菌中の発現データに追従するものである。
表27:NIH3T3細胞およびHEK293細胞においてOgLuc組み合わせ変異体によって発せられた発光の増加
実施例33に記載の通りに、9B8OgLuc変異体を過剰発現させて精製した。希釈された酵素および基質間の反応は、以下の2×緩衝液/アッセイ試薬を用いて行われた:100mM MES(pH6.0)、1mM CDTA、150mM KCl、35mM チオ尿素、2mM DTT、0.25%TERGITOL(登録商標)NP−9(v/v)、0.025%MAZU(登録商標)DF204、10mg/mL 2−ヒドロキシ−β−シクロデキストリン、および20μM PBI−3939。精製された酵素および基質の最終的なアッセイ濃度は、それぞれ0.5pMおよび10μMであった。同時に、希釈された精製ホタルルシフェラーゼ(すなわち、QUANTILUM(登録商標)組換えルシフェラーゼ(プロメガ社))と希釈された精製ルシフェリンの反応を分析した。ホタルルシフェラーゼ反応用のアッセイ緩衝液/試薬はBRIGHT−GLO(商標)であり、その最終アッセイ濃度は0.5pM 酵素および500μM ルシフェリンであった。各反応用の緩衝液/試薬は「白熱(glow)」動態を与えることが知られており、15分の時点が発光データを収集するのに用いられた。この実験から得られた結果は、PBI−3939を用いる9B8opt(19,200RLU)が、BRIGHT−GLO(商標)を用いるQUANTILUM(登録商標)組換えルシフェラーゼ(2,300RLU)のおよそ8倍より明るかったことを示した。
非特異的相互作用に対するOgLuc変異体の感受性を決定するために、9B8およびL27V変異体の活性を、LOPAC(薬理的活性化合物のライブラリー)ライブラリーに対して、スクリーニングした。前記化合物をDMSO中で1mMに希釈することにより、LOPAC1280ライブラリー(シグマ社)を作製した。アッセイの当日、前記化合物を1×PBS中で20μMに希釈し、10μLを96ウェルの白色プレートに移した。各ウェルに、Glo溶解緩衝液(プロメガ社)中で10-4に希釈された、10μLの精製された9B8、L27Vまたはホタルルシフェラーゼ(Luc2)酵素を加え、室温で2分間インキュベートした。試料に、20μLのアッセイ試薬(1mM CDTA、150mM KCl、2mM DTT、100mM MES(pH6.0)、35mM チオ尿素、0.5%TERGITOL(登録商標)NP−9(v/v)および60μM PBI−3939)を加え、3分間インキュベートし、TECAN(登録商標)GENIOS(商標)プロ・ルミノメーターで発光を測定した。ホタルルシフェラーゼをアッセイするために、製造業者のプロトコルに従ってBRIGHT−GLO(商標)アッセイ試薬(プロメガ社)を使用した。陰性対照として、各プレートの8ウェルには、1×PBS+2%グリセロールが含められた。陽性対照として、各プレートの8ウェルには、2%DMSO中の2mM スラミンまたは2%DMSO中の2mM ルシフェラーゼ阻害剤1(カルバイオケム社)が含まれた。LOPACライブラリーの事前のスクリーニング(すなわち、LOPACライブラリーを、20μMというより低い基質濃度の9B8変異体を使用してスクリーニングした)において、スラミンはOgLucの阻害剤であることが特定された。
1. 精製9B8酵素および精製L27V酵素を、0.5mg/mL BSAを含有する、または含有しない緩衝液(1×PBS、1mM DTT、および0.005%IGEPAL(登録商標)CA−630)中で1:10に連続希釈して(4セットの各希釈物)、200μLをPCRストリップ管に入れた。試料を60℃でインキュベートし、0時間、2時間、4時間、および6時間の時点で、各変異体について1セットの希釈物を−70℃に移行させた。
OgLuc変異体が、哺乳類細胞で発現された場合に何らかの翻訳後修飾を経るかどうかを決定するために、哺乳類細胞および大腸菌(E. coli)の両方において、9B8およびL27V変異体を発現させ、質量分析(MS)によって分析した。
A. IV
転写レポーターとして使用される本発明のOgLuc変異体の能力を決定するために、フォワードトランスフェクション、リバーストランスフェクション、および大量(bulk)トランスフェクションにおいて、OgLuc変異体9B8optを転写レポーターとして使用した。これらの形質移入法が選択されたのは、それらが遺伝子転写レポーターの一過性発現に、一般に使用されるアプローチの代表であるためである。
表28:HEK293細胞における、CREを含有する転写レポーター(3時間の時点)
表29:HEK293細胞におけるAREを含有する転写レポーター(24時間の時点)
表31:HEK293細胞におけるCREを含有する転写レポーター(4時間の時点)
細胞懸濁液中の1×105細胞/mLのHepG2細胞に、プラスミドDNA(L27V02、luc2P(プロメガ社)、luc2(プロメガ社)またはL27V02−IL6(IL−6分泌配列と置き換えられた天然分泌配列を有するL27V02;(「IL601−L27V02A」;配列番号324)を含有するpGL4.32バックボーン;プロメガ社)を、FUGENE(登録商標)HDを用い、製造業者の取扱説明書に従って、リバーストランスフェクションした(DNA−形質移入混合物対細胞が1:20)。次に、100μLの細胞懸濁液を96ウェルプレートのウェルに播種し、37℃、5%CO2で22時間インキュベートした。IL−6分泌配列で置き換えられた天然分泌配列を有する他のOgLucコンストラクトとしては、IL601−L27V01およびIL602−L27V03(それぞれ、配列番号321および327)が挙げられる。
細胞ベースの、溶解性転写レポーターという背景における本発明のOgLuc変異体は、他のルシフェラーゼを用いて現れ得るよりも早くシグナルが現れる程の大きさの発光シグナルを提供するはずである。明るい発光によって、弱いプロモーターが試験されることも可能となるはずである。
本発明のOgLuc変異体を、形質移入困難な細胞株(difficult to transfect cell line)、例えば、Jurkat、HepG2、初代細胞、非分裂初代細胞、または幹細胞(例えば、図59C参照)において、レポーターとして使用した。それらの高いシグナル強度により、OgLuc変異体は、形質移入効率が低い場合に、検出可能な発光を可能にする。OgLuc変異体は、形質移入に関連する条件、すなわち、DNA濃度、形質移入試薬添加に特に感受性を有する細胞においても、レポーターとして使用することができる。OgLuc変異体の輝度により、適切な発光レベルを、より低いDNA濃度、より少ない形質移入試薬、および恐らくは、アッセイ開始前のより短い形質移入後時間を用いて、達成することができる。これは、そうでなければ感受性細胞であろうものに対して、毒性という負担をそれほど与えないであろう。OgLuc変異体の明るい発光は、そのような出力が望ましい事象において、非常に長い時点で、シグナルが検出されることも可能にするはずである。別の例として、OgLuc変異体は、単一コピーの天然プロモーター、例えば、HSBチミジル酸キナーゼ(TK)プロモーター、HOX遺伝子、またはLIN28に対するレポーターとして使用され得る。
細胞質中でまたは分泌型として本発明のOgLuc変異体を発現する、頑強で安定した細胞株の特定は、ルシフェラーゼの明るいシグナルおよび小サイズのOgLuc遺伝子によって容易となり得る。比較的小さな遺伝子配列は、外来DNA組込みによってもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させるはずである。
A. IVopt
表34
A. 生細胞中でのOgLuc変異体およびPBI−3939の使用を試験した。HEK293細胞を96ウェルプレート中に、15,000細胞/ウェルで播種し、37℃で一晩増殖させた。次の日、細胞に、3連でTRANSIT(登録商標)−LT1を用いて、pF4Ag中の100ngのhRLまたは9B8optを一過的に形質移入し、37℃で一晩増殖させた。次の日、hRLおよび9B8opt形質移入細胞の両方について、増殖培地を除去し、60μM VIVIREN(商標)生細胞基質(プロメガ社)、60μM ENDUREN(商標)生細胞基質(プロメガ社)、または60μM PBI−3939を含有する培地で置き換えた。非形質移入細胞はバックグラウンド対照として使用した。プレートを37℃で1日間インキュベートし、TECAN(登録商標)GENIOS(商標)プロ・ルミノメーターで定期的に、すなわち24時間の間に11回測定した。図66A〜Bは、各基質について、非形質移入細胞の発光で除算された形質移入細胞の発光、すなわちシグナル/バックグラウンド比を示している。データは、細胞をVIVIREN(商標)、ENDUREN(商標)、またはPBI−3939と一緒にインキュベートすることによって、9B8optが生細胞環境(すなわち、溶解無し)において発光を生じたことを示している。データは、PBI−3939が培養液中の細胞に浸透し、OgLuc変異体と反応し、発光を生じることができ、それ故、OgLuc変異体を生細胞アッセイにおける使用に適合することも明らかにした。
本発明のOgLuc変異体は、目的の標的タンパク質に対する融合タグとして、その標的タンパク質の細胞内レベルをモニターする手段として使用することができる。ストレス応答経路、例えば、DNA損傷、酸化的ストレス、炎症に関わる特定のタンパク質は、各種の刺激がこれらの経路で果たす役割を探索する手段として、細胞中でモニターすることができる。変異体は、標的タンパク質の細胞輸送をモニターする手段としても使用することができる。変異体は、ウイルスゲノム(例えば、HIV、HCV)にも融合することができ、それにより、有望な抗ウイルス剤での処理の後に、力価レベル、すなわち感染価を細胞中でモニターすることができる。変異体は(標的タンパク質に加えて)緑色蛍光タンパク質(GFP)またはHalotag(登録商標)にも融合することができ、それによって、高発現クローンを特定し、局在情報を提供するのにFACSを使用することができる。
3成分融合タンパク質、または「サンドイッチ」融合体は、BRETに基づくバイオセンサーの最適化のために、生物発光タンパク質および蛍光タンパク質を互いに近くに配置するのに使用することができる。
表35:サンドイッチバックグラウンドにおける9B8opt+K33N+170Gと比較した場合の、OgLuc変異体により発せられる発光の増加
表36:サンドイッチバックグラウンドにおける9B8opt+K33Nと比較した場合の、OgLuc変異体により発せられる発光の増加
表37:9B8opt+K33N+170Gと比較した場合の、OgLuc変異体により発せられる発光の増加
表38:サンドイッチバックグラウンドにおける9B8opt+K33Nと比較した場合の、サンドイッチバックグラウンドにおけるOgLuc変異体により発せられた発光における増加
表39:サンドイッチバックグラウンド存在下でのOgLuc変異体の発光における減少倍率
A. 変異体9B8optを発現する大腸菌(E. coli)の溶解物を、実施例27における先の記載の通りに調製し、フェノールレッド無しのDMEM+0.1%PRIONEX(登録商標)中で1000倍に希釈した。6.3μg/mLの精製赤色コメツキムシルシフェラーゼおよび変異体9B8optを発現する大腸菌(E. coli)溶解物を含有する試料からの発光を、改変されたDUAL−GLO(登録商標)ルシフェラーゼアッセイ系(プロメガ社)を用いて、検出した。20μM セレンテラジン−hを含有するDUAL−GLO(登録商標)STOP&GLO(登録商標)試薬、および20μM PBI3939を含有するDUAL−GLO(登録商標)STOP&GLO(登録商標)試薬を、製造業者のプロトコルに従って使用し、単一試料からの赤色コメツキムシルシフェラーゼおよびOgLuc変異体9B8ルシフェラーゼを検出した。3連で実行した。
表40:改変されたDUAL−ルシフェラーゼ(商標)レポーターアッセイを用いた、赤色コメツキムシルシフェラーゼおよび9B8optルシフェラーゼにより発せられた平均発光
表41:PBI−3939を基質として用いて、9B8optを発現する細菌溶解物により発せられた発光に対する、PBI−3077およびPBI−1424の影響
L27V変異体の循環置換(CP)バージョンを2つ作製した:CP84およびCP95。数字記号はN末端の残基を指す(例えば、「84」は、CPバージョンの新しいN末端を表す。)。
追加のCP部位を特定し、ルシフェラーゼ活性に対するそのCP部位の影響を決定し、断片間の「つなぎ鎖(tether)」の使用を研究するために、L27V変異体のおよそ3番目の部位(すなわち、アミノ酸)毎に作製された循環置換を有するCPコンストラクトを構築した(図73E参照)。当業者であれば、他の部位、例えば、1番目および2番目の部位も、本明細書に記載の方法を用いて、本明細書に記載の循環置換されたOgLuc変異体において試験および使用が可能であることを理解するであろう。例えば、L27V変異体は、循環置換、特に、比較的大きな結合ドメインが置換された断片(例えばcAMP/RIIbBベースのセンサー)の間に配置される状況に対して、特に寛容性があることが分かっている。それぞれの部位に、
(配列番号328)を加えた。下線を引いた配列は、TEVプロテアーゼ認識部位を指す。リンカーの目的は、2つの変異体断片間に、機能的なルシフェラーゼ酵素を生成する方法においてそれらが結合できるように、十分長いつなぎ鎖を提供することである。TEVプロテアーゼ認識部位は、活性を維持することに対するその重要性を調査することができるように、つなぎ鎖を破壊するための手段を提供するために使用された(TEVプロテアーゼの存在下で)。TEVプロテアーゼ認識部位の使用は、どのCP部位がタンパク質相補試験(PCA)に、またはバイオセンサー応用(例えば、CP部位間への応答要素の挿入)に有用であるかを予測するための方法を作った。
