JP5605727B2 - セレンテラジン類縁体及びセレンテラミド類縁体 - Google Patents

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本発明は、セレンテラジン類縁体、セレンテラミド類縁体、カルシウム結合型発光蛋白質、蛍光蛋白質などに関する。
生物発光に関与する蛋白質の一つに、カルシウム結合型発光蛋白質がある。この発光蛋白質は、Ca2+と特異的に結合し瞬間的に発光する。カルシウム結合型発光蛋白質は、酸素添加機能をもつ蛋白質と発光基質であるルシフェリンのペルオキシドを含む複合体である。カルシウム結合型発光蛋白質において、酸素添加機能をもつ蛋白質はアポ蛋白質とよばれる。また、ルシフェリンのペルオキシドは、セレンテラジンペルオキシド（２−hydroperoxycoelenterazine）である。このようなカルシウム結合型蛋白質としては、具体的には、イクオリン（aequorin）、クライティン−Ｉ（clytin−I）、クライティン−ＩＩ（clytin−II）、マイトロコミン（mitrocomin）、及びオベリン（obelin）などの腔腸動物由来のものが知られている。
このうち、イクオリンは、発光クラゲであるオワンクラゲ（Aequorea aequorea）から単離された発光蛋白質である（非特許文献１：Shimomura, In: Bioluminescence, Chemical principles and methods (2006) pp90−158, World Scientific Pub. Co.； 非特許文献２：Shimomura et al. (1962) J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223−240）。このイクオリンは、アポ蛋白質であるアポイクオリン（21.4kDa）とセレンテラジンのヒドロペルオキシドとの非共有結合性複合体である（非特許文献３： Head et al. (2000) Nature405, 372−376）。アポイクオリンは、189のアミノ酸残基から構成される単純ポリペプチドであり、Ca2+結合部位に特徴的な3つのEFハンドモチーフを有する（非特許文献４：Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.82, 3154−3158）。Ca2+の存在下で、イクオリンは、分子内反応によって青い光を発し（λmax＝ 〜460 nm）、アポイクオリンとセレンテラミドとCO2とに分解する（非特許文献５： Shimomura & Johnson (1972) Biochemistry11, 1602−1608.; 非特許文献６： Shimomura & Johnson (1973) Tetrahedron Lett. 2963−2966）。この分解により得られたCa2+結合アポイクオリンとセレンテラミドの複合体は、青色蛍光蛋白質(BFP)として知られている（非特許文献７： Shimomura & Johnson (1975) Nature 256, 236−238）。このBFPの蛍光発光スペクトルは、イクオリンの生物発光スペクトルと同一である（非特許文献８：Shimomura (1995) Biochem. J. 306, 537−543； 非特許文献９： Inouye (2004) FEBS Lett.577, 105−110）。
大腸菌より調製した組換えアポイクオリンは、EDTA及び還元試薬の存在下、セレンテラジン及び酸素と共にインキュベートすることにより、組換えイクオリンを再生することができる（非特許文献１０：Inouye et al. (1986) Biochemistry 25, 8425−8429；非特許文献１１： Inouye et al. (1989) J. Biochem. 105, 473−477）。この組換えイクオリンは、高度に精製されている（非特許文献１２：Shimomura & Inouye (1999) Protein Express. Purif. 16, 91−95）。組換えイクオリンの発光特性は、天然のイクオリンの特性と一致している（非特許文献１３：Shimomura et al. (1990) Biochem. J. 270, 309−312）。
これまでに50種類程度のセレンテラジン類縁体（CTZアナログ）が合成され、それらの一部については、半合成イクオリンの調製に使用された実績がある。（例えば、非特許文献１３：Shimomura et al. (1990) Biochem. J. 270, 309−312、非特許文献１４：Shimomura O. et al. (1988) Biochem. J. 251, 405−410、非特許文献１５：Shimomura O. et al. (1989) Biochem. J. 261, 913−920、非特許文献１６：Inouye S.& Shimomura O. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 349−353）。
イクオリン及び半合成イクオリンの結晶構造が解析され（非特許文献３：Head et al. (2000) Nature405, 372−376；非特許文献１7：Toma et al. (2005) Protein Science 14, 409−416）、イクオリンのEFハンドモチーフに対するMg2+の結合特性も、NMR分析によって調べられている（非特許文献１８：Ohashi et al. (2005) J. Biochem. 138, 613−620）。
最近、精製された組換えイクオリンからBFPが定量的に調製され（非特許文献９：Inouye (2004) FEBS Lett.577, 105−110；非特許文献１９：Inouye & Sasaki (2006) FEBS Lett. 580 1977−1982）、このBFPが実質的な発光活性を有し、ルシフェラーゼのようにセレンテラジンの酸化を触媒するということが明らかとなった。このBFPの発光強度は、Ca2+結合アポイクオリンの発光強度の約10倍である（非特許文献９：Inouye (2004) FEBS Lett. 577, 105−110）。すなわちこのBFPは、蛍光活性及びルシフェラーゼ活性を有する新規の二機能性蛋白質である。更に、BFPは、EDTAの処理により蛍光発光最大ピーク約470nmを有する緑色蛍光蛋白質(gFP)に変換される。
gFPは、アポイクオリンとセレンテラミドとの非共有結合性複合体であり、還元試薬の非存在下25℃で、gFPをセレンテラジンとともにインキュベーションすることにより、イクオリンを再生することができる（非特許文献９：Inouye (2004) FEBS Lett.577, 105−110）。EDTA及びジチオスレイトール(DTT)の存在下、様々なセレンテラジンのアナログをBFP又はgFPと共にインキュベートすることにより、半合成イクオリンも調製可能である（非特許文献１９：Inouye & Sasaki (2006) FEBS Lett. 580, 1977−1982）。更に、BFPのルシフェラーゼとしての発光活性は、セレンテラジン及びそのアナログを基質として、30〜300mMの濃度のイミダゾール添加によって活性化される（非特許文献２０：Inouye & Sasaki (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 354, 650−655）。
BFP及びgFPの用途開発において、重要な基礎情報であるセレンテラジンへの酸素添加のための蛋白質触媒領域又はアミノ残基は依然不明であるという問題がある。これらの問題解決及び用途開発において、容易に数十ミリグラムの量のBFP及びgFPを調製する必要があり、本発明者らは、アポイクオリンと化学合成したセレンテラミドより半合成gFP及び半合成BFPを調製する方法の確立も行なった（非特許文献２１：Inouye & Hosoya (2009)Biochem. Biophys. Res. Commun. 386, 617−622）。この方法で調製した半合成BFPは、イクオリンから発光により調製したBFPと同様にセレンテラジンを基質とするルシフェラーゼ活性を有する。その発光スペクトルは、470 nm前後の青色である。
生体内プローブとして使用するものとして、蛍光の最大波長がより近赤外領域(~600 nm以上)に近いプローブが求められている。しかし、セレンテラミド類縁体と天然型イクオリン由来のアポイクオリンとにより調製した半合成BFP及び半合成gFPにおいて蛍光の最大波長が近赤外領域により近い485 nm以上のものは、いまだ報告されていない。
Shimomura, In: Bioluminescence, Chemical principles and methods (2006) pp90−158, World Scientific Pub. Co. Shimomura et al. (1962) J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223−240 Head et al. (2000) Nature405, 372−376 Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 3154−3158 Shimomura & Johnson (1972) Biochemistry11, 1602−1608 Shimomura & Johnson (1973) Tetrahedron Lett. 2963−2966 Shimomura ＆ Johnson (1975) Nature 256, 236−238 Shimomura (1995) Biochem. J. 306, 537−543 Inouye (2004) FEBS Lett. 577, 105−110 Inouye et al (1986) Biochemistry 25, 8425−8429 Inouye et al., (1989) J. Biochem. 105 473−477 Shimomura & Inouye (1999) Protein Express. Purif. 16, 91−95 Shimomura et al., (1990) Biochem. J. 270, 309−312 Shimomura et al. (1988) Biochem. J. 251, 405−410 Shimomura et al. (1989) Biochem. J. 261, 913−920 Inouye S.& Shimomura O. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 349−353 Toma et al. (2005) Protein Science 14, 409−416 Ohashi et al. (2005) J. Biochem. 138, 613−620 Inouye & Sasaki (2006) FEBS Lett. 580, 1977−1982 Inouye & Sasaki (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 354, 650−655 Inouye & Hosoya (2009) Biochem. Biophys. Res. Commun. 386, 617−622
上記状況において、従来のものと異なる発光特性を示すセレンテラジン類縁体などが求められていた。
また、従来のものと異なる蛍光特性を示すセレンテラミド類縁体、及びそのようなセレンテラミド類縁体を含有する蛍光蛋白質なども求められていた。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、セレンテラジンの８位を改変したセレンテラジン類縁体が、従来のものと異なる発光特性を示すこと、セレンテラミドの２位又は３位を改変したセレンテラミド類縁体が、従来のものと異なる蛍光特性を示すこと、などを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、セレンテラジン類縁体、セレンテラミド類縁体、カルシウム結合型発光蛋白質、蛍光蛋白質などを提供する。
［１］ 下記一般式(I)で表わされる化合物。

（式中、Ｒ３は、水素原子、臭素原子、及び下記式

で表わされる基から選択されるいずれかであり、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり、Ｒ６とＲ８が結合して、Ｒ６とＲ８がそれぞれ結合する炭素原子とともに置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のヘテロアリールを形成してもよい。）
［２］ 下記から選択される、上記［１］記載の化合物。

［３］ 下記から選択される、上記［１］記載の化合物。

［４］ 下記一般式（II）で表わされる化合物。

（式中、Ｒ３’は、水素原子、臭素原子、及び下記式

で表わされる基から選択されるいずれかであり、Ｒ６’、Ｒ７’及びＲ８’は、それぞれ独立して、水素原子、置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり、Ｒ６’とＲ８’が結合して、Ｒ６’とＲ８’がそれぞれ結合する炭素原子とともに置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のヘテロアリールを形成してもよい。）
［５］ 下記から選択される、上記［４］記載の化合物。

［６］ 下記一般式(III)で表わされる化合物。

（式中、Ｚ１は、Ｏ又はＳであり、Ｒ３’’は、水素原子、臭素原子、置換若しくは無置換のアリール、置換若しくは無置換のアリールアルキル、置換若しくは無置換のアリールアルケニル、置換若しくは無置換のアリールアルキニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキニル、脂肪族環式基、又は複素環式基である。）
［７］ 下記一般式(IV)で表わされる化合物。

(式中、Ｒ２’’’は、

から選択される基であり、Ｒ３’’’は、水素原子、臭素原子、置換若しくは無置換のアリール、置換若しくは無置換のアリールアルキル、置換若しくは無置換のアリールアルケニル、置換若しくは無置換のアリールアルキニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキニル、脂肪族環式基、又は複素環式基である。）
［８］ 下記から選択される、上記［６］又は［７］に記載の化合物。

