JP6155424B2 - オキヒオドシエビ属由来ルシフェラーゼ、新規セレンテラジン基質、及び使用法 - Google Patents

オキヒオドシエビ属由来ルシフェラーゼ、新規セレンテラジン基質、及び使用法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月２日に出願された米国仮出願番号第６１／４０９，４２２号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
深海エビのトゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）から分泌されるルシフェラーゼは、高活性、高量子収量、および広範な基質特異性（例えば、セレンテラジンおよび種々のセレンテラジン類似体を含む）等の多くの興味深い特徴を有することが示されている。オキヒオドシエビ属（Oplophorus）の生物発光反応は、分子状酸素によるセレンテラジン（基質）の酸化がオキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼによって触媒されるときに起こり、４６２ｎｍに最大強度をもつ光、並びに生成物であるＣＯ2およびコエレンテルアミドが生じる（Shimomura et al., Biochemistry, 17:994 (1978)）。最適な発光は０．０５〜０．１Ｍ ＮａＣｌの存在下、４０℃、ｐＨ９で生じ、この酵素の例外的な熱耐性のために、高度に精製された酵素が使用された場合では５０℃超の温度で、または部分的に精製された酵素が使用された場合では７０℃超で可視発光が生じる。Shimomura et al. (1978)において、天然ルシフェラーゼはｐＨ８．７でおよそ１３０ｋＤａの分子量を有し、外見上それぞれ３１ｋＤａの４つの単量体から成ること；低ｐＨでは、天然ルシフェラーゼは重合する傾向があることが報告された。
後の研究により、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostri）ルシフェラーゼが３５ｋＤａの天然タンパク質と１９ｋＤａの天然タンパク質の複合体であること、すなわち、２つの１９ｋＤａの構成要素および２つの３５ｋＤａの構成要素から成るヘテロ四量体であることが示された。Inouye et al. (2000)において、オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼの３５ｋＤａおよび１９ｋＤａのタンパク質をコードするｃＤＮＡの分子クローニング、並びに発光反応を触媒するタンパク質成分の特定が報告された。前記タンパク質をコードするｃＤＮＡは、細菌細胞および哺乳類細胞で発現され、１９ｋＤａのタンパク質は、セレンテラジンの酸化発光を触媒することができる成分として特定された（Inouye et al., 2000）。
オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼの１９ｋＤａのタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＢＡＢ１３７７６、１９６アミノ酸）は、ルシフェラーゼ機能を有する最小の触媒成分であると思われ、その一次構造は、イミダゾピラジノンルシフェラーゼを含むいかなる既報告のルシフェラーゼとも有意な類似性を有していない（Lorenz et al., PNAS USA, 88:4438 (1991); Thompson et al., PNAS USA, 86:6567 (1989)）。大腸菌（E. coli）において前記１９ｋＤａタンパク質を発現させた結果、封入体が形成された（Inouye and Sasaki, Protein Expression and Purification, 56:261-268 (2007)）。封入体形成は、タンパク質の不安定性によるものである可能性が高い。
オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼの基質特異性は予想外に幅広い（Inouye and Shimomura. BBRC, 223:349 (1997)）。例えば、セレンテラジン類似体であるビスデオキシセレンテラジン（すなわち、セレンテラジン−ｈｈ）は、セレンテラジンに匹敵する、オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼの優れた基質である（Nakamura et al., Tetrahedron Lett., 38:6405 (1997)）。さらに、オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼは、海生貝虫類のウミホタル（Cypridina (Vargula) hilgendorfii）のルシフェラーゼに類似した分泌酵素であり（Johnson and Shimomura, Meth. Enzyme, 57:331 (1978)）、光を発するのにイミダゾピラジノン型ルシフェリンも用いる。
一態様において、本開示は、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物に関し、式中、Ｒ2は、
またはＣ2-5直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ8は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共にＨまたは共にＣ1-2アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ2、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ2Ｒであり；
Ｘは、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＲ22−であり；
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＯＲ11であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
各Ｒ11は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’または−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’であり；
Ｒ22は、Ｈ、ＣＨ3またはＣＨ2ＣＨ3であり；
各Ｒは独立してＣ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
Ｒ’’は、Ｃ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し、；
ただし、Ｒ2が
または
であるとき、Ｒ8は、
ではなく；
Ｒ2が、
であるとき、Ｒ8は、
または低級シクロアルキルであり；そして
Ｒ6がＮＨ2であるとき、Ｒ2は、
またはＣ2-5アルキルであり；
あるいは、Ｒ8は
ではない。
別の態様では、本開示は、
から選択される化合物に関する。
一態様において、本開示は、式：
または
の化合物に関する。
一態様において、本開示は、配列番号１におけるアミノ酸に対応するある位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号１に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、ここで、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドは増強された発光を有する。
一態様において、本開示は、配列番号１におけるあるアミノ酸に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号１に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、ここで該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドは配列番号３のＯｇＬｕｃポリペプチドと比較して増強された発光を有するが、ただし、該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドは表４７に列挙されるもののうちの１つではない。
一態様において、本開示は、配列番号１におけるあるアミノ酸に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号１に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、ここで、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドは、配列番号３１のポリペプチドと比較して増強された発光を有するが、ただし、該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドは配列番号３でも配列番号１５でもない。
一態様において、本開示は、配列番号１におけるあるアミノ酸に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号１に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、ここで、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドは、配列番号２９のポリペプチドと比較して増強された発光を有するが、ただし、該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドは配列番号３でも１５でもない。
一態様において、本開示は、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８Ｉ、Ｎ１６６Ｒ、Ｉ９０Ｖ、Ｆ５４Ｉ、Ｑ１８Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを含む、配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対し少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドはルシフェラーゼ活性を有する。
一態様において、本開示は、配列番号１に対応して、４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位がアルギニンであり、１８位がロイシンであり、３３位がリジンであり、４４位がイソロイシンであり、５４位がイソロイシンであり、６８位がチロシンであり、７２位がグルタミンであり、７５位がリジンであり、９０位がバリンであり、１１５位がグルタミン酸であり、１２４位がリジンであり、１３８位がイソロイシンであり、１６６位がアルギニンである、配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対し少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドはルシフェラーゼ活性を有する。
一態様において、本開示は、配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対し少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１に対応して、アミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８Ｉ、Ｎ１６６Ｒ、Ｑ１８Ｌ、Ｆ５４Ｉ、Ｌ９２Ｈ、およびＹ１０９Ｆを含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドはルシフェラーゼ活性を有する。
一態様において、本開示は、配列番号１に対応して、アミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ａ５４Ｉ、Ｆ７７Ｙ、Ｉ９０Ｖ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８ＩおよびＮ１６６Ｒを含む、配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対し少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドはルシフェラーゼ活性を有する。
一態様において、本開示は、配列番号１に対応して、４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位がアルギニンであり、１８位がロイシンであり、３３位がリジンであり、４４位がイソロイシンであり、５４位がイソロイシンであり、９２位がヒスチジンであり、１０９位がフェニルアラニンであり、１１５位がグルタミン酸であり、１２４位がリジンであり、１３８位がイソロイシンであり、そして１６６位がアルギニンである、配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対し少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、ここで、該ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドはルシフェラーゼ活性を有する。
一態様において、本開示は、配列番号１に対応して、４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位がアルギニンであり、３３位がリジンであり、４４位がイソロイシンであり、５４位がイソロイシンであり、７７位がチロシンであり、９０位がバリンであり、１１５位がグルタミン酸であり、１２４位がリジンであり、１３８位がイソロイシンであり、１６６位がアルギニンである、配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対し少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、ここで、ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドはルシフェラーゼ活性を有する。
一態様において、本開示は、配列番号１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一態様において、本開示は、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４２、配列番号８８、または配列番号９２のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。
一態様において、本開示は、配列番号１に対し少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有する十脚類のルシフェラーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関し、該ポリペプチドは、式（ＶＩＩ）の配列パターンに対応する配列パターンを含み、５つより多い差異を含むことはなく、該差異は、式（ＶＩＩ）に対して、表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに従う、パターン位置１、２、３、５、８、１０、１２、１４、１５、１７、または１８との差異を含み、並びに表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに従う、式（ＶＩＩ）のパターン位置のいずれかの間のギャップまたは挿入を含み、ここで、該十脚類ルシフェラーゼはセレンテラジンの存在下で発光する。
一態様において、本開示は、配列番号２を有する親核酸配列に対し８０％以下の核酸配列同一性を有し、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、もしくは配列番号２５に対し９０％以上の核酸配列同一性を有する少なくとも１００のヌクレオチドから成る断片、またはその補体を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列に関し、ここで、配列同一性の減少は、該親核酸配列におけるコドンに対する、該合成ヌクレオチド配列における異なるコドンによるものであり、ここで、該合成ヌクレオチド配列は、該親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体をコードしており、さらにここで、該合成ヌクレオチド配列は、該親核酸配列と比較して、減少した数の制御配列を有している。
一態様において、本開示は、配列番号１４を有する親核酸配列に対し８０％以下の核酸配列同一性を有し、配列番号２２もしくは配列番号２３に対して９０％以上の核酸配列同一性を有する少なくとも３００のヌクレオチドから成る断片またはその補体を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列に関し、ここで、配列同一性の減少は、該親核酸配列におけるコドンに対する、該合成ヌクレオチド配列における異なるコドンによるものであり、ここで、該合成ヌクレオチド配列は、該親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するホタルルシフェラーゼをコードしており、さらにここで、該合成ヌクレオチド配列は、該親核酸配列と比較して、減少した数の制御配列を有している。
一態様において、本開示は、配列番号１８を有する親核酸配列に対し８０％以下の核酸配列同一性を有し、配列番号２４もしくは配列番号２５に対し９０％以上の核酸配列同一性を有する少なくとも１００のヌクレオチドから成る断片、またはその補体を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列に関し、ここで、配列同一性の減少は該親核酸配列におけるコドンに対する、該合成ヌクレオチド配列における異なるコドンによるものであり、ここで、該合成ヌクレオチド配列は、該親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体をコードしており、さらにここで、該合成ヌクレオチド配列は、該親核酸配列と比較して、減少した数の制御配列を有している。
一態様において、本開示は、異種タンパク質と融合したトゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来シグナルペプチドを含む融合ペプチドに関し、ここで該シグナルペプチドは配列番号５４であり、該融合ペプチドは細胞で発現され、その細胞から分泌される。
一態様において、本開示は、ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成する方法に関し、該方法は、（ａ）親ＯｇＬｕｃポリペプチドおよび少なくとも１つの異種ポリペプチドを含む親融合タンパク質コンストラクトを用いて、変異体融合タンパク質のライブラリーを作製すること；並びに（ｂ）親融合タンパク質コンストラクトと比較した場合の増強された発光、増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうち少なくとも１つのために、該ライブラリーをスクリーニングすること、を含む。
一態様において、本開示は、ある生物においての使用を目的としたルシフェラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを生成する方法に関し、該方法は、該ルシフェラーゼ中の各アミノ酸に対し、該アミノ酸をコードするのに該生物において使用される２つの最も頻繁に使用されるコドンから１つのコドンを無作為に選択して、第一のコドン最適化ポリヌクレオチドを生成することを含む。
本発明の他の態様は、詳細な説明および添付図面を考慮することによって明らかになる。
天然セレンテラジン、既知のビス−セレンテラジン（セレンテラジン−ＨＨ）、および既知のセレンテラジン−Ｈの化学構造を示し、Ｒ２、Ｒ６およびＲ８は、修飾が行われた分子の領域を表す。 新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９６、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３９３２、およびＰＢＩ−３８４０の化学構造を示す。 ＰＢＩ−３９３９のＫｍ決定を示す。 本発明の種々の新規セレンテラジンの化学構造を示す。 Ａ〜Ｇは、天然セレンテラジン、既知セレンテラジン、および新規セレンテラジンを基質として用いた、Ｃ１＋Ａ４Ｅを発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光（ＲＬＵ）を示す。図５Ａ、図５Ｃ〜Ｇは、天然セレンテラジンを比較として用い、既知の、および新規のセレンテラジンでＣ１＋Ａ４Ｅにより生じた発光をＲＬＵで測定した、独立した実験を示す。図５Ｂは、天然セレンテラジンと比較した、図５Ａに示された基質を用いた、Ｃ１＋４ＡＥによって生じた発光における低減倍率を示す。 Ａ〜Ｄは、天然セレンテラジン（「Ｃｏｅｌｅｎｔｅ」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、既知の２−メチルセレンテラジン（「２−ｍｅ」）、既知のセレンテラジン−ｖ（「ｖ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８９９、ＰＢＩ−３９００、ＰＢＩ−３９１２、ＰＢＩ−３９１３、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９９、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９３３、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９４６、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９６、ＰＢＩ−３９２５、およびＰＢＩ−３９４５を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 種々のＯｇＬｕｃ変異体におけるアミノ酸置換を示す。 Ａ〜Ｂは、天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３９１２、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９３３、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９４６、ＰＢＩ−３９４１、およびＰＢＩ−３８９６を基質として用いた、図７に列挙されるＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−９８９４、およびＰＢＩ−３８９６を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 種々のＯｇＬｕｃ変異体におけるアミノ酸置換を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３８９４、およびＰＢＩ−３８９６を基質として用いた、図１０に列挙されるＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３８９７を基質として用いた、ＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「Ｈ，Ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３８９４を基質として用いた、ＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 種々のＯｇＬｕｃ変異体におけるアミノ酸置換を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３８９４を基質として用いた、図１４に列挙されるＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ＨＨ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１およびＰＢＩ−３８９７を基質として用いた、ＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「Ｃｏｅｌ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９７およびＰＢＩ−３８４１を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体およびヒト化ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（ｈＲＬ）を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、およびＰＢＩ−４００２を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、およびＰＢＩ−４００２を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 種々のＯｇＬｕｃ変異体におけるアミノ酸置換を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、ＰＢＩ−３９３２、およびＰＢＩ−３８４０を基質として用いた、図２０に列挙されるＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 種々のＯｇＬｕｃ変異体におけるアミノ酸置換を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−４００２、ＰＢＩ−３９３２、およびＰＢＩ−３８４０を基質として用いた、図２２に列挙されるＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「Ｈ，Ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９およびＰＢＩ−３９４５を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体およびｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、およびＰＢＩ−４００２を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体およびｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 種々のＯｇＬｕｃ変異体におけるアミノ酸置換を示す。 天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「ｈ，ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、およびＰＢＩ−４００２を基質として用いた、図２６に列挙されるＯｇＬｕｃ変異体を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジン（「Ｃｏｅｌ．」）、既知のセレンテラジン−ｈ（「Ｈ」）、既知のセレンテラジン−ｈｈ（「Ｈ，Ｈ」）、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、およびＰＢＩ−４００２を基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体およびｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジンおよびＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、細菌溶解物中の９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎの発光、並びに天然セレンテラジンと比較した、ＰＢＩ−３９３９に対するこれらの変異体の相対的特異性を示す。 Ａ〜Ｄは、天然セレンテラジン（図３０Ａ）、セレンテラジン−ｈ（図３０Ｂ）、およびＰＢＩ−３９９（図３０Ｃ）を用いた、１６６位での変異解析を示す。 ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖにおける種々の欠失の発光を示し、ここで（−）は装置のバックグラウンドである。 天然セレンテラジンを基質として使用したｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）を発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた発光を正規化したもの、ルシフェリン（ＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）アッセイ試薬）を基質として使用したホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）を発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた発光を正規化したもの、および新規ＰＢＩ−３９３９を基質として使用した種々のＯｇＬｕｃ変異体を発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた発光を正規化したもの示す。 新規セレンテラジンＰＢＩ−３９４５を基質として用いた、細菌溶解物中のＩＶおよび１５Ｃ１のシグナル安定性、並びに新規セレンテラジンＰＢＩ−３８８９を基質として用いた、細菌溶解物中のＩＶおよび９Ｂ８のシグナル安定性を示す。 Ａ〜Ｂは、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）およびウミシイタケ属（Renilla）（Ｒｌｕｃ）ルシフェラーゼと比較した、ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖのより高い活性（図３４Ａ）およびより高いシグナル安定性（図３４Ｂ）を示す。 新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、細菌溶解物中の種々のＯｇＬｕｃ変異体のＶｍａｘ（ＲＬＵ／秒）およびＫｍ（μＭ）の値を示す。 新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、細菌溶解物中の種々のＯｇＬｕｃ変異体のＶｍａｘ（ＲＬＵ／秒）およびＫｍ（μＭ）の値を示す。 新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、細菌溶解物中の９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ両方のＶｍａｘ（ＲＬＵ／秒）およびＫｍ（μＭ）の値を示す。 天然セレンテラジンを基質として用いた、細菌溶解物中の種々のＯｇＬｕｃ変異体の５０℃でのタンパク質の安定性を、ｔ＝０での発光として、および分単位の半減期として示す。 Ａ〜Ｂは、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（ｈＲＬ）およびホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）と比較した、２５℃（図３９Ａ）、および３７℃（図３９Ｂ）での種々のＯｇＬｕｃ変異体の細菌溶解物における構造的完全性（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により示されるような、発現、安定性、および溶解性によって決定される）を示す。 Ａ〜Ｂは、新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎの細菌溶解物における６０℃でのタンパク質安定性を、時間に対する発光（ＲＬＵ単位）の自然対数（ｌｎ）（図４０Ａ）、および時間単位の半減期（図４０Ｂ）として示す。 ６０℃におけるＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８およびＬ２７Ｖの活性パーセントを示す。 Ａ〜Ｂは、種々のｐＨ（図４２Ａ）、および種々の塩濃度（図４２Ｂ）におけるＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖのタンパク質安定性を示す。 Ａ〜Ｂは、精製されたＣ１＋Ａ４Ｅ（図４３Ａ）、および９Ｂ８（図４３Ｂ）のゲル濾過クロマトグラフィー分析を示す。 ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖが単量体型で存在することを示すゲル濾過クロマトグラフィー分析を示す。 Ａ〜Ｂは、無希釈の細菌溶解物試料および１：１希釈された細菌溶解物試料における種々のＯｇＬｕｃ変異体−ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（ＨＴ７）融合タンパク質の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されたタンパク質発現レベル（図４５Ａ）、および正規化されたタンパク質発現レベル（図４５Ｂ）を示す。 Ａ〜Ｂは、ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８ｏｐｔ、Ｖ２およびＬ２７Ｖのタンパク質発現（図４６Ａ）、および溶解性（図４６Ｂ）を示す。 天然セレンテラジンおよび新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、ＩＶ、９Ｂ８、およびｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）を発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた正規化された発光をＲＬＵ単位で示す。 それぞれＰＢＩ−３９３９、ルシフェリン（ＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）アッセイ試薬）、および天然セレンテラジンを基質として用いた、ｐＦ４Ａｇ−Ｏｇｌｕｃ−９Ｂ８−ＨＴ７、ｐＦ４Ａｇ−Ｌｕｃ２−ＨＴ７およびｐＦ４Ａｇ−ウミシイタケ属（Renilla）−ＨＴ７を発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた正規化された発光をＲＬＵ単位で示す。 新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、９Ｂ８ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（「Ｋ３３Ｎ」）のいずれかをコードする３０ｎｇまたは１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた発光を示す。 Ａ〜Ｅは、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）と比較した、ＨＥＫ２９３（図５０Ａ）、およびＨｅＬａ細胞（非融合）（図５０Ｂ）における、ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖの発光、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合体の、ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖ（図５０Ｃ）およびホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）（図５０Ｄ）と比較した発光、およびＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ」）およびＨｅＬａ細胞（「ＨｅＬａ」）における、ハロＴａｇ（登録商標）−ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）と比較した、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＯｇＬｕｃ Ｌ２７Ｖのタンパク質発現を示す。 ＯｇＬｕｃ変異体である９Ｂ８およびＬ２７Ｖの、非特異的相互作用に対する感受性を決定するための、それらのＬＯＰＡＣライブラリーに対する阻害分析を示す。 Ａ〜Ｅは、ＯｇＬｕｃ変異体である９Ｂ８およびＬ２７Ｖの、スラミンおよびＴｙｒ ａｇ８３５による阻害分析（図５２Ａ〜Ｃ）、およびスラミン（図５２Ｄ）とＴｙｒ ａｇ８３５（図５２Ｅ）の化学構造を示す。 非特異的なタンパク質相互作用に対する耐性を決定するために、ＯｇＬｕｃ変異体である９Ｂ８およびＬ２７Ｖの活性がＢＳＡ存在下で分析されたことを示す。 プラスチックへの反応性を決定するための、ＯｇＬｕｃ変異体である９Ｂ８およびＬ２７Ｖの活性パーセントを示す。 フォルスコリン処理した（「誘導」）または処理しない（「基底」）、既知のセレンテラジン−ｈを基質として用いた、ｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）と比較した、ＩＶ ｃＡＭＰ転写レポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた発光、およびフォルスコリン処理による誘導倍率（応答）（「倍率」）を示す。 フォルスコリン処理した（「誘導」）または処理しない（「基底」）、ＰＢＩ−３９３９（９Ｂ８および９Ｂ８ｏｐｔに対して）、天然セレンテラジン（ｈＲＬに対して）またはルシフェリン（ＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）アッセイ試薬；Ｌｕｃ２に対して）を基質として用いた、９Ｂ８、９Ｂ８ｏｐｔ、ｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）またはホタルルシフェラーゼ（「Ｌｕｃ２」）ｃＡＭＰ転写レポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた発光を正規化したもの、およびフォルスコリン処理による誘導倍率（応答）（「倍率」）を示す。 フォルスコリン処理した（「誘導」）または処理しない（「基底」）、新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（「Ｋ３３Ｎ」）ｃＡＭＰ転写レポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞の溶解物から生じた発光、並びにフォルスコリン処理による誘導倍率（「誘導倍率」）を示す。 Ａ〜Ｃは、複数の細胞型における複数の経路に関する、ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８およびＬ２７Ｖ溶解レポーターコンストラクトの発光を示す。 Ａ〜Ｃは、種々の細胞株における、そして種々の応答要素を有する、ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖレポーターコンストラクトの発光を示す。 Ａ〜Ｂは、ＣＭＶプロモーター（図６０Ａ）、またはＮＦｋＢ応答要素（図６０Ｂ）を有するＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖ分泌性レポーターの発光を、メトリディア・ロンガ（Metridia longa）ルシフェラーゼと比較して示す。 Ａ〜Ｆは、ＨｅＬａ細胞において発現されるＬ２７Ｖ（Ｌ２７Ｖ００）と比較した、Ｌ２７Ｖ（Ｌ２７Ｖ０１、Ｌ２７Ｖ０２およびＬ２７Ｖ０３）の最適化型の絶対発光（図６１Ａおよび図６１Ｂ）、正規化された発光（図６１Ｃおよび図６１Ｄ）、および応答倍率（図６１Ｅおよび図６１Ｆ）を示す。 Ａ〜Ｂは、種々の用量のｒｈＴＮＦα（「ＴＮＦα」）で処理されたＨｅｐＧ２細胞において発現された、分泌型ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖ０２（ＩＬ−６分泌シグナル含有）レポーターの発光（図６２Ａ）、並びにＬ２７Ｖ０２（「Ｌ２７Ｖ（０２）」）、Ｌ２７Ｖ０２Ｐ（「Ｌ２７Ｖ（０２）Ｐ（０１）」）およびｌｕｃ２（「Ｆｌｕｃ」）レポーターの発光（図６２Ａ）を示す。 新規ＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、分泌シグナル配列を有するかまたは有さないコドン最適化変異体ＩＶｏｐｔを発現するＨＥＫ２９３細胞の培地および溶解試料から生じた発光を、天然セレンテラジンを基質として用いた、分泌シグナル配列有りまたは無しのｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）と比較して示す。 Ａ〜Ｄは、ＣＨＯ細胞（図６４Ａおよび図６４Ｂ）、およびＨｅＬａ（図６４Ｃおよび図６４Ｄ）において発現された、分泌型ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８、Ｖ２およびＬ２７Ｖレポーターの発光を示す。 Ａ〜Ｂは、ＰＢＩ−３９３９を基質として用いた分泌型ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８およびＶ２からの発光と、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｌｏｗ（商標）を基質として用いたメトリディア・ロンガ（Metridia longa）の分泌型ルシフェラーゼの発光との比較を、数値的に（図６５Ａ）、および図表で（図６５Ｂ）示す。 Ａ〜Ｂは、セレンテラジン誘導体ＥＮＤＵＲＥＮ（商標）（図６６Ａ）、およびＶＩＶＩＲＥＮ（商標）（図６６Ｂ）および新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９（図６６Ｂ）を基質として用いた、ｈＲＬ（「Ｒｅｎ」）および９Ｂ８ｏｐｔを発現するＨＥＫ２９３細胞から生じた発光の、バックグラウンドと比較した増加倍率を示す。 Ａ〜Ｄは、Ｌ２７Ｖ−ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合体（図６７Ａ）、またはＩＬ６−Ｌ２７Ｖ融合体（図６７Ｂ〜Ｄ）を一過的に発現しているＵ２ＯＳ細胞の共焦点像を示す。スケールバー＝２０μｍである。 サンドイッチバックグラウンドの存在下（「Ｓａｎｄ」）または非存在下（「ｐＦ４Ａｇ」）における、天然セレンテラジンを基質として用いた、種々のＯｇＬｕｃ変異体およびｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）を発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 天然セレンテラジンを基質として用いた、サンドイッチバックグラウンドの存在を原因とする種々のＯｇＬｕｃ変異体およびｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）の活性における低減倍率を示す。 新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、サンドイッチバックグラウンドの存在を原因とする細菌溶解物中の９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎの活性における低減倍率を示す。 ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖのスペクトル特性を示す。 リンカーを有さない、または５、１０、もしくは２０個のアミノ酸から成るリンカーを有するＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖ、ＣＰ８４およびＣＰ９５の２つの循環置換（ＣＰ）型の発光を示す。 Ａ〜Ｇは、小麦胚芽抽出物（図７３Ａ〜Ｄ）、大腸菌（E. coli）（図７３Ｆ〜Ｇ）およびＨＥＫ２９３細胞（図７３Ｈ）で発現された種々のＣＰ−ＴＥＶプロテアーゼＬ２７Ｖコンストラクトの発光を示す。図７３Ａ〜Ｄは、ＴＥＶ添加前の種々のＣＰ−ＴＥＶプロテアーゼＬ２７Ｖコンストラクトの基底発光を示す。図７３Ｅは、図７３Ａ〜ＤのＣＰ−ＴＥＶプロテアーゼＬ２７Ｖコンストラクトの応答を示す。 種々のタンパク質相補Ｌ２７Ｖ対の応答倍率を示す。 Ａ〜Ｃは、各対の一方のＬ２７Ｖ断片が１／４構成（図７５Ａ）または２／３構成（図７５Ｂ）を用いてＦＫＢＰまたはＦＲＢのいずれかに融合された種々のタンパク質相補（ＰＣＡ）Ｌ２７Ｖ対の発光、並びにＨＥＫ２９３細胞においてモニターされたＦＫＢＰおよびＦＲＢの相互作用を示す。種々のタンパク質相補（ＰＣＡ）陰性対照の発光もモニターされた（図７５Ｃ）。 Ａ〜Ｈは、各対の一方のＬ２７Ｖ断片が２／３構成（図７６Ａおよび図７６Ｃ）または１／４構成（図７６Ｂおよび７６Ｄ）を用いてＦＫＢＰまたはＦＲＢのいずれかに融合された、種々のタンパク質相補（ＰＣＡ）Ｌ２７Ｖ対の発光、並びに小麦胚芽抽出物（図７６Ａおよび図７６Ｂ）およびウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）（図７６Ｃおよび図７６Ｄ）においてモニターされたＦＫＢＰおよびＦＲＢの相互作用を示す。種々のタンパク質相補（ＰＣＡ）陰性対照の発光も、無細胞系で測定された（図７６Ｅ）。１／４構成が、無細胞系（図７６Ｆ）、ＨＥＫ２９３細胞（図７６Ｇ）、および溶解系（図７６Ｈ）で使用された。 Ａ〜Ｃは、ＦＫ５０６およびラパマイシンで処理された種々のタンパク質相補Ｌ２７Ｖ対の発光（図７７Ａ）、並びにＦＫ５０６（図７７Ａ）およびラパマイシン（図７７Ｂ）の化学構造を示す。 フォルスコリン処理による、ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８ｃＡＭＰバイオセンサーの活性を示す。 Ａ〜Ｄは、ウサギ網状赤血球溶解物（図７９Ａ〜Ｂ）およびＨＥＫ２９３細胞（図７９Ｃ〜Ｄ）における、循環置換型（circularly permuted）（図７９Ａおよび図７９Ｃ）および直鎖開裂型（straight split）（図７９Ｂおよび７９Ｄ）Ｌ２７Ｖ変異体の発光を示す。 Ａ〜Ｂは、種々の露光時間での、Ｕ２ＯＳ細胞における、ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖ（図８０Ａ）および対照ベクターｐＧＥＭ３ＺＦ（図８０Ｂ）の細胞内分布を示す。 Ａ〜Ｃは、転写因子Ｎｒｆ２（図８１Ｂ）またはＧＰＣＲ（図８１Ｃ）のいずれかに融合したＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖの細胞内位置を、非融合Ｌ２７Ｖ対照（図８１Ａ）と比較して示す。 Ａ〜Ｃは、ＰＢＩ−４３７７（図８２Ａ）を用いて細胞内シグナル伝達経路をモニターするための、ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８ｏｐｔの使用を示す。９Ｂ８ｏｐｔルシフェラーゼは、ＩｋＢ（図８２Ｂ）またはＯＤＤ（Ｈｉｆ−１αの酸素依存性分解ドメイン）（図８２Ｃ）のいずれかに融合され、刺激（ＩｋＢに対してはＴＮＦα、およびＯＤＤに対してはフェナントロリン）に対する応答倍率が発光を介してモニターされた。 Ａ〜Ｃは、ＯｇＬｕｃ変異体（図８３Ａ）、Ｌ２７Ｖ０２（図８３Ｂ）、またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）（図８３Ｃ）を用いた、酸化的ストレスシグナル経路のモニタリングを示す。 Ａ〜Ｂは、Ｎｒｆ２−Ｌ２７Ｖ０２センサー（図８４Ａ）およびＮｒｆ２（ＡＲＥ）−Ｌｕｃ２Ｐレポーター（図８４Ｂ）の比較を示す。 Ａ〜Ｂは、１μＭ ＴＭＲ（図８５Ａ）または１０μＭ ローダミン１１０（図８５Ｂ）をＨＴ７に対するリガンドとして用い、セレンテラジン−ｈをＩＶに対する基質として用いた、リガンド有りおよび無しでの、ＩＶ−ＨＴ７の発光スペクトルを示す。 前セレンテラジン基質を用いた、カスパーゼ−３と混合された（「＋カスパーゼ」）または混合されていない（「カスパーゼ無し」）、９Ｂ８ｏｐｔを発現する細菌細胞の溶解物から生じた発光を示す。 Ａ〜Ｃは、ラパマイシン処理された（図８７Ｂ）またはされていない（データ示さず）、ＰＢＩ−３９３９を基質として用いた、循環置換された直鎖開裂型Ｌ２７Ｖ変異体のＣＰ８４およびＣＰ１０３から生じた発光、並びにラパマイシン処理による応答（図８７Ｃ）を示す。循環置換された直鎖開裂型変異体の概念は図８７Ａに示される。 種々の量の尿素に暴露した後のＬ２７Ｖ変異体の残存活性パーセントを示す。 Ｌ２７Ｖ変異体の活性に対する３Ｍ尿素の影響を示す。 Ａ〜Ｂは、ＰＢＩ−３９３９基質を用いた、ＯｇＬｕｃ融合体のホルモン誘発性核内受容体（ＮＲ）移行の生物発光画像を示す。 Ａ〜Ｂは、ＰＢＩ−３９３９基質を用いた、ＯｇＬｕｃ融合体のホルボールエステル誘発性プロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）移行の生物発光画像を示す。 Ａ〜Ｂは、ＰＢＩ−３９３９基質を用いた、ＯｇＬｕｃ融合体のオートファゴソームタンパク質移行の生物発光画像を示す。
本発明の実施形態が詳細に説明される前に、発明がその適用において、以下の説明に記載される、または以下の図面に図示される構成要素の構造、合成および配置の詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は特定の実施形態および技術に関して記載されるが、本発明は他の実施形態、および様々な方法での実践または実行が可能である。
本発明の方法の以下の説明では、特に断りがない限り、工程段階は室温（約２２℃）、常圧で実行される。本明細書に記載されるあらゆる数値範囲が、小さい方の数値から大きい方の数値までの全ての数値を含むことも、明確に理解されるものとする。例えば、濃度範囲または有益作用範囲が１％〜５０％と記述されている場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％などの値が、本明細書において明示的に列挙されているものされる。同様に、配列同一性の範囲が、例えば、６０％〜１００％未満のように与えられた場合、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％等の中間値が、本明細書において明示的に列挙されているものとされる。これらは具体的に意図されるものの単なる例であり、最も低い値から最も高い値までの全ての可能な数値が本出願において明示的に述べられたものと見なされる。
別段の明白な定めがない限り、「〜を含む」という用語は、「〜を含む」により導入された列挙の構成要素に加えて、さらなる構成要素が所望により存在してよいことを示すために、本出願の文脈では使用される。しかしながら、「〜を含む」という用語が、さらなる構成要素が存在しないという可能性を包含することは、本発明の特定の実施形態として企図される。すなわち、この実施形態の目的のために、「〜を含む」は「〜から成る」の意味を有するものとして理解されるべきである。
以下の詳細な説明により、本発明の個々の特徴の特定の変形例および／または好ましい変形例が開示される。本発明は、特に好ましい実施形態として、本発明の特徴のうち２つ以上について記載された、特定の変形例および／または好ましい変形例のうちの２つ以上の組み合わせによって生じる実施形態も企図する。
別段の明白な定めがない限り、本出願における相対量の表示の全ては、重量／重量ベースでなされる。総称により特徴付けられる成分の相対量の表示は、前記総称により包含される全ての特定の変形例または構成要素の総量を指すことが意図されている。総称により規定されるある成分がある相対量で存在することが明示され、この成分が該総称により包含される特定の変形例または構成要素であると、さらに特徴付けられた場合、該総称により包含される成分の総相対量が明示された相対量を上回る程に、該総称により包含される他の変種または構成要素は追加で存在しないことが意図されている。前記総称に包含される変形例または構成要素が他に全く存在しないことがより好ましい。
概要
種々の態様において、本発明は、新規化合物、新規ルシフェラーゼ、およびそれらの組み合わせに関する。本発明は、新規化合物、新規ルシフェラーゼ、および／またはそれらの組み合わせを含む、方法、組成物、およびキットを包含する。
新規化合物は、発光を生じるのにセレンテラジンを利用するタンパク質により基質として使用され得る新規セレンテラジンであり、該タンパク質としては、例えば、刺胞動物ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ）、クラゲルシフェラーゼ（例えば、オワンクラゲ（Aequorea jellyfish）から得られるエクオリン）および十脚類ルシフェラーゼ（例えば、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）のルシフェラーゼ複合体）等の種々の海洋生物に見出されるルシフェラーゼおよび発光タンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。種々の実施形態において、本発明の新規セレンテラジンは、天然セレンテラジンと比較して、増強された物理的安定性（例えば、セレンテラジンの増強された安定性）、低減された自己発光、および増加された細胞との生体適合性（例えば、異種細胞型を含む細胞に対するより少ない毒性）のうちの少なくとも１つを有する。
本明細書で開示される新規ルシフェラーゼは、十脚類ルシフェラーゼの活性サブユニットの変異体を含む。新規ルシフェラーゼは、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジン並びに本発明の新規セレンテラジンを含むがこれらに限定されない種々のセレンテラジンを、基質として利用することができる。新規ルシフェラーゼは、増強された発光（増加された輝度、増強されたシグナル安定性および／または延長されたシグナル継続時間を含む）、増強された酵素安定性（すなわち、高温、ｐＨ変化、阻害剤、変性剤、および／または界面活性剤に対する増強された耐性を含む増強された酵素活性）、改変された基質特異性（すなわち、相対的基質特異性における変化）、および増強された生体適合性（細胞中での改善された発現、低減された毒性および／または細胞ストレスのうち少なくとも１つを含む）のうち少なくとも１つを提示する。種々の実施形態において、本発明は、他の分子（例えば、融合タンパク質）に化学的に連結した、または固体表面（例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ管もしくはアッセイプレート）上に付着した、可溶性の活性単量体として、溶液中に存在する新規ルシフェラーゼを包含する。
新規セレンテラジンと新規ルシフェラーゼの特定の組み合わせは、増強された発光を含む、生物発光分析法のための重要な技術的利点を提供し、ここで、増強された発光は、増強されたシグナル安定性および増強されたセレンテラジン安定性を含む一つまたは複数の要因によるものであり得る。さらに、新規セレンテラジンの多くは、市販のセレンテラジンおよび／または既知のセレンテラジンよりもより小さくなるように設計された。いくつかの場合、本発明の新規ルシフェラーゼは、市販および／または既知のより大きなセレンテラジンよりもより小さな新規セレンテラジンを優先的に利用する。
本発明は、新規ルシフェラーゼ変異体と新規セレンテラジン、新規ルシフェラーゼ変異体と既知または天然のセレンテラジン、および新規セレンテラジンとセレンテラジンを基質として用いるあらゆる既知または天然のタンパク質（例えば、ルシフェラーゼまたは発光タンパク質）との組み合わせを包含する。
「セレンテラジン」という用語は、自然発生の（「天然の」）セレンテラジン並びにその類似体を指し、ＷＯ２００３／０４０１００および米国出願第１２／０５６，０７３号（段落［００８６］）に開示されるもの（これらの開示は本明細書に参照によって組み込まれる）に加え、例えば、セレンテラジン−ｎ、セレンテラジン−ｆ、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｃｐ、セレンテラジン−ｃｐ、セレンテラジン−ｃ、セレンテラジン−ｅ、セレンテラジン−ｆｃｐ、ビス−デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン−ｈｈ」）、セレンテラジン−ｉ、セレンテラジン−ｉｃｐ、セレンテラジン−ｖ、および２−メチルセレンテラジンが含まれる。「セレンテラジン」という用語は、本明細書で開示される新規セレンテラジンも指す（以下参照）。「既知のセレンテラジン」という用語は、本発明より以前に知られていたセレンテラジン類似体を指す。
「ＯｇＬｕｃ」という用語は、セレンテラジン存在下で発光を生じる、十脚類ルシフェラーゼタンパク質またはそのようなタンパク質の変異体を指す。ＯｇＬｕｃタンパク質は、その自然発生形態では、単量体であるか、またはタンパク質複合体のサブユニットであり得る。本明細書で開示される例示的な実施形態で使用されるＯｇＬｕｃは、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）のルシフェラーゼ複合体から得られた１９ｋＤａのサブユニットであるが、他の十脚類種（他のオキヒオドシエビ属（Oplophorus）種を含む）から得られた同等のポリペプチドも使用可能であり、本発明に包含され、（R.D. Dennell, Observations on the luminescence of bathypelagic Crustacea decapoda of the Bermuda area, Zool. J. Linn. Soc., Lond. 42 (1955), pp. 393−406を参照；また、Poupin et al. Sept 1999. Inventaire documente des especies et bilan des formes les plus communes de la mer d'Iroise. Rapport Scientifique du Laboratoire d'Oceanographie de l'Ecole Navale (LOEN), Brest (83pgs)も参照、これらはそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる）；例としては、プレシオペナエウス・コルスカンス（Plesiopenaeus coruscans）を含むチヒロエビ科（Aristeidae family）；ヘテロカルプス（Heterocarpus）およびパラパンダルス・リカルディ（Parapandalus richardi）を含むタラバエビ科（Pandalidea family）、ヒュメノペナエウス・デビリス（Hymenopenaeus debilis）およびメソペナエウス・トゥロピカリス（Mesopenaeus tropicalis）を含むクダヒゲエビ科（Solenoceridae family）；ルキフェル・テュプス（Lucifer typus）を含むユメエビ科（Luciferidae family）；セルゲステス・アトゥランティクス（Sergestes atlanticus）、セルゲステス・アルクティクス（Sergestes arcticus）、セルゲステス・アルマトゥス（Sergestes armatus）、セルゲステス・ペディフォルミス（Sergestes pediformis）、セルゲステス・コルヌトゥス（Sergestes cornutus）、セルゲステス・エドゥワルドゥシ（Sergestes edwardsi）、セルゲステス・ヘンセニ（Sergestes henseni）、セルゲステス・ペクティナトゥス（Sergestes pectinatus）、セルゲステス・サルガッシ（Sergestes sargassi）、セルゲステス・シミリス（Sergestes similis）、セルゲステス・ヴィギラクス（Sergestes vigilax）、セルギア・カッレンゲリ（Sergia challengeri）、セルギア・グランディス（Sergia grandis）、セルギア・ルケンス（Sergia lucens）、セルギア・プレヘンシリス（Sergia prehensilis）、セルギア・ポテンス（Sergia potens）、セルギア・ロブスタ（Sergia robusta）、セルギア・スキンティッランス（Sergia scintillans）、およびセルギア・スプレンデンス（Sergia splendens）を含むサクラエビ科（Sergestidae family）；グリュプス・マルスピアリス（Glyphus marsupialis）、レプトケラ・ベルムデンシス（Leptochela bermudensis）、パラパシパエ・スルカティフロンス（Parapasiphae sulcatifrons）、およびパシペア・タルダ（Pasiphea tarda）を含むオキエビ科（Pasiphaeidae family）；アカンテピュラ・アカンティテルソニス（Acanthephyra acanthitelsonis）、アカンテピュラ・アクティフロンス（Acanthephyra acutifrons）、アカンテピュラ・ブレヴィロストゥリス（Acanthephyra brevirostris）、アカンテピュラ・ククッラタ（Acanthephyra cucullata）、アカンテピュラ・クルティロストゥリス（Acanthephyra curtirostris）、アカンテピュラ・エクシミア（Acanthephyra eximia）、アカンテピュラ・グラキリペス（Acanthephyra gracilipes）、アカンテピュラ・キングスレユィ（Acanthephyra kingsleyi）、アカンテピュラ・メディア（Acanthephyra media）、アカンテピュラ・ミクロプタルマ（Acanthephyra microphthalma）、アカンテピュラ・ペラギカ（Acanthephyra pelagica）、アカンテピュラ・プリオノタ（Acanthephyra prionota）、アカンテピュラ・プルプレア（Acanthephyra purpurea）、アカンテピュラ・サングイネア（Acanthephyra sanguinea）、アカンテピュラ・シボガエ（Acanthephyra sibogae）、アカンテピュラ・ステュロロストゥラティス（Acanthephyra stylorostratis）、エピュリナ・ビフィダ（Ephyrina bifida）、エピュリナ・フィグエイライ（Ephyrina figueirai）、エピュリナ・コスキュニイ（Ephyrina koskynii）、エピュリナ・オムバンゴ（Ephyrina ombango）、ヒュメノドラ・グラキアリス（Hymenodora glacialis）、ヒュメノドラ・グラキリス（Hymenodora gracilis）、メニンゴドラ・ミッキュラ（Meningodora miccyla）、メニンゴドラ・モッリス（Meningodora mollis）、メニンゴドラ・ヴェスカ（Meningodora vesca）、ノトストムス・ギッボスス（Notostomus gibbosus）、ノトストムス・アウリクラトゥス（Notostomus auriculatus）、オプロポルス・グラキリロストゥリス（Oplophorus gracilirostris）、オプロポルス・グリマルディイ（Oplophorus grimaldii）、オプロポルス・ノヴァエゼアランディアエ（Oplophorus novaezealandiae）、オプロポルス・スピニカウダ（Oplophorus spinicauda）、オプロポルス・フォリアケウス（Oplophorus foliaceus）、オプロポルス・スピノスス（Oplophorus spinosus）、オプロポルス・テュプス（Oplophorus typus）、シュステッラスピス・ブラウエリ（Systellaspis braueri）、シュステッラスピス・クリスタタ（Systellaspis cristata）、シュステッラスピス・デビリス（Systellaspis debilis）、およびシュステッラスピス・ペッルキダ（Systellaspis pellucida）を含むヒオドシエビ科（Oplophoridae family）；並びにクロロトコイデス・スピニカウダ（Chlorotocoides spinicauda）、タラッソカリス・クリニタ（Thalassocaris crinita）、およびタラッソカリス・ルキダ（Thalassocaris lucida）を含むタラッソカリダエ科（Thalassocaridae family）のルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定はされない。
自然発生形態のトゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）ルシフェラーゼの成熟した（すなわち、シグナル配列を含まない）１９ｋＤａサブユニットのポリペプチド配列（すなわち、ＢＡＢ１３７７６の１６９アミノ酸、残基２８〜１９６）が配列番号１に示される。種々の実施形態において、合成ＯｇＬｕｃ配列（例えば、Ｃ１＋Ａ４Ｅポリペプチド配列、配列番号３に示されるような）の最初にメチオニン残基およびバリン残基が挿入されることにより、異種系におけるクローニングおよび発現が促進される。それにもかかわらず、一貫性を保つために、本明細書で参照される種々のアミノ酸置換の位置番号は、配列番号１、すなわち、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）ルシフェラーゼタンパク質複合体の成熟した（シグナル配列を含まない）天然の１９ｋＤａサブユニットのポリペプチド配列「に対して」特定される。
具体的には、あるタンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号１と整列されたときに、配列同一性が３０％超、好ましくは４０％超、最も好ましくは５０％超であり、且つ、該タンパク質がセレンテラジンを基質として利用して発光を触媒することができ、且つ、配列番号１の８位に対応する位置で開始する該アミノ酸配列が下記：
[GSAIVK]-{FE}-[FYW]-x-[LIVMFSYQ]-x-x-{K}-x-[NHGK]-x-[DE]-x-[LIVMFY]-[LIVMWF]-x-{G}-[LIVMAKRG](配列番号330)(VII)
であり、
前記アミノ酸配列が、５より多い差異を有することがないか、またはより好ましくは４、３、２、もしくは１より多い差異を有することがないか、または最も好ましくは差異を含まず、その差異が表４に記載の式（ＶＩＩ）のパターン位置（pattern position）１、２、３、５、８、１０、１２、１４、１５、１７、または１８に対応する位置で生じる場合、十脚類ルシフェラーゼである。差異には、表４のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。
「変異体」という用語は、開始ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列の改変型を指す。「親の（parental）」という用語は、その後に改変される開始配列を指す相対語である。親配列は通常、得られた改変配列にコードされるタンパク質の参照として、例えば、親配列および改変配列にコードされるタンパク質の活性レベルまたは他の性質を比較するために、使用される。開始配列は自然発生の（すなわち、天然または野生型の）配列であり得る。開始配列は、その後に改変される変異体配列でもあり得る。ポリペプチド配列は、配列の最初、中央、および／または最後で、一つまたは複数のアミノ酸（自然発生であっても合成であってもよい）が置換、欠失、および／または付加された場合に、「改変される」。ポリヌクレオチド配列は、配列の最初、中央、および／または最後で、一つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、および／または付加された場合に、「改変される」が、該配列にコードされるアミノ酸は変更されても変更されなくてもよい。いくつかの実施形態では、改変により、特定のＯｇＬｕｃまたはＯｇＬｕｃ変異体の機能性断片である変異体が生成される。機能性断片は、完全長の親配列と同じ機能活性を有する完全長未満の親配列である断片である。機能活性とは発光を呈する能力である。いくつかの実施形態では、改変により、循環置換された配列並びに欠失および／または挿入を含む置換された配列等の、親配列の置換された配列である変異体が生成される。
本明細書で開示されるＯｇＬｕｃ変異体のいくつかは、考察を容易にするために、略名を割り当てられる。「Ｃ１＋Ａ４Ｅ」（「Ｃ１Ａ４Ｅ」とも称される）という用語は、配列番号１に対しアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ａ５４Ｆ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８Ｉ、およびＮ１６６Ｒを有するある特定のＯｇＬｕｃ変異体（配列番号２および３）を指す（ここで、型式「ｘ＃ｙ」は、変異体アミノ酸「ｙ」に変えられる、「＃」位の親アミノ酸「ｘ」を表す）。本明細書で提供されるＣ１＋Ａ４Ｅ ＯｇＬｕｃ変異体の変異体は、特に明記しない限り、少なくともＣ１＋Ａ４Ｅに存在するアミノ酸置換を含有する。「ＩＶＹ」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｆ５４Ｉ、Ｉ９０Ｖ、およびＦ７７Ｙを有する、Ｃ１＋Ａ４Ｅ ＯｇＬｕｃ変異体の変異体（配列番号８および９）を指す。「ＩＶ」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｆ５４ＩおよびＩ９０Ｖを有する、Ｃ１＋Ａ４Ｅ ＯｇＬｕｃ変異体の別の変異体（配列番号１４および１５）を指す。「ＱＣ２７」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、Ｆ５４Ｉ、Ｌ９２Ｈ、およびＹ１０９Ｆを有する、Ｃ１＋Ａ４Ｅ ＯｇＬｕｃ変異体のさらに別の変異体（配列番号４および５）を指す。「ＱＣ２７−９ａ」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｖ２１Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、Ｍ７５Ｋ、Ｈ９２Ｒ、およびＶ１５８Ｆを有する、ＱＣ２７ ＯｇＬｕｃ変異体の変異体（配列番号６および７）を指す。「９Ｂ８」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを有する、ＩＶ ＯｇＬｕｃ変異体の変異体（配列番号１８および１９）を指す。「９Ｂ８ｏｐｔ」という用語は、９Ｂ８変異体のコドン最適化型（配列番号２４）を指す。「９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｋ３３Ｎを有する、９Ｂ８ｏｐｔ変異体の変異体（配列番号４２および４３）を指す。「９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋１７０Ｇ」という用語は、配列番号１に対し、変異体のＣ末端に付加された追加のグリシン、すなわち、１７０Ｇを有する、「９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ」変異体の変異体（配列番号６８および６９）を指す。「Ｌ２７Ｖ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ」および「Ｌ２７Ｖ」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｌ２７Ｖ、Ｔ３９Ｔ、Ｋ４３Ｒ、およびＹ６８Ｄを有する、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ」変異体の変異体（配列番号８８および８９）を指す。「Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ」および「Ｖ２」という用語は、配列番号１に対し追加のアミノ酸置換Ｔ３９Ｔ、Ｋ４３Ｒ、およびＹ６８Ｄを有する、「９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ」変異体の変異体（配列番号９２および９３）を指す。
一般的に、「増強された」とは、特定の性質（例えば、発光、シグナル安定性、生体適合性、タンパク質安定性（例えば、酵素安定性）、またはタンパク質発現）が、参照ルシフェラーゼ＋セレンテラジンの組み合わせまたは試験中のルシフェラーゼのそれと比較した場合に、増加されたことを意味し、ここで、増加は、参照ルシフェラーゼとセレンテラジンの組み合わせまたは試験中のルシフェラーゼよりも、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％大きい。
「発光」という用語は、適切な条件下、例えば、セレンテラジン等の適切な基質の存在下における、ＯｇＬｕｃ変異体の光出力を指す。光出力は、セレンテラジン基質を追加してすぐに開始され得る発光反応の開始時点での、光出力の瞬間的またはほぼ瞬間的な測定値（「Ｔ＝０」発光または「フラッシュ」と称されることもある）として測定されてもよい。種々の実施形態における発光反応は、溶液中で行われる。他の実施形態では、発光反応は、固体の支持体上で行われる。溶液は、溶解物、例えば原核生物または真核生物の発現系における細胞から得られたものを含有してもよい。他の実施形態では、発現が無細胞系で行われるか、またはルシフェラーゼタンパク質が細胞外培地に分泌され、後者の場合は、溶解物を作製する必要がない。いくつかの実施形態では、発光タンパク質を含有する反応チャンバ（例えば、９６ウェルプレート等のマルチウェルプレートの１ウェル）に、例えばセレンテラジン、緩衝液等の適切な物質を注入することによって、反応が開始される。さらに他の実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンは宿主に導入され、発光が該宿主またはその一部分上で測定され、該一部分には、その生物体もしくは細胞全体、組織、外植片、または抽出物が含まれ得る。反応チャンバは、例えばルミノメーターまたは光電子増倍管を用いて、光出力を測定することができる読み取り装置に配置してもよい。光出力または発光は、例えば同一反応チャンバ中で、数秒間、数分間、数時間等、経時的に測定してもよい。光出力または発光は、経時的に平均測定値として、シグナル減衰の半減期として、一定期間に渡るシグナルの合計として、またはピークの出力として報告してもよい。発光は相対発光量（ＲＬＵ）単位で測定してもよい。