タンパク質相補試験(PCA)は、2つの生体分子、例えばポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。PCAは、互いに接近させられた場合に機能的な活性タンパク質に再構成され得る、同一タンパク質、例えば酵素の2つの断片を利用する。本発明のOgLuc変異体は、分離に寛容性のある部位で、2つの断片に分離され得る。その後、分離されたOgLuc変異体の各断片は、相互作用すると考えられている目的のポリペプチド対(例えばFKBPおよびFRB)のうちの一方に融合され得る。目的の2つのポリペプチドが実際に相互作用するならば、OgLuc断片は互いにすぐ近くに接近して、機能的な活性OgLuc変異体を再構成する。その後、再構成されたOgLuc変異体の活性を、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンまたは本発明の新規セレンテラジンを用いて、検出および測定することができる。別の例では、開裂OgLuc変異体は、lac−Z(Langley et al., PNAS, 72:1254-1257 (1975))またはリボヌクレアーゼS(Levit and Berger, J. Biol. Chem., 251:1333 -1339 (1976))に類似した、より一般的な相補系で使用することができる。具体的には、別のOgLuc変異体断片(「B」)を補完することが知られているOgLuc変異体断片(「A」と命名)を、標的タンパク質に融合させることができ、得られた融合体を、断片Bを含有する細胞または細胞溶解物中の発光によってモニターすることができる。断片Bの源は、同一細胞(染色体中または別のプラスミド上のいずれか)であるか、または別の細胞由来の溶解物または精製タンパク質であり得る。この同一の融合タンパク質(断片A)は、断片Bと、固体の支持体に付着可能なHaloTag(登録商標)等のポリペプチド間の融合によって、捕捉または固定化することができる。その後、発光は、成功した捕捉を実証するために、または捕捉された物質の量を定量化するために、使用することができる。タンパク質相補の方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0153310号に従って行うことができる。
表42
本発明のOgLuc変異体は、濃度を通じてだけでなく、酵素活性の調節を通じても、光出力に関わることができる。例えば、cAMPバイオセンサーは、プロテインキナーゼAから得られたcAMP−結合ドメインを循環置換されたOgLuc変異体に組み入れることによって開発され得る。本発明のOgLuc変異体は、当該技術分野において周知の方法(例えば、米国特許出願公開第2005/0153310号)によるそのような置換に対し寛容性がある部位で、循環置換され得る。哺乳類細胞中で発現された場合、得られた循環置換されたOgLuc変異体キメラタンパク質は、cAMPに対する細胞内バイオセンサーとして機能し得る。cAMPがバイオセンサーに結合すると、バイオセンサーは、活性型ルシフェラーゼ酵素を生成する立体構造変化を起こす。細胞をアデニル酸シクラーゼに対する活性化物質であるフォルスコリンで処理することは、フォルスコリンの増加濃度に伴って、発光における増加をもたらすはずである。カルシウム(Ca+2)、cGMP、およびカスパーゼおよびタバコエッチ病ウイルス(TEV)等のプロテアーゼを含むがこれらに限定はされない、標的に対する同様のバイオセンサーは、それぞれに対する適切な結合ドメインまたは切断部位を、循環置換されたOgLuc変異体に組み入れることによって、開発することができる。
表43:循環配列されたOgLucバイオセンサーのcAMPに対する応答
細胞内分布を分析するために、U2OS細胞を、10%FBSを含有するマッコイ5A培地(インビトロジェン社)中で2×104細胞/cm2で、ガラス底培養皿に播種した。次に、細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。次に、細胞に1/20量の形質移入混合物(FUGENE(登録商標)HDおよびpF5A−CMV−L27V(CMVプロモーター(プロメガ社)を有するpF5AベクターにクローニングされたL27V変異体(配列番号88))、またはpGEM3ZF(プロメガ社;陰性対照))を形質移入し、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞培地を、0.5%FBSおよび100μM PBI−4378を含有するCO2非依存性培地と置き換えた。37℃で30分間インキュベートした後、フィルタ処理されていない画像を、25、100、1000、および5000ミリ秒間、60×対物レンズ(図80A−B)を用いるオリンパス社製LV200生物発光顕微鏡で撮り込んだ。
本実施例は、(転写活性化を表す応答要素の例とは対照的に)タンパク質レベルで細胞内シグナル経路をモニターするのに使用されている新規ルシフェラーゼの2つの例を提供する。変異体9B8opt(配列番号24)を、IkB(Gross et al., Nature Methods 2(8):607-614 (2005))(C末端に、すなわち、N−IkB−(9B8opt)−C))またはODD(Hif−1−αの酸素依存性分解ドメイン(Moroz et al., PLoS One 4(4):e5077 (2009))(N末端に、すなわち、N−(9B8opt)−ODD−C))のいずれかに融合した。IKBは、TNFαで刺激されると細胞中で分解されることが知られており;そのため、IKB−(9B8opt)コンストラクトは、生細胞TNFαセンサーとして使用することができる。ODD(Hif−1−α)は、低酸素を誘導する化合物で刺激されると細胞内に蓄積されることが知られており;そのため、ODD−(9B8opt)コンストラクトは生細胞低酸素センサーとして使用することができる。
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)は、タンパク質−タンパク質相互作用のモニタリングを可能にする。分子内エネルギー移動を、HT7がフルオロフォア、すなわちTMR(励起/発光(ex/em)波長=555/585nm)またはローダミン110(励起/発光波長=502/527nm)で事前に標識されたIVとHT7融合パートナーの間で調べた。実施例34のIV−HT7融合タンパク質を含有する50μLの細菌細胞溶解物を、0.001μM〜10μM フルオロフォアリガンド存在下、または非存在下で、室温で1時間インキュベートした。インキュベートした後、22μM セレンテラジン−hを含有する50μLのRENILLA−GLO(商標)を、50μLの酵素−リガンド混合物に加え、発光スペクトルを5分の時点で記録した。TMR(図83A)またはローダミン110(「Rhod110」)(図85B)を有するIV−HT7のスペクトルの例が示され、これは、リガンドのex/emがOgLucの発光ピークである460nmに近いほど、BRETがより大きかったことを示している(すなわち、ローダミン110を用いた方がより大きい)。このデータは、融合タンパク質上の、OgLuc変異体とフルオロフォア間で分子内エネルギー移動が発生可能であることを示している。3つの異なる対照を比較のために使用した(データ未記載):1)非HT融合、2)HTリガンドで標識されなかったHT融合、および3)OgLucとHTの間のTEV部位でタンパク分解により開裂された標識化HT融合(近接/距離の関与を示した)。BRETは3つの異なる対照において観察されなかったが、このことは、HTがBRETを達成するのに関わっていたことを示している。C末端HT7を有するC1+A4EおよびIVが、N末端HT7を有するものと比べて、BRETがより大きかった。
1例において、循環置換された(CP)または直鎖開裂型(SS)OgLuc融合タンパク質はタンパク質近接の測定に適用される。OgLucは、プロテアーゼ基質アミノ酸配列(例えば、TEV)の挿入を介して置換または開裂され、低い生物発光を発する。不活性ルシフェラーゼが、モニタータンパク質に繋留される(例えば、遺伝子融合を介して)。有望な相互作用タンパク質が、プロテアーゼ(例えば、TEV)に繋留される(例えば、遺伝子融合を介して)。前記2つのモニタータンパク質が相互作用するか、または十分近位に存在する場合(例えば、恒常的な相互作用、薬剤刺激または経路応答を介して)、ルシフェラーゼが開裂されて、増加された生物発光活性を生じる。前記の例は、細胞、または生化学分析において、タンパク質近接の測定に適用することができる。さらに、OgLuc変異体ルシフェラーゼの高い熱安定性は、溶解された細胞、または生化学分析における抗体−抗原相互作用の測定を可能にし得る。
1. カスパーゼ−3酵素を検出するための生物発光分析におけるOgLuc変異体の用途を示すために、9B8opt変異体を、DEVDカスパーゼ−3開裂配列を含む前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用した。精製カスパーゼ−3酵素を、実施例27に記載の通りに調製された、変異体9B8optを発現する大腸菌(E. coli)溶解物試料と混合し、100mM HEPES(pH7.5)中の23.5μM z−DEVD−セレンテラジン−hを含むかまたは含まない、100mM MES(pH6.0)、1mM CDTA、150mM KCl、35mM チオ尿素、2mM DTT、0.25%TERGITOL(登録商標)NP−9(v/v)、0.025%MAZU(登録商標)DF204を含有する緩衝液中で10倍に希釈した。カスパーゼ−3酵素を溶解物試料と一緒に室温で3時間インキュベートし、ターナー社製MODULUS(商標)ルミノメーターで、様々な時点における発光を検出した。細菌溶解物のみを含有する試料およびカスパーゼ−3のみを含有する試料を、対照として使用した。3連を用いた。図86および表44は、9B8opt、従って他の本発明のOgLuc変異体が、目的酵素を検出するための、前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用され得ることを示す。
表44:z−DEVD−セレンテラジン−hを基質として使用して、精製カスパーゼ−3を用いるかまたは用いずにインキュベートした、9B8opt変異体を発現する細菌溶解物から発せられたRLU単位の平均発光
表45
本発明のOgLuc変異体は、種々の異なるイムノアッセイ概念に組み込まれる。例えば、OgLuc変異体は、検出法に特定の分析物を提供するために、一次抗体または二次抗体に、遺伝的に融合または化学的に結合される。別の例として、OgLuc変異体は、タンパク質A、タンパク質G、タンパク質L、またはIg断片に結合することが知られているあらゆる他のペプチドもしくはタンパク質に遺伝的に融合または化学的に結合され、今度はこれが、特定の分析物に結合した特異的抗体を検出するのに使用され得る。別の例として、OgLuc変異体がストレプトアビジンに遺伝的に融合または化学的に結合され、特定の分析物に結合した特異的ビオチン化抗体を検出するのに使用される。別の例として、ELISAのようなあらゆる様式において、一次抗体が特定の固定化された分析物を認識し、二次抗体が該一次抗体を認識する場合、OgLuc変異体の相補的断片は一次および二次抗体に遺伝的に融合または化学的に結合される。OgLuc変異体活性、すなわち発光は、固定化された分析物の存在下で再構成され、該分析物を定量化する手段として使用される。
本実施例は、完全長の循環置換型OgLuc変異体が、それぞれの結合パートナー、例えばFRBおよびFKBPに融合され、タンパク質相補性分析で使用され得ることを示す。本明細書で開示される方法と従来のタンパク質相補性の間の重要な差異は、相補性はなかったが、2つの完全長酵素、例えば循環置換型OgLuc変異体の二量体化があったことである。
OgLuc変異体9B8、9B8+K33N、V2、L27V、およびV2+L27Mの細胞内半減期を決定した。15〜100mmプレートにおける10%FBSおよび1×ピルビン酸ナトリウムを含有するF12培地中のCHO細胞(500,000)に、9B8、9B8+K33N、V2、L27V(「V2+L27V」)またはV2+L27M(全てpF4A ベクターバックグラウンド中)を含有する30μLの100ng/μL プラスミドDNAを、TRANSIT(登録商標)−LT1(ミラス社(Mirus))を用い、製造業者の説明書に従って、形質移入した。次に、細胞を6時間インキュベートした。
表46
ホタルルシフェラーゼは比較的不安定であることが知られているが、尿素暴露に対してはさらにより感受性が高い。これがOgLuc変異体を用いた場合でも当てはまるかどうかを決定するために、OgLucの尿素に対する感受性を決定した。5μlの45.3μM L27V酵素を100μLの尿素溶液(100mM MOPS(pH7.2)、100mM NaCl、1mM CDTA、5%グリセロールおよび様々な濃度の尿素)と混合し、室温で30分間インキュベートした。5μLの尿素+L27V酵素溶液を、フェノールレッド+0.1%PRIONEX(登録商標)無しのDMEM中に10,000倍希釈し、50μLを、100μM PBI−3939(前述)を含有する50μLのアッセイ試薬と混合し、発光を10分の時点で読み取った(図88)。図88は、L27Vが、尿素耐性であるか、または尿素除去後に非常に迅速に機能的酵素にリフォールディングしたことを示している。これは、化学的変性条件が含まれている場合に、L27Vがレポーター酵素として使用され得ることを示唆している(例えば、OgLuc変異体に基づく反応の前の酵素反応を止めるのに変性剤が使用される条件での多重化)。