［９］ 上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の化合物のペルオキシドと、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを含む、カルシウム結合型発光蛋白質。
［１０］ 上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の化合物と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることを含む、カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
［１１］ 上記［９］記載のカルシウム結合型発光蛋白質を用いることを含む、カルシウムイオンを検出又は定量する方法。
［１２］ 上記［９］記載のカルシウム結合型発光蛋白質をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、生理機能又は酵素活性の解析方法。
［１３］ 上記［４］〜［８］のいずれか一項記載の化合物、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む、蛍光蛋白質。
［１４］ 上記［９］記載のカルシウム結合型発光蛋白質に、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させて、蛍光蛋白質を得ることを含む、蛍光蛋白質の製造方法。
［１５］ 上記［４］〜［８］のいずれか一項記載の化合物を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下において、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に接触させて、蛍光蛋白質を得ることを含む、蛍光蛋白質の製造方法。
［１６］ 前記接触を、還元剤の存在下で行う、上記［１４］又は［１５］記載の方法。
［１７］ 上記［４］〜［８］のいずれか一項記載の化合物、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む、蛍光蛋白質。
［１８］ 上記［４］〜［８］のいずれか一項記載の化合物を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に接触させて、蛍光蛋白質を得ることを含む、蛍光蛋白質の製造方法。
［１９］ 上記［１３］記載の蛍光蛋白質を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することを含む、蛍光蛋白質の製造方法。
［２０］ 前記接触を、還元剤の存在下で行う、上記［１８］又は［１９］記載の方法。
［２１］ 上記［１３］又は［１７］記載の蛍光蛋白質をアクセプター又はドナーとして用いて蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、生理機能又は酵素活性の解析方法。
本発明によれば、新たなセレンテラジン類縁体が提供される。本発明のいくつかの態様のセレンテラジン類縁体は、従来のセレンテラジンと異なる発光特性を示す。
また、本発明によれば、新たなセレンテラミド類縁体が提供される。本発明のいくつかの態様のセレンテラミド類縁体は、従来のセレンテラミドと異なる蛍光特性を示す。
セレンテラジン類縁体より調製した半合成イクオリンのカルシウム添加による発光スペクトルを示す図である。 セレンテラジン類縁体より調製した半合成イクオリンのカルシウム添加による生成した蛍光蛋白質の蛍光スペクトルを示す図である。 半合成イクオリンの初期発光強度とカルシウムイオン濃度との関係を示す図である。 EDTA存在下、セレンテラミド類縁体（4a−4l）とアポイクオリンより調製した半合成gFPの蛍光スペクトルを示す図である。 EDTA存在下、セレンテラミド類縁体（4m−4z）とアポイクオリンより調製した半合成gFPの蛍光スペクトルを示す図である。 カルシウムイオン存在下、セレンテラミド類縁体（4a−4l）とアポイクオリンより調製した半合成BFPの蛍光スペクトルを示す図である。 カルシウムイオン存在下、セレンテラミド類縁体（4m−4z）とアポイクオリンより調製した半合成BFPの蛍光スペクトルを示す図である。 セレンテラミドからBFP、gFP及びイクオリンなどを製造するためのスキームを示す図である。
以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明のセレンテラジン類縁体
本発明は、一般式(I)で表わされる化合物（以下、「本発明のセレンテラジン類縁体」という場合がある）を提供する。本発明のセレンテラジン類縁体は、セレンテラジンのC-8位を改変したものである。

（式中、Ｒ３は、水素原子、臭素原子、及び下記式

で表わされる基から選択されるいずれかであり、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり、Ｒ６とＲ８が結合して、Ｒ６とＲ８がそれぞれ結合する炭素原子とともに置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のヘテロアリールを形成してもよい。）
ここで、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８の「置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル」は、例えば、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有する炭素数１〜６のアルキル、又は無置換のアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。「置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、フルオロメチル、又はパーフルオロアルキル（例、トリフルオロメチル、パーフルオロヘキシル）などである。
Ｒ６、Ｒ７及びＲ８の「置換若しくは無置換のアリール」、又はＲ６とＲ８が結合してＲ６とＲ８がそれぞれ結合する炭素原子とともに形成する「置換若しくは無置換のアリール」は、例えば、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有するアリール、又は無置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は、水酸基、ニトロ、又はジメチルアミノである。「置換若しくは無置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ナフチル（１−ナフチル、２−ナフチル）、ヒドロキシフェニル（２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル）、アミノフェニル（例、４−ジメチルアミノフェニル）、ニトロフェニル（例、４−ニトロフェニル）、フルオロフェニル（例、４−フルオロフェニル）、トリフルオロメチルフェニル（例、４−トリフルオロメチルフェニル）などである。
Ｒ６、Ｒ７及びＲ８の「置換若しくは無置換のヘテロアリール」、又はＲ６とＲ８が結合してＲ６とＲ８がそれぞれ結合する炭素原子とともに形成する「置換若しくは無置換のヘテロアリール」は、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有するヘテロアリール、又は無置換のヘテロアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル、好ましくは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ）、アリール（例、フェニル、ナフチル、アントラニル）、ヘテロアリール（例、チエニル（２−チエニル、３−チエニル）、フリル（２−フリル、３−フリル）、ピロリル（２−ピロリル、３−ピロリル）、ピリジル（２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、イミダゾイル、ピラゾイル、オキサゾイル、チアゾイル、イソキサゾイル、ピリミジル、ピラジル、ピリダゾイル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。「置換若しくは無置換のヘテロアリール」は、具体的には、チエニル（２−チエニル、３−チエニル）、ベンゾチエニル（例、ベンゾ[b]チオフェン−2−イル、ベンゾ[b]チオフェン−3−イル）、チエノチエニル（例、チエノ［2，3−b］チエニル、チエノ［3，2−b］チエニル、チエノ［3，2−b:2,3−d］チエニル）、ビチオフェニル（例、２，２−ビチオフェン−５−イル）、ベンゾフラニル、インドイル、インダゾイル、ベンゾイミダゾイル、ベンゾオキサゾイル、ベンゾイソオキサゾイル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、又はアクリジニルなどである。
本発明の好ましい態様のセレンテラジン類縁体は、次の化合物である。
本発明のさらに好ましい態様のセレンテラジン類縁体は、次の化合物である。
本発明のいくつかのセレンテラジン類縁体を発光基質として含むカルシウム結合型発光蛋白質は、セレンテラジンを発光基質として含むものと比較して、発光強度値が最大発光強度値の半分になるまでの時間である発光の半減時間が長く、例えば、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、3.0倍以上、4.0倍以上、5.0倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、又は70倍以上長い。セレンテラジンと比較して、発光の半減時間を長くすることができるセレンテラジン類縁体としては、より具体的には、上記セレンテラジン類縁体（3a〜3t）のうち、3a、3b、3d、3e、3f、3h、及び3jを挙げることができ、好ましくは、3a、3e、3f、及び3jを挙げることができ、特には、3fを挙げることができる。
本発明のさらにいくつかのセレンテラジン類縁体を発光基質として含むカルシウム結合型発光蛋白質の発光スペクトルは、当該カルシウム結合型発光蛋白質をカルシウムにより発光させることにより調製した対応する蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと異なり、例えば、発光と蛍光の最大発光波長が、±20nm以上、±25nm以上、±30nm以上、±35nm以上、±40nm以上、±45nm以上、±50nm以上、±60nm以上、±70nm以上、±80nm以上、±90nm以上、±100nm以上、±100nm以上、±110nm以上、±120nm以上、又は±130nm以上異なる。発光スペクトルと蛍光スペクトルを異なるものとすることができるセレンテラジン類縁体としては、より具体的には、上記セレンテラジン類縁体（3a〜3t）のうち、3a、3b、3e、3f、3h、及び3jを挙げることができ、好ましくは、3b、3e、及び3jを挙げることができ、特には、3b、及び3jを挙げることができる。
２．本発明のセレンテラジン類縁体の製造方法
上記本発明のセレンテラジン類縁体、すなわち下記一般式（Ｉ）

（式中、Ｒ３は前記の通りである。）で表わされるセレンテラジン類縁体は、次のようにして製造することができる。すなわち、一般式（Ｉ）で表わされるセレンテラジン類縁体は、下記一般式（I−1）

（式中、Ｒ３は、前記の通りであり、Ｙ１は、水素原子又は保護基である。）で表わされる化合物を、
下記一般式（I−2）

（式中、Y2は、水素原子又は保護基であり、Ｒ２は、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル又はイソプロピルであり、２つのＲ２が結合して、炭素数２〜４のアルキレンを形成してもよい。）で表わされる化合物に反応させることにより、一般式（I）で表わされる化合物を得ることができる。
ここで、Ｙ１及びＹ２で示される保護基としては、それぞれ独立して、例えば、tert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)、tert−ブチルジフェニルシリル（TBDPS）、トリメチルシリル（TMS）、トリエチルシリル（TES）、トリイソプロピルシリル（TIPS）、メトキシメチル（MOM）、2−メトキシエトキシメチル（MEM）、2−テトラヒドロピラニル（THP）などを挙げることができ、特に、TBDMS、MOM又はTHPが好ましい。
２つのＲ２が結合して形成される炭素数２〜４のアルキレンは、エチレン、プロピレン、又はブチレンなどである。
一般式（I-1）で表わされる化合物は、公知の方法で製造することができる。例えば、一般式（I-1）で表わされる化合物は、Y. Kishi et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747−2748 (1972)、又はM. Adamczyk et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)、又はF. D. Wael et al., Bioorg. Med. Chem., 17, 4336−4344 (2009)に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。より具体的には、まず、ルイス酸触媒を用いて置換フェニルグリオキサールアルドキシムとグリシノニトリル誘導体との環化反応を行い、ピラジンオキシドを形成した後、Raney Ni等を触媒として用いた接触水素還元により製造するか、又は３位に適切な置換基を有する２−アミノ−５−ブロモピラジン誘導体と置換フェニルホウ酸或は置換フェニルホウ酸ピナコールエステルとの鈴木−宮浦カップリング反応を行うか、又は２−アミノ−３−ブロモピラジン誘導体と適切なホウ酸誘導体或はホウ酸ピナコールエステル誘導体との鈴木−宮浦カップリング反応を行うことで、一般式（I-1）で表わされる化合物を製造できる。
一般式（I−2）で表わされる化合物は、公知の方法で製造することができる。例えば、一般式（I−2）で表わされる化合物は、M.Adamczyk, M. et al., Synth. Commun., 32, 3199−3205 (2002)、又はH. Baganz & H.−J. May, Chem. Ber., 99, 3766−3770 (1966)及びH. Baganz & H.−J. May, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 5, 420 (1966)に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。より具体的には、置換ベンジルGrignard反応剤をジエトキシ酢酸エチルと低温（−78 ℃）で反応させるか、又はエタノール中でα−ジアゾ−α−置換 フェニルケトンに次亜塩素酸tert−ブチルを作用させることで、一般式（I−2）で表わされる化合物を製造することができる。
ここで、本発明の一般式（Ｉ）で表わされる化合物の製造方法において使用される反応試薬は、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、フッ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸等の酸触媒であり、これらは単独で又は混合して使用することができ、特に塩酸が好ましい。
本発明の一般式（Ｉ）で表わされる化合物の製造方法において使用される溶媒は、特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エーテル、メタノール、エタノール、又は水等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
また、本発明の一般式（１）で表わされる化合物の製造方法において、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、０℃〜２００℃で１時間〜９６時間、室温〜１５０℃で３時間〜７２時間、又は６０℃〜１２０℃で６時間〜２４時間である。
３．本発明のセレンテラミド類縁体
本発明は下記一般式(II)又は一般式(III)で表わされる化合物（以下、「本発明のセレンテラミド類縁体」という場合がある。）を提供する。本発明のセレンテラミド類縁体は、セレンテラミドのＣ−３位又はＣ−２位を改変したものである。
３．１．Ｃ−３位を改変したセレンテラミド類縁体
Ｃ−３位を改変した本発明のセレンテラミド類縁体は、次の化合物である。

（式中、Ｒ３’は、水素原子、臭素原子、及び下記式

で表わされる基から選択されるいずれかであり、Ｒ６’、Ｒ７’及びＲ８’は、それぞれ独立して、水素原子、置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり、Ｒ６’とＲ８’が結合して、Ｒ６’とＲ８’がそれぞれ結合する炭素原子とともに置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のヘテロアリールを形成してもよい。）
ここで、Ｒ６’、Ｒ７’及びＲ８’の「置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル」は、例えば、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有する炭素数１〜６のアルキル、又は無置換のアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。「置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル」は、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、フルオロメチル、又はパーフルオロアルキル（例、トリフルオロメチル、パーフルオロヘキシル）などである。
Ｒ６’、Ｒ７’及びＲ８’の「置換若しくは無置換のアリール」、又はＲ６’とＲ８’が結合してＲ６’とＲ８’がそれぞれ結合する炭素原子とともに形成する「置換若しくは無置換のアリール」は、例えば、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有するアリール、又は無置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は、水酸基、ニトロ、又はジメチルアミノである。「置換若しくは無置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ナフチル（１−ナフチル、２−ナフチル）、ヒドロキシフェニル（２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル）、アミノフェニル（例、４−ジメチルアミノフェニル）、ニトロフェニル（例、４−ニトロフェニル）、フルオロフェニル（例、４−フルオロフェニル）、トリフルオロメチルフェニル（例、４−トリフルオロメチルフェニル）などである。
Ｒ６’、Ｒ７’及びＲ８’の「置換若しくは無置換のヘテロアリール」、又はＲ６’とＲ８’が結合してＲ６’とＲ８’がそれぞれ結合する炭素原子とともに形成する「置換若しくは無置換のヘテロアリール」は、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有するヘテロアリール、又は無置換のヘテロアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル、好ましくは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ）、アリール（例、フェニル、ナフチル、アントラニル）、ヘテロアリール（例、チエニル（２−チエニル、３−チエニル）、フリル（２−フリル、３−フリル）、ピロリル（２−ピロリル、３−ピロリル）、ピリジル（２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、イミダゾイル、ピラゾイル、オキサゾイル、チアゾイル、イソキサゾイル、ピリミジル、ピラジル、ピリダゾイル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。「置換若しくは無置換のヘテロアリール」は、具体的には、チエニル（２−チエニル、３−チエニル）、ベンゾチエニル（例、ベンゾ[b]チオフェン−2−イル、ベンゾ[b]チオフェン−3−イル）、チエノチエニル（例、チエノ［2，3−b］チエニル、チエノ［3，2−b］チエニル、チエノ［3，2−b:2,3−d］チエニル）、ビチオフェニル（例、２，２−ビチオフェン−５−イル）、ベンゾフラニル、インドイル、インダゾイル、ベンゾイミダゾイル、ベンゾオキサゾイル、ベンゾイソオキサゾイル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、又はアクリジニルなどである。
Ｃ−３位を改変した本発明の好ましい態様のセレンテラミド類縁体は、次の化合物である。
３．２．Ｃ−２位を改変したセレンテラミド類縁体
Ｃ−２位を改変した本発明のいくつかの態様のセレンテラミド類縁体は、次の化合物である。