ＯｇＬｕｃ変異体の「増強された発光」は、以下の特徴、すなわち増強された光出力（すなわち輝度）、増強された基質特異性、増強されたシグナル安定性、および／または延長されたシグナル継続時間のうちの一つまたは複数によるものであり得る。増強されたシグナル安定性には、例えば、経時的なシグナル減衰の半減期によって測定されるように、ルシフェラーゼからのシグナルがどれだけ長く発光し続けるかにおいての増加が含まれる。以下の実施例に示されるように、天然基質、既知基質、または新規基質と組み合わされた、野生型ＯｇＬｕｃ、ＯｇＬｕｃ変異体タンパク質、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（例えば、ｈＲｌｕｃ）、またはホタルルシフェラーゼ（例えば、ポティヌス・ピュラリス（Photinus pyralis）由来のＬｕｃ２ルシフェラーゼ）等のルシフェラーゼの比較できる性質と比較して、増強された発光を測定することができる。例えば、特定のセレンテラジン（天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または新規セレンテラジンを含む）と組み合わされた所与のＯｇＬｕｃ変異体の発光は、以下の実施例で開示されるアッセイのうちの一つまたは複数を用いて、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または本明細書で開示される新規セレンテラジンのいずれかと組み合わされたＯｇＬｕｃ変異体Ｃ１＋Ａ４Ｅ、ＩＶ、またはＩＶＹのうちの一つの性質と比較することができる。具体的には、増強された発光は、基質ＰＢＩ−３９３９と共に対象のＯｇＬｕｃ変異体を含有する細菌溶解物のインキュベーションにより生じる発光シグナル（ＲＬＵ）を測定することによって決定することができる。測定は、Ｇｌｏに類似した動態を提供するＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）を含有し得る試薬中で行われ、例えば、その中では、酵素の不活性化が減速され、発光シグナルが安定されるが、このことは、本出願の他の場所に記載される。いくつかの実施形態では、いくつかのルシフェラーゼ変異体、例えば、Ｌ２７Ｖは、特定の化合物、例えば、ＰＢＩ−３９３９と共に、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）非存在下で、延長された発光期間、またはｇｌｏｗに類似した動態を提供する。発光シグナルは、Ｃ１＋Ａ４Ｅ変異体とセレンテラジンまたはセレンテラジン−ｈ、またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと天然セレンテラジン等の基準点のそれと比較することができる。
「酵素安定性」とは、酵素活性の安定性（すなわち、反応条件に対する酵素活性の耐性）を指す。増強された酵素安定性とは、酵素活性の増強された安定性（すなわち、反応条件に対する増強された耐性）を指す。増強された酵素安定性には、増強された熱安定性（例えば、高温での安定性）および化学安定性（例えば、阻害剤、または例えばＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含む界面活性剤等の変性剤の存在下での安定性）が含まれる。酵素安定性は、高温または化学的変性剤の存在等の、特にタンパク質構造に破壊的であると知られている条件下での、タンパク質安定性の尺度として使用することができる。具体的には、増強されたタンパク質安定性は、本出願の他の場所（例えば、実施例２８）に記載されるような熱分析を用いて決定することができる。発光シグナルは、Ｃ１＋Ａ４Ｅ変異体とセレンテラジンもしくはセレンテラジン−ｈ、またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと天然セレンテラジンの基準点と比較することができる。
「生体適合性」とは、ルシフェラーゼおよび／またはセレンテラジン化合物に対する、細胞（例えば、原核生物細胞または真核生物細胞）の耐性を指す。ルシフェラーゼおよび／またはセレンテラジン化合物の生体適合性は、宿主細胞に引き起こすストレスに関連している。例えば、細胞に許容されないルシフェラーゼ（すなわち、細胞にストレスを与えるルシフェラーゼ）は、細胞内で効率的に発現され得ず、例えば、そのようなルシフェラーゼは細胞内で発現可能ではあるが、発現されたタンパク質による封入体形成によって活性の低減を示す。ルシフェラーゼの生体適合性は、外来遺伝子、すなわち、ルシフェラーゼまたはその断片をコードする遺伝子を含有する導入遺伝子の挿入を許容する細胞の能力に関連しており、それにより、該導入遺伝子を有する細胞が、ストレス応答経路の誘導、成長速度減少、および／または生存率減少（例えば、生細胞数減少、膜完全性低減、またはアポトーシスの割合増加）を含むストレスの徴候を示すことはない。細胞ストレスの他の徴候には、遺伝子発現、シグナル経路、および／または調節経路における変化が含まれ得る。ＯｇＬｕｃ変異体の増強された生体適合性は、増強されたタンパク質発現および／または低減された細胞ストレス等の要因によるものであり得る。ＯｇＬｕｃ変異体をコードする特定のポリヌクレオチドの増強された発光発現は、野生型ＯｇＬｕｃ、またはコドン最適化ポリヌクレオチドを含むＯｇＬｕｃ変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発光発現レベルと比較して決定することができ、ここで、発光活性はタンパク質発現レベルをモニターするための手段として使用され得る。
具体的には、ＯｇＬｕｃ変異体、新規セレンテラジン化合物および／またはそれらの組み合わせの増強された生体適合性は、細胞生存率および／または細胞の成長速度を測定することで決定することができる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体の増強された生体適合性は、セレンテラジン化合物の非存在下で、ホタルルシフェラーゼもしくはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼを含有するか、またはルシフェラーゼを含有しない細胞と比較して、ＯｇＬｕｃ変異体を含有する細胞の生存率および／または成長速度を測定して、ルシフェラーゼが細胞に対してどの程度適合性および／または毒性があるかを決定することによって、決定することができる。新規セレンテラジン化合物の増強された生体適合性は、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して、新規セレンテラジン化合物に暴露された細胞のルシフェラーゼ発現がない場合における細胞生存率を測定して、該セレンテラジン化合物が細胞に対してどの程度適合性および／または毒性があるかを決定することによって、決定することができる。ＯｇＬｕｃ変異体と新規セレンテラジン化合物の組み合わせ増強された生体適合性は、ＯｇＬｕｃ変異体を含有し、新規セレンテラジンに暴露された細胞の生存率および／または成長速度を測定することで決定することができ、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼを含有するか、またはルシフェラーゼを含有せず、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンに暴露された細胞と比較することができる。
具体的には、増強された生体適合性は、本出願の他の場所に記載されるような細胞生存率解析（例えば、実施例１８に記載されるようなＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイ、または製造業者の取扱説明書に従ってカスパーゼ−ＧＬＯ（登録商標）の技術を使用するもの等のアポトーシスアッセイを用いて）または当該技術分野において周知の細胞生存率解析を用いて、決定することができる。細胞生存率またはアポトーシスに対するＯｇＬｕｃ変異体の影響は、Ｃ１＋Ａ４Ｅ変異体、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ等の、参照ルシフェラーゼの影響と比較することができる。細胞生存率またはアポトーシスに対する新規セレンテラジン化合物の影響は、細胞生存率またはアポトーシスに対する天然セレンテラジン化合物または既知のセレンテラジン化合物の影響と比較することができる。
増強された生体適合性は、細胞成長または遺伝子発現に対するＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジン化合物の影響を測定することによっても決定することができる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体の増強された生体適合性は、別のルシフェラーゼを含有するか、またはルシフェラーゼを含有しない細胞と比較して、一定期間後の細胞数を測定することにより、またはＯｇＬｕｃ変異体を含有する細胞試料中のストレス応答遺伝子の発現を測定することにより、決定することができる。新規セレンテラジン化合物の増強された生体適合性は、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンに暴露されたか、またはセレンテラジンに暴露されていない細胞と比較して、一定期間後の細胞数を測定することにより、または新規セレンテラジン化合物に暴露された細胞試料中のストレス応答遺伝子の発現を測定することにより、決定することができる。細胞成長または遺伝子発現に対するＯｇＬｕｃ変異体の影響は、Ｃ１＋Ａ４Ｅ変異体、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ等の参照ルシフェラーゼと比較することができる。細胞成長または遺伝子発現に対する新規セレンテラジンの影響は、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較することができる。
細胞質中で、または分泌型として本発明のＯｇＬｕｃ変異体を発現する頑強で安定な細胞株の特定は、輝度が高いルシフェラーゼシグナルおよび小サイズのＯｇＬｕｃ遺伝子によって促進され得る。比較的小さな遺伝子配列は、細胞ゲノムへの外来ＤＮＡの組込みによりもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させることが期待される。本発明のＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンの増加された輝度の結果として、天然のＯｇＬｕｃ、ホタルルシフェラーゼ、またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ等の他の既知のルシフェラーゼと比較して、より少ないタンパク質発現と、それによる形質移入に要するより少ないＤＮＡは、所与の輝度レベルを提供することが可能であり、これは、ＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンの増強された生体適合性に寄与する。ＯｇＬｕｃ変異体の増強された生体適合性は、他のルシフェラーゼ、例えば、天然ＯｇＬｕｃ、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼを形質移入された細胞と同じ発光レベルを有する細胞を作製するための一過性導入に必要な、ＤＮＡまたは試薬、例えば、形質移入化学薬品の量によって測定することができる。いくつかの実施形態では、他のルシフェラーゼにより得られる同レベルの発光を有する形質移入細胞を作製するための、形質移入に必要なＯｇＬｕｃ変異体ＤＮＡまたは試薬の量は、別のルシフェラーゼ、例えば、天然ＯｇＬｕｃ、ホタルルシフェラーゼ、またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼに必要な量未満である。ＯｇＬｕｃ変異体の増強された生体適合性は、形質移入後の細胞の回復時間により測定することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体を形質移入された後の回復に要する時間は、別のルシフェラーゼ、例えば、天然ＯｇＬｕｃ、ホタルルシフェラーゼ、またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼの場合に必要とされる時間未満である。
「相対的基質特異性」は、試験セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光を、参照セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光で除算することによって決定される。例えば、相対的特異性は、ルシフェラーゼと本発明の新規セレンテラジンの発光を、該ルシフェラーゼと異なるセレンテラジン（例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジン（例えば図１参照）、または本発明の異なる新規セレンテラジン）の発光で除算することによって決定することができる。比較される試験セレンテラジン基質および参照セレンテラジン基質は、相対的基質特異性を決定するための比較基質対（comparison substrate pair）であると見なされる。
「相対的基質特異性の変化」は、比較基質対を用いる試験ルシフェラーゼの相対的基質特異性を、同じ比較基質対を用いる参照ルシフェラーゼの相対的基質特異性で除算することによって測定される。例えば、相対的特異性の変化は、本発明の新規セレンテラジンを用いる試験ルシフェラーゼの、異なるセレンテラジン（例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジンまたは本発明の異なる新規セレンテラジン）と比較した場合の相対的基質特異性を、同じ本発明の新規セレンテラジンを用いる参照ルシフェラーゼの、試験ルシフェラーゼに対し使用された同一の異なるセレンテラジンと比較した場合の相対的基質特異性で割ることによって、決定することができる。
いくつかの実施形態では、ある新規セレンテラジンを用いる発光が、異なる新規セレンテラジンを用いる発光と比較される。いくつかの実施形態では、ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光が、別の天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光と比較される。さらに他の実施形態では、ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光が、ある新規セレンテラジンを用いる発光と比較される。
本発明の新規セレンテラジンは、増強された物理的安定性（例えば、増強されたセレンテラジン安定性）または減少した自己発光等の特性を含む。セレンテラジンの物理的安定性とは、セレンテラジンが、ルシフェラーゼによって基質として使用された場合に、発光する能力を維持するような、特定の条件下でどの程度安定であるかを指す。ルシフェラーゼまたは発光タンパク質の活性に依存しない発光は、自己発光と呼ばれる。自己発光は、減衰または分解の間に光の形態で放出されるエネルギーによって発せられる物質の発光である。例えば、自己発光は、発光基質であるセレンテラジンの自然酸化によって生じ得る。
本明細書で使用される場合、「純粋な」または「精製された」とは、目的の種が、存在する主な種であること（すなわち、モル濃度および／または質量基準で、水、溶媒、緩衝液、または組成物における水溶液系の他の通常成分を除いた、いかなる他の個々の種よりもより豊富であること）を意味し、いくつかの実施形態では、精製された画分は、目的の種が、存在する全巨大分子種のうち少なくとも約５０％（モル濃度基準で）を構成する組成物である。一般的に、「実質的に純粋な」組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の約８０％超を構成し、いくつかの実施形態では、約８５％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超を構成する。いくつかの実施形態では、目的の種は、該組成物が単一の巨大分子種から本質的に成る本質的な均一性（混入物種が従来の検出方法で組成物中に検出できない）になるまで精製される。
セレンテラジン誘導体
いくつかの実施形態では、本発明は、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の新規セレンテラジン誘導体を提供し、
式中、Ｒ2は、
またはＣ2-5直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ8は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共にＨまたは共にＣ1-2アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ2、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ2Ｒであり；
Ｘは、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＲ22−であり；
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＯＲ11であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
各Ｒ11は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’または−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’であり；
Ｒ22は、Ｈ、ＣＨ3またはＣＨ2ＣＨ3であり
各Ｒは独立してＣ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
Ｒ’’は、Ｃ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、Ｒ2が
または
であるとき、Ｒ8は、
ではなく；
Ｒ2が、
であるとき、Ｒ8は、
または低級シクロアルキルであり；そして
Ｒ6がＮＨ2であるとき、Ｒ2は、
またはＣ2-5アルキルであり；
または、Ｒ8は
ではない。
「アルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、炭化水素化合物から１個の水素原子を取り除くことによって得られる一価の部分に関し、飽和でも、部分不飽和でも、または完全不飽和であってもよい。アルキル基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。アルキル基は、例えば、ハロで所望により置換されていてもよい。直鎖アルキル基の例としては、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｎ−プロピル、ｎ−ヘキシルおよびｎ−ヘプチルが挙げられるが、これらに限定はされない。一つまたは複数の炭素炭素二重結合を有する不飽和アルキル基の例としては、エテニル（ビニル、−ＣＨ＝ＣＨ2）、２−プロペニル（アリル、−ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ2）、およびブテニルが挙げられるが、これらに限定はされない。一つまたは複数の炭素炭素三重結合を有する不飽和アルキルの例としては、エチニルおよび２−プロピニル（プロパルギル）が挙げられるが、これらに限定はされない。分岐鎖アルキル基の例としては、イソプロピル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルおよびイソ−ペンチルが挙げられる。
「低級シクロアルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、３〜５個の炭素原子を有する炭化水素化合物から１個の水素原子を取り除くことによって得られる一価の部分に関する。飽和低級シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチルおよびシクロペンチル等の基が挙げられるが、これらに限定はされない。一つまたは複数の炭素炭素二重結合を有する不飽和低級シクロアルキル基の例としては、シクロプロペニル、シクロブテニルおよびシクロペンテニル等の基が挙げられるが、これらに限定はされない。
「ハロ」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｃｌ、Ｆ、ＢｒまたはＩ等のハロゲンに関する。
いくつかの実施形態では、Ｒ2は
であり；ＸはＯまたはＳである。他の実施形態では、Ｒ2はＣ2-5直鎖アルキルである。ある実施形態では、Ｒ8は
、低級シクロアルキルまたはＨである。他の実施形態では、Ｒ8はベンジルである。いくつかの実施形態では、Ｒ’’は、−Ｃ（ＣＨ3）3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2Ｃ（ＣＨ3）3、または−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2である。
いくつかの実施形態では、本発明は、式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）：
または
で示される化合物を提供し、
式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ6はＨまたはＯＨであり、Ｒ11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。
いくつかの実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
または
で示される化合物を提供し、
式中、Ｒ12はＣ2-5直鎖アルキル、フリルまたはチエニルであり、Ｒ6はＨまたはＯＨであり、Ｒ11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。
いくつかの実施形態では、本発明は、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）：
または
で示される化合物を提供し、
式中、ＸはＯまたはＳであり、Ｒ6はＨまたはＯＨであり、Ｒ18はＨ、
または低級シクロアルキルであり、Ｒ3、Ｒ4およびＲ11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。
いくつかの実施形態では、本発明は、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）：
または
で示される化合物を提供し、
式中、Ｒ8はベンジルであり、Ｒ11は上記定義の通りであり、破線の結合は任意の環の存在を表す。
いくつかの実施形態では、本発明は、式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）：
または
の新規セレンテラジン誘導体を提供し、
式中、Ｒ2は、
またはＣ2-5直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ8は、
、Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は、共にＨ、または共にＣ1-2アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ2、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ2Ｒであり；
Ｘは、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＯＲ11であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
各Ｒ11は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’または−ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’であり；
各Ｒは、独立して、Ｃ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
Ｒ’’は、Ｃ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は任意の環の存在を表し、これは飽和であっても不飽和であってもよく；
ただし、Ｒ2が
または
であるとき、Ｒ8は、
ではなく；
Ｒ2が、
であるとき、Ｒ8は、
または低級シクロアルキルであり；そして
Ｒ6がＮＨ2であるとき、Ｒ2は、
またはＣ2-5アルキルであり；
または、Ｒ8は
ではない。
本発明によれば、適切な化合物は、
を含む。
異性体、塩および保護形態
ある化合物は、一つまたは複数の特定の幾何学的形態、光学的形態、鏡像異性形態、ジアステレオ異性形態、エピマー形態、立体異性形態、互変異性形態、高次構造形態、またはアノマー形態で存在している場合があり、例えば、シス型およびトランス型；Ｅ型およびＺ型；ｃ型、ｔ型、およびｒ型；エンド型およびエキソ型；Ｒ型、Ｓ型、およびメソ型；Ｄ型およびＬ型；ｄ型およびｌ型；（＋）型および（−）型；ケト型、エノール型、およびエノラート型；シン型およびアンチ型；向斜型および背斜型；α型およびβ型；アキシャル型およびエクアトリアル型；舟型、いす型、ねじれ型、エンベロープ型、および半いす型；並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされず、これ以後は、集合的に「異性体」と称する。
互変異性型に関する下記の記述を除いて、構造異性体（すなわち、単に空間中の原子の配置によってではなく、原子間の連結において異なる異性体）が、本明細書で使用される用語「異性体」から特定的に除外されることに留意されたい。例えば、メトキシ基、−ＯＣＨ3への言及は、その構造異性体であるヒロドキシメチル基、−ＣＨ2ＯＨへの言及と解釈されるべきではない。同様に、オルト−クロロフェニルへの言及は、その構造異性体であるメタ−クロロフェニルへの言及と解釈されるべきではない。しかし、あるクラスの構造体への言及は、そのクラスに含まれる構造異性体を含み得る（例えば、Ｃ1-7アルキルはｎ−プロピルおよびイソ−プロピルを含み；ブチルはｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルを含み；メトキシフェニルはオルト−メトキシフェニル、メタ−メトキシフェニル、およびパラメトキシフェニルを含む）。
一つまたは複数の同位体置換を有する化合物が特別に用語「異性体」に含まれることに留意されたい。例えばＨは、1Ｈ、2Ｈ（Ｄ）、および3Ｈ（Ｔ）を含むいかなる同位体形態で存在してもよく；Ｃは、12Ｃ、13Ｃ、および14Ｃを含むいかなる同位体形態で存在してもよく；Ｏは、16Ｏおよび18Ｏを含むいかなる同位体形態で存在してもよい、等。
特に断りがない限り、特定の化合物への言及には、ラセミ混合物および他のその混合物を（全体的にまたは部分的に）含む、そのような異性体全てが含まれる。そのような異性体を調製する方法（例えば、不斉合成）および分離するための方法（例えば、分別再結晶およびクロマトグラフ法）は、当該技術分野において周知であるか、または既知の様式で、本明細書に示されている方法、または既知の方法を適合させることにより容易に得ることができる。
特に断りがない限り、特定の化合物への言及には、例えば、以下で論じられるような、そのイオン形態、塩形態、溶媒和化合物形態、および保護形態も含まれる。活性化合物の対応する塩、例えば、薬剤的に許容できる塩を調製、精製、および／または操作することが好都合であるかまたは望ましい場合がある。薬剤的に許容できる塩の例は、Berge et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)で述べられている。
例えば、化合物が陰イオンであるか、または陰イオンであり得る官能基（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−であり得る）を有する場合、適切な陽イオンによって塩が形成され得る。適切な無機陽イオンの例としては、Ｎａ+およびＫ+等のアルカリ金属イオン、Ｃａ2+およびＭｇ2+等のアルカリ土類陽イオン、並びにＡｌ3+等の他の陽イオンが挙げられるが、これらに限定はされない。適切な有機陽イオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ4+）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ3Ｒ+、ＮＨ2Ｒ2 +、ＮＨＲ3 +、ＮＲ4 +）が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例としては、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミンから誘導されたもの、並びにリジンおよびアルギニン等のアミノ酸から誘導されたものが挙げられる。一般的な四級アンモニウムイオンの一例はＮ（ＣＨ3）4 +である。
化合物が陽イオンであるか、または陽イオンであり得る官能基（例えば、−ＮＨ2は−ＮＨ3 +であり得る）を有する場合、適切な陰イオンによって塩が形成され得る。適切な無機陰イオンの例としては、以下の無機酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定はされない：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、および亜リン酸。適切な有機陰イオンの例としては、以下の有機酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定はされない：酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、パルミチン酸、乳酸、リンゴ酸、パモ酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、桂皮酸、ピルビン酸、サリチル酸（salicyclic）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸（2-acetyoxybenzoic）、フマル酸、フェニルスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸の、シュウ酸、パントテン酸、イセチオン酸、吉草酸、ラクトビオン酸、およびグルコン酸。適切な高分子陰イオンの例としては、以下の高分子酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定はされない：タンニン酸、カルボキシメチルセルロース。
活性化合物の対応する溶媒和化合物を調製、精製、および／または操作することが好都合であるかまたは望ましい場合がある。「溶媒和化合物」という用語は、溶質（例えば、活性化合物、活性化合物の塩）と溶媒の複合体を表すための従来の意味で、本明細書では使用される。溶媒が水である場合、溶媒和化合物は、水和物、例えば、一水和物、二水和物、三水和物等と都合良く称され得る。
活性化合物を化学的に保護された形態で調製、精製、および／または操作することが好都合であるかまたは望ましい場合がある。「化学的に保護された形態」という用語は、本明細書で使用される場合、一つまたは複数の反応性官能基が望ましくない化学反応から保護されている、すなわち、保護された基または保護基（マスクされた基もしくはマスク基、または遮断された基もしくは遮断基としても知られている）の形態にある化合物に関する。反応性官能基を保護することにより、他の保護されていない反応性官能基が関与する反応を、保護された基に影響を与えずに行うことができ；保護基は、通常は後のステップで、分子の残りに実質的に影響を与えずに除去することができる。例えば、Protective Groups in Organic Synthesis (T. Green and P. Wuts, Wiley, 1999)を参照されたい。
例えば、ヒドロキシ基は、エーテル（−ＯＲ）またはエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ）として保護されてもよく、例えば、ｔ−ブチルエーテル；ベンジル、ベンズヒドリル（ジフェニルメチル）、もしくはトリチル（トリフェニルメチル）エーテル；トリメチルシリルもしくはｔ−ブチルジメチルシリルエーテル；またはアセチルエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、−ＯＡｃ）として保護されてもよい。例えば、アルデヒドまたはケトン基は、それぞれアセタールまたはケタールとして保護されてもよく、そこでカルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）は、例えば第一級アルコールを用いる反応によって、ジエーテル（＞Ｃ（ＯＲ）2）に変換される。アルデヒドまたはケトン基は、酸の存在下で大過剰の水を用いる加水分解によって、容易に再生される。例えばアミン基は、例えばアミドまたはウレタンとして保護されてもよく、例えば、メチルアミド（−ＮＨＣＯ−ＣＨ3）；ベンジルオキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ2Ｃ6Ｈ5、−ＮＨＣｂｚ）として；ｔ−ブトキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ3）3、−ＮＨ−Ｂｏｃ）；２−ビフェニル−２−プロポキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ4Ｃ6Ｈ5、−ＮＨ−Ｂｐｏｃ）として、９−フルオレニルメトキシアミド（−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）として、６−ニトロベラチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｎｖｏｃ）として、２−トリメチルシリルエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｅｏｃ）として、２，２，２−トリクロロエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｒｏｃ）として、アリルオキシアミド（−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ）として、２（−フェニルスルホニル）エチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｐｓｅｃ）として；または、好適な場合、Ｎ−オキシドとして保護されてもよい。
例えばカルボン酸基は、エステルとして保護されてもよく、例えば、Ｃ1-7アルキルエステル（例えば、メチルエステル；ｔ−ブチルエステル）；Ｃ1-7ハロアルキルエステル（例えば、Ｃ1-7トリハロアルキルエステル）；トリＣ1-7アルキルシリル−Ｃ1-7アルキルエステル；もしくはＣ5-20アリール−Ｃ1-7アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル；ニトロベンジルエステル）として；またはアミド、例えば、メチルアミドとして保護されてもよい。
例えばチオール基は、チオエーテル（−ＳＲ）として保護されてもよく、例えば、ベンジルチオエーテル；アセトアミドメチルエーテル（−Ｓ−ＣＨ2ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ3）として保護されてもよい。
セレンテラジン誘導体の合成
本発明によるセレンテラジン誘導体は、実施例１〜１６に詳細に記載された方法に従って合成することができる。
オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼ変異体
本発明の実施形態では、本明細書に記載される種々の技術が、改良された合成ＯｇＬｕｃポリペプチドを生成するために、アミノ酸置換部位を特定するのに使用された。追加の技術が、ポリペプチドの発現を増強させるために、種々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化するのに使用された。一つまたは複数のアミノ酸置換を、単独でまたは組み合わせて行うことにより、増強された発光（例えば、増強された輝度、増強されたシグナル安定性、増強された酵素安定性、および／または相対的基質特異性の変化）を有する合成ＯｇＬｕｃ型ポリペプチドが生成されることが発見された。さらに、種々の合成ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに一つまたは複数のコドン最適化置換を含むことにより、種々の真核生物および原核生物の発現系において、増強されたポリペプチド発現がもたらされた。本発明の一実施形態は、原核細胞および／または真核細胞で発現された場合に、単量体型で可溶性であり且つ活性を有する合成ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、いかなる目的タンパク質または目的分子にもカップリングさせることができる。いくつかの実施形態では、該変異体は融合タンパク質であり、例えばいくつかの変異体は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに結合されるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ポリペプチドにカップリングされる。特に断りのない限り、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合体である変異体には、名称の部分として「ＨＴ７」が含まれる（例えば、「ＩＶＹ−ＨＴ７」）。いくつかの実施形態では、シグナル配列（例えば、自然発生のトゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）シグナル配列）が融合タンパク質のＮ末端に結合されて、細胞からの該融合タンパク質の分泌が促進される。哺乳類細胞または他の細胞型におけるタンパク質分泌を促進するための、ＯｇＬｕｃルシフェラーゼの自然発生のシグナル配列以外のシグナル配列は、当該技術分野において周知である。ＯｇＬｕｃ変異体を細胞膜の外表面上に位置させるため、または提示するために、膜アンカー配列と組み合わせたシグナル配列を使用してもよい。ＯｇＬｕｃ変異体を膜または細胞内の他の部位に位置させるために、当該技術分野において周知の他の方法を使用してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、対応する親変異体十脚類ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する改変された十脚類ルシフェラーゼを提供する。例えば、親変異体ＯｇＬｕｃは、Ｃ１＋Ａ４Ｅ、ＩＶＹ、ＩＶ、ＱＣ２７、ＱＣ２７−９ａ、９Ｂ８、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋１７０Ｇ、Ｖ２または「Ｌ２７Ｖ」である。別の実施形態では、本発明は、新規セレンテラジンを利用する改変された十脚類ルシフェラーゼを提供する。一実施形態では、改変された十脚類ルシフェラーゼは、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジンまたは新規セレンテラジンに対する相対的特異性に変化がある。一実施形態では、改変された十脚類ルシフェラーゼは、対応する親変異体十脚類ルシフェラーゼと比較して、相対的特異性に変化がある。
いくつかの実施形態では、対応する親の、変異十脚類ルシフェラーゼは、十脚目に含まれる科の様々な種を含む十脚類種であり、例としては、プレシオペナエウス・コルスカンス（Plesiopenaeus coruscans）を含むチヒロエビ科（Aristeidae family）；ヘテロカルプス（Heterocarpus）およびパラパンダルス・リカルディ（Parapandalus richardi）を含むタラバエビ科（Pandalidea family）、ヒュメノペナエウス・デビリス（Hymenopenaeus debilis）およびメソペナエウス・トゥロピカリス（Mesopenaeus tropicalis）を含むクダヒゲエビ科（Solenoceridae family）；ルキフェル・テュプス（Lucifer typus）を含むユメエビ科（Luciferidae family）；セルゲステス・アトゥランティクス（Sergestes atlanticus）、セルゲステス・アルクティクス（Sergestes arcticus）、セルゲステス・アルマトゥス（Sergestes armatus）、セルゲステス・ペディフォルミス（Sergestes pediformis）、セルゲステス・コルヌトゥス（Sergestes cornutus）、セルゲステス・エドゥワルドゥシ（Sergestes edwardsi）、セルゲステス・ヘンセニ（Sergestes henseni）、セルゲステス・ペクティナトゥス（Sergestes pectinatus）、セルゲステス・サルガッシ（Sergestes sargassi）、セルゲステス・シミリス（Sergestes similis）、セルゲステス・ヴィギラクス（Sergestes vigilax）、セルギア・カッレンゲリ（Sergia challengeri）、セルギア・グランディス（Sergia grandis）、セルギア・ルケンス（Sergia lucens）、セルギア・プレヘンシリス（Sergia prehensilis）、セルギア・ポテンス（Sergia potens）、セルギア・ロブスタ（Sergia robusta）、セルギア・スキンティッランス（Sergia scintillans）、およびセルギア・スプレンデンス（Sergia splendens）を含むサクラエビ科（Sergestidae family）；グリュプス・マルスピアリス（Glyphus marsupialis）、レプトケラ・ベルムデンシス（Leptochela bermudensis）、パラパシパエ・スルカティフロンス（Parapasiphae sulcatifrons）、およびパシペア・タルダ（Pasiphea tarda）を含むオキエビ科（Pasiphaeidae family）；アカンテピュラ・アカンティテルソニス（Acanthephyra acanthitelsonis）、アカンテピュラ・アクティフロンス（Acanthephyra acutifrons）、アカンテピュラ・ブレヴィロストゥリス（Acanthephyra brevirostris）、アカンテピュラ・ククッラタ（Acanthephyra cucullata）、アカンテピュラ・クルティロストゥリス（Acanthephyra curtirostris）、アカンテピュラ・エクシミア（Acanthephyra eximia）、アカンテピュラ・グラキリペス（Acanthephyra gracilipes）、アカンテピュラ・キングスレユィ（Acanthephyra kingsleyi）、アカンテピュラ・メディア（Acanthephyra media）、アカンテピュラ・ミクロプタルマ（Acanthephyra microphthalma）、アカンテピュラ・ペラギカ（Acanthephyra pelagica）、アカンテピュラ・プリオノタ（Acanthephyra prionota）、アカンテピュラ・プルプレア（Acanthephyra purpurea）、アカンテピュラ・サングイネア（Acanthephyra sanguinea）、アカンテピュラ・シボガエ（Acanthephyra sibogae）、アカンテピュラ・ステュロロストゥラティス（Acanthephyra stylorostratis）、エピュリナ・ビフィダ（Ephyrina bifida）、エピュリナ・フィグエイライ（Ephyrina figueirai）、エピュリナ・コスキュニイ（Ephyrina koskynii）、エピュリナ・オムバンゴ（Ephyrina ombango）、ヒュメノドラ・グラキアリス（Hymenodora glacialis）、ヒュメノドラ・グラキリス（Hymenodora gracilis）、メニンゴドラ・ミッキュラ（Meningodora miccyla）、メニンゴドラ・モッリス（Meningodora mollis）、メニンゴドラ・ヴェスカ（Meningodora vesca）、ノトストムス・ギッボスス（Notostomus gibbosus）、ノトストムス・アウリクラトゥス（Notostomus auriculatus）、オプロポルス・グラキリロストゥリス（Oplophorus gracilirostris）、オプロポルス・グリマルディイ（Oplophorus grimaldii）、オプロポルス・ノヴァエゼアランディアエ（Oplophorus novaezealandiae）、オプロポルス・スピニカウダ（Oplophorus spinicauda）、オプロポルス・フォリアケウス（Oplophorus foliaceus）、オプロポルス・スピノスス（Oplophorus spinosus）、オプロポルス・テュプス（Oplophorus typus）、シュステッラスピス・ブラウエリ（Systellaspis braueri）、シュステッラスピス・クリスタタ（Systellaspis cristata）、シュステッラスピス・デビリス（Systellaspis debilis）、およびシュステッラスピス・ペッルキダ（Systellaspis pellucida）を含むヒオドシエビ科（Oplophoridae family）；並びにクロロトコイデス・スピニカウダ（Chlorotocoides spinicauda）、タラッソカリス・クリニタ（Thalassocaris crinita）、およびタラッソカリス・ルキダ（Thalassocaris lucida）を含むタラッソカリダエ科（Thalassocaridae family）のルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定はされない。ある実施形態では、改変されたルシフェラーゼは、対応する野生型ルシフェラーゼと比較して、原核細胞および／または真核細胞において、増加された発光（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも２倍、または少なくとも４倍）を有する。いくつかの実施形態では、改変された十脚類ルシフェラーゼの一つまたは複数の特性は、別の種から得られたルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼの比較できる特性と比較される。
いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２７、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５６、５８、６０、６２、６４、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、または９５に対して有する。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体またはその機能性断片は、多くて５つまでの差異を有し、またはより好ましくは多くて４、３、２、もしくは１つまでの差異を有し、または最も好ましくは差異を含まず、その差異は表４に記載の式（ＶＩＩ）のパターン位置１、２、３、５、８、１０、１２、１４、１５、１７、または１８に対応する位置に生じる。差異には、表４のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方に一つまたは複数の異種アミノ酸配列を有し（エピトープまたは融合タグを有するもの等の融合ポリペプチド）、これが、任意で直接的または間接的に目的分子と相互作用する。いくつかの実施形態では、異種配列の存在は、目的分子との相互作用の前または後に、ＯｇＬｕｃ変異体の発光を実質的に変化させない。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、目的分子との相互作用の間または後に立体構造変化を起こすものであり、この立体構造変化は次いでＯｇＬｕｃ変異体の活性を変化させる。例えば、そのようなアミノ酸配列を有するＯｇＬｕｃ変異体は、アロステリック相互作用を検出するのに有用である。ＯｇＬｕｃ変異体またはＯｇＬｕｃ変異体またはその断片との融合体は、受容体として使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のＯｇＬｕｃ変異体の断片が異種アミノ酸配列に融合され、それにより該融合体はβバレル構造を形成し、その融合タンパク質は、自然発生セレンテラジンまたは本明細書で論じられる種々の既知のセレンテラジンを含むその類似体、もしくは本発明の新規セレンテラジンから発光を起こすことが可能である
本発明のＯｇＬｕｃ変異体またはその融合体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドまたは該ＯｇＬｕｃ変異体もしくはその融合体を有する単離された宿主細胞、および本発明のポリヌクレオチド、ＯｇＬｕｃ変異体もしくはその融合体、または宿主細胞の使用方法も提供される。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関しての、「同一性」という用語は、任意の数の配列比較アルゴリズムを用いて、または手動の整列および目視検査により測定して、比較ウィンドウまたは指定領域上で最大の一致が得られるよう比較および整列された場合に、同一である２つ以上の配列または部分列、もしくは同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを指定された割合で有する２つ以上の配列または部分列を指す。比較のために配列を整列させる方法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、Smith et al., (J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981))のアルゴリズム、Needleman and Wunsch, (J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970))の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448 (1988))の類似性検索方法、アルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ（William R. Pearson http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_intro.shtmlによるバージニア大学のＦＡＳＴＡサーバーで利用可能）、一連のＣｌｕｓｔａｌプログラム（Chenna et al., Nucl. Acids Res. 31(13):3497-3500 (2003)；http://www.ebi.ac.ukまたはhttp://www.ch.embnet.orgで例を入手可能）、または他の配列解析ソフトウェアのコンピューターによる実行によって、実施することができる。有意な配列変異（例えば、ドメイン順序の改変、ドメインの欠損／付加、ドメインの繰り返し、ドメインのシャッフル、循環置換）を有するポリペプチド配列間で最大一致を有する整列をつくることは、ＡＢＡ法（Raphael et al., Genome Res. 14(11):2336-2346 (2004)）、他の適切な方法、または該ポリペプチド配列の２つの連結された同一コピーを用いた整列の実行等の、特殊化した方法の使用を必要とする場合があることは当該技術分野において周知である。
「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質前駆体の産生に必要なコード配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸を指す。コードされたポリペプチドは、完全長のポリペプチド、その断片（完全長未満）、または融合ポリペプチドをもたらす、完全長のポリペプチドもしくはその断片のいずれかと別のポリペプチドとの融合体であってよい。
タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの形態で存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、オリゴヌクレオチドは一本鎖（例えば、センス鎖）または二本鎖であり得る。エンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナル等の適切な調節領域は、適切な転写開始および／または一次ＲＮＡ転写物の正確なプロセシングを可能とするのに必要である場合、遺伝子のコード配列のすぐそばに位置され得る。他の制御または調節エレメントとしては、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルおよびエンハンサーエレメントが挙げられるが、これらに限定はされない。
「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、さまざまな長さのアミノ酸鎖を意味する。本発明の核酸分子は、誘導が最初になされる親タンパク質のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性であるアミノ酸配列を有する、人工の（すなわち、合成の）変異体タンパク質の変異体またはそのポリペプチド断片をコードし、ここで該親タンパク質はその後さらに改変される自然発生の（天然または野生型）配列または変異体配列であり得る。「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、一つまたは複数の異種配列（例えば、非ＯｇＬｕｃポリペプチド）に対しＮ末端および／またはＣ末端で連結された参照タンパク質（例えば、ＯｇＬｕｃ変異体）を含有するキメラタンパク質を指す。異種配列としては、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質（プロメガ社）、ＦｌＡｓＨ（フルオレセインヒ素らせん結合剤）、およびＲｅＡｓＨ（赤色ヒ素らせん結合剤）（例えば、ＬＵＭＩＯ（商標）タグ認識配列（インビトロジェン社））、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ラクタマーゼ（Ｐ−ｇａｌ）、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）、ＧＵＳ、ガラクトピラノシド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（例えば、ポティヌス・ピィラリス（Photinus pyralis）またはポトゥリス・ペンンシュルヴァニカ（Photuris pennsylvanica））、またはコメツキムシルシフェラーゼ（例えば、ピィロポルス・プラギオフタラムス（Pyrophorus plagiophthalamus）またはピィレアリヌス・テルミティルミナンス（Pyrearinus termitilluminans））またはツチボタルルシフェラーゼ（例えば、フリクソトゥリクス・ヒルトゥス（Phrixothrix hirtus））、キシロシダーゼ、チミジンキナーゼ、アラビノシダーゼおよびＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグおよびＭＣＰタグ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs））等のレポータータンパク質が含まれ得るが、これらに限定はされない。一実施形態では、キメラタンパク質は、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質（プロメガ社）にＮ末端で連結されたＯｇＬｕｃ変異体を含有する。別の実施形態では、キメラタンパク質は、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質にＣ末端で連結されたＯｇＬｕｃ変異体含有する。
核酸は様々なタイプの「変異」を含有することが知られており、変異とは、特定の塩基位置にあるヌクレオチドの配列における、野生型の配列と比較した場合の改変を指す。変異は、核酸配列を参照配列、例えば野生型配列と異ならせる一つまたは複数の塩基の挿入もしくは欠失、または終止コドンでの置換を指す場合もある。「置換」とは、配列中の特定位置にあるアミノ酸における変化、例えば、４位でのＡからＥへの変化を指す。
「ベクター」という用語は、その中にＤＮＡの断片を挿入またはクローニングし得、ＤＮＡセグメントを細胞に導入するのに用いることができ、細胞中で複製可能である、核酸分子を指す。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド等に由来し得る。
「野生型」または「天然」という用語は、本明細書で使用される場合、自然発生源から単離されたその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集合の中で最も頻繁に観察されるもの、それ故に該遺伝子の「野生型」形態と任意に名付けられるもの、である。対照的に、「変異体」という用語は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較された場合に、配列および／または機能特性における改変（すなわち、改変された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の変異体を単離することが可能であることに注意する；これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較された場合に、それらが変更された特徴を有するという事実によって特定される。
例示的なポリヌクレオチドおよびタンパク質
本発明は、野生型ＯｇＬｕｃと比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＯｇＬｕｃ変異体またはそのタンパク質断片、例えば、欠失、例えば１〜約５個残基の欠失、およびそのキメラ（融合体）（米国特許出願第２００９／０２５３１３１号およびＷＩＰＯ出願第ＷＯ２００７／１２０５２２号、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を有するものを含み、該置換によって、増強された安定性、増強された発光、例えば、増加された発光、発光動態のより大きな安定性、および／または変更された発光色を有するＯｇＬｕｃ変異体がもたらされる。ＯｇＬｕｃ変異体の配列は、対応する野生型ＯｇＬｕｃのアミノ酸配列と実質的に同一である。実質的に同一な配列を有するポリペプチドまたはペプチドとは、アミノ酸配列が完全にではないが大部分において、同一であり、それが関連する配列の機能活性を保持していることを意味する。通常、２つのアミノ酸配列は、それらが少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、ただし１００％未満のアミノ酸配列同一性である場合に、実質的に同一である。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は組換えポリヌクレオチドにコードされる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体、またはその機能性断片は、多くて５つまでの差異を有し、またはより好ましくは多くて４、３、２、もしくは１つまでの差異を有し、または最も好ましくは差異を含まず、それらの差異は、表４に記載の式（ＶＩＩ）のパターン位置１、２、３、５、８、１０、１２、１４、１５、１７、または１８に対応する位置に生じる。差異には、表４のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。
本発明のＯｇＬｕｃ変異タンパク質または融合タンパク質は、組換え法または固相化学的ペプチド合成法によって作製することができる。そのような方法は当該技術分野において周知である。
使用法およびキット
本発明の化合物およびタンパク質は、ルシフェラーゼおよびルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジンが使用されている、いかなる方法においても使用することができる。例えば、それらは、試料中の一つもしくは複数の分子、例えば酵素、酵素反応のための補助因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤、もしくはＯＨラジカルを検出するために、または一つもしくは複数の条件、例えば酸化還元条件を検出するためにセレンテラジンの類似体を使用する生物学的発光法（bioluminogenic method）において、使用することができる。試料としては、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物等）、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または細胞の精製画分（例えば、細胞成分分画）が含まれ得る。かかる分子の存在、量、スペクトル分布、発光動態、または比活性を検出または定量することができる。その分子は、多相溶液（multiphasic solution）（例えば、乳剤または懸濁剤）を含む溶液中においてでも、固体支持体（例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ容器（assay vessel））上ででも、検出または定量することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、目的酵素、例えば、ＣＹＰ４５０酵素、ＭＡＯ Ａ酵素またはＭＡＯ Ｂ酵素、カスパーゼ等を検出するために、発光に基づくアッセイで使用することができる。新規セレンテラジンは、エクオリン、オベリン、またはｉＰｈｏｔｉｎａ等の発光タンパク質と一緒に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、別の分子（例えば、フルオロフォア、発色団、またはナノ粒子）に対するエネルギー供与体として使用することができる。
本発明は、転写レポーターをコードするポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体またはその断片は、転写制御配列、例えば、一つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはそれらの組み合わせに機能的に連結することで、発現カセットを形成することができる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、最小プロモーターおよびｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）に機能的に連結することができる。
本発明のタンパク質はバイオセンサーとして使用されてもよく、例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、別の分子（例えば、一つまたは複数の目的分子）の存在下で、または特定の条件下で、一つまたは複数の変化した活性を有する。目的分子と相互作用すると、または特定の条件に曝されると、バイオセンサーは立体構造変化を起こすか、または化学的に変化し、これによって、酵素活性または発光、例えば、比活性、スペクトル分布、または発光動態の変化が引き起こされる。例えば、本発明のＯｇＬｕｃ変異体、例えば循環置換変異体は、目的分子に対する相互作用ドメインを含むことができる。あるいは、例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、エネルギー受容体、例えば蛍光タンパク質にカップリングすることができ、酵素からエネルギー受容体へのエネルギー移動の効率を変化させる相互作用ドメインを含むことができる。例えば、バイオセンサーは、プロテアーゼ、キナーゼ、リガンド、抗体等の結合タンパク質、ｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰ等の環状ヌクレオチド、またはカルシウム等の金属を検出するために、適切なセンサー領域をＯｇＬｕｃ変異体配列に挿入することによって作製することができる。一つまたは複数のセンサー領域を、Ｃ末端、Ｎ末端、および／またはポリペプチド配列中の一つまたは複数の適切な位置に挿入することができ、そこで、センサー領域は一つまたは複数のアミノ酸を含む。循環置換されたＯｇＬｕｃ変異体の場合、センサー領域は、親ＯｇＬｕｃ変異体のＮ末端とＣ末端の間に挿入することができる。さらに、挿入されたセンサー領域の１つまたは全ては、センサーをＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドの残りにカップリングさせるためのリンカーアミノ酸を含むことができる。ルシフェラーゼバイオセンサーの例は、米国特許出願公開第２００５／０１５３３１０号および第２００９／０３０５２８０号およびＰＣＴ国際公開第２００７／１２０５２２Ａ２号に記載されており、これらは各々、参照によって本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、本明細書で開示されるＯｇＬｕｃ変異体は、エネルギー受容体にエネルギーを転移するのに、例えば生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）解析において、使用することができる。例えば、ＢＲＥＴ解析で使用されるＯｇＬｕｃ変異体は、２つの分子が互いに結合可能であるかどうか、または細胞中で共存するかどうかを決定するのに使用することができる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、目的の分子またはタンパク質と組み合わされて、第一の融合タンパク質を生成する生物発光供与分子として使用することができる。種々の実施形態において、第一融合タンパク質はＯｇＬｕｃ変異体および目的タンパク質を含有する。種々の実施形態において、ＯｇＬｕｃ変異体を含有する第一融合タンパク質は、細胞溶解物、無傷細胞、および生きている動物を含むがこれらに限定はされない系の中で、タンパク質／タンパク質相互作用を検出するのに、ＢＲＥＴ解析において使用することができる。種々の実施形態において、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を、蛍光受容体分子として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）は、第２の目的タンパク質に、またはＯｇＬｕｃ変異体に、融合することができる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）に融合することができ、細胞または動物中で発現させることができ、そしてＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンド等の蛍光ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドで標識することができる。続いて、融合体が励起されて、細胞浸透性ＯｇＬｕｃ基質存在下で蛍光が発せられ得る。いくつかの実施形態では、ＢＲＥＴは、少数の非限定例を命名するのに、蛍光タンパク質、例えば、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）と、または蛍光ラベル、例えば、フルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、またはアレクサ４８８と組み合わせて、ＯｇＬｕｃ変異体を用いて行うことができる。
種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンは、２つの生体分子、例えばポリペプチドの相互作用を検出するのに、タンパク質相補試験（ＰＣＡ）において使用することができる。例えば、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、分離に耐性がある部位で、２つの断片に分離することができ、分離されたＯｇＬｕｃ変異体の各断片は、相互作用すると考えられている目的のポリペプチドの対、例えば、ＦＫＢＰおよびＦＲＢの対のうちの一つに融合することができる。目的の２つのポリペプチドが実際に相互作用する場合、ＯｇＬｕｃ断片は互いにすぐ近くまで接近し、機能的な、活性ＯｇＬｕｃ変異体を再構成する。いくつかの実施形態では、再構成されたＯｇＬｕｃ変異体の活性は、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジンまたは本発明の新規セレンテラジンを用いて検出および測定することができる。いくつかの実施形態では、分割されたＯｇＬｕｃ変異体は、ｌａｃ−Ｚ（Langley et al., PNAS 72:1254-1257 (1975)）またはリボヌクレアーゼＳ（Levit and Berger, J. Biol. Chem. 251:1333 −1339 (1976)）に類似したより一般的な相補系（complementation system）で使用することができる。いくつかの実施形態では、別のＯｇＬｕｃ変異体断片（「Ｂ」）と補完し合うことが知られているＯｇＬｕｃ変異体断片（「Ａ」と称する）を標的タンパク質に融合することができ、得られた融合体は、断片Ｂを含有する細胞または細胞溶解物における発光を介してモニターすることができる。いくつかの実施形態では、断片Ｂの供給源は同一の細胞であるか（例えば、断片Ｂの遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれる場合、または細胞内の別のプラスミドに含有される場合）、または別の細胞から得られた溶解物もしくは精製タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、この同一の融合タンパク質（断片Ａ）は、断片Ｂと、固体支持体への付着が可能なＨａｌｏＴａｇ（登録商標）等のポリペプチドとの融合を用いて、捕捉および固定化することができる。いくつかの実施形態では、発光は、捕捉の成功を示すのに、または捕捉された物質の量を定量するのに使用することができる。
種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンは、セレンテラジンを定量するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、セレンテラジン（例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジン、または本発明の新規セレンテラジン）は、特定の生化学的活性、例えば、アポトーシスおよび薬物代謝のプローブとして使用することができる。いくつかの実施形態では、セレンテラジン濃度は、目的の特定酵素によって作用され得る「前セレンテラジン」または「前基質」によって、特定の酵素活性に対して、連結される。いくつかの実施形態では、前セレンテラジンは、ルシフェラーゼと混合されたときに発光を直接補助することができない分子であるが、目的の特定酵素による酵素的プロセシングを通じて、セレンテラジンに変換することができる。いくつかの実施形態では、このアプローチは、薬物代謝に用いられるもの（例えば、シトクロムＰ４５０酵素、モノアミンオキシダーゼ、およびグルタチオンＳ転移酵素）等の酵素；並びにアポトーシスに用いられるもの（例えば、カスパーゼ）等の酵素に対して使用することができる。例えば、セレンテラジン（例えば、天然セレンテラジンもしくは既知のセレンテラジン、または本発明の新規セレンテラジン）は、６’−Ｏ−メチル等の切断可能な基を含有するように改変することができる。いくつかの実施形態では、特定のシトクロムＰ４５０酵素と一緒にインキュベートされた場合、前記６’Ｏ−メチルは切断されて、前セレンテラジンは、本発明のＯｇＬｕｃ変異体で検出可能なセレンテラジンに変換される。いくつかの実施形態では、前セレンテラジンは、発光を補助するのに必要な他の成分、例えば、本発明のＯｇＬｕｃ変異体等の発光タンパク質と混合されて、単一試薬および均一なアッセイを提供することができる。例えば、前記試薬が試料に加えられると、前セレンテラジンがセレンテラジンに変換される際に、発光が生じる。種々の実施形態において、前セレンテラジンからセレンテラジンの生成に結び付けられ得る他の酵素、小分子、または他の細胞プロセスに関して、同様のアッセイを開発することができる。
種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンは、遺伝子転写レポーター系として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、異なる波長の光を発するルシフェラーゼ、例えば、赤色コメツキムシルシフェラーゼ（ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）；プロメガ社）と多重化することができる。例えば、本発明のＯｇＬｕｃ変異体が機能的なレポーターとして使用される場合、赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼは、遺伝的調節に対する非特異的な効果に対して対照をとるために、または形質移入の効率を正規化するために、使用することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体から生じる発光（およそ４６０ｎｍ）および赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）（およそ６１０ｎｍ）は、波長識別フィルタとともにルミノメーターを用いて、容易に分離することができ、同じ試料から得られる両方のシグナルの測定を可能にする。別の例では、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、転写レポーターとして使用することができ、アッセイ試薬に含有される異なる波長の光を発するルシフェラーゼと対合させることができる。例えば、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、転写レポーターとして使用することができ、エクオリンもしくはｃＡＭＰ循環置換ホタルルシフェラーゼバイオセンサーのいずれかと、または同時に両方と対合させることで、１つの試料の中で複数の経路を検出することができる。そのような系では、例えば、エクオリンはカルシウムの検出および／または測定に、バイオセンサーはｃＡＭＰの検出および／または測定に、そしてＯｇＬｕｃ変異体は下流の遺伝子発現のモニタリングに、使用することができる。別の例では、ＯｇＬｕｃ変異体は、一つまたは複数の追加のルシフェラーゼと一緒に使用することができ、そこで、各ルシフェラーゼの発光は選択的酵素阻害剤の使用によって別々に測定することができる。例えば、第一のルシフェラーゼの発光は、適切な基質および緩衝液の追加の際に測定することができ、第二のルシフェラーゼの測定は、その後の適切な基質および緩衝液並びに第一のルシフェラーゼに対して選択的な一つまたは複数の阻害剤の追加の際に行うことができる。別の例では、アッセイ試薬に含有されるルシフェラーゼは、細胞生理の特定の側面、例えば、細胞生存率を評価するためのＡＴＰ、または細胞アポトーシスを評価するためのカスパーゼ活性を測定するのに使用することができる。