本実施例は、蛍光励起の必要なしに、生細胞におけるタンパク質移行をモニターするための、OgLucおよびOgLuc変異体の用途を示す。OgLuc変異体を、ヒト糖質コルチコイド受容体(GR;配列番号451および452)、ヒトプロテインキナーゼCα(PKCa;配列番号449および450)またはLC3(配列番号577および578)に融合させた。生物発光画像法を用いて細胞内タンパク質移行を分析するために、HeLa細胞を、10%FBSを含有するDMEM培地(インビトロジェン社)中2×104細胞/cm2で、ガラス底培養皿(MatTek)中に播種した。次に、細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。次に、細胞に1/20量の形質移入混合物(FUGENE(登録商標)HDおよびpF5Aベクター(プロメガ社)にクローニングされた、L27V02−GR(配列番号453および454)またはL27V02−PKCα(配列番号455および456)をコードするDNA)を形質移入した。L27V02−GRに関するプラスミドDNAを、pGEM−3ZF(プロメガ社)中で1:20希釈し、L27V02−GRの適切な発現レベルを達成した。L27V02−LC3およびL27V02−PKCαに関するプラスミドDNAは、無希釈で使用した。次に、細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。GR融合タンパク質を形質移入された細胞を、1%木炭/デキストランで処理されたFBS(インビトロジェン社)を補充されたMEM培地を用いて、20時間GR作動薬を枯渇させた。形質移入の24時間後(PKCα測定の場合)または形質移入の48時間後(GR測定の場合)、イメージング直前に、細胞培地を100μM PBI−3939を含有するCO2非依存性培地で置き換えた。150×対物レンズを用いるオリンパス社製LV200生物発光顕微鏡で、フィルタ処理されていない画像を直ちに撮り込んだ。
表47.但し書きリスト
〔1〕配列番号1に対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドが非オキヒオドシエビ属(Oplophorus)ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、単離ポリヌクレオチド。
〔2〕非オキヒオドシエビ属(Oplophorus)ルシフェラーゼがウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼである、前記〔1〕に記載のポリヌクレオチド。
〔3〕非オキヒオドシエビ属(Oplophorus)ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、前記〔1〕に記載のポリヌクレオチド。
〔4〕配列番号1に対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドは配列番号3のOgLucポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが表47に列挙されるもののうちの1つではない、ポリヌクレオチド。
〔5〕配列番号1に対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドは配列番号31のポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが配列番号3または15ではない、ポリヌクレオチド。
〔6〕配列番号1に対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドが配列番号29のポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが配列番号3または15ではない、ポリヌクレオチド。
〔7〕前記ポリペプチドが配列番号1に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、前記〔1〕〜〔6〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔8〕前記ポリペプチドが配列番号1に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、前記〔1〕〜〔7〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔9〕OgLuc変異体ポリペプチドが配列番号3のポリペプチドと比較して増強されたタンパク質安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも1つを有する、前記〔1〕〜〔8〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔10〕OgLuc変異体ポリペプチドがウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼと比較して増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも1つを有する、前記〔1〕〜〔9〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔11〕前記OgLuc変異体ポリペプチドがホタルルシフェラーゼと比較して増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも1つを有する、前記〔1〕〜〔10〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔12〕前記OgLuc変異体ポリペプチドがセレンテラジンの存在下で配列番号3のポリペプチドと比較して増強された発光を有する、前記〔1〕〜〔11〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔13〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、式(Ia)または(Ib):
または
の化合物の存在下で配列番号3のポリペプチドと比較して増強された発光を有する前記〔1〕〜〔12〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは-S−、-O−または-NR22−であり;
Yは、-H、−OH、または-OR11であり;
Zは、-CH−または-N−であり;
各R11は独立して-C(O)R”または-CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔14〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、異なるセレンテラジンと比較した場合のあるセレンテラジンの存在下で、配列番号3のポリペプチドと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔1〕〜〔13〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔15〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して式(Ia)または(Ib):
または
の化合物の存在下で、配列番号3のポリペプチドと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔1〕〜〔14〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは−S−、−O−または−NR22−であり;
Yは、−H、−OH、または−OR11であり;
Zは、−CH−または−N−であり;
各R11は独立して−C(O)R”または−CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔16〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号3のポリペプチドと比較して増強された生体適合性を有する、前記〔1〕〜〔15〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔17〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、セレンテラジンの存在下でウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、前記〔1〕〜〔16〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔18〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、式(Ia)または(Ib):
または
の化合物の存在下で、ウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、前記〔1〕〜〔17〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは-S−、-O−または-NR22−であり;
Yは、-H、−OH、または-OR11であり;
Zは、-CH−または-N−であり;
各R11は独立して-C(O)R”または-CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔19〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、異なるセレンテラジンと比較してあるセレンテラジンの存在下で、ウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔1〕〜〔18〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔20〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して式(Ia)または(Ib):
または
の化合物の存在下で、ウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔1〕〜〔19〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは-S−、-O−または-NR22−であり;
Yは、-H、−OH、または-OR11であり;
Zは、-CH−または-N−であり;
各R11は独立して-C(O)R”または-CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔21〕前記OgLuc変異体ポリペプチドがウミシイタケ属(Renilla)ルシフェラーゼと比較して増強された生体適合性を有する、前記〔1〕〜〔20〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔22〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、ルシフェリン存在下のホタルルシフェラーゼと比較して、セレンテラジンの存在下で増強された発光を有する、前記〔1〕〜〔21〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔23〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、ルシフェリン存在下のホタルルシフェラーゼと比較して、式(Ia)または(Ib):
または
の化合物の存在下で増強された発光を有する、前記〔1〕〜〔22〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは-S−、-O−または-NR22−であり;
Yは、-H、−OH、または-OR11であり;
Zは、-CH−または-N−であり;
各R11は独立して-C(O)R”または-CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔24〕前記OgLuc変異体ポリペプチドがホタルルシフェラーゼと比較して増強された生体適合性を有する、前記〔1〕〜〔23〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔25〕OgLuc変異体ポリペプチドが、オプロポルス・グラキリロストゥリス(Oplophorus gracilirostris)、オプロポルス・グリマルディイ(Oplophorus grimaldii)、オプロポルス・スピニカウダ(Oplophorus spinicauda)、オプロポルス・フォリアケウス(Oplophorus foliaceus)、オプロポルス・ノヴァエゼエランディアエ(Oplophorus novaezeelandiae)、オプロポルス・テュプス(Oplophorus typus)、またはオプロポルス・スピノスス(Oplophorus