（式中、Ｚ１は、Ｏ又はＳであり、Ｒ３’’は、水素原子、臭素原子、置換若しくは無置換のアリール、置換若しくは無置換のアリールアルキル、置換若しくは無置換のアリールアルケニル、置換若しくは無置換のアリールアルキニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキニル、脂肪族環式基、又は複素環式基である。）
ここで、Ｒ３’’の「置換若しくは無置換のアリール」は、例えば１〜５個の置換基を有するアリール、又は無置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、アミノ、及び炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は水酸基である。「置換若しくは無置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−アミノフェニル、又はｐ−ジメチルアミノフェニルなどであり、好ましくは、フェニル、又はｐ−ヒドロキシフェニルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは無置換のアリール」は、無置換のアリールであり、例えば、フェニルなどである。
Ｒ３’’の「置換若しくは無置換のアリールアルキル」は、例えば１〜５個の置換基を有する炭素数７〜１０個のアリールアルキル、又は無置換の炭素数７〜１０個のアリールアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、アミノ、及び炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などが挙げられる。「置換若しくは無置換のアリールアルキル」は、例えば、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、p−ヒドロキシベンジル、又はp−ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、又はフェニルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは無置換のアリールアルキル」は、ベンジルである。
Ｒ３’’の「置換若しくは無置換のアリールアルケニル」は、例えば１〜５個の置換基を有する炭素数８〜１０個のアリールアルケニル、又は無置換の炭素数８〜１０個のアリールアルケニルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、アミノ、及び炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などが挙げられる。「置換若しくは無置換のアリールアルケニル」は、例えば、フェニルビニル、p−ヒドロキシフェニルビニル、又はp−ジメチルアミノフェニルビニルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは無置換のアリールアルケニル」は、無置換のアリールアルケニルであり、例えば、フェニルビニルなどである。
Ｒ３’’の「置換若しくは無置換のアリールアルキニル」は、例えば１〜５個の置換基を有する炭素数８〜１０個のアリールアルキニル、又は無置換の炭素数８〜１０個のアリールアルキニルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、アミノ、及び炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などが挙げられる。「置換若しくは無置換のアリールアルキニル」は、例えば、フェニルエチニル、ナフチルエチニル、４−フルオロフェニルエチニル、４−トリフルオロメチルフェニルエチニル、４−メトキシフェニルエチニル、４−ニトロフェニルエチニルなどであり、好ましくは、フェニルエチニルなどである。
Ｒ３’’の「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル」は、例えば、無置換の直鎖若しくは分枝鎖の炭素数１〜４個のアルキル、又は例えば１〜１０個の脂肪族環式基によって置換された直鎖若しくは分枝鎖の炭素数１〜４個のアルキルである。脂肪族環式基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、又はアダマンチルなどである。「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロブチルメチル、又はシクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、又はシクロヘキシルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル」は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、又はシクロヘキシルエチルなどである。
Ｒ３’’の「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル」は、無置換の直鎖若しくは分枝鎖の炭素数２〜６個のアルケニル、又は例えば１〜１０個の脂肪族環式基によって置換された直鎖若しくは分枝鎖の炭素数２〜６個のアルケニルである。脂肪族環式基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、又はアダマンチルなどである。「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル」は、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、又は２−メチルプロペニルなどであり、好ましくは、２−メチルプロペニルなどである。
Ｒ３’’の「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキニル」は、無置換の直鎖若しくは分枝鎖の炭素数２〜６個のアルキニル、又は例えば１〜１０個の脂肪族環式基によって置換された直鎖若しくは分枝鎖の炭素数２〜６個のアルキニルである。脂肪族環式基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、又はアダマンチルなどである。「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキニル」は、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニルなどであり、好ましくは、１−プロピニルなどである。
Ｒ３’’の「脂肪族環式基」は、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシルなどである。
Ｒ３’’の「複素環式基」は、環を構成する原子として炭素以外にＮ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される１〜３個の原子を含む例えば５〜７員環であって炭素を介して結合する基、又は２つ以上のそのような環が縮環したものであって炭素を介して結合する基、若しくはそのような環とベンゼン環が縮環したものであって炭素を介して結合する基である。「複素環式基」は、例えば、チオフェン−２−イル、２−フラニル、又は４−ピリジルなどである。本発明のいくつかの態様では、「複素環式基」は、硫黄を含む複素環式基であり、例えば、チオフェン−２−イルである。
本発明の好ましい態様によれば、Ｒ３’’は、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、フェニルエチル、フェニルビニル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロペニル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、又はチオフェン−２−イルである。本発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ３’’は、ベンジルである。
本発明の別の好ましい態様によれば、Ｒ３’’は、水素原子、臭素原子、及び下記式

で表わされる基から選択されるいずれかであり、Ｒ６’’、Ｒ７’’及びＲ８’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり、Ｒ６’’とＲ８’’が結合して、Ｒ６’’とＲ８’’がそれぞれ結合する炭素原子とともに置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のヘテロアリールを形成してもよい。）
ここで、Ｒ６’’、Ｒ７’’及びＲ８’’の「置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル」は、例えば、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有する炭素数１〜６のアルキル、又は無置換のアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。「置換若しくは無置換の炭素数１〜６のアルキル」は、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、フルオロメチル、又はパーフルオロアルキル（例、トリフルオロメチル、パーフルオロヘキシル）などである。
Ｒ６’’、Ｒ７’’及びＲ８’’の「置換若しくは無置換のアリール」、又はＲ６’’とＲ８’’が結合してＲ６’’とＲ８’’がそれぞれ結合する炭素原子とともに形成する「置換若しくは無置換のアリール」は、例えば、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有するアリール、又は無置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は、水酸基、ニトロ、又はジメチルアミノである。「置換若しくは無置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ナフチル（１−ナフチル、２−ナフチル）、ヒドロキシフェニル（２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル）、アミノフェニル（例、４−ジメチルアミノフェニル）、ニトロフェニル（例、４−ニトロフェニル）、フルオロフェニル（例、４−フルオロフェニル）、トリフルオロメチルフェニル（例、４−トリフルオロメチルフェニル）などである。
Ｒ６’’、Ｒ７’’及びＲ８’’の「置換若しくは無置換のヘテロアリール」、又はＲ６’’とＲ８’’が結合してＲ６’’とＲ８’’がそれぞれ結合する炭素原子とともに形成する「置換若しくは無置換のヘテロアリール」は、同一若しくは異なって１〜５個の置換基を有するヘテロアリール、又は無置換のヘテロアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、ニトロ、シアノ、アミノ、炭素数１〜６個のアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、t−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル）、炭素数１〜６個のアルコキシル（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、t−ペントキシ、ヘキシロキシ、イソヘキシロキシ）、炭素数１〜６個のジアルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、１−ピペリジニル、１−ピロリジニル、好ましくは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ジイソプロピルアミノ）、アリール（例、フェニル、ナフチル、アントラニル）、ヘテロアリール（例、チエニル（２−チエニル、３−チエニル）、フリル（２−フリル、３−フリル）、ピロリル（２−ピロリル、３−ピロリル）、ピリジル（２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、イミダゾイル、ピラゾイル、オキサゾイル、チアゾイル、イソキサゾイル、ピリミジル、ピラジル、ピリダゾイル）などからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。「置換若しくは無置換のヘテロアリール」は、具体的には、チエニル（２−チエニル、３−チエニル）、ベンゾチエニル（例、ベンゾ[b]チオフェン−2−イル、ベンゾ[b]チオフェン−3−イル）、チエノチエニル（例、チエノ［2，3−b］チエニル、チエノ［3，2−b］チエニル、チエノ［3，2−b:2,3−d］チエニル）、ビチオフェニル（例、２，２−ビチオフェン−５−イル）、ベンゾフラニル、インドイル、インダゾイル、ベンゾイミダゾイル、ベンゾオキサゾイル、ベンゾイソオキサゾイル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、又はアクリジニルなどである。
Ｃ−２位を改変した本発明の別のくつかのセレンテラミド類縁体は、次の化合物である。

(式中、Ｒ２’’’は、

から選択される基であり、Ｒ３’’’は、水素原子、臭素原子、置換若しくは無置換のアリール、置換若しくは無置換のアリールアルキル、置換若しくは無置換のアリールアルケニル、置換若しくは無置換のアリールアルキニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル、脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキニル、脂肪族環式基、又は複素環式基である。）
ここで、Ｒ３’’’の「置換若しくは無置換のアリール」、「置換若しくは無置換のアリールアルキル」、「置換若しくは無置換のアリールアルケニル」、「置換若しくは無置換のアリールアルキニル」、「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキル」、「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルケニル」、「脂肪族環式基によって置換されていてもよいアルキニル」、「脂肪族環式基」、及び「複素環式基」は、Ｒ３’’で説明したのと同様である。
本発明の好ましい態様のセレンテラミド類縁体は、次の化合物である。
本発明のいくつかの態様のセレンテラミド類縁体を含む蛍光蛋白質は、最大蛍光波長が485nm以上であり、例えば、485nm以上、486nm以上、487nm以上、488nm以上、489nm以上、490nm以上、491nm以上、492nm以上、493nm以上、494nm以上、495nm以上、496nm以上、497nm以上、498nm以上、499nm以上、500nm以上、510nm以上、515nm以上、520nm以上、525nm以上、530nm以上、535nm以上、540nm以上、545nm以上である。最大蛍光波長を485nm以上とすることができるセレンテラミド類縁体としては、より具体的には、上記セレンテラミド類縁体（4a〜4z）のうち、4a〜4l、4n〜4p、及び4u〜4zを挙げることができ、好ましくは、4a〜4d、4f〜4l、4p、4n、4v、及び4x〜4zを挙げることができ、より好ましくは、4a、4b、4d、4f〜4i、4k、4l、及び4pを挙げることができ、さらに好ましくは、4b、4f、4h、4ｋ及び4pを挙げることができ、特には、4b、4h、及び4pを挙げることができる。
本発明のいくつかの態様のセレンテラミド類縁体を含む蛍光蛋白質は、対応するセレンテラミド類縁体単体と比較して、より蛍光強度が強く、例えば、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、3.0倍以上、4.0倍以上、5.0倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、110倍以上、120倍以上、130倍以上強い。蛍光蛋白質のときに、対応するセレンテラミド類縁体単体のときと比較して蛍光強度を強くすることができるセレンテラミド類縁体としては、より具体的には、上記セレンテラミド類縁体（4a〜4z）のうち、4a〜4p、及び4r〜4zを挙げることができ、好ましくは、4a〜4g、4i〜4p、及び4r〜4zを挙げることができ、より好ましくは、4a、4f、4g、及び4wを挙げることができ、特には、4a、4f、及び4wを挙げることができる。
本発明のいつかの態様のセレンテラミド類縁体を含む蛍光蛋白質は、対応するセレンテラミド類縁体単体と蛍光スペクトルが異なり、例えば、両者の最大蛍光波長が、±5nm以上、±10nm以上、±15nm以上、±20nm以上、±25nm以上、±30nm以上、±35nm以上、±40nm以上、±45nm以上、±50nm以上、±55nm以上、±60nm以上、±65nm以上、±70nm以上、±75nm以上、±80nm以上、±85nm以上、±90nm以上、±95nm以上、又は±100nm以上異なる。蛍光蛋白質のときと、対応するセレンテラミド単体のときとで最大蛍光強度を異なるものとすることができるセレンテラミドル類縁体としては、より具体的には、上記セレンテラミド類縁体（4a〜4z）のうち、４a〜4n、4p、4r、4s、及び4u〜4zを挙げることができ、好ましくは、4a〜4e、4f、4h、4i、4k、4m、4n、4p、4u、及び4w〜4zを挙げることができる。
４．本発明のセレンテラミド類縁体の製造方法
４．１．Ｃ−３位を改変したセレンテラミド類縁体
本発明のセレンテラミド類縁体のうち、下記一般式(II)