種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、形質移入困難な細胞株において、あるいは、おそらく非分裂初代細胞、例えば、幹細胞またはＨｅｐＧ２細胞においてでさえ、レポーターとして使用することができる。それらの高いシグナル強度のために、本発明のＯｇＬｕｃ変異体により、形質移入効率が低い場合でも、検出可能な発光が可能となる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、形質移入に関わる条件に特に感受性がある、例えば、ＤＮＡ濃度上昇または形質移入試薬の追加に対して感受性がある細胞において、レポーターとして使用することができる。従って、種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体の増強された発光によって、より低いＤＮＡ濃度、より少ない形質移入試薬、および／またはアッセイ開始前のより短い形質移入後の時間での適切なレベルの発光が達成可能であり、その結果、感受性の細胞に負担となる毒性が減少する。種々の実施形態において、ＯｇＬｕｃ変異体の増強された発光は、シグナルがさらに後の時点で検出されることも可能にする。さらに他の実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、単一コピーの天然プロモーターのためのレポーターとして使用することができる。
種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、標的タンパク質の細胞内レベルをモニターする手段として、目的の標的タンパク質用の融合タグとして使用することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、細胞内のストレス応答経路（例えば、ＤＮＡ損傷、酸化的ストレス、炎症）に関わる特定のタンパク質をモニターするのに、様々なタイプの刺激がそれらの経路で果たす役割を探求する手段として、使用することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、標的タンパク質の細胞輸送をモニターする手段としても、使用することができる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、ウイルスゲノム（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）に融合させることもでき、それによって、有望な抗ウイルス剤での処理後に、力価レベル、すなわち感染価を、細胞中でモニターすることができる。いくつかの実施形態では、前記変異体は、高発現クローンを特定するための蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）のために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（標的タンパク質に加えて）に融合させることもできる。
種々の実施形態において、細胞質内で、または分泌型として、本発明のＯｇＬｕｃ変異体を発現する頑強で安定な細胞株の特定は、ＯｇＬｕｃ変異体の増強されたシグナルおよびＯｇＬｕｃ遺伝子の小さなサイズによって、促進され得る。比較的小さな遺伝子配列は、外来ＤＮＡの細胞ゲノムへの組込みによりもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させることとなる。
種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、様々な異なるイムノアッセイの概念の中に組み込むことができる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、一次または二次抗体に融合させることにより、特定の分析物の検出方法を提供することができる。別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体は、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇに融合させることが可能であり、その融合体は、特定の分析物に結合した特定の抗体を検出するのに使用することができる。別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体は、ストレプトアビジンに融合させることが可能であり、特定の分析物に結合した特定のビオチン化抗体を検出するのに使用することができる。さらに別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体の補完的な断片は、一次および二次抗体に融合させることが可能であり、そこで、該一次抗体は特定の分析物を認識し、該二次抗体は一次抗体を認識する。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体の活性は、分析物の存在下で再構成されるであろう。さらに別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体は、分析物（例えば、プロスタグランジン）と複合体化させることが可能であり、競合的サンドイッチＥＬＩＳＡ形式にて使用することができる。分析物と複合体化されたＯｇＬｕｃ変異体は、分析物と結合することができる抗体を検出するのにも使用することができ、そこで、その結合活性は、該ＯｇＬｕｃ変異体が該抗体に選択的に連結するのを可能にする。抗原標的に対する患者の抗体価を定量的に測定するためにウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼを使用している例は、ルシフェラーゼ免疫沈降系である（Burbelo et al., Expert Review of Vaccines 9(6):567-578 (2010))。
種々の実施形態において、本発明のＯｇＬｕｃ変異体および新規基質は、生細胞における発光検出に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＯｇＬｕｃ変異体は、（レポーターまたは別のものとして）細胞内で発現させることができ、細胞は、セレンテラジン、例えばＰＢＩ−３９３９等の新規セレンテラジンで処理され、セレンテラジンは、培養液中の細胞に浸透し、ＯｇＬｕｃ変異体と反応し、発光する。細胞浸透性であるだけでなく、ＰＢＩ−３９３９は、細胞生存率の点から、天然セレンテラジンに匹敵する生体適合性を示す。いくつかの実施形態では、培地中の天然セレンテラジンの安定性を増加させることが知られている化学修飾を含有するあるバージョンのＰＢＩ−３９３９が合成可能であり、より頑強な生細胞中でのＯｇＬｕｃ変異体ベースのレポーターアッセイに使用することができる。さらに他の実施形態では、本発明のＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンを含有する試料（細胞、組織、動物等を含む）は、種々の顕微鏡検査技術および画像処理技術を用いて分析可能である。さらに他の実施形態では、分泌可能なＯｇＬｕｃ変異体が、生細胞レポーター系の一部として細胞中で発現される。
種々の実施形態において、本明細書で開示されるＯｇＬｕｃ変異体および／または新規セレンテラジンは、キットの一部として提供可能である。前記キットは、使用者が本明細書で開示されるようなアッセイを実行するのを可能にするための、適切な試薬および説明書と共に、本明細書に記載されるような一つもしくは複数のＯｇＬｕｃ変異体（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または両方の形態）および／またはセレンテラジンを含み得る。セレンテラジンは、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または本明細書で開示される新規セレンテラジンのうちのいずれかであり得る。キットは、本明細書で開示されるような一つまたは複数の緩衝液も含み得る。
改変されたルシフェラーゼまたはその融合体をコードするベクターおよび宿主細胞
発光活性を有するもの、もしくは別の分子に補完されて発光活性がもたらされ得るもの、または発光活性を有するその融合体等の、ＯｇＬｕｃ変異体またはその断片をコードする望ましい核酸分子が調製されると、ＯｇＬｕｃ変異体もしくはその断片、例えば、補完のためのもの、または発光活性を有するその融合体をコードする発現カセットが調製され得る。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、転写制御配列、例えば、一つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはそれらの組み合わせに所望により機能的に連結されて、発現カセットを形成することができる。核酸分子または発現カセットは、選択マーカー遺伝子を所望により含むベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターに導入され得、該ベクターは、目的細胞、例えば、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス種（Streptomyces spp.）、炭疽菌種（Bacillus spp.）、ブドウ球菌種（Staphylococcus spp.）等の原核細胞、並びに植物（双子葉類または単子葉類）、真菌（酵母、例えば、ピキア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）またはシゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）を含む酵母）、もしくは哺乳類細胞を含む真核細胞、それらの溶解物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物に導入され得る。哺乳類細胞としては、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞、およびヒト細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。哺乳類細胞株としては、限定なしで、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＶ−１、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が挙げられるが、多数の他の細胞株も使用可能である。
コードされたＯｇＬｕｃ変異体の発現は、合成プロモーターを含む原核細胞または真核細胞中で発現可能ないかなるプロモーターによっても制御することができる。原核細胞プロモーターとしては、プロモーター活性を有するいかなる断片をも含む、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃまたはマルトースプロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。真核細胞プロモーターとしては、プロモーター活性を有するいかなる断片をも含む、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびＲＳＶプロモーター等のウイルスプロモーター、並びに調節プロモーター、例えば、プロモーター、ｈｓｐ７０プロモーターおよびＣＲＥにより調節される合成プロモーター等の誘導プロモーターまたは抑制プロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。コードされたＯｇＬｕｃ変異体の発現は、ＲＮＡプロセシングの調節または翻訳の調節等の転写後過程によって、例えばＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡによって、またはＲＮＡもしくはタンパク質の分解によって、制御することもできる。本発明の核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターは、カルシウム媒介性の形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション等が挙げられるがこれらに限定はされない任意の方法によって、細胞に導入することができる。
ＯｇＬｕｃ変異体をコードする、最適化された配列、並びにベクターおよび宿主細胞
本発明のＯｇＬｕｃ変異体、その機能性断片またはその融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）も提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１つの選択された宿主中での発現に最適化された核酸配列を含む。最適化された配列は、コドン最適化された配列、すなわち、別の生物、例えば遠縁生物と比較した場合に、ある生物でより頻繁に使用されるコドン、並びにコザック配列および／もしくはイントロンを付加もしくは改変するための改変、並びに／または望ましくない配列、例えば、潜在的転写因子結合部位を取り除くための改変、を含む。そのような最適化された配列は、宿主細胞に導入された場合に、増強された発現、例えば、増加されたタンパク質発現レベルを提供することができる。最適化された配列の例は、米国特許第７，７２８，１１８号および米国特許出願公開第２００８／００７０２９９号、第２００８／００９０２９１号、および第２００６／００６８３９５号に開示されており、そのそれぞれが参照によって本発明に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは本発明のＯｇＬｕｃ変異体をコードする核酸配列を含み、この核酸配列は哺乳類宿主細胞での発現に最適化される。いくつかの実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドは、対応する最適化されていない配列にハイブリダイズしなくなり、例えば、中ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件下で、最適化されていない配列にハイブリダイズしない。「ストリンジェントな（stringency）」という用語は、温度、イオン強度、および他の化合物の存在の条件に関して使用され、その条件下で核酸ハイブリダイゼーションが行われる。「高ストリンジェントな（high stringency）」条件では、核酸塩基対合は、高頻度に相補的な塩基配列を有する核酸断片の間だけで起こる従って、「中」ストリンジェントまたは「低」ストリンジェントな条件は、互いに完全には相補的でない核酸がハイブリダイズまたはアニーリングされることが所望される場合に、しばしば使用される。当該技術分野では、中ストリンジェントまたは低ストリンジェントな条件を構成するために、多数の等価条件が使用可能であることがよく知られている。
いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、対応する最適化されていない配列に対し９０％未満、例えば８０％未満の核酸配列同一性を有し、任意で、最適化されていない配列にコードされるポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。単離された核酸分子、例えば、最適化された核酸配列を含む、コンストラクト、例えば発現カセットおよびベクター、並びに単離された核酸分子、コンストラクトまたはベクターを含むキットも提供される。
本発明のＯｇＬｕｃ変異体、その断片またはその融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、任意で、特定の宿主細胞内での発現に最適化され、また任意で、転写制御配列、例えば、一つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはそれらの組み合わせに機能的に連結されて、発現カセットを形成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＯｇＬｕｃ変異体、その断片またはその融合体をコードする核酸配列は、コドン、例えば親ＯｇＬｕｃ配列中のコドンのうち少なくとも２５％を、特定の（選択された）細胞において選択的に使用されるコドンと置換することによって最適化される。好ましいコドンは、選択された細胞において比較的高いコドン利用頻度を有しており、それらの導入によって、選択された宿主細胞に存在する転写因子への転写因子結合部位、および他の望ましくない構造特性の導入が、比較的少ないことが好ましい。望ましくない構造特性の例としては、制限酵素部位、真核性配列エレメント、脊椎動物プロモーターモジュールおよび転写因子結合部位、応答要素、大腸菌（E. coli）配列エレメント、ｍＲＮＡ二次構造が挙げられるが、これらに限定はされない。従って、最適化された核酸産物は、コドン利用頻度の改善、および望ましくない転写制御配列の数の減少による、不適切な転写挙動のリスクの低減の結果として、向上した発現レベルを有し得る。
単離され、最適化された核酸分子は、コドンの３０％超、３５％超、４０％超または４５％超、例えば、５０％超、５５％超、６０％あるいはそれ以上において、対応する野生型核酸配列のコドンとは異なるコドン組成を有し得る。本発明用の例示的なコドンは、特定の生物における同一のアミノ酸に対して、少なくとも１つの他のコドンよりもより頻繁に使用されるコドンであり、いくつかの実施形態では、その生物において使用率が低いコドンでもなく、該核酸分子の発現のためのクローニングまたはスクリーニングに使用される生物において使用率が低いコドンではない。さらに、特定のアミノ酸に対するコドン（すなわち、３つ以上のコドンを有するようなアミノ酸）は、その他の（好ましくない）コドンよりもより頻繁に使用される２つ以上のコドンを含み得る。他の生物においてよりもある生物においてより頻繁に使用されるコドンが核酸分子中に存在することによって、それらのコドンをより頻繁に使用する生物の細胞に導入する際に、それらの細胞中での野生型または親の核酸配列の発現より大きなレベルで、それらの細胞において発現される核酸分子がもたらされる。
本発明のいくつかの実施形態では、異なるコドンは哺乳動物でより頻繁に使用されるものであり、一方、さらに他の実施形態では、異なるコドンは植物でより頻繁に使用されるものである。様々な生物に対し好ましいコドンは、当該技術分野で知られており、例えば、http://www.kazusa.or.jp./codon/を参照のこと。特定の種類の哺乳動物、例えばヒトは、別の種類の哺乳動物とは異なる、一連の好ましいコドンを有し得る。同様に、特定の種類の植物は、別の種類の植物とは異なる、一連の好ましいコドンを有し得る。本発明の一実施形態では、異なっているコドンの大半は、所望の宿主細胞において好ましいコドンであるものである。哺乳動物（例えば、ヒト）および植物を含む生物にとって好ましいコドンは、当該技術分野で知られている（例えば、Wada et al., Nucl. Acids Res., 18:2367 (1990); Murray et al., Nucl. Acids Res., 17:477 (1989)）。
参考例１． α−アミノニトリル（化合物１）の合成：
フラスコを亜硫酸水素ナトリウム（７１．４ｍｍｏｌ）および１７ｍＬの水で満たした。これに、１４ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のアルデヒド（６９．３ｍｍｏｌ）の溶液を、内部温度を６０℃未満に保つ速度で滴加した。得られた懸濁液を周囲温度で４０分間撹拌し、水酸化アンモニウム溶液（４．８５ｍＬ）を２分間かけて加えた。得られた溶液を、磁気的に撹拌しながら、６０℃で１時間油浴で加熱し、その後周囲温度で一晩放置した。溶液を、内部温度が５℃未満に測定されるまで、氷／塩水槽中で冷却した。これに、１４ｍＬの水中のシアン化ナトリウム（７１．４ｍｍｏｌ）の溶液を、３０分間かけて滴加した。得られた混合物を、およそ１０℃で２０分間、３０℃で２時間、そして周囲温度で１８時間、撹拌した。反応混合物を、各２００ｍＬのジエチルエーテルに３回抽出し、合わせた抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物を濾過し、溶液を氷浴中で２０分間冷却した。撹拌した溶液に、沈殿が止むまで塩化水素ガスを加えて、懸濁液を１時間撹拌した。固体を濾過分離し、各５０ｍＬのジエチルエーテルで３回すすいだ。物質を真空下で乾燥させて、６．４ｇ（４７．５ｍｍｏｌ）の白色固体を得た（６９％）。手順は、以下から改変したものである：Freifelder and Hasbrouck, "Synthesis of Primary 1,2-Diamines by Hydrogenation of alpha-Aminonitriles," Journal of the American Chemical Society, 82(3):696-698 (1960)。
参考例２． ２−オキソ−２−フェニルアセトアルデヒドオキシム（化合物２）の合成：
フラスコをカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５８ｍｍｏｌ）および６３ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルアルコールで満たした。溶液になるまで混合物を撹拌し、３５ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルアルコール中の適切なベンゾフェノン（５０ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間かけて滴加した。反応混合物を１時間撹拌し、無希釈の亜硝酸イソアミル（７５ｍｍｏｌ）を５分間かけて加えた。反応混合物を完了したかどうかモニターし、その後１００ｍＬのヘプタンで希釈した。得られた固体（３８ｍｍｏｌ）を吸引濾過で収集し、真空下で一定重量になるまで乾燥させた。手順は、以下から改変したものである：Hagedorn et al., Chem. Ber., 98:193 (1965)。
参考例３． ピラジン誘導体（化合物３）の合成
三つ口フラスコに温度計、隔壁、およびアルゴン導管（argon line）を取り付けた。これに、アミノニトリル（４７．５ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１９０ｍＬ）、およびオキシム（６１．７５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間十分に撹拌し、テトラ−クロロ（ビス−ピリジル）チタン複合体（９４．９ｍｍｏｌ）を、内部温度が４０℃未満を維持していることを確認しながら、３５分間かけて、５回に分けて加えた。添加完了後、反応混合物を一晩周囲温度で撹拌した。反応混合物を、少しずつ、炭酸水素ナトリウム（１７４ｍＬの水中で２１．７５ｇ）の溶液にゆっくりと加えた。得られた混合物を１５分間十分に撹拌し、８０ｇのセライトを加えた。懸濁液を３０分間撹拌し、ブフナー漏斗を通して濾過した。濾液を取って分液漏斗にかけ、濾滓を４００ｍＬのメタノールに懸濁させた。混合物を３０分間撹拌し、再度濾過した。この工程を合計で４回繰り返した。メタノール性の濾液を合わせて濃縮し、残渣を２００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）に溶解させた。溶液を最初の濾液を含む分液漏斗に加え、混合物をさらに各１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた抽出物を、各１００ｍＬの飽和炭酸ナトリウムで２回、各１００ｍＬのブライン溶液で２回洗浄した。有機溶媒を蒸発させ、未精製のピアジンオキシド（pyazine-oxide）を褐色の油状物質として得た。物質を３ｍＬのメタノールに溶解させ、８９ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えた。この溶液に、亜鉛末（８０．７ｍｍｏｌ）を加え、１５℃の内部温度に達するまで、混合物を氷浴中で冷却した。混合物を氷酢酸（３ｍＬ）で処理し、油浴中で４０分間、３０℃の内部温度まで温めた。反応混合物を室温まで冷却し、セライトのパッドを通して濾過した。濾滓をＤＣＭですすぎ、合わせた濾液を飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄した。粗生成物をヘプタン／ＥｔＯＡｃ勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。これにより２．９ｇ（２９％）のピラジンが褐色固体として得られた。手順は、以下から改変したものである：Kishi et al., "The structure confirmation of the light-emitting moiety of bioluminescent jellyfish." Tetrahedron Lett., 13(27):2747 (1972)。
参考例４． セレンテラジンの合成
方法Ａ：（以下の化合物が方法Ａで合成できる：化合物ＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３８８６、ＰＢＩ−３８５７、ＰＢＩ−３８８７、ＰＢＩ−３９１３、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３８９６、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８４１およびＰＢＩ−３８４２）
フラスコをピラジン（８．２５ｍｍｏｌ）、ピルビン酸（１４．０ｍｍｏｌ）、カンファースルホン酸（０．８ｍｍｏｌ）、および無水２−メチルＴＨＦ（１５０ｍＬ）で満たした。フラスコに冷却器、および４オングストロームのモレキュラーシーブで満たしたソックスレー抽出器を取り付け、反応混合物を油浴中１１０℃で１８時間加熱した。篩を新品と取り換えて、還流を２４時間続けた。反応混合物を濾過および濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解させた。この溶液を、各２５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で３回、１００ｍＬの０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５、および１００ｍＬのブライン溶液で洗浄した。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、２．３ｇ（６．２ｍｍｏｌ、７５％）の未精製エナミン／酸を得た。この物質を無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解させ、その溶液を氷／水浴中で１０分間冷却した。これに、カルボジイミド（９．０ｍｍｏｌ）および無希釈ジイソプロピルエチルアミン（１４．９ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後に冷浴を取り除き、反応混合物を周囲温度で３時間撹拌した。反応混合物に、５０ｍＬの０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５を加え、混合物を１０分間十分に撹拌した。二相混合物を各１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出し、合わせた抽出物をブライン溶液で洗浄した。有機溶液を濃縮し、残渣をＤＣＭ／メタノール勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。これにより、３３６ｍｇ（０．９４ｍｍｏｌ、１６％）のデヒドロセレンテラジンが赤色固体として得られた。この物質を１０ｍＬのメタノールに懸濁し、混合物を氷浴中で冷却した。これに、水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を１時間かけて３回に分けて加えた。反応混合物をさらに３０分間撹拌し、ｐＨ５になるまで無希釈の氷酢酸を滴加した。溶液を濃縮し、残渣を１５ｍＬの水で粉砕した。固体を吸引濾過で単離し、真空下で数時間乾燥させて、３１８ｍｇ（９４％）の未精製セレンテラジンを黄色固体として得た。手順は、以下から改変したものである：Kakoi and Inoue, Chem. Lett. 11(3):299-300 (1980)。
方法Ｂ：（以下の化合物を方法Ｂによって合成することができる：化合物ＰＢＩ−３８８２、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３８８１）
フラスコをグリオキサール（２．２ｍｍｏｌ）、アミノピラジン（１．１ｍｍｏｌ）、エタノール（２０ｍＬ）、１２Ｎ ＨＣｌ（０．６ｍＬ）、および水（１ｍＬ）で満たした。反応混合物を２４時間加熱還流し、濃縮した。残渣をＤＣＭ／メタノール勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。これにより、１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ、２３％）のセレンテラジン生成物が暗色固体として得られた。手順は、以下から改変したものである：Inoue et al. "Squid bioluminescence. II. Isolation from Watasenia scintillans and synthesis of 2-(p-hydroxybenzyl)-6-(p-hydroxyphenyl)-3,7- dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one." Chem. Lett., 4(2):141-4 (1975)。
方法Ｃ：新規セレンテラジンの合成（以下の化合物を方法Ｃによって合成することができる：ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−４００２）
化合物４−（５−アミノ−６−ベンジルピラジン−２−イル）フェノールは、以前に記載されている方法に従って調製することができる（Kishi et al., Tetrahedron Lett., 13:2747 (1972); Mosrin et al., Organic Letters, 11:3406 (2009); Kakoi, Chem. Pharm. Bull., 50:301 (2002)）。
２−アミノ−３−ベンジル−５−フェニルピラジンの合成。丸底フラスコを５ｇ（３３．５ｍｍｏｌ）の２−イソニトロソアセトフェノン、６．７ｇ（３６．８ｍｍｏｌ）の２−アミノ−３−フェニルプロパンニトリル塩酸塩および１００ｍＬの無水ピリジンで満たした。混合物を−２０℃に冷却し、４．６ｍＬ（４０．０ｍｍｏｌ）のＴｉＣｌ4を滴加した。反応物を−２０℃で３０分間維持し、２．５時間かけて８０℃に加熱した。溶媒を蒸発させ、残渣を１ＬのＤＣＭに溶解させた。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ3およびブラインで洗浄した。全ての揮発性物質を蒸発させ、残渣をエタノール（４００ｍＬ）に再溶解させた。ラネーＮｉ（２．０ｇ、水性懸濁液）を加え、反応を１気圧の水素下で５日間撹拌させた。混合物をセライトに通し、揮発性物質を除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン／ＤＣＭ）にかけ、２．５ｇ（２９％）の２−アミノ−３−ベンジル−５−フェニルピラジンを得た。
２-アミノ-３-フェニルプロパンニトリル塩酸塩の合成。丸底フラスコを６５ｇ（０．６２４ｍｏｌ）の亜硫酸水素ナトリウムおよび１５０ｍＬの水で満たした。ＴＨＦ１５０ｍＬ中の７５ｇ（０．６２４ｍｏｌ）のフェニルアセトアルデヒドの溶液を滴加した。２０分間撹拌した後、３７ｍＬの１４Ｍ 水酸化アンモニウムを一度に加え、混合物を６０分間かけて６０℃に加熱した。０℃に冷却した後、混合物を１５０ｍＬの水で希釈し、内部温度を１０℃未満に保ちつつ水１００ｍＬ中のシアン化ナトリウム（２７．５ｇ、０．５６０ｍｏｌ）の溶液を滴加した。添加したらすぐに、混合物を２時間かけて３０℃に加熱し、エーテルで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、全ての揮発性物質を蒸発させ、残渣を３．５Ｌのエーテルに溶解させ、４００ｍＬの３．３Ｍのエタノール性ＨＣｌで処理した。得られた沈殿物を濾過し、真空乾燥させて、５５ｇ（６０％）の生成物を得た。
３−（フラン−２−イル）−２−オキソプロパン酸の合成。１００ｍＬフラスコに、３−（フラン−２−イル）−２−オキソプロパノエート（９４０ｍｇ）を２３ｍＬの冷６Ｎ ＮａＯＨとともに加えた。不溶性混合物を溶解するまで９０℃の浴中で５分間撹拌した。溶液が酸性になるまで冷１Ｎ ＨＣｌを加えた（およそ１２０ｍＬ）。溶液を２×５０ｍＬ ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を４０ｍＬブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶液を蒸発させて、５４０ｍｇの褐色固体を得た。固体を、９７％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液からアセトニトリル（ＡＣＮ）への勾配を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でさらに精製した。
エチル３−（フラン−２−イル）−２−オキソプロパノエートの合成。異性体（Ｅ／Ｚ）−エチル２−ホルムアミド−３−（フラン−２−イル）アクリレート（５．０ｇ）の混合物を含む５００ｍＬのフラスコに、５０／５０エタノール／水中の１．４Ｍ（５％）ＨＣｌの冷却溶液２２０ｍＬを加えた。５時間後、反応物を２００ｍＬのＥｔＯＡｃと３０ｍＬのブラインに分配した。水層を２×５０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を１×５０ｍＬの水、および１×５０ｍＬのブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。有機層を２６ｇのセライトにより共蒸発させ、ヘプタンからＥｔＯＡｃへの勾配を用いて８０ｇのシリカ金（silica gold）上で溶出させた。適切な、合わせた画分を蒸発させて、２．１ｇを得た。
（Ｅ／Ｚ）−エチル２−ホルムアミド−３−（フラン−２−イル）アクリレートの合成。５００ｍＬのフラスコに、５０ｍＬのジエチルエーテル、Ｃｕ2Ｏ（３２０ｍｇ）、およびフリルアルデヒド（５．２ｍＬ）を加えた。そのフラスコ（The flasked）を氷浴中で冷却し、エチル２−イソシアノ酢酸（５．３ｍＬ）を加えた。１．５時間後、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５ｇ）を反応物に加えた。４時間後、その不均一な反応物を濾過した。６０ｍＬの３０％クエン酸および２０ｍＬのＥｔＯＡｃを加え、１０分間撹拌した。水層を５０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ＥｔＯＡｃ層を２４ｇのセライトにより共蒸発させ、ヘプタンからＥｔＯＡｃへの勾配を用いる８０ｇシリカ金上で溶出した。黄色シロップ状物質はさらなる精製なしで使用された。
２-オキソ-３-（チオフェン-２-イル）プロパン酸の合成。２５０ｍＬのフラスコに、（Ｅ／Ｚ）−５−（チオフェン−２−イルメチレン）イミダゾリジン−２，４−ジオン（５．０ｇ）および１００ｍＬの冷却６Ｎ ＮａＯＨを加えた。混合物を１時間かけて１００℃に加熱した。濃縮したＨＣｌを酸性（ｐＨ＝１）になるまで前記冷却溶液に加えた。混合物を８×５０ｍＬのジエチルエーテルで抽出した。合わせたエーテル層を５０ｍＬのブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて、３．３６ｇの固体を得た。試料をα，α，α−トリフルオロトルエンでの再結晶化でさらに精製して、１．６３ｇを得た。
（Ｅ／Ｚ）−５−（チオフェン−２−イルメチレン）イミダゾリジン−２，４−ジオンの合成。２５０ｍＬのフラスコに、ヒダントイン（９．８ｇ）およびチオフェン−２−カルバルデヒド（１０ｇ）を加えた。混合物に、ピペリジン（９．６ｍＬ）を滴加した。混合物を１時間かけて１００℃に加熱し、その後３００ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、真空中で乾燥させて、４．９ｇの固体を得た。
ステップ１． マイクロ波バイアル（１０ｍＬ）に、適切なフェニルピラジン−２−アミン（１００ｍｇ）、適切なピルビン酸（２等量）、ＤＣＭ（１ｍＬ）、および１，１，１−トリフルオロエタノール（１ｍＬ）を、８０℃で３０分間、撹拌しつつ加熱した。反応物を２グラムのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを２４ｇの球状シリカゲルに添加し、ヘプタンから酢酸エチルへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて蒸発させた。
ステップ２． ＴＨＦ（０．５ｍＬ）に溶解された、ステップ１で単離した物質を、氷浴中で冷却した。無水酢酸（２５μＬ）、ジメチルアミノピリジン（８．５ｍｇ）、およびトリエチルアミン（２５μＬ）を加えた。２時間後、ＴＨＦの大部分を真空中で除去した。生成物を３０％クエン酸（２ｍＬ）の水溶液で沈殿させた。固体を水（２ｍＬ）で洗浄し、その後３ｍＬのＤＣＭに溶解させた。ＤＣＭを、１×２ｍＬの水で、続いて１×２ｍＬのブラインで洗浄した。ＤＣＭ層を２グラムのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを１２ｇの球状シリカゲルに添加し、ヘプタンからＤＣＭへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて、蒸発させた。
ステップ３． ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解させた、ステップ２で得られた物質を氷浴中で冷却した。溶液に、メタノール（０．５ｍＬ）およびジエチレングリコールジメチルエーテル中の水素化ホウ素ナトリウム溶液（３２５μＬの０．５Ｍ）を加えた。２時間後、酢酸（１０μＬ）を加え、溶液を３０％クエン酸水溶液（１ｍＬ）およびＤＣＭ（２ｍＬ）にすばやく分配した。ＤＣＭ層を１グラムのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを４ｇの球状シリカゲルに添加し、ＤＣＭからＥｔＯＡｃへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて、蒸発させた。
ステップ４（Ｒ”＝ＯＡｃの場合のみ）． ステップ３の物質をＴＨＦ（２００μＬ）に溶解させ、氷浴中で冷却した。１等量のＴＨＦ中１．３５Ｍ カリウムメトキシドを溶液に加えた。３０分後、反応物をＤＣＭ（１ｍＬ）と３０％クエン酸（１ｍＬ）に分配した。ＤＣＭ層を０．５ｇのセライトに共吸着させ、溶媒を真空中で除去した。セライトを４ｇの球状シリカゲルに添加し、ＤＣＭからＥｔＯＡｃへの勾配を用いて溶出した。適切な画分を合わせて、蒸発させた。
方法Ｄ：（以下の化合物を方法Ｄによって合成することができる：化合物ＰＢＩ−３８９９、ＰＢＩ−３９００、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３９３３、ＰＢＩ−３９４６。概して、水素雰囲気下、パラジウム触媒存在下で、アミノピラジンを２等量の２−オキソ酸と縮合させた。生成されたαアミノ酸を精製し、その後、分子内縮合のために活性化して、対応するイミダゾピラジノンを生じた。
実施例５． ８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロピルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンの合成
２−（（３−ベンジル−５−（４−ヒドロキシフェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）ペンタン酸。４−（５−アミノ−６−ベンジルピラジン−２−イル）フェノール（１００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を、エタノール（２０ｍＬ）中の２−オキソ吉草酸（８４ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）と混合した。Ｐｄ／Ｃ（活性炭中の１０％パラジウム、４０ｍｇ）を加え、反応混合物を６５℃に加熱した。空気をＮ2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を４時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘプタン中５０％ ＥｔＯＡｃ）で精製して、生成物を黄色粉末（７０ｍｇ、５２％）として得た。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2, δ): 8.31 (s, 1H), 7.82 (d, 2H, J = 9.0Hz), 7.31 (m, 5H), 6.92 (d, 2H, J = 9.0Hz), 5.34 (s, 2H), 4.20 (m, 1H), 1.10 (m, 2H), 0.98 (m, 2H), 0.87 (t, 3H); MS (ESI) m/z 378.3 (M+1)。
８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロピルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン。２−（（３−ベンジル−５−（４−ヒドロキシフェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）ペンタン酸（４９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。ピリジン（０．５ｍＬ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＥｔＯＡｃ〜ＤＣＭ〜ＤＣＭ中１０％メタノール）で精製して、生成物を黄色粉末（４０ｍｇ、８６％）として得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 7.35 (m, 8H), 6.88 (d, J = 9.0Hz, 2H), 4.40 (s, 2H), 2.81 (t, J = 7.5Hz, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.02 (t, J = 7.5Hz, 3H); MS (ESI) m/z 359.0。
実施例６． ８−ベンジル−２−ブチル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンの合成
２−（（３−ベンジル−５−（４−ヒドロキシフェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）ヘキサン酸。４−（５−アミノ−６−ベンジルピラジン−２−イル）フェノール（２００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を、エタノール（２０ｍＬ）中の２−ケトヘキサン酸ナトリウム塩（２２０ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）と混合した。Ｐｄ／Ｃ（活性炭中の１０％パラジウム、１００ｍｇ）を、数滴の酢酸と共に加え、反応混合物を６５℃に加熱した。空気をＮ2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を４時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘプタン中５０％ ＥｔＯＡｃ）で精製して、生成物を黄色粉末（１３０ｍｇ、４６％）としてを得た。MS (ESI): m/z 392.2 (M+1)。
８−ベンジル−２−ブチル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン。２−（（３−ベンジル−５−（４−ヒドロキシフェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）ヘキサン酸（１３０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。ピリジン（０．５ｍＬ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１３７ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＥｔＯＡｃ〜ＤＣＭ〜ＤＣＭ中１０％メタノール）で精製して、生成物を黄色粉末（１１０ｍｇ、８９％）として得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 7.30 (m, 8H), 6.88 (d, 2H), 4.40 (s, 2H), 2.84 (t, 2H), 1.77 (m, 2H), 1.51 (m, 2H), 0.89 (m, 3H); MS (ESI) m/z 374.3 (M + 1)。
実施例７． ８−ベンジル−２−エチル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−３９２５）の合成
２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）ブタン酸。３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−アミン（２００ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を、エタノール（２０ｍＬ）中の２−オキソ酪酸（１５７ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）と混合した。Ｐｄ／Ｃ（活性炭中の１０％パラジウム、１００ｍｇ）を加え、反応混合物を６５℃に加熱した。空気をＮ2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を４時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘプタン中５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物を黄色粉末（９０ｍｇ、３４％）として得た。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2, δ): 7.72 (s, 1H), 7.32-7.48 (m, 10H), 4.46 (s, 2H), 4.20 (m, 2H), 2.25 (q, 2H), 0.99 (t, 3H); MS (ESI): m/z 348.3 (M+1)。
２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）ブタン酸をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。ピリジン（０．５ｍＬ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１３７ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＥｔＯＡｃ〜ＤＣＭ〜ＤＣＭ中１０％メタノール）で精製して、生成物を黄色粉末（１１０ｍｇ、８９％）として得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 7.26 (m, 3H), 6.84-7.07 (m, 8H), 4.03 (s, 2H), 2.47 (q, J = 9.0Hz, 2H), 0.96 (t, J = 9.0Hz, 3H); MS (ESI): m/z 330.2 (M+1).
実施例８． ８−ベンジル−６−フェニル−２−（３，３，３−トリフルオロプロピル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンの合成
５，５，５−トリフルオロ−２−オキソペンタン酸。エチル４，４，４−トリフルオロブチレート（１ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）およびシュウ酸ジエチル（３．８７ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）を、エタノールに溶解させた。ナトリウムエトキシド（エタノール中２１％、２．０９ｇ）を溶液に加え、反応混合物を０．５時間撹拌した。溶媒を蒸留し、残渣をＥｔＯＡｃ／水で抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒を除去して透明な液体を得た。MS (ESI): m/z 269.1 (M-1)。その後、液体を３Ｎ ＨＣｌ（２０ｍＬ）に溶解させ、反応混合物を４時間還流させた。冷却後、反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒を除去し、残渣を次のステップに直接使用した。MS (ESI): m/z 169.7 (M-1)。
５，５，５−トリフルオロ−２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）ブタン酸。３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−アミン（２４０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を、エタノール（２０ｍＬ）中の５，５，５−トリフルオロ−２−オキソペンタン酸（１５０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）と混合した。Ｐｄ／Ｃ（活性炭中の１０％パラジウム、１００ｍｇ）を加え、反応混合物を６５℃に加熱した。空気をＮ2ガスによって泡立たせて除去し、水素風船を反応フラスコに取り付けた。反応を４時間継続的に撹拌した。冷却後、それを濾過し、得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘプタン中５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物を黄色粉末（２００ｍｇ、５４％）としてを得た。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2, δ): 11.45 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.34 (m, 10H), 5.34 (s, 2H), 3.96-4.23 (m, 2H), 3.02-3.28 (m, 2H); FNMR: -76.3; MS (ESI): m/z 416.1 (M+1)。
セレンテラジン（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＦ3）。５，５，５−トリフルオロ−２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）ブタン酸（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。ピリジン（０．５ｍＬ）を加え、続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間ゆっくりと撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＥｔＯＡｃ〜ＤＣＭ〜ＤＣＭ中の１０％メタノール）で精製して、生成物を黄色粉末（８０ｍｇ、８７％）として得た。1H NMR (300 MHz, CD2Cl2, δ): 7.36 (m, 11H), 3.43 (s, 2H), 1.60-1.92 (m, 4H); FNMR: 67.4 (t, J = 18Hz); MS (ESI): m/z 398.2 (M+1)。
実施例９． ８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−３９３９）の合成
PBI-３９３９
８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン：
３−（フラン−２−イル）−２−オキソプロパン酸および３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−アミンを出発物質として用いて、方法Ｃから合成した。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 8.88 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.9, 2H), 7.61 − 7.38 (m, 6H), 7.37 − 7.14 (m, 3H), 6.38 (s, 1H), 6.26 (d, J = 3.2, 1H), 4.64 (s, 3H), 4.40 (s, 3H);C24H20N3O2 +の計算による正確な質量m/z+ 382.16, 実測値m/z+ 382。
実施例１０． ８−ベンジル−６−フェニル−２−（チオフェン−２−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−３８８９）の合成
ＰＢＩ−３８８９
８−ベンジル−６−フェニル−２−（チオフェン−２−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン：
２−オキソ−３−（チオフェン−２−イル）プロパン酸および３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−アミンを出発物質として用いて方法Ｃから合成した。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 8.85 (s, 1H), 7.99 (d, J = 6.8, 2H), 7.63 − 7.02 (m, 10H), 6.94 (dd, J = 3.5, 5.1, 1H), 4.62 (s, 2H), 4.58 (s, 2H), 2.69 (混入);C24H20N3OS+の計算された正確な質量 m/z+ 398.13, 実測値 m/z+ 398。
実施例１１． ８−シクロプロピル−２−（４−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−３８９７）の合成
ＰＢＩ−３８９７
８−シクロプロピル−２−（４−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン：
３−シクロプロピル−５−フェニルピラジン−２−アミンおよび３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−オキソプロパン酸を出発物質として用いて方法Ａにより合成した。C22H18N3O2の計算による正確な質量 m/z- 356.14, 実測値 m/z- 356。
実施例１２． ８−ベンジル−２−メチル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−３９３２）の合成
ＰＢＩ−３９３２
８−ベンジル−２−メチル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン：
１，１−ジメトキシプロパン−２−オンおよび３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−アミンを出発物質として用いて方法Ｂによって合成した。C20H18N3O+の算出による正確な質量m/z+ 316.14, 実測値 m/z+ 316。
実施例１３． ２−（４−ヒドロキシベンジル）−８−メチル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−３８９６）の合成
ＰＢＩ−３８９６
２−（４−ヒドロキシベンジル）−８−メチル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン：
３−メチル−５−フェニルピラジン−２−アミンおよび３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−オキソプロパン酸を出発物質として用いて方法Ａによって合成した。1H NMR (300 MHz, dmso) δ 8.84 (s, 1H), 8.00 (d, J = 7.6, 2H), 7.47 (dd, J = 8.6, 16.2, 3H), 7.17 (d, J = 7.3, 2H), 6.69 (d, J = 8.4, 2H), 6.26 (s, 4H), 4.17 (s, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.48 (s, 1H)。
実施例１４． ８−ベンジル−２−（４−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−３８４０）の合成
ＰＢＩ−３８４０
８−ベンジル−２−（４−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン：
３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−オキソプロパン酸および３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−アミンを出発物質として用いて方法Ａを使用して合成した。C26H22N3O2 +の算出による正確な質量m/z+ 408.17, 実測値 m/z+ 408。
実施例１５． 保護されたセレンテラジン（安定化）（ＰＢＩ−４３７７）の合成
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＰＢＩ−３９３９、炭酸カリウム（１．１等量）およびヨウ化カリウム（１．１等量）の混合物に、アルゴン雰囲気下、室温で、１等量のピバル酸クロロメチルを加えた。反応の進行を薄層クロマトグラフィーでモニターし、完了後すぐに、反応混合物を数分間氷浴中で冷却し、その後、反応物体積と等量の水を添加した。得られた混合物を適切な有機溶媒（例えば、ＥｔＯＡｃ）で抽出し、抽出物を濃縮し、粗生成物を得た。物質をシリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製した。
実施例１６. ８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−４５２５）、８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−４５４０）および２−（（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＰＢＩ−４５４１）の合成
１０ｍｍｏｌの２−メチルイミダゾール誘導体１または２を含むフラスコに、アルゴン雰囲気下で、２０ｍＬの無水ＴＨＦを加え、溶液をドライアイス／アセトン浴中でおよそ−７８℃に冷却した。冷却した混合物に、９．３ｍｍｏｌのｎ−ブチルリチウム溶液（ヘキサン中２．４６Ｍ）を数分かけて滴加した。得られた溶液をおよそ−７８℃で３０分間撹拌し、６．７ｍｍｏｌの化合物３を、注射器を介して加えた。反応混合物を３時間撹拌し、２０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液および２０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加してクエンチした。冷浴を取り除き、室温まで温めた後、混合物を３×１００ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、真空濃縮し、未精製化合物４または５を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製した。
マイクロ波バイアルを１００ｍｇ（１等量）の化合物６または７、および２等量の化合物８または９で満たした。混合物に、４．５ｍＬのエタノールおよび０．２５ｍＬの濃縮ＨＣｌを加えた。反応混合物をマイクロ波中１００℃で１．５時間加熱した。得られた混合物を５０ｍＬのＥｔＯＡｃに加え、２０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液および２０ｍＬのブラインで順次洗浄した。有機相を真空濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（メタノール／ジクロロメタン）で精製して、化合物１０〜１２を得た。
実施例１７． 新規セレンテラジンの安定性および自己発光の特性評価
新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、またはＰＢＩ−３８９６の安定性および自己発光の特徴付けを決定した。より高い安定性およびより少ない自己発光は、基質／試薬において魅力的な技術的特徴である。
安定性を決定するため、２０μＭの新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、もしくはＰＢＩ−３８９６、３０μＭの天然セレンテラジン、または２２μＭの既知のセレンテラジン−ｈもしくは既知のセレンテラジン−ｈｈを、５０ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ、３５ｍＭ チオ尿素、１％ ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、および０．１％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４を含有するレポーター試薬緩衝液中に置いた。反復試験試料を室温（すなわち、２２〜２４℃）で様々な期間インキュベートし、その後−７０℃に移行した。全ての試料を回収し凍結した後、それらを解凍し、フェノールレッド＋０．１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）無しの４０μＬのＤＭＥＭ中の、ＯｇＬｕｃ変異体ＩＶを含有する１０μＬの細菌細胞溶解物と混合した。試料の発光をＩＶ添加の５分後に読み取った。
「Ｔ90」は、発光シグナルが、周囲温度すなわち２２℃で、１０％だけ減衰（すなわち、活性が１０％だけ喪失）するのに要する時間の量を表す。発光シグナル（「Ｔ90」）の減衰速度を、対数ＲＬＵ対時間としてプロットされたデータの線型回帰の傾斜から決定したが、これは、以下の式から算出された：
ｔ＝ｌｎ（Ａ／Ａ0）÷（−ｋ）
式中、Ａ＝時間ｔでの強度、Ａ0＝時間０での強度、およびｋ＝減衰速度、である。表１に示されるように、既知のセレンテラジン−ｈおよびセレンテラジン−ｈｈ、新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、およびＰＢＩ−３８９６のＴ90値は、天然セレンテラジンよりも高かったが、これは、これらのセレンテラジンが天然セレンテラジンよりもより安定な化合物であったことを示している。
自己発光の特徴付けを決定するため、ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ピルビン酸塩中、１５，０００細胞／ウェルで、一晩増殖させた。培地を除去し、ＣＯ2非依存性培地＋１０％ＦＢＳ中に希釈された、図２に示される各２０μＭの新規セレンテラジン、すなわち、ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９６、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３９３２、およびＰＢＩ−３８４０、天然セレンテラジン並びに既知のセレンテラジンであるセレンテラジン−ｈおよびセレンテラジン−ｈｈと置き換えた。基質を添加した直後にＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーター（１秒／ウェル）で発光を測定した。バックグラウンド発光は１５４±１５ＲＬＵであった。表１は、天然セレンテラジンに対して正規化された自己発光の特徴付けを示している（「自己発光（セレンテラジンに対して正規化）」）。天然セレンテラジンと比べて、セレンテラジン−ｈは自己発光がより多かったが、その他全ての試験セレンテラジンは自己発光がより少なかった。
表１：種々のセレンテラジンを用いた、ＩＶの安定性実験および自己発光特徴付け
実施例１８. 新規セレンテラジンの毒性
新規セレンテラジンの毒性をＨＥＫ２９３細胞において調査した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ピルビン酸塩中、１５，０００／ウェルで、一晩増殖させた。培地を除去し、ＣＯ2独立培地＋１０％ＦＢＳに希釈された新規セレンテラジン化合物（またはＤＭＳＯ対照）と置き換えた。化合物添加から２４時間後に、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイ試薬（プロメガ社）を用い、製造業者の取扱説明書に従って、細胞生存率を測定し、発光はＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーター（１秒／ウェル）で測定した。表２は、ＨＥＫ２９３細胞における、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈおよびセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、およびＰＢＩ−３８４０の毒性を示している。ＰＢＩ−３８４０を例外として、新規セレンテラジンは少なくともセレンテラジン−ｈｈと同じ毒性を有していた。新規セレンテラジンのいくつかは、天然セレンテラジンおよびセレンテラジン−ｈと同じ毒性を有していた。
表２：ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）に基づく、ＨＥＫ２９３細胞における種々のセレンテラジンの毒性
実施例１９. ＰＢＩ−３９３９のＫｍ
ＰＢＩ−３９３９のＫｍを決定するため、ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖ（実施例２６に記載）を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質精製系を用いて、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合によって、製造業者の取扱説明書に従って精製し、フェノールレッドおよび０．１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）を含まないＤＭＥＭに希釈した。様々な量のＰＢＩ−３９３９を含有する５０μＬのアッセイ緩衝液（１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、３５ｍＭ チオ尿素、０．５％ ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、２ ｍＭ ＤＴＴおよび１５０ｍＭ ＫＣｌ）を、５０μＬの希釈酵素（およそ２０ｐＭ 最終酵素濃度）に加え、発光を２２℃、３分後に測定した。図３のデータが示すように、ＰＢＩ−３９３９のＫｍはおよそ１０μＭであった。
実施例２０. 化合物ＰＢＩ−４５２５、ＰＢＩ−４５４０およびＰＢＩ−４５４１の特徴付け
化合物ＰＢＩ−４５２５、ＰＢＩ−４５４０およびＰＢＩ−４５４１を、それらの発光検出能に関してスクリーニングした。分析のため、２０μＭのそれぞれの化合物を、アッセイ試薬を作製するために１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）でｐＨ７に調整したアッセイ緩衝液（１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、３５ｍＭ チオ尿素、０．５％ ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴおよび１５０ｍＭ ＫＣｌ）に加えた。その後、アッセイ試薬を、フェノールレッドを含有しないＤＭＥＭおよび０．１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）中の３６ｐＭ 精製Ｌ２７Ｖ０２酵素（実施例２５Ｂに記載）と混合した。対照として、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９またはＰＢＩ−４５２８を含有するアッセイ緩衝液を使用した。アッセイ試薬を酵素混合物に加えてから３分後に、発光を前述の通りに測定した。表３は、化合物ＰＢＩ−４５２５、ＰＢＩ−４５４０およびＰＢＩ−４５４１が、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼからの発光を検出するのに使用できることを示している。
表３
実施例２１. ＯｇＬｕｃパターン配列
異なるクラスのルシフェラーゼを含む酵素ファミリーは、共通の３次元構造および明確な触媒活性を有することによって、認識できる。酵素ファミリーは他の酵素ファミリーと進化史を共有しているため、それらはそれらの３次元構造において類似性も示す。構造解析および機能解析の様々な手段によって、発明者は、ＯｇＬｕｃが、代表的な十脚類ルシフェラーゼとして、進化史の共有性を含めて、脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）に著しく類似した３次元構造を有していることを決定した。従って、十脚類ルシフェラーゼは、ＦＡＢＰに類似した特徴的な３次元構造を有し、セレンテラジンを基質として利用し発光を触媒すると定義することができる。他のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ等は、明らかに異なる３次元構造を有しており、このことは、それらが異なる酵素ファミリーに属しており、進化史を共有していないことを示している。渦鞭毛藻類ルシフェラーゼは、ＦＡＢＰに対しいくらかの類似性を示す３次元構造を有しているが、このことは、進化史は共有しているが、セレンテラジンを基質として利用せず、従って十脚類ルシフェラーゼと同じ酵素ファミリーに属していないことを示している。
アミノ酸配列は３次元構造程はよく保存されていないため、配列比較のみに基づいて酵素ファミリーを定義することは困難である可能性がある。例えば、ＦＡＢＰ全ては特徴的な樽型３次元形状を有しているが、それらのアミノ酸配列の比較により、非常に低いレベルの配列同一性がしばしば明らかにされる。それでも、配列同一性を３次元構造の共有性を示すのに使用することができる。それらのアミノ酸配列が整列されて、３０％超の配列同一性、好ましくは４０％超の配列同一性、および最も好ましくは５０％の配列同一性を明らかにすることができた場合、２つのタンパク質は類似の３次元構造を有することとなる（Chothia and Lesk, EMBO J. 5(4):823-826 (1986); Tramontano, Genomics, 4:402−405 (2003)）。従って、あるタンパク質は、そのアミノ酸配列とＯｇＬｕｃの配列が整列された際、配列同一性が３０％超、好ましくは４０％超、および最も好ましくは好ましくは５０％超である場合、且つ、該タンパク質がセレンテラジンを基質として利用し、発光を触媒可能である場合、十脚類ルシフェラーゼである。
酵素ファミリーのその特徴的な３次元構造を維持するのに必要な構造的な制約のために、酵素ファミリーのアミノ酸配列のいくつかの部分は、より大きな量の保存（すなわち、より大きなレベルの配列同一性）を示す。従って、これらの保存領域は、２つのタンパク質の間で共有された共通の３次元構造というさらなる証拠として役立つことができる。保存された配列パターンは、シグネチャー（signature）、モチーフ、またはフィンガープリントとも称されるが、当該技術分野において周知の手作業によるまたはコンピュータによる方法によって作製することができる。パターンは、ＰＲＯＳＩＴＥ等の公開データベースに見出すことができる（http://expasy.org/prosite; Sigrist et al., Nucleic Acids Res. 38(suppl 1):D161-D166 (2010)）。
例えば、保存アミノ酸配列のパターンは、多数の既知のＦＡＢＰを調べて見出され得る。ＰＲＯＳＩＴＥ（２０１０年１０月５日の、リリース２０．６７）は、ＦＡＢＰパターン（受入番号ＰＳ００２１４、１９９０年４月に作成、２００６年４月に更新されたデータ）を含む。このＦＡＢＰパターンは、１８個のアミノ酸の位置にまたがり、以下の通りに定義される：
[GSAIVK]-{FE}-[FYW]-x-[LIVMF]-x-x-{K}-x-[NHG]-[FY]-[DE]-x-[LIVMFY]-[LIVM]-{N}-{G}-[LIVMAKR]（配列番号３２９）（ＶＩ）、
ここで：
・アミノ酸に対しては、標準的なＩＵＰＡＣの１文字コードが使用される。
・あらゆるアミノ酸が許容される位置に対しては、「ｘ」の記号が使用される。
・ある部位における代替的なアミノ酸はアミノ酸を角括弧「［ ］」の間に列挙することによって示される（例えば：［ＡＬＴ］は、その位置がＡｌａ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒである可能性を表す）。