spinosus)由来である、前記〔1〕〜〔24〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔26〕少なくとも1つのアミノ酸置換が、配列番号1の1位、4位、6位、10位、11位、14位、15位、16位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、39位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、56位、58位、59位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、87位、89位、90位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、102位、106位、109位、110位、111位、112位、113位、117位、119位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、135位、136位、138位、139位、142位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、152位、154位、155位、158位、159位、163位、164位、166位、168位もしくは169位に対応する位置またはそれらの組み合わせに存在する、前記〔1〕〜〔25〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔27〕前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するF1I、E4K、F6Y、W10Y、R11Q、A14V/S、G15R、Y16E、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/V/W/Y、D19N、Q20P/R、V21L/M、L22I/F、E23K、Q24A、G25L、L27M/V/A/D/G/I、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、T39I、P40T/I/L/Q、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G/K、N50K/S、G51E/R/V、A54I/S、D55E/G、I56V、V58I/L、I59T、I60V、S66T/N、G67D/S、F68L/S/W/Y/D、Q69H、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、E74I/K、M75F/K、I76F/N/V、F77A/C/D/G/M/N/S/T/V/W/Y、H86L/R、H87N/T、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/R/S/Y、H93R、Y94F、G95D/S、T96A、L97E、V98F、I99T/V、D100I、V102E/M/T、M106I/K、Y109F、F110I、G111N、R112C、P113H/T/K、I117F、V119M、K124M、I125L、T126R、V127A、T128A/S、G129Q、T130K、N135D/Y、L136M、I138S、D139G、L142V/E/K/W、P145L/Q、D146G、G147N、S148T、L149I/M、L150V、R152H/S/E/T、T154S、I155T、V158I、T159I/S、L163I、C164S、N166I/F/E、L168F、もしくはA169Vのうちの少なくとも1つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔28〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔1〕〜〔27〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する、1位のイソロイシン、4位のリジン、6位のチロシン、10位のチロシン、11位のグルタミン、14位のバリンもしくはセリン、15位のアルギニン、16位のグルタミン酸、18位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、19位のアスパラギン、20位のアルギニンもしくはプロリン、21位のロイシンもしくはメチオニン、22位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、23位のリジン、24位のアラニン、25位のロイシン、27位のバリン、メチオニン、アラニン、アスパラギン酸、グリシンもしくはイソロイシン、28位のチロシン、31位のイソロイシン、32位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、33位のアスパラギンもしくはメチオニン、34位のメチオニン、36位のメチオニンもしくはグルタミン酸、38位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、39位のイソロイシン、40位のトレオニン、イソロイシン、ロイシンもしくはグルタミン、42位のヒスチジン、43位のアスパラギンもしくはアルギニン、44位のフェニルアラニン、45位のグルタミン酸、46位のグルタミン、47位のプロリン、48位のアルギニン、49位のアスパラギン酸、グリシン、もしくはリジン、50位のリジンもしくはセリン、51位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、54位のセリンもしくはイソロイシン、55位のグリシンもしくはグルタミン酸、56位のバリン、58位のイソロイシンもしくはロイシン、59位のトレオニン、60位のバリン、66位のトレオニンもしくはアスパラギン、67位のセリンもしくはアスパラギン酸、68位のロイシン、アスパラギン酸、セリン、チロシンもしくはトリプトファン、69位のバリン、70位のバリン、71位のアスパラギン酸、72位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、74位のリジンもしくはイソロイシン、75位のリジンもしくはフェニルアラニン、76位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、77位のアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、86位のアルギニンもしくはロイシン、87位のアスパラギンもしくはトレオニン、89位のグルタミン酸、90位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、92位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、セリン、もしくはチロシン、93位のアルギニン、94位のフェニルアラニン、95位のセリンもしくはアスパラギン酸、96位のアラニン、97位のグルタミン酸、98位のフェニルアラニン、99位のトレオニンもしくはバリン、100位のイソロイシン、102位のメチオニン、グルタミン酸、もしくはトレオニン、106位のイソロイシンもしくはリジン、109位のフェニルアラニン、110位のイソロイシン、111位のアスパラギン、112位のシステイン、113位のヒスチジン、トレオニン、もしくはリジン、117位のフェニルアラニン、119位のメチオニン、124位のメチオニン、125位のロイシン、126位のアルギニン、127位のアラニン、128位のアラニンもしくはセリン、129位のグルタミン、130位のリジン、135位のアスパラギン酸もしくはチロシン、136位のメチオニン、138位のセリン、139位のグリシン、142位のバリン、グルタミン酸、リジンもしくはトリプトファン、145位のロイシンもしくはグルタミン、146位のグリシン、147位のアスパラギン、148位のトレオニン、149位のイソロイシンもしくはメチオニン、150位のバリン、152位のヒスチジン、セリン、グルタミン酸もしくはトレオニン、154位のセリン、155位のトレオニン、158位のイソロイシン、159位のセリンもしくはイソロイシン、163位のイソロイシン、164位のセリン、168位のフェニルアラニン、もしくは169位のバリン。
〔29〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138IおよびN166R、並びに配列番号1の1位、4位、6位、11位、14位、15位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、39位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、56位、58位、59位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、89位、90位、92位、93位、94位、95位、96位、98位、99位、102位、106位、109位、110位、112位、113位、117位、119位、124位、126位、127位、128位、135位、136位、138位、139位、142位、145位、148位、149位、152位、154位、155位、158位、159位、163位、164位、168位、もしくは169位に対応する位置またはそれらの組み合わせに少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔1〕〜〔28〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔30〕配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号1の1位、4位、6位、11位、14位、15位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、39位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、56位、58位、59位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、89位、90位、92位、93位、94位、95位、96位、98位、99位、102位、106位、109位、110位、112位、113位、117位、119位、124位、126位、127位、128位、135位、136位、138位、139位、142位、145位、148位、149位、152位、154位、155位、158位、159位、163位、164位、168位、もしくは169位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔1〕〜〔29〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔31〕少なくとも1つのアミノ酸置換が、配列番号1に対応するF1I、E4K、F6Y、R11Q、A14V、G15R、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/V/W/Y、D19N、Q20P/R、V21L/M、L22I/F、E23K、L27M/V、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、T39I、P40T、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G/K、N50K/S、G51E/R/V、A54I/S、D55E/G、I56V、V58I/L、I59T、I60V、S66T/N、G67D/S、F68L/S/W/Y/D、Q69H、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、E74I/K、M75F/K、I76F/N/V、F77A/C/D/G/M/N/S/T/V/W/Y、H86L/R、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/R/S/Y、H93R、Y94F、G95D/S、T96A、V98F、I99T/V、V102E/M、M106I/K、Y109F、F110I、R112C、P113H/T、I117F、V119M、K124M、T126R、V127A、T128A/S、N135D/Y、L136M、I138S、D139G、L142V、P145L/Q、S148T、L149I、R152H/S、T154S、I155T、V158I、T159I/S、L163I、C164S、L168F、もしくはA169Vのうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせに対応している、前記〔29〕または〔30〕に記載のポリヌクレオチド。
〔32〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔29〕または〔30〕に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する1位のイソロイシン、4位のリジン、6位のチロシン、11位のグルタミン、14位のバリン、15位のアルギニン、18位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、19位のアスパラギン、20位のアルギニンもしくはプロリン、21位のロイシンもしくはメチオニン、22位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、23位のリジン、27位のバリンもしくはメチオニン、28位のチロシン、31位のイソロイシン、32位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、33位のアスパラギンもしくはメチオニン、34位のメチオニン、36位のメチオニンもしくはグルタミン酸、38位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、39位のイソロイシン、40位のトレオニン、42位のヒスチジン、43位のアスパラギンもしくはアルギニン、44位のフェニルアラニン、45位のグルタミン酸、46位のグルタミン、47位のプロリン、48位のアルギニン、49位のアスパラギン酸、グリシン、もしくはリジン、50位のリジンもしくはセリン、51位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、54位のセリンもしくはイソロイシン、55位のグリシンもしくはグルタミン酸、56位のバリン、58位のイソロイシンもしくはロイシン、59位のトレオニン、60位のバリン、66位のトレオニンもしくはアスパラギン、67位のセリンもしくはアスパラギン酸、68位のアスパラギン酸、セリン、チロシンもしくはトリプトファン、69位のヒスチジン、70位のバリン、71位のアスパラギン酸、72位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、74位のリジンもしくはイソロイシン、75位のリジンもしくはフェニルアラニン、76位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、77位のアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、86位のアルギニンもしくはロイシン、89位のグルタミン酸、90位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、92位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、セリン、もしくはチロシン、93位のアルギニン、94位のフェニルアラニン、セリンもしくは95位のアスパラギン酸、96位のアラニン、98位のフェニルアラニン、99位のトレオニンもしくはバリン、102位のメチオニンもしくはグルタミン酸、106位のイソロイシンもしくはリジン、109位のフェニルアラニン、110位のイソロイシン、112位のシステイン、113位のヒスチジンもしくはトレオニン、117位のフェニルアラニン、119位のメチオニン、124位のメチオニン、126位のアルギニン、127位のアラニン、128位のアラニンもしくはセリン、135位のアスパラギン酸もしくはチロシン、136位のメチオニン、138位のセリン、139位のグリシン、142位のバリン、145位のロイシンもしくはグルタミン、148位のトレオニン、149位のイソロイシン、152位のヒスチジンもしくはセリン、154位のセリン、155位のトレオニン、158位のイソロイシン、159位のセリンもしくはイソロイシン、163位のイソロイシン、164位のセリン、168位のフェニルアラニン、もしくは169位のバリン。