（式中、Ｒ３’は前記の通りである。）で表わされるＣ−３位を改変したセレンテラミド類縁体は、次のようにして製造することができる。
すなわち、一般式（II）で表わされるセレンテラジン類縁体は、下記一般式（II−1）

(式中、Ｒ３’は前記の通りであり、Ｙ１’は水素原子又は保護基である。)で表わされる化合物を、
下記一般式（II−2）

（式中、Ｘは脱離基であり、Ｙ２’は水素原子又は保護基である）で表わされる化合物と反応させることで、
下記一般式（II−3）

(式中、Ｒ３’、Ｙ１’及びＹ２’は前記の通りである。)で表わされる化合物を得ることなどにより、製造することができる。
ここで、Ｙ１’及びＹ２’の「保護基」としては、それぞれ独立して、例えば、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、tert-ブチルジフェニルシリル（TBDPS）、トリメチルシリル（TMS）、トリエチルシリル（TES）、トリイソプロピルシリル（TIPS）、メトキシメチル（MOM）、2-メトキシエトキシメチル（MEM）、2-テトラヒドロピラニル（THP）、メチル（Me）、tert-ブチル（t-Bu）、ベンジル（Bn）、p-メトキシベンジル（PMB）、アセチル（Ac）又は、ベンゾイル（Bz）を挙げることができ、特に、TBDMS、Me、Bn又はAcが好ましい。
Ｘで示される脱離基としては、例えば、ハロゲン（例えば、塩素、フッ素、臭素、若しくはヨウ素）、スルホン酸の反応性残基（例えば、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、若しくはトルエンスルホニルオキシ）、又は酸無水物を形成せしめるアシルオキシ（例えば、（４−Y2’Ｏ）Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＯＯ−（式中、Y2’は前記の通りである。））が挙げられる。なかでもハロゲンが好ましく、特に塩素がより好ましい。
一般式（II-1）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができ、例えば、Kishi et al. (1972) Tetrahedron Lett. 13, 2747-2748、又はAdamczyk et al. (2001) Org. Prep. Proced. Int.33, 477-485、又はWael, F. D. et al. (2009) Bioorg. Med. Chem. 17, 4336−4344に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。
一般式(II-2）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。具体的には、いずれの化合物も、対応するカルボン酸に対して過剰の塩化チオニルを作用させて加熱還流した後、減圧濃縮するか、又は、ジクロロメタン溶媒中、触媒量のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）存在下、対応するカルボン酸に対して二塩化オキサリルを反応させた後、減圧濃縮するか、のいずれかの方法で製造することができる。あるいは、市販のものを入手してもよい。
一般式（II-3）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。具体的には、いずれの化合物も、一般式（II-１）で表わされる化合物と、一般式（II-2）で表わされる化合物とを、例えば、有機溶媒中、塩基の存在下、又は塩基性有機溶媒中で反応させることで製造することができる。
このように製造した一般式（II-3）の化合物のＹ１’及びＹ２’が保護基である場合、一般式（II）で表わされるセレンテラミド類縁体は、一般式（II-3）で表わされる化合物の保護基を脱保護することで製造することができる。より具体的には、一般式（II）で表わされるセレンテラミド類縁体は、後述の実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法を用いて製造することができる。
ここで、一般式(II)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される反応試薬は、例えば、保護基（Ｙ１’及びＹ２’）がTBDMSである場合、テトラブチルアンモニウムフルオリド（TBAF）、フッ化カリウム、フッ化水素酸等のフッ素試薬、或は酢酸、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、フッ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、硝酸、等の酸であり、これらは単独で又は混合して使用することができ、特にTBAFが好ましい。
一般式(II)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される溶媒は、例えば、保護基（Ｙ１’及びＹ２’）がTBDMSである場合、種々のものを使用でき、例えば、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、エーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、トルエン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ブタノール、又は水等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
また、一般式(II)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において、例えば、保護基（Ｙ１’及びＹ２’）がTBDMSである場合、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−２０℃〜２００℃で、１０分〜２４時間、好ましくは、０℃〜１００℃で、１０分〜６時間、より好ましくは、室温〜５０℃で、３０分〜２時間である。
また、一般式(II)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される反応試薬は、例えば、保護基（Ｙ１’及びＹ２’）がMeである場合、種々のものを使用でき、例えば、文献 Inouye & Hosoya (2009) Biochem. Biophys. Res. Commun. 386, 617−622に記載の方法又はそれに準ずるの方法で行うことができる。例えば、三臭化ホウ素又はピリジニウムクロリドを使用することができ、特に三臭化ホウ素が好ましい。
一般式(II)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において溶媒を用いることができ、例えば、保護基（Ｙ１’及びＹ２’）がMeである場合、種々のものを使用でき、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、エーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、又はトルエン等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
また、一般式(II)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において、例えば、保護基（Ｙ１’及びＹ２’）がMeである場合、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−７８℃〜２００℃で、１０分〜７２時間、好ましくは、０℃〜１５０℃で、３０分〜３６時間、より好ましくは、室温〜６０℃で、１時間〜１２時間である。
４．２．Ｃ−２位を改変したセレンテラミド類縁体
４．２．１．一般式（III）で表わされるセレンテラミド類縁体
本発明のセレンテラミド類縁体のうち、下記一般式（III）

（式中、Ｚ１及びＲ３’’は前記の通りである。）で表わされるＣ−２位を改変したセレンテラミド類縁体は、次のようにして製造することができる。
先ず、下記一般式(III-1)

（式中、Ｒ３’’は前記の通りであり、Ｙ１’’は、水素原子、又は保護基である。）で表わされる化合物を、
下記一般式（III-2）

（式中、Ｚ１は前記の通りであり、Ｙ２’’は、水素原子、又は保護基である。）で表わされる化合物と反応させることにより、下記一般式(III−3)

（式中、Ｒ３’’、Ｙ１’’、Ｙ２’’、Ｚ１は前記の通りである。）で表わされる化合物を得ることなどにより、製造することができる。
ここで、Ｙ１’’及びＹ２’’の「保護基」としては、Ｙ１’及びＹ２’ので説明したのと同様のものを挙げることができる。
一般式（III-1）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができ、例えば、Y. Kishi et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747-2748 (1972)、又はM. Adamczyk et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001)、又はF. D. Wael et al., Bioorg. Med. Chem., 17, 4336−4344 (2009)に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。
一般式(III-2)で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができ、例えば、文献S. Knaggs et al., Org. Biomol. Chem., 3, 4002−4010 (2005)に記載の方法に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。あるいは、市販のものを入手してもよい。
一般式（III-3）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。具体的には、いずれの化合物も、一般式（III-１）で表わされる化合物と、一般式（III-2）で表わされる化合物とを、例えば、有機溶媒中、塩基の存在下、又は塩基性有機溶媒中で反応させることで製造することができる。
このように製造した一般式（III-3）の化合物のＹ１’’及びＹ２’’が保護基である場合、一般式（III）で表わされるセレンテラミド類縁体は、一般式（III-3）で表わされる化合物の保護基を脱保護することで製造することができる。より具体的には、一般式（III）で表わされるセレンテラミド類縁体は、後述の実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法を用いて製造することができる。
ここで、一般式(III)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される反応試薬は、例えば、保護基（Ｙ１’’及びＹ２’’）がTBDMSである場合、テトラブチルアンモニウムフルオリド（TBAF）、フッ化カリウム、フッ化水素酸等のフッ素試薬、或は酢酸、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、フッ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、硝酸、等の酸であり、これらは単独で又は混合して使用することができ、特にTBAFが好ましい。
一般式(III)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される溶媒は、例えば、保護基（Ｙ１’’及びＹ２’’）がTBDMSである場合、種々のものを使用でき、例えば、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、エーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、トルエン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ブタノール、又は水等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
また、一般式(III)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において、例えば、保護基（Ｙ１’’及びＹ２’’）がTBDMSである場合、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−２０℃〜２００℃で、１０分〜２４時間、好ましくは、０℃〜１００℃で、１０分〜６時間、より好ましくは、室温〜５０℃で、３０分〜２時間である。
また、一般式(III)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される反応試薬は、例えば、保護基（Ｙ１’’及びＹ２’’）がMeである場合、種々のものを使用でき、例えば、文献 Inouye & Hosoya, Biochem. Biophys. Res. Commun., 386, 617−622 (2009) に記載の方法又はそれに準ずるの方法で行うことができる。例えば、三臭化ホウ素又はピリジニウムクロリドを使用することができ、特に三臭化ホウ素が好ましい。
一般式(III)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において溶媒を用いることができ、例えば、保護基（Ｙ１’’及びＹ２’’）がMeである場合、種々のものを使用でき、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、エーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、又はトルエン等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
また、一般式(III)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において、例えば、保護基（Ｙ１’’及びＹ２’’）がMeである場合、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−７８℃〜２００℃で、１０分〜７２時間、好ましくは、０℃〜１５０℃で、３０分〜３６時間、より好ましくは、室温〜６０℃で、１時間〜１２時間である。
４．２．２．一般式（IV）で表わされるセレンテラミド類縁体
本発明のセレンテラミド類縁体のうち、下記一般式(IV)

(式中、Ｒ２’’’、及びＲ３’’’は前記の通りである。）で表わされるＣ−２位を改変したセレンテラミド類縁体は、次のようにして製造することができる。
すなわち、下記一般式（IV-1）

（式中、Ｒ３’’’は前記の通りであり、Y１’’’は水素原子又は保護基である。）
で表わされる化合物を、
下記一般式（IV-2）

（式中、Ｘは脱離基であり、Ｒ２’’’は、

から選択される基（Y１’’’は、水素原子又は保護基である。）である。）で表わされる化合物と反応させることにより下記一般式(IV-3-1)又は(IV-3-2)