・ある部位における特定のアミノ酸の欠如は波括弧「｛ ｝」によって示される（例えば：｛ＡＭ｝は、ある位置がＡｌａおよびＭｅｔ以外のあらゆるアミノ酸であることを表す）。
・各配列の位置（またはパターン中の構成要素）は、その隣から、「−」によって隔てられている。
・各配列の位置は、「パターン位置」と称され、例えば［ＧＳＡＩＶＫ］は式（ＶＩ）のパターン位置１と見なされ、｛ＦＥ｝は式（ＶＩ）のパターン位置２と見なされるなど等である。
保存された配列パターンは共通の、基礎をなす３次元構造からもたらされるが、該配列パターンへのいくつかの変化は、３次元構造への撹乱をもたらさずに可能であり得る。例えば、ＦＡＢＰファミリーのいくつかの構成要素について、ＰＲＯＳＩＴＥパターンにおける４つの部位で差異が見出される。ＦＡＢＰファミリーのこれらの追加の構成要素としては、偽陰性ヒット（false negative hit）としてＰＲＯＳＩＴＥに列挙される５つのタンパク質、すなわち、ＦＡＢＰパターン（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース受入番号ＦＢＰ１２＿ＨＵＭＡＮ、ＦＡＢＰ１＿ＦＡＳＧＩ、ＦＡＢＰ２＿ＦＡＳＨＥ、ＦＡＢＰＬ＿ＳＣＨＢＩ、ＲＥＴ５＿ＢＯＶＩＮ）により拾われなかった、ＦＡＢＰタンパク質ファミリーメンバー、およびＦＡＢＰの折り畳みを有することが知られる１つのタンパク質（蛋白質構造データバンク受入番号２Ａ０２）が挙げられる。ＯｇＬｕｃはＦＡＢＰとかなり類似した３次元構造共有しているが、天然アミノ酸配列および変異体アミノ酸配列の配列パターンも、ＰＲＯＳＩＴＥパターンと５つの位置で差異を有し、わずかに異なっている。種々の実施形態において、ＯｇＬｕｃにおけるパターンは、配列番号１の８位に対応する位置で開始する。アミノ酸の置換、欠失、または挿入配列パターンは差異とみなされ、含められる。
これらの追加のＦＡＢＰおよびＯｇＬｕｃ変異体からの配列情報を組み合わせて、改良された配列パターンが誘導できる：
[GSAIVK]-{FE}-[FYW]-x-[LIVMFSYQ]-x-x-{K}-x-[NHGK]-x-[DE]-x-[LIVMFY]-[LIVMWF]-x-{G}-[LIVMAKRG]（配列番号３３０）（ＶＩＩ）。
このパターンを誘導するために使用される配列情報を表４に示す。縦列１は、パターン位置（Ｎ末端からＣ末端まで列挙；パターンの長さは１８アミノ酸である）を特定しており、縦列６は、ＯｇＬｕｃにおける対応する配列の位置（配列番号１に従って番号付け）を特定している。縦列２は、各パターン位置のＰＲＯＳＩＴＥ ＦＡＢＰパターン（式（ＶＩ））要素を示している。縦列３は、ＰＲＯＳＩＴＥ ＦＡＢＰパターンによっては表されない６つのＦＡＢＰファミリーメンバーに存在するアミノ酸を列挙している。縦列４は、ＰＲＯＳＩＴＥパターンによっては表されないＯｇＬｕｃ（配列番号１）またはＯｇＬｕｃ変異体に存在するアミノ酸を列挙している。縦列５は、縦列２、３、および４のパターン情報を組み合わせることにより作成される改良されたパターン（「ＯｇＬｕｃパターン」）（式（ＶＩＩ））を列挙している。縦列７は、ＰＲＯＳＩＴＥ ＦＡＢＰパターン位置に対応するＯｇＬｕｃ（配列番号１）におけるアミノ酸を列挙している。縦列８は、前記改良パターンに対応する位置で、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ配列（８つの異なる種）に存在するアミノ酸（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号２０２１２６２Ａ、ＡＡＡ６８４９１、ＡＡＣ３６４７２、ＡＡＶ３５３７９、ＡＡＶ３５３８０、ＡＡＬ４０６７６、ＡＡＬ４０６７７、ＡＡＶ３５３７８、ＡＡＶ３５３７７、ＡＡＶ３５３８１、および蛋白質構造データバンク受入番号１ＶＰＲ）を列挙している。
改良パターン（式（ＶＩＩ））は、ＦＡＢＰとＯｇＬｕｃの間で共有される３次元タンパク質構造の表示（すなわち、フィンガープリント）として役立つ。しかし、このパターンとの厳密な一致は３次元構造の共有性を表すのに必要ではない。本明細書で与えられる例から、共通の３次元構造は、パターン中に５つもの変化を有していてさえ存在し得る。また、例えば、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼはＦＡＢＰおよびＯｇＬｕｃに類似した３次元構造を有するが、該ルシフェラーゼは改良パターンとの４つの差異を有する。
従って、あるタンパク質は配列類似性およびセレンテラジンの発光への利用に基づいて十脚類ルシフェラーゼと見なすことができるが、前記改良された配列パターンを有することによってもさらに認識することができる。具体的には、あるタンパク質は、そのアミノ酸配列を配列番号１またはその変異体と整列させたときに、配列同一性が３０％超、好ましくは４０％超、最も好ましくは５０％超であり、且つ、そのタンパク質が発光を触媒するのにセレンテラジンを基質として利用でき、且つ、配列番号１の８位に対応する位置で開始するアミノ酸配列が以下：
[GSAIVK]-{FE}-[FYW]-x-[LIVMFSYQ]-x-x-{K}-x-[NHGK]-x-[DE]-x-[LIVMFY]-[LIVMWF]-x-{G}-[LIVMAKRG]（配列番号３３０）（ＶＩＩ）
であり、
前記アミノ酸配列が、５より多い差異を有さず、またはより好ましくは４、３、２、または１より多い差異を有さず、または最も好ましくは差異が無く、その差異が表４に記載の式（ＶＩＩ）のパターン位置１、２、３、５、８、１０、１２、１４、１５、１７、または１８に対応する位置で生じる場合、十脚類ルシフェラーゼである。差異には、表４のパターン位置の間のギャップまたは挿入も含まれ得る。
表４：タンパク質配列パターン
実施例２２. ＯｇＬｕｃ変異体の生成
実験の詳細
特に明記しない限り、無作為置換を有する開始ＯｇＬｕｃ変異体配列のさらなる変異体は、製造業者の取扱説明書に従う、誤りがちな、変異誘発性ＰＣＲに基づく系であるＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ無作為変異誘発キット（ストラタジーン社；Daughtery, PNAS USA, 97(5):2029 (2000)）、およびＮＮＫ部位飽和（Zheng et al., Nucleic Acids Research, 32:e115 (2004)）を用いて、生成された。
特定の変異を有する開始ＯｇＬｕｃ変異体のさらなる変異体を、オリゴをベースとする部位特異的変異誘発キットであるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン社；Kunkel, PNAS USA, 82(2):488 (1985)）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、生成した。
得られた変異体は、Ｔ７プロモーターに基づいた発現用のｐＦ１Ｋ ＦＬＥＸＩ（登録商標）ベクター（プロメガ社）の背景において、構築された。あるいは、得られた変異体は、融合タンパク質を生成するために、Ｃ末端にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ社；本明細書では「ＨＴ７」と称する）を有する、または有さない大腸菌（E. coli）リボソーム結合部位を含有するように改変されたＴ７プロモーターおよびＣＭＶプロモーターを含有する、ｐＦ４Ａｇベクター（市販品ｐＦ４Ａ（プロメガ社）の１つのバージョンの背景において、構築された（Ohana et al., Protein Expression and Purification, 68:110-120 (2009)）。例えば、Ｃ１＋Ａ４Ｅ変異体を得るために、ｐＦ１Ｋベクターのバックグラウンドで、ＮＮＫ飽和突然変異誘発実験が行われた。Ｃ１＋Ａ４Ｅライブラリーが、ＨＴ７なしで、ｐＦ４Ａｇベクターのバックグラウンドで、作製された。ＱＣ２７、ＱＣ２７−９ａ、およびＩＶＹライブラリーが、Ｃ末端ＨＴ７有りで、ｐＦ４Ａｇベクターのバックグラウンドで作製された。ＩＶベースの変異体が、ＨＴ７無しで、ｐＦ４Ａｇベクターバックグラウンドで作成された。得られたベクターは、当該技術分野において周知の技術を用いて、ＫＲＸ大腸菌（E. coli）を形質転換するのに使用された。
作製されたＯｇＬｕｃ変異体は、変異体において特定されたアミノ酸置換にちなんで、および／または該変異体を含有する大腸菌（E. coli）クローンにちなんで命名されており、例えば図６Ａは、他の結果の中で、大腸菌（E. coli）クローン１６Ｃ５が置換Ｑ２０Ｒを有することを示している。
スクリーニングの詳細
得られたライブラリーを大腸菌（E. coli）で発現させ、対応する開始ＯｇＬｕｃ変異体と比較した場合に、増加した光出力（すなわち、増加した発光、増加した輝度、または増加した発光）または相対的特異性の変化を有するＯｇＬｕｃ変異体を求めて、自動装置の系を用いて、第一のスクリーニングを行った。自動装置による第一スクリーニングは、以下のように行われた：作製されたライブラリーから得られた個々のコロニーを、９６ウェルプレート中の最少培地に播種するのに使用し、３７℃で１７〜２０時間増殖させた（「Ｍ１培養物」）。Ｍ１培養物を、新しい最少培地で１：２０に希釈し、３７℃で１７〜２０時間増殖させた（「Ｍ２培養物」）。Ｍ２培養物を１：２０に希釈して誘導培地とし、ウォーク・アウェイ（walk-away）誘導、すなわち、自動誘導させつつ２５℃で１７〜２０時間増殖させた（Schagat et al., “KRX Autoinduction Protocol: A Convenient Method for Protein Expression.” Promega Notes, 98:16-18 (2008)）。新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８４２、ＰＢＩ−３８５７、ＰＢＩ−３８８０、ＰＢＩ−３８８１、ＰＢＩ−３８８６、ＰＢＩ−３８８７、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９６、またはＰＢＩ−３８９４が第一スクリーニングで基質として使用された場合、誘導培地はラムノースおよびグルコースを含有していた。天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、または新規セレンテラジンＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８９９、もしくはＰＢＩ−３９００が第一スクリーニングで基質として使用された場合、誘導培地はラムノースもグルコースも含有していなかった。異なる誘導培地の使用は、Ｃ１＋Ａ４Ｅと新規セレンテラジンとの間で生じた発光に基づいて決定された。すなわち、ラムノースおよびグルコースを含有する誘導培地が、Ｃ１＋Ａ４Ｅを用いるその他の新規セレンテラジンと比較して、Ｃ１＋Ａ４Ｅを用いる、より少ない発光を生じた新規セレンテラジンと共に使用された。
１０μＬの誘導細胞を、３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ チオ尿素、０．３×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（「ＰＬＢ」；プロメガ社カタログ番号Ｅ１９４Ａ）、０．３ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、および０．００３Ｕ／μＬ ＲＱ１デオキシリボヌクレアーゼを含有する６０μＬの溶解緩衝液を用いて溶解し、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、および２０μＭの天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン、または新規セレンテラジンを基質として含有する５０μＬのアッセイ緩衝液を用いて、発光を測定した。各変異体についての発光測定は試薬添加の３分後に行い、相対発光量（ＲＬＵ）の値を、各プレートに対応する開始ＯｇＬｕｃ変異体の８個の対照ウェルの平均に対して正規化した。アッセイを、ＴＥＣＡＮ（登録商標）自動装置系上で完了した。
目的のＯｇＬｕｃ変異体を、それぞれそのような変異体におけるいかなる追加のアミノ酸置換をも特定するために、当該技術分野において周知の標準的な配列決定技術を用いて配列決定した。目的の変異体クローンに非自動装置（手動）系を用いる第二のスクリーニングを行った。手動のスクリーニングを以下のように行った：変異体クローンを９６ウェルプレート中で３連で増殖させ、発現され、アッセイ緩衝液がマルチチャンネルピペットを用いての手動で加えられる以外は自動化されたアッセイについて記載されたようにアッセイされた。各変異体について、発光を測定し、平均をとり、対応する開始ＯｇＬｕｃ変異体に対し正規化した。ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００ルミノメーターを用いて発光測定を行った。
相対的特異性における変化の決定
試験セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光を、参照セレンテラジン基質存在下でのルシフェラーゼの発光で除算することにより、相対的基質特異性を決定した。例えば、本発明の新規セレンテラジンを用いるルシフェラーゼの発光を、異なるセレンテラジン（例えば、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジン、または本発明の異なる新規セレンテラジン）を用いるルシフェラーゼの発光で除算することによって、相対的特異性を決定した。比較された試験セレンテラジン基質および参照セレンテラジン基質は、相対的基質特異性を決定するための比較基質対であると見なされた。
比較基質対を用いる試験ルシフェラーゼの相対的基質特異性を、同じ比較基質対を用いる参照ルシフェラーゼの相対的基質特異性で除算することによって、相対的基質特異性における変化を決定した。例えば、異なるセレンテラジン（例えば、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンまたは本発明の異なる新規セレンテラジン）と比較した場合の、本発明の新規セレンテラジンを用いる試験ルシフェラーゼの相対的基質特異性を、試験ルシフェラーゼに対し用いられた同一の異なるセレンテラジンと比較した場合の、同一の本発明の新規セレンテラジンを用いる参照ルシフェラーゼの相対的基質特異性で除算することによって、相対的特異性における変化を決定した。
ある新規セレンテラジンを用いる発光を、異なる新規セレンテラジンを用いる発光と比較した。ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光を、別の天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光と比較した。ある天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いる発光を、新規セレンテラジンを用いる発光と比較した。
新規セレンテラジンに対する対応する開始ＯｇＬｕｃ鋳型と比較した場合の、ＯｇＬｕｃ変異体の発光（ＲＬＵ）における増加、並びに参照セレンテラジンに対する発光における低減または変化なしは、相対的特異性における変化の指標であった。対応する開始ＯｇＬｕｃと比較した場合の、新規セレンテラジンおよび参照セレンテラジンの両方に対するＯｇＬｕｃ変異体の発光における低減であるが、新規セレンテラジンを用いるＯｇＬｕｃ変異体の発光がより減少することも、相対的特異性における変化の指標とされた。新規セレンテラジンおよび参照セレンテラジンに対しての、対応する開始ＯｇＬｕｃと比較した場合のＯｇＬｕｃ変異体の発光における増加は、活性／安定性／発現における向上を示した。新規セレンテラジンおよび参照セレンテラジンの両方を用いるＯｇＬｕｃ変異体の発光が増加するが、新規セレンテラジンを用いる発光の増加がより大きい場合、それにより、相対的特異性における増加およびＯｇＬｕｃ変異体の活性／安定性／発現における向上が示されたことになる。
Ａ． Ｃ１＋Ａ４Ｅ変異体
米国特許仮出願番号第１２／７７３，００２号（米国特許出願公開第２０１０／０２８１５５２号）に以前に記載された、Ｃ１＋Ａ４Ｅ（配列番号２および３）を、追加の合成ＯｇＬｕｃ変異体を生成するために、第一の開始配列（すなわち、親配列）として使用した。Ｃ１＋Ａ４Ｅは、配列番号１に対し、以下：Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ａ５４Ｆ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８Ｉ、およびＮ１６６Ｒのアミノ酸置換を有する。実施例１〜１４に記載される新規セレンテラジン（例えば図４参照）を基質として用いる、細菌溶解物を含有するＣ１＋Ａ４Ｅの発光を、前に記載された通りに測定し、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンを基質として使用する発光と比較した（図５Ａ〜Ｇ）。図５Ａは、天然セレンテラジン（「セレンテラジン」）、既知のＰＢＩ−３８８０、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４２、ＰＢＩ−３８５７、ＰＢＩ−３８８１、ＰＢＩ−３８８２、ＰＢＩ−３８８６、およびＰＢＩ−３８８７を基質として用いる、Ｃ１＋Ａ４Ｅの発光を示している。既知のセレンテラジンおよび新規セレンテラジンを用いる発光測定は、天然セレンテラジンを用いるＣ１＋Ａ４Ｅの発光に対し正規化され、低減倍率が、天然セレンテラジンと比較された（図５Ｂ）。図５Ｃ〜Ｅは、天然セレンテラジン並びに新規セレンテラジンＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８９４、およびＰＢＩ−４００２をそれぞれ用いての、Ｃ１＋Ａ４Ｅの発光を示している。図５Ｆは、天然セレンテラジンおよび新規セレンテラジンＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８９９、およびＰＢＩ−３９００を用いるＣ１＋Ａ４Ｅの発光を示している。図５Ｇは、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジンＰＢＩ−３９１２並びに新規セレンテラジンＰＢＩ−３９１３、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９３３、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９４６、ＰＢＩ−３８４１、およびＰＢＩ−３８９６を用いるＣ１＋Ａ４Ｅの発光を示している。データは、Ｃ１＋Ａ４Ｅ変異体がそれぞれの新規セレンテラジンを基質として使用可能であることを示している。
特に明記しない限り、Ｃ１＋Ａ４Ｅにおいて特定されたアミノ酸置換を少なくとも有するＣ１＋Ａ４Ｅ変異体が生成された。前に記載された通りの無作為変異誘発によって、Ｃ１＋Ａ４Ｅの４４００種の変異体クローンから成るライブラリー（ライブラリー１）を作製し、相対的特異性変化および／または活性変化、例えば、輝度における向上を求めて、前述の通りにスクリーニングした。変異体を、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、既知のＰＢＩ−３８８０、および新規セレンテラジンＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８４２、ＰＢＩ−３８５７、ＰＢＩ−３８８１、ＰＢＩ−３８８６、ＰＢＩ−３８８７、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８９７、およびＰＢＩ−３９００を基質として用いて、一次スクリーニングした。さらに、前記変異体の半分を、新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９６およびＰＢＩ−３８９４を基質として用いてスクリーニングした。先の新規化合物のスクリーニングから特定された、目的の既知の変異を有する変異体を含有するプレートを選択した。一次スクリーニングにおいて試験された新規セレンテラジンのうちの一つまたは複数について、向上を示した変異体（相対的特異性における変化または活性における変化）を単離し、配列決定し、二次スクリーニングにおいてスクリーニングした。
手動の二次スクリーニングにおいて、変異体を、既知のセレンテラジンＰＢＩ−３９１２、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｈ、２−メチルセレンテラジン、およびセレンテラジンｖ；並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８９９、ＰＢＩ−３９００、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３９４４、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３９１３、およびＰＢＩ−３８９６を基質として用いて試験した。図６Ａ〜Ｄは、変異体（「クローン」）について、Ｃ１＋Ａ４Ｅに対し正規化された平均発光をまとめたものである。図６Ａ〜Ｄは、これらの変異体（「ＡＡ配列」）における置換をまとめたものであり、変異体は、以下：Ａ１４Ｖ、Ｇ１５Ｒ、Ｑ１８Ｌ、Ｑ２０Ｒ、Ｌ２２Ｉ、Ｅ２３Ｋ、Ｌ２７Ｖ、Ｌ２７Ｍ、Ｋ３３Ｎ、Ｔ３９Ｉ、Ｅ４９Ｋ、Ｆ５４Ｓ、Ｆ５４Ｉ、Ｄ５５Ｇ、Ｉ５６Ｖ、Ｖ５８Ｉ、Ｖ５８Ｌ、Ｉ５９Ｔ、Ｓ６６Ｔ、Ｇ６７Ｓ、Ｆ６８Ｓ、Ｌ７２Ｑ、Ｍ７５Ｋ、Ｉ７６Ｎ、Ｆ７７Ｔ、Ｆ７７Ｃ、Ｋ８９Ｅ、Ｉ９０Ｖ、Ｉ９０Ｔ、Ｌ９２Ｈ、Ｈ９３Ｒ、Ｍ１０６Ｋ、Ｙ１０９Ｆ、Ｐ１１３Ｔ、Ｉ１１７Ｆ、Ｔ１２６Ｒ、Ｖ１２７Ａ、Ｌ１３６Ｍ、Ｄ１３９Ｇ、Ｐ１４５Ｌ、Ｓ１４８Ｔ、Ｃ１６４Ｓ、またはＡ１６９Ｖの追加のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有していた。
５４位、９２位、および１０９位でのアミノ酸置換は重要であった。なぜならこれらの位置での置換はより大きな光出力または向上された相対的特異性、すなわち、図６Ａ〜Ｃに示すように、天然セレンテラジンから離れて、少なくとも１つの新規セレンテラジンに向かう特異性を提供したからである。クローン２９Ｈ７におけるアミノ酸置換Ｆ５４Ｉは、天然セレンテラジン、および新規セレンテラジンのうちのいくつかを用いて、より大きな光出力を提供した。クローン４０Ｈ１１におけるアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、クローン０４Ａ１２におけるアミノ酸置換Ｌ９２Ｈ、およびクローン４３Ｆ９におけるアミノ酸置換Ｙ１０９Ｆは、向上された相対的特異性を提供した。
表５は、前に記載した通りに生成された、７７位、９２位、または１０９位に追加のアミノ酸置換を有するＣ１＋Ａ４Ｅ変異体を列挙している（「ＡＡ変化」）。これらの変異体を、光出力の増加について前に記載した通りに分析した。すなわち、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、および新規セレンテラジンＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３８９６、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３９３２、またはＰＢＩ−３９２５を基質として使用して、Ｃ１＋Ａ４Ｅよりも少なくとも１．３倍明るい変異体を求めてスクリーニングした。以下：Ｌ９２Ｇ、Ｌ９２Ｑ、Ｌ９２Ｓ、Ｌ９２Ａ、Ｌ９２Ｍ、Ｌ９２Ｈ、Ｌ９２Ｙ、Ｆ７７Ｗ、Ｆ７７Ｙ、Ｆ７７Ｓ、Ｆ７７Ｔ、Ｆ７７Ｖ，、Ｆ７７Ａ、Ｆ７７Ｇ、Ｆ７７Ｃ、Ｆ７７Ｄ、Ｆ７７Ｍ、およびＹ１０９Ｆの追加の置換は、Ｃ１＋Ａ４Ｅよりも少なくとも１．３倍明るい変異体をもたらした。表５に示されるように、Ｌ９２Ｈ、Ｆ７７ＷおよびＦ７７Ａ置換は、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３９３２による、最も劇的な向上があった。
表５：７７位、９２位および１０９位の部位飽和
追加のＣ１＋Ａ４Ｅ変異体（Ａ群）は、前に記載した通りの部位特異的変異誘発によって作製されたことで、配列番号１に対し、以下：１８、２０、５４、５９、７２、７７、８９、９２、１０９、１１３、１２７、１３６、または１６４のアミノ酸位置の少なくとも１つにおいて追加の置換を有する。これらのアミノ酸位置が選択されたのは、ライブラリー１の一次および二次スクリーニングに基づき、これらの位置での置換は、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較した場合に、以下のうち少なくとも１つを基質として用いる総光出力を増加させたためである：新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９６、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３９２５、もしくはＰＢＩ−３９３２、または既知のセレンテラジンである２−メチルセレンテラジンもしくはＰＢＩ−３９１２。図７は、変異体（「クローン」）および各変異体に含まれる追加のアミノ酸置換を列挙している。変異体クローンは、前述の通り、手動の二次スクリーニングについての記載の通りに３連で分析し、Ｃ１＋Ａ４Ｅに対し正規化した。図８Ａ〜Ｂおよび図９は、種々のセレンテラジンを基質として用いた場合の、図７に列挙される変異体の正規化された平均発光を示している。図８Ａ〜Ｂおよび図９は、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較して、列挙された新規化合物に対する発光が大きく増加した、または、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較して、既知のセレンテラジンに対する発光における変化が無いもしくは減少した変異体を示している。追加のアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、Ｆ５４Ｉ、Ｌ９２Ｈ、およびＹ１０９Ｆを有するクローンＱＣ２７は、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較して、ＰＢＩ−３８９６による発光において５６１．３２倍の増加、ＰＢＩ−３８９４では３９２．９８倍の増加、およびＰＢＩ−３８９６では２８３．８５倍の増加を有した。このデータは、Ｑ１８Ｌ、Ｌ９２Ｈ、およびＹ１０９Ｆが互いに組み合わせ可能であり、追加の置換により、向上した相対的特異性を有する変異体がもたらされることことを示している。
ライブラリー１から特定された重要な他の置換は、追加の変異体（Ｂ群）を作製するために組み合わされた（図１０）。配列番号１に対し、追加のアミノ酸置換を、以下のアミノ酸位置の少なくとも１つに行った：１８、２０、５４、７１、７７、９０、９２、１０９、または１２７。これらの置換は、以下の新規セレンテラジンのうち少なくとも１つを基質として用いることにより、向上を示した：ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９６、ＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３９２５、またはＰＢＩ−３９３２。これらの変異体を、Ａ群の変異体について記載したように、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３８９４、およびＰＢＩ−３８９６を用いて分析した。変異体クローンは、前に記載した通り、手動の二次スクリーニングについての記載の通りに３連で分析し、Ｃ１＋Ａ４Ｅに対し正規化した。図１１は、種々のセレンテラジンを基質として用いた場合の、図１０に列挙される変異体の正規化された平均発光を示している。図１１は、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較して、列挙された新規セレンテラジンに対する発光が大きく増加した、または、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較して、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンに対する発光における変化が無いもしくは減少した変異体を示している。
追加のアミノ酸置換Ｉ９０Ｖおよび／またはＹ１０９Ｆ（Ｃ群）を有する追加の変異体を生成し、Ａ群またはＢ群より生成された変異体と比較した（図１２参照）。Ｉ９０Ｖ置換（「Ｉ９０Ｖ」）、Ｙ１０９Ｆ置換（「Ｙ１０９Ｆ」）、または両方の置換（「ＬＥ２」）を有する変異体を含むクローンを、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３９３２、ＰＢＩ−３８９４、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３８９７を基質として用いるＡ群の組換え体について記載されたようなアッセイを使用して、クローンＱＣ＃２７、ＱＣ＃２Ｅ７、ＱＣ＃２Ｆ４、およびＱＣ＃１Ａ１１と比較した（図１２）。変異体クローンは、前に記載した通り、手動の二次スクリーニングについての記載の通りに３連で分析し、Ｃ１＋Ａ４Ｅに対し正規化した（図１２）。図１２は、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較して、列挙された新規セレンテラジンに対する発光が大きく増加し、Ｃ１＋Ａ４Ｅと比較して、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンに対する発光における変化が無いもしくは減少した変異体を示している。図１２は、天然セレンテラジンおよび新規基質のいくつかに対して、Ｉ９０Ｖがより大きな光出力を提供することを示している。
Ｂ． ＱＣ２７変異体
追加のアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、Ｆ５４Ｉ、Ｌ９２Ｈ、およびＹ１０９Ｆを有している、Ａから得られた変異体ＱＣ２７（配列番号４および５）を、前に記載した通りｐＦ４Ａ改変ベクターにクローニングし、Ｃ末端ＨＴ７（プロメガ社）融合タンパク質（「ＱＣ２７−ＨＴ７」）（配列番号４４および４５）を生成した。ＱＣ２７−ＨＴ７の４４００種の変異体（ライブラリー２）を前に記載した通りの無作為変異誘発によって作製し、天然セレンテラジン並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９６およびＰＢＩ−３８９７を基質として用い、相対的特異性における変化の増加を求めて、前に記載した通りに一次スクリーニングした。変異体クローンを選択し、配列決定し、前に記載した通り天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３８９４を基質として用いて手動の二次スクリーニングで分析した。
図１３は、これらの変異体（「試料」）において特定された追加のアミノ酸置換（「配列」）、並びに二次スクリーニングにおいて天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３８９４を基質として使用する、対応する開始ＱＣ２７−ＨＴ７に対し正規化された該変異体の発光を列挙している。図１４における変異体は、以下：Ｆ１Ｉ、Ｒ１１Ｑ、Ｌ１８Ｉ、Ｌ１８Ｑ、Ｖ２１Ｌ、Ｖ２１Ｍ、Ｌ２２Ｆ、Ｆ３１Ｉ、Ｑ３２Ｈ、Ｖ４５Ｅ、Ｌ４６Ｑ、Ｓ４７Ｐ、Ｇ４８Ｒ、Ｅ４９Ｄ、Ｇ５１Ｅ、Ｄ５５Ｅ、Ｇ６７Ｓ、Ｆ６８Ｙ、Ｆ６８Ｌ、Ｑ６９Ｈ、Ｌ７２Ｑ、Ｅ７４Ｋ、Ｅ７４Ｉ、Ｍ７５Ｋ、Ｉ７６Ｆ、Ｉ７６Ｖ、Ｈ８６Ｒ、Ｉ９０Ｔ、Ｈ９２Ｑ、Ｈ９２Ｒ、Ｔ９６Ａ、Ｖ９８Ｆ、Ｉ９９Ｖ、Ｉ９９Ｔ、Ｖ１０２Ｍ、Ｍ１０６Ｉ、Ｆ１０９Ｙ、Ｌ１４２Ｖ、Ｖ１５８Ｉ、Ｔ１５９Ｓ、Ｌ１６８Ｆ、またはＧ１７０Ｒの追加のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有していた（Ｇ１７０Ｒは、ＨＴ７とＯｇＬｕｃ変異体の間のリンカー領域に位置していた）。
変異体２４Ｂ１２におけるアミノ酸置換Ｆ６８Ｙ、変異体２９Ｃ４におけるＬ７２Ｑ、および変異体３Ｈ１１におけるＭ７５Ｋは、それぞれ、天然セレンテラジンおよび新規基質のいくつかに対して、より大きな光出力を提供した。変異体２５Ａ１１におけるアミノ酸置換Ｖ２１Ｌおよび変異体１Ｂ６におけるＨ９２Ｒは、相対的特異性の向上を提供した。これら置換の両方の場合において、発光シグナルは、新規セレンテラジンを基質として使用することにより低減したが、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンを基質として使用することでより低減した。
前に記載した通りの部位特異的変異誘発を用いて、特定のアミノ酸置換（図１４）を有するように、追加のＱＣ２７−ＨＴ７変異体を生成した。追加の置換は、配列番号１に対し以下：２１、６８、７２、７５、７６、９０、９２、および１５８のアミノ酸位置の少なくとも１つにおいてなされたが、これは、これらの位置が図１４に示されるように相対的特異性変化における向上を示したためである。図１５は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、および新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８９７、ＰＢＩ−３８４１、ＰＢＩ−３８９６、およびＰＢＩ−３８９４を基質として使用した場合の、対応する開始ＱＣ２７−ＨＴ７に対して正規化されたＱＣ２７−ＨＴ７変異体の発光を示している。図１５に示されるように、３つのアミノ酸置換Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５ＫをＶ１５８Ｉと組み合わせることにより、例えば変異体ＱＣ２７＃１でのように、各試験セレンテラジンに対し、より大きな光出力が提供された。
Ｃ． ＱＣ２７−９ａ変異体
Ｂから得られた、追加のアミノ酸置換Ｖ２１Ｌ、Ｈ２９Ｒ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、Ｍ７５Ｋ、およびＶ１５８Ｉを有するＱＣ２７−ＨＴ７融合タンパク質である変異体ＱＣ２７−９ａ（配列番号６および７）を、ライブラリーを作製するための開始配列として使用した。前に記載した通りの無作為変異誘発によってＱＣ２７−９ａの４４００種の変異体（ライブラリー３）を作製し、天然セレンテラジン並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１およびＰＢＩ−３８９７を使用して、増加した相対的特異性変化を求めてスクリーニングした。変異体クローンを選択し、配列決定し、前に記載した通りの手動の二次スクリーニングで、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、既知のセレンテラジン−ｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１およびＰＢＩ−３８９７を基質として使用して、分析した。図１６は、変異体（「試料」）において特定された追加の置換（「ＡＡ変化」）、並びに二次スクリーニングにおいて天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、既知のセレンテラジン−ｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１およびＰＢＩ−３８９７を基質として使用する、対応する開始ＱＣ２７−９ａに対して正規化された該変異体の平均発光を列挙している。相対的特異性における増加は、開始テンプレートと比較した場合に、新規セレンテラジン、天然セレンテラジン、および既知のセレンテラジンを用いる変異体の発光に低減があったが、天然セレンテラジンおよび既知のセレンテラジンを用いる発光がより減少した場合を表している。例えば、アミノ酸置換Ｌ２２Ｆを有する変異体３０Ｄ１２では、新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１およびＰＢＩ−３８９７を用いる活性においておよそ３倍の喪失があった。しかし、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、および既知のセレンテラジン−ｈｈを用いる変異体３０Ｄ１２の発光は、１０倍以上低減した。
図１７は、ヒト化ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（本明細書では「ｈＲＬ」と称される）（配列番号３０および３１）と比較した場合の、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４１およびＰＢＩ−３８９７を基質として使用する、Ｃ１＋Ａ４Ｅ、ＱＣ２７−ＨＴ７およびＱＣ２７−９ａの発光の比較を示している。ＰＢＩ−３８９７を用いてのＱＣ２７−９ａの反応は、ＰＢＩ−３８４１を用いるＱＣ２７−９ａよりもより明るかったが（図１７参照）、進化の傾向、すなわち、発光における向上の大きさは、ＰＢＩ−３８４１（表６）に対して最も大きかった。発光における向上（４４０倍）と、天然セレンテラジンに対する発光における低減（８００倍）を組み合わせることより、天然セレンテラジンと比較した場合の、ＰＢＩ−３８４１を使用するＱＣ２７−９ａの相対的特異性における変化（３５０，０００倍）が示された。
表６：天然セレンテラジンおよびセレンテラジン−ｈｈと比較した場合の、ＰＢＩ−３８９７およびＰＢＩ−３８４１に対するＯｇＬｕｃ変異体の相対的特異性における変化
Ｄ． ＩＶＹ変異体
追加のアミノ酸置換Ｆ５４Ｉ、Ｉ９０Ｖ、およびＦ７７Ｙを有するＣ１＋Ａ４Ｅ変異体であるＩＶＹ（配列番号８および９）を、前に記載した通りにｐＦ４Ａ改変ベクターにクローニングし、Ｃ末端ＨＴ７融合タンパク質（「ＩＶＹ−ＨＴ７」）を生成した。ＩＶＹ−ＨＴ７の４４００種の変異体（ライブラリー４）を無作為変異誘発により作製し、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８４０、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９２５、ＰＢＩ−３９３２、およびＰＢＩ−３９４５を基質として使用しての、増加された光出力（すなわち、増加された輝度）および増加された相対的特異性を求めてスクリーニングした。変異体クローンを選択し、配列決定し、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、およびＰＢＩ−４００２を基質として使用する、前に記載した通りの二次スクリーニングにおいて３連で分析した。図１８および図１９は、変異体（「試料」）において特定された追加の置換（「ＡＡ変化」）、並びに、二次スクリーニングにおいて、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、およびＰＢＩ−４００２を基質として使用する、ＩＶＹ−ＨＴ７に対して正規化された変異体の平均発光を列挙している。図１８は、以下：Ｑ１８Ｈ、Ｄ１９Ｎ、Ｑ２０Ｐ、Ｑ３２Ｐ、Ｋ３３Ｎ、Ｖ３８Ｉ、Ｖ３８Ｆ、Ｋ４３Ｎ、Ｉ４４Ｆ、Ｅ４９Ｇ、Ｉ６０Ｖ、Ｑ６９Ｈ、Ｉ７６Ｎ、Ｙ７７Ｎ、Ｙ９４Ｆ、Ｇ９５Ｓ、Ｇ９５Ｄ、Ｆ１１０Ｉ、Ｖ１１９Ｍ、Ｋ１２４Ｍ、Ｌ１４９Ｉ、またはＲ１５２Ｓのアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有するＰＢＩ−３９４５（Ａ群）を用いての性能に基づいて選択された変異体を列挙している。図１９は、以下：Ｆ６Ｙ、Ｑ１８Ｌ、Ｌ２７Ｖ、Ｓ２８Ｙ、Ｑ３２Ｌ、Ｋ３３Ｎ、Ｖ３６Ｅ、Ｐ４０Ｔ、Ｑ４２Ｈ、Ｎ５０Ｋ、Ｇ５１Ｒ、Ｈ８６Ｌ、Ｎ１３５Ｄ、またはＩ１５５Ｔのアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有するＰＢＩ−３８８９（Ｂ群）を用いての性能に基づいて選択された変異体を列挙している。
追加のＩＶＹ−ＨＴ７変異体を、前に記載した通りの部位特異的変異誘発を用いて、追加の特定のアミノ酸置換を有するように生成した。図２０は、配列番号１に対し、以下：１９、２０、２７、３２、３８、４３、４９、５８、７７、９５、１１０、および１４９の追加のアミノ酸位置のうち少なくとも１つを有する変異体を列挙しているが、それは、これらの置換が、ＰＢＩ−３９４５およびＰＢＩ−４００２に対する特異性を示した図１８の変異体において特定されたためである。図２１は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−４００２、ＰＢＩ−３９３２およびＰＢＩ−３８４０を基質として使用する、ＩＶＹ−ＨＴ７に対して正規化された、図２０に列挙される変異体の発光を示している。いずれの変異体も、ＩＶＹ−ＨＴ７を超える向上を示さなかったが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いての発光が約３〜４対数減少したが、ＰＢＩ−３９４５およびＰＢＩ−４００２を用いての発光が２倍しか減少しなかった場合が、変異体Ｃ５．１９（配列番号１２および１３）等であった。変異体Ｃ５．１９は、追加のアミノ酸置換Ｌ２７Ｖ、Ｖ３８Ｉ、およびＬ１４９Ｉを有する。
図２２は、配列番号１に対し、以下：６、１８、２７、２８、３３、３４、３６、４０、５０、５１、１３５、および１５５の追加のアミノ酸位置のうち少なくとも１つを有する変異体を列挙しているが、それは、これらの置換が、ＰＢＩ−３８８９およびＰＢＩ−３９３９に対する特異性を示した図１９の変異体において特定されたためである。図２３は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−４００２、ＰＢＩ−３９３２、およびＰＢＩ−３８４０を基質として使用した場合の、ＩＶＹ−ＨＴ７に対して正規化された、図２１に列挙される変異体の発光を示している。ＩＶＹ−ＨＴ７と比較した場合、それぞれの変異体に対して、発光が低減した。変異体Ｃ１．３（配列番号１０および１１）は、ＰＢＩ−３９３９を用いた場合に、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンを用いた場合より約２０００倍多い発光を有した。変異体Ｃ１．３は、追加のアミノ酸置換Ｆ６Ｙ、Ｋ３３Ｎ、Ｎ１３５Ｄ、およびＩ１５５Ｔを有する。
ｈＲＬおよびＩＶＹ−ＨＴ７と比較した場合の相対的特異性変化に関して最良のＩＶＹ−ＨＴ７変異体は、ＰＢＩ−３９４５を用いた場合に最良の発光を有したＣ５．１９、およびＰＢＩ−３８８９を用いた場合に最良の発光を有したＣ１．３であった。図２４は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９およびＰＢＩ−３９４５を使用する、ｈＲＬ、ＩＶＹ−ＨＴ７、Ｃ５．１９（Ｃ末端でのＨＴ７融合）、およびＣ１．３（Ｃ末端でのＨＴ７融合）の発光を示している。
Ｅ． ＩＶ変異体
追加のアミノ酸置換Ｆ５４ＩおよびＩ９０Ｖを有するＣ１＋Ａ４Ｅ変異体であるＩＶ（配列番号１４および１５）を、前に記載した通りに生成した。転写レポーターとして使用するための最も明るい変異体を決定するために、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、およびＰＢＩ−４００２を基質として使用する、Ｃ１＋Ａ４Ｅ（配列番号２および３）、ＩＶＹ（配列番号８および９）、およびＩＶ（配列番号１４および１５）に対して提供される発光を前に記載した通りに測定した。ｈＲＬを対照として使用した。図２５に示されるように、ＩＶは、Ｃ１＋Ａ４ＥおよびＩＶＹの両方よりも明るかった。ＩＶにおけるアミノ酸置換Ｆ５４Ｉは、天然セレンテラジンおよびいくつかの新規基質に対し、より大きな光出力を提供した。これら全ての変異体は、試験セレンテラジンを用いるｈＲＬよりも明るかった。
Ａ、ＢおよびＤ（すなわち、開始配列としてのＣ１＋Ａ４Ｅ、ＩＶＹ、およびＱＣ２７から作製されたライブラリーのスクリーニング）から得られたデータを再検討して、種々のセレンテラジンを用いる、増加した光出力（すなわち、増加した輝度）を有するような追加のアミノ酸置換を決定した。ＩＶ変異体を、天然セレンテラジンに対する特異性を２〜１０倍だけ低減させた追加の置換を有するように、前に記載した通りに生成した。図２６に列挙されるように、ＩＶ変異体（「クローン」）は、以下：Ｆ１Ｉ、Ｅ４Ｋ、Ｑ１８Ｌ、Ｌ２７Ｖ、Ｋ３３Ｎ、Ｖ３８Ｉ、Ｆ６８Ｙ、Ｍ７０Ｖ、Ｌ７２Ｑ、Ｍ７５Ｋ、またはＶ１０２Ｅのアミノ酸置換のうち少なくとも１つの追加のアミノ酸置換（「配列」）を有していた。
アミノ酸置換の全ての組み合わせについて、変異体クローンの１６枚のプレートを、前に記載した自動装置を用いる方法を使用して、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８８９およびＰＢＩ−３９４５を基質として用いて、一次スクリーニングおよび分析をした。向上した発光を有する変異体を選択し、配列決定し、前に記載した通りの手動スクリーニングを用いて３連で分析した。天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈ、既知のセレンテラジン−ｈｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３８８９、ＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、およびＰＢＩ−４００２を基質として用いて、発光を測定した。対応する開始配列ＩＶおよびｈＲＬを、対照として使用した。
図２６は、変異体、および該変異体において特定された追加のアミノ酸置換を列挙している。図２７は、ＩＶに対して正規化された、二次スクリーニングにおける変異体の平均発光を示している。追加のアミノ酸置換Ｆ１Ｉ、Ｌ２７Ｖ、およびＶ３８Ｉを有する変異体８Ａ３（配列番号２６および２７）は、新規セレンテラジンを用いた場合に向上した相対的特異性を有しが、ＩＶよりも明るくはなかった。追加のアミノ酸置換Ｌ２７Ｖを有する変異体８Ｆ２（配列番号４６および４７）は、使用された４種の新規セレンテラジンのうち３種を用いた場合に、向上した相対的特異性および輝度を提供した。追加のアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを有する変異体９Ｂ８（配列番号１８および１９）は、全ての基質に対してより明るく、天然セレンテラジンを超える、いくつかの相対的特異性における利点も提供した。追加のアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、Ｌ２７Ｖ、Ｖ３８Ｉ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを有する変異体９Ｆ６（配列番号２０および２１）は、８Ｆ２に見られたものと同様の向上を示した。追加のアミノ酸置換Ｅ４Ｋ、Ｋ３３Ｎ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを有する変異体１５Ｃ１（配列番号１６および１７）は、全ての新規セレンテラジンに対してより明るかったが、相対的特異性における利点にはいかなる向上もなかった。変異体１Ｄ６におけるアミノ酸置換Ｑ１８Ｌは、向上した相対的特異性、すなわち、ＩＶに関連して、天然セレンテラジンから離れて、新規基質へと向かう相対的特異性を提供した。通常、アミノ酸置換Ｌ２７Ｖは、ＩＶに関連して、向上した相対的特異性を提供した。
図２８は、天然セレンテラジン、既知のセレンテラジン−ｈｈ、既知のセレンテラジン−ｈ、並びに新規セレンテラジンのＰＢＩ−３９３９、ＰＢＩ−３９４５、ＰＢＩ−３８８９、およびＰＢＩ−４００２を基質として用いての二次スクリーニングにおける、８Ａ３、９Ｂ８、９Ｆ６、および１５Ｃ１変異体の発光を、ＩＶおよびｈＲＬと比較して示している。変異体８Ａ３は、ＩＶと比較して、天然セレンテラジンを用いた場合の輝度において、２対数分の減少を有した。変異体９Ｆ６は、ＩＶと比較して、天然セレンテラジンを用いた場合の輝度において、１対数分の低減を有した。ＰＢＩ−３９４５を用いた場合の変異体１５Ｃ１は最も明るかったが、そのシグナル半減期は短かった（実施例２７参照）。
Ｆ． ９Ｂ８変異体
Ｅから得られた９Ｂ８変異体を、さらに改変して、増加した発光および／またはＰＢＩ−３９３９に対し向上した相対的特異性を有する追加の変異体を生成した。アミノ酸置換Ｌ７２Ｑは、増加した発光（すなわち輝度）のために有益なアミノ酸置換であるように見えたが、それは、その全てが向上した発光を示した変異体９Ｂ８、９Ｆ６、および１５Ｃ１において、この置換が特定されたためである。７２位での他のアミノ酸置換が、輝度における同様の増加を提供するか否かを決定するために、前に記載した通り、７２位を代替的な残基で飽和させることによって、９Ｂ８の追加の変異体を生成した。４連で大腸菌（E. coli）溶解物を調製し、アッセイ緩衝液が１０ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、３５ｍＭ チオ尿素、および０．５％ ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）を含有していること以外は前に記載した通りに、ＰＢＩ−３９３９を基質として用いて輝度を分析した。表７は、９Ｂ８に対して正規化された発光（「ＲＬＵ（９Ｂ８に対して正規化された）」）、すなわち向上倍率によって示されるように、９Ｂ８と比較した場合に同様の、または向上した発光を有する９Ｂ８変異体（「変異体」）を列挙している。７２位でのＡ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、およびＭのアミノ酸置換は、少なくともアミノ酸Ｑと同じ（すなわち１倍）輝度という利点を提供した。
表７：変異体９Ｂ８と比較した場合に同様の発光を有する変異体
新規ＰＢＩ−３９３９に対して向上した相対的特異性を有する追加の変異体を、変異体９Ｂ８におけるアミノ酸位置１８、６８、７２、７５、および９０を飽和させることによって、前に記載した通りに生成した。大腸菌（E. coli）溶解物を調製し、天然セレンテラジンおよび新規ＰＢＩ−３９３９を基質として用いて、前に記載した通りに輝度を分析した。対応する９Ｂ８の発光の割合に対して正規化された、天然セレンテラジンを用いる変異体の発光に対する、ＰＢＩ−３９３９を用いる変異体の発光の割合から、相対的特異性を決定した。表８は、ＰＢＩ−３９３９に対する相対的特異性において少なくとも１．１倍の増加を有する９Ｂ８変異体（「変異体」）を列挙している。結果は、各部位での少なくとも１つの追加の変化が、天然セレンテラジンと対照して、ＰＢＩ−３９３９に対する向上した相対的特異性を提供したことを示している。アミノ酸置換Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｙ、Ｗ、およびＨを１８位に有する９Ｂ８変異体は、相対的特異性において最も高い倍率の向上を有した。
表８：ＰＢＩ−３９３９に対する向上した相対的特異性を有する変異体

Ｇ． ９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ変異体
輝度、相対的特異性、および熱安定性に対するアミノ酸置換Ｋ３３Ｎの利点を調べるために、追加の変異体である９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（配列番号４２および４３）を生成した。９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎを試験し、種々の適用の中で９Ｂ８ｏｐｔ（実施例２５Ａに記載）と比較した。
変異体９Ｂ８ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎを含む大腸菌（E. coli）溶解物を作製し、アッセイ緩衝液が０．１％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）を含有する以外は前に記載した通りに分析した。新規ＰＢＩ−３９３９および天然セレンテラジンを基質として用いて、溶解物から発せられた発光を測定した。ＰＢＩ−３９３９および天然セレンテラジンに対する変異体の相対的特異性を、前に記載した通りに算出した。９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（「Ｋ３３Ｎ」）は、９Ｂ８ｏｐｔと比較した場合、より大きな光出力（ＲＬＵ）、および天然セレンテラジンに対してよりもＰＢＩ−３９３９に対してより大きな相対的特異性を有した（図２９）。このことは、Ｋ３３Ｎ置換がより大きな光出力および向上した相対的特異性を提供したことを示している。
９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎを開始テンプレートとして用いて、新しいＯｇＬｕｃライブラリーを作製した。ＤＩＶＥＲＳＩＦＹ（登録商標）ＰＣＲ無作為変異誘発キット（クロンテック社；カタログ番号６３０７０３）を用いて、無作為なライブラリーを作製した。条件５（ユーザマニュアル中に列挙される）を使用して追加の変異体を生成し、８３個の無作為に選択したクローンから得た配列データを集計することによって平均突然変異率を算出した結果、遺伝子あたり２．６個の変異であった。このＰＣＲライブラリーを、前に記載したｐＦ４Ａｇベースの非融合型ベクターバックグラウンド（non-fusion vector background）、およびサンドイッチ型バックグラウンド（sandwich background）、すなわち、Ｉｄ−ＯｇＬｕｃ−ＨＴ７（実施例４５に記載）にクローニングした。ｐＦ４Ａｇベースの非融合型ベクターバックグラウンドにおける変異体を、（ＮＦ）を用いて設計した。サンドイッチ型ベクターバックグラウンドにおける変異体を、（Ｆ）を用いて設計した。両方のベクターにＰＣＲ産物をクローニングするために、アミノ酸、すなわちグリシンを、ｐＦ４Ａｇにおける変異体配列に付加し、ＯｇＬｕｃ変異体（「１７０Ｇ」）に新しい１７０位を生成した。１７０Ｇはサンドイッチ型コンストラクトに存在するが、この場合、ＯｇＬｕｃとＨＴ７の間のリンカーの部分であるとみなされる。各ライブラリーについて、４，４００種の大腸菌（E. coli）クローンを、以下の例外を除き前に記載した通りに、分析した。溶解緩衝液は、ＨＥＰＥＳの代わりの３００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、および０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）を含有したが、チオ尿素は含有しなかった。アッセイ緩衝液は、ＨＥＰＥＳの代わりの１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、および３５ｍＭ チオ尿素を含有した。アッセイにおける体積（assay volume）は以下の通りであった：１０μＬの細胞、４０μＬの溶解緩衝液、および５０μＬのアッセイ緩衝液。
ｐＦ４Ａｇベースの非融合型バックグラウンドにおけるＰＣＲライブラリーを、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋１７０Ｇ（配列番号６８および６９）と比較した場合に増加した発光を有する追加の変異体を求めてスクリーニングした。その後、選択された変異体を、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞において分析した。各細胞型について、１５，０００個の細胞を播種し、３７℃で一晩増殖させた。その次の日に、実施例２５に記載される通りに、細胞に、形質移入の対照としての１０ｎｇのｐＧＬ４．１３（プロメガ社）、および１００ｎｇのＯｇＬｕｃ試験ＤＮＡを形質移入した。培地を除去し、溶解緩衝液がＨＥＰＥＳの代わりに１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を含有する以外は実施例２５に記載される通りに、１００μＬの溶解緩衝液で細胞を溶解させ、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターを用いて発光を測定した。各試料について、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する５０μＬの溶解緩衝液を用いて、１０μＬの溶解物を分析した。形質移入対照については、５０μＬのＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）アッセイ試薬を用いて、１０μＬの溶解物を分析した。
表９は、大腸菌（E. coli）、ＨＥＫ２９３細胞、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞における変異体の発光においての増加倍率、並びにこれらの変異体に存在するアミノ酸置換を示している。変異体２７Ａ５（ＮＦ）（配列番号７０および７１）、２３Ｄ４（ＮＦ）（配列番号７２および７３）および２４Ｃ２（ＮＦ）（配列番号７４および７５）は、大腸菌（E. coli）およびＨＥＫ２９３細胞における発光において、少なくとも１．３倍の増加があった。
表９：大腸菌（E. coli）、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞における、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋１７０Ｇと比較した場合のＯｇＬｕｃ変異体により発せられる発光の増加
上記のデータに基づいて、さらなる組み合わせ変異体（combination variant）を、１７０Ｇを持たないｐＦ４Ａｇベースの非融合型ベクターバックグラウンドの背景において、設計し、作製した（表１０参照）。変異体を、上記の通りに、大腸菌（E. coli）、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞において分析し、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎと比較した。天然セレンテラジンを用いた場合の発光についても、変異体を試験した。表１０は、大腸菌（E. coli）、ＨＥＫ２９３細胞、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞における変異体の発光においての増加倍率、並びにこれらの変異体（「試料」）に存在するアミノ酸置換を示している。接頭辞「９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ」に、変異体における追加のアミノ酸置換を加えることにより、変異体を命名した。表１１は、大腸菌（E. coli）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＨＥＫ２９３細胞においての、天然セレンテラジンと比較した場合のＰＢＩ−３９３９に対する異なる変異体の相対的特異性を示している。表１０に示されるように、変異体９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ（「Ｖ２」；配列番号９２および９３）は、大腸菌（E. coli）における向上した発光、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞における発光においてのわずかな向上を有した。変異体９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ（「Ｌ２７Ｖ、Ｋ４３Ｒ、Ｙ６８Ｄ」）は、試験された３種の細胞型において、発光における中間の向上（表１０）、および９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（表１１）を超える、相対的特異性における５倍の増加を有した。
表１０：大腸菌（E. coli）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨＥＫ２９３細胞における、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎと比較した場合のＯｇＬｕｃ組み合わせ変異体により発せられる発光における増加
表１１：大腸菌（E. coli）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨＥＫ２９３細胞における、天然セレンテラジンと比較した場合の、ＰＢＩ−３９３９に対するＯｇＬｕｃ組み合わせ変異体の相対的特異性における変化
追加のＯｇＬｕｃ変異体を、配列番号１に対し以下：Ｌ２７Ｖ、Ｔ３９Ｔ、Ｋ４３Ｒ、Ｙ６８Ｄ、またはＳ６６Ｎの追加のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを含有するように、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎから作製した（変異体におけるアミノ酸置換に関する表１２の「試料」を参照）。接頭辞「９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ」の後ろに変異体における追加のアミノ酸置換を加えることにより、変異体を命名した。上記から得られた、これらの追加の変異体並びに変異体９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｙ６８Ｄ（「Ｌ２７Ｖ、Ｙ６８Ｄ」）、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ（「Ｌ２７Ｖ、Ｋ４３Ｒ、Ｙ６８Ｄ」）、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｓ６６Ｎ（「Ｌ２７Ｖ、Ｋ４３Ｒ、Ｓ６６Ｎ」）、および９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ（「Ｔ３９Ｔ、Ｋ４３Ｒ、Ｙ６８Ｄ」；「Ｖ２」としても知られている）を、輝度、相対的特異性、シグナル安定性および熱安定性について試験した。変異体を、変異体９Ｂ８ｏｐｔ（「９Ｂ８」）および９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（「Ｋ３３Ｎ」）に対して、比較した。
変異体を含有する大腸菌（E. coli）溶解物を作製し、前に記載した通りに分析した。新規ＰＢＩ−３９３９および天然セレンテラジンを基質として用いて溶解物から生じた発光を測定した。９Ｂ８ｏｐｔにより発せられた発光に対して変異体の発光を正規化した（表１２）。ＰＢＩ−３９３９および天然セレンテラジンに対する変異体の相対的特異性を、ＰＢＩ−３９３９を基質として用いた場合の変異体の発光を、天然セレンテラジンを基質として用いた場合の変異体の発光で除算することにより算出した（表１２）。このデータは、アミノ酸置換Ｌ２７Ｖが天然セレンテラジンに対する特異性を低減させることを示している。
表１２：細菌溶解物における、９Ｂ８と比較した場合のＯｇＬｕｃ変異体により発せられる発光の増加、および天然セレンテラジンと比較した場合のＰＢＩ−３９３９に対するＯｇＬｕｃ変異体の特異性における変化
Ｈ． Ｖ２変異体
Ｖ２（追加のアミノ酸置換Ｋ３３Ｎ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄを有する９Ｂ８ｏｐｔ）をテンプレートとして用いて、一連の追加の変異体を設計した。表１３に示される置換を、１）２８の脂肪酸結合タンパク質（１ＶＹＦ、１ＦＤＱ、２Ａ０Ａ、１Ｏ８Ｖ、１ＢＷＹ、２ＡＮＳ、１ＶＩＶ、１ＰＭＰ、１ＦＴＰ、２ＨＮＸ、１ＪＪＪ、１ＣＢＲ、２ＣＢＳ、１ＬＰＪ、１ＫＱＷ、２ＲＣＱ、１ＥＩＩ、１ＣＲＢ、１ＩＦＣ、２ＰＹＩ、２ＪＵ３、１ＭＶＧ、２ＱＯ４、１Ｐ６Ｐ、２ＦＴ９、１ＭＤＣ、１Ｏ１Ｕ、１ＥＩＯ；米国特許出願公開第２０１０／０２８１５５２号参照）の構造に基づく整列による既知の多様性、または、２）基質特異性において役割を果たすことが以前に特定された位置での、代替的な残基の探索のいずれかに基づいて設計した。表１３の「コンセンサス」の下に列挙される変化は、整列された上記脂肪酸結合タンパク質のうち少なくとも５０％において特定された残基に関する。「主な少数派」の下に列挙される変化は、上記脂肪酸結合タンパク質の多くで特定されたが、整列された配列のうち５０％未満にしか存在しなかった残基に関する。「他」の下に列挙される変化は、整列された配列における所与の位置で、主な少数派の残基より少ない頻度で特定された残基に関する。最後に、「特異性」の下に列挙される変化は、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体に対する変異体の特異性を決定することに関わると思われる位置に関する。例えば、２７位（親配列、すなわちＶ２におけるロイシン残基）での設計された特異性変化は、代替的な化学的性質を表す他の疎水性残基またはアミノ酸（例えば、環を含有する他の疎水性残基、無電荷の極性側鎖を含有する残基、または荷電側鎖含有する残基）に変化され；４０位（親配列におけるプロリン）での設計された特異性変化は、異なる化学的性質（化学的性質（例えば、環を含有する他の疎水性残基、無電荷の極性側鎖を含有する残基、または荷電側鎖含有する残基）の試料採取に変化され；注目すべきことに、グリシン、グルタミン、イソロイシン、およびロイシンがこの位置、整列された脂肪酸結合タンパク質で特定されることである）。
表１３
標準的な部位特異的変異誘発プロトコル（先の実施例を参照）を用いて変異体を構築し、得られたプラスミドは、分析のために、大腸菌（E. coli）の中に、変換された。培養物を、前に記載した通りに、最少培地中で標準的なウォーク・アウェイ誘導（walk away induction）によって増殖させた。培養され、形質転換された大腸菌（E. coli）細胞１０μＬに、４０μＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．３Ｘ ＰＬＢ、０．３ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、０．００３Ｕ／μＬ ＲＱ１デオキシリボヌクレアーゼＩおよび０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ））を加え、その後、等量の（５０μＬ）のアッセイ試薬（１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９または天然セレンテラジン、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３５ｍＭ チオ尿素、および０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ））を追加で加えた。発光を、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６マイクロプレートルミノメーター（プロメガ社）で測定した。
表１４は、分析中に特定された異なるアミノ酸置換をまとめたものである。ＰＢＩ−３９３９および天然セレンテラジンの両方について測定された発光に関して、データは、親クローン（Ｖ２）に対して正規化されたように、提示される。天然セレンテラジンに関して、ＰＢＩ−３９３９に対する特異性における相対変化もまた示される。
表１４
Ｉ． Ｌ２７Ｖ変異体
ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖを開始テンプレート、すなわち開始配列または親配列として用いて、Ｌ２７Ｖ変異体におけるアミノ酸のいくつか（表１５）が配列番号１の天然ＯｇＬｕｃルシフェラーゼに存在するアミノ酸に戻った追加の変異体を作製した。変異体を前に記載した通りに、部位特異的変異誘発によって構築した。その後変異体を、天然セレンテラジンまたはＰＢＩ−３９３９のいずれか用いる相対活性について先に記載した通りに、スクリーニングした。基質／アッセイ試薬（Ｈに記載）を加えた５分後に、発光をＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００で測定し、Ｌ２７Ｖ変異体開始テンプレートに対して正規化した。溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、比較できる発現レベルを示している（データ未記載）。
表１５は、天然セレンテラジンまたはＰＢＩ−３９３９を用いた場合の、Ｌ２７Ｖ変異体の相対活性を示している。１未満の相対活性は、Ｌ２７Ｖ変異体におけるその部位の残基と比較した場合に、その復帰変異が有害であることを示している。１を超える相対活性は、Ｌ２７Ｖ変異体におけるその部位の残基と比較した場合に、その復帰変異が活性に対し都合が良いことを示している。これらの変異体に関するいくつかの追加のデータは、以下を示した。１６６Ｋ、５４Ｆ、５４ＡおよびＬ２７Ｖを熱安定性について試験した。１６６Ｋ、５４Ｆ、および５４ＡのＴ1/2６０℃は、それぞれ８７、７４、および３３％であった。このことは、これらの置換が熱安定性における低減を引き起こすことを示している。これらの同一の４つの変異体のＫｍ値は以下であった。天然セレンテラジンについては、Ｌ２７Ｖは１６μＭであり、５４Ａは２３μＭであり、５４Ｆは４０μＭであり、１６６Ｋは２１μＭであった。ＰＢＩ−３９３９については、Ｌ２７Ｖは１８μＭであり、５４Ａは６２μＭであり、５４Ｆは１６３μＭであり、１６６Ｋは２３μＭであった。このことは、Ｌ２７Ｖに対する、特に５４位の置換に対するより高い基質親和性を示している。
表１５
実施例２３. １６６位の変異解析
Ａ． １６６位の異なるアミノ酸の、ルシフェラーゼ活性に対する影響を評価するために、１６６位のアルギニン（Ｒ）残基を、ｐＦ４Ａｇベクターの背景において（すなわち、野生型ＯｇＬｕｃ配列（配列番号１）の背景において）先に記載した通りの部位特異的変異誘発を用いて、その他の１９の各アミノ酸に置換した。その後これらの１６６位変異体を、前に記載した通りに大腸菌（E. coli）において発現させた。
溶解物を作製するため、５０μＬの０．５×ＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）細胞溶解試薬（プロメガ社）を、９５０μｌの誘導された培養物に加え、混合物を２２℃で３０分間インキュベートした。解析のために、１００μＭ ＰＢＩ−３９３９、３０μＭ 天然セレンテラジン、または２２μＭ セレンテラジン−ｈのいずれかを含有する５０μＬのアッセイ試薬（先に実施例２２Ｈで記載）の中で、５０μＬの溶解物を分析した。発光を前に記載した通りに測定した（図３０Ａ〜Ｃ）。図３０Ａ〜Ｃは、Ｎ１６６変異体の相対活性を示している。ウェスタン分析により、全ての変異体の比較できる発現が確認された（データ未記載）。
Ｂ． 特定の１アミノ酸置換、Ｌ２７Ｖ、Ａ３３Ｎ、Ｋ４３Ｒ、Ｍ７５Ｋ、Ｔ３９Ｔ、Ｌ７２ＱおよびＦ６８Ｄを、野生型ＯｇＬｕｃまたはＮ１６６Ｒバックグラウンドにおいて評価した。１アミノ酸置換を前に記載した通りの部位特異的変異誘発によって生成し、前に記載した通りに大腸菌（E. coli）において発現し、２２μＭ 天然セレンテラジンを含有するアッセイ試薬（実施例２２Ｈに先述）を用いて発光を測定した（図３０Ｄ）。ウェスタン分析により、全ての変異体の比較できる発現が確認された（データ未記載）。
実施例２４． 欠失変異体
以下のような欠失がＬ２７Ｖ変異体に対してなされた：
表１６
ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７ＶのＮ末端は、メチオニン、バリンおよびフェニルアラニン、すなわち、ＭＶＦである。番号付けの目的のために、フェニルアラニンを最初のアミノ酸と見なした。「Ｖａｌ−１」は、「ＭＶＦ」におけるバリンが欠失されたことを表す。「ＭＶＦ」のメチオニンは、これらの欠失に含まれた。Ｌ２７欠失変異体を、前に記載した通りに、ｐＦ４Ａｇベクターにクローニングし、大腸菌（E. coli）ＫＲＸ細胞において発現させた。記載のように、誘導および溶解物調製を行い、溶解物をアッセイ試薬（前述；１００μＭ ＰＢＩ−３９３９）を用いて分析し、発光を前に記載した通りに測定した（図３１）。データは、ＯｇＬｕｃ変異体のより小さな断片も発光を生じさせることがきることを示している。
実施例２５． ＯｇＬｕｃ変異体のコドン最適化
Ａ． ＩＶおよび９Ｂ８
ＩＶおよび９Ｂ８ ＯｇＬｕｃ変異体を、コドン最適化のためのテンプレートとして使用した。目的は、当業者には理解されるように、二重にあり、すなわち、１）ＯｇＬｕｃ変異体の調節または発現を強力に干渉し得る、既知の転写因子結合部位、または他の制御配列、例えば、プロモーターモジュール、スプライス供与／受容部位、スプライスサイレンサー、コザック配列、およびポリＡシグナルを除去すること、並びに、２）まれにしか使用されないコドンを除去し、大腸菌（E. coli）、ヒト、他の哺乳類、または他の真核生物の細胞において最も多く使用されるコドンを好むように、（タンパク質配列を変更しないサイレント変異によって）ＤＮＡ配列を変更すること、である（Wada et al., Nucleic Acids Res., 18:2367 (1990)）。
ｏｐｔ（ａｋａ ｏｐｔＡ）およびｏｐｔＢと称される、ＩＶおよび９Ｂ８に対する２つの異なる最適化された配列を、各変異体に対して設計した。各変異体に対する最初の最適化された配列、すなわちｏｐｔ／ｏｐｔＡを、各部位に対する２つの最良の、すなわち最も一般的な、ヒトコドン（表１７参照）を特定し、その後、各部位での取り込みのためにその２つのうち１つを無作為に選ぶことによって、設計した。ｏｐｔＢバージョンのために、先の、コドン使用頻度最適化型、すなわちｏｐｔ／ｏｐｔＡを開始テンプレートとして用い、各コドンを、このコドン最適化戦略のために特定された前記２つの最良のヒトコドンのうちのもう一方で置き換えた。一例として、ＩＶまたは９Ｂ８のいずれかの配列の３位にあるロイシンは、コドンＴＴＧによってコードされる。ＴＴＧは、ヒト細胞のロイシンに対する前記２つの最も一般的なコドンのうちの１つではないため、該コドンを、ロイシンに対する代替的な、より一般的なコドン、ＣＴＣ（ｏｐｔ／ｏｐｔＡ）またはＣＴＧ（ｏｐｔＢ）に変更した。これと同じ方法を配列中の全てのロイシンに対して繰り返し、アプローチの無作為性のため、最終的に、ＣＴＣコドンはｏｐｔＢになることができ、ＣＴＧはｏｐｔＡになることができた。最適化への、この２つのコドン使用頻度アプローチのために、配列ｏｐｔ／ｏｐｔＡおよびｏｐｔＢは、最大限にコドンが異なっていた。
表１７：コドン最適化に使用されたコドン