〔33〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138IおよびN166R、並びに、配列番号1の1位、4位、14位、15位、18位、20位、22位、23位、27位、33位、38位、39位、43位、49位、54位、55位、56位、58位、59位、66位、67位、68位、70位、71位、72位、75位、76位、77位、89位、90位、92位、93位、102位、106位、109位、113位、117位、126位、127位、136位、139位、145位、148位、163位、164位もしくは169位に対応する位置またはそれらの組み合わせに少なくとも1つのアミノ酸を含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔34〕配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号1の1位、4位、14位、15位、18位、20位、22位、23位、27位、33位、38位、39位、43位、49位、54位、55位、56位、58位、59位、66位、67位、68位、70位、71位、72位、75位、76位、77位、89位、90位、92位、93位、102位、106位、109位、113位、117位、126位、127位、136位、139位、145位、148位、163位、164位もしくは169位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔35〕前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するF1I、E4K、A14V、G15R、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/W/Y、Q20R、L22I、E23K、L27M/V、A33N、V38I、T39I、K43R、E49K、A54I/S、D55G、I56V、V58I/L、I59T、S66T/N、G67S、F68S/W/Y/D、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、M75F/K、I76N、F77A/C/D/G/M/S/T/V/W/Y、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/S/Y、H93R、V102E、M106K、Y109F、P113T、I117F、T126R、V127A、L136M、D139G、P145L、S148T、L163I、C164S、もしくはA169Vのうちの少なくとも1つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔33〕または〔34〕に基記載のポリヌクレオチド。
〔36〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔33〕または〔34〕に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する、1位のイソロイシン、4位のリジン、14位のバリン、15位のアルギニン、18位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トリプトファン、もしくはチロシン、20位のアルギニン、22位のイソロイシン、23位のリジン、27位のバリンもしくはメチオニン、33位のアスパラギン、38位のイソロイシン、39位のイソロイシン、43位のアルギニン、49位のリジン、54位のセリンまたはイソロイシン、55位のグリシン、56位のバリン、58位のイソロイシンまたはロイシン、59位のトレオニン、66位のトレオニンまたはアスパラギン、67位のセリン、68位のアスパラギン酸、セリン、チロシンまたはトリプトファン、70位のバリン、71位のアスパラギン酸、72位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、75位のリジンもしくはフェニルアラニン、76位のアスパラギン、77位のトリプトファン、チロシン、セリン、トレオニン、バリン、アラニン、グリシン、システイン、アスパラギン酸もしくはメチオニン、89位のグルタミン酸、90位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、92位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、セリン、もしくはチロシン、93位のアルギニン、102位のグルタミン酸、106位のリジン、109位のフェニルアラニン、113位のトレオニン、117位のフェニルアラニン、126位のアルギニン、127位のアラニン、136位のメチオニン、139位のグリシン、145位のロイシン、148位のトレオニン、163位のイソロイシン、164位のセリン、もしくは169位のバリン。
〔37〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138IおよびN166R、並びに配列番号1に対応する1位、4位、6位、11位、18位、19位、20位、21位、22位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、58位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、90位、92位、94位、95位、96位、98位、99位、102位、106位、109位、110位、112位、113位、119位、124位、128位、135位、138位、142位、145位、149位、152位、154位、155位、158位、159位もしくは168位に対応する位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔38〕配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号1に対応する1位、4位、6位、11位、18位、19位、20位、21位、22位、27位、28位、31位、32位、33位、34位、36位、38位、40位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、54位、55位、58位、60位、66位、67位、68位、69位、70位、72位、74位、75位、76位、77位、86位、90位、92位、94位、95位、96位、98位、99位、102位、106位、109位、110位、112位、113位、119位、124位、128位、135位、138位、142位、145位、149位、152位、154位、155位、158位、159位もしくは168位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔39〕前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するF1I、E4K、F6Y、R11Q、Q18H/I/LV、D19N、Q20P、V21L/M、L22F、L27V、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、P40T、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G、N50K/S、G51E/R/V、A54I、D55E、V58I、I60V、S66N、G67D/S、F68L/Y/D、Q69H、M70V、L72Q、E74I/K、M75K、I76F/N/V、F77N/Y、H86L/R、I90T/V、L92Q/R、Y94F、G95D/S、T96A、V98F、I99T/V、V102E/M、M106I、Y109F、F110I、R112C、P113H、V119M、K124M、T128A/S、N135D/Y、I138S、L142V、P145Q、L149I、R152H/S、T154S、I155T、V158I、T159I/S、もしくはL168Fのうちの少なくとも1つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔37〕または〔38〕に記載のポリヌクレオチド。
〔40〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔37〕または〔38〕に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する、1位のイソロイシン、4位のリジン、6位のチロシン、11位のグルタミン、18位のヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、もしくはバリン、19位のアスパラギン、20位のプロリン、21位のロイシンもしくはメチオニン、22位のフェニルアラニン、27位のバリン、28位のチロシン、31位のイソロイシン、32位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、33位のアスパラギンもしくはメチオニン、34位のメチオニン、36位のメチオニンもしくはグルタミン酸、38位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、40位のトレオニン、42位のヒスチジン、43位のアスパラギンもしくはアルギニン、44位のフェニルアラニン、45位のグルタミン酸、46位のグルタミン、47位のプロリン、48位のアルギニン、49位のアスパラギン酸もしくはグリシン、50位のリジンもしくはセリン、51位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、54位のイソロイシン、55位のグルタミン酸、58位のイソロイシン、60位のバリン、66位のアスパラギン、67位のセリンもしくはアスパラギン酸、68位のアスパラギン酸、ロイシン、もしくはチロシン、69位のヒスチジン、70位のバリン、72位のグルタミン、74位のリジンもしくはイソロイシン、75位のリジン、76位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、77位のアスパラギンもしくはチロシン、86位のアルギニンもしくはロイシン、90位のトレオニンもしくはバリン、92位のアルギニンもしくはグルタミン、94位のフェニルアラニン、95位のセリンもしくはアスパラギン酸、96位のアラニン、98位のフェニルアラニン、99位のトレオニンもしくはバリン、102位のメチオニンもしくはグルタミン酸、106位のイソロイシン、109位のフェニルアラニン、110位のイソロイシン、112位のシステイン、113位のヒスチジン、119位のメチオニン、124位のメチオニン、128位のアラニンもしくはセリン、135位のアスパラギン酸もしくはチロシン、138位のセリン、142位のバリン、145位のグルタミン、149位のイソロイシン、152位のヒスチジンもしくはセリン、154位のセリン、155位のトレオニン、158位のイソロイシン、159位のセリンもしくはイソロイシン、もしくは168位のフェニルアラニン。
〔41〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、F54I、I90V、P115E、Q124K、Y138IおよびN166R、並びに、配列番号1の1位、4位、10位、14位、16位、18位、24位、25位、27位、33位、38位、40位、68位、70位、72位、75位、87位、90位、97位、100位、102位、111位、113位、125位、129位、130位、142位、146位、147位、149位、150位、152位もしくは166位に対応する位置またはそれらの組み合わせにおける少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔42〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がイソロイシンであり、90位のアミノ酸がバリンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸置換、および配列番号1の1位、4位、10位、14位、16位、18位、24位、25位、27位、33位、38位、40位、68位、70位、72位、75位、87位、90位、97位、100位、102位、111位、113位、125位、129位、130位、142位、146位、147位、149位、150位、152位もしくは166位に対応する位置またはそれらの組み合わせにおける少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔43〕少なくとも1つのアミノ酸置換が、配列番号1に対応するF1I、E4K、W10Y、A14S、Y16E、Q18D/F/G/H/K/L/M/N/P/R/S/W/Y、Q24A、G25L、L27M/A/D/G/I、A33N、V38I、P40I/L/Q、F68W/Y、M70V、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/R/S/T/V/W/Y、M75F/K、H87N/T、I90D/K/P/Q/R/Y、L97E、D100I、V102E/T、G111N、P113K、I125L、G129Q、T130K、L142E/K/W、D146G、G147N、L149M、L150V、R152E/T、もしくはN166I/F/Eのうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせに対応している、前記〔41〕または〔42〕に記載のポリヌクレオチド。