（式中、Ｒ２’’’、Ｒ３’’’、及びY１’’’は前記の通りである。）で表わされる化合物を得ることなどにより、製造することができる。
ここで、Ｘで示される脱離基としては、例えば、ハロゲン（例えば、塩素、フッ素、臭素、若しくはヨウ素）、スルホン酸の反応性残基（例えば、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、若しくはトルエンスルホニルオキシ）、又は酸無水物を形成せしめるアシルオキシ（例えば、（４−Y１’’’Ｏ）Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＯＯ−（式中、Y１’’’は前記の通りである。））が挙げられる。なかでもハロゲンが好ましく、特に塩素がより好ましい。
一般式（IV-1）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができ、例えば、Kishi et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747-2748 (1972)、又はAdamczyk et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001)に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。
一般式(IV-2)で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。具体的には、いずれの化合物も、対応するカルボン酸に対して過剰の塩化チオニルを作用させて加熱還流した後、減圧濃縮するか、又は、ジクロロメタン溶媒中、触媒量のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）存在下、対応するカルボン酸に対して二塩化オキサリルを反応させた後、減圧濃縮するか、のいずれかの方法で製造することができる。あるいは、市販のものを入手してもよい。
一般式（IV−3−１）又は一般式（IV−３−２）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。具体的には、いずれの化合物も、一般式（IV-１）で表わされる化合物と、一般式（IV-2）で表わされる化合物とを、例えば、有機溶媒中、塩基の存在下、又は塩基性有機溶媒中で反応させることで製造することができる。
このように製造した一般式（IV−3−１）又は一般式（IV−３−２）で表わされる化合物のＹ１’’’及びＹ２’’’が保護基である場合、一般式（IV）で表わされるセレンテラミド類縁体は、一般式（IV-3−１）又は一般式（IV-3−２）で表わされる化合物の保護基を脱保護することで製造することができる。より具体的には、一般式（IV）で表わされるセレンテラミド類縁体は、後述の実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法を用いて製造することができる。
ここで、一般式(IV)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される反応試薬は、例えば、保護基（Ｙ１’’’及びＹ２’’’）がTBDMSである場合、テトラブチルアンモニウムフルオリド（TBAF）、フッ化カリウム、フッ化水素酸等のフッ素試薬、或は酢酸、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、フッ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、硝酸、等の酸であり、これらは単独で又は混合して使用することができ、特にTBAFが好ましい。
一般式(IV)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される溶媒は、例えば、保護基（Ｙ１’’’及びＹ２’’’）がTBDMSである場合、種々のものを使用でき、例えば、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、エーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、トルエン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ブタノール、又は水等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
また、一般式(IV)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において、例えば、保護基（Ｙ１’’’及びＹ２’’’）がTBDMSである場合、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−２０℃〜２００℃で、１０分〜２４時間、好ましくは、０℃〜１００℃で、１０分〜６時間、より好ましくは、室温〜５０℃で、３０分〜２時間である。
また、一般式(IV)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において使用される反応試薬は、例えば、保護基（Ｙ１’’’及びＹ２’’’）がMeである場合、種々のものを使用でき、例えば、文献 Inouye & Hosoya, Biochem. Biophys. Res. Commun., 386, 617−622 (2009) に記載の方法又はそれに準ずるの方法で行うことができる。例えば、三臭化ホウ素又はピリジニウムクロリドを使用することができ、特に三臭化ホウ素が好ましい。
一般式(IV)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において溶媒を用いることができ、例えば、保護基（Ｙ１’’’及びＹ２’’’）がMeである場合、種々のものを使用でき、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、エーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、又はトルエン等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。
また、一般式(IV)で表わされるセレンテラミド類縁体の製造方法において、例えば、保護基（Ｙ１’’’及びＹ２’’’）がMeである場合、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−７８℃〜２００℃で、１０分〜７２時間、好ましくは、０℃〜１５０℃で、３０分〜３６時間、より好ましくは、室温〜６０℃で、１時間〜１２時間である。
５．カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法
５．１．セレンテラジン類縁体からの製造
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、上記本発明のセレンテラジン類縁体と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることにより、製造又は再生することができる。
ここで、「接触」とは、本発明のセレンテラジン類縁体とカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、本発明のセレンテラジン類縁体を収容した容器にカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を添加すること、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を収容した容器に本発明のセレンテラジン類縁体を添加すること、又は本発明のセレンテラジン類縁体とカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを混合すること、などが含まれる。
本発明のいくつかの態様によれば、接触は、還元剤（例えば、メルカプトエタノール、又はジチオスレイトールなど）及び酸素の存在下、低温で行う。より具体的には、本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、例えば、Shimomura, O. et al. Biochem. J. 251, 405−410 (1988)、及び Shimomura, O. et al. Biochem. J. 261, 913−920 (1989) などに記載の方法によって製造又は再生することができる。本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、酸素存在下において、本発明のセレンテラジン類縁体と分子状酸素から生成するセレンテラジン類縁体のペルオキシドと、アポ蛋白質とが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジン類縁体の酸化物であるセレンテラミド類縁体と二酸化炭素を生成する。前記複合体を「本発明の発光蛋白質」と称することがある。
本発明の発光蛋白質を製造するのに用いるアポ蛋白質は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポベルボイン等である。本発明のいくつかの態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポオベリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、又はマイトロコミン等であり、例えば、アポイクオリンである。アポ蛋白質は、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであってよい。さらに、アポ蛋白質は、カルシウム結合型発光蛋白質を製造できるものであれば、そのアミノ酸配列を天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。
天然から採取した発光蛋白質のアポ蛋白質（天然型アポ蛋白質）の塩基配列及びアミノ酸配列は、次の通りである。すなわち、天然型アポイクオリンの塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。天然型アポクライティン−Ｉの塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。天然型アポクライティン−ＩＩの塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。天然型アポマイトロコミンの塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す。天然型アポオベリンの塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。天然型アポベルボインの塩基配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。
組換え技術によって変異させたアポ蛋白質は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される蛋白質である。
（ａ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、
（ｂ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、及び
（ｃ）天然型アポ蛋白質の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質。
上記「天然型アポ蛋白質」は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポベルボイン等である。本発明のある態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、アポオベリン、又はアポマイトロコミン等であり、好ましくは、アポイクオリンである。これらの天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列又は塩基配列は、前記の通りである。
上記「カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性又は機能」とは、例えば、アポ蛋白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する活性又は機能を意味する。「蛋白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する」とは、具体的には、（１）アポ蛋白質が、セレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を形成すること、だけではなく（２）アポ蛋白質が、酸素存在下に、セレンテラジン若しくはその誘導体と接触することにより、アポ蛋白質とセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとを含有する発光蛋白質（複合体）を形成すること、をも意味する。ここで、「接触」とは、アポ蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器にアポ蛋白質を添加すること、アポ蛋白質を収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又はアポ蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。また、「セレンテラジン類縁体」は、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。セレンテラジン又はその類縁体は、例えば、本発明のセレンテラジン類縁体の他、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｌ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｈ−セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、ｅｆ−セレンテラジン、ｅｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｐ−セレンテラジン等である。本発明のセレンテラジン類縁体は、例えば、実施例に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。その他のセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、Shimomura et al. (1988) Biochem.J. 251, 405−410、Shimomura et al. (1989) Biochem.J. 261, 913−920、Shimomura et al. (1990) Biochem.J. 270,309−312に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。或いは、チッソ株式会社、和光純薬社、プロメガ社等から各種市販されているので、これらの市販のものを用いてもよい。
上記「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入若しくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、“Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”、“Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)”、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、又は“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
また、上記「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、天然型アポ蛋白質の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニー或いはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline−sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)、又はGlover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
ここで言う「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。
本発明で使用することができる組換えアポ蛋白質として、例えば、Shimomura, O. and Inouye, S. Protein Express. Purif. (1999) 16: 91−95に記載の組換えイクオリン、Inouye, S. and Sahara, Y. Protein Express. Purif. (2007) 53: 384−389に記載の組換えクライティン−I、又はInouye, S.J.Biochem. (2008) 143: 711−717に記載の組換えクライティン−IIなどを挙げることができる。
このようにして得たカルシウム結合型発光蛋白質は、さらに精製に供してもよい。カルシウム結合型発光蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
本発明のいくつかの態様の発光蛋白質は、公知の発光蛋白質とは異なる発光特性を示す。本発明の好ましい態様の発光蛋白質は、セレンテラジンを発光基質として含むものと比較して、発光強度値が最大発光強度値の半分になるまでの時間である発光の半減時間が長い。また、本発明のさらに好ましい態様の発光蛋白質は、発光スペクトルが、当該発光蛋白質をカルシウムにより発光させることにより調製した対応する蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと異なるものである。
５．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）様蛋白質からの製造
図８に示すように、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質は、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下、本発明のgFP様蛋白質に、セレンテラジン又はその類縁体を接触させて、カルシウム結合型発光蛋白質を得ることにより製造することが出来る。「接触」とは、本発明のgFP様蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器に本発明のgFP様蛋白質を添加すること、本発明のgFP様蛋白質を収容した容器に本発明のセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又は本発明のgFP様蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質の製造に用いる本発明のgFP様蛋白質は、後述の通りである。
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質の製造に用いるセレンテラジン又はその類縁体は、本発明のセレンテラジン類縁体の他、例えば、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｌ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｈ−セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、ｅｆ−セレンテラジン、ｅｃｈ−セレンテラジン、又はｈｃｐ−セレンテラジン等であり、好ましくは、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、又はｅ−セレンテラジンである。これらのセレンテラジン又はその類縁体の入手方法は、前記の通りである。
カルシウム結合型発光蛋白質の製造のために用いるセレンテラジン又はその類縁体の量は、特に制限されないが、gFP様蛋白質1molに対して、例えば、1.2mol以上であれば良い。
カルシウム結合型発光蛋白質の製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜42℃で0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で0.1時間〜2時間、又は4℃〜15℃で0.1時間〜24時間である。
本発明のgFP様蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において行うのが好ましい。本発明においてgFP様蛋白質を製造するのに用いるキレート剤は、前記と同様である。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２若しくは３価のイオンと強く結合するものであれば良く、特に制限されない。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）等を挙げることができる。ここで、カルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンは、後述の通りである。
gFP様蛋白質の製造のために用いるキレート剤の量は、gFP様蛋白質の再生に影響しなければ、その濃度は特に制限されない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合することが示されていることより、例えば、3mol 以上が好ましい。
本発明のさらに好ましい態様では、蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、還元剤の存在下において行う。このとき用いる還元剤は、例えば、ジチオトレイトール（DTT）、又はメルカプトエタノール等である。カルシウム結合型発光蛋白質の製造のために用いる還元剤の量は、再生に影響しなければ、特に制限されないが、アポイクオリンには、３カ所のシステイン残基が存在することより、S−S 結合形成を防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトールや0.1％（v/v）メルカプトエタノールである。
６．本発明の発光蛋白質の利用
（１）カルシウムイオンの検出又は定量
上記のようにして得た本発明の発光蛋白質は、アポ蛋白質と、セレンテラジン類縁体及び分子状酸素より生成するセレンテラジン類縁体のペルオキシドとが非共有的な結合を形成したものであり、且つカルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質（ホロ蛋白質）である。よって、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出又は定量に使用することができる。
カルシウムイオンの検出又は定量は、検体溶液を直接発光蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することにより、カルシウムイオンを検出又は定量することもできる。また、前記発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出又は定量を行う測定系に添加する前に、予めアポ蛋白質の水溶液と本発明のセレンテラジン類縁体とを接触させて生成させたものを用いてもよい。また、測定系中で、アポ蛋白質とセレンテラジン類縁体とを接触させることにより、アポ蛋白質とセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる発光蛋白質を生成させてもよい。生成した発光蛋白質は、アポ蛋白質と本発明のセレンテラジン類縁体のペルオキシドとの複合体（発光蛋白質）であり、前記複合体（すなわち本発明の発光蛋白質）はカルシウムイオン濃度依存的に発光する。