その後、それぞれの４つの配列（ＩＶｏｐｔ、ＩＶｏｐｔＢ；９Ｂ８ｏｐｔ、９Ｂ８ｏｐｔＢ）を、転写因子結合部位または上記のような他の制御配列の有無について分析し（ゲノマティクスソフトウェア社（Genomatix Software）、ドイツ）、これらの望ましくない配列を、サイレントなヌクレオチド変更によって壊した。ヒトおよび大腸菌（E. coli）の両方について、まれではないコドンが他に存在したいくつかの場合では、たとえそれらが選択＃１でも選択＃２でもないが、これらのコドンのうちの１つを変更することによって、転写因子結合部位または他の調節要素を除去した（表１８参照）。転写因子結合部位または他の調節要素の除去にまれなコドンの導入が関与した場合には、転写結合部位（または他の調節要素）は、通常変更されなかった。
表１８：転写結合部位および他の調節要素を除去するために使用された追加のコドン
ＩＶのコドン最適化型（「ＩＶｏｐｔ」（配列番号２２）および「ＩＶｏｐｔＢ」（配列番号２３））および９Ｂ８（「９Ｂ８ｏｐｔ」（配列番号２４）および「９Ｂ８ｏｐｔＢ」（配列番号２５））を、生成し、当該技術分野において周知の方法により、ｐＦ４Ａｇにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞を１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩増殖させた。次の日、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴ１形質移入試薬（ミラスバイオ社（Mirus Bio））を用いて、細胞に、ｐＦ４Ａｇ中にコドン最適化型をコードする１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、６連のウェル中で一過的に形質移入し、３７℃で一晩増殖させた。ＨＥＫ２９３細胞に、ＧＬ４．１３（Ｌｕｃ２／ＳＶ４０）（Paguio et al., “pGL4 Vectors: A New Generation of Luciferase Reporter Vectors” Promega Notes, 89:7-10 (2005)）またはｐＧＬ４．７３（ｈＲＬ／ＳＶ４０）（同著）のいずれかも形質移入し、形質移入効率における差異に対して正規化した。１０ｎｇ／形質移入または全導入ＤＮＡの１０％が使用された。培地を除去し、細胞を、１０ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、３５ｍＭ チオ尿素、および０．５％ ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）を含有する１００μＬの溶解緩衝液で溶解させて、溶解物試料を作製した。溶解物試料の発光をＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００ルミノメーターで以下のように測定した：ｈＲＬおよびＯｇＬｕｃ変異体について、１０μＬの溶解物試料を、２０μＭの基質（ｈＲＬに対しては天然セレンテラジン、そしてＯｇＬｕｃ変異体に対してはＰＢＩ−３９３９）を含有する５０μＬの溶解緩衝液を用いた場合の発光について分析した。ホタルルシフェラーゼであるＬｕｃ２（配列番号２８および２９）については、１０μＬの溶解物試料を、５０μＬのＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）を用いた場合の発光について分析した。
図３２は、ＯｇＬｕｃ変異体のコドン最適化型を含有する溶解物について測定された発光の、ｈＲＬおよびＬｕｃ２との比較を示している。当該技術分野において周知の方法を用いて、ｈＲＬおよびＯｇＬｕｃ変異体はｐＧＬ４．１３に対して正規化し、Ｌｕｃ２はｐＧＬ４．７３に対して正規化した。図３２に示されるように、Ｌｕｃ２はｈＲＬよりもおよそ１４倍より高い発光を有した。ＯｇＬｕｃ変異体はＬｕｃ２およびｈＲＬと比較してより高い発光を有した。ＩＶのコドン最適化型（「ＩＶｏｐｔ」および「ＩＶｏｐｔＢ」）および９Ｂ８（「９Ｂ８ｏｐｔ」）は、非最適化型と比較して、増加した発光を示した。
この最適化の結果、「ｏｐｔ／ｏｐｔＡ」バージョンは、ヒトＨＥＫ２９３細胞において、それらの親配列よりもより良好に発現されたが、一方で、「ｏｐｔＢ」バージョンは、親配列と比較して、ＨＥＫ２９３細胞において同様には発現されなかった。
Ｂ． Ｌ２７Ｖ
Ｌ２７Ｖ変異体（配列番号８８）を最適化して、一般的な脊椎動物応答要素（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘデータベースにあるあらゆる転写因子結合部位（ＴＦＢＳ））の発生頻度を最小化した。Ｌ２７Ｖ変異体の３つの差異について最適化型を作製した：
１． Ｌ２７Ｖ０１−バージョン１（配列番号３１９）
個々のＴＦＢＳを除いて、プロモーターモジュールおよび他の全ての望ましくない配列要素（以下に追加の詳細）をヌクレオチド置換によって除去した。
２． Ｌ２７Ｖ０２−バージョン２
Ｌ２７Ｖ０１を開始配列、すなわち親配列として使用し、高い厳密性の一致基準を用いて、多くのＴＦＢＳを可能な限り除去した（より高い厳密性は結合部位へのより良い一致に関与し、従って、より低い厳密性よりもより少ない一致しか発見しない）。Ｌ２７Ｖ０２に対して作製された、Ａ（配列番号３２２）＆Ｂ（（配列番号３１８））という２つのバージョンがあった。これら２つのバージョンは、望ましくない配列要素を除去するために、各バージョンに対して、異なるコドンを選択することによって作製された。より低い厳密性でＴＦＢＳを探索することにより、両方のバージョンを分析した。
３． Ｌ２７Ｖ０３−バージョン３（配列番号３２５）
Ｌ２７Ｖ０２Ｂ（配列番号３１８）を開始配列として使用した。より低い厳密性のＴＦＢＳ一致を、可能であれば除外した。Ｌ２７Ｖ０３を、Ｌ２７Ｖ０２Ａとはコドンが非常に異なるように、作製した。
Ｌ２７Ｖ最適化変異体を作製するのに、以下の基準を用いた：
１． コドン使用頻度：好ましくは、最良の２つのヒトコドンを各アミノ酸に対して使用し（ＩＶ 変異体に対して行ったように）、まれなヒトコドン（ＨＳ；アミノ酸の１０％未満をコード）の使用は避けた（表１９）。まれな大腸菌（E. coli）コドン（ＥＣ）の使用は、望ましくない配列要素を除去するために、必要な場合に、用いた。
表１９
２． 可能であれば除去された望ましくない配列要素
Ａ． 制限酵素（ＲＥ）部位：クローニングに有用ではあるが、その他の点では読み取り枠（ＯＲＦ）中に存在するべきではないＲＥ部位を除去した。
Ｂ． 真核生物配列要素：（＋）ｍＲＮＡ鎖中の、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、スプライスサイレンサー、コザック配列並びにポリＡ配列を除去した。
Ｃ． 脊椎動物プロモーターモジュール（ＰＭ）（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ分類中：脊椎動物）を除去した。
Ｄ． 脊椎動物ＴＦＢＳ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ分類中：脊椎動物、一般的なコアプロモーター要素、および種々の他の配列）を可能であれば除去した。これは、Ｌ２７Ｖ最適化型２および３にだけ適用され、バージョン１には適用されなかった。
Ｅ． 大腸菌（E. coli）配列要素：大腸菌（E. coli）プロモーターを除去した。
Ｆ． ｍＲＮＡ二次構造：５’末端付近の強固な二次構造（高いｍＲＮＡ折り畳みエネルギー）（Zuker, Nucleic Acid Res. 31(13): 3406-3415 (2003)）および他の強固なヘアピン構造を除去した。
配列比較、対配列同一性パーセントが、表２０に提供される（「（）」はヌクレオチド差異の数を表す）。
表２０
実施例２６． ＯｇＬｕｃ変異体のシグナル安定性
Ａ． １５Ｃ１、９ＢおよびＩＶ
ＰＢＩ−３９４５を用いた場合の１５Ｃ１のシグナル安定性、並びにＰＢＩ−３８８９を用いた場合の９Ｂ８のシグナル安定性を測定し、ＩＶと比較した。１５Ｃ１、９Ｂ８、またはＩＶをコードするプラスミドＤＮＡを含む大腸菌（E. coli）を、８連で、増殖させて、前に記載した通りに誘導した。細胞を、３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、０．３×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（「ＰＬＢ」；プロメガ社カタログ番号Ｅ１９４Ａ）、０．３ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、および０．００３Ｕ／μＬ ＲＱ１ デオキシリボヌクレアーゼを含有する溶解緩衝液を用いて溶解させた。溶解物を溶解緩衝液中で１：１０００に希釈し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００ルミノメーターを用いて発光を測定した。１０μＬの希釈溶解物試料に、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ チオ尿素、０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、および２０μＭの新規セレンテラジンＰＢＩ−３９４５またはＰＢＩ３８８９のいずれかを含有する５０μＬの「Ｇｌｏ」０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬアッセイ緩衝液（「０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ」）を添加した直後に、測定を行った。
試料にアッセイ緩衝液を添加した後、ある期間にわたって３０秒毎にプレートを再読み取りすることによって、変異体のシグナル安定性を決定した。当該技術分野において周知の方法を用いて、これらの測定から、シグナル半減期を決定した。平均シグナル半減期を、変異体とＩＶの間で比較した。１５Ｃ１および９Ｂ８の両方が少なくとも３０分のシグナル半減期を有した（図３３）。ＰＢＩ−３９４５を用いて分析された１５Ｃ１は、ｔ＝０でより高い発光を有したが、そのシグナルは、ＰＢＩ−３８８９を用いて分析された変異体９Ｂ８よりも、より急速に減衰した。ｔ＝１０分で、ＰＢＩ−３９４５を用いた場合の１５Ｃ１の発光と、ＰＢＩ−３８８９を用いた場合の９Ｂ８の発光は同等であった。
Ｂ． ９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ
９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ変異体のシグナル安定性を試験した。変異体を含有する大腸菌（E. coli）溶解物を調製し、アッセイ緩衝液が０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ チオ尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、および２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する以外は前に記載した通りに、分析した。表２２は、変異体のシグナル半減期を分単位で示しており、アミノ酸置換Ｌ２７Ｖがシグナル安定性を向上させることを示している。
表２２：細菌溶解物におけるＯｇＬｕｃ変異体のシグナル安定性
Ｌ２７Ｖ変異体（９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ；配列番号８８および８９）のシグナルの活性および安定性を測定し、ホタル（Ｌｕｃ２）ルシフェラーゼおよびウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼのそれと比較した。Ｌ２７Ｖ変異体、Ｌｕｃ２ルシフェラーゼおよびウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼを、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）に融合し、大腸菌（E. coli）で発現させた。前記ルシフェラーゼを、製造業者のプロトコル（ｐＦＮ１８Ａ；ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質精製系）に従って、精製標識としてＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を用いて精製した。１０ｐＭの各精製ルシフェラーゼ（０．０１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）を含有するフェノールレッドを含まないＤＭＥＭで希釈）を、次に等量のアッセイ試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、３５ｍＭ チオ尿素、０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、並びにＬ２７Ｖ変異体に対する１００μＭ ＰＢＩ−３９３９；ホタルルシフェラーゼに対するＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社）；およびウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼに対するＲＥＮＩＬＬＡ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社））と混合し、経時的に（３分、１０分、２０分、３０分、４５分および６０分）、発光をモニターした。図３４Ａ〜Ｂは、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと比較した場合の、Ｌ２７Ｖ変異体の高い比活性（図３４Ａ）およびシグナル安定性（図３４Ｂ）を示している。
実施例２７． ＯｇＬｕｃ変異体の酵素動態
Ａ． ＩＶ、１５Ｃ１、９Ｂ８、９Ｆ６および９Ａ３
当該技術分野において周知の方法を用いて、ＩＶ並びにＩＶ変異体の１５Ｃ１、９Ｂ８、９Ｆ６、および９Ａ３を含有する大腸菌（E. coli）の溶解物を用いて、発光を測定する酵素反応動態アッセイを行った。溶解緩衝液がｐＨ７．５である以外は実施例２６に記載の通りに、細胞を誘導し、溶解させ、希釈した。先に実施例２６に記載されるアッセイ緩衝液におけるＰＢＩ−３９３９の２倍連続希釈液を、希釈溶解物を用いて、アッセイした。図３５は、ＩＶと、変異体１５Ｃ１、９Ｂ８、９Ｆ６、および９Ａ３の双曲線の一致を用いて算出されたＫｍおよびＶｍａｘの値を示している。変異体９Ｂ８および９Ｆ６は、ＩＶと比較してより高いＫｍ値を有したが、他の変異体のＫｍ値は変化が無かった。ＩＶと比較した場合に、変異体１５Ｃ１、９Ｂ８、および９Ｆ６は全てより高いＶｍａｘ値を有したが、８Ａ３はより低いＶｍａｘ値を有した。
１５Ｃ１は、アミノ酸置換Ｋ３３Ｎを含有するＰＢＩ−３９４５を用いた場合に最も高い発光を有したが、このことは、Ｋ３３Ｎが増加した発光を提供したことを示している。９Ｂ８変異体を、この追加の置換を有するように作製し、この変異体に発光の向上を与えた。９Ｂ８および９Ｆ６の追加の変異体を、アミノ酸置換Ｋ３３ＮまたはＶ３８Ｉ（「９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ＋Ｖ３８Ｉ」および「９Ｆ６＋Ｋ３３Ｎ」）のうち少なくとも１つを有するように作製した。光出力および安定性の増加に対する、６８位、７２位、および７５位でのアミノ酸置換の重要性を強調するために、変異体１Ｄ６を使用した。図３６は、ＩＶと、変異体９Ｂ８、９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ＋Ｖ３８Ｉ、９Ｆ６、９Ｆ６＋Ｋ３３Ｎ、および１Ｄ６の双曲線当てはめ用いて算出されたＫｍおよびＶｍａｘ値を示している。実際のＫｍ値は、９Ｂ８および９Ｆ６に関して、図３５と図３６の間で異なっているが、変異体間の全体的な傾向は一貫していた。
変異体９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎについての酵素動態、すなわちＶｍａｘおよびＫｍの値を、大腸菌（E. coli）溶解物が、１ｍＭ ＣＴＤＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３５ｍＭ チオ尿素、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、１０ｍｇ／ｍＬ ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、および２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する緩衝液を用いてアッセイされる以外は上記の通りに、決定し、比較した。発光を、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００ルミノメーターで測定した。図３７に示されるように、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３ＮのＶｍａｘおよびＫｍの値は、９Ｂ８ｏｐｔよりもより高く、このことは、このクローンがより明るく、基質に対してより低い親和性を有することを示している。
Ｂ． ９Ｂ８ＯＰＴ＋Ｋ３３Ｎ変異体
ＯｇＬｕｃ変異体の酵素動態の値を、発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターを用いて測定した以外は前に記載した通りに決定した。各変異体に対して、３連を用いた。表２３は、ＨＹＰＥＲ．ＥＸＥ、バージョン１．０を用いて算出した、平均Ｋｍ値および平均Ｖｍａｘ値を、標準偏差（それぞれ「Ｋｍ（＋／−）」および「Ｖｍａｘ（＋／−）」）と共に示している。
表２３：ＯｇＬｕｃ変異体のＶｍａｘ（ＲＬＵ／０．５秒）およびＫｍ（μＭ）の値
実施例２８． ＯｇＬｕｃ変異体のタンパク質安定性
ルシフェラーゼタンパク質の安定性は発光に影響を及ぼす別の因子であるため、変異体のタンパク質安定性、すなわち熱安定性が決定された。
Ａ． １５Ｃ１、９Ｂ８、９Ｆ６、８Ａ３およびＩＶ
１５Ｃ１、９Ｂ８、９Ｆ６、８Ａ３またはＩＶを含む大腸菌（E. coli）およびｈＲＬ（配列番号３０および３１）を発現する大腸菌（E. coli）の溶解物を、前に記載した通りの誘導された培養物から調製した。溶解物試料を、０．１％ゼラチンと共に１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液で１：１０００に希釈した。希釈された溶解物（１００μＬ）試料を、レプリケート９６ウェルプレート中で、５０℃でインキュベートした。異なる時点で、プレートを−７０℃（マイナス７０摂氏温度）に置いた。前に記載した通りに発光を測定する前に、各プレートを室温すなわち２２℃で１０分間解凍した。試料（１０μＬの各解凍試料）を、天然セレンテラジンを基質として用いてアッセイした。各時点のプレートにアッセイ緩衝液を添加した直後に発光を測定した。タンパク質の半減期は、タンパク質安定性を示すものであったが、これは当該技術分野において周知の方法を用いて各時点の発光データから算出された。
表２４は、分（時間）単位でそれぞれ６３０．１（１０．５）、３４６．６（５．８）、７７０．２（１２．８）および６５．４（１．１）の半減期を有する変異体１５Ｃ１、９Ｂ８、９Ｆ６、および８Ａ３のタンパク質安定性を示している。比較すると、ｈＲＬは９．６分の半減期を有し、一方でＩＶは２７．２分の半減期を有した。表２４はまた、４時間の時点で、１５Ｃ１、９Ｂ８、および９Ｆ６それぞれの７９％、６１％、および８０％が活性状態を維持していたことを示している。
表２４：５０℃でのＯｇＬｕｃ変異体のタンパク質安定性
Ｂ． １Ｄ６、９Ｂ８、９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ＋Ｖ３８Ｉ、９Ｆ６、９Ｆ６＋Ｋ３３Ｎ、およびＩＶ
１Ｄ６、９Ｂ８、９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ＋Ｖ３８Ｉ、９Ｆ６、９Ｆ６＋Ｋ３３Ｎ、またはＩＶを含む大腸菌（E. coli）の溶解物を、前に記載した通りに、誘導された培養物から調製し、発光についてアッセイした。溶解物のタンパク質安定性、すなわち熱安定性を、本実施例中の上記の通りにアッセイした。図３８は、インキュベーション期間の開始時点、すなわちｔ＝０で天然セレンテラジンを基質として用いて測定された、５０℃での変異体の分（分）単位の半減期、および試料の発光を示している。変異体９Ｂ８＋３３＋３８と９Ｆ６の差異は、１つのアミノ酸置換、Ｌ２７Ｖであったが、このことは、このアミノ酸置換が安定性を増加させたことを示している。６８位、７２位、および７５位における「活性／発現」置換の付加が、安定性を増加させた。図３８は、Ｋ３３Ｎがより大きな熱安定性を変異体９Ｆ６に与えたこと、並びに変異体９Ｂ８が変異体１Ｄ６よりもより大きな光出力および安定性を有したことを示している。これら２つの変異体の差異、すなわち、９Ｂ８が追加のアミノ酸置換Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを有していることは、これら３つの置換の重要性を示すものである。
熱安定性に加えて、発現、安定性、および溶解性により決定される構造的完全性もまた、発光に影響を及ぼし得る。改善された変異体の構造的完全性をさらに試験するする手段として、ｐＦ４Ａｇベースの（すなわち、ＨＴ７無し）ＯｇＬｕｃ変異体Ｎ１６６Ｒ（米国特許仮出願番号第１２／７７３，００２号（米国特許出願公開第２０１０／０２８１５５２号）において先に記述される）、Ｃ１＋Ａ４Ｅ、ＩＶ、９Ｂ８、および９Ｆ６を含むＫＲＸ大腸菌（E. coli）を、ルリアブロス培地（ＬＢ）中３７℃で、ＯＤ600＝０．６まで増殖させ、その後ラムノース（０．２％最終濃度）の添加により過剰発現を誘導した。２連で誘導された培養物を、次に２５℃または３７℃のいずれかで１７時間増殖させ、その時点で、全画分（Ｔ）および可溶性画分（Ｓ）を調製し、ゲルを染色するのにＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（インビトロジェン社）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図３９Ａ〜Ｂ）。ｈＲＬおよびＬｕｃ２を、対照として使用した。
２５℃で誘導が起こったとき、ＯｇＬｕｃ変異体、ｈＲＬおよびＬｕｃ２は、十分に発現され、可溶性であった（図３９Ａ；Ｎ１６６Ｒ変異体を除くＯｇＬｕｃ変異体の「可溶性」画分におけるおよそ１９ｋＤａの暗いバンド、並びにｈＲＬおよびＬｕｃ２それぞれの「可溶性」画分におけるおよそ３６ｋＤａおよび６４ｋＤａのバンドに注目）。対照的に、３７℃ではＣ１＋Ａ４Ｅ、ＩＶ、９Ｂ８、および９Ｆ６は十分に発現されたが（「全」画分に示されるように、ｈＲＬまたはＬｕｃ２よりも有意により良く）、上昇した誘導温度が用いられた場合、９Ｂ８変異体および９Ｆ６変異体のみが可溶性であった（図３９Ｂ参照；９Ｂ８および９Ｆ６の「可溶性」画分におけるおよそ１９ｋＤａの暗いバンドに注目）。これらの結果は、表２４および図３８に示される熱安定性データに追従するものである。
Ｃ． ９Ｂ８ＯＰＴおよび９Ｂ８ＯＰＴ＋Ｋ３３Ｎ
変異体９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎの熱安定性を比較した。変異体９Ｂ８ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎを含む大腸菌（E. coli）溶解物を、以下の例外はあるが前に記載した通りに、調製して分析した：溶解物を前に記載した溶解緩衝液中で１：１００に希釈し、同一実験の希釈溶解物をサーモサイクラー中６０℃でインキュベートした。異なる時点で一定分量を取り出し、ドライアイス上に置いて、試料を凍結した。凍結された溶解物を２２℃で解凍し、２０ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、３５ｍＭ チオ尿素、および０．１％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）を含有する緩衝液を用いて、アッセイした。発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーター（プロメガ社）で測定した。図４０Ａは、分単位の時間にわたって測定された、ＲＬＵ単位の発光の自然対数（ｌｎ）値という、光出力の経時変化を示している。図４０Ｂに示されるように、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎは６０℃で６．８時間の半減期を有し、これは９Ｂ８ｏｐｔの半減期５．７時間よりも長かった。
表２５は、９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎの６０℃での熱安定性（「Ｔ1/2（６０℃）」）、並びにインキュベーション期間の開始時点（すなわち、ｔ＝０）での発光（「ＲＬＵ」）データを示している。９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎは、９Ｂ８ｏｐｔよりも、より安定でおよそ１．８倍明るかったが、このことは、アミノ酸置換Ｋ３３Ｎがより大きな光出力およびより高い熱安定性の両方を与えたことを示している。
表２５：９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎの熱安定性および発光データ
Ｄ． ９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ変異体
６０℃での変異体の熱安定性を、アッセイ緩衝液がＨＥＰＥＳの代わりに１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を含有したこと以外は上記の通りに、調べた。表２６および図４１は、６０℃での変異体の半減期を時間単位で示している。データは、アミノ酸置換Ｌ２７Ｖが熱安定性を向上させたことを示している。
表２６：６０℃でのＯｇＬｕｃ変異体の熱安定性
変異体９Ｂ８およびＶ２（９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ）も、それらの安定性を決定するために、ＨＥＫ２９３細胞においてスクリーニングした。前に記載した通りに、変異体をｐＦ４Ａｇにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞（１５，０００細胞／ウェル）に形質移入した。形質移入後、細胞をアッセイ試薬（前に記載した通りに；ＰＢＩ−３９３９無し）中に溶解させ、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含むアッセイ試薬を用いて、発光を測定した。９Ｂ８は５．２時間の半減期を有し、一方、Ｖ２は１６．８時間の半減期を有した。これは、大腸菌（E. coli）におけるこれらの変異体について分かった半減期と一致している（表２６）。
Ｅ． Ｌ２７Ｖ変異体
Ｌ２７Ｖ変異体（９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ）の活性を、様々なｐＨ、および異なる塩条件で評価した。９Ｂ８および９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎは、ｐＨ６およびｐＨ７において同様の安定性を有することが前もって示された（データ未記載）。様々な塩条件での活性を評価するために、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９および変動量のＫＣｌまたはＮａＣｌを含む５０μＬのアッセイ緩衝液を、Ｌ２７Ｖ（ｐＦ４Ａｇ）を一過的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞５０μＬと混合した。発光を測定し、活性パーセント（塩無しに対する発光の割合）を決定した（図４２Ｂ）。様々なｐＨにおける活性を評価するため、様々なｐＨ値に対し用量設定された、１００ｍＭ クエン酸塩、１００ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＴＡＰＳ、０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．０５％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４、１ｍＭ ＣＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴを含有する試薬を作製した。アッセイ試薬中の３６２ｐＭ Ｌ２７Ｖを、基質である１００μＭ ＰＢＩ−３９３９と混合し、発光を測定した（図４２Ａ）。
実施例２９． ＯｇＬｕｃ変異体のゲル濾過クロマトグラフ分析
Ａ． Ｃ１＋Ａ４Ｅおよび９Ｂ８
ゲル濾過分析を用いて理論値に基づく精製ＯｇＬｕｃタンパク質の予想分子量を検証し、それによりそれらのオリゴマー状態を決定した。ＯｇＬｕｃ変異体Ｃ１＋Ａ４Ｅおよび９Ｂ８の相対的流体力学的体積の比較を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって行った。この分析のために、ＯｇＬｕｃ変異体、Ｃ１＋Ａ４Ｅおよび９Ｂ８のヌクレオチド配列を、ＨＱ−Ｔａｇｇｅｄ ＦＬＥＸＩ（登録商標）ベクター（プロメガ社）にクローニングし、大腸菌（E. coli）ＫＲＸ細胞において過剰発現される、Ｎ末端にＨＱＨＱＨＱ標識されたタンパク質を生成した。過剰発現されたタンパク質を、ＨＩＳＬＩＮＫ（商標）タンパク質精製系（プロメガ社）を用い、製造業者の取扱説明書に従って、精製した。個々の標準タンパク質および試料タンパク質の試料を、ゲル濾過クロマトグラフィーで分析した。このゲル濾過クロマトグラフィーは、２４℃、アジレント１２００ＨＰＬＣ上で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ５／１５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、０．２５ｍＬ／分の流速で行われた（図４３Ａ〜Ｂ）。移動相（すなわち、泳動緩衝液）は、５０ｍＭ トリスおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌから構成されていた（ｐＨ７．５）。タンパク質の溶出を２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。標準的な検量線を、以下を用いて作成した：１）オボアルブミン、４３ｋＤａ（ＧＥヘルスケア社）、２）炭酸脱水酵素、２９ｋＤａ（シグマ社）および３）ミオグロビン、１７ｋＤａ（ウマ心筋、シグマ社）。精製タンパク質の分子量を検量線から直接算出した。
このカラムを用いて観察されたタンパク質の相対的な溶出は、７．９８分にオボアルブミン、８．６５分に炭酸脱水酵素、８．９７分に９Ｂ８、および９．０６分にミオグロビンであった（図４３Ａ〜Ｂ）。図４３Ｂに示されるように、９Ｂ８は２１ｋＤａのタンパク質（予想ＭＷはおよそ１９ｋＤａ）として溶出されたが、このことは９Ｂ８変異体が単量体として存在したことを示しており、一方、Ｃ１＋Ａ４Ｅはおよそ４．３分に溶出され（図４３Ａ）、このことは、Ｃ１＋Ａ４Ｅが多量体、例えば、恐らくは四量体複合体またはより大きな何かとして、発現され存在していることを示している。
Ｂ． Ｌ２７Ｖ 変異体
ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖが単量体状態で存在することを示すために、ゲル濾過分析を用いて理論値に基づく精製Ｌ２７Ｖタンパク質の予想分子量を検証し、それによりそれらのオリゴマー状態を決定した。Ｌ２７Ｖ変異体の相対的流体力学的体積をゲル濾過クロマトグラフィーによって作製した。この分析のために、Ｌ２７Ｖ変異体のヌクレオチド配列をＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクターｐＦＮ１８Ａ（プロメガ社）にクローニングし、大腸菌（E. coli）ＫＲＸ細胞（プロメガ社）において過剰発現されるＨａｌｏＴａｇ（登録商標）末端標識化タンパク質を生成した。過剰発現されたタンパク質を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質精製系（プロメガ社）を用い、製造業者の取扱説明書に従って精製した。個々の標準タンパク質および試料タンパク質の試料を、２４℃、アジレント１２００ＨＰＬＣ上で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ５／１５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、０．２５ｍＬ／分の流速で行われるゲル濾過クロマトグラフィーで分析した（図５６）。移動相（すなわち、泳動緩衝液）は、５０ｍＭ トリスおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌをから構成されていた（ｐＨ７．５）。タンパク質の溶出を２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。標準的な検量線を、以下を用いて作成した：１）オボアルブミン、４３ｋＤａ（ＧＥヘルスケア社）、２）ミオグロビン、１７ｋＤａ（ウマ心筋、シグマ社）、および３）リボヌクレアーゼ、１４ｋＤａ（ウシ膵臓、ＧＥヘルスケア社）。図４４に示されるように、Ｌ２７Ｖ変異体は２４ｋＤａのタンパク質（予想ＭＷはおよそ１９ｋＤａ）として溶出され、このことは、Ｌ２７Ｖ変異体が単量体として存在していたことを示している。
実施例３０． ＯｇＬｕｃ変異体のタンパク質発現レベル
Ａ． ＩＶ、８Ａ３、８Ｆ２、９Ｂ８、９Ｆ６および１５Ｃ１
タンパク質発現の正規化によって、比活性における潜在的な差異についての情報が得られた。タンパク質発現を定量するための手段を提供するため、前に記載した通りに、ＯｇＬｕｃ変異体をＣ末端ＨＴ７を含有するｐＦ４Ａｇベクターにクローニングし、ＯｇＬｕｃ変異体−ＨＴ７融合タンパク質を生成した。以下の融合タンパク質を生成した：ＩＶ−ＨＴ７（配列番号４８および４９）、８Ａ３−ＨＴ７（配列番号３４および３５）、８Ｆ２−ＨＴ７（配列番号５０および５１）、９Ｂ８−ＨＴ７（配列番号３６および３７）、９Ｆ６−ＨＴ７（配列番号３８および３９）、および１５Ｃ１−ＨＴ７（配列番号５２および５３）。ＯｇＬｕｃ変異体−ＨＴ７融合体を含む大腸菌（E. coli）を、前に記載した通りに、増殖させて誘導した。９００μＬの細胞培養物を１００μＬの１０×ＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）細胞溶解試薬（プロメガ社）で溶解させた。ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲ−リガンド（プロメガ社）を、各細菌溶解物試料に加えて、０．５μＭの最終濃度を得た。細菌溶解物を、製造業者の説明書に従って、室温で３０分間、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲ−リガンドと一緒にインキュベートした。１０μＬの各試料を１×ＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）で１：１に、すなわち、１０μＬの試料：１０μＬの１×ＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）に希釈した。各試料について、１５μＬの溶解物および１５μＬの１：１希釈物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。標識化融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色し（図４５Ａ）、蛍光画像作成を行った（ＧＥヘルスケア社製Ｔｙｐｈｏｏｎ）。バンドを、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥヘルスケア社）を用いて定量化した。図４５Ｂは、ＩＶ−ＨＴ７に対して正規化された、ＩＶ−ＨＴ７（「ＩＶ」）、１５Ｃ１−ＨＴ７（「１５Ｃ１」）、９Ｂ８−ＨＴ７（「９Ｂ８」）、９Ｆ６−ＨＴ７（「９Ｆ６」）、および８Ｆ２−ＨＴ７（「８Ｆ２」）の、図４５Ａから測定されたバンド体積を示している。データは、ＩＶ変異体が、ＩＶと比較して、十分に発現されていることを示している。
Ｂ． ９Ｂ８ｏｐｔ、Ｖ２およびＬ２７Ｖ
９Ｂ８ｏｐｔ、Ｖ２およびＬ２７Ｖの発現レベルおよび溶解性を比較した。これら３つの変異体は、ｐＦ４Ａｇバックグラウンドの背景において、大腸菌（E. coli）ＫＲＸ細胞を形質転換するのに使用された。得られたクローンを発現実験に使用し、発現実験では、単一コロニーを３０℃で一晩増殖させ、ＬＢで１：１００に希釈し、およそ０．５のＯＤ600まで増殖させ、その後、０．２％ラムノースを用いて、２５℃で１８時間誘導した。次に細胞を、０．５×ＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）溶解試薬（プロメガ社）の存在下で、室温で３０分間インキュベートし、得られた溶解物を−２０℃で保存した。氷上でゆっくりと解凍した後、４℃、１０分間の高速遠心分離によって可溶性画分を調製した。次に、未精製の全画分（Ｔ）および可溶性画分（Ｓ）を、発現レベルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＋Ｓｉｍｐｌｙ ｂｌｕｅ染色（図４６Ａ）、並びに発光測定（図４６Ｂ）によって分析した。発光測定のために、９６ウェルマイクロタイタープレート中の５０μＬの可溶性溶解物を、５０μＬのアッセイ試薬（前述；４０μＭ ＰＢＩ−３９３９）と混合し、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００マルチ検出プレートリーダーを用いて発光を測定した。これらの結果は、発現レベルおよび溶解性に関しての、これら３つの変異体の順位が、Ｌ２７Ｖ＞Ｖ２＞９Ｂ８ｏｐｔであることを示している。
実施例３１． 哺乳類細胞で発現されるＯｇＬｕｃ変異体の輝度
Ａ． ＩＶおよび９Ｂ８
ｐＦ４Ａｇベクター（すなわち、ＨＴ７無し）中のＩＶおよび９Ｂ８変異体を、ＨＥＫ２９３細胞における輝度について評価した。ｈＲＬを対照として使用した。簡潔に説明すると、１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種されたＨＥＫ２９３細胞に、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴ１を用いて、種々の変異体および／または制御配列をコードするプラスミドＤＮＡを一過的に形質移入した。細胞を実施例２５に記載の通りに、増殖させ、溶解させ、処理した。細胞に、形質移入対照としてｐＧＬ４．１３（プロメガ社）を同時形質移入した（１０ｎｇ／形質移入または全導入ＤＮＡの１０％を使用）。発光を、ｈＲＬに対する基質として天然セレンテラジンを用いて、またはＯｇＬｕｃ変異体に対する基質としてＰＢＩ−３９３９を用いて、前に記載した通りに測定した。ＯｇＬｕｃ変異体データを、Ｌｕｃ２の発光（すなわち、ルシフェリン基質添加後の発光測定）を用いて、形質移入効率に対して補正した。ＯｇＬｕｃ変異体ＩＶおよび９Ｂ８は、ｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）と比較した場合に、より大きな発光を有した（図４７）。
哺乳類細胞においての、１モルあたりでの輝度の比較のために、実施例３０に記載の変異体９Ｂ８のＣ末端ＨＴ７融合タンパク質（「ｐＦ４Ａｇ−ＯｇＬｕｃ−９Ｂ８−ＨＴ７」）を分析し、Ｃ末端ＨＴ７−ｈＲＬ融合タンパク質（「ｐＦ４Ａｇ−ウミシイタケ属（Renilla）−ＨＴ７」）およびＣ末端ＨＴ７−Ｌｕｃ２融合タンパク質（「ｐＦ４Ａｇ−Ｌｕｃ２−ＨＴ７」）と比較した。ＨＥＫ２９３細胞（１５，０００）を播種し、３７℃で一晩増殖させた。これらの細胞に、ｐＦ４Ａｇ−ウミシイタケ属（Renilla）−ＨＴ７、ｐＦ４Ａｇ−Ｌｕｃ２−ＨＴ７、またはｐＦ４Ａｇ−ＯｇＬｕｃ−９Ｂ８−ＨＴ７からの、１００ｎｇのＤＮＡを形質移入し、３７℃で一晩増殖させた。培地を除去し、前に記載した通りに細胞を溶解させた。１０μＬの各試料を、Ｌｕｃ２に対して５０μＬのＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）、ｈＲＬに対して５０μＬの２０μＭ 天然セレンテラジン、および変異体９Ｂ８に対して５０μＬの２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を用いた場合の発光（ＲＬＵ）について、アッセイした。
６個のウェルから得られた溶解物をプールし、実施例３０に記載の通りにＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲ−リガンドでタグ付けした。タグ化融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、蛍光画像作成を行った（ＧＥヘルスケア社製Ｔｙｐｈｏｏｎ）。バンド密度を測定して、各々のルシフェラーゼ酵素の存在するモルの相対数を定量化し、各試料のＲＬＵ値を算出されたバンド密度に対し正規化して、各タンパク質の発現レベルを正規化した。すなわち、ＲＬＵをＴＭＲタグ定量化を用いて正規化した（図４８）。モル対モル基準で、９Ｂ８変異体はＬｕｃ２よりもおよそ１５倍明るく、ｈＲＬよりも１００倍を超えて明るかった。このデータは比活性における差異を表すものであった。
Ｂ． ９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ
ＨＥＫ２９３細胞で発現された変異体９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎの輝度を、実施例３１においてＨＴ７を含まない変異体について記載された通りに、測定して比較した。変異体ＤＮＡを含有する３０ｎｇおよび１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入するのに用いた。１ｍＭ ＣＴＤＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３５ｍＭ チオ尿素、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、および１０ｍｇ／ｍＬ ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含有する溶解緩衝液で細胞が溶解されたこと以外は実施例３１に記載の通りに、細胞を増殖させて誘導した。溶解物を、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する溶解緩衝液を用いてアッセイし、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＧＥＮＩＯＳ（商標）プロ・ルミノメーターで発光を測定した。図４９に示されるように、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎは、ＨＥＫ２９３細胞において、９Ｂ８ｏｐｔと比較してより大きな発光を有し、これは、表２５および図２９における細菌中の発現データに追従するものである。
Ｃ． ９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ変異体
ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞において発現された変異体の輝度を、前に記載した通りに測定した。変異体の発光を、９Ｂ８ｏｐｔにより発せられた発光に対して正規化した（表２７）。
表２７：ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨＥＫ２９３細胞においてＯｇＬｕｃ組み合わせ変異体によって発せられた発光の増加
Ｄ． Ｌ２７Ｖ
単独のホタルルシフェラーゼおよび融合体としてのホタルルシフェラーゼに対する、Ｌ２７Ｖ変異体の発光の比較を行った。ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞を、それぞれ１５，０００細胞／ウェルおよび１０，０００細胞／ウェルで１２ウェルプレートのウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。次に、細胞に、Ｌ２７ＶまたはＬｕｃ２を含有するｐＦ４Ａｇの連続希釈物を形質移入した。２０ｎｇのｐＧＬ４．１３（プロメガ社）をＬ２７Ｖと共に同時形質移入し、２０ｎｇのｐＧＬ４．７３（プロメガ社）をＬｕｃ２と共に同時形質移入して、Ｌ２７ＶまたはＬｕｃ２プラスミドＤＮＡのより低い希釈物のための担体ＤＮＡとして機能させた。次に、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴＩ形質移入試薬を用い、製造業者の取扱説明書に従って、プラスミドＤＮＡを細胞（各細胞型の各希釈に対し６連で）に形質移入した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。
形質移入後、培地を細胞から除去し、０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）を含有する１００μＬのＰＢＳを加え、室温で１０分間振盪した。１０μＬの各細胞溶解物を、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社；Ｌｕｃ２）またはアッセイ試薬（２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を用いる実施例２２Ｈ；ＯｇＬｕｃ）を用いて、アッセイした。ＨＥＫ２９３（図５０Ａ）およびＨｅＬａ細胞（図５０Ｂ）について、前に記載した通りに発光を測定した。
融合パートナーとしてのＬ２７ＶおよびＬｕｃ２の比較を、上記の通りに行った。Ｌ２７ＶおよびＬｕｃ２を、ｐＦ４ＡｇにおいてＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質に融合させた。図５０Ｃ〜Ｄは、ＨＥＫ２９３（図５０Ｃ）およびＨｅＬａ細胞（図５０Ｄ）において、異なる融合体を用いた場合に測定された発光を示している。
発光の測定に加えて、タンパク質発現も分析した。形質移入を上記の通りに行った。形質移入後、培地を細胞から取り除き、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。１μＭ ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンド（プロメガ社）および２０Ｕ デオキシリボヌクレアーゼＩを含有する１００μＬの０．１×Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社）を加え、細胞を室温で４５分間、ゆっくり振盪しながらインキュベートした。次に、細胞試料を−２０℃で凍結した。タンパク質分析のために、３２．５μＬの４×ＳＤＳローディングダイを各試料に加え、試料を９５℃で２分間加熱した。次に、１０μＬの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加し、前に記載した通りにＴｙｐｈｏｏｎ Ｓｃａｎｎｅｒで画像処理した（図５０Ｅ）。
実施例３２． ホタルルシフェラーゼと比較した場合の精製ＯｇＬｕｃ変異体の輝度
実施例３３に記載の通りに、９Ｂ８ＯｇＬｕｃ変異体を過剰発現させて精製した。希釈された酵素および基質間の反応は、以下の２×緩衝液／アッセイ試薬を用いて行われた：１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ チオ尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．０２５％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４、１０ｍｇ／ｍＬ ２−ヒドロキシ−β−シクロデキストリン、および２０μＭ ＰＢＩ−３９３９。精製された酵素および基質の最終的なアッセイ濃度は、それぞれ０．５ｐＭおよび１０μＭであった。同時に、希釈された精製ホタルルシフェラーゼ（すなわち、ＱＵＡＮＴＩＬＵＭ（登録商標）組換えルシフェラーゼ（プロメガ社））と希釈された精製ルシフェリンの反応を分析した。ホタルルシフェラーゼ反応用のアッセイ緩衝液／試薬はＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）であり、その最終アッセイ濃度は０．５ｐＭ 酵素および５００μＭ ルシフェリンであった。各反応用の緩衝液／試薬は「白熱（glow）」動態を与えることが知られており、１５分の時点が発光データを収集するのに用いられた。この実験から得られた結果は、ＰＢＩ−３９３９を用いる９Ｂ８ｏｐｔ（１９，２００ＲＬＵ）が、ＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）を用いるＱＵＡＮＴＩＬＵＭ（登録商標）組換えルシフェラーゼ（２，３００ＲＬＵ）のおよそ８倍より明るかったことを示した。
実施例３３． 阻害分析
非特異的相互作用に対するＯｇＬｕｃ変異体の感受性を決定するために、９Ｂ８およびＬ２７Ｖ変異体の活性を、ＬＯＰＡＣ（薬理的活性化合物のライブラリー）ライブラリーに対して、スクリーニングした。前記化合物をＤＭＳＯ中で１ｍＭに希釈することにより、ＬＯＰＡＣ１２８０ライブラリー（シグマ社）を作製した。アッセイの当日、前記化合物を１×ＰＢＳ中で２０μＭに希釈し、１０μＬを９６ウェルの白色プレートに移した。各ウェルに、Ｇｌｏ溶解緩衝液（プロメガ社）中で１０-4に希釈された、１０μＬの精製された９Ｂ８、Ｌ２７Ｖまたはホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）酵素を加え、室温で２分間インキュベートした。試料に、２０μＬのアッセイ試薬（１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３５ｍＭ チオ尿素、０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）および６０μＭ ＰＢＩ−３９３９）を加え、３分間インキュベートし、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＧＥＮＩＯＳ（商標）プロ・ルミノメーターで発光を測定した。ホタルルシフェラーゼをアッセイするために、製造業者のプロトコルに従ってＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）アッセイ試薬（プロメガ社）を使用した。陰性対照として、各プレートの８ウェルには、１×ＰＢＳ＋２％グリセロールが含められた。陽性対照として、各プレートの８ウェルには、２％ＤＭＳＯ中の２ｍＭ スラミンまたは２％ＤＭＳＯ中の２ｍＭ ルシフェラーゼ阻害剤１（カルバイオケム社）が含まれた。ＬＯＰＡＣライブラリーの事前のスクリーニング（すなわち、ＬＯＰＡＣライブラリーを、２０μＭというより低い基質濃度の９Ｂ８変異体を使用してスクリーニングした）において、スラミンはＯｇＬｕｃの阻害剤であることが特定された。
図５１における結果は、ＬＯＰＡＣライブラリー中の化合物とＬ２７Ｖの間の非特異的相互作用が、概して低頻度であることを示している。このことは、生細胞ベースの型式（例えば、高処理スクリーニング系）を含む、多様な化学物質および治療薬候補の大規模なライブラリーに対するスクリーニング手段として、Ｌ２７Ｖを使用できる可能性を示している。
阻害耐性をさらに試験するために、精製された９Ｂ８およびＬ２７Ｖを、様々な濃度のスラミン（シグマ社Ｓ−２６７１）およびチロホスチンＡＧ８３５（「Ｔｙｒ ａｇ８３５」）（シグマ社Ｔ−５５６８）に対して、スクリーニングした（図５２Ａ〜Ｃ）。図５２Ｅ〜Ｄは、スラミンおよびＴｙｒ ａｇ８３５それぞれの化学構造を示している。精製された９Ｂ８およびＬ２７Ｖを上記の通りに調製した。阻害剤の連続希釈物（０、２μＭ、６μＭ、２０μＭ、６０μＭ、２００μＭおよび２ｍＭ）を、２％ＤＭＳＯを含む１×ＰＢＳ中で調製した。９６ウェル白色アッセイプレートのウェルに、１０μＬの希釈酵素および１０μＬの希釈阻害剤を加え、室温で２分間インキュベートした。２０μＬのアッセイ試薬（上記）を加え、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）−９６ルミノメーターで発光を測定した（図５２Ａ〜Ｃ）。図５２Ａ〜Ｂは、９Ｂ８およびＬ２７Ｖの、スラミン（図５２Ａ）およびＴｙｒ ａｇ８３５（図５２Ｂ）に対する用量反応曲線を示している。図５２Ｃは、９Ｂ８およびＬ２７Ｖに対するスラミンおよびＴｙｒ ａｇ８３５の５０％阻害濃度（ＩＣ50）を示している。データは、Ｌ２７Ｖが、多様な化学物質および／または治療薬候補の大規模ライブラリーに対するスクリーニング手段として使用でき得る、頑強なレポーターであることを示している。
実施例３４． 非特異的タンパク質相互作用に対する抵抗性
１． 精製９Ｂ８酵素および精製Ｌ２７Ｖ酵素を、０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有する、または含有しない緩衝液（１×ＰＢＳ、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．００５％ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０）中で１：１０に連続希釈して（４セットの各希釈物）、２００μＬをＰＣＲストリップ管に入れた。試料を６０℃でインキュベートし、０時間、２時間、４時間、および６時間の時点で、各変異体について１セットの希釈物を−７０℃に移行させた。
活性を分析するために、試料を水浴中で室温まで解凍した。５０μＬのアッセイ試薬（前に記載した通り、１００μＭ ＰＢＩ−３９３９を含む）を加え、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００プレートリーダーで、発光を１分ごとに３０分間測定した。活性を、１×１０6および１×１０7希釈物の平均発光を用いて算出した（図５３）。
２． プラスチックに対するＯｇＬｕｃ変異体の反応性を示すために、精製９Ｂ８および精製Ｌ２７Ｖを、ポリスチレンプレートに曝して、それらの活性を測定した。
０．１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）を含むフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中の、５０μＬの精製９Ｂ８（４５．３ｐＭ）および精製Ｌ２７Ｖ（８５．９ｐＭ）を、９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに、６０分、４０分、２０分および０分の時点で入れた。試料に、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する５０μＬのアッセイ試薬（上記）を加え、室温で５分間インキュベートした。発光を前に記載した通りに測定し、活性パーセントを決定した（図５４；時間０に対する発光の割合）。
実施例３５． 翻訳後修飾
ＯｇＬｕｃ変異体が、哺乳類細胞で発現された場合に何らかの翻訳後修飾を経るかどうかを決定するために、哺乳類細胞および大腸菌（E. coli）の両方において、９Ｂ８およびＬ２７Ｖ変異体を発現させ、質量分析（ＭＳ）によって分析した。
９Ｂ８およびＬ２７Ｖ変異体を、Ｎ末端ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合体（大腸菌（E. coli）に対してはｐＦＮ１８Ｋ；ＨＥＫ２９３細胞に対してはｐＦＮ２１Ｋ）として、ＨＥＫ２９３細胞および大腸菌（E. coli）ＫＲＸ（プロメガ社）細胞中で発現させ、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質精製系（プロメガ社）を用い、製造業者の説明書に従って、精製した。およそ５ピコモルの精製酵素を、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ質量分析計（サーモサイエンティフィック社）に連結されたＣ４カラム（ウォーターズ社製Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００、３．５μｍ）を用いるＬＣ／ＭＳによって分析した。検出のためにＬＴＱを用いて６００〜２０００ｍ／ｚからデータを得て、ＭａｇＴｒａｎ ｖ１．０３ソフトウェアを用いて処理した（Zhang et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 9:225-233 (1998)）。無修飾ＯｇＬｕｃ変異体、すなわち、いかなる翻訳後修飾も存在しないＯｇＬｕｃ変異体の、１９，６６５Ｄａという算出された質量と比較して、精製された酵素は両方とも１９，６６６Ｄａという実験的に決定された質量を有していた。
実施例３６． ＯｇＬｕｃ変異体の転写レポーターとしての評価
Ａ． ＩＶ
転写レポーターとしてのＯｇＬｕｃ変異体の使用を試験した。ｃＡＭＰの転写レポーターを生成するために、ｈＲＬおよびＩＶを、当該技術分野において周知の方法を用いて、バルナーゼ配列（barnase sequence）を含有する改変されたｐＧＬ４ベクター（プロメガ社）にサブクローニングし、目的のＤＮＡ断片で置き換えた。フォルスコリン（ＦＳＫ）等のｃＡＭＰ作動薬での刺激の際に、ｃＡＭＰを蓄積している細胞が前記レポーターを活性化して発光するように、改変されたｐＧＬ４のリーダー配列は最小プロモーターおよびｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ；配列番号９６）を含有していた。この実験では、ｈＲＬまたはＩＶいずれかの転写レポーターコンストラクトの２ｎｇのＤＮＡが、実施例２５に記載の通りに、ＨＥＫ２９３細胞の形質移入に使用された。形質移入から２４時間後、細胞を１００μＭ ＦＳＫで処理した。ＦＳＫで処理しなかった細胞は対照として使用した。６時間後、レポーター試薬を、処理細胞および対照細胞に加えた。ｈＲＬについては、レポーター試薬はＲｅｎｉｌｌａ−Ｇｌｏ（商標）試薬（プロメガ社）であった。ＩＶについては、レポーター試薬は１ｍＭ ＣＤＴＡ（ｐＨ５．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、２０μＭ セレンテラジン−ｈ、および１５０ｍＭ チオ尿素を含有していた。１０分後、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（サーモサイエンティフィック社）で発光を読み取った。
図５５は、ＦＳＫで処理された（「＋ＦＳＫ」）または処理されていない（「−ＦＳＫ」）、ｈＲＬ（「ウミシイタケ属（Renilla）」）またはＩＶ転写レポーターを含有するＨＥＫ２９３細胞の正規化された発光を示している。応答、すなわち、発光における誘導倍率または増加倍率（「倍率」）を、処理細胞（＋ＦＳＫ）からの発光を対照細胞（−ＦＳＫ）からの発光で除算することによって決定した。図５５に示されるように、ｈＲＬについての応答は５０未満であり、一方、ＩＶについては、応答は３００を超えており、このことは、転写レポーターとしてのＩＶの用途を明らかにするものである。
Ｂ． ９Ｂ８および９Ｂ８ｏｐｔ
転写レポーターとしての変異体９Ｂ８および９Ｂ８ｏｐｔの使用も、以下の変更を加えてＩＶ転写レポーターについて先述される通りに試験して、ｈＲＬおよびＬｕｃ２転写レポーターに対して比較した。変異体９Ｂ８または９Ｂ８ｏｐｔのいずれかを含有するｃＡＭＰの転写レポーターを、上記の通りに生成した。ＦＳＫ誘導の６時間後、培地を細胞から除去して、実施例２５に記載の１００μＬの溶解緩衝液で置き換え、溶解物を生成した。ＦＳＫで処理されたか、または処理されていない形質移入細胞の溶解物を、実施例２５に記載される通りに、発光についてアッセイした。１０μＬのＬｕｃ２溶解物を、５０μＬのＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を用いてアッセイした。１０μＬのｈＲＬ溶解物を、２０μＭ 天然セレンテラジンを含有する５０μＬの溶解緩衝液を用いてアッセイした。１０μＬの変異体９Ｂ８および９Ｂ８ｏｐｔ溶解物を、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する５０μＬの溶解緩衝液を用いてアッセイした。
図５６は、ＦＳＫで処理された（「誘導」）または処理されていない（「基底」）、９Ｂ８、９Ｂ８ｏｐｔ、ｈＲＬ、またはＬｕｃ２転写レポーターを含有するＨＥＫ２９３細胞の正規化された発光を示している。応答、すなわち、発光における誘導倍率または増加倍率（「倍率」）を、誘導された発光を基底の発光で除算することによって決定した（図５６）。誘導倍率の値はＬｕｃ２以外の各レポーターについて同様であるが、誘導された９Ｂ８ｏｐｔ転写レポーターによって生じた発光は、誘導されたウミシイタケ属（Renilla）転写レポーターよりもおよそ２．５対数より高く、Ｌｕｃ２転写レポーターよりもおよそ１．５対数より高かった。図５６は、転写レポーターとしての９Ｂ８および９Ｂ８ｏｐｔの使用を示す。
Ｃ． ９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ
変異体９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎを、溶解性転写レポーターアッセイにおいて比較した。変異体９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎを、サイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）を含有するｐＧＬ４．２９ベクター（プロメガ社）に、当該技術分野において周知の方法を用いてクローニングした。９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ転写レポーターを、ＨＥＫ２９３細胞において、上記の通りに試験して、９Ｂ８ｏｐｔ転写レポーターに対して比較した。変異体の転写レポーターバージョンを含有する３０ｎｇおよび１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞の形質移入に使用した。細胞を、ＦＳＫを用いて、発光測定前に５時間誘導した。細胞を、１ｍＭ ＣＴＤＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３５ｍＭ チオ尿素、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、および１０ｍｇ／ｍＬ ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含有する溶解緩衝液を用いて溶解させた。発光を、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＧＥＮＩＯＳ（商標）プロ・ルミノメーターで測定した。溶解物を、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する溶解緩衝液を用いてアッセイした。図５７は、ＦＳＫで処理された（「誘導」）、または処理されていない（「基底」）、９Ｂ８ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ転写レポーターコンストラクトを発現するＨＥＫ２９３細胞の正規化された発光（補正された形質移入）を示している。図５７に示されるように、９Ｂ８ｏｐｔについての誘導倍率は、３０ｎｇのＤＮＡが形質移入に使用された場合は３６０であり、１００ｎｇが形質移入に使用された場合は１０９であったが、一方、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎについての誘導倍率は、それぞれ、２７５および１４７であった。より多量なＤＮＡを形質移入に使用した場合、Ｋ３３Ｎはより大きな応答を提供した。
Ｄ． Ｌ２７Ｖ
１． Ｌ２７Ｖを、本実施例のＣに記載の通りに、ＣＲＥ、ＮＦｋＢまたはＨＳＥ（熱ショック要素）応答要素を含有するレポーターベクターにクローニングした。次に、レポーターコンストラクトを前に記載した通りにＨＥＫ２９３細胞またはＨｅＬａ細胞に形質移入した。次に、細胞を、ＣＲＥに対してはＦＳＫを、ＮＦｋＢに対してはＴＮＦαを、またはＨＳＥに対しては１７−ＡＡＧを用いて誘導した。発光を、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有するアッセイ試薬を用いて、前に記載した通りに測定した（図５８Ａ〜Ｃ）。レポーターコンストラクトを、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｕ２ＯＳおよびＪｕｒｋａｔ細胞株全てにおいて、妥当性確認した（データ未記載）。
２． Ｌ２７Ｖ０２およびＬ２７Ｖ０２Ｐ（ＰＥＳＴ配列；配列番号３２３を含有）を、本実施例のＣに記載の通りに、レポーターベクター（ｐＧＬ４．３２ベース）にクローニングした。ＰＥＳＴ配列を含有する他のＯｇＬｕｃ変異体としては、Ｌ２７Ｖ０１−ＰＥＳＴ００およびＬ２７Ｖ０３−ＰＥＳＴ０２（それぞれ、配列番号３２０および３２６）が挙げられる。次にレポーターコンストラクトを、前に記載した通りに、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。次に、ＦＳＫを用いて細胞を誘導し、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有するアッセイ試薬を用いて前に記載した通りに、発光を測定した（図５９Ａ〜Ｂ）。種々の他のレポーターコンストラクトも構築し、種々の細胞株において試験した（図５９Ｃ）。図５９Ａは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＥ系についての、完全用量反応を示している。図５９Ｂは、図５９Ｂを要約したものである。図５９Ｃは、図５９Ａ〜Ｂのデータを要約したものであり、ＮＦｋＢ応答要素についての同種のデータを示している。ＣＲＥおよびＮＦｋＢレポーターコンストラクトを両方とも、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＥ１８０、ＨＣＴ１１６、およびＵ２ＯＳ細胞株において試験した。
３． ＨＥＫ２９３細胞（Ｔ２５フラスコ中の０．９×１０6個の細胞）に、ｐＮＦｋＢ−Ｌ２７Ｖ分泌コンストラクト（配列番号４６３および４６４；ＩＬ−６分泌配列（配列番号４６１および４６２）によって天然ＯｇＬｕｃ分泌配列の配列番号５４が置き換えられた）、メトリディア・ロンガ（Metridia longa）（クロンテック社）、ｐＮＦｋＢ−Ｌ２７Ｖ（天然分泌配列；配列番号４６５および４６６）またはホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２；ｐＧＬ４．３２ベース）プラスミドＤＮＡを、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（プロメガ社）を用い、製造業者の取扱説明書に従って、形質移入した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で８時間インキュベートし、その後０．５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（インビトロジェン社）中でトリプシン処理した。次に、溶解物を、１０％ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡおよび１×ピルビン酸ナトリウムを含有する８ｍＬのＤＭＥＭに再懸濁した。次に、１００μＬの再懸濁試料を９６ウェルプレートのウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ2で１６時間インキュベートした。
インキュベートした後、培地を細胞から除去して、ＴＮＦα（連続希釈した）を含有する、または含有しない、１００μＬの新しい培地と置き換えた。分泌についてアッセイするため、３時間および６時間の時点で、５μＬの培地（３連）を細胞から取り出し、ＰＢＳで５０μＬにして、５０μＬのアッセイ試薬（前述と同様に、１００μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する）と混合した。前に記載した通りに、０分および１０分の時点で発光を測定した（図６０）。
メトリディア・ロンガ（Metridia longa）ルシフェラーゼ活性を測定するために、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｌｏｗ（商標）分泌型ルシフェラーゼ系（クロンテック社）を、製造業者のプロトコルに従って使用した。簡潔に説明すると、５μＬのＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｌｏｗ（商標）試薬を５μＬの試料および４５μＬのＰＢＳに加えた。試薬添加直後に発光を測定した（図６０）。
Ｅ． Ｌ２７Ｖ最適化変異体
プラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ４．３２−Ｌ２７Ｖ００、ｐＧＬ４．３２−Ｌ２７Ｖ０１、ｐＧＬ４．３２−Ｌ２７Ｖ０２、ｐＧＬ４．３２−Ｌ２７Ｖ０３、およびｐＧＬ４．１３）を、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを用い、製造業者のプロトコルに従って、形質移入用に構築した。ｐＧＬ４．３２ベクター（プロメガ社）は、ＮＦ−κＢ応答要素を含有している。Ｌ２７Ｖコドン最適化配列によって、ベクター中のＬｕｃ２Ｐ配列が置き換えられた。ｐＧＬ４．１３ベクター（プロメガ社）は、ＳＶ４０プロモーターにより駆動されるＬｕｃ２遺伝子を含有している。
次に、３００μＬのＤＮＡ形質移入混合物を、６ｍＬのＨｅＬａ細胞懸濁液（２×１０5細胞／ｍＬ）と混合し、均質化し、１００μＬを９６ウェルプレートのウェルに播種した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。インキュベートした後、ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ中の１０μＬの１０×ｒｈＴＮＦαをウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ2で４．５時間インキュベートした。６ウェルに、ビヒクルのみを加えた。次に、細胞を室温で２０分間平衡化させ、その後、１００μＬのアッセイ試薬（前述と同様、１００μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する）を加えた。Ｌｕｃ２を発現しているか、またはビヒクル単独処理を受けた細胞に、１００μＬのＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を加えた。アッセイ試薬添加の１２分後、前に記載した通りに発光を測定した。図６１Ａ〜Ｂは絶対発光を示しており、図６１Ｃ〜Ｄは正規化された発光を示しており、図６１Ｅ〜Ｆは応答倍率を示している。
実施例３７． 転写レポーターアッセイにおけるＯｇＬｕｃ変異体
転写レポーターとして使用される本発明のＯｇＬｕｃ変異体の能力を決定するために、フォワードトランスフェクション、リバーストランスフェクション、および大量（bulk）トランスフェクションにおいて、ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８ｏｐｔを転写レポーターとして使用した。これらの形質移入法が選択されたのは、それらが遺伝子転写レポーターの一過性発現に、一般に使用されるアプローチの代表であるためである。
フォワードトランスフェクション
ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）および９Ｂ８ｏｐｔまたはＰＥＳＴタンパク質分解配列をさらに含む９Ｂ８ｏｐｔ（９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐ）を含有する転写レポーターを、ｐＧＬ４．２９（プロメガ社）バックボーンにおいて作製した。すなわち、ｐＧＬ４．２９ベクターのｌｕｃ２Ｐ遺伝子を９Ｂ９ｏｐｔ（配列番号２４）または９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐ（配列番号６５）で置き換えた。ｐＧＬ４．２９を対照／基準として使用した。
ＨＥＫ２９３細胞を、６個の９６ウェル組織培養プレートに、１５，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×可欠アミノ酸（ＮＥＡＡ）中で増殖させ、３７℃で一晩インキュベートした。細胞に、１０ｎｇまたは１００ｎｇプラスミドＤＮＡ／ウェルのｐＧＬ４．２９ ９Ｂ８ｏｐｔ、ｐＧＬ４．２９ ９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐ、またはｐＧＬ４．２９のいずれかを一過的に形質移入した。プラスミドＤＮＡを、８５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（インビトロジェン社）および３２．４μＬのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ形質移入試薬（プロメガ社）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。８μＬの形質移入／レポーターＤＮＡ混合物を適切なウェルに加えた（２コンストラクト／プレート）。細胞を３７℃で４時間インキュベートした。培地を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）＋０．５％透析ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ＋１×ピルビン酸ナトリウム＋１×Ｐｅｎｎ−Ｓｔｒｅｐで置き換え、３７℃で一晩インキュベートした。