〔44〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔41〕または〔42〕に記載のポリヌクレオチド:配列番号1に対応する、1位のイソロイシン、4位のリジン、10位のチロシン、14位のセリン、16位のグルタミン酸、18位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トリプトファン、もしくはチロシン、24位のアラニン、25位のロイシン、27位のメチオニン、アラニン、アスパラギン酸、グリシンもしくはイソロイシン、33位のアスパラギン、38位のイソロイシン、40位のイソロイシン、ロイシンもしくはグルタミン、68位のチロシンもしくはトリプトファン、70位のバリン、72位のアラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、75位のリジンもしくはフェニルアラニン、87位のアスパラギンもしくはトレオニン、90位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、もしくはチロシン、97位のグルタミン酸、100位のイソロイシン、102位のグルタミン酸もしくはトレオニン、111位のアスパラギン、113位のリジン、125位のロイシン、129位のグルタミン、130位のリジン、142位のグルタミン酸、リジンもしくはトリプトファン、146位のグリシン、147位のアスパラギン、149位のメチオニン、150位のバリン、152位のグルタミン酸もしくはトレオニン、もしくは166位のイソロイシン、フェニルアラニン、もしくはグルタミン酸。
〔45〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、P115E、Q124K、Y138I、N166R、I90V、F54I、Q18L、F68Y、L72Q、およびM75Kを含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔46〕配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、18位のアミノ酸がロイシンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がイソロイシンであり、68位のアミノ酸がチロシンであり、72位のアミノ酸がグルタミンであり、75位のアミノ酸がリジンであり、90位のアミノ酸がバリンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンである、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔47〕配列番号1の33に対応する位置におけるアミノ酸置換がアスパラギンである、前記〔45〕または〔46〕に記載のポリヌクレオチド。
〔48〕39位がコドンACTによってコードされ、配列番号1に対応する39位のアミノ酸がトレオニンであり、43位のアミノ酸がアルギニンであり、68位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔47〕に記載のポリヌクレオチド。
〔49〕配列番号1に対応する27位のアミノ酸がバリンであり、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔48〕に記載のポリヌクレオチド。
〔50〕配列番号19のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔51〕配列番号18、配列番号24、配列番号25、配列番号42、配列番号88、または配列番号92のポリヌクレオチドを含む、前記〔1〕〜〔26〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔52〕前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換Q18L、F54I、L92H、およびY109Fをさらに含む、前記〔37〕〜〔40〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔53〕前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換V21L、F68Y、L72Q、M75K、H92RおよびV158Iをさらに含む、〔52〕に記載のポリヌクレオチド。
〔54〕前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するアミノ酸置換F54I、I90VおよびF77Yを含む、前記〔37〕〜〔40〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔55〕配列番号1に対応する18位のアミノ酸がロイシンであり、54位のアミノ酸がイソロイシンであり、92位のアミノ酸がヒスチジンであり、109位のアミノ酸がフェニルアラニンである、前記〔37〕〜〔40〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔56〕配列番号1に対応する21位のアミノ酸がロイシンであり、68位のアミノ酸がチロシンであり、72位のアミノ酸がグルタミンであり、75位のアミノ酸がリジンであり、92位のアミノ酸がアルギニンであり、158位のアミノ酸がイソロイシンである、55に記載のポリヌクレオチド。
〔57〕配列番号1に対応する54位のアミノ酸がイソロイシンであり、90位のアミノ酸がバリンであり、77位のアミノ酸がチロシンである、前記〔37〕〜〔40〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔58〕前記コードされたOgLuc変異体ポリペプチドが、配列番号1に対応するF1I、E4K、F6Y、R11Q、Q18H/I/V、D19N、Q20P、V21M、L22F、L27V、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、P40T、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G、N50K/S、G51E/R/V、D55E、V58I、I60V、S66N、G67D/S、F68L/D、Q69H、M70V、E74I/K、I76F/N/V、F77N、H86L/R、I90T、Y94F、G95D/S、T96A、V98F、I99T/V、V102E/M、M106I、F110I、R112C、P113H、V119M、K124M、T128A/S、N135D/Y、I138S、L142V、P145Q、L149I、R152H/S、T154S、I155T、T159I/S、もしくはL168Fのうちの少なくとも1つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔52〕〜〔57〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔59〕前記前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも1つ、またはそれらの組み合わせを含む、前記〔52〕〜〔57〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド:1位のイソロイシンアミノ酸、4位のリジン、6位のチロシン、11位のグルタミン、18位のヒスチジン、イソロイシン、もしくはバリン、19位のアスパラギン、20位のプロリン、21位のメチオニン、22位のフェニルアラニン、27位のバリン、28位のチロシン、31位のイソロイシン、32位のプロリン、ヒスチジン、またはロイシン、33位のアスパラギンまたはメチオニン、34位のメチオニン、36位のメチオニンまたはグルタミン酸、38位のイソロイシンまたはフェニルアラニン、40位のトレオニン、42位のヒスチジン、43位のアスパラギンまたはアルギニン、44位のフェニルアラニン、45位のグルタミン酸、46位のグルタミン、47位のプロリン、48位のアルギニン、49位のアスパラギン酸またはグリシン、50位のリジンまたはセリン、51位のグルタミン酸、アルギニン、またはバリン、55位のグルタミン酸、58位のイソロイシン、60位のバリン、66位のアスパラギン、67位のセリンまたはアスパラギン酸、68位のロイシンまたはアスパラギン酸、69位のヒスチジン、70位のバリン、74位のリジンまたはイソロイシン、76位のアスパラギン、フェニルアラニン、またはバリン、77位のアスパラギン、86位のアルギニンまたはロイシン、90位のトレオニン、92位のグルタミン、94位のフェニルアラニン、95位のセリンまたはアスパラギン酸、96位のアラニン、98位のフェニルアラニン、99位のトレオニンまたはバリン、102位のメチオニンまたはグルタミン酸、106位のイソロイシン、110位のイソロイシン、112位のシステイン、113位のヒスチジン、119位のメチオニン、124位のメチオニン、128位のアラニンまたはセリン、135位のアスパラギン酸またはチロシン、138位のセリン、142位のバリン、145位のグルタミン、149位のイソロイシン、152位のヒスチジンもしくはセリン、154位のセリン、155位のトレオニン、159位のセリンもしくはイソロイシン、もしくは168位のフェニルアラニン。
〔60〕配列番号1のOgLucポリペプチドに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、P115E、Q124K、Y138I、N166R、I90V、F54I、Q18L、F68Y、L72Q、およびM75Kを含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔61〕配列番号1のOgLucポリペプチドに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、18位のアミノ酸がロイシンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がイソロイシンであり、68位のアミノ酸がチロシンであり、72位のアミノ酸がグルタミンであり、75位のアミノ酸がリジンであり、90位のアミノ酸がバリンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔62〕配列番号1の33に対応する位置におけるアミノ酸置換がアスパラギンである、前記〔60〕または〔61〕に記載のポリヌクレオチド。
〔63〕39位がコドンACTによってコードされ、配列番号1に対応する39位のアミノ酸がトレオニンであり、43位のアミノ酸がアルギニンであり、68位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔62〕に記載のポリヌクレオチド。
〔64〕配列番号1に対応する27位のアミノ酸がバリンであり、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔63〕に記載のポリヌクレオチド。
〔65〕配列番号1のOgLucポリペプチドに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、P115E、Q124K、Y138I、N166R、Q18L、F54I、L92H、およびY109Fを含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔66〕配列番号1に対応するアミノ酸置換V21L、F68Y、L72Q、M75K、H92R、およびV158Fをさらに含む、前記〔65〕に記載のポリヌクレオチド。
〔67〕配列番号1のOgLucポリペプチドに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1に対応するアミノ酸置換A4E、Q11R、A33K、V44I、A54I、F77Y、I90V、P115E、Q124K、Y138IおよびN166Rを含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔68〕配列番号1のOgLucポリペプチドに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、18位のアミノ酸がロイシンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がイソロイシンであり、92位のアミノ酸がヒスチジンであり、109位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、前記OgLuc変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔69〕配列番号1に対応する21位のアミノ酸がロイシンであり、68位のアミノ酸がチロシンであり、72位のアミノ酸がグルタミンであり、75位のアミノ酸がリジンであり、92位のアミノ酸がアルギニンであり、158位のアミノ酸がイソロイシンである、前記〔68〕に記載のポリヌクレオチド。