カルシウムイオンの検出又は定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、発光蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
本発明のセレンテラジン類縁体は、アポ蛋白質とセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる発光蛋白質を作製し、前記発光蛋白質をマイクロインジェクション法などの手法により細胞内に直接導入することによって、生理的条件下の細胞内カルシウムイオン濃度変化の検出に利用することもできる。
本発明のセレンテラジン類縁体は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、アポ蛋白質遺伝子（アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を細胞内で発現させることによって、細胞内で生成させ、さらに、生成したアポ蛋白質に細胞外より本発明のセレンテラジン類縁体を付与することにより、発光蛋白質を生成させるのに用いてもよい。
このようにして細胞内に導入した、又は細胞内で生成した本発明の発光蛋白質を用いて、外部刺激（たとえば、レセプターに関与する薬剤による刺激等）に対する細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を測定することもできる。
（２）発光によるレポーター蛋白質等としての利用
本発明の発光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラジン類縁体を接触させ、本発明の発光蛋白質に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主細胞と本発明のセレンテラジン類縁体とを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器に本発明のセレンテラジン類縁体を添加すること、宿主細胞と本発明のセレンテラジン類縁体とを混合すること、宿主細胞を本発明のセレンテラジン類縁体の存在下で培養することなどが含まれる。
さらに、本発明は、プロモーターなどの転写活性の測定に使用するためのキットを提供する。本発明のいくつかの態様のキットは、本発明のセレンテラジン類縁体と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質をコードするポリヌクレオチド(例えば、DNA)を含む細胞などを含む。本発明のセレンテラジン類縁体などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、及び説明書などからなる群から選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。
（３）発光による検出マーカ等としての利用
本発明の発光蛋白質は、発光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明の発光蛋白質を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラジン類縁体を接触させることによって、本発明の発光蛋白質を生成させて、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、「接触」とは、細胞と本発明のセレンテラジン類縁体とを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、細胞の培養容器に本発明のセレンテラジン類縁体を添加すること、細胞と本発明のセレンテラジン類縁体とを混合すること、宿主細胞を本発明のセレンテラジン類縁体の存在下で培養することなどが含まれる。
このような目的物質などの分布の測定は、発光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
さらに、本発明は、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に使用するためのキットを提供する。本発明のいくつかの態様のキットは、本発明の発光蛋白質を含む。本発明の別の態様のキットは、本発明のセレンテラジン類縁体と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質をコードするポリヌクレオチド(例えば、DNA)を含む細胞などを含む。セレンテラジン類縁体などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、及び説明書などからなる群から選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。
（４）アミューズメント用品の材料
アポ蛋白質と本発明のセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる複合体（本発明の発光蛋白質）は、微量のカルシウムイオンと結合するだけで発光する。よって、本発明の発光蛋白質は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
（５）生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）法
本発明の発光蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
例えば、本発明の発光蛋白質をドナー蛋白質として使用し、有機化合物又は蛍光蛋白質をアクセプターとして使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。本発明のいくつかの態様では、アクセプターとして使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo−1又はDAP1などである。本発明の別のいくつかの態様では、アクセプターとして使用する蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質（GFP）、青色蛍光蛋白質（BFP）、変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリンなどである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体（特にG蛋白質共役受容体）、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の別の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又はリン酸化酵素などである。
BRET法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem. J. 2005, 385, 625−637、又はExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541−556などに記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、Nat Methods 2006, 3:165−174、又はBiotechnol J. 2008, 3:311−324などに記載の方法に準じて行うことができる。
さらに、本発明は、上記分析方法に使用するためのキットを提供する。キットは、本発明の発光蛋白質と、有機化合物及び／又は蛍光蛋白質とを含む。本発明の発光蛋白質、有機化合物、蛍光蛋白質などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、及び説明書などからなる群から選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。
７．蛍光蛋白質
図８に示すように、青色蛍光蛋白質（BFP）様蛍光蛋白質は、セレンテラミド又はその類縁体に、アポイクオリン等のアポ蛋白質を接触させて、BFP様蛋白質を得ることにより製造することができる。或いは、BFP様蛍光蛋白質は、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質にカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させて発光させ、BFP様蛋白質を得ることにより調製することもできる。
一方、緑色蛍光蛋白質(gFP)様蛍光蛋白質は、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下、セレンテラミド又はその類縁体に、アポイクオリン等のアポ蛋白質を接触させて、gFP様蛋白質を得ることにより製造することができる。或いは、gFP様蛍光蛋白質は、BFP様蛍光蛋白質を、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することにより製造することができる。
７．１．青色蛍光蛋白質（BFP）様蛍光蛋白質
７．１．１．青色蛍光蛋白質（BFP）様蛍光蛋白質の製造方法
本発明の青色蛍光蛋白質（BFP）様蛍光蛋白質は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、本発明のセレンテラミド類縁体が配位した複合体である。すなわち、本発明のBFP様蛍光蛋白質は、本発明のセレンテラミド類縁体、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む。BFP様蛍光蛋白質は、光の励起を受けて蛍光を発生することができるとともに、BFP様蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体と接触させることで、発光を生じさせることもできる。
本発明では、BFP様蛍光蛋白質を、本発明のセレンテラミド類縁体から次のように製造する。すなわち、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、本発明のセレンテラミド類縁体を、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に接触させて、BFP様蛍光蛋白質を得ることで、BFP様蛍光蛋白質を製造する。ここで、「接触」とは、アポ蛋白質とセレンテラミド類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラミド類縁体を収容した容器にアポ蛋白質を添加すること、アポ蛋白質を収容した容器にセレンテラミド類縁体を添加すること、又はアポ蛋白質とセレンテラミド類縁体とを混合すること、などが含まれる。
本発明においてBFP様蛍光蛋白質を製造するのに用いる本発明のセレンテラミド類縁体は、前記で説明した通りである。本発明のセレンテラミド類縁体として、例えば、後記の実施例又はそれに準ずる方法により製造した化合物を挙げることができる。
本発明においてBFP様蛍光蛋白質を製造するのに用いるカルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンとは、カルシウムイオンに代えてカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こす２価又は３価のイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウムイオンと同等の作用をするものである。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンは、例えば、カルシウムイオン（Ｃａ２+）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ２＋）、バリウムイオン（Ｂａ２＋）、鉛イオン（Ｐｂ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、カドミウムイオン（Ｃｄ２＋）、イットリウムイオン（Ｙ３＋）、ランタンイオン（Ｌａ３＋）、サマリウムイオン（Ｓｍ３＋）、ユウロピウムイオン（Ｅｕ３＋）、ジスプロシウムイオン（Ｄｙ３＋）、ツリウムイオン（Ｔｍ３＋）、又はイットリビウムイオン（Ｙｂ３＋）等を挙げることができる。これらのうち、２価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の２価の金属イオン、例えばＣａ２＋、Ｓｒ２＋、又はＰｂ２＋等である。
本発明においてBFP様蛍光蛋白質を製造するのに用いるカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質は、前記と同様である。
BFP様蛍光蛋白質の製造のために用いる本発明のセレンテラミド類縁体の量は、特に制限されないが、アポ蛋白質1molに対して、例えば、1mol〜5mol、好ましくは、1mol〜2mol、さらに好ましくは、1mol〜1.2molである。
BFP様蛍光蛋白質の製造において、本発明のセレンテラミド類縁体とアポ蛋白質とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとの反応は、還元剤の存在下で行うのが好ましい。ここで用いる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール(DTT)、又はメルカプトエタノール等を挙げることができる。BFP様蛍光蛋白質の再生に影響しなければ、BFP様蛍光蛋白質の製造のために用いる還元剤の量は、特に制限されないが、アポイクオリンには、３ヵ所のシステイン残基が存在することにより、S−S結合形成を防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1mMジチオトレイトールや0.1%（v/v）メルカプトエタノールである。
BFP様蛍光蛋白質の製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜42℃で0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で0.1時間〜2時間、又は、4℃〜15℃で0.1時間〜24時間である。
このようにして得たBFP様蛍光蛋白質は、さらに精製に供してもよい。BFP様蛍光蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
７．１．２．青色蛍光蛋白質(BFP)様蛍光蛋白質の利用
（１）発光触媒としての利用
本発明のBFP様蛍光蛋白質は、発光基質に作用しそれを発光させるので、発光触媒として利用できる。そこで、本発明は、本発明のBFP様蛍光蛋白質に、セレンテラジン又はその類縁体を接触させることを含む、発光方法を提供する。ここで、「接触」とは、BFP様蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器にBFP様蛍光蛋白質を添加すること、BFP様蛍光蛋白質を収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又はBFP様蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。
本発明の発光方法に用いる発光基質は、例えばセレンテラジン又はその類縁体である。セレンテラジンの類縁体としては、前記したものと同様のものを挙げることができる。
これらのセレンテラジン及びその類縁体をBFP様蛍光蛋白質に接触させ、接触させたBFP様蛍光蛋白質の触媒作用によって、セレンテラジン又はその類縁体が対応するセレンテラミド又はその類縁体に酸化される際（この時、二酸化炭素が放出される）、発光が生じる。通常発光時間は、０．５〜３時間であるが、条件の選択により、発光時間を更に長時間とすることも、又は発光時間を更に短時間とすることも可能である。
（２）レポーター蛋白質としての利用
本発明のBFP様蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させ、本発明の蛍光蛋白質に由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器にセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、宿主細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で培養することなどが含まれる。
（３）検出マーカとしての利用
本発明のBFP様蛍光蛋白質は、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明のBFP様蛍光蛋白質を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。
また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに本発明のセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させること等によって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、「接触」とは、細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、細胞の培養容器にセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で培養することなどが含まれる。
このような目的物質などの分布の測定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
（４）アミューズメント用品の材料
本発明のBFP様蛍光蛋白質は、光の励起をうけて蛍光を生じる。よって、本発明のBFP様蛍光蛋白質は、アミューズメント用品の材料の蛍光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
（５）蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法
本発明のBFP様蛍光蛋白質は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の解析（又は測定）等の分析方法に利用することができる。
例えば、本発明のBFP様蛍光蛋白質をドナー又はアクセプターとして使用し、有機化合物又は他の蛍光蛋白質をアクセプター又はドナーとして使用して、両者の間で蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を起こすことにより蛋白質間の相互作用などを検出することができる。本発明のいくつかの態様では、アクセプター又はドナーとして使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo−1又はDAP1などである。本発明の別のいくつかの態様では、アクセプター又はドナーとして使用する他の蛍光蛋白質は、他の緑色蛍光蛋白質（GFP）、他の青色蛍光蛋白質（BFP）、他の変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリンなどである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体（特にG蛋白質共役受容体）、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又はリン酸化酵素などである。
FRET法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、文献Hoffmann, C et al Nat Methods (2005) 2: 171-176, Paulsson, J.F. et al. Exp. Diabetes Res. 2008:2008, 865850.などに記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、文献Ting, A.Y. et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 15003-15008, Evellin, S et al (2004) Methods. Mol. Biol. 284: 259-270, Palmer A.E & Tsien, R.Y. (2006) 1:1057-1065などに記載の方法に準じて行うことができる。
さらに、本発明は、上記分析方法に使用するためのキットを提供する。キットは、本発明のBFP様蛍光蛋白質と、有機化合物及び／又は他の蛍光蛋白質とを含む。本発明のBFP様蛍光蛋白質、有機化合物、他の蛍光蛋白質などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、及び説明書などからなる群から選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。
７．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）様蛋白質
７．２．１．緑色蛍光蛋白質（gFP）様蛋白質の製造
本発明の緑色蛍光蛋白質（gFP）様蛋白質は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、本発明のセレンテラミド類縁体が配位した複合体である。すなわち、本発明のgFP様蛋白質は、本発明のセレンテラミド類縁体、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む。一方、本発明のgFP様蛋白質は、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な2価若しくは3価のイオンを含まない。gFP様蛋白質は、光の励起を受けて蛍光を発生することができる。
本発明のgFP様蛋白質は、本発明のセレンテラミド類縁体を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に接触させて、gFP様蛋白質を得ることにより製造することができる。
或いは、前述のBFP様蛍光蛋白質からカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを取り除くことによって、gFP様蛋白質を得ることにより製造することもできる。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンは、BFP様蛍光蛋白質を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することによって、BFP様蛋白質から取り除くことができる。
本発明においてgFP様蛋白質を製造するのに用いるキレート剤は、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２若しくは３価のイオンと強く結合するものであれば良く、特に制限されない。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）等を挙げることができる。ここで、カルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンは、前記の通りである。