インキュベートした後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中の１０ｎＭまたは１０μＭ ＦＳＫ（１０×ストックから）を細胞に加え、３７℃で３時間インキュベートした。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．１）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ チオ尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．０２５％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４、および２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する溶解試薬を、ｐＧＬ４．２９ ９Ｂ８ｏｐｔまたはｐＧＬ４．２９ ９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐを含有する細胞に加えて、室温で１０分間インキュベートした（１００μＬの溶解試薬を１００μＬの細胞に加えた）。ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）アッセイ試薬（プロメガ社）を、ｐＧＬ４．２９を含有する細胞に加え、製造業者のプロトコルに従って使用した（１００μＬの試薬を１００μＬの細胞に加えた）。発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで測定した。表２６は、１０ｎＭ（「ベースライン」）または１０ｍＭ ＦＳＫで処理された、ＣＲＥを含有する転写レポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞の発光、およびＦＳＫに対する応答（すなわち、１０ｎＭ ＦＳＫで処理された細胞の発せられた発光で除算した、１０ｍＭ ＦＳＫで処理された細胞により発せられた発光）を示している。
表２８に示される結果は、９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐが、ｌｕｃ２Ｐよりもより明るかったこと、並びに、全てのルシフェラーゼレポーターが、１００ｎｇのＤＮＡが形質移入に使用された場合にＦＳＫに対し応答したことを示している。しかし、１０ｎｇだけのＤＮＡが形質移入に使用された場合は、ｌｕｃ２Ｐレポーターについての発光は、ルミノメーターの検出レベルを下回った。
表２８：ＨＥＫ２９３細胞における、ＣＲＥを含有する転写レポーター（３時間の時点）
リバーストランスフェクション
抗酸化反応要素（ＡＲＥ）および９Ｂ８ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐを含有する転写レポーターを、ｐＧＬ４．２９（プロメガ社）バックボーンにおいて作製した。すなわち、当該技術分野において周知の方法を用いて、ｐＧＬ４．２９ベクターのｌｕｃ２Ｐ遺伝子を９Ｂ９ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐで置き換え、ＣＲＥを、２×ＡＲＥ（配列番号６６）で置き換えた。
ＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理し（Ｔ７５フラスコ、３ｍＬのトリプシン）、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡを含有する培地中で、１ｘ１０5細胞／ｍＬ（およそ８．９ｘ１０6個の総細胞）に再懸濁した。各転写レポーターを、１．２ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）、１２μＬの転写レポーターＤＮＡ（１００ｎｇ）および３６μＬのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ形質移入試薬を混合することにより形質移入用に作製し、室温で３５分間インキュベートした。インキュベートした後、６２４μＬの形質移入／レポーターＤＮＡ混合物を、１２ｍＬの細胞懸濁液に加え、反転によって混合した。混合後、１００μＬの細胞／ＤＮＡ混合物を、９６ウェルプレートのウェルに加えた（２コンストラクト／プレート）。細胞を、３７℃で２２時間インキュベートした。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中の、Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（Ｎｒｆ２安定剤；ｔＢＨＱ；１μＭ（「ベースライン」）または２０μＭ）またはスルホラファン（Ｎｒｆ２を活性化させることが知られている有機硫黄抗酸化剤；１μＭ（「ベースライン」）または２０μＭ）を、各ウェルに加え、３７℃で２４時間インキュベートした。フォワードトランスフェクションについての上記の通りの１００μＬの溶解試薬を用いて、細胞を溶解させた。発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで測定した。
表２９は、１μＭ（「ベースライン」）または２０μＭのスルホラファンで処理された、ＡＲＥを含有する転写レポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞の発光、およびスルホラファンに対する応答（すなわち、２０μＭのスルホラファン処理細胞の発せられた発光で除算された、１μＭのスルホラファン処理細胞により発せられた発光）を示している。表３０は、１μＭ（「ベースライン」）または２０μＭ ｔＢＨＱで処理された、ＡＲＥを含有する転写レポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞の発光、およびｔＢＨＱに対する応答（すなわち、２０μＭ ｔＢＨＱ処理細胞の発せられた発光で除算された、１μＭ ｔＢＨＱ処理細胞により発せられた発光）を示している。表２９および表３０は、９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐが、ＡＲＥに対する２つの異なる既知の刺激の存在を報告し得ることを示している。
表２９：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＲＥを含有する転写レポーター（２４時間の時点）
表３０：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＲＥを含有する転写レポーター（２４時間の時点）
大量トランスフェクション
フォワードトランスフェクションにおいて記載された、ＣＲＥおよび９Ｂ８ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐを含有する転写レポーターを、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の大量トランスフェクションで使用した。熱ショック応答要素（ＨＲＥ；配列番号６７）および９Ｂ８ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐを含有する転写レポーターを、ｐＧＬ４．２９（プロメガ社）バックボーンにおいて作製した。すなわち、ｐＧＬ４．２９ベクターのｌｕｃ２Ｐ遺伝子を９Ｂ９ｏｐｔまたは９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐで置き換え、ＣＲＥをＨＲＥで置き換えた。ＨＲＥおよび９Ｂ８ｏｐｔ−Ｐを含有する転写レポーターを、ＨｅＬａ細胞の大量トランスフェクションで使用した。
ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、またはＨｅＬａ細胞を、ＨＥＫ２９３細胞については、３ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ＋１×ピルビン酸ナトリウム）中で４．５×１０5細胞／ウェルの密度で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞については、３ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）＋１×ＮＥＡＡ＋１×ピルビン酸ナトリウム）中で３×１０5細胞／ウェルの密度で、またはＨｅＬａ細胞については、３ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ）中で９．９×１０5細胞／ウェルの密度で、形質移入の前日に６ウェル組織培養プレートの１つのウェルに播種した。細胞を３７℃で一晩増殖させた。
１５５μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中の３，３００ｎｇのレポータープラスミドＤＮＡを９．９μＬのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ形質移入試薬と混合し、短時間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。ＣＲＥ転写レポーターをＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質移入に使用した。ＨＲＥ転写レポーターをＨｅＬａ細胞の形質移入に使用した。レポーター混合物を細胞に加え、穏やかに前後に揺らして混合した後、３７℃で６時間（ＨＥＫ２９３およびＮＩＨ３Ｔ３）または３時間（ＨｅＬａ）インキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理し、培地（ＨＥＫ２９３細胞に対してはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ＋１×ピルビン酸ナトリウム、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋１×ＮＥＡＡ＋１×ピルビン酸ナトリウム、またはＨｅＬａ細胞に対してはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ）に再懸濁し、その後、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し（ＨＥＫ２９３については２０，０００細胞／１００μＬ、ＮＩＨ３Ｔ３については１０，０００細胞／１００μＬ、またはＨｅＬａについては１３，０００細胞／μＬ）、３７℃で一晩インキュベートした。
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中の、ＦＳＫ（ＣＲＥ刺激物質）または１７−ＡＡＧ（ＨＲＥ刺激物質；１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン）を、細胞に加え（ＦＳＫについては、１０ｎＭまたは１０μＭ最終濃度；１７−ＡＡＧについては、１ｎＭまたは１μＭ最終濃度）、３７℃で４時間（ＦＳＫ）または６時間（１７−ＡＡＧ）インキュベートした。プレートを恒温器から取り出し、２５分間、室温に対し平衡化させた。フォワードトランスフェクションについての上記の通りの１００μＬの溶解試薬を用いて、細胞を溶解させた。ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで発光を測定した。
表３１は、１０ｎＭ（「ベースライン」）または１０ｍＭ ＦＳＫで処理された、ＣＲＥを含有する転写レポーターを発現するＨＥＫ２９３細胞の発光、およびＦＳＫに対する応答を示している。表３２は、１０ｎＭ（「ベースライン」）または１０ｍＭ ＦＳＫで処理された、ＣＲＥを含有する転写レポーターを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の発光、およびＦＳＫに対する応答を示している。表３３は、１０ｎＭ（「ベースライン」）または１０ｍＭ １７−ＡＡＧで処理された、ＨＲＥを含有する転写レポーターを発現するＨｅＬａ細胞の発光、および１７−ＡＡＧに対する応答を示している。
表２９〜表３１は、１）９Ｂ８ｏｐｔ ＯｇＬｕｃ変異体の両バージョンとも、２つの異なる細胞株、ＨＥＫ２９３およびＮＩＨ３Ｔ３という背景において、ＣＲＥに対するＦＳＫの存在および刺激作用を報告することができること、並びに、２）９Ｂ８ ｏｐｔＰが、ＨｅＬａ細胞という背景において、ＨＲＥに対する１７−ＡＡＧの存在および刺激作用を報告することができることを示している。
表３１：ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＥを含有する転写レポーター（４時間の時点）
表３２：ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＣＲＥを含有する転写レポーター（４時間の時点）
表３３：ＨｅＬａ細胞におけるＨＲＥを含有する転写レポーター（６時間の時点）
実施例３８． 発現困難な細胞（Difficult to Express Cell）における溶解性レポーターおよび分泌型レポーター
細胞懸濁液中の１×１０5細胞／ｍＬのＨｅｐＧ２細胞に、プラスミドＤＮＡ（Ｌ２７Ｖ０２、ｌｕｃ２Ｐ（プロメガ社）、ｌｕｃ２（プロメガ社）またはＬ２７Ｖ０２−ＩＬ６（ＩＬ−６分泌配列と置き換えられた天然分泌配列を有するＬ２７Ｖ０２；（「ＩＬ６０１−Ｌ２７Ｖ０２Ａ」；配列番号３２４）を含有するｐＧＬ４．３２バックボーン；プロメガ社）を、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを用い、製造業者の取扱説明書に従って、リバーストランスフェクションした（ＤＮＡ−形質移入混合物対細胞が１：２０）。次に、１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレートのウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2で２２時間インキュベートした。ＩＬ−６分泌配列で置き換えられた天然分泌配列を有する他のＯｇＬｕｃコンストラクトとしては、ＩＬ６０１−Ｌ２７Ｖ０１およびＩＬ６０２−Ｌ２７Ｖ０３（それぞれ、配列番号３２１および３２７）が挙げられる。
分泌分析のために、培地を細胞から除去して、細胞を１００μＬのＤＰＢＳで洗浄した。１００μＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ）を、変動用量（１ｐｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＴＮＦα（「ＴＮＦα」）と一緒に、４．５時間加えた。次に、１０μＬの培地を取り出し、９０μＬの完全培地に加え、１００μＬのアッセイ試薬（前述と同様；１００μＭ ＰＢＩ−３９３９）を加えた。発光を前に記載した通りに測定した（図６２Ａ）。
溶解性分析のために、播種後、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で４．５時間インキュベートした。次に、細胞を２０分間、室温に対して平衡化した。アッセイ試薬（前述と同様；１００μＭ ＰＢＩ−３９３９）を細胞に加え、発光を前に記載した通りに測定した（図６２Ｂ）。
実施例３９． 溶解性レポーターの追加の特徴
細胞ベースの、溶解性転写レポーターという背景における本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、他のルシフェラーゼを用いて現れ得るよりも早くシグナルが現れる程の大きさの発光シグナルを提供するはずである。明るい発光によって、弱いプロモーターが試験されることも可能となるはずである。
実施例４０． 哺乳類細胞形質移入
本発明のＯｇＬｕｃ変異体を、形質移入困難な細胞株（difficult to transfect cell line）、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＨｅｐＧ２、初代細胞、非分裂初代細胞、または幹細胞（例えば、図５９Ｃ参照）において、レポーターとして使用した。それらの高いシグナル強度により、ＯｇＬｕｃ変異体は、形質移入効率が低い場合に、検出可能な発光を可能にする。ＯｇＬｕｃ変異体は、形質移入に関連する条件、すなわち、ＤＮＡ濃度、形質移入試薬添加に特に感受性を有する細胞においても、レポーターとして使用することができる。ＯｇＬｕｃ変異体の輝度により、適切な発光レベルを、より低いＤＮＡ濃度、より少ない形質移入試薬、および恐らくは、アッセイ開始前のより短い形質移入後時間を用いて、達成することができる。これは、そうでなければ感受性細胞であろうものに対して、毒性という負担をそれほど与えないであろう。ＯｇＬｕｃ変異体の明るい発光は、そのような出力が望ましい事象において、非常に長い時点で、シグナルが検出されることも可能にするはずである。別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体は、単一コピーの天然プロモーター、例えば、ＨＳＢチミジル酸キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ＨＯＸ遺伝子、またはＬＩＮ２８に対するレポーターとして使用され得る。
実施例４１． 安定した細胞株
細胞質中でまたは分泌型として本発明のＯｇＬｕｃ変異体を発現する、頑強で安定した細胞株の特定は、ルシフェラーゼの明るいシグナルおよび小サイズのＯｇＬｕｃ遺伝子によって容易となり得る。比較的小さな遺伝子配列は、外来ＤＮＡ組込みによってもたらされる遺伝的不安定性の可能性を減少させるはずである。
本発明のＯｇＬｕｃ変異体を用いて安定な細胞株を作製するために、ＯｇＬｕｃ変異体および選択マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンのヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡを、目的の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞の形質移入に使用する。初期継代数、例えば１０継代未満の細胞を、Ｔ２５（１×１０6）またはＴ７５（３×１０6）組織培養フラスコに播種し、一晩増殖させて、およそ７５％コンフルエントにする。次に、細胞を、上記プラスミドＤＮＡおよび適切な形質移入試薬、例えば、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴ１またはＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを用いて形質移入する。形質移入の４８時間後、培地を、細胞上で、選択薬剤、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはピューロマイシンを、未形質移入細胞を死滅させるのに予め決定された濃度で含有する選択培地で置き換える。プラスミドＤＮＡを含有する細胞の選択は２〜４週間かけて行われる。この期間中、細胞を、選択培地中で種々の濃度で、Ｔ２５またはＴ７５組織培養フラスコのいずれかに再播種する。再播種された細胞上の培地は、２〜３週間、３〜４日毎に、新しい選択培地と取り換える。フラスコは生細胞コロニーの情報を求めてモニターされる。最終的に、フラスコは、多くの大コロニーを含むが、死細胞はほとんど含まない。
フラスコ中の安定したコロニーのプールから、単一コロニーを単離し、１枚の２４ウェル組織培養プレート中に増殖させる。簡潔に説明すると、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ法を用いて回収する。すなわち、培地を除去し、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含有しないＰＢＳで洗い、トリプシン／ＥＤＴＡで処理することにより剥離して、細胞を回収する。細胞を、血球計数器を用いて計数し、完全培地中で１×１０5に希釈する。次に、細胞を、完全培地中で１００細胞／ｍＬ、３３細胞／ｍＬ、１０細胞／ｍＬ、および３．３細胞／ｍＬに希釈する。１００μＬの各希釈物を、９６ウェル組織培養プレートの全ウェルに播種し（各希釈に対し１プレート）、４〜５日間増殖させて、その後、５０μＬの選択培地を細胞に加える。播種からおよそ１週間後、細胞を、コロニー増殖を求めて目視で選別し、別の５０μＬの選択培地を加える。単一コロニーがウェルの面積の４０〜６０％を占めるまで、細胞を継続的にモニターする。コロニーが増殖および選別できる状態であるとき、トリプシン／ＥＤＴＡ法を用いてコロニーを回収する。各コロニーを以下のように選択培地に移す：１）機能アッセイ、例えば発光検出用に、１：１０に希釈して、９６ウェルアッセイプレートの６ウェルに移す；２）細胞生存率アッセイ、例えば細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（プロメガ社）用に、１：１０に希釈して、透明底９６ウェルアッセイプレートの３ウェルに移す；並びに３）増殖用に、１：１０に希釈し、２４ウェル組織培養プレートに移す。次に、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイ用のプレート中の細胞を２〜３日間増殖させて、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイを行う。２４ウェルプレート中の陽性クローンを、機能アッセイおよび細胞生存率アッセイを用いてさらに試験し、さらに、少なくとも２０継代の間の発現および応答の安定性、正常な増殖率形態を試験し、将来での使用のために可能な限り早期の継代で凍結する。
実施例４２． ＯｇＬｕｃ分泌シグナル分析
Ａ． ＩＶｏｐｔ
野生型ＯｇＬｕｃは、合成後に処理されて、分泌シグナル配列が切断された成熟タンパク質にされる。分泌シグナル配列がＯｇＬｕｃ変異体の分泌を促進するかどうかを決定するために、実施例２５のＩＶｏｐｔ変異体およびｈＲＬを、Ｎ末端ＯｇＬｕｃ分泌シグナル（配列番号５４）を含有するｐＦ４Ａｇにクローニングした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する１００μＬのダルベッコー修飾イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）中のＨＥＫ２９３細胞（１５，０００）に、実施例２５に記載の通りに、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、すなわち、分泌シグナルを含む、または含まないｈＲＬまたはＩＶｏｐｔを形質移入し、３７℃で一晩増殖させた。５０μＬの培地を取り出し、新しいプレートに移し、後のアッセイ用に保存し、「培地」試料を作製した。培地の残りを除去し、実施例２５に記載される１００μＬの溶解緩衝液で細胞を溶解させ、「溶解物」試料を作製した。１０μＬの培地試料および１０μＬの溶解物試料を発光についてアッセイした（図６３）。ＯｇＬｕｃ分泌シグナル配列を有する（「ウミシイタケ属（Renilla）ｓｉｇ」）または有さない（「ウミシイタケ属（Renilla）」）ｈＲＬの試料を、２０μＭ 天然セレンテラジンを含有する５０μＬの溶解緩衝液を用いて測定した。ＯｇＬｕｃ分泌シグナル配列を有する（「ＩＶｏｐｔ ｓｉｇ」）または有さない（「ＩＶｏｐｔ」）ＩＶｏｐｔの試料を、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する５０μＬの溶解緩衝液を用いて測定した。
図６３において、黒塗りのバーは、いかなる溶解試薬も存在しない培地から検出された光の量を表す。白いバーは、溶解試薬を添加したときに検出された光の合計（分泌物＋非分泌物）を表す。図６３は、ＩＶｏｐｔがＨＥＫ２９３細胞から増殖培地に分泌されたこと、および分泌シグナル配列が哺乳類細胞において機能的であったことを示している。「ＩＶｏｐｔ ｓｉｇ」は、かなりの量のルシフェラーゼが培地中で検出された唯一の状況を表している。結果は、この特定のシグナルペプチドがｈＲＬの分泌を促進しなかったことも示している。
Ｂ． ９Ｂ８、Ｖ２およびＬ２７Ｖ
ＯｇＬｕｃの分泌シグナル配列がその分泌を促進するかどうかを検定するために、ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８、Ｖ２およびＬ２７Ｖを、Ｎ末端ＯｇＬｕｃ分泌シグナル配列を含有するｐＦ４Ａｇにクローニングした。変異体を、分泌シグナル配列を含有しないベクターにもクローニングした。次に、ＣＨＯ細胞またはＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１×ピルビン酸ナトリウムを含有する１ｍＬのＦ１２培地（ＣＨＯ細胞）中、または１０％ＦＢＳおよび１×ピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ（ＨｅＬａ細胞）中で、１００，０００細胞／ウェルで、１２ウェルプレート中に播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。
一晩インキュベートした後、細胞に、分泌シグナル配列を含み、または含まずに、９Ｂ８、Ｖ２、またはＬ２７Ｖを含有する１μｇのプラスミドＤＮＡを、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴ１形質移入試薬（ミラスバイオ社（Mirus Bio））およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（インビトロジェン社）を用いて、形質移入した。再度、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。
２度目の一晩インキュベーションの後、培地を取り出し、分析用に保存した。細胞に、１ｍＬのアッセイ緩衝液（１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、３５ｍＭ チオ尿素および０．５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ））を加え、細胞溶解物を作製した。各試料から得られた１０μＬの細胞溶解物または保存した培地に、４０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する５０μＬのアッセイ緩衝液を加え、発光を上記の通りに測定した。図６４Ａ〜Ｄは、９Ｂ８、Ｖ２およびＬ２７Ｖ変異体が分泌系（secretable system）で使用できることを示す。
分泌された変異体の安定性を決定するために、各試料から得られた保存した培地の一定分量１５０μＬを、３７℃または５０℃に置いた。次に、その一定分量を異なる時点（０分、１分、２分、３分、５分、６分、および７分）で取り出し、ドライアイス上で凍結し、アッセイされるまで−２０℃に保った。安定性についてアッセイするため、培地の一定分量を室温まで解凍し、１０μＬの各一定分量を、上記の通りの、ＰＢＩ−３９３９を含有するアッセイ緩衝液（ｐＨ６．０）と混合した。発光を上記の通りに測定し、半減期（ｔ50）を決定した（表３４）。
表３４
Ｃ． ９Ｂ８およびＶ２と、メトリディア・ロンガ（Metridia longa）の分泌型ルシフェラーゼとの比較
ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８およびＶ２の分泌を、メトリディア・ロンガ（Metridia longa）から得られた分泌型ルシフェラーゼのそれと比較した。ＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳを含有する３ｍＬのＦ１２培地中で３００，０００細胞／ウェルで、６ウェルプレートのウェル中に播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。次に、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴＩを用い、製造業者の取扱説明書に従って、１０ｎｇまたは１００ｎｇの各変異体またはメトリディア（Metridia）ルシフェラーゼ（クロンテック社）プラスミドＤＮＡを、細胞に形質移入し、３７℃、５％ＣＯ2で２０時間インキュベートした。形質移入後、培地を細胞から取り出して、アッセイした。ＯｇＬｕｃ変異体については、５０μＬのアッセイ試薬（前述；４０μＭ ＰＢＩ−３９３９）を用いて、５０μＬの培地をアッセイした。メトリディア（Metridia）ルシフェラーゼについては、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｌｏ（商標）分泌型ルシフェラーゼレポーター系（クロンテック社）を用い、製造業者のプロトコルに従って、培地をアッセイした。簡潔に説明すると、５μＬの１×基質／反応緩衝液を５０μＬの培地試料に加えた。次に、発光を前に記載した通りに測定した（図６５Ａ〜Ｂ）。
実施例４３． 生細胞中でのＯｇＬｕｃ変異体および新規セレンテラジンの評価
Ａ． 生細胞中でのＯｇＬｕｃ変異体およびＰＢＩ−３９３９の使用を試験した。ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレート中に、１５，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃で一晩増殖させた。次の日、細胞に、３連でＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴ１を用いて、ｐＦ４Ａｇ中の１００ｎｇのｈＲＬまたは９Ｂ８ｏｐｔを一過的に形質移入し、３７℃で一晩増殖させた。次の日、ｈＲＬおよび９Ｂ８ｏｐｔ形質移入細胞の両方について、増殖培地を除去し、６０μＭ ＶＩＶＩＲＥＮ（商標）生細胞基質（プロメガ社）、６０μＭ ＥＮＤＵＲＥＮ（商標）生細胞基質（プロメガ社）、または６０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する培地で置き換えた。非形質移入細胞はバックグラウンド対照として使用した。プレートを３７℃で１日間インキュベートし、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＧＥＮＩＯＳ（商標）プロ・ルミノメーターで定期的に、すなわち２４時間の間に１１回測定した。図６６Ａ〜Ｂは、各基質について、非形質移入細胞の発光で除算された形質移入細胞の発光、すなわちシグナル／バックグラウンド比を示している。データは、細胞をＶＩＶＩＲＥＮ（商標）、ＥＮＤＵＲＥＮ（商標）、またはＰＢＩ−３９３９と一緒にインキュベートすることによって、９Ｂ８ｏｐｔが生細胞環境（すなわち、溶解無し）において発光を生じたことを示している。データは、ＰＢＩ−３９３９が培養液中の細胞に浸透し、ＯｇＬｕｃ変異体と反応し、発光を生じることができ、それ故、ＯｇＬｕｃ変異体を生細胞アッセイにおける使用に適合することも明らかにした。
Ｂ． ＯｇＬｕｃ変異体を用いて生細胞分析を実証するために、Ｌ２７ＶをＨａｌｏＴａｇ（登録商標）に融合させ、生細胞中で発現させてモニターした。Ｕ２ＯＳ細胞を、４０，０００細胞／ｍＬでイメージング・チャンバ・ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。次に、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを用い、製造業者のプロトコルに従って、Ｌ２７Ｖを含有するプラスミドｐＦＣ１４Ｋ、ｐＦＮ２１ＫもしくはｐＦ４Ａｇ（全てプロメガ社）、または天然配列もしくはＩＬ−６分泌配列を有する、Ｌ２７Ｖを含有するｐＦ４Ａｇを、細胞に形質移入した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。
インキュベートした後、細胞をＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンド（プロメガ社）に暴露し、画像取得し、固定した。次に、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）技術におけるＩＣＣプロトコル：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ技術マニュアル（プロメガ社；ＴＭ２６０）に従って、免疫細胞化学（ＩＣＣ）を行った。使用した一次抗体は、ウサギ抗ＯｇＬｕｃ９Ｂ８ポリクローナル抗体（１：１０００）であった。使用した二次抗体は、アレクサ４８８結合二次抗体（緑）であった（図６７Ａ）。図６７Ａは緑色蛍光チャネルを示しており、図６７Ｂは微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を示している。３７℃＋ＣＯ2雰囲気試料室（ソーレント・サイエンティフィック社（Solent Scientific Ltd.）、イギリス）を取り付けた、オリンパス社製Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ５００共焦点顕微鏡（オリンパス社、米国）を用いて、画像を得た。
図６７Ｂ〜Ｄは、天然配列またはＩＬ−６分泌配列を有する場合の、ＩＣＣイメージを示している。両方のシグナル配列が、核内の酵素量を劇的に減少させる。細胞質における標識化の区切り性質（punctuate nature）は、分泌過程で起こることが予測されるベシクル形成を示すものである。データは、シグナルペプチドの存在が核中のルシフェラーゼ量を減少させることを示す。
Ｃ． 上で示されるように、本発明のＯｇＬｕｃ変異体および新規基質は生体適合性である。ＯｇＬｕｃ変異体が目的のプロモーターを有する発現ベクターにクローニングされ、レポータータンパク質として細胞中で発現されるという、レポーター系が想定される。次に細胞は、培養下の細胞に浸透し、ＯｇＬｕｃ変異体と反応し、発光を生じるＰＢＩ−３９３９で処理される。
細胞浸透性であることに加えて、ＰＢＩ−３９３９は、細胞生存率の点で天然セレンテラジンに匹敵する生体適合性を示す。培地中の天然セレンテラジンの安定性を増加させることが知られている化学修飾を含むあるバージョンの化合物３９３９は、合成可能で、より頑強な生細胞でのＯｇＬｕｃ変異体ベースのレポーターアッセイに使用することができる。生細胞でのレポーター機能（reporting）の別の例には、分泌型ＯｇＬｕｃ変異体のレポーターとしての使用が含まれる。天然の分泌シグナルペプチド（または他の既知の分泌シグナルペプチド）は、ＯｇＬｕｃ変異体のＮ末端に融合することができ、それによって、該融合体が哺乳類細胞で発現される場合に、その一部分が細胞膜を貫通して培地中に分泌される。基質を添加すると、発光が生み出される。
実施例４４． タンパク質融合レポーター
本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、目的の標的タンパク質に対する融合タグとして、その標的タンパク質の細胞内レベルをモニターする手段として使用することができる。ストレス応答経路、例えば、ＤＮＡ損傷、酸化的ストレス、炎症に関わる特定のタンパク質は、各種の刺激がこれらの経路で果たす役割を探索する手段として、細胞中でモニターすることができる。変異体は、標的タンパク質の細胞輸送をモニターする手段としても使用することができる。変異体は、ウイルスゲノム（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）にも融合することができ、それにより、有望な抗ウイルス剤での処理の後に、力価レベル、すなわち感染価を細胞中でモニターすることができる。変異体は（標的タンパク質に加えて）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＨａｌｏｔａｇ（登録商標）にも融合することができ、それによって、高発現クローンを特定し、局在情報を提供するのにＦＡＣＳを使用することができる。
実施例４５． ３成分融合タンパク質（「サンドイッチ」）におけるＯｇＬｕｃ変異体の評価
３成分融合タンパク質、または「サンドイッチ」融合体は、ＢＲＥＴに基づくバイオセンサーの最適化のために、生物発光タンパク質および蛍光タンパク質を互いに近くに配置するのに使用することができる。
Ａ． Ｃ１＋４ＡＥ、ＩＶ、９Ｂ８および９Ｆ６
ＯｇＬｕｃ変異体Ｃ１＋４ＡＥ（配列番号５５および５６）、ＩＶ（配列番号５７および５８）、９Ｂ８（配列番号６１および６２）、および９Ｆ６（配列番号６３および６４）、並びにｈＲＬ（配列番号３２および３３）を、不良な融合パートナーとして知られるＮ末端Ｉｄ（Benezra et al., Cell, 61(1):49-59 (1990)）、および正規化のために用いられたＣ末端ＨＴ７を有するｐＦ４Ａｇ融合ベクターに、クローニングした。目的の遺伝子をＩｄとＨＴ７の間に「サンドイッチ」した（すなわち、Ｉｄ−ルシフェラーゼ−ＨＴ７）。ｐＦ４ＡｇまたはｐＦ４Ａｇサンドイッチバックグラウンドにおいて変異体コンストラクトを含有する大腸菌（E. coli）溶解物を、実施例２６に記載の通りに調製し、次に、実施例２５に記載の緩衝液中の２０μＭ 天然セレンテラジンを用いてアッセイした。
図６８は、ｐＦ４ＡｇまたはｐＦ４Ａｇサンドイッチバックグラウンドのいずれかにおける各変異体の発光を示している（「Ｓａｎｄ」）。図６９は、ＩｄおよびＨＴ７の存在による、ｐＦ４Ａｇにおける変異体の発光をｐＦ４Ａｇ−サンドイッチにおける変異体の発光で除算することによって決定された、発光における低減倍率を示している。最大値を有する試料は、不良な融合パートナーＩｄに対して最も高い感受性を示した。変異体９Ｂ８は、サンドイッチ背景において最も明るかった。
Ｂ． ９Ｂ８ＯＰＴおよび９Ｂ８ＯＰＴ＋Ｋ３３Ｎ
変異体９Ｂ８ｏｐｔおよび９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎを、上記の通りに、サンドイッチバックグラウンドにおいて分析した。９Ｂ８ｏｐｔ（配列番号４０および４１）および９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（配列番号５９および６０）のサンドイッチコンストラクトを、上記の通りに構築した。大腸菌（E. coli）溶解物を、図４０を作製するのに用いたものと同じアッセイ緩衝液およびルミノメーターを用いて、アッセイし、測定した。図７０は、サンドイッチバックグラウンドの存在下における低減倍率を示しており、これは、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎが、９Ｂ８ｏｐｔと比べて、不良な融合パートナーＩｄに対する感受性が低いことを示している。
Ｃ． ２３Ｄ２および２４Ｃ２
変異体２３Ｄ４（ＮＦ）および２４Ｃ２（ＮＦ）をＩｄ−ＯｇＬｕｃ−ＨＴ７サンドイッチバックグラウンドにサブクローニングし、大腸菌（E. coli）においてアッセイした。サンドイッチ変異体、２３Ｄ４（Ｆ）（配列番号７６および７７）および２４Ｃ２（Ｆ）（配列番号７８および７９）を、サンドイッチバックグラウンドにおける９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ（配列番号５９および６０）と比較した。表３５は、変異体が、サンドイッチバックグラウンド（background context）における９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎと少なくとも同じ発光を有していたことを示している。
表３５：サンドイッチバックグラウンドにおける９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋１７０Ｇと比較した場合の、ＯｇＬｕｃ変異体により発せられる発光の増加
Ｄ． １Ｆ７および１５Ｈ１
Ｉｄ−ＯｇＬｕｃ−ＨＴ７サンドイッチバックグラウンドにおけるＰＣＲライブラリーを、サンドイッチバックグラウンドにおける９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎと比較して増加された発光を有する追加の変異体を求めてスクリーニングした。次に選別された変異体をＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞においてアッセイした。表３６は、大腸菌（E. coli）、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞での、サンドイッチ変異体の発光における増加倍率、並びにこれらの変異体に存在するアミノ酸置換を示している。１Ｆ７（Ｆ）（配列番号８４および８５）および１５Ｈ１（Ｆ）（配列番号８６および８７）は、大腸菌（E. coli）での発光において少なくとも１．３の増加倍率を有していた。１Ｆ７（Ｆ）は、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞での、サンドイッチバックグラウンドにおける９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎよりもより明るかった。
表３６：サンドイッチバックグラウンドにおける９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎと比較した場合の、ＯｇＬｕｃ変異体により発せられる発光の増加
サンドイッチ変異体をｐＦ４Ａｇベースの非融合型バックグラウンドベクターにサブクローニングして１Ｆ７（ＮＦ）（配列番号８０および８１）および１５Ｈ１（ＮＦ）（配列番号８２および８３）を作製し、上記の通りに分析し、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎと比較した。表３７は、大腸菌（E. coli）、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞での、変異体の発光における増加倍率を示している。１Ｆ７（ＮＦ）および１５Ｈ１（Ｆ）は、大腸菌（E. coli）およびＨＥＫ２９３細胞での発光において少なくとも１．３の増加倍率を有していた。
表３７：９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋１７０Ｇと比較した場合の、ＯｇＬｕｃ変異体により発せられる発光の増加
Ｅ． Ｖ２、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｓ６６ＮおよびＬ２７Ｖ
変異体９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ（「Ｖ２」；配列番号９２および９３）、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ（配列番号３３９および３４０）、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｓ６６Ｎ（配列番号３４１および３４２）、および９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ（「Ｌ２７Ｖ」；配列番号８８および８９）を、上記の通りにＩｄ−ＯｇＬｕｃ−ＨＴ７サンドイッチバックグラウンドにサブクローニングし、上記の通りにＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞においてアッセイした。サンドイッチされた変異体により発せられた発光を、９Ｂ９ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎサンドイッチ（配列番号５９および６０）により発せられた発光（表３８）と比較した。Ｌ２７Ｖサンドイッチ（配列番号９０および９１）およびＶ２サンドイッチ（配列番号９４および９５）は、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞での発光において少なくとも１．３の増加倍率を示した。
表３８：サンドイッチバックグラウンドにおける９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎと比較した場合の、サンドイッチバックグラウンドにおけるＯｇＬｕｃ変異体により発せられた発光における増加
変異体Ｖ２、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｙ６８Ｄ、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎ＋Ｌ２７Ｖ＋Ｔ３９Ｔ＋Ｋ４３Ｒ＋Ｓ６６Ｎ、およびＬ２７Ｖのサンドイッチバージョンおよび非サンドイッチバージョンを、実施例３７に記載の通りにＨＥＫ２９３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞においてアッセイした。非サンドイッチ型変異体により発せられた発光を、サンドイッチ型変異体により発せられた発光と比較した（表３９）。表３９に示されるデータは、図７０に示されるように、９Ｂ８ｏｐｔ＋Ｋ３３Ｎサンドイッチの発光における低減倍率が、大腸菌（E. coli）細胞においてよりも、哺乳類細胞においてより少なかったことを示している。
表３９：サンドイッチバックグラウンド存在下でのＯｇＬｕｃ変異体の発光における減少倍率
実施例４６． 多重化
Ａ． 変異体９Ｂ８ｏｐｔを発現する大腸菌（E. coli）の溶解物を、実施例２７における先の記載の通りに調製し、フェノールレッド無しのＤＭＥＭ＋０．１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）中で１０００倍に希釈した。６．３μｇ／ｍＬの精製赤色コメツキムシルシフェラーゼおよび変異体９Ｂ８ｏｐｔを発現する大腸菌（E. coli）溶解物を含有する試料からの発光を、改変されたＤＵＡＬ−ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社）を用いて、検出した。２０μＭ セレンテラジン−ｈを含有するＤＵＡＬ−ＧＬＯ（登録商標）ＳＴＯＰ＆ＧＬＯ（登録商標）試薬、および２０μＭ ＰＢＩ３９３９を含有するＤＵＡＬ−ＧＬＯ（登録商標）ＳＴＯＰ＆ＧＬＯ（登録商標）試薬を、製造業者のプロトコルに従って使用し、単一試料からの赤色コメツキムシルシフェラーゼおよびＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８ルシフェラーゼを検出した。３連で実行した。
発光をターナー社（Turner）製ＭＯＤＵＬＵＳ（商標）ルミノメーターで検出した。表４０は、赤色コメツキムシルシフェラーゼ（「コメツキムシ」）により発せられた平均発光、およびセレンテラジン−ｈ（「ｃｏｅｌ ｈ」）またはＰＢＩ−３９３９（「３９３９」）を使用した場合に９Ｂ８ｏｐｔ（「Ｏｇｌｕｃ」）により発せられた発光を示している。標準偏差（「＋／−」）および変動係数（「ＣＶ」）も示される。セレンテラジン非存在下における、ＤＵＡＬ−ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系のＤＵＡＬ−ＧＬＯ（登録商標）ＳＴＯＰ＆ＧＬＯ（登録商標）試薬による赤色コメツキムシシグナルの消光量を示すために、「セレンテラジン無し」対照を行った。「セレンテラジン無し」対照は、３４９倍の消光をもたらした。表４０は、赤色コメツキムシおよびＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８両方からの大きな発光シグナルが、単一試料で検出されたことを示している。このことは、各シグナルが、２段階アッセイにおいて連続して読み取り可能であること、および、第一酵素からのシグナルが第二酵素からのシグナルに有意な寄与を与えないだけ十分に消光され得ることを示す。
表４０：改変されたＤＵＡＬ−ルシフェラーゼ（商標）レポーターアッセイを用いた、赤色コメツキムシルシフェラーゼおよび９Ｂ８ｏｐｔルシフェラーゼにより発せられた平均発光
Ｂ． 上記の多重レポーターアッセイを逆順（すなわち、ＯｇＬｕｃ発光を最初に検出し、消光し、そして第二発光を検出）で行うことができることを示すために、例えば、赤色コメツキムシまたはホタルルシフェラーゼ、種々のウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ阻害剤（米国特許出願公開第２００８／０２４８５１１号参照）を、ＯｇＬｕｃも阻害するそれらの能力を求めてスクリーニングした。２つの異なる、先に特定された、ウミシイタケ属（Renilla）阻害剤、ＰＢＩ−３０７７および１４２４を、変異体９Ｂ８（上記の通りに希釈）を発現する大腸菌（E. coli）溶解物試料、並びに１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ チオ尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．０２５％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４、および２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有する緩衝液に、種々の濃度で（表４１参照）加えた。発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）−マルチマイクロプレートルミノメーター（プロメガ社；ターナー社製ＭＯＤＵＬＵＳ（商標）としても知られている）を用いて測定したこと以外は前に記載した通りに、発光を測定した。表４１に示されるように、両化合物がＯｇＬｕｃ発光を阻害することができた。このことは、レポーターアッセイにおいてＯｇＬｕｃ変異体が別のルシフェラーゼと多重化され得、ＯｇＬｕｃ変異体からの発光が、レポーターアッセイにおいて最初に検出されるということを示す。
表４１：ＰＢＩ−３９３９を基質として用いて、９Ｂ８ｏｐｔを発現する細菌溶解物により発せられた発光に対する、ＰＢＩ−３０７７およびＰＢＩ−１４２４の影響
Ｃ． ＯｇＬｕｃ変異体Ｌ２７Ｖとホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）間のスペクトル分解を解析した。フェノールレッド無しのＤＭＥＭ＋０．１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）中の精製Ｌ２７Ｖ（前述；９．５４ｐＭ）を、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有するアッセイ試薬（前述）と混合した。同じ培地中の精製ホタルルシフェラーゼ酵素（ＱＵＡＮＴＩＬＵＭ（登録商標）組換えルシフェラーゼ；プロメガ社；２７１ｎｇ／ｍＬ）を、試薬（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１６ｍＭ ＭｇＳＯ4、１％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．１％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４、５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＤＴＴ、３３３μＭ ルシフェリン）と混合した。１×ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼアッセイ溶解緩衝液（プロメガ社）中の精製ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（５ｎｇ／ｍＬ ＧＳＴ−ウミシイタケ属（Renilla)）を、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液中の１０．５μＭの天然セレンテラジンと混合した。Ｌ２７ＶおよびＦｌｕｃについては３分後に、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼについては１０分後に、発光を測定した（図７１）。
Ｄ． 別の例として、本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、転写レポーターとして使用することができ、エクオリンまたはｃＡＭＰ循環置換型ホタルルシフェラーゼバイオセンサーのいずれか（または両方同時に）と対合して、単一試料における複数の経路を検出することができる（例えば、エクオリンはカルシウムの検出および／または測定用、バイオセンサーはｃＡＭＰの検出および／または測定用、そしてＯｇＬｕｃ変異体は下流の遺伝子発現のモニタリング用）。
Ｅ． 本発明のＯｇＬｕｃ変異体との多重化の他の例としては、以下が挙げられる：
ｉ）細胞に本発明のＯｇＬｕｃ変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、第一試薬が、細胞を溶解させるために、並びに、第一のルシフェラーゼに発光を発するための基質を提供するために、添加され得る。次に、第一ルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。次に、第二の試薬が、第一ルシフェラーゼからの発光を消光するために、並びに、第二のルシフェラーゼから発光を生み出すための基質を提供するために、加えられることとなる。次に、第二のルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。どのルシフェラーゼを最初に測定するかの選択は、第二の試薬による、第一ルシフェラーゼからの発光を消光する能力にのみ依存することになるであろう。この例において、高濃度のルシフェリン（ホタルルシフェラーゼに対する基質）はＯｇＬｕｃ変異体の活性を阻害することが示されているため、ＯｇＬｕｃ変異体からの発光は最初に測定され得る。
ｉｉ）細胞に、本発明のＯｇＬｕｃ変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、第一のルシフェラーゼのための、発光を発するための生細胞基質を含有した第一試薬が添加され得る。次に、第一ルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。次に、第二の試薬が、細胞を溶解させるために、第一ルシフェラーゼからの発光を消光するために、そして第二のルシフェラーゼから発光を生み出すための基質を提供するために、加えられることとなる。次に、第二のルシフェラーゼからの発光が測定されることとなるであろう。これは、細胞溶解が、生細胞基質の利用をさらに制限し、第一ルシフェラーゼからの発光の消光に寄与すること以外は、ｉ）と類似している。
ｉｉｉ）細胞に本発明のＯｇＬｕｃ変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、両方のルシフェラーゼから発光を発するための基質を含んでいた１つの試薬が添加され得るが、各ルシフェラーゼからの発光はスペクトル的に異なっている。ＯｇＬｕｃ変異体の発光極大はおよそ４６０ｎｍであり、ホタルルシフェラーゼに対するある基質、例えば５’−クロロルシフェリンおよび５’−メチルルシフェリンは、およそ６１０ｎｍの発光極大を生み出すことができる。従って、青色発光から赤色発光へのいくらかの重なりは存在し得るが、青色発光への赤色発光の重なりは存在しないであろう。このことは、数学的補正はほとんど含まれるないであろうことを示唆している。
ｉｖ）細胞に本発明のＯｇＬｕｃ変異体およびホタルルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、両方のルシフェラーゼから発光を発するための生細胞基質を含んでいた１つの試薬が添加され得る。この例の独自の特徴は、ホタルの発光が、生細胞アッセイ温度、例えば３７℃で、赤色に変化する傾向があり、そのため、いくつかの異なるルシフェリン誘導体が、ＯｇＬｕｃ変異体のとはスペクトル的に異なる発光を発するために、ホタルルシフェラーゼに対する生細胞基質として選択され得るということである。
ｖ）細胞に本発明のＯｇＬｕｃ変異体およびウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、第一試薬が、細胞を溶解させるために、並びに、第一のルシフェラーゼに発光を発するための基質を提供するために、添加され得る。次に、第一ルシフェラーゼからの発光が測定されることとなる。次に、第二の試薬が、第一ルシフェラーゼからの発光を消光するために、並びに、第二のルシフェラーゼから発光を生み出すための基質を提供するために、加えられることとなる。次に、第二のルシフェラーゼからの発光が測定されるだろう。どのルシフェラーゼを最初に測定するかの選択は、第二の試薬による、第一ルシフェラーゼからの発光を消光する能力にのみ依存するであろう。この例として、ＯｇＬｕｃ変異体またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼのいずれかの発光を消光するための阻害剤の使用が、必要とされるだろう。
ｖｉ）細胞に本発明のＯｇＬｕｃ変異体およびコメツキムシルシフェラーゼを含有するコンストラクトを形質移入すること。形質移入後、両方のルシフェラーゼから発光を発するための基質を含んでいた１つの試薬が添加され得るが、コメツキムシルシフェラーゼは天然ルシフェリンによって赤色に変化した発光を発するため、各ルシフェラーゼからの発光はスペクトル的に異なっている。
実施例４７． 循環置換
Ｌ２７Ｖ変異体の循環置換（ＣＰ）バージョンを２つ作製した：ＣＰ８４およびＣＰ９５。数字記号はＮ末端の残基を指す（例えば、「８４」は、ＣＰバージョンの新しいＮ末端を表す。）。
循環置換を作製するために、先のＮ末端およびＣ末端は、リンカー無し（「ＣＰ８４ リンカー無し」（配列番号９７および９８）、「ＣＰ９５ リンカー無し」（配列番号１０５および１０６））または５（「ＣＰ８４ ５ＡＡリンカー」（配列番号９９および１００）および「ＣＰ９５ ５ＡＡリンカー」（配列番号１０７および１０８）、１０（「ＣＰ８４ １０ＡＡリンカー」（配列番号１０１および１０２）および「ＣＰ９５ １０ＡＡリンカー」（配列番号１０９および１１０）、または２０（「ＣＰ８４ ２０ＡＡリンカー」（配列番号１０３および１０４）および「ＣＰ９５ ２０ＡＡリンカー」（配列番号１１１および１１２）アミノ酸リンカー、（ＧＳＳＧＧ）ｎ（配列番号１１３）と、Ｎ末端およびＣ末端間で融合される。（注意：Ｌ２７ＶはＮ末端でフェニルアラニンから始まる（すなわち、ＭＶＦ）。「ＭＶ」は「リンカー無し」コンストラクト中に存在するが、「リンカー」コンストラクト）中には存在しない。一度循環置換されると、ＣＰ Ｌ２７Ｖ変異体は、ｐＦ１Ｋベクターにクローニングされた。大腸菌（E. coli）細胞にＣＰベクターを形質移入し、前述の標準的なウォーク・アウェイ誘導プロトコルを用いて最少培地中で増殖させた。各ＣＰコンストラクトのために、細胞を９６ウェルプレートの８ウェル中で増殖させた。誘導後、各試料からの前記８ウェルをプールし、１０μＬを、４０μＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．３×ＰＬＢ、０．３ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、０．００３Ｕ／μＬ デオキシリボヌクレアーゼＩ、および０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ））中で、溶解させた。次に、溶解物を溶解緩衝液中で１：１００（リンカーを有するＣＰバージョン）または１：１０００（非ＣＰバージョン）に希釈した。リンカーを含まないＣＰバージョンは希釈しなかった。溶解物または溶解希釈物を、５０μＬのアッセイ試薬（前述）中で、３連でアッセイした。発光を前に記載した通りに測定した（図７２）。
実施例４８． 循環置換のための追加の部位の特定
追加のＣＰ部位を特定し、ルシフェラーゼ活性に対するそのＣＰ部位の影響を決定し、断片間の「つなぎ鎖（tether）」の使用を研究するために、Ｌ２７Ｖ変異体のおよそ３番目の部位（すなわち、アミノ酸）毎に作製された循環置換を有するＣＰコンストラクトを構築した（図７３Ｅ参照）。当業者であれば、他の部位、例えば、１番目および２番目の部位も、本明細書に記載の方法を用いて、本明細書に記載の循環置換されたＯｇＬｕｃ変異体において試験および使用が可能であることを理解するであろう。例えば、Ｌ２７Ｖ変異体は、循環置換、特に、比較的大きな結合ドメインが置換された断片（例えばｃＡＭＰ／ＲＩＩｂＢベースのセンサー）の間に配置される状況に対して、特に寛容性があることが分かっている。それぞれの部位に、
（配列番号３２８）を加えた。下線を引いた配列は、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位を指す。リンカーの目的は、２つの変異体断片間に、機能的なルシフェラーゼ酵素を生成する方法においてそれらが結合できるように、十分長いつなぎ鎖を提供することである。ＴＥＶプロテアーゼ認識部位は、活性を維持することに対するその重要性を調査することができるように、つなぎ鎖を破壊するための手段を提供するために使用された（ＴＥＶプロテアーゼの存在下で）。ＴＥＶプロテアーゼ認識部位の使用は、どのＣＰ部位がタンパク質相補試験（ＰＣＡ）に、またはバイオセンサー応用（例えば、ＣＰ部位間への応答要素の挿入）に有用であるかを予測するための方法を作った。
ＴＥＶ切断前に見られる活性は、変異体酵素の各半分が繋ぎ止められた状態でどのように振る舞うかを表す。認識部位に結合するＴＥＶは切断を引き起こし、それによって変異体酵素の各半分を分離させる。ＴＥＶにより切断された試料は、非誘導状態を表し、どのくらいの量のバックグラウンドが予想され得るかの指標となるだろう。ＴＥＶ切断後の低活性は、各半分が誘導無しでは集合することができないことを示している。ＴＥＶ切断後に大きな活性喪失を示す試料は、ＰＣＡおよびバイオセンサー応用において機能するであろう部位を示す。ＰＣＡの場合、変異体酵素の各半分は、誘導による結合事象の後に集合する（繋留する）ことができる結合パートナーに融合されることとなる。バイオセンサーの場合、各半分は、結合が誘導される立体構造変化が起こった後に、「繋留する」こととなる。ＰＣＡについての一例は、Ｌ２７Ｖの半分の一方をＦＲＢに、もう一方の半分をＦＫＢＰに融合させることとなるであろう。各半分は、ラパマイシンへの暴露によって近くまで運ばれることとなる（Banaszynski et al., J. Am. Chem. Soc, 127(13):4715-4721(2005)）。バイオセンサー応用の一例は、サイクリックＡＭＰ結合ドメイン（例えば、ＲＩＩｂＢ）をＣＰ部位間に挿入し、結合ドメインへのサイクリックＡＭＰの結合によって立体構造変化を誘導することであろう。
各ＣＰ Ｌ２７Ｖコンストラクトを構築した後、ＣＰ酵素をコムギ胚芽、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）および哺乳類細胞中で発現させ、ＴＥＶプロテアーゼで消化して、ルシフェラーゼ活性を調べた。
１． コムギ胚芽での分析のために、ＣＰコンストラクトを、ＴｎＴ（登録商標）Ｔ７カップリングコムギ胚芽抽出系（プロメガ社）を用い、製造業者の説明書に従って、発現させた。次に、ＴｎＴ（登録商標）反応物を１×ＰＢＳ＋０．１％ゼラチン中で１：１００に希釈し、２０μＬを、２５μＬのＴＥＶ反応試薬（５μＬの２０×ＰｒｏＴＥＶ緩衝液（プロメガ社）、１μＬの１００ｍＭ ＤＴＴ、および２μＬの１０Ｕ ＰｒｏＴＥＶ Ｐｌｕｓ（プロメガ社））に加えた。消化反応物の体積を水で１００μＬにして、３０℃で６０分間インキュベートした。ＴＥＶプロテアーゼを含まない対照試料も調製した。次に、１０μＬの消化試料を、４０μｌのＤＭＥＭに加え、最終体積を５０μＬにし、５０μＬのアッセイ試薬（前に記載した通り；１００μＭ ＰＢＩ−３９３９）中でアッセイした。発光を前に記載した通りに測定した（図７３Ａ〜Ｄ）。
２． 哺乳類細胞での分析のために、逆トランスフェクションプロトコルを用いて、ＨＥＫ２９３細胞にＣＰ Ｌ２７Ｖ変異体を形質移入した。簡潔に説明すると、１ｎｇのＣＰ Ｌ２７ＶプラスミドＤＮＡを１μｇの担体ＤＮＡと混合し、１２ウェルプレートの１ウェル中の細胞に加えた。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で１６時間インキュベートした。次に、細胞から培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗い、１ｍＬの１×ＰＬＢを加えることによって、細胞溶解物を調製した。次に、溶解物を０．１％ゼラチンを含有する１×ＰＢＳ中で１：１０に希釈した。次に、４０μＬの希釈溶解物を、上記の通りのＴＥＶプロテアーゼ消化で使用した。１０μＬの消化物をフェノールレッドを含まない４０μＬのＤＭＥＭと混合し、５０μＬのアッセイ試薬（前述；１００μＭ ＰＢＩ−３９３９）を加えた。発光を前に記載した通りに測定した（図７３Ｈ）。
３． 大腸菌（E. coli）での分析の場合、ＣＰ Ｌ２７Ｖ変異体を発現する大腸菌（E. coli）培養物を、３０℃で一晩増殖させた。これらの培養物を使用して（ＬＢ＋抗菌剤中で１：１００に希釈）、最終的な誘導用の新しい出発培養物を作製した。出発培養物を、３７℃で２．５時間、振盪させながらインキュベートした（ＯＤ600はおよそ０．５である）。ラムノース（０．２％の最終濃度）を加え、培養物を２５℃に移し、１８時間、振盪させながらインキュベートした。
溶解物を作製するために、５０μＬの０．５×ＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）細胞溶解試薬（プロメガ社）を、９５０μＬの誘導された培養物に加え、混合物を２２℃で３０分間インキュベートした。次に５０μＬの溶解した培養物を、上記の通りにＴＥＶプロテアーゼで消化し、室温で２時間インキュベートした。
分析のために、溶解物をＨａｌｏＴａｇ（登録商標）哺乳類精製緩衝液（プロメガ社）中で１：１０，０００に希釈し、５０μＬを、５０μＬのアッセイ試薬（前に記載した通り；１００μＭ ＰＢＩ−３９３９）中でアッセイした。基底発光およびＴＥＶにより誘導された発光を、前に記載した通りに、５分の時点で測定し（図７３Ｆ）、応答（図７３Ｇ）を決定した。
図７３Ａ〜Ｄは、小麦胚芽抽出物で発現された種々のＣＰ−ＴＥＶプロテアーゼ Ｌ２７Ｖコンストラクトの基底発光を示している。図７３Ｅは、ＴＥＶプロテアーゼに反応した、誘導されたＣＰ変異体を要約したものであり（反応は低減倍率）、これは、ＣＰ変異体をＴＥＶセンサーとして使用できること、すなわち、それらが「つなぎ鎖依存性」を表すことを示している。少なくとも１．２倍の変化を示す変異体を、スチューデントの検定（対応なしのｐ値；０．０３の信頼水準）を用い、表示として、さらに妥当性検証した。これらの結果は、各ＣＰ変異体が発光を発することが可能であることを示している。
種々のＣＰ−ＴＥＶプロテアーゼＬ２７ＶコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。前に記載した逆トランスフェクションプロトコルを用いて、１μｇの担体ＤＮＡと一緒に、１ウェルあたり１ｎｇのＤＮＡを形質移入した。各細胞試料を、１２ウェルプレートにおいて、１ｍＬの培地中で増殖させた。培地を除去し、１ｍＬの１×ＰＬＢを添加することで細胞溶解物を調製した。試料を１×ＰＢＳ＋０．１％ゼラチン中で１：１０に希釈した。４０μＬの希釈試料をＴＥＶ消化用に準備した。１０μＬの消化反応物を、前に記載した通りに、フェノールレッドを含有しない４０μＬのＤＭＥＭおよび５０μＬのＰＢＩ−３９３９に加えた。図７３Ｈは、ＨＥＫ２９３細胞で発現された種々のＣＰ−ＴＥＶプロテアーゼＬ２７Ｖコンストラクトの発光を示している。
図７３Ａ〜Ｈ中のデータは、Ｌ２７Ｖ変異体を様々な部位で循環置換できること、および異なる部位がつなぎ鎖の長さと関連した異なる依存性を有していることを示す。哺乳類細胞のデータおよびコムギ胚芽のデータは、ＴＥＶ切断による同様の低減倍率を示している。つなぎ鎖により依存的な、すなわち、よりＴＥＶプロテアーゼ開裂に対する感受性がより高いＣＰ Ｌ２７Ｖ変異体は、ＰＣＡの有望な候補である。つなぎ鎖に対する依存性がより低いＣＰ Ｌ２７Ｖ変異体は、自己相補／二量体化アッセイの有望な候補であり得る。
実施例４９． タンパク質相補試験
タンパク質相補試験（ＰＣＡ）は、２つの生体分子、例えばポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。ＰＣＡは、互いに接近させられた場合に機能的な活性タンパク質に再構成され得る、同一タンパク質、例えば酵素の２つの断片を利用する。本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、分離に寛容性のある部位で、２つの断片に分離され得る。その後、分離されたＯｇＬｕｃ変異体の各断片は、相互作用すると考えられている目的のポリペプチド対（例えばＦＫＢＰおよびＦＲＢ）のうちの一方に融合され得る。目的の２つのポリペプチドが実際に相互作用するならば、ＯｇＬｕｃ断片は互いにすぐ近くに接近して、機能的な活性ＯｇＬｕｃ変異体を再構成する。その後、再構成されたＯｇＬｕｃ変異体の活性を、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンまたは本発明の新規セレンテラジンを用いて、検出および測定することができる。別の例では、開裂ＯｇＬｕｃ変異体は、ｌａｃ−Ｚ（Langley et al., PNAS, 72:1254-1257 (1975)）またはリボヌクレアーゼＳ（Levit and Berger, J. Biol. Chem., 251:1333 -1339 (1976)）に類似した、より一般的な相補系で使用することができる。具体的には、別のＯｇＬｕｃ変異体断片（「Ｂ」）を補完することが知られているＯｇＬｕｃ変異体断片（「Ａ」と命名）を、標的タンパク質に融合させることができ、得られた融合体を、断片Ｂを含有する細胞または細胞溶解物中の発光によってモニターすることができる。断片Ｂの源は、同一細胞（染色体中または別のプラスミド上のいずれか）であるか、または別の細胞由来の溶解物または精製タンパク質であり得る。この同一の融合タンパク質（断片Ａ）は、断片Ｂと、固体の支持体に付着可能なＨａｌｏＴａｇ（登録商標）等のポリペプチド間の融合によって、捕捉または固定化することができる。その後、発光は、成功した捕捉を実証するために、または捕捉された物質の量を定量化するために、使用することができる。タンパク質相補の方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１５３３１０号に従って行うことができる。
１． ９Ｂ８ｏｐｔ ＰＣＡコンストラクトを以下のように構築した：
−ｐ９Ｂ８ＰＣＡ１／４＝ｐＦ５Ａ／Ｍｅｔ−［９Ｂ８ｏｐｔ（５１−１６９）］−ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳ−ＦＲＢ（配列番号３３１および３３２）＆ｐＦ５Ａ／ＦＫＢＰ−ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ−［９Ｂ８ｏｐｔ（１−５０）］（配列番号３３７および３３８）
−ｐ９Ｂ８ＰＣＡ１／２＝ｐＦ５Ａ／Ｍｅｔ−［９Ｂ８ｏｐｔ（５１−１６９）］−ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳ−ＦＲＢ（配列番号３３１および３３２）＆ｐＦ５Ａ／［９Ｂ８ｏｐｔ（１−５０）］−ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳ−ＦＲＢ（配列番号３３３および３３４）
−ｐ９Ｂ８ＰＣＡ２／３＝ｐＦ５Ａ／［９Ｂ８ｏｐｔ（１−５０）］−ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳ−ＦＲＢ（配列番号３３３および３３４）＆ｐＦ５Ａ／ＦＫＢＰ−ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ−［９Ｂ８ｏｐｔ（５１−１６９）］（配列番号３３５および３３６）
−ｐ９Ｂ８ＰＣＡ３／４＝ｐＦ５Ａ／ＦＫＢＰ−ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ−［９Ｂ８ｏｐｔ（５１−１６９）］（配列番号３３５および３３６）＆ｐＦ５Ａ／ＦＫＢＰ−ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ−［９Ｂ８ｏｐｔ（１−５０）］（配列番号３３７および３３８）
ＰＣＡコンストラクトを、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを用い、製造業者の取扱説明書に従って、９６ウェルプレート中に、ＨＥＫ２９３細胞（１５，０００細胞／ウェル）に形質移入した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。形質移入後、細胞上の培地を、１０％ＦＢＳを含有するＣＯ2非依存性培地で置き換えた。次に、２０μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有するアッセイ試薬を加え、２８℃で、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈで発光を測定した。次に、１００μＭ ラパマイシンをウェルに加え、発光を１時間連続的に測定した。応答倍率を、所与のウェルの全発光を、同じウェルのラパマイシン前処理の発光で除算することにより算出した（図７４）。
２． ＰＣＡにおけるＯｇＬｕｃ変異体の用途を示すために、Ｌ２７Ｖ０２Ａ変異体断片をＦＫＢＰまたはＦＲＢで補完し（complementate）、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ間の相互作用を測定した。
表４２は、構築および試験された種々のタンパク質相補（ＰＣＡ）コンストラクトを列挙している。「２／３」は、１）Ｌ２７Ｖ０２Ａの「古い（ｏｌｄ）」Ｃ末端（「古い」＝Ｌ２７Ｖ０２Ａの元のＣ末端）が、ＦＫＢＰのＣ末端のパートナーであり；２）Ｌ２７Ｖ０２Ａの「古い」Ｎ末端がＦＲＢのＮ末端のパートナーである、変異体相補対を示している。「１／４」は、１）Ｌ２７Ｖ０２Ａの「古い」Ｎ末端がＦＫＢＰのＣ末端のパートナーであり；２）Ｌ２７Ｖ０２Ａの「古い」Ｃ末端がＦＲＢのＮ末端のパートナーである、変異体対を示している。全てのコンストラクトについて、ＦＫＢＰはＬ２７Ｖ０２Ａ断片のＮ末端に位置しており、ＦＲＢはＬ２７Ｖ０２Ａ断片のＣ末端に位置していた。例えば、１５７位（表４２、「２／３」および「１／４」＃１１および＃１２（配列番号２８８〜２９５）参照）、１０３位（表４２、「２／３」および「１／４」＃９および＃１０（配列番号２９６〜３０３）参照）、および８４位（表４２、「２／３」および「１／４」＃７および＃８（配列番号３０４−３１５）参照）に開裂部位（split site）を有するＰＣＡコンストラクトを構築した。他のＰＣＡコンストラクトを構築した（配列番号３４３〜４２６および４２８〜４４０）（表２１参照）。
表４２
表２１