〔70〕配列番号1のOgLucポリペプチドに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するOgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号1に対応する4位のアミノ酸がグルタミン酸であり、11位のアミノ酸がアルギニンであり、33位のアミノ酸がリジンであり、44位のアミノ酸がイソロイシンであり、54位のアミノ酸がイソロイシンであり、77位のアミノ酸がチロシンであり、90位のアミノ酸がバリンであり、115位のアミノ酸がグルタミン酸であり、124位のアミノ酸がリジンであり、138位のアミノ酸がイソロイシンであり、166位のアミノ酸がアルギニンであり、前記OgLuc変異体ポリペプチドルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔71〕配列番号19のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
〔72〕配列番号18、配列番号24、配列番号25、配列番号42、配列番号88、または配列番号92のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
〔73〕配列番号1に対して少なくとも30%のアミノ酸配列同一性を有する十脚類ルシフェラーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、式(VII)の配列パターンに対応し、かつ多くて5つまでの差異を含む配列パターンを含み、差異が、表4に列挙されるOgLucパターンに記載の式(VII)に対するパターン位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17、または18との差異、並びに表4に列挙されるOgLucパターンに記載の式(VII)のパターン位置のいずれかの間のギャップまたは挿入を含み、前記十脚類ルシフェラーゼがセレンテラジンの存在下で発光を生ずる、単離ポリヌクレオチド。
〔74〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表4に列挙されるOgLucパターンに記載の式(VII)の配列パターンと多くて4つまでの差異を含む、前記〔73〕に記載のポリヌクレオチド。
〔75〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表4に列挙されるOgLucパターンに記載の式(VII)の配列パターンと多くて3つまでの差異を含む、前記〔73〕に記載のポリヌクレオチド。
〔76〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表4に列挙されるOgLucパターンに記載の式(VII)の配列パターンと多くて2つまでの差異を含む、前記〔73〕に記載のポリヌクレオチド。
〔77〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表4に列挙されるOgLucパターンに記載の式(VII)の配列パターンと多くて1つまでの差異を含む、前記〔73〕に記載のポリヌクレオチド。
〔78〕前記ポリペプチドが表4に列挙されるOgLucパターンに記載の式(VII)に対応する配列を含む、前記〔73〕に記載のポリヌクレオチド。
〔79〕前記十脚類ルシフェラーゼが、チヒロエビ(Aristeidae)科、タラバエビ(Pandalidea)科、クダヒゲエビ(Solenoceridae)科、ユメエビ(Luciferidae)科、サクラエビ(Segestidae)科、オキエビ(Pasiphaeidae)科、ヒオドシエビ(Oplophoridae)科、またはタラッソカリダエ(Thalassocaridae)科由来である、前記〔73〕に記載のポリヌクレオチド。
〔80〕前記十脚類ルシフェラーゼがヒオドシエビ(Oplophoridae)科由来である、前記〔79〕に記載のポリヌクレオチド。
〔81〕前記十脚類ルシフェラーゼがオキヒオドシエビ属(Oplophorus)種由来である、前記〔80〕に記載のポリヌクレオチド。
〔82〕前記十脚類ルシフェラーゼが、プレシオペナエウス・コルスカンス(Plesiopenaeus coruscans)、ヘテロカルプス(Heterocarpus)種、パラパンダルス(Parapandalus)種、ヒュメノペナエウス・デビリス(Hymenopenaeus debilis)、メソペナエウス・トゥロピカリス(Mesopenaeus tropicalis)、ルキフェル・テュプス(Lucifer typus)、セルゲステス・アトゥランティクス(Sergestes atlanticus)、セルゲステス・アルクティクス(Sergestes arcticus)、セルゲステス・アルマトゥス(Sergestes armatus)、セルゲステス・ペディフォルミス(Sergestes pediformis)、セルゲステス・コルヌトゥス(Sergestes cornutus)、セルゲステス・エドゥワルドゥシ(Sergestes edwardsi)、セルゲステス・ヘンセニ(Sergestes henseni)、セルゲステス・ペクティナトゥス(Sergestes pectinatus)、セルゲステス・サルガッシ(Sergestes sargassi)、セルゲステス・シミリス(Sergestes similis)、セルゲステス・ヴィギラクス(Sergestes vigilax)、セルギア・カッレンゲリ(Sergia challengeri)、セルギア・グランディス(Sergia grandis)、セルギア・ルケンス(Sergia lucens)、セルギア・プレヘンシリス(Sergia prehensilis)、セルギア・ポテンス(Sergia potens)、セルギア・ロブスタ(Sergia robusta)、セルギア・スキンティッランス(Sergia scintillans)、セルギア・スプレンデンス(Sergia splendens)、グリュプス・マルスピアリス(Glyphus marsupialis)、レプトケラ・ベルムデンシス(Leptochela bermudensis)、パラパシパエ・スルカティフロンス(Parapasiphae sulcatifrons)、パシペア・タルダ(Pasiphea tarda)、アカンテピュラ・アカンティテルソニス(Acanthephyra acanthitelsonis)、アカンテピュラ・アクティフロンス(Acanthephyra acutifrons)、アカンテピュラ・ブレヴィロストゥリス(Acanthephyra brevirostris)、アカンテピュラ・ククッラタ(Acanthephyra cucullata)、アカンテピュラ・クルティロストゥリス(Acanthephyra curtirostris)、アカンテピュラ・エクシミア(Acanthephyra eximia)、アカンテピュラ・グラキリペス(Acanthephyra gracilipes)、アカンテピュラ・キングスレユィ(Acanthephyra kingsleyi)、アカンテピュラ・メディア(Acanthephyra media)、アカンテピュラ・ミクロプタルマ(Acanthephyra microphthalma)、アカンテピュラ・ペラギカ(Acanthephyra pelagica)、アカンテピュラ・プリオノタ(Acanthephyra prionota)、アカンテピュラ・プルプレア(Acanthephyra purpurea)、アカンテピュラ・サングイネア(Acanthephyra sanguinea)、アカンテピュラ・シボガエ(Acanthephyra sibogae)、アカンテピュラ・ステュロロストゥラティス(Acanthephyra stylorostratis)、エピュリナ・ビフィダ(Ephyrina bifida)、エピュリナ・フィグエイライ(Ephyrina figueirai)、エピュリナ・コスキュニイ(Ephyrina koskynii)、エピュリナ・オムバンゴ(Ephyrina ombango)、ヒュメノドラ・グラキアリス(Hymenodora glacialis)、ヒュメノドラ・グラキリス(Hymenodora gracilis)、メニンゴドラ・ミッキュラ(Meningodora miccyla)、メニンゴドラ・モッリス(Meningodora mollis)、メニンゴドラ・ヴェスカ(Meningodora vesca)、ノトストムス・ギッボスス(Notostomus gibbosus)、ノトストムス・アウリクラトゥス(Notostomus auriculatus)、オプロポルス・グラキリロストゥリス(Oplophorus gracilirostris)、オプロポルス・グリマルディイ(Oplophorus grimaldii)、オプロポルス・ノヴァエゼアランディアエ(Oplophorus novaezealandiae)、オプロポルス・スピニカウダ(Oplophorus spinicauda)、オプロポルス・フォリアケウス(Oplophorus foliaceus)、オプロポルス・スピノスス(Oplophorus spinosus)、オプロポルス・テュプス(Oplophorus typus)、シュステッラスピス・ブラウエリ(Systellaspis braueri)、シュステッラスピス・クリスタタ(Systellaspis cristata)、シュステッラスピス・デビリス(Systellaspis debilis)、シュステッラスピス・ペッルキダ(Systellaspis pellucida)、クロロトコイデス・スピニカウダ(Chlorotocoides spinicauda)、タラッソカリス・クリニタ(Thalassocaris crinita)、またはタラッソカリス・ルキダ(Thalassocaris lucida)由来のルシフェラーゼである、前記〔79〕に記載のポリヌクレオチド。
〔83〕式(VII)の配列パターンが、配列番号1の8番目の残基を先頭として配列番号1と整列されている、前記〔73〕に記載のポリヌクレオチド。
〔84〕配列がコドン最適化されている、前記〔1〕〜〔83〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔85〕ポリヌクレオチドが配列番号22、配列番号23、配列番号24、または配列番号25を含む、前記〔84〕に記載のポリヌクレオチド。
〔86〕ポリヌクレオチドがOgLuc変異体ポリペプチドと連結された目的のポリペプチドをさらにコードし、目的のポリペプチドおよびOgLuc変異体ポリペプチドが融合タンパク質として発現されることが可能である、前記〔1〕〜〔85〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔87〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔88〕前記ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されている前記〔96〕に記載のベクター。
〔89〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔87〕もしくは〔88〕に記載のベクターを含む細胞。
〔90〕前記〔89〕に記載の細胞を含む非ヒト遺伝子導入動物。
〔91〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔87〕もしくは〔88〕に記載のベクターを含む非ヒト遺伝子導入動物。
〔92〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるOgLuc変異体ポリペプチド。
〔93〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
〔94〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるOgLuc変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質。
〔95〕前記〔89〕に記載の細胞を、OgLuc変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させることを含む、OgLuc変異体ポリペプチドの製造方法。
〔96〕OgLuc変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記〔87〕または〔88〕に記載のベクターを細胞に導入することを含む、OgLuc変異体ポリペプチドの製造方法。
〔97〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔87〕もしくは〔88〕に記載のベクターを含むキット。
〔98〕前記〔92〕に記載のOgLuc変異体ポリペプチドを含むキット。
〔99〕 以下のうちの少なくとも1つをさらに含む、前記〔97〕または〔98〕のいずれか一項に記載のキット:
(a)式(Ia)または(Ib):
または
の化合物であって、
式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは-S−、-O−または-NR22−であり;
Yは、-H、−OH、または-OR11であり;
Zは、-CH−または-N−であり;
各R11は独立して-C(O)R”または-CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
の化合物
;並びに
(b)緩衝液試薬。
〔100〕化合物
または