gFP様蛍光蛋白質の製造のために用いるキレート剤の量は、gFP様蛍光蛋白質の再生に影響しなければ、その濃度は特に制限されない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合することが示されていることより、例えば、3mol 以上が好ましい。
gFP様蛋白質の製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜42℃で0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で0.1時間〜2時間、又は、4℃〜15℃で0.1時間〜24時間である。
このようにして得たgFP様蛋白質は、さらに精製に供してもよい。gFP様蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
７．２．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）様蛋白質の利用
（１）レポーター蛋白質としての利用
本発明のgFP様蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体を接触させてBFP様蛋白質を生成させた後、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤を接触させることでgFP様蛋白質を生成させ、本発明のgFP様蛋白質に由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。
（２）検出マーカとしての利用
本発明のgFP様蛋白質は、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明のgFP様蛋白質を化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体を接触させてBFP様蛋白質を生成させた後、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤を接触させることでgFP様蛋白質を生成させること等によって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的物質などの分布の測定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
（３）アミューズメント用品の材料
本発明のgFP様蛋白質は、アミューズメント用品の材料の蛍光材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
（４）蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法
本発明のgFP様蛍光蛋白質は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の解析（又は測定）等の分析方法に利用することができる。
例えば、本発明のgFP様蛍光蛋白質をドナー又はアクセプターとして使用し、有機化合物又は他の蛍光蛋白質をアクセプター又はドナーとして使用して、両者の間で蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を起こすことにより蛋白質間の相互作用などを検出することができる。本発明のいくつかの態様では、アクセプター又はドナーとして使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo−1又はDAP1などである。本発明の別のいくつかの態様では、アクセプター又はドナーとして使用する他の蛍光蛋白質は、他の緑色蛍光蛋白質（GFP）、他の青色蛍光蛋白質（BFP）、他の変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリンなどである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体（特にG蛋白質共役受容体）、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又はリン酸化酵素などである。
FRET法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、文献Hoffmann, C et al Nat Methods (2005) 2: 171-176, Paulsson, J.F. et al. Exp. Diabetes Res. 2008:2008, 865850.などに記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、文献Ting, A.Y. et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 15003-15008, Evellin, S et al (2004) Methods. Mol. Biol. 284: 259-270, Palmer A.E & Tsien, R.Y. (2006) 1:1057-1065などに記載の方法に準じて行うことができる。
さらに、本発明は、上記分析方法に使用するためのキットを提供する。キットは、本発明のgFP様蛍光蛋白質と、有機化合物及び／又は他の蛍光蛋白質とを含む。本発明のgFP様蛍光蛋白質、有機化合物、他の蛍光蛋白質などの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。本キットは、さらに必要に応じて、専用容器、その他必要なアクセサリー、及び説明書などからなる群から選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
[合成例]
材料及び方法
（１）高速液体クロマトグラフィー (HPLC)
セレンテラジン類縁体およびセレンテラミド類縁体の純度は、Agilent社製、1100シリーズHPLCシステムを用いて検定した。カラムはMerck Chemicals社製Lichrosorb RP−18 (5μm, 4.0 mm i.d. × 125 mm) を使用した。移動相：gradient 60−100% methanol/0.1% aqueous TFA for 40 min；流速：0.45 mL/min；検出：UV 225 nm；インジェクトサンプル量：0.5 mg/5 mL in methanol/0.1% aqueous TFA = 6/4。
（２）クロマトグラフィー
分析用薄層クロマトグラフィー (TLC) は、あらかじめシリカゲルが塗布されたガラスプレート (MERCK 5715, silica gel 60 F254) を用いて行った。スポット検出は、紫外線ランプ (254 nmまたは365 nm)、ヨウ素吸着、アニスアルデヒド水溶液に浸した後、ホットプレートで焼くことで行った。また、C−C不飽和結合の検出には過マンガン酸カリウム水溶液に浸した後、ホットプレートで焼くことで行った。
分取用フラッシュカラムクロマトグラフィーには、シリカゲル (関東化学 37563−85, silica gel 60 N (spherical, neutral), 粒径 45−50 μm) と (関東化学 37565−85, silica gel 60 N (spherical, neutral), 粒径 63−210 μm) を用いた。ただし、CTZ類縁体の精製の際には、シリカゲル (関東化学 37562−79, silica gel 60 N (spherical), 粒径 40−50 μm) と (関東化学 37558−79, silica gel 60 N (spherical), 粒径 100−210 μm) を用いた。
（３）核磁気共鳴 (NMR) スペクトル
1H核磁気共鳴 (NMR) スペクトル (400 MHz) は、Varian社製、Unity Plus 400核磁気共鳴装置を用いて測定した。化学シフト (δ) は、tetramethylsilane ((CH3)4Si) (CDCl3中での測定 ; 0 ppm) または測定溶媒の非重水素化体由来のピーク (CD3ODでの測定；3.31 ppm、DMSO−d6での測定；2.49 ppm) を内部標準として相対的値として表した。シグナル分裂線様式の略語s、d、mはそれぞれ単重線、二重線、多重線を表す。
13C核磁気共鳴スペクトル(75.5および67.8 MHz) は、Varian社製、Mercury 300核磁気共鳴装置、又はJEOL社製、JNM−EX270を用いて測定した。化学シフト (δ) は、測定溶媒の炭素由来のピーク (acetone−d6での測定；29.8 ppm、DMSO−d6での測定；39.5 ppm) を内部標準として相対的値として表した。
（４）赤外線吸収 (IR) スペクトル
IRスペクトルは、DRS−8000を装着した島津製作所社製、SHIMAZU IRPrestige−21 spectrophotometerを用い、拡散反射法により測定した。
（５）質量分析
高分解能質量分析スペクトル(HRMS) は、Bruker社製 Bruker micrOTOFを用いたエレクトロスプレーイオン化法 (ESI+)、又はJEOL社製 JMS−700を用いた高速原子衝突法 (FAB+)により測定した。
（６）元素分析
元素分析（Anal.）は、YANACO CHN CORDER MT-5を用いて行った。
（７）化学薬品
すべての試薬は特に記さない限り、市販のものをそのまま使用した。反応、抽出、クロマトグラフィー用の溶媒には、DMF、酢酸エチル、n−ヘキサン、脱水THF、トルエン、エタノール、DMSO、ジエチルエーテル、メタノール、THF、ジクロロメタン、1,4−ジオキサン、脱水ピリジン、ジエチルアミン、脱水ジクロロメタン、脱水1,2−ジクロロエタン、脱水DMFの市販品をそのまま用いた。
混合溶媒の比率は、特に記さない限り、容量に基づくものである。
反応試薬は、以下に挙げる物を使用した。和光純薬工業株式会社からはimidazole (Cat. No. 095−0015)、triisopropyl borate (Cat. No. 324−41535)、Na2CO3 (Cat. No. 199−01585)、aminopyrazine (Cat. No. 013−12083)、N−bromosuccinimide (Cat.No. 025−07235)、p−hydroxybenzaldehyde (Cat. No. 081−05925)、triethylamine (Cat. No. 202−02646)、methanesulfonyl chloride (Cat. No. 131−01583)、1−naphthaleneboronic acid (Cat. No. 322−63393)、benzo[b]thiophene−2−boronic acid (Cat. No. 329−64121)、p−nitrophenylboronic acid (Cat. No. 327−59813)、hydrochloric acid (Cat. No. 080−01066)、p−hydroxyphenylacetic acid (Cat. No. 084−04185)、oxalyl dichloride (Cat. No. 155−01642)、4−(dimethylamino)pyridine (Cat. No. 042−19212)、thionyl chloride (Cat. No. 200−01106)、m−anisoyl chloride (Cat. No. 326−77701) を、Aldrich社からはdichlorobis(triphenylphosphine) palladium(II) (Cat. No. 412740)、2−naphthaleneboronic acid (Cat. No. 480134)、2−(tributylstannyl)thiophene (Cat. No. 414492)、thianaphthene−3−boronic acid (Cat. No. 512117)、trans−2−phenylvinylboronic acid (Cat. No. 473790)、3−thienylboronic acid (Cat. No. 436844)、1−phenylvinylboronic acid (Cat. No. 571350)、4−(dimethylamino)phenylboronic acid (Cat. No. 483532)、copper(I) iodide (Cat. No. 21554)、phenylacetylene (Cat. No. 117706)、 1 M tetrabutylammonium fluoride in THF (Cat. No. 216143) を、東京化成工業株式会社からは4−bromophenol (Cat. No. B0787)、tert−butyldimethylsilyl chloride (Cat. No. B0995)、5−bromopyrazin−2−amine (Cat. No. A1683)、ethyl diethoxyacetate (Cat. No. D1883)、phenylboronic acid (Cat. No. B0857)、thieno[3,2−b]thiophen−2−boronic acid (Cat. No. T2621)、dithieno[3,2−b:2’,3’−d]thiophen−2−boronic acid (Cat. No. D3823)、5−(4,4,5,5−tetramethyl−1,3,2−dioxaborolan−2−yl)−2,2'−bithiophene (Cat. No. T2518)、4-methoxyphenyl isocyanate (Cat. No. I0440)、4-methoxyphenyl isothiocyanate (Cat. No. I0513)、4-methoxybenzoyl chloride (Cat. No. M0721) を、関東化学株式会社からは2.64 M n−butyl lithium in n−hexane (Cat. No. 04937−25)、sodium borohydride (Cat. No. 37828−35)、magnesium, turning (Cat. No. 26000−25)、NH4Cl (Cat. No. 01287−01)、水素化ナトリウム (Cat. No. 37842−35) を、MERCK社からはpalladium/charcoal activated (10% Pd) (Cat. 8.07104.0010) を購入し、そのまま反応に用いた。
[参考合成例１]
(4−Bromophenoxy)(tert−butyl)dimethylsilane (36) (既知化合物、参考文献：P. Jeanjot, et al., Synthesis, 513−522 (2003))
4−Bromophenol (35) (20.0 g, 116 mmol) をDMF (200 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、imidazole (23.6 g, 347 mmol) およびtert−butyldimethylsilyl chloride (24.4 g, 162 mmol) を順次加え、室温に昇温しながら3時間攪拌した。これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 200 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 100/1) で精製し、化合物36 (32.3 g, crude) を無色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。Rf = 0.57 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 49/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.18 (s, 6H), 0.97 (s, 9H), 6.68−6.75 (AA’BB’, 2H), 7.30−7.35 (AA’BB’, 2H)。
[参考合成例２]
4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenylboronic acid (37) (既知化合物、参考文献：P. Jeanjot, et al., Synthesis, 513−522 (2003))
アルゴン雰囲気下、上記で調製した (4−bromophenoxy)(tert−butyl)dimethylsilane (36) (32.3 g, crude) を脱水THF (300 mL) に溶解した。これを−78 ℃に冷却後、n−butyl lithium (2.64 M n−ヘキサン溶液) (46.0 mL, 121 mmol) を加え、1時間攪拌した。これにtriisopropyl borate (134 mL, 579 mmol) を加え、室温に昇温しながら13時間攪拌した。これに1 M塩酸 (200 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル)することで、化合物37 (20.9 g, 82.9 mmol, 71.8% (2 steps)) を無色固体として得た。Rf = 0.62 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.25 (s, 6H), 1.01 (s, 9H), 6.93−6.98 (AA’BB’, 2H), 8.09−8.14 (AA’BB’, 2H)。
[参考合成例３]
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (39) (既知化合物)
アルゴン雰囲気下、 4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenylboronic acid (37) (7.97 g, 31.6 mmol)をトルエン (290 mL) およびエタノール (10 mL) に溶解した。これに5−bromopyrazin−2−amine (38) (5.00 g, 28.7 mmol) 、dichlorobis(triphenylphosphine) palladium(II) (1.21 g, 1.72 mmol) および1 M Na2CO3水溶液 (29.0 mL, 29.0 mmol) を順次加え、17時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 200g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1) で精製し、化合物39 (7.82 g, 25.9 mmol, 90.2%) を無色固体として得た。Rf = 0.39 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.22 (s, 6H), 1.00 (s, 9H), 4.53 (s, 2H), 6.88−6.95 (AA’BB’, 2H), 7.71−7.79 (AA’BB’, 2H), 8.04 (s, 1H), 8.84 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.0 (2C), 126.1 (2C), 130.7, 131.3, 138.1, 139.2, 154.5, 154.7；IR (KBr, cm−1) 417, 478, 513, 544, 567, 629, 644, 658, 683, 750, 781, 806, 841, 912, 1007, 1052, 1080, 1103, 1169, 1207, 1254, 1341, 1379, 1418, 1474, 1506, 1539, 1570, 1605, 1639, 2857, 2893, 2928, 2955, 3163, 3302, 3431。
[参考合成例４]
3−Bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (既知化合物、参考文献：F. D. Wael, et al., Bioorg. Med. Chem., 17, 4336−4344 (2009))
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (39) (12.7 g, 42.1 mol) をDMSO (790 mL) および水 (19.5 mL) に溶解した。これにN−bromosuccinimide (7.90 g, 44.4 mmol) を加え、室温にて17時間攪拌した。これに水を加え、生成物をジエチルエーテル (400 mL×8) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL×2) および飽和食塩水 (200 mL×2) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 200 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物5 (13.0 g, 34.2 mmol, 80.9%) を黄色固体として得た。Rf = 0.32 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.22 (s, 6H), 0.99 (s, 9H), 4.99 (s, 2H), 6.87−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.71−7.77 (AA’BB’, 2H), 8.34 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (2C), 17.9, 25.4 (3C), 120.1 (2C), 124.7, 126.4 (2C), 128.9, 137.4, 140.0, 152.0, 155.2；IR (KBr, cm−1) 554, 619, 646, 675, 704, 756, 779, 806, 849, 905, 1036, 1094, 1109, 1169, 1202, 1261, 1337, 1416, 1464, 1501, 1566, 1605, 1630, 2857, 2928, 2955, 3138, 3281, 3460。
[参考合成例５]
3,5−Dibromopyrazin−2−amine (42) (既知化合物、参考文献：P. Jeanjot, et al., Synthesis, 513−522 (2003))
Aminopyrazine (41) (10.0 g, 105 mmol) をDMSO (200 mL) および水 (5 mL) に溶解した。これにN−bromosuccinimide (39.3 g, 221 mmol) を加え、室温にて23時間攪拌した。これに水を加え、生成物をジエチルエーテル (300 mL×4) を用いて抽出した。有機層を水 (400 mL×2) および飽和食塩水 (500 mL×2) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 280 g, n−ヘキサン/ジクロロメタン/酢酸エチル = 5/4/1) で精製した。得られた固体を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) で再度精製し、化合物42 (17.3 g, 68.3 mmol, 64.9%) を無色固体として得た。Rf = 0.48 (n−ヘキサン/ジクロロメタン/酢酸エチル = 5/4/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ5.05 (s, 2H), 8.05 (s, 1H)。
[参考合成例６]