表４２に記載の相補対を、前に記載した通りに、ｐＦ４Ａｇベクターにクローニングした。次に、ＰＣＡコンストラクト（９００μＬ）を、製造業者の説明書に従って、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ；プロメガ社）または小麦胚芽抽出物（プロメガ社）中で発現させた。各ＰＣＡ対の１．２５μＬの発現反応物（expression reaction）を、１０μＬの２×結合緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、２０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）および７．５μＬの水と混合し、１８μＬを９６ウェルプレートのウェルに移した。２μＬの５μＭ ラパマイシン（最終濃度０．５μＭ）を加え、１０分間室温でインキュベートした。
インキュベートした後、１００μＬのＰＢＩ−３９３９（５０×ストックをアッセイ緩衝液中で１×に希釈）、そして、室温で３分間インキュベートする。発光を前に記載した通りに測定した（図７６Ａ〜Ｂ：コムギ胚芽；図７６Ｃ〜Ｄ：ウサギ網状赤血球；図７６Ｅ〜Ｆ：無細胞系［which system? WG or RRL?］；図７６Ｇ：ＨＥＫ２９３細胞）。
図７６Ａ〜Ｇは、種々のタンパク質相補（ＰＣＡ）Ｌ２７Ｖ対の発光（各対の一方のＬ２７Ｖ断片は、記載の通りの２／３構成（図７６Ａおよび７６Ｃ）または１／４構成（図７６Ｂおよび７６Ｄ）を用いて、ＦＫＢＰまたはＦＲＢのいずれかに融合されていた）、小麦胚芽抽出物（図７６Ａおよび７６Ｂ）およびウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）（図７６Ｃおよび７６Ｄ）中でモニターされたＦＫＢＰおよびＦＲＢの相互作用；種々のタンパク質相補（ＰＣＡ）陰性対照の発光（図７６Ｅ）を示している。無細胞系（ＲＲＬ）（図７６Ｆ）およびＨＥＫ２９３細胞（図７６Ｇ）中の、１／４構成を用いる種々のタンパク質相補Ｌ２７Ｖの発光を測定した。図７６Ａ〜Ｇ中のデータは、種々の異なる欠失、すなわちＬ２７Ｖ変異体の小断片が、機能的であることを示す。
３． 細胞ベースのＰＣＡにおけるＰＣＡコンストラクトの用途を示すために、コンストラクトをＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、ＰＢＩ−４３７７を用いてアッセイした。各ＰＣＡ対（６、１２、５５、８４、および１０３）からのプラスミドＤＮＡ（５ｎｇ）を、４０ｎｇの担体ＤＮＡ（ｐＧＥＭ−３ｆｚ）および５μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）と混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（０．１５μＬ）を加え、室温で１５分間再びインキュベートした。ＤＮＡ形質移入混合物を、１０％ＦＢＳ（抗菌剤無し）を含有するＤＭＥＭ中の１００μＬのＨＥＫ２９３細胞（１．５×１０5細胞／ｍＬ）に加え、９６ウェルプレートのウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。
形質移入後、培地を除去し、２０μＭまたは５０×ＰＢＩ−４３７７を含有するＣＯ2非依存性培地で置き換え、３７℃、ＣＯ2調節無しで、２時間インキュベートした。発光を測定し、１０μＬのラパマイシン加え、再度、発光を２分毎に２時間測定した（図７６Ａ〜Ｃ）。
４． タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤を特定するための、ＰＣＡコンストラクトの用途を示すために、本実施例の＃２に記載のコンストラクトを使用した。
表４２に記載の相補対、１０３「２／３」、１５７「２／３」、１０３「１／４」および１５７「１／４」を、前に記載した通りにｐＦ４Ａｇベクターにクローニングした。次に、ＰＣＡコンストラクト（２５μＬ）を、製造業者の説明書に従って、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ；プロメガ社）中で発現させた。各ＰＣＡ対の１．２５μＬの発現反応物を、１０μＬの２×結合緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、２０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）および７．５μＬの水と混合し、１６．２μＬを９６ウェルプレートのウェルに移した。ラパマイシンを、様々な量のＦＫ５０６で試験した。反応物に、ＦＲＢ−ＦＫＢＰ結合阻害剤、ＦＫ５０６（１０×）を加え、反応物を室温で１０分間インキュベートした。１５ｎＭのラパマイシン（１０×原液）を、最終濃度が１．５ｎＭ ラパマイシンとなるように加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベートした後、１００μＬのＰＢＩ−３９３９（５０×ストックをアッセイ緩衝液中で１×に希釈）、そして、室温で３分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで発光を測定した。図７７は、本明細書で開示されるＰＣＡコンストラクトが、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤を特定するのに使用することができることを示す。
５． 溶解性型式（lytic format）におけるＰＣＡコンストラクトの用途を示すために、相補対、１０３「２／３」、１５７「２／３」、および１０３「１／４」を、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、ＰＢＩ−３９３９を用いてアッセイした。各ＰＣＡ対からの０．５ｎｇのプラスミドを、５μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）および４９ｎｇのｐＧＥＭ−３ｚｆ（プロメガ社）と混合した。試料混合物を室温で５分間インキュベートした。次に、０．１５μＬのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを試料混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。１．５×１０5細胞／ｍＬの濃度の、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（抗菌剤無し）中の１００μＬのＨＥＫ２９３細胞を、各試料混合物に加えた。次に、細胞試料を９６ウェルプレートの１ウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。
次の日、１１．１μＬの１０μＭ ラパマイシン（最終濃度１μＭ）を、ウェルの半分に加え、１１．１μＬの水をウェルのもう半分に加えた。９６ウェルプレートを３７℃で１時間インキュベートした。１００μＬのアッセイ試薬＋ＰＢＩ−３９３９（２μＬの５０×ＰＢＩ−３９３９を前に記載した９８μＬのアッセイ試薬と混合）を、各ウェルに加え、プレートを３７℃で４分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで、３７℃、０．５秒の積分時間および１回の読み取りで、発光を測定した（図７６Ｈ）。
実施例５０． ＯｇＬｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサー
本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、濃度を通じてだけでなく、酵素活性の調節を通じても、光出力に関わることができる。例えば、ｃＡＭＰバイオセンサーは、プロテインキナーゼＡから得られたｃＡＭＰ−結合ドメインを循環置換されたＯｇＬｕｃ変異体に組み入れることによって開発され得る。本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、当該技術分野において周知の方法（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１５３３１０号）によるそのような置換に対し寛容性がある部位で、循環置換され得る。哺乳類細胞中で発現された場合、得られた循環置換されたＯｇＬｕｃ変異体キメラタンパク質は、ｃＡＭＰに対する細胞内バイオセンサーとして機能し得る。ｃＡＭＰがバイオセンサーに結合すると、バイオセンサーは、活性型ルシフェラーゼ酵素を生成する立体構造変化を起こす。細胞をアデニル酸シクラーゼに対する活性化物質であるフォルスコリンで処理することは、フォルスコリンの増加濃度に伴って、発光における増加をもたらすはずである。カルシウム（Ｃａ＋２）、ｃＧＭＰ、およびカスパーゼおよびタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）等のプロテアーゼを含むがこれらに限定はされない、標的に対する同様のバイオセンサーは、それぞれに対する適切な結合ドメインまたは切断部位を、循環置換されたＯｇＬｕｃ変異体に組み入れることによって、開発することができる。
ｃＡＭＰセンサーとの関連で変異体９Ｂ８ｏｐｔを分析することにより、ＯｇＬｕｃのバイオセンサーとしての有用性が示された。循環置換のための部位が下記のように選択されること以外はＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８１７６に記載される通りに、ＯｇＬｕｃ変異体配列に隣接したプロテインキナーゼ−ＡのＲＩＩβＢサブユニットを含有する循環置換されたコンストラクトを構築し、無細胞系で発現させた。ｃＡＭＰの存在下および非存在下で、新生タンパク質をアッセイした。ｃＡＭＰに対する応答を、活性比（＋）ｃＡＭＰ／（−）ｃＡＭＰと定義する。
ＯｇＬｕｃの構造モデルが、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３３４４９で先に記載された、既知の構造のある脂肪酸結合タンパク質への類似性に基づいて、作製されている。モデルは、標準的なタンパク質構造モチーフ；αへリックスおよびβシートの規則正しい配列を予測している。循環置換部位としてこれらの構造要素間を移行する領域を選択した（表４３参照）。
１． バイオセンサーコンストラクトの発現用鋳型は、プラスミドｐＦ５（プロメガ社）中の、Ｃ末端のＯｇＬｕｃ配列−ＲＩＩβＢ配列−Ｎ末端ＯｇＬｕｃ配列から成った。ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７カップリングコムギ胚芽抽出系（プロメガ社 品番Ｌ４１４０）を、コンストラクトを翻訳するのに使用した。ＴＮＴ（登録商標）コムギ胚芽抽出反応は、２５μＬのＴＮＴ（登録商標）コムギ胚芽抽出液（Ｌ４１１Ａ）、２μＬのＴＮＴ（登録商標）反応緩衝液（Ｌ４６２Ａ）、１μＬのアミノ酸混合物、完全（Complete）（Ｌ４４６Ａ）、１μＬのＲＮａｓｉｎ（登録商標）（４０Ｕ／μＬ）（Ｎ２６１５）、１μＬのＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ５１６Ａ）、１．０μｇのＤＮＡ鋳型、および５０μＬの総体積にするためのヌクレアーゼを含まない水を含んでいた。反応混合物を３０℃で１２０分間インキュベートした。
５０μＬのＯｇＬｕｃ翻訳混合物に、１００μＭ ｃＡＭＰを含有する、または含有しない、５０μＬのＯｇＬｕｃ Ｇｌｏ試薬（１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ チオ尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．０２５％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４、および２０μＭ ＰＢＩ−３９３９）を加えることでＯｇＬｕｃ活性検査を行い、動態読み取りを３０分間行った（ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００プレートリーダー）。ｃＡＭＰ有りでバイオセンサーにより発せられた発光を、ｃＡＭＰ無しでバイオセンサーにより発せられた発光で除算することによって、応答を決定する（表４３）。
表４３：循環配列されたＯｇＬｕｃバイオセンサーのｃＡＭＰに対する応答
２． ＣＰ部位５１で循環置換された９Ｂ８ｏｐｔのｃＡＭＰバイオセンサーを、１に記載の通りに作製した。次に、バイオセンサーを、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを用い、製造業者の取扱説明書に従って、９６ウェルプレート中に、ＨＥＫ２９３細胞（１５，０００細胞／ウェル）に形質移入し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。形質移入後、培地を除去し、１０％ＦＢＳを含有するＣＯ2非依存性培地で置き換えた。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２時間インキュベートし、その後、様々な量のＦＳＫを加えた。次に、細胞を再度、３７℃、５％ＣＯ2で３時間インキュベートした。次に、６μＭ ＰＢＩ−３９３９加え、１３分後に発光を測定した（図７８）。
３． Ｌ２７Ｖの循環置換型（「ＣＰ」；例えばＣＰ６は、Ｍｅｔ後に新しい残基１となる古い残基６を指す）バージョンおよび直鎖開裂型（「ＳＳ」；例えばＳＳ６は、以下のように方向づけられたセンサーを指す：ＯｇＬｕｃ（１〜６）−ＲＩＩβｂ結合部位（配列番号４４１および４４２）−ＯｇＬｕｃ（７〜１６９））バージョンを、ｃＡＭＰバイオセンサー（配列番号４６７〜５７４）として使用した。Ｌ２７Ｖ変異体のＣＰ（配列番号４６７〜４９８および５５５〜５７４）バージョンおよびＳＳ（配列番号４９９−５５４）バージョンを、前に記載した通りに誘導し、製造業者の説明書に従ってウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ；プロメガ社）中で発現させた。ＲＩＩβｂ結合部位のＣ末端とＯｇＬｕｃルシフェラーゼ配列の間のリンカー配列はＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号５７５）であった。ＲＩＩβｂ結合部位のＮ末端とＯｇＬｕｃルシフェラーゼ配列の間のリンカー配列は、ＡＧＣＴＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＡ（配列番号５７６）であった ３．７５μＬの発現反応物を１．２５μＬの４×ｃＡＭＰ（最終濃度１ｎＭ〜０．１ｍＭ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベション後、１００μＬのＰＢＩ−３９３９（５０×ストックをアッセイ緩衝液中で１×に希釈）、そして、室温で３分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで発光を測定した（図７９Ａ〜Ｂ）。前に記載した通りに、ＨＥＫ２９３細胞中で発現され、フォルスコリンで処理された、Ｌ２７Ｖ変異体のＣＰバージョンおよびＳＳバージョンについての発光も測定した（図７９Ｃ−Ｄ）。図７９Ａ〜Ｄは、本明細書で開示されるＯｇＬｕｃ変異体の循環置換型バージョンおよび直鎖開裂型バージョンは、バイオセンサーとして使用することができることを示す。
実施例５１． 細胞内分布および細胞内局在
細胞内分布を分析するために、Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するマッコイ５Ａ培地（インビトロジェン社）中で２×１０4細胞／ｃｍ2で、ガラス底培養皿に播種した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。次に、細胞に１／２０量の形質移入混合物（ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤおよびｐＦ５Ａ−ＣＭＶ−Ｌ２７Ｖ（ＣＭＶプロモーター（プロメガ社）を有するｐＦ５ＡベクターにクローニングされたＬ２７Ｖ変異体（配列番号８８））、またはｐＧＥＭ３ＺＦ（プロメガ社；陰性対照））を形質移入し、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞培地を、０．５％ＦＢＳおよび１００μＭ ＰＢＩ−４３７８を含有するＣＯ2非依存性培地と置き換えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、フィルタ処理されていない画像を、２５、１００、１０００、および５０００ミリ秒間、６０×対物レンズ（図８０Ａ−Ｂ）を用いるオリンパス社製ＬＶ２００生物発光顕微鏡で撮り込んだ。
細胞内局在を分析するために、ＩＬ−６分泌配列（配列番号４６１および４６２）を有するＧＰＣＲ ＡＴ１Ｒ（アンジオテンシン１型受容体（配列番号４５９および４６０））または転写因子であるＮｒｆ２（配列番号３１７）とのＮ末端Ｌ２７Ｖ融合体を、ＧＳＳＧリンカー（配列番号４５７および４５８）を用いて作製し、上記の通りにＵ２ＯＳ細胞に形質移入した（図８１Ａ〜Ｃ）。図８１Ｃ（「ＧＰＲＣ」）は、ＩＬ６シグナル配列がＬ２７Ｖ変異体配列の上流であり、ＡＴ１ＲがＬ２７Ｖ 変異体配列の下流である場合のコンストラクトの発現を示している。Ｌ２７Ｖ変異体単独も形質移入した（「非融合」）。３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした後、細胞培地を、０．５％ＦＢＳを含有するＣＯ2非依存性培地で置き換え、非ＣＯ2調節雰囲気下、３７℃で１時間平衡化した。次に等量の培地＋２００μＭ ＰＢＩ−３９３９を加え、直後に、６０×または１５０×対物レンズを用いるオリンパス社製ＬＶ２００生物発光顕微鏡で、フィルタ処理されていない画像を撮り込んだ（図８１Ａ−Ｃ）。Ｌ２７Ｖ単独を発現する細胞については、画像撮り込み直前に、ＰＢＩ−３９３９を細胞から洗い落とした。
実施例５２． 細胞内シグナル経路のモニタリング
本実施例は、（転写活性化を表す応答要素の例とは対照的に）タンパク質レベルで細胞内シグナル経路をモニターするのに使用されている新規ルシフェラーゼの２つの例を提供する。変異体９Ｂ８ｏｐｔ（配列番号２４）を、ＩｋＢ（Gross et al., Nature Methods 2(8):607-614 (2005)）（Ｃ末端に、すなわち、Ｎ−ＩｋＢ−（９Ｂ８ｏｐｔ）−Ｃ））またはＯＤＤ（Ｈｉｆ−１−αの酸素依存性分解ドメイン（Moroz et al., PLoS One 4(4):e5077 (2009)）（Ｎ末端に、すなわち、Ｎ−（９Ｂ８ｏｐｔ）−ＯＤＤ−Ｃ））のいずれかに融合した。ＩＫＢは、ＴＮＦαで刺激されると細胞中で分解されることが知られており；そのため、ＩＫＢ−（９Ｂ８ｏｐｔ）コンストラクトは、生細胞ＴＮＦαセンサーとして使用することができる。ＯＤＤ（Ｈｉｆ−１−α）は、低酸素を誘導する化合物で刺激されると細胞内に蓄積されることが知られており；そのため、ＯＤＤ−（９Ｂ８ｏｐｔ）コンストラクトは生細胞低酸素センサーとして使用することができる。
９Ｂ８ｏｐｔを有するＩｋＢまたはＯＤＤとの融合体を含有するコンストラクト（ｐＦ５Ａ）を、ＨＥＫ２９３細胞中で、前に記載した通りの逆トランスフェクション（５ｎｇ（ＩｋＢ）または０．０５ｎｇ（ＯＤＤ）のＤＮＡ（キャリアーＤＮＡと混合して合計５０ｎｇを得た））を介して発現させ、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。形質移入後、培地を、０．５％ＦＢＳおよび２０μＭ ＰＢＩ−４３７７を含有する新しいＣＯ2非依存性培地と置き換え、３７℃で４時間、大気中のＣＯ2に対し平衡化した。次に、細胞を刺激に暴露した：ＩｋＢ融合体発現細胞に対してはＴＮＦα、そしてＯＤＤ融合体発現細胞に対してはフェナントロリン。ＤＭＳＯ（ビヒクル）を対照細胞に加えた。ＴＮＦα／ＩＫＢ試料について、刺激を加えるおよそ１５分前に１００μｇ／ｍＬ シクロヘキシミドを加え、新しいタンパク質の合成を妨げた。処理後の示された時点で、細胞を発光についてアッセイした。データ正規化のために、所与の時点での各試料のＲＬＵを、刺激直後に同じ試料から得られたＲＬＵで除算した。次に、各センサーの応答倍率を決定した（図８２Ａ〜Ｃ）。
Ｂ． 前記タンパク質レベルでの酸化的ストレスシグナル経路をモニターするために、Ｌ２７Ｖを使用した。Ｌ２７Ｖまたはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）を、ｐＦ５Ｋ発現ベクターにおいて、Ｎｒｆ２／ＮＦＥ２Ｌ２と融合させた（Ｃ末端で；すなわち、Ｎ−Ｎｒｆ２−（Ｌ２７Ｖ）−ＣまたはＮ−Ｎｒｆ２−（Ｒｌｕｃ）−Ｃ）。Ｋｅａｐ１はＮｒｆ２の負の制御因子である（配列番号２１７）。Ｎｒｆ２−Ｌ２７Ｖ０２のタンパク質レベルの調節を忠実に表すために、Ｋｅａｐ１を共発現させ、Ｎｒｆ２レベルを低く維持した（ユビキチン化を介して）。
Ｎｒｆ２−Ｌ２７ＶまたはＮｒｆ２−Ｒｌｕｃ（５ｎｇ、ｐＦ５Ｋ）およびＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−Ｋｅａｐ１融合タンパク質（ｐＦＮ２１−ＨＴ７−Ｋｅａｐ１（配列番号３１６）；５０ｎｇ）を、前に記載した通りに９６ウェルプレートに播種する時点で細胞に形質移入することによって、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。形質移入後、培地を、Ｌ２７Ｖについては０．５％ＦＢＳおよび２０μＭ ＰＢＩ−４３７７を含有する、またはウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼについては２０μＭ ＥＮＤＵＲＥＮ（商標）（プロメガ社）を含有する新しいＣＯ2非依存性培地と置き換え、細胞を３７℃、大気中ＣＯ2下で４時間平衡化した。動態解析のために、２０μＭ Ｄ，Ｌスルホラファンまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）を使用した。図８３Ａでは、発光が、処理後の示された時点で、前に記載した通りに測定された。データ正規化のために、所与の時点での各試料の発光を、刺激直後に同じ試料から得られた発光で除算した（図８３Ｂ〜Ｃ）。
Ｃ． Ｂに記載されるＮｒｆ２センサーと、Ｎｒｆ２（ＡＲＥ）−Ｌｕｃ２Ｐレポーター（プロメガ社）の応答の比較を行った。Ｎｒｆ２センサーおよびレポーターの両方を、上記のセクションＢに記載される通りにスクリーニングした。ホタル（Ｌｕｃ２Ｐ）レポーター遺伝子アッセイのために、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）アッセイ試薬を使用した。図８４Ａ〜Ｂは、２時間におけるＮｒｆ２−Ｌ２７Ｖおよび１６時間におけるＮｒｆ２（ＡＲＥ）−Ｌｕｃ２Ｐの正規化された応答を示す。
実施例５３． ＢＲＥＴによる、ＯｇＬｕｃ変異体の生物発光レポーターとしての評価
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）は、タンパク質−タンパク質相互作用のモニタリングを可能にする。分子内エネルギー移動を、ＨＴ７がフルオロフォア、すなわちＴＭＲ（励起／発光（ｅｘ／ｅｍ）波長＝５５５／５８５ｎｍ）またはローダミン１１０（励起／発光波長＝５０２／５２７ｎｍ）で事前に標識されたＩＶとＨＴ７融合パートナーの間で調べた。実施例３４のＩＶ−ＨＴ７融合タンパク質を含有する５０μＬの細菌細胞溶解物を、０．００１μＭ〜１０μＭ フルオロフォアリガンド存在下、または非存在下で、室温で１時間インキュベートした。インキュベートした後、２２μＭ セレンテラジン−ｈを含有する５０μＬのＲＥＮＩＬＬＡ−ＧＬＯ（商標）を、５０μＬの酵素−リガンド混合物に加え、発光スペクトルを５分の時点で記録した。ＴＭＲ（図８３Ａ）またはローダミン１１０（「Ｒｈｏｄ１１０」）（図８５Ｂ）を有するＩＶ−ＨＴ７のスペクトルの例が示され、これは、リガンドのｅｘ／ｅｍがＯｇＬｕｃの発光ピークである４６０ｎｍに近いほど、ＢＲＥＴがより大きかったことを示している（すなわち、ローダミン１１０を用いた方がより大きい）。このデータは、融合タンパク質上の、ＯｇＬｕｃ変異体とフルオロフォア間で分子内エネルギー移動が発生可能であることを示している。３つの異なる対照を比較のために使用した（データ未記載）：１）非ＨＴ融合、２）ＨＴリガンドで標識されなかったＨＴ融合、および３）ＯｇＬｕｃとＨＴの間のＴＥＶ部位でタンパク分解により開裂された標識化ＨＴ融合（近接／距離の関与を示した）。ＢＲＥＴは３つの異なる対照において観察されなかったが、このことは、ＨＴがＢＲＥＴを達成するのに関わっていたことを示している。Ｃ末端ＨＴ７を有するＣ１＋Ａ４ＥおよびＩＶが、Ｎ末端ＨＴ７を有するものと比べて、ＢＲＥＴがより大きかった。
実施例５４． 生細胞様式または溶解性様式のタンパク質近接解析
１例において、循環置換された（ＣＰ）または直鎖開裂型（ＳＳ）ＯｇＬｕｃ融合タンパク質はタンパク質近接の測定に適用される。ＯｇＬｕｃは、プロテアーゼ基質アミノ酸配列（例えば、ＴＥＶ）の挿入を介して置換または開裂され、低い生物発光を発する。不活性ルシフェラーゼが、モニタータンパク質に繋留される（例えば、遺伝子融合を介して）。有望な相互作用タンパク質が、プロテアーゼ（例えば、ＴＥＶ）に繋留される（例えば、遺伝子融合を介して）。前記２つのモニタータンパク質が相互作用するか、または十分近位に存在する場合（例えば、恒常的な相互作用、薬剤刺激または経路応答を介して）、ルシフェラーゼが開裂されて、増加された生物発光活性を生じる。前記の例は、細胞、または生化学分析において、タンパク質近接の測定に適用することができる。さらに、ＯｇＬｕｃ変異体ルシフェラーゼの高い熱安定性は、溶解された細胞、または生化学分析における抗体−抗原相互作用の測定を可能にし得る。
実施例５５． 生物発光分析
１． カスパーゼ−３酵素を検出するための生物発光分析におけるＯｇＬｕｃ変異体の用途を示すために、９Ｂ８ｏｐｔ変異体を、ＤＥＶＤカスパーゼ−３開裂配列を含む前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用した。精製カスパーゼ−３酵素を、実施例２７に記載の通りに調製された、変異体９Ｂ８ｏｐｔを発現する大腸菌（E. coli）溶解物試料と混合し、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の２３．５μＭ ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈを含むかまたは含まない、１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ チオ尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．０２５％ＭＡＺＵ（登録商標）ＤＦ２０４を含有する緩衝液中で１０倍に希釈した。カスパーゼ−３酵素を溶解物試料と一緒に室温で３時間インキュベートし、ターナー社製ＭＯＤＵＬＵＳ（商標）ルミノメーターで、様々な時点における発光を検出した。細菌溶解物のみを含有する試料およびカスパーゼ−３のみを含有する試料を、対照として使用した。３連を用いた。図８６および表４４は、９Ｂ８ｏｐｔ、従って他の本発明のＯｇＬｕｃ変異体が、目的酵素を検出するための、前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用され得ることを示す。
表４４：ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈを基質として使用して、精製カスパーゼ−３を用いるかまたは用いずにインキュベートした、９Ｂ８ｏｐｔ変異体を発現する細菌溶解物から発せられたＲＬＵ単位の平均発光
２． Ｌ２７Ｖ変異体を、ＤＥＶＤカスパーゼ−３開裂配列を含む前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析で使用した。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）（５０μＬ）中の精製カスパーゼ−３酵素（１ｍｇ／ｍＬ）を、アッセイ緩衝液（５０μＬ）中の２２７ｎＭ Ｌ２７Ｖ０２変異体および４７μＭ ＰＢＩ−３７４１（ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈ）と混合した。反応物を室温で３時間インキュベートし、発光を前に記載した通りに検出した。Ｌ２７Ｖ変異体を用いるアッセイを、ホタルルシフェラーゼバージョンのアッセイ、カスパーゼ−ＧＬＯ（登録商標）３／７−アッセイ系（カスパーゼ−Ｇｌｏ；プロメガ社）と比較した。表４５は、Ｌ２７Ｖ変異体、従って他の本発明のＯｇＬｕｃ変異体が、目的酵素を検出するための、前セレンテラジン基質を用いる生物発光分析において使用され得ることを示す。
表４５
実施例５６． 免疫学的検定
本発明のＯｇＬｕｃ変異体は、種々の異なるイムノアッセイ概念に組み込まれる。例えば、ＯｇＬｕｃ変異体は、検出法に特定の分析物を提供するために、一次抗体または二次抗体に、遺伝的に融合または化学的に結合される。別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｌ、またはＩｇ断片に結合することが知られているあらゆる他のペプチドもしくはタンパク質に遺伝的に融合または化学的に結合され、今度はこれが、特定の分析物に結合した特異的抗体を検出するのに使用され得る。別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体がストレプトアビジンに遺伝的に融合または化学的に結合され、特定の分析物に結合した特異的ビオチン化抗体を検出するのに使用される。別の例として、ＥＬＩＳＡのようなあらゆる様式において、一次抗体が特定の固定化された分析物を認識し、二次抗体が該一次抗体を認識する場合、ＯｇＬｕｃ変異体の相補的断片は一次および二次抗体に遺伝的に融合または化学的に結合される。ＯｇＬｕｃ変異体活性、すなわち発光は、固定化された分析物の存在下で再構成され、該分析物を定量化する手段として使用される。
別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体の相補的断片は２つの抗体に融合され得、そこで一方の抗体が１つのエピトープで特定の分析物を認識し、第二の抗体が別のエピトープで該分析物を認識する。ＯｇＬｕｃ変異体活性は分析物の存在下で再構成されることとなる。前記方法は、細胞溶解物または細胞培地等の複雑な環境における分析物定量化（analyte quantification）の測定に適していることとなるでだろう。別の例として、一方の抗体が特定の分析物を、修飾を問わず認識し、第二の抗体が修飾された分析物（例えば、翻訳後修飾後）のみを認識する場合、ＯｇＬｕｃ変異体の相補的断片は２つの抗体に融合され得る。ＯｇＬｕｃ変異体活性は、分析物が修飾される場合にのみ、分析物の存在下で再構成されることとなる。この方法は、細胞溶解物等の複雑な環境における修飾された分析物の測定に適していることとなるであろう。別の例として、ＯｇＬｕｃ変異体は、分析物（例えば、プロスタグランジン）に複合体化され、競合的サンドイッチＥＬＩＳＡ様式において使用され得る。
実施例５７． 二量体形成アッセイ
本実施例は、完全長の循環置換型ＯｇＬｕｃ変異体が、それぞれの結合パートナー、例えばＦＲＢおよびＦＫＢＰに融合され、タンパク質相補性分析で使用され得ることを示す。本明細書で開示される方法と従来のタンパク質相補性の間の重要な差異は、相補性はなかったが、２つの完全長酵素、例えば循環置換型ＯｇＬｕｃ変異体の二量体化があったことである。
簡潔に説明すると、低活性用に同様に構築された、循環置換されたレポータータンパク質を、融合タンパク質パートナーの両方に融合した（図８７Ａ参照）。例えば、各融合パートナーは、全く同じに構築された、置換されたレポーターに連結され得る。融合パートナーの相互作用により置換されたレポーターはすぐ近くに運ばれ、それによってより高い活性を有するハイブリッドレポーターの再構築が可能となった。新しいハイブリッドレポーターは、構造的拘束を低減させるように、各循環置換されたレポーターの部分を含んでいた。
循環置換された、直鎖開裂型Ｌ２７Ｖ変異体ＣＰ８４およびＣＰ１０３（Ｎ−（ＳＳ−１６９）−（１−ＳＳ1）−ＦＲＢ−ＣおよびＣ−（１−ＳＳ1）−（ＳＳ−１６９）−ＦＫＢＰ）を、前に記載した通りにクローニングし、製造業者の説明書に従って、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ；プロメガ社）中で、発現させた（２５μＬ）。各二量体化対の１．２５μＬの発現反応物を、１０μＬの２×結合緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、２０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）および７．５μＬの水と混合し、１８μＬを９６ウェルプレートのウェルに移した。反応物に、２μＬのラパマイシン（最終濃度０および０．１〜１０００ｎＭ）を加え、反応物を室温で１０分間インキュベートした。インキュベートした後、１００μＬのＰＢＩ−３９３９（５０×ストックをアッセイ緩衝液中で１×に希釈）、そして、室温で３分間インキュベートした。ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで発光を測定し（図８７Ｂ）、応答を決定した（図８７Ｃ）。図８７Ｂ〜Ｃは、ＰＣＡ型二量体化アッセイを介してタンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに、本発明のＯｇＬｕｃ変異体を使用することができることを示す。
実施例５８． 細胞内半減期
ＯｇＬｕｃ変異体９Ｂ８、９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ、Ｖ２、Ｌ２７Ｖ、およびＶ２＋Ｌ２７Ｍの細胞内半減期を決定した。１５〜１００ｍｍプレートにおける１０％ＦＢＳおよび１×ピルビン酸ナトリウムを含有するＦ１２培地中のＣＨＯ細胞（５００，０００）に、９Ｂ８、９Ｂ８＋Ｋ３３Ｎ、Ｖ２、Ｌ２７Ｖ（「Ｖ２＋Ｌ２７Ｖ」）またはＶ２＋Ｌ２７Ｍ（全てｐＦ４Ａ ベクターバックグラウンド中）を含有する３０μＬの１００ｎｇ／μＬ プラスミドＤＮＡを、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−ＬＴ１（ミラス社（Mirus））を用い、製造業者の説明書に従って、形質移入した。次に、細胞を６時間インキュベートした。
インキュベートした後、培地を除去し、１ｍＬのトリプシンを加え、細胞をプレートから剥離した。次に、３ｍＬのＦ１２培地を加え、細胞を計数した。次に、細胞を１０，０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレートの６ウェル（６ウェル／変異体）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。試料を３枚のプレートに散布した。各プレートは、異なる時点での測定に対し、６つの反復実験を有した。
一晩インキュベートした後、培地をｔ＝０試料のための細胞から除去して、１００μＬのアッセイ緩衝液（前述；基質無し）を加えた。試料をドライアイス上で凍結させ、−２０℃で保存した。シクロヘキシミド（１００ｍｇ／ｍＬ）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中で、１：１００に希釈して１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。ＤＭＳＯ（１００％）も、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中で、１：１００（最終濃度１％）に希釈した。希釈したシクロヘキシミド（１ｍｇ／ｍＬ）を、それぞれの形質移入された変異体の試料の３つの反復実験に加え（１１μＬ）、１１μＬの希釈したＤＭＳＯ（１％）を、その他の３つの反復実験に加えた。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、様々な時点（すなわち、０時間、０．５時間、０．９時間、２．５時間、４．３時間、および６．２時間）で取り出し、ｔ＝０試料として処理した。
分析のために、試料を室温まで解凍し、１０μＬを５０μＬのアッセイ試薬中でアッセイした。ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターで発光を測定した。各時点で、未処理およびシクロヘキシミド処理試料の発光を測定した。シクロヘキシミドで処理された細胞のＲＬＵを、未処理細胞のＲＬＵで正規化した。
各変異体の細胞内半減期を、各時点での、未処理のものからの発光に対する、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理したものからの発光の割合を測定することによって算出した。次に、前記割合を、時間に対して自然対数プロット（未処理に対する処理の％）し、半減期を算出した（表４６）。ＯｇＬｕｃ変異体は、完全な（full strength）ＣＭＶプロモーターを有する場合はおよそ６〜９時間の細胞内半減期を有したが、ＣＭＶ欠失変異体（ｄ２）を有する場合は、半減期が減少した。完全なＣＭＶプロモーターと組み合わされたＰＥＳＴ分解シグナルが存在することにより、半減期は有意に減少する。
表４６
実施例５２に記載の逆トランスフェクションプロトコルを用い、ＨＥＫ２９３細胞を使用して、別の実験を完了させた（データ未記載）。この実験から得られた結果は、ＰＥＳＴを有するＬ２７Ｖ変異体の細胞内半減期が１０分であることを示している。この実験で使用された分解シグナルを持たないＬ２７Ｖ変異体は、この実験を通じて減衰を示さなかった。この場合、減衰をｔ＝０での未処理細胞に対して正規化した。
実施例５９． ＯｇＬｕｃ変異体の尿素への暴露
ホタルルシフェラーゼは比較的不安定であることが知られているが、尿素暴露に対してはさらにより感受性が高い。これがＯｇＬｕｃ変異体を用いた場合でも当てはまるかどうかを決定するために、ＯｇＬｕｃの尿素に対する感受性を決定した。５μｌの４５．３μＭ Ｌ２７Ｖ酵素を１００μＬの尿素溶液（１００ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣＤＴＡ、５％グリセロールおよび様々な濃度の尿素）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。５μＬの尿素＋Ｌ２７Ｖ酵素溶液を、フェノールレッド＋０．１％ＰＲＩＯＮＥＸ（登録商標）無しのＤＭＥＭ中に１０，０００倍希釈し、５０μＬを、１００μＭ ＰＢＩ−３９３９（前述）を含有する５０μＬのアッセイ試薬と混合し、発光を１０分の時点で読み取った（図８８）。図８８は、Ｌ２７Ｖが、尿素耐性であるか、または尿素除去後に非常に迅速に機能的酵素にリフォールディングしたことを示している。これは、化学的変性条件が含まれている場合に、Ｌ２７Ｖがレポーター酵素として使用され得ることを示唆している（例えば、ＯｇＬｕｃ変異体に基づく反応の前の酵素反応を止めるのに変性剤が使用される条件での多重化）。
精製Ｌ２７Ｖ変異体の０．３１ｍｇ／ｍＬの原液を、緩衝液（ＰＢＳ＋１ｍＭ ＤＴＴ＋０．００５％ＩＧＥＰＡＬ）中に１００，０００倍希釈し、３Ｍ 尿素と共に、２５℃で３０分間インキュベートし、次に、１００μＭ ＰＢＩ−３９３９（前述）を含有するアッセイ試薬と１：１（５０μＬ＋５０μＬ）混合した。反応物を、前に記載した通りに（１００分間；１分の読み取り間隔）、ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＩＮＦＩＮＩＴＥ（登録商標）Ｆ５００ルミノメーターで読み取った（図８９）。結果は、３Ｍ 尿素がＬ２７Ｖ変異体の活性をおよそ５０％だけ低減させるが、尿素を２倍に（１．５Ｍの最終濃度に）希釈すると、活性が、恐らくはりフォールディングのために、増加することを示している。
実施例６０． ＯｇＬｕｃ融合タンパク質の画像取得
本実施例は、蛍光励起の必要なしに、生細胞におけるタンパク質移行をモニターするための、ＯｇＬｕｃおよびＯｇＬｕｃ変異体の用途を示す。ＯｇＬｕｃ変異体を、ヒト糖質コルチコイド受容体（ＧＲ；配列番号４５１および４５２）、ヒトプロテインキナーゼＣα（ＰＫＣａ；配列番号４４９および４５０）またはＬＣ３（配列番号５７７および５７８）に融合させた。生物発光画像法を用いて細胞内タンパク質移行を分析するために、ＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）中２×１０4細胞／ｃｍ2で、ガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ）中に播種した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。次に、細胞に１／２０量の形質移入混合物（ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤおよびｐＦ５Ａベクター（プロメガ社）にクローニングされた、Ｌ２７Ｖ０２−ＧＲ（配列番号４５３および４５４）またはＬ２７Ｖ０２−ＰＫＣα（配列番号４５５および４５６）をコードするＤＮＡ）を形質移入した。Ｌ２７Ｖ０２−ＧＲに関するプラスミドＤＮＡを、ｐＧＥＭ−３ＺＦ（プロメガ社）中で１：２０希釈し、Ｌ２７Ｖ０２−ＧＲの適切な発現レベルを達成した。Ｌ２７Ｖ０２−ＬＣ３およびＬ２７Ｖ０２−ＰＫＣαに関するプラスミドＤＮＡは、無希釈で使用した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。ＧＲ融合タンパク質を形質移入された細胞を、１％木炭／デキストランで処理されたＦＢＳ（インビトロジェン社）を補充されたＭＥＭ培地を用いて、２０時間ＧＲ作動薬を枯渇させた。形質移入の２４時間後（ＰＫＣα測定の場合）または形質移入の４８時間後（ＧＲ測定の場合）、イメージング直前に、細胞培地を１００μＭ ＰＢＩ−３９３９を含有するＣＯ2非依存性培地で置き換えた。１５０×対物レンズを用いるオリンパス社製ＬＶ２００生物発光顕微鏡で、フィルタ処理されていない画像を直ちに撮り込んだ。
Ｌ２７Ｖ０２−ＧＲ融合タンパク質の細胞質ゾルから核への移行は、０．５ｍＭ デキサメタゾンでの１５分間の刺激によって達成された。Ｌ２７Ｖ０２−ＰＫＣα融合タンパク質の細胞質ゾルから原形質膜への移行は、１００ｎＭ ＰＭＡでの２０分間の刺激によって達成された。Ｌ２７Ｖ０２−ＬＣ３融合タンパク質形質移入細胞は、未処理のままにするか、または１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）中の５０ｍＭ クロロキンで処理した。
Ｌ２７Ｖ０２−グルココルチコイド受容体
糖質コルチコイド非存在下では、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）はＨｓｐ９０タンパク質と複合体化し、細胞質ゾルに存在する。ＧＲがデキサメタゾン等の糖質コルチコイドと相互作用すると、ＧＲタンパク質はこれらのタンパク質複合体から分離して核に移行し、遺伝子転写を制御する。図９０Ａ〜Ｂは、ＨｅＬａ細胞における、ＰＢＩ−３９３９基質を用いての、Ｌ２７Ｖ０２−糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）融合タンパク質の、デキサメタゾンにより誘導された細胞質ゾルから核内への受容体（ＮＲ）移行の生物発光画像を示している。
Ｌ２７Ｖ０２−ＰＫＣａ
ホルボールエステルで処理すると、ＰＫＣαタンパク質は原形質膜に動員され、膜動力学およびシグナル伝達を含む細胞応答を制御する。図９１Ａ〜Ｂは、Ｕ−２ＯＳ細胞における、ＰＢＩ３９３９基質を用いての、ＯｇＬｕｃ Ｌ２７Ｖ０２−ＰＫＣα融合体の、ホルボールエステルにより誘導されたプロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）の細胞質ゾルから原形質膜への移行の生物発光画像を示している。
Ｌ２７Ｖ−ＬＣ３
処理されたＬＣ−３タンパク質とオートファゴソームとの会合は、オートファジーにおける特徴的なステップを表す。クロロキン処理は、自己貪食性流出をこの段階で停止させ、オートファゴソーム上にＬＣ−３タンパク質の蓄積をもたらす（点状の細胞内分布をつくる）。図９２Ａ〜Ｂは、２つの代表的なＨｅＬａ細胞試料における、ＰＢＩ−３９３９基質を用いての、ＯｇＬｕｃ Ｌ２７Ｖ−ＬＣ３融合タンパク質（配列番号５９２および５９３）の、クロロキンにより誘導されたオートファゴソームタンパク質移行の生物発光画像法を示している。
表４７．但し書きリスト
本発明の態様として、例えば以下のものがある。
〔１〕配列番号１に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが非オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、単離ポリヌクレオチド。
〔２〕非オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼがウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼである、前記〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３〕非オキヒオドシエビ属（Oplophorus）ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、前記〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕配列番号１に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドは配列番号３のＯｇＬｕｃポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが表４７に列挙されるもののうちの１つではない、ポリヌクレオチド。
〔５〕配列番号１に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドは配列番号３１のポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが配列番号３または１５ではない、ポリヌクレオチド。
〔６〕配列番号１に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１中のアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが配列番号２９のポリペプチドと比較して増強された発光を有し、ただし、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが配列番号３または１５ではない、ポリヌクレオチド。
〔７〕前記ポリペプチドが配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔８〕前記ポリペプチドが配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔９〕ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが配列番号３のポリペプチドと比較して増強されたタンパク質安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも１つを有する、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１０〕ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと比較して増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも１つを有する、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１１〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがホタルルシフェラーゼと比較して増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも１つを有する、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１２〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがセレンテラジンの存在下で配列番号３のポリペプチドと比較して増強された発光を有する、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１３〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物の存在下で配列番号３のポリペプチドと比較して増強された発光を有する前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは-Ｓ−、-Ｏ−または-ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、-Ｈ、−ＯＨ、または-ＯＲ 11 であり；
Ｚは、-ＣＨ−または-Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して-Ｃ（Ｏ）Ｒ”または-ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔１４〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、異なるセレンテラジンと比較した場合のあるセレンテラジンの存在下で、配列番号３のポリペプチドと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１５〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物の存在下で、配列番号３のポリペプチドと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＯＲ 11 であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ”または−ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔１６〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号３のポリペプチドと比較して増強された生体適合性を有する、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１７〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、セレンテラジンの存在下でウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、前記〔１〕〜〔１６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１８〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物の存在下で、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、前記〔１〕〜〔１７〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは-Ｓ−、-Ｏ−または-ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、-Ｈ、−ＯＨ、または-ＯＲ 11 であり；
Ｚは、-ＣＨ−または-Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して-Ｃ（Ｏ）Ｒ”または-ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔１９〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、異なるセレンテラジンと比較してあるセレンテラジンの存在下で、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔１〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔２０〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較して式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物の存在下で、ウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと比較して相対的基質特異性における変化を有する、前記〔１〕〜〔１９〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは-Ｓ−、-Ｏ−または-ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、-Ｈ、−ＯＨ、または-ＯＲ 11 であり；
Ｚは、-ＣＨ−または-Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して-Ｃ（Ｏ）Ｒ”または-ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔２１〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがウミシイタケ属（Renilla）ルシフェラーゼと比較して増強された生体適合性を有する、前記〔１〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔２２〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、ルシフェリン存在下のホタルルシフェラーゼと比較して、セレンテラジンの存在下で増強された発光を有する、前記〔１〕〜〔２１〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔２３〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、ルシフェリン存在下のホタルルシフェラーゼと比較して、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物の存在下で増強された発光を有する、前記〔１〕〜〔２２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは-Ｓ−、-Ｏ−または-ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、-Ｈ、−ＯＨ、または-ＯＲ 11 であり；
Ｚは、-ＣＨ−または-Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して-Ｃ（Ｏ）Ｒ”または-ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
ポリヌクレオチド。
〔２４〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがホタルルシフェラーゼと比較して増強された生体適合性を有する、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔２５〕ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、オプロポルス・グラキリロストゥリス（Oplophorus gracilirostris）、オプロポルス・グリマルディイ（Oplophorus grimaldii）、オプロポルス・スピニカウダ（Oplophorus spinicauda）、オプロポルス・フォリアケウス（Oplophorus foliaceus）、オプロポルス・ノヴァエゼエランディアエ（Oplophorus novaezeelandiae）、オプロポルス・テュプス（Oplophorus typus）、またはオプロポルス・スピノスス（Oplophorus spinosus）由来である、前記〔１〕〜〔２４〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔２６〕少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号１の１位、４位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２７位、２８位、３１位、３２位、３３位、３４位、３６位、３８位、３９位、４０位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５４位、５５位、５６位、５８位、５９位、６０位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７４位、７５位、７６位、７７位、８６位、８７位、８９位、９０位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０２位、１０６位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１７位、１１９位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３５位、１３６位、１３８位、１３９位、１４２位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５２位、１５４位、１５５位、１５８位、１５９位、１６３位、１６４位、１６６位、１６８位もしくは１６９位に対応する位置またはそれらの組み合わせに存在する、前記〔１〕〜〔２５〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔２７〕前記コードされたＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するＦ１Ｉ、Ｅ４Ｋ、Ｆ６Ｙ、Ｗ１０Ｙ、Ｒ１１Ｑ、Ａ１４Ｖ／Ｓ、Ｇ１５Ｒ、Ｙ１６Ｅ、Ｑ１８Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｄ１９Ｎ、Ｑ２０Ｐ／Ｒ、Ｖ２１Ｌ／Ｍ、Ｌ２２Ｉ／Ｆ、Ｅ２３Ｋ、Ｑ２４Ａ、Ｇ２５Ｌ、Ｌ２７Ｍ／Ｖ／Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｉ、Ｓ２８Ｙ、Ｆ３１Ｉ、Ｑ３２Ｈ／Ｌ／Ｐ、Ａ３３Ｎ／Ｍ、Ｌ３４Ｍ、Ｖ３６Ｅ／Ｍ、Ｖ３８Ｆ／Ｉ、Ｔ３９Ｉ、Ｐ４０Ｔ／Ｉ／Ｌ／Ｑ、Ｑ４２Ｈ、Ｋ４３Ｎ／Ｒ、Ｉ４４Ｆ、Ｖ４５Ｅ、Ｌ４６Ｑ、Ｓ４７Ｐ、Ｇ４８Ｒ、Ｅ４９Ｄ／Ｇ／Ｋ、Ｎ５０Ｋ／Ｓ、Ｇ５１Ｅ／Ｒ／Ｖ、Ａ５４Ｉ／Ｓ、Ｄ５５Ｅ／Ｇ、Ｉ５６Ｖ、Ｖ５８Ｉ／Ｌ、Ｉ５９Ｔ、Ｉ６０Ｖ、Ｓ６６Ｔ／Ｎ、Ｇ６７Ｄ／Ｓ、Ｆ６８Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ／Ｄ、Ｑ６９Ｈ、Ｍ７０Ｖ、Ｇ７１Ｄ、Ｌ７２Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｅ７４Ｉ／Ｋ、Ｍ７５Ｆ／Ｋ、Ｉ７６Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ｆ７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｈ８６Ｌ／Ｒ、Ｈ８７Ｎ／Ｔ、Ｋ８９Ｅ、Ｉ９０Ｄ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｌ９２Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｈ９３Ｒ、Ｙ９４Ｆ、Ｇ９５Ｄ／Ｓ、Ｔ９６Ａ、Ｌ９７Ｅ、Ｖ９８Ｆ、Ｉ９９Ｔ／Ｖ、Ｄ１００Ｉ、Ｖ１０２Ｅ／Ｍ／Ｔ、Ｍ１０６Ｉ／Ｋ、Ｙ１０９Ｆ、Ｆ１１０Ｉ、Ｇ１１１Ｎ、Ｒ１１２Ｃ、Ｐ１１３Ｈ／Ｔ／Ｋ、Ｉ１１７Ｆ、Ｖ１１９Ｍ、Ｋ１２４Ｍ、Ｉ１２５Ｌ、Ｔ１２６Ｒ、Ｖ１２７Ａ、Ｔ１２８Ａ／Ｓ、Ｇ１２９Ｑ、Ｔ１３０Ｋ、Ｎ１３５Ｄ／Ｙ、Ｌ１３６Ｍ、Ｉ１３８Ｓ、Ｄ１３９Ｇ、Ｌ１４２Ｖ／Ｅ／Ｋ／Ｗ、Ｐ１４５Ｌ／Ｑ、Ｄ１４６Ｇ、Ｇ１４７Ｎ、Ｓ１４８Ｔ、Ｌ１４９Ｉ／Ｍ、Ｌ１５０Ｖ、Ｒ１５２Ｈ／Ｓ／Ｅ／Ｔ、Ｔ１５４Ｓ、Ｉ１５５Ｔ、Ｖ１５８Ｉ、Ｔ１５９Ｉ／Ｓ、Ｌ１６３Ｉ、Ｃ１６４Ｓ、Ｎ１６６Ｉ／Ｆ／Ｅ、Ｌ１６８Ｆ、もしくはＡ１６９Ｖのうちの少なくとも１つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔２８〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔１〕〜〔２７〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド：配列番号１に対応する、１位のイソロイシン、４位のリジン、６位のチロシン、１０位のチロシン、１１位のグルタミン、１４位のバリンもしくはセリン、１５位のアルギニン、１６位のグルタミン酸、１８位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、１９位のアスパラギン、２０位のアルギニンもしくはプロリン、２１位のロイシンもしくはメチオニン、２２位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、２３位のリジン、２４位のアラニン、２５位のロイシン、２７位のバリン、メチオニン、アラニン、アスパラギン酸、グリシンもしくはイソロイシン、２８位のチロシン、３１位のイソロイシン、３２位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、３３位のアスパラギンもしくはメチオニン、３４位のメチオニン、３６位のメチオニンもしくはグルタミン酸、３８位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、３９位のイソロイシン、４０位のトレオニン、イソロイシン、ロイシンもしくはグルタミン、４２位のヒスチジン、４３位のアスパラギンもしくはアルギニン、４４位のフェニルアラニン、４５位のグルタミン酸、４６位のグルタミン、４７位のプロリン、４８位のアルギニン、４９位のアスパラギン酸、グリシン、もしくはリジン、５０位のリジンもしくはセリン、５１位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、５４位のセリンもしくはイソロイシン、５５位のグリシンもしくはグルタミン酸、５６位のバリン、５８位のイソロイシンもしくはロイシン、５９位のトレオニン、６０位のバリン、６６位のトレオニンもしくはアスパラギン、６７位のセリンもしくはアスパラギン酸、６８位のロイシン、アスパラギン酸、セリン、チロシンもしくはトリプトファン、６９位のバリン、７０位のバリン、７１位のアスパラギン酸、７２位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、７４位のリジンもしくはイソロイシン、７５位のリジンもしくはフェニルアラニン、７６位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、７７位のアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、８６位のアルギニンもしくはロイシン、８７位のアスパラギンもしくはトレオニン、８９位のグルタミン酸、９０位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、９２位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、セリン、もしくはチロシン、９３位のアルギニン、９４位のフェニルアラニン、９５位のセリンもしくはアスパラギン酸、９６位のアラニン、９７位のグルタミン酸、９８位のフェニルアラニン、９９位のトレオニンもしくはバリン、１００位のイソロイシン、１０２位のメチオニン、グルタミン酸、もしくはトレオニン、１０６位のイソロイシンもしくはリジン、１０９位のフェニルアラニン、１１０位のイソロイシン、１１１位のアスパラギン、１１２位のシステイン、１１３位のヒスチジン、トレオニン、もしくはリジン、１１７位のフェニルアラニン、１１９位のメチオニン、１２４位のメチオニン、１２５位のロイシン、１２６位のアルギニン、１２７位のアラニン、１２８位のアラニンもしくはセリン、１２９位のグルタミン、１３０位のリジン、１３５位のアスパラギン酸もしくはチロシン、１３６位のメチオニン、１３８位のセリン、１３９位のグリシン、１４２位のバリン、グルタミン酸、リジンもしくはトリプトファン、１４５位のロイシンもしくはグルタミン、１４６位のグリシン、１４７位のアスパラギン、１４８位のトレオニン、１４９位のイソロイシンもしくはメチオニン、１５０位のバリン、１５２位のヒスチジン、セリン、グルタミン酸もしくはトレオニン、１５４位のセリン、１５５位のトレオニン、１５８位のイソロイシン、１５９位のセリンもしくはイソロイシン、１６３位のイソロイシン、１６４位のセリン、１６８位のフェニルアラニン、もしくは１６９位のバリン。
〔２９〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ａ５４Ｆ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８ＩおよびＮ１６６Ｒ、並びに配列番号１の１位、４位、６位、１１位、１４位、１５位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２７位、２８位、３１位、３２位、３３位、３４位、３６位、３８位、３９位、４０位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５４位、５５位、５６位、５８位、５９位、６０位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７４位、７５位、７６位、７７位、８６位、８９位、９０位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９８位、９９位、１０２位、１０６位、１０９位、１１０位、１１２位、１１３位、１１７位、１１９位、１２４位、１２６位、１２７位、１２８位、１３５位、１３６位、１３８位、１３９位、１４２位、１４５位、１４８位、１４９位、１５２位、１５４位、１５５位、１５８位、１５９位、１６３位、１６４位、１６８位、もしくは１６９位に対応する位置またはそれらの組み合わせに少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔２８〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔３０〕配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号１の１位、４位、６位、１１位、１４位、１５位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２７位、２８位、３１位、３２位、３３位、３４位、３６位、３８位、３９位、４０位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５４位、５５位、５６位、５８位、５９位、６０位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７４位、７５位、７６位、７７位、８６位、８９位、９０位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９８位、９９位、１０２位、１０６位、１０９位、１１０位、１１２位、１１３位、１１７位、１１９位、１２４位、１２６位、１２７位、１２８位、１３５位、１３６位、１３８位、１３９位、１４２位、１４５位、１４８位、１４９位、１５２位、１５４位、１５５位、１５８位、１５９位、１６３位、１６４位、１６８位、もしくは１６９位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔２９〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔３１〕少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号１に対応するＦ１Ｉ、Ｅ４Ｋ、Ｆ６Ｙ、Ｒ１１Ｑ、Ａ１４Ｖ、Ｇ１５Ｒ、Ｑ１８Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｄ１９Ｎ、Ｑ２０Ｐ／Ｒ、Ｖ２１Ｌ／Ｍ、Ｌ２２Ｉ／Ｆ、Ｅ２３Ｋ、Ｌ２７Ｍ／Ｖ、Ｓ２８Ｙ、Ｆ３１Ｉ、Ｑ３２Ｈ／Ｌ／Ｐ、Ａ３３Ｎ／Ｍ、Ｌ３４Ｍ、Ｖ３６Ｅ／Ｍ、Ｖ３８Ｆ／Ｉ、Ｔ３９Ｉ、Ｐ４０Ｔ、Ｑ４２Ｈ、Ｋ４３Ｎ／Ｒ、Ｉ４４Ｆ、Ｖ４５Ｅ、Ｌ４６Ｑ、Ｓ４７Ｐ、Ｇ４８Ｒ、Ｅ４９Ｄ／Ｇ／Ｋ、Ｎ５０Ｋ／Ｓ、Ｇ５１Ｅ／Ｒ／Ｖ、Ａ５４Ｉ／Ｓ、Ｄ５５Ｅ／Ｇ、Ｉ５６Ｖ、Ｖ５８Ｉ／Ｌ、Ｉ５９Ｔ、Ｉ６０Ｖ、Ｓ６６Ｔ／Ｎ、Ｇ６７Ｄ／Ｓ、Ｆ６８Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ／Ｄ、Ｑ６９Ｈ、Ｍ７０Ｖ、Ｇ７１Ｄ、Ｌ７２Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｅ７４Ｉ／Ｋ、Ｍ７５Ｆ／Ｋ、Ｉ７６Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ｆ７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｈ８６Ｌ／Ｒ、Ｋ８９Ｅ、Ｉ９０Ｄ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｌ９２Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｈ９３Ｒ、Ｙ９４Ｆ、Ｇ９５Ｄ／Ｓ、Ｔ９６Ａ、Ｖ９８Ｆ、Ｉ９９Ｔ／Ｖ、Ｖ１０２Ｅ／Ｍ、Ｍ１０６Ｉ／Ｋ、Ｙ１０９Ｆ、Ｆ１１０Ｉ、Ｒ１１２Ｃ、Ｐ１１３Ｈ／Ｔ、Ｉ１１７Ｆ、Ｖ１１９Ｍ、Ｋ１２４Ｍ、Ｔ１２６Ｒ、Ｖ１２７Ａ、Ｔ１２８Ａ／Ｓ、Ｎ１３５Ｄ／Ｙ、Ｌ１３６Ｍ、Ｉ１３８Ｓ、Ｄ１３９Ｇ、Ｌ１４２Ｖ、Ｐ１４５Ｌ／Ｑ、Ｓ１４８Ｔ、Ｌ１４９Ｉ、Ｒ１５２Ｈ／Ｓ、Ｔ１５４Ｓ、Ｉ１５５Ｔ、Ｖ１５８Ｉ、Ｔ１５９Ｉ／Ｓ、Ｌ１６３Ｉ、Ｃ１６４Ｓ、Ｌ１６８Ｆ、もしくはＡ１６９Ｖのうちの少なくとも１つまたはそれらの組み合わせに対応している、前記〔２９〕または〔３０〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３２〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔２９〕または〔３０〕に記載のポリヌクレオチド：配列番号１に対応する１位のイソロイシン、４位のリジン、６位のチロシン、１１位のグルタミン、１４位のバリン、１５位のアルギニン、１８位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、１９位のアスパラギン、２０位のアルギニンもしくはプロリン、２１位のロイシンもしくはメチオニン、２２位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、２３位のリジン、２７位のバリンもしくはメチオニン、２８位のチロシン、３１位のイソロイシン、３２位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、３３位のアスパラギンもしくはメチオニン、３４位のメチオニン、３６位のメチオニンもしくはグルタミン酸、３８位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、３９位のイソロイシン、４０位のトレオニン、４２位のヒスチジン、４３位のアスパラギンもしくはアルギニン、４４位のフェニルアラニン、４５位のグルタミン酸、４６位のグルタミン、４７位のプロリン、４８位のアルギニン、４９位のアスパラギン酸、グリシン、もしくはリジン、５０位のリジンもしくはセリン、５１位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、５４位のセリンもしくはイソロイシン、５５位のグリシンもしくはグルタミン酸、５６位のバリン、５８位のイソロイシンもしくはロイシン、５９位のトレオニン、６０位のバリン、６６位のトレオニンもしくはアスパラギン、６７位のセリンもしくはアスパラギン酸、６８位のアスパラギン酸、セリン、チロシンもしくはトリプトファン、６９位のヒスチジン、７０位のバリン、７１位のアスパラギン酸、７２位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、７４位のリジンもしくはイソロイシン、７５位のリジンもしくはフェニルアラニン、７６位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、７７位のアラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、８６位のアルギニンもしくはロイシン、８９位のグルタミン酸、９０位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、９２位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、セリン、もしくはチロシン、９３位のアルギニン、９４位のフェニルアラニン、セリンもしくは９５位のアスパラギン酸、９６位のアラニン、９８位のフェニルアラニン、９９位のトレオニンもしくはバリン、１０２位のメチオニンもしくはグルタミン酸、１０６位のイソロイシンもしくはリジン、１０９位のフェニルアラニン、１１０位のイソロイシン、１１２位のシステイン、１１３位のヒスチジンもしくはトレオニン、１１７位のフェニルアラニン、１１９位のメチオニン、１２４位のメチオニン、１２６位のアルギニン、１２７位のアラニン、１２８位のアラニンもしくはセリン、１３５位のアスパラギン酸もしくはチロシン、１３６位のメチオニン、１３８位のセリン、１３９位のグリシン、１４２位のバリン、１４５位のロイシンもしくはグルタミン、１４８位のトレオニン、１４９位のイソロイシン、１５２位のヒスチジンもしくはセリン、１５４位のセリン、１５５位のトレオニン、１５８位のイソロイシン、１５９位のセリンもしくはイソロイシン、１６３位のイソロイシン、１６４位のセリン、１６８位のフェニルアラニン、もしくは１６９位のバリン。