および前記〔60〕〜〔64〕または71〜72のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔60〕〜〔64〕もしくは71〜72のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むキット。
〔101〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド;前記〔87〕または〔88〕のいずれか一項に記載のベクター;前記〔89〕に記載の細胞;前記〔90〕〜〔91〕のいずれか一項に記載の動物;前記〔92〕に記載のOgLuc変異体ポリペプチド;前記〔93〕に記載のポリペプチド;および前記〔94〕に記載の融合タンパク質のうちの少なくとも1つを用いる、生物発光の測定方法。
〔102〕配列番号2を有する親核酸配列に対し80%以下の核酸配列同一性を有し、配列番号22、配列番号23、配列番号24、もしくは配列番号25に対し90%以上の核酸配列同一性を有する少なくとも100ヌクレオチドの断片またはその補体を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列であって、減少した配列同一性が親核酸配列中のコドンと比較して合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンによるものであり、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するOgLuc変異体をコードし、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列と比較して減少した数の制御配列を有する、上記合成ヌクレオチド配列。
〔103〕配列番号14を有する親核酸配列に対し80%以下の核酸配列同一性を有し、配列番号22もしくは配列番号23に対し90%以上の核酸配列同一性を有する少なくとも300ヌクレオチドの断片またはその補体を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列であって、減少した配列同一性が親核酸配列中のコドンと比較して合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンによるものであり、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するホタルルシフェラーゼをコードし、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列と比較して減少した数の制御配列を有する、上記合成ヌクレオチド配列。
〔104〕配列番号18を有する親核酸配列に対し80%以下の核酸配列同一性を有し、配列番号24もしくは配列番号25に対し90%以上の核酸配列同一性を有する少なくとも100ヌクレオチドの断片またはその補体を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列であって、減少した配列同一性が親核酸配列中のコドンと比較して合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンによるものであり、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するOgLuc変異体をコードし、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列と比較して減少した数の制御配列を有する、上記合成ヌクレオチド配列。
〔105〕前記OgLuc変異体ポリペプチドが可溶性の単量体である、前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔106〕前記融合タンパク質がOgLuc変異体ポリペプチドのN末端にシグナル配列を含む、前記〔86〕に記載のポリヌクレオチド。
〔107〕前記融合タンパク質が細胞から分泌される、前記〔106〕に記載のポリヌクレオチド。
〔108〕異種タンパク質と融合された、トゲオキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)由来のシグナルペプチドを含む融合ペプチドであって、前記シグナルペプチドが配列番号54であり、前記融合ペプチドが細胞中で発現され、そして細胞から分泌される、上記融合ペプチド。
〔109〕第一の標的タンパク質および生物発光供与体分子を含み、生物発光供与体分子が前記〔10〕〜〔88〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるOgLuc変異体である、第一の融合タンパク質;第二の標的タンパク質および蛍光受容体分子を含む第二の融合タンパク質;並びにOgLuc基質、を含む生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)系。
〔110〕OgLuc基質が天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンである、前記〔109〕に記載のBRET系。
〔111〕OgLuc基質が、式(Ia)または(Ib):
または
の化合物である、前記〔109〕に記載のBRET系であって、
式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは−S−、−O−または−NR22−であり;
Yは、−H、−OH、または−OR11であり;
Zは、−CH−または−N−であり;
各R11は独立して−C(O)R”または−CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
BRET系。
〔112〕OgLuc基質が化合物
または
である、前記〔109〕に記載のBRET系。
〔113〕発光源タンパク質の酵素活性の測定方法であって、発光源タンパク質、脱保護酵素、および保護発光団を接触させること;並びに前記組成物から発せられた光を検出することを含み、発光源タンパク質が前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるOgLuc変異体であり、発光団が式(Ia)または(Ib):
または
の化合物であり、
式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは−S−、−O−または−NR22−であり;
Yは、−H、−OH、または−OR11であり;
Zは、−CH−または−N−であり;
各R11は独立して−C(O)R”または−CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
方法。
〔114〕酵素活性が、生きている無傷の非ヒト動物において測定される、前記〔113〕に記載の方法。
〔115〕目的の非発光酵素の活性の測定方法であって、(a)目的の非発光酵素に対する基質である発光源分子および前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるOgLuc変異体の前基質を提供することと;b)発光源分子を少なくとも1つの目的の非発光酵素および少なくとも1つのOgLuc変異体と接触させて反応混合物を生成することと;並びに(c)反応混合物の発光を測定することによって目的の非発光酵素の活性を決定することと、を含む方法。
〔116〕発光源分子が、式(Ia)または(Ib):
または
の化合物の変更形態である、前記〔115〕に記載の方法であって、
式中、R2は、
またはC2-5直鎖アルキルからなる群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rからなる群から選択され;
R8は、
Hまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され;
式中、R3およびR4は、共にHまたは共にC1-2アルキルであり;
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;
Xは-S−、-O−または-NR22−であり;
Yは、-H、−OH、または-OR11であり;
Zは、-CH−または-N−であり;
各R11は独立して-C(O)R”または-CH2OC(O)R”であり;
R22は、H、CH3またはCH2CH3であり;
各Rは独立してC1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
R”は、C1-7直鎖アルキルまたはC1-7分岐鎖アルキルであり;
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し;
ただし、
R2が、
または
のとき、R8は、
ではなく;
R2が、
であるとき、R8は、
または低級シクロアルキルであり;
R6がNH2であるとき、R2は、
またはC2-5アルキルであり;
またはR8は、
ではない、
方法。
〔117〕目的の非発光酵素がプロテアーゼ酵素、シトクロムP450酵素、モノアミンオキシダーゼ酵素、またはグルタチオンS−トランスフェラーゼ酵素である、前記〔115〕および〔116〕のいずれか一項に記載の方法。
〔118〕非発光酵素の活性が生きている無傷動物において測定される、前記〔115〕〜〔117〕のいずれか一項に記載の方法。
〔119〕試料中の少なくとも2つの分子の存在を検出するための方法であって、試料を前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるOgLuc変異体を含む第一のレポーター分子に接触させることであって、第一のレポーター分子が試料の第一の成分に機能的に連結されることと;試料を第二のレポーター分子に接触させることであって、第二のレポーター分子が試料の第二の成分に機能的に連結されることと、;第一のレポーター分子および第二のレポーター分子の存在を検出して、試料中の第一の成分および第二の成分の存在および/または量を決定すること、を含む方法。
〔120〕細胞中の少なくとも2つの分子の存在を検出するための方法であって、細胞を前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるOgLuc変異体を含む第一のレポーター分子に接触させることであって、第一のレポーター分子が試料の第一の成分に機能的に連結されることと;試料を第二のレポーター分子に接触させることであって、第二のレポーター分子が試料の第二の成分に機能的に連結されることと;第一のレポーター分子および第二のレポーター分子の存在を検出して、試料中の第一の成分および第二の成分の存在および/または量を決定すること、を含む方法。
〔121〕OgLuc変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成方法であって、
(a)親OgLucポリペプチドおよび少なくとも1つの異種ポリペプチドを含む親融合タンパク質コンストラクトを用いて変異融合タンパク質のライブラリーを作製することと;並びに
(b)親融合タンパク質コンストラクトと比較して増強された発光、増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも1つのために前記ライブラリーをスクリーニングすること、
を含む方法。
〔122〕異種ポリペプチドがOgLucポリペプチドに対してC末端側である、前記〔121〕に記載の方法。
〔123〕異種ポリペプチドがOgLucポリペプチドに対してN末端側である、前記〔121〕に記載の方法。
〔124〕異種ポリペプチドがHaloTag(登録商標)である、前記〔121〕〜〔123〕のいずれか一項に記載の方法。
〔125〕融合タンパク質コンストラクトが2つの異種ポリペプチドを含む、前記〔121〕に記載の方法。
〔126〕異種ポリペプチドの一方がOgLucポリペプチドに対しN末端側であり、もう一方の異種ポリペプチドがOgLucポリペプチドに対しC末端側である、前記〔125〕に記載の方法。
〔127〕異種ポリペプチドがHaloTag(登録商標)およびIdである、前記〔125〕または〔126〕に記載の方法。
〔128〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはその断片を含むベクター。
〔129〕前記〔1〕〜〔86〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはその断片を含む、循環置換されたルシフェラーゼ。
〔130〕生物中で使用するためのルシフェラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドの生成方法であって、ルシフェラーゼ中の各アミノ酸に対し、前記アミノ酸をコードするのに前記生物において使用される2つの最も頻繁に使用されるコドンから1つのコドンを無作為に選択し、第一のコドン最適化ポリヌクレオチドを生成すること、を含む方法。
〔131〕前記アミノ酸をコードするのに前記生物において使用される2つの最も頻繁に使用されるコドンのうちのもう一方を選択し、第二のコドン最適化ポリヌクレオチドを生成することをさらに含む、前記〔130〕に記載のコドンを最適化する方法。
Claims (1)
- 配列番号1に対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号1中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むOgLuc変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記OgLuc変異体ポリペプチドが非オキヒオドシエビ属ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、単離ポリヌクレオチド。
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