〔３３〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ａ５４Ｆ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８ＩおよびＮ１６６Ｒ、並びに、配列番号１の１位、４位、１４位、１５位、１８位、２０位、２２位、２３位、２７位、３３位、３８位、３９位、４３位、４９位、５４位、５５位、５６位、５８位、５９位、６６位、６７位、６８位、７０位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、８９位、９０位、９２位、９３位、１０２位、１０６位、１０９位、１１３位、１１７位、１２６位、１２７位、１３６位、１３９位、１４５位、１４８位、１６３位、１６４位もしくは１６９位に対応する位置またはそれらの組み合わせに少なくとも１つのアミノ酸を含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔３４〕配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号１の１位、４位、１４位、１５位、１８位、２０位、２２位、２３位、２７位、３３位、３８位、３９位、４３位、４９位、５４位、５５位、５６位、５８位、５９位、６６位、６７位、６８位、７０位、７１位、７２位、７５位、７６位、７７位、８９位、９０位、９２位、９３位、１０２位、１０６位、１０９位、１１３位、１１７位、１２６位、１２７位、１３６位、１３９位、１４５位、１４８位、１６３位、１６４位もしくは１６９位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔３５〕前記コードされたＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するＦ１Ｉ、Ｅ４Ｋ、Ａ１４Ｖ、Ｇ１５Ｒ、Ｑ１８Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｑ２０Ｒ、Ｌ２２Ｉ、Ｅ２３Ｋ、Ｌ２７Ｍ／Ｖ、Ａ３３Ｎ、Ｖ３８Ｉ、Ｔ３９Ｉ、Ｋ４３Ｒ、Ｅ４９Ｋ、Ａ５４Ｉ／Ｓ、Ｄ５５Ｇ、Ｉ５６Ｖ、Ｖ５８Ｉ／Ｌ、Ｉ５９Ｔ、Ｓ６６Ｔ／Ｎ、Ｇ６７Ｓ、Ｆ６８Ｓ／Ｗ／Ｙ／Ｄ、Ｍ７０Ｖ、Ｇ７１Ｄ、Ｌ７２Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｍ７５Ｆ／Ｋ、Ｉ７６Ｎ、Ｆ７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｋ８９Ｅ、Ｉ９０Ｄ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｌ９２Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｙ、Ｈ９３Ｒ、Ｖ１０２Ｅ、Ｍ１０６Ｋ、Ｙ１０９Ｆ、Ｐ１１３Ｔ、Ｉ１１７Ｆ、Ｔ１２６Ｒ、Ｖ１２７Ａ、Ｌ１３６Ｍ、Ｄ１３９Ｇ、Ｐ１４５Ｌ、Ｓ１４８Ｔ、Ｌ１６３Ｉ、Ｃ１６４Ｓ、もしくはＡ１６９Ｖのうちの少なくとも１つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔３３〕または〔３４〕に基記載のポリヌクレオチド。
〔３６〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔３３〕または〔３４〕に記載のポリヌクレオチド：配列番号１に対応する、１位のイソロイシン、４位のリジン、１４位のバリン、１５位のアルギニン、１８位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トリプトファン、もしくはチロシン、２０位のアルギニン、２２位のイソロイシン、２３位のリジン、２７位のバリンもしくはメチオニン、３３位のアスパラギン、３８位のイソロイシン、３９位のイソロイシン、４３位のアルギニン、４９位のリジン、５４位のセリンまたはイソロイシン、５５位のグリシン、５６位のバリン、５８位のイソロイシンまたはロイシン、５９位のトレオニン、６６位のトレオニンまたはアスパラギン、６７位のセリン、６８位のアスパラギン酸、セリン、チロシンまたはトリプトファン、７０位のバリン、７１位のアスパラギン酸、７２位のグルタミン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、７５位のリジンもしくはフェニルアラニン、７６位のアスパラギン、７７位のトリプトファン、チロシン、セリン、トレオニン、バリン、アラニン、グリシン、システイン、アスパラギン酸もしくはメチオニン、８９位のグルタミン酸、９０位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、もしくはチロシン、９２位のアラニン、グリシン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、セリン、もしくはチロシン、９３位のアルギニン、１０２位のグルタミン酸、１０６位のリジン、１０９位のフェニルアラニン、１１３位のトレオニン、１１７位のフェニルアラニン、１２６位のアルギニン、１２７位のアラニン、１３６位のメチオニン、１３９位のグリシン、１４５位のロイシン、１４８位のトレオニン、１６３位のイソロイシン、１６４位のセリン、もしくは１６９位のバリン。
〔３７〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ａ５４Ｆ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８ＩおよびＮ１６６Ｒ、並びに配列番号１に対応する１位、４位、６位、１１位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２７位、２８位、３１位、３２位、３３位、３４位、３６位、３８位、４０位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５４位、５５位、５８位、６０位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７２位、７４位、７５位、７６位、７７位、８６位、９０位、９２位、９４位、９５位、９６位、９８位、９９位、１０２位、１０６位、１０９位、１１０位、１１２位、１１３位、１１９位、１２４位、１２８位、１３５位、１３８位、１４２位、１４５位、１４９位、１５２位、１５４位、１５５位、１５８位、１５９位もしくは１６８位に対応する位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔３８〕配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンであり、並びに配列番号１に対応する１位、４位、６位、１１位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２７位、２８位、３１位、３２位、３３位、３４位、３６位、３８位、４０位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５４位、５５位、５８位、６０位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７２位、７４位、７５位、７６位、７７位、８６位、９０位、９２位、９４位、９５位、９６位、９８位、９９位、１０２位、１０６位、１０９位、１１０位、１１２位、１１３位、１１９位、１２４位、１２８位、１３５位、１３８位、１４２位、１４５位、１４９位、１５２位、１５４位、１５５位、１５８位、１５９位もしくは１６８位に対応しているある位置またはそれらの組み合わせにおいて少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔３９〕前記コードされたＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するＦ１Ｉ、Ｅ４Ｋ、Ｆ６Ｙ、Ｒ１１Ｑ、Ｑ１８Ｈ／Ｉ／ＬＶ、Ｄ１９Ｎ、Ｑ２０Ｐ、Ｖ２１Ｌ／Ｍ、Ｌ２２Ｆ、Ｌ２７Ｖ、Ｓ２８Ｙ、Ｆ３１Ｉ、Ｑ３２Ｈ／Ｌ／Ｐ、Ａ３３Ｎ／Ｍ、Ｌ３４Ｍ、Ｖ３６Ｅ／Ｍ、Ｖ３８Ｆ／Ｉ、Ｐ４０Ｔ、Ｑ４２Ｈ、Ｋ４３Ｎ／Ｒ、Ｉ４４Ｆ、Ｖ４５Ｅ、Ｌ４６Ｑ、Ｓ４７Ｐ、Ｇ４８Ｒ、Ｅ４９Ｄ／Ｇ、Ｎ５０Ｋ／Ｓ、Ｇ５１Ｅ／Ｒ／Ｖ、Ａ５４Ｉ、Ｄ５５Ｅ、Ｖ５８Ｉ、Ｉ６０Ｖ、Ｓ６６Ｎ、Ｇ６７Ｄ／Ｓ、Ｆ６８Ｌ／Ｙ／Ｄ、Ｑ６９Ｈ、Ｍ７０Ｖ、Ｌ７２Ｑ、Ｅ７４Ｉ／Ｋ、Ｍ７５Ｋ、Ｉ７６Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ｆ７７Ｎ／Ｙ、Ｈ８６Ｌ／Ｒ、Ｉ９０Ｔ／Ｖ、Ｌ９２Ｑ／Ｒ、Ｙ９４Ｆ、Ｇ９５Ｄ／Ｓ、Ｔ９６Ａ、Ｖ９８Ｆ、Ｉ９９Ｔ／Ｖ、Ｖ１０２Ｅ／Ｍ、Ｍ１０６Ｉ、Ｙ１０９Ｆ、Ｆ１１０Ｉ、Ｒ１１２Ｃ、Ｐ１１３Ｈ、Ｖ１１９Ｍ、Ｋ１２４Ｍ、Ｔ１２８Ａ／Ｓ、Ｎ１３５Ｄ／Ｙ、Ｉ１３８Ｓ、Ｌ１４２Ｖ、Ｐ１４５Ｑ、Ｌ１４９Ｉ、Ｒ１５２Ｈ／Ｓ、Ｔ１５４Ｓ、Ｉ１５５Ｔ、Ｖ１５８Ｉ、Ｔ１５９Ｉ／Ｓ、もしくはＬ１６８Ｆのうちの少なくとも１つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔３７〕または〔３８〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４０〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔３７〕または〔３８〕に記載のポリヌクレオチド：配列番号１に対応する、１位のイソロイシン、４位のリジン、６位のチロシン、１１位のグルタミン、１８位のヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、もしくはバリン、１９位のアスパラギン、２０位のプロリン、２１位のロイシンもしくはメチオニン、２２位のフェニルアラニン、２７位のバリン、２８位のチロシン、３１位のイソロイシン、３２位のプロリン、ヒスチジン、もしくはロイシン、３３位のアスパラギンもしくはメチオニン、３４位のメチオニン、３６位のメチオニンもしくはグルタミン酸、３８位のイソロイシンもしくはフェニルアラニン、４０位のトレオニン、４２位のヒスチジン、４３位のアスパラギンもしくはアルギニン、４４位のフェニルアラニン、４５位のグルタミン酸、４６位のグルタミン、４７位のプロリン、４８位のアルギニン、４９位のアスパラギン酸もしくはグリシン、５０位のリジンもしくはセリン、５１位のグルタミン酸、アルギニン、もしくはバリン、５４位のイソロイシン、５５位のグルタミン酸、５８位のイソロイシン、６０位のバリン、６６位のアスパラギン、６７位のセリンもしくはアスパラギン酸、６８位のアスパラギン酸、ロイシン、もしくはチロシン、６９位のヒスチジン、７０位のバリン、７２位のグルタミン、７４位のリジンもしくはイソロイシン、７５位のリジン、７６位のアスパラギン、フェニルアラニン、もしくはバリン、７７位のアスパラギンもしくはチロシン、８６位のアルギニンもしくはロイシン、９０位のトレオニンもしくはバリン、９２位のアルギニンもしくはグルタミン、９４位のフェニルアラニン、９５位のセリンもしくはアスパラギン酸、９６位のアラニン、９８位のフェニルアラニン、９９位のトレオニンもしくはバリン、１０２位のメチオニンもしくはグルタミン酸、１０６位のイソロイシン、１０９位のフェニルアラニン、１１０位のイソロイシン、１１２位のシステイン、１１３位のヒスチジン、１１９位のメチオニン、１２４位のメチオニン、１２８位のアラニンもしくはセリン、１３５位のアスパラギン酸もしくはチロシン、１３８位のセリン、１４２位のバリン、１４５位のグルタミン、１４９位のイソロイシン、１５２位のヒスチジンもしくはセリン、１５４位のセリン、１５５位のトレオニン、１５８位のイソロイシン、１５９位のセリンもしくはイソロイシン、もしくは１６８位のフェニルアラニン。
〔４１〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ｆ５４Ｉ、Ｉ９０Ｖ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８ＩおよびＮ１６６Ｒ、並びに、配列番号１の１位、４位、１０位、１４位、１６位、１８位、２４位、２５位、２７位、３３位、３８位、４０位、６８位、７０位、７２位、７５位、８７位、９０位、９７位、１００位、１０２位、１１１位、１１３位、１２５位、１２９位、１３０位、１４２位、１４６位、１４７位、１４９位、１５０位、１５２位もしくは１６６位に対応する位置またはそれらの組み合わせにおける少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔４２〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がイソロイシンであり、９０位のアミノ酸がバリンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸置換、および配列番号１の１位、４位、１０位、１４位、１６位、１８位、２４位、２５位、２７位、３３位、３８位、４０位、６８位、７０位、７２位、７５位、８７位、９０位、９７位、１００位、１０２位、１１１位、１１３位、１２５位、１２９位、１３０位、１４２位、１４６位、１４７位、１４９位、１５０位、１５２位もしくは１６６位に対応する位置またはそれらの組み合わせにおける少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔４３〕少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号１に対応するＦ１Ｉ、Ｅ４Ｋ、Ｗ１０Ｙ、Ａ１４Ｓ、Ｙ１６Ｅ、Ｑ１８Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｑ２４Ａ、Ｇ２５Ｌ、Ｌ２７Ｍ／Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｉ、Ａ３３Ｎ、Ｖ３８Ｉ、Ｐ４０Ｉ／Ｌ／Ｑ、Ｆ６８Ｗ／Ｙ、Ｍ７０Ｖ、Ｌ７２Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｍ７５Ｆ／Ｋ、Ｈ８７Ｎ／Ｔ、Ｉ９０Ｄ／Ｋ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、Ｌ９７Ｅ、Ｄ１００Ｉ、Ｖ１０２Ｅ／Ｔ、Ｇ１１１Ｎ、Ｐ１１３Ｋ、Ｉ１２５Ｌ、Ｇ１２９Ｑ、Ｔ１３０Ｋ、Ｌ１４２Ｅ／Ｋ／Ｗ、Ｄ１４６Ｇ、Ｇ１４７Ｎ、Ｌ１４９Ｍ、Ｌ１５０Ｖ、Ｒ１５２Ｅ／Ｔ、もしくはＮ１６６Ｉ／Ｆ／Ｅのうちの少なくとも１つまたはそれらの組み合わせに対応している、前記〔４１〕または〔４２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４４〕前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つまたはそれらの組み合わせを含む、前記〔４１〕または〔４２〕に記載のポリヌクレオチド：配列番号１に対応する、１位のイソロイシン、４位のリジン、１０位のチロシン、１４位のセリン、１６位のグルタミン酸、１８位のアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トリプトファン、もしくはチロシン、２４位のアラニン、２５位のロイシン、２７位のメチオニン、アラニン、アスパラギン酸、グリシンもしくはイソロイシン、３３位のアスパラギン、３８位のイソロイシン、４０位のイソロイシン、ロイシンもしくはグルタミン、６８位のチロシンもしくはトリプトファン、７０位のバリン、７２位のアラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、もしくはチロシン、７５位のリジンもしくはフェニルアラニン、８７位のアスパラギンもしくはトレオニン、９０位のアスパラギン酸、リジン、プロリン、グルタミン、アルギニン、もしくはチロシン、９７位のグルタミン酸、１００位のイソロイシン、１０２位のグルタミン酸もしくはトレオニン、１１１位のアスパラギン、１１３位のリジン、１２５位のロイシン、１２９位のグルタミン、１３０位のリジン、１４２位のグルタミン酸、リジンもしくはトリプトファン、１４６位のグリシン、１４７位のアスパラギン、１４９位のメチオニン、１５０位のバリン、１５２位のグルタミン酸もしくはトレオニン、もしくは１６６位のイソロイシン、フェニルアラニン、もしくはグルタミン酸。
〔４５〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８Ｉ、Ｎ１６６Ｒ、Ｉ９０Ｖ、Ｆ５４Ｉ、Ｑ１８Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔４６〕配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、１８位のアミノ酸がロイシンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がイソロイシンであり、６８位のアミノ酸がチロシンであり、７２位のアミノ酸がグルタミンであり、７５位のアミノ酸がリジンであり、９０位のアミノ酸がバリンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンである、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔４７〕配列番号１の３３に対応する位置におけるアミノ酸置換がアスパラギンである、前記〔４５〕または〔４６〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４８〕３９位がコドンＡＣＴによってコードされ、配列番号１に対応する３９位のアミノ酸がトレオニンであり、４３位のアミノ酸がアルギニンであり、６８位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔４７〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４９〕配列番号１に対応する２７位のアミノ酸がバリンであり、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔４８〕に記載のポリヌクレオチド。
〔５０〕配列番号１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５１〕配列番号１８、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４２、配列番号８８、または配列番号９２のポリヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５２〕前記コードされたＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ｑ１８Ｌ、Ｆ５４Ｉ、Ｌ９２Ｈ、およびＹ１０９Ｆをさらに含む、前記〔３７〕〜〔４０〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５３〕前記コードされたＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ｖ２１Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、Ｍ７５Ｋ、Ｈ９２ＲおよびＶ１５８Ｉをさらに含む、〔５２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔５４〕前記コードされたＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ｆ５４Ｉ、Ｉ９０ＶおよびＦ７７Ｙを含む、前記〔３７〕〜〔４０〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５５〕配列番号１に対応する１８位のアミノ酸がロイシンであり、５４位のアミノ酸がイソロイシンであり、９２位のアミノ酸がヒスチジンであり、１０９位のアミノ酸がフェニルアラニンである、前記〔３７〕〜〔４０〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５６〕配列番号１に対応する２１位のアミノ酸がロイシンであり、６８位のアミノ酸がチロシンであり、７２位のアミノ酸がグルタミンであり、７５位のアミノ酸がリジンであり、９２位のアミノ酸がアルギニンであり、１５８位のアミノ酸がイソロイシンである、５５に記載のポリヌクレオチド。
〔５７〕配列番号１に対応する５４位のアミノ酸がイソロイシンであり、９０位のアミノ酸がバリンであり、７７位のアミノ酸がチロシンである、前記〔３７〕〜〔４０〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５８〕前記コードされたＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが、配列番号１に対応するＦ１Ｉ、Ｅ４Ｋ、Ｆ６Ｙ、Ｒ１１Ｑ、Ｑ１８Ｈ／Ｉ／Ｖ、Ｄ１９Ｎ、Ｑ２０Ｐ、Ｖ２１Ｍ、Ｌ２２Ｆ、Ｌ２７Ｖ、Ｓ２８Ｙ、Ｆ３１Ｉ、Ｑ３２Ｈ／Ｌ／Ｐ、Ａ３３Ｎ／Ｍ、Ｌ３４Ｍ、Ｖ３６Ｅ／Ｍ、Ｖ３８Ｆ／Ｉ、Ｐ４０Ｔ、Ｑ４２Ｈ、Ｋ４３Ｎ／Ｒ、Ｉ４４Ｆ、Ｖ４５Ｅ、Ｌ４６Ｑ、Ｓ４７Ｐ、Ｇ４８Ｒ、Ｅ４９Ｄ／Ｇ、Ｎ５０Ｋ／Ｓ、Ｇ５１Ｅ／Ｒ／Ｖ、Ｄ５５Ｅ、Ｖ５８Ｉ、Ｉ６０Ｖ、Ｓ６６Ｎ、Ｇ６７Ｄ／Ｓ、Ｆ６８Ｌ／Ｄ、Ｑ６９Ｈ、Ｍ７０Ｖ、Ｅ７４Ｉ／Ｋ、Ｉ７６Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ｆ７７Ｎ、Ｈ８６Ｌ／Ｒ、Ｉ９０Ｔ、Ｙ９４Ｆ、Ｇ９５Ｄ／Ｓ、Ｔ９６Ａ、Ｖ９８Ｆ、Ｉ９９Ｔ／Ｖ、Ｖ１０２Ｅ／Ｍ、Ｍ１０６Ｉ、Ｆ１１０Ｉ、Ｒ１１２Ｃ、Ｐ１１３Ｈ、Ｖ１１９Ｍ、Ｋ１２４Ｍ、Ｔ１２８Ａ／Ｓ、Ｎ１３５Ｄ／Ｙ、Ｉ１３８Ｓ、Ｌ１４２Ｖ、Ｐ１４５Ｑ、Ｌ１４９Ｉ、Ｒ１５２Ｈ／Ｓ、Ｔ１５４Ｓ、Ｉ１５５Ｔ、Ｔ１５９Ｉ／Ｓ、もしくはＬ１６８Ｆのうちの少なくとも１つに対応する置換またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔５２〕〜〔５７〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５９〕前記前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つ、またはそれらの組み合わせを含む、前記〔５２〕〜〔５７〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド：１位のイソロイシンアミノ酸、４位のリジン、６位のチロシン、１１位のグルタミン、１８位のヒスチジン、イソロイシン、もしくはバリン、１９位のアスパラギン、２０位のプロリン、２１位のメチオニン、２２位のフェニルアラニン、２７位のバリン、２８位のチロシン、３１位のイソロイシン、３２位のプロリン、ヒスチジン、またはロイシン、３３位のアスパラギンまたはメチオニン、３４位のメチオニン、３６位のメチオニンまたはグルタミン酸、３８位のイソロイシンまたはフェニルアラニン、４０位のトレオニン、４２位のヒスチジン、４３位のアスパラギンまたはアルギニン、４４位のフェニルアラニン、４５位のグルタミン酸、４６位のグルタミン、４７位のプロリン、４８位のアルギニン、４９位のアスパラギン酸またはグリシン、５０位のリジンまたはセリン、５１位のグルタミン酸、アルギニン、またはバリン、５５位のグルタミン酸、５８位のイソロイシン、６０位のバリン、６６位のアスパラギン、６７位のセリンまたはアスパラギン酸、６８位のロイシンまたはアスパラギン酸、６９位のヒスチジン、７０位のバリン、７４位のリジンまたはイソロイシン、７６位のアスパラギン、フェニルアラニン、またはバリン、７７位のアスパラギン、８６位のアルギニンまたはロイシン、９０位のトレオニン、９２位のグルタミン、９４位のフェニルアラニン、９５位のセリンまたはアスパラギン酸、９６位のアラニン、９８位のフェニルアラニン、９９位のトレオニンまたはバリン、１０２位のメチオニンまたはグルタミン酸、１０６位のイソロイシン、１１０位のイソロイシン、１１２位のシステイン、１１３位のヒスチジン、１１９位のメチオニン、１２４位のメチオニン、１２８位のアラニンまたはセリン、１３５位のアスパラギン酸またはチロシン、１３８位のセリン、１４２位のバリン、１４５位のグルタミン、１４９位のイソロイシン、１５２位のヒスチジンもしくはセリン、１５４位のセリン、１５５位のトレオニン、１５９位のセリンもしくはイソロイシン、もしくは１６８位のフェニルアラニン。
〔６０〕配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８Ｉ、Ｎ１６６Ｒ、Ｉ９０Ｖ、Ｆ５４Ｉ、Ｑ１８Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、およびＭ７５Ｋを含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔６１〕配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、１８位のアミノ酸がロイシンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がイソロイシンであり、６８位のアミノ酸がチロシンであり、７２位のアミノ酸がグルタミンであり、７５位のアミノ酸がリジンであり、９０位のアミノ酸がバリンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンであり、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔６２〕配列番号１の３３に対応する位置におけるアミノ酸置換がアスパラギンである、前記〔６０〕または〔６１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔６３〕３９位がコドンＡＣＴによってコードされ、配列番号１に対応する３９位のアミノ酸がトレオニンであり、４３位のアミノ酸がアルギニンであり、６８位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔６２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔６４〕配列番号１に対応する２７位のアミノ酸がバリンであり、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、前記〔６３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔６５〕配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８Ｉ、Ｎ１６６Ｒ、Ｑ１８Ｌ、Ｆ５４Ｉ、Ｌ９２Ｈ、およびＹ１０９Ｆを含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔６６〕配列番号１に対応するアミノ酸置換Ｖ２１Ｌ、Ｆ６８Ｙ、Ｌ７２Ｑ、Ｍ７５Ｋ、Ｈ９２Ｒ、およびＶ１５８Ｆをさらに含む、前記〔６５〕に記載のポリヌクレオチド。
〔６７〕配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１に対応するアミノ酸置換Ａ４Ｅ、Ｑ１１Ｒ、Ａ３３Ｋ、Ｖ４４Ｉ、Ａ５４Ｉ、Ｆ７７Ｙ、Ｉ９０Ｖ、Ｐ１１５Ｅ、Ｑ１２４Ｋ、Ｙ１３８ＩおよびＮ１６６Ｒを含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔６８〕配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、１８位のアミノ酸がロイシンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がイソロイシンであり、９２位のアミノ酸がヒスチジンであり、１０９位のアミノ酸がフェニルアラニンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンであり、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔６９〕配列番号１に対応する２１位のアミノ酸がロイシンであり、６８位のアミノ酸がチロシンであり、７２位のアミノ酸がグルタミンであり、７５位のアミノ酸がリジンであり、９２位のアミノ酸がアルギニンであり、１５８位のアミノ酸がイソロイシンである、前記〔６８〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７０〕配列番号１のＯｇＬｕｃポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１に対応する４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１１位のアミノ酸がアルギニンであり、３３位のアミノ酸がリジンであり、４４位のアミノ酸がイソロイシンであり、５４位のアミノ酸がイソロイシンであり、７７位のアミノ酸がチロシンであり、９０位のアミノ酸がバリンであり、１１５位のアミノ酸がグルタミン酸であり、１２４位のアミノ酸がリジンであり、１３８位のアミノ酸がイソロイシンであり、１６６位のアミノ酸がアルギニンであり、前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドルシフェラーゼ活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔７１〕配列番号１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
〔７２〕配列番号１８、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４２、配列番号８８、または配列番号９２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
〔７３〕配列番号１に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有する十脚類ルシフェラーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、式（ＶＩＩ）の配列パターンに対応し、かつ多くて５つまでの差異を含む配列パターンを含み、差異が、表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに記載の式（ＶＩＩ）に対するパターン位置１、２、３、５、８、１０、１２、１４、１５、１７、または１８との差異、並びに表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに記載の式（ＶＩＩ）のパターン位置のいずれかの間のギャップまたは挿入を含み、前記十脚類ルシフェラーゼがセレンテラジンの存在下で発光を生ずる、単離ポリヌクレオチド。
〔７４〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに記載の式（ＶＩＩ）の配列パターンと多くて４つまでの差異を含む、前記〔７３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７５〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに記載の式（ＶＩＩ）の配列パターンと多くて３つまでの差異を含む、前記〔７３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７６〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに記載の式（ＶＩＩ）の配列パターンと多くて２つまでの差異を含む、前記〔７３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７７〕前記十脚類ルシフェラーゼが、表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに記載の式（ＶＩＩ）の配列パターンと多くて１つまでの差異を含む、前記〔７３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７８〕前記ポリペプチドが表４に列挙されるＯｇＬｕｃパターンに記載の式（ＶＩＩ）に対応する配列を含む、前記〔７３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７９〕前記十脚類ルシフェラーゼが、チヒロエビ（Aristeidae）科、タラバエビ（Pandalidea）科、クダヒゲエビ（Solenoceridae）科、ユメエビ（Luciferidae）科、サクラエビ（Segestidae）科、オキエビ（Pasiphaeidae）科、ヒオドシエビ（Oplophoridae）科、またはタラッソカリダエ（Thalassocaridae）科由来である、前記〔７３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８０〕前記十脚類ルシフェラーゼがヒオドシエビ（Oplophoridae）科由来である、前記〔７９〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８１〕前記十脚類ルシフェラーゼがオキヒオドシエビ属（Oplophorus）種由来である、前記〔８０〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８２〕前記十脚類ルシフェラーゼが、プレシオペナエウス・コルスカンス（Plesiopenaeus coruscans）、ヘテロカルプス（Heterocarpus）種、パラパンダルス（Parapandalus）種、ヒュメノペナエウス・デビリス（Hymenopenaeus debilis）、メソペナエウス・トゥロピカリス（Mesopenaeus tropicalis）、ルキフェル・テュプス（Lucifer typus）、セルゲステス・アトゥランティクス（Sergestes atlanticus）、セルゲステス・アルクティクス（Sergestes arcticus）、セルゲステス・アルマトゥス（Sergestes armatus）、セルゲステス・ペディフォルミス（Sergestes pediformis）、セルゲステス・コルヌトゥス（Sergestes cornutus）、セルゲステス・エドゥワルドゥシ（Sergestes edwardsi）、セルゲステス・ヘンセニ（Sergestes henseni）、セルゲステス・ペクティナトゥス（Sergestes pectinatus）、セルゲステス・サルガッシ（Sergestes sargassi）、セルゲステス・シミリス（Sergestes similis）、セルゲステス・ヴィギラクス（Sergestes vigilax）、セルギア・カッレンゲリ（Sergia challengeri）、セルギア・グランディス（Sergia grandis）、セルギア・ルケンス（Sergia lucens）、セルギア・プレヘンシリス（Sergia prehensilis）、セルギア・ポテンス（Sergia potens）、セルギア・ロブスタ（Sergia robusta）、セルギア・スキンティッランス（Sergia scintillans）、セルギア・スプレンデンス（Sergia splendens）、グリュプス・マルスピアリス（Glyphus marsupialis）、レプトケラ・ベルムデンシス（Leptochela bermudensis）、パラパシパエ・スルカティフロンス（Parapasiphae sulcatifrons）、パシペア・タルダ（Pasiphea tarda）、アカンテピュラ・アカンティテルソニス（Acanthephyra acanthitelsonis）、アカンテピュラ・アクティフロンス（Acanthephyra acutifrons）、アカンテピュラ・ブレヴィロストゥリス（Acanthephyra brevirostris）、アカンテピュラ・ククッラタ（Acanthephyra cucullata）、アカンテピュラ・クルティロストゥリス（Acanthephyra curtirostris）、アカンテピュラ・エクシミア（Acanthephyra eximia）、アカンテピュラ・グラキリペス（Acanthephyra gracilipes）、アカンテピュラ・キングスレユィ（Acanthephyra kingsleyi）、アカンテピュラ・メディア（Acanthephyra media）、アカンテピュラ・ミクロプタルマ（Acanthephyra microphthalma）、アカンテピュラ・ペラギカ（Acanthephyra pelagica）、アカンテピュラ・プリオノタ（Acanthephyra prionota）、アカンテピュラ・プルプレア（Acanthephyra purpurea）、アカンテピュラ・サングイネア（Acanthephyra sanguinea）、アカンテピュラ・シボガエ（Acanthephyra sibogae）、アカンテピュラ・ステュロロストゥラティス（Acanthephyra stylorostratis）、エピュリナ・ビフィダ（Ephyrina bifida）、エピュリナ・フィグエイライ（Ephyrina figueirai）、エピュリナ・コスキュニイ（Ephyrina koskynii）、エピュリナ・オムバンゴ（Ephyrina ombango）、ヒュメノドラ・グラキアリス（Hymenodora glacialis）、ヒュメノドラ・グラキリス（Hymenodora gracilis）、メニンゴドラ・ミッキュラ（Meningodora miccyla）、メニンゴドラ・モッリス（Meningodora mollis）、メニンゴドラ・ヴェスカ（Meningodora vesca）、ノトストムス・ギッボスス（Notostomus gibbosus）、ノトストムス・アウリクラトゥス（Notostomus auriculatus）、オプロポルス・グラキリロストゥリス（Oplophorus gracilirostris）、オプロポルス・グリマルディイ（Oplophorus grimaldii）、オプロポルス・ノヴァエゼアランディアエ（Oplophorus novaezealandiae）、オプロポルス・スピニカウダ（Oplophorus spinicauda）、オプロポルス・フォリアケウス（Oplophorus foliaceus）、オプロポルス・スピノスス（Oplophorus spinosus）、オプロポルス・テュプス（Oplophorus typus）、シュステッラスピス・ブラウエリ（Systellaspis braueri）、シュステッラスピス・クリスタタ（Systellaspis cristata）、シュステッラスピス・デビリス（Systellaspis debilis）、シュステッラスピス・ペッルキダ（Systellaspis pellucida）、クロロトコイデス・スピニカウダ（Chlorotocoides spinicauda）、タラッソカリス・クリニタ（Thalassocaris crinita）、またはタラッソカリス・ルキダ（Thalassocaris lucida）由来のルシフェラーゼである、前記〔７９〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８３〕式（ＶＩＩ）の配列パターンが、配列番号１の８番目の残基を先頭として配列番号１と整列されている、前記〔７３〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８４〕配列がコドン最適化されている、前記〔１〕〜〔８３〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔８５〕ポリヌクレオチドが配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５を含む、前記〔８４〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８６〕ポリヌクレオチドがＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドと連結された目的のポリペプチドをさらにコードし、目的のポリペプチドおよびＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが融合タンパク質として発現されることが可能である、前記〔１〕〜〔８５〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔８７〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔８８〕前記ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されている前記〔９６〕に記載のベクター。
〔８９〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔８７〕もしくは〔８８〕に記載のベクターを含む細胞。
〔９０〕前記〔８９〕に記載の細胞を含む非ヒト遺伝子導入動物。
〔９１〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔８７〕もしくは〔８８〕に記載のベクターを含む非ヒト遺伝子導入動物。
〔９２〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチド。
〔９３〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
〔９４〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質。
〔９５〕前記〔８９〕に記載の細胞を、ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させることを含む、ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドの製造方法。
〔９６〕ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記〔８７〕または〔８８〕に記載のベクターを細胞に導入することを含む、ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドの製造方法。
〔９７〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔８７〕もしくは〔８８〕に記載のベクターを含むキット。
〔９８〕前記〔９２〕に記載のＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドを含むキット。
〔９９〕 以下のうちの少なくとも１つをさらに含む、前記〔９７〕または〔９８〕のいずれか一項に記載のキット：
（ａ）式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物であって、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは-Ｓ−、-Ｏ−または-ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、-Ｈ、−ＯＨ、または-ＯＲ 11 であり；
Ｚは、-ＣＨ−または-Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して-Ｃ（Ｏ）Ｒ”または-ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
の化合物
；並びに
（ｂ）緩衝液試薬。
〔１００〕化合物
または
および前記〔６０〕〜〔６４〕または７１〜７２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは前記〔６０〕〜〔６４〕もしくは７１〜７２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むキット。
〔１０１〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；前記〔８７〕または〔８８〕のいずれか一項に記載のベクター；前記〔８９〕に記載の細胞；前記〔９０〕〜〔９１〕のいずれか一項に記載の動物；前記〔９２〕に記載のＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチド；前記〔９３〕に記載のポリペプチド；および前記〔９４〕に記載の融合タンパク質のうちの少なくとも１つを用いる、生物発光の測定方法。
〔１０２〕配列番号２を有する親核酸配列に対し８０％以下の核酸配列同一性を有し、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、もしくは配列番号２５に対し９０％以上の核酸配列同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチドの断片またはその補体を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列であって、減少した配列同一性が親核酸配列中のコドンと比較して合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンによるものであり、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体をコードし、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列と比較して減少した数の制御配列を有する、上記合成ヌクレオチド配列。
〔１０３〕配列番号１４を有する親核酸配列に対し８０％以下の核酸配列同一性を有し、配列番号２２もしくは配列番号２３に対し９０％以上の核酸配列同一性を有する少なくとも３００ヌクレオチドの断片またはその補体を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列であって、減少した配列同一性が親核酸配列中のコドンと比較して合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンによるものであり、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するホタルルシフェラーゼをコードし、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列と比較して減少した数の制御配列を有する、上記合成ヌクレオチド配列。
〔１０４〕配列番号１８を有する親核酸配列に対し８０％以下の核酸配列同一性を有し、配列番号２４もしくは配列番号２５に対し９０％以上の核酸配列同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチドの断片またはその補体を含むＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列であって、減少した配列同一性が親核酸配列中のコドンと比較して合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンによるものであり、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対し少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するＯｇＬｕｃ変異体をコードし、合成ヌクレオチド配列が親核酸配列と比較して減少した数の制御配列を有する、上記合成ヌクレオチド配列。
〔１０５〕前記ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドが可溶性の単量体である、前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１０６〕前記融合タンパク質がＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドのＮ末端にシグナル配列を含む、前記〔８６〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１０７〕前記融合タンパク質が細胞から分泌される、前記〔１０６〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１０８〕異種タンパク質と融合された、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来のシグナルペプチドを含む融合ペプチドであって、前記シグナルペプチドが配列番号５４であり、前記融合ペプチドが細胞中で発現され、そして細胞から分泌される、上記融合ペプチド。
〔１０９〕第一の標的タンパク質および生物発光供与体分子を含み、生物発光供与体分子が前記〔１０〕〜〔８８〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＯｇＬｕｃ変異体である、第一の融合タンパク質；第二の標的タンパク質および蛍光受容体分子を含む第二の融合タンパク質；並びにＯｇＬｕｃ基質、を含む生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）系。
〔１１０〕ＯｇＬｕｃ基質が天然セレンテラジンまたは既知のセレンテラジンである、前記〔１０９〕に記載のＢＲＥＴ系。
〔１１１〕ＯｇＬｕｃ基質が、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物である、前記〔１０９〕に記載のＢＲＥＴ系であって、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＯＲ 11 であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ”または−ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
ＢＲＥＴ系。
〔１１２〕ＯｇＬｕｃ基質が化合物
または
である、前記〔１０９〕に記載のＢＲＥＴ系。
〔１１３〕発光源タンパク質の酵素活性の測定方法であって、発光源タンパク質、脱保護酵素、および保護発光団を接触させること；並びに前記組成物から発せられた光を検出することを含み、発光源タンパク質が前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＯｇＬｕｃ変異体であり、発光団が式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物であり、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＯＲ 11 であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ”または−ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
方法。
〔１１４〕酵素活性が、生きている無傷の非ヒト動物において測定される、前記〔１１３〕に記載の方法。
〔１１５〕目的の非発光酵素の活性の測定方法であって、（ａ）目的の非発光酵素に対する基質である発光源分子および前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＯｇＬｕｃ変異体の前基質を提供することと；ｂ）発光源分子を少なくとも１つの目的の非発光酵素および少なくとも１つのＯｇＬｕｃ変異体と接触させて反応混合物を生成することと；並びに（ｃ）反応混合物の発光を測定することによって目的の非発光酵素の活性を決定することと、を含む方法。
〔１１６〕発光源分子が、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
または
の化合物の変更形態である、前記〔１１５〕に記載の方法であって、
式中、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 直鎖アルキルからなる群から選択され；
Ｒ 6 は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ 2、 −ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
Ｒ 8 は、
Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
式中、Ｒ 3 およびＲ 4 は、共にＨまたは共にＣ 1-2 アルキルであり；
Ｗは、−ＮＨ 2 、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ 2 Ｒであり；
Ｘは-Ｓ−、-Ｏ−または-ＮＲ 22 −であり；
Ｙは、-Ｈ、−ＯＨ、または-ＯＲ 11 であり；
Ｚは、-ＣＨ−または-Ｎ−であり；
各Ｒ 11 は独立して-Ｃ（Ｏ）Ｒ”または-ＣＨ 2 ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
Ｒ 22 は、Ｈ、ＣＨ 3 またはＣＨ 2 ＣＨ 3 であり；
各Ｒは独立してＣ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
Ｒ”は、Ｃ 1-7 直鎖アルキルまたはＣ 1-7 分岐鎖アルキルであり；
破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
ただし、
Ｒ 2 が、
または
のとき、Ｒ 8 は、
ではなく；
Ｒ 2 が、
であるとき、Ｒ 8 は、
または低級シクロアルキルであり；
Ｒ 6 がＮＨ 2 であるとき、Ｒ 2 は、
またはＣ 2-5 アルキルであり；
またはＲ 8 は、
ではない、
方法。
〔１１７〕目的の非発光酵素がプロテアーゼ酵素、シトクロムＰ４５０酵素、モノアミンオキシダーゼ酵素、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素である、前記〔１１５〕および〔１１６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１８〕非発光酵素の活性が生きている無傷動物において測定される、前記〔１１５〕〜〔１１７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１９〕試料中の少なくとも２つの分子の存在を検出するための方法であって、試料を前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＯｇＬｕｃ変異体を含む第一のレポーター分子に接触させることであって、第一のレポーター分子が試料の第一の成分に機能的に連結されることと；試料を第二のレポーター分子に接触させることであって、第二のレポーター分子が試料の第二の成分に機能的に連結されることと、；第一のレポーター分子および第二のレポーター分子の存在を検出して、試料中の第一の成分および第二の成分の存在および／または量を決定すること、を含む方法。
〔１２０〕細胞中の少なくとも２つの分子の存在を検出するための方法であって、細胞を前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるＯｇＬｕｃ変異体を含む第一のレポーター分子に接触させることであって、第一のレポーター分子が試料の第一の成分に機能的に連結されることと；試料を第二のレポーター分子に接触させることであって、第二のレポーター分子が試料の第二の成分に機能的に連結されることと；第一のレポーター分子および第二のレポーター分子の存在を検出して、試料中の第一の成分および第二の成分の存在および／または量を決定すること、を含む方法。
〔１２１〕ＯｇＬｕｃ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成方法であって、
（ａ）親ＯｇＬｕｃポリペプチドおよび少なくとも１つの異種ポリペプチドを含む親融合タンパク質コンストラクトを用いて変異融合タンパク質のライブラリーを作製することと；並びに
（ｂ）親融合タンパク質コンストラクトと比較して増強された発光、増強された酵素安定性または増強された生体適合性のうちの少なくとも１つのために前記ライブラリーをスクリーニングすること、
を含む方法。
〔１２２〕異種ポリペプチドがＯｇＬｕｃポリペプチドに対してＣ末端側である、前記〔１２１〕に記載の方法。
〔１２３〕異種ポリペプチドがＯｇＬｕｃポリペプチドに対してＮ末端側である、前記〔１２１〕に記載の方法。
〔１２４〕異種ポリペプチドがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）である、前記〔１２１〕〜〔１２３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２５〕融合タンパク質コンストラクトが２つの異種ポリペプチドを含む、前記〔１２１〕に記載の方法。
〔１２６〕異種ポリペプチドの一方がＯｇＬｕｃポリペプチドに対しＮ末端側であり、もう一方の異種ポリペプチドがＯｇＬｕｃポリペプチドに対しＣ末端側である、前記〔１２５〕に記載の方法。
〔１２７〕異種ポリペプチドがＨａｌｏＴａｇ（登録商標）およびＩｄである、前記〔１２５〕または〔１２６〕に記載の方法。
〔１２８〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはその断片を含むベクター。
〔１２９〕前記〔１〕〜〔８６〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはその断片を含む、循環置換されたルシフェラーゼ。
〔１３０〕生物中で使用するためのルシフェラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドの生成方法であって、ルシフェラーゼ中の各アミノ酸に対し、前記アミノ酸をコードするのに前記生物において使用される２つの最も頻繁に使用されるコドンから１つのコドンを無作為に選択し、第一のコドン最適化ポリヌクレオチドを生成すること、を含む方法。
〔１３１〕前記アミノ酸をコードするのに前記生物において使用される２つの最も頻繁に使用されるコドンのうちのもう一方を選択し、第二のコドン最適化ポリヌクレオチドを生成することをさらに含む、前記〔１３０〕に記載のコドンを最適化する方法。





































































































































































Claims (20)

  1. 配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号３に対して１つ以上のアミノ酸置換を含む発光ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記配列番号３に対して１つ以上のアミノ酸置換が、以下からなる群から選択され、
    Q18L、L27V、Y109F、A14V+K89E、L27M+K33N、E49K+L72Q、F54I+S66T、F54S+G67S、I56V+H93R、F77T+T126R、F77T+T39I、K89E+S148T、M106K+C164S、E23K+V58L+A169V、F68S+I90V+P145L、I59T+Y109F+P113T+L136M、Q20R+Y109F、L92H+Y109F、F54I+L92H+Y109F、F54I+Y109F、Q18L+L92H+Y109F、Q18L+F54I+L92H+Y109F、Q18L+I59T+L92H+Y109F+P113T+V127A+K136M、Q18L+Y109F、Q18L+F54I、Q18L+F54I+Y109F、Q20R+F77C+I90V+L92H+V127A、Q20R+G71D+F77C+I90V+L92H+V127A、Q20R+G71D+F77C+L92H+V127A、F54I+G71D+F77C+L92H+V127A、F54I+G71D+F77C+I90V+L92H、F54I+G71D+F77C+I90V+L92H+V127A、Q20R+F54I+G71D+F77C+I90V+L92H+V127A、G71D+I90V+L92H+Y109F+V127A、G71D+L92H+Y109F+V127A、Q20R+F54I+G71D+F77C+I90V+L92H+V127A、Q18L+G71D+F77Y+I90V+L92H+Y109F+V127A、Q18L+F54I+G71D+F77Y+I90V+L92H+Y109F+V127A、G71D+F77C+I90V+L92H+V127A、G71D+F77C+I90V+V127A、Q20R+G71D+F77C+L92H、F54I+G71D+F77C+L92H、Q20R+F54I+G71D+F77C+L92H+V127A、I90V+L92H+Y109F+V127A、F54I+I90V+L92H+Y109F+V127A、F54I+G71D+I90V+L92H+Y109F、Q18L+G71D+F77Y+L92H+Y109F+V127A、Q18L+F77Y+I90V+L92H+Y109F+V127A、Q18L+F54I+F77Y+I90V+L92H+Y109F+V127A、Q18L+F54I+I90V+L92H+Y109F+V127A、Q18L+F54I+G71D+F77Y+L92H+Y109F+V127A、G71D+F77C、I90V+Y109F、Q18L+F54I+I90V、F1I+L27V+F54I+I90V、L27V+F54I+I90V、Q18L+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+V38I+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V、F1I+L27V+V38I+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V、F1I+Q18L+F54I+M70V+L72Q+M75K+I90V、F1I+K33N+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V+V102E、Q18L+F54I+F68Y+L72A+M75K+I90V、Q18L+F54I+F68Y+L72G+M75K+I90V、Q18L+F54I+F68Y+L72N+M75K+I90V、Q18L+F54I+F68Y+L72R+M75K+I90V、Q18L+F54I+F68Y+L72M+M75K+I90V、Q18L+K33N+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V、Q18L+K33N+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68Y+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+K33N+K43R+F54I+S66N+F68Y+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+S66N+F68Y+L72Q+M75K+I90V、W10Y+Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、A14S+Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Y16E+Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+E23K+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+Q24A+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27A+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27I+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27M+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+H87N+I90V、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+H87T+I90V、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+V102T、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+G111N、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+P113K、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+I125L、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+T130K、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+L142E、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+L142K、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+L142W、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+D146G、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+G147N、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+L149M、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+L150V、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+R152E、Q18L+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+R152T、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+M75K+I90V、E4A+Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+K124Q、Q18L+L27V+K33N+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+E115P、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+R166N、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33A+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+I138Y、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54A+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K、Q18L+L27V+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+I44V+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+R166K、R11Q+Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、Q18L+L27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V+R166F及びL27V+K33N+K43R+F54I+F68D+L72Q+M75K+I90V、
    前記発光ポリペプチドが配列番号３のポリペプチドと比較して増強された発光を有する、前記単離ポリヌクレオチド。
  2. 前記発光ポリペプチドが、配列番号１に対して、５４位及び９０位においてアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 配列番号１の５４位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、配列番号１の９０位に対応する位置のアミノ酸がバリンである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記発光ポリペプチドが、配列番号１に対して、１８位、６８位、７２位及び７５位のうちの１つ以上においてアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 配列番号１の１８位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、配列番号１の７２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンであり、配列番号１の７５位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記発光ポリペプチドが、配列番号１に対して、３３位、２７位、４３位及び６８位のうちの１つ以上においてアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  7. 配列番号１の３３位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、配列番号１の２７位に対応する位置のアミノ酸がバリンであり、配列番号１の４３位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記発光ポリペプチドが、配列番号１の１１位、４４位、１１５位、１２４位又は１３８位に対応する位置において、配列番号３に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号１の１１位に対応する位置においてグルタミンに、配列番号１の４４位に対応する位置においてバリンに、配列番号１の１１５位に対応する位置においてプロリンに、配列番号１の１２４位に対応する位置においてグルタミンに、又は配列番号１の１３８位に対応する位置においてチロシンに対応する、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記発光ポリペプチドが目的のポリペプチドと連結され、前記目的のポリペプチドおよび前記発光ポリペプチドが融合タンパク質として発現されることが可能である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記発光ポリペプチドが可溶性の単量体である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  12. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  13. 前記ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されている請求項１２に記載のベクター。
  14. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
  15. 請求項１４に記載の細胞を含む非ヒト遺伝子導入動物。
  16. 請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる発光ポリペプチド。
  17. 請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる発光ポリペプチドを含む融合タンパク質。
  18. 請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、循環置換されたルシフェラーゼ。
  19. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
  20. 以下のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１９に記載のキット：
    （ａ）式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
    または
    の化合物であって、
    式中、Ｒ2は、
    またはＣ2-5直鎖アルキルからなる群から選択され；
    Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群から選択され；
    Ｒ8は、
    Ｈまたは低級シクロアルキルからなる群から選択され；
    式中、Ｒ3およびＲ4は、共にＨまたは共にＣ1-2アルキルであり；
    Ｗは、−ＮＨ2、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ2Ｒであり；
    Ｘは-Ｓ−、-Ｏ−または-ＮＲ22−であり；
    Ｙは、-Ｈ、−ＯＨ、または-ＯＲ11であり；
    Ｚは、-ＣＨ−または-Ｎ−であり；
    各Ｒ11は独立して-Ｃ（Ｏ）Ｒ”または-ＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ”であり；
    Ｒ22は、Ｈ、ＣＨ3またはＣＨ2ＣＨ3であり；
    各Ｒは独立してＣ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
    Ｒ”は、Ｃ1-7直鎖アルキルまたはＣ1-7分岐鎖アルキルであり；
    破線の結合は、飽和でも不飽和でもよい任意の環の存在を表し；
    ただし、
    Ｒ2が、
    または
    のとき、Ｒ8は、
    ではなく；
    Ｒ2が、
    であるとき、Ｒ8は、
    または低級シクロアルキルであり；
    Ｒ6がＮＨ2であるとき、Ｒ2は、
    またはＣ2-5アルキルであり；
    またはＲ8は、
    ではない、
    化合物
    ；並びに
    （ｂ）緩衝液試薬。
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