4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)benzaldehyde (44) (既知化合物、参考文献：M. Adamczyk, et al., Tetrahedron, 59, 8129−8142 (2003))
p−Hydroxybenzaldehyde (43) (12.0 g, 98.3 mmol) をDMF (25 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、imidazole (16.7 g, 245 mmol) およびtert−butyldimethylsilyl chloride (17.8 g, 118 mmol) を順次加え、室温に昇温しながら3時間攪拌した。これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を飽和K2CO3水溶液 (300 mL)、水 (300 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 200 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 19/1) で精製し、化合物44 (20.5 g, 86.7 mmol, 88.2%) を無色油状物質として得た。Rf = 0.32 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 19/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.25 (s, 6H), 1.00 (s, 9H), 6.92−6.98 (AA’BB’, 2H), 7.76−7.83 (AA’BB’, 2H), 9.89 (s, 1H)。
[参考合成例７]
4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)benzyl alcohol (45) (既知化合物、参考文献：M. Adamczyk, et al., Tetrahedron, 59, 8129−8142 (2003))
4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)benzaldehyde (44) (20.5g, 86.7 mmol) をメタノール (120 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、sodium borohydride (3.93 g, 104 mmol) を加え、室温に昇温しながら5時間攪拌した。これに水を加え、生成物をジエチルエーテル (300 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。これを濾過、減圧濃縮し、化合物45 (20.5 g, 104 mmol, 100%) を無色油状物質として得た。十分純度が高かったため、これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。Rf = 0.21 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 19/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.19 (s, 6H), 0.98 (s, 9H), 1.59 (br, 1H), 4.61 (s, 2H), 6.80−6.85 (AA’BB’, 2H), 7.20−7.26 (AA’BB’, 2H)。
[参考合成例８]
4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)benzyl chloride (46) (既知化合物、参考文献：M. Adamczyk, et al., Tetrahedron, 59, 8129−8142 (2003))
4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)benzyl alcohol (45) (10.0 g, 42.0 mmol) をDMF (100 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、triethylamine (12.0 mL, 86.1 mmol) およびmethanesulfonyl chloride (4.90 mL, 63.1 mmol) を順次加え、室温に昇温しながら20時間攪拌した。これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 200 g, n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 10/1) で精製し、化合物46 (8.07 g, 31.4 mmol, 74.9%) を無色油状物質として得た。Rf = 0.71 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 19/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.20 (s, 6H), 0.98 (s, 9H), 4.56 (s, 2H), 6.78−6.84 (AA’BB’, 2H), 7.22−7.27 (AA’BB’, 2H)。
[参考合成例９]
3−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (既知化合物、参考文献：M. Adamczyk, et al., Tetrahedron, 59, 8129−8142 (2003))
真空下で切削片状マグネシウム (640 mg, 26.3 mmol) をヒートガンを用いて加熱乾燥した。室温まで放冷し、アルゴン雰囲気下にした後、脱水THF (28 mL) を加え、これに4−(tert−butyldimethylsilyloxy)benzyl chloride (46) (6.15 g, 24.0 mmol) を室温にて滴下した。室温にて1時間攪拌し、大部分のマグネシウム片の消失を確認した後、4−(tert−butyldimethylsilyloxy)benzyl magnesium chlorideのTHF溶液として次の反応にそのまま用いた。
アルゴン雰囲気下、ethyl diethoxyacetate (4.30 mL, 24.0 mmol) を脱水THF (50 mL) に溶解した。これを−78 ℃に冷却後、上記で調製した4−(tert−butyldimethylsilyloxy)benzyl magnesium chlorideのTHF溶液を加え、−78 ℃にて2時間攪拌した。これに10% NH4Cl水溶液 (150 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を10% NH4Cl水溶液 (300 mL) 、水 (300 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 200 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 40/1) で精製し、化合物8 (6.19 g, 17.6 mmol, 72.9%) を無色油状物質として得た。Rf = 0.43 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 19/1)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.18 (s, 6H), 0.97 (s, 9H), 1.24 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 3.53 (dq, 2H, J= 2.3, 7.1 Hz), 3.68 (dq, 2H, J = 2.3, 7.1 Hz), 4.63 (s, 1H), 6.74−6.81 (AA’BB’, 2H), 7.03−7.10 (AA’BB’, 2H)。
[参考合成例１０]
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (既知化合物、参考文献：O. Brummer, et al., Tetrahedron Lett., 42, 2257−2259 (2001))
p−Hydroxyphenylacetic acid (48) (10.0 g, 65.7 mmol) をTHF (80 mL) に溶解し、0 ℃に冷却後、これにimidazole (22.4 g, 329 mmol) およびtert−butyldimethylsilyl chloride (27.7 g, 184 mmol) を順次加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和Na2CO3水溶液 (250 mL) を加え、室温で1時間攪拌した。これに2 M HCl水溶液 (650 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (300 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (400 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 200 g, n−ヘキサン → n−ヘキサン/酢酸エチル/酢酸 = 1/1/0.05) で精製し、化合物9 (10.6 g, 39.9 mmol, 60.7%) を無色固体として得た。Rf = 0.64 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.20 (s, 6H), 0.99 (s, 9H), 3.58 (s, 2H), 6.76−6.85 (AA’BB’, 2H), 7.10−7.17 (AA’BB’, 2H)。
[合成例１] C−8位を改変したセレンテラジン（CTZ）類縁体
１−１）TMD−296 (3a)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−phenylpyrazin−2−amine (7a)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.50 g, 3.94 mmol) をトルエン (45 mL) およびエタノール (1.7 mL) に溶解した。これにphenylboronic acid (6a) (577 mg, 4.73 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (165 mg, 235 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (4.00 mL, 4.00 mmol) を順次加え、17時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル= 3/1) で精製し、化合物7a (1.46 g, 3.87 mmol, 98.1%) を褐色固体として得た。Rf = 0.41 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.21 (s, 6H), 0.96 (s, 9H), 6.20 (s, 2H), 6.89−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.42−7.55 (m, 3H), 7.76−7.82 (m, 2H), 7.85−7.91 (AA’BB’, 2H), 8.48 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.0 (2C), 126.4 (2C), 128.2 (2C), 128.4, 128.6 (2C), 130.5, 137.2, 137.68, 137.72, 139.9, 151.6, 155.0；IR (KBr, cm−1) 523, 637, 677, 700, 720, 752, 779, 808, 841, 914, 1018, 1070, 1092, 1105, 1167, 1204, 1263, 1319, 1362, 1381, 1435, 1460, 1510, 1605, 2857, 2886, 2928, 2955, 3059, 3159, 3291, 3428；HRMS (ESI+) m/z378.1990 ([M+H]+, C22H28N3OSi+requires 378.1996)。
2−(4−Hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)−8−phenylimidazo[1,2−a]pyrazin−3(7H)−one (3a, TMD−296)
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−phenylpyrazin−2−amine (7a) (272 mg, 720 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (381 mg, 1.08 mmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (780 μL) を加え、17時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3a (TMD−296) (158 mg, 386 μmol, 53.6%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.59 (酢酸エチル)；HPLC retention time 8.0 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.16 (s, 2H), 6.69−6.76 (AA’BB’, 2H), 6.91−6.97 (AA’BB’, 2H), 7.09−7.16 (AA’BB’, 2H), 7.56−7.68 (m, 3H), 7.84−7.91 (AA’BB’, 2H), 7.98−8.03 (m, 2H), 8.39 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 523, 656, 696, 779, 843, 891, 1173, 1265, 1342, 1443, 1512, 1591, 1609, 1655, 2814, 3154；HRMS (ESI+) m/z410.1497 ([M+H]+, C25H20N3O3 +requires 410.1499)。
１−２）TMD−282 (3b)
(E)−5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−styrylpyrazin−2−amine (7b)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.00 g, 2.63 mmol) をトルエン (30 mL) およびエタノール (1.2 mL) に溶解した。これにtrans−2−phenylvinylboronic acid (6b) (543 mg, 3.16 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (111 mg, 158 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (2.70 mL, 2.70 mmol) を順次加え、18時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7b (997 mg, 2.47 mmol, 94.0%) を黄色固体として得た。Rf = 0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.19 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 6.60 (s, 2H), 6.84−6.91 (AA’BB’, 2H), 7.22−7.31 (m, 1H), 7.31−7.44 (m, 2H), 7.55 (d, 1H, J = 16 Hz), 7.65−7.77 (m, 3H), 7.87−7.93 (AA’BB’, 2H), 9.39 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.1 (2C), 122.1, 126.5 (2C), 127.3 (2C), 128.2, 128.7 (2C), 130.8, 132.8, 133.8, 136.9, 137.7, 139.4, 152.0, 155.0；IR (KBr, cm−1) 444, 463, 507, 534, 633, 691, 745, 781, 806, 841, 914, 964, 1011, 1072, 1088, 1103, 1153, 1213, 1263, 1379, 1420, 1454, 1512, 1566, 1605, 1634, 2856, 2886, 2930, 2955, 3057, 3196, 3329；HRMS (ESI+) m/z 404.2161 ([M+H]+, C24H30N3OSi+requires 404.2153)。
(E)−2−(4−Hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)−8−styrylimidazo[1,2−a]pyrazin−3(7H)−one (3b, TMD−282)
アルゴン雰囲気下、(E)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−styrylpyrazin−2−amine (7b) (290 mg, 719 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (380 mg, 1.08 mmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (600 μL) を加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3b (TMD−282) (74.0 mg, 170 μmol, 23.6%) を褐色固体として得た。Rf = 0.22 (酢酸エチル)；HPLC retention time 14.3 min。
１−３）TMD−276 (3d)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(naphthalen−1−yl)pyrazin−2−amine (7d)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.48 g, 3.90 mmol) をトルエン (45 mL) およびエタノール (2 mL) に溶解した。これに1−naphthaleneboronic acid (6d) (805 mg, 4.68 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (164 mg, 234 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (4.00 mL, 4.00 mmol) を順次加え、18時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1) で精製し、化合物7d (1.44 g, 3.37 mmol, 86.5%) を黄色泡状固体として得た。Rf = 0.25 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.14 (s, 6H), 0.90 (s, 9H), 5.89 (s, 2H), 6.80−6.87 (AA’BB’, 2H), 7.41−7.48 (m, 1H), 7.48−7.64 (m, 4H), 7.74−7.81 (AA’BB’, 2H), 7.96−8.04 (m, 2H), 8.55 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.1 (2C), 125.2, 125.8, 126.0, 126.37 (2C), 126.40, 127.2, 128.4, 128.8, 130.6, 130.9, 133.6, 134.7, 137.8, 138.1, 139.5, 152.5, 154.9；IR (KBr, cm−1) 517, 544, 579, 631, 675, 706, 739, 777, 806, 841, 910, 980, 1055, 1080, 1103, 1121, 1169, 1179, 1198, 1265, 1337, 1362, 1375, 1423, 1450, 1508, 1570, 1605, 2857, 2886, 2928, 2955, 3051, 3179, 3300, 3383, 3474；HRMS (ESI+) m/z428.2163 ([M+H]+, C26H30N3OSi+requires 428.2153)。
2−(4−Hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)−8−(naphthalen−1−yl)imidazo[1,2−a]pyrazin−3(7H)−one (3d, TMD−276)
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(naphthalen−1−yl)pyrazin−2−amine (7d) (255 mg, 596 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (315 mg, 894 μmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (780 μL) を加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3d (TMD−276) (74.3 mg, 162 μmol, 27.1%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.54 (酢酸エチル/メタノール = 20/1)；HPLC retention time 9.1 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.06 (s, 2H), 6.64−6.70 (AA’BB’, 2H), 6.88−6.95 (AA’BB’, 2H), 7.00−7.07 (AA’BB’, 2H), 7.47−7.55 (m, 1H), 7.55−7.63 (m, 1H), 7.68−7.73 (m, 1H), 7.80−7.92 (m, 4H, includes AA’BB’), 8.00−8.07 (m, 1H), 8.14−8.22 (m, 1H), 8.54 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 463, 492, 646, 779, 808, 968, 1015, 1045, 1082, 1109, 1173, 1240, 1325, 1346, 1443, 1508, 1591, 1609, 1653, 2814, 3169；HRMS (ESI+) m/z460.1656 ([M+H]+, C29H22N3O3 +requires 460.1656)。
１−４）TMD−277 (3e)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(naphthalen−2−yl)pyrazin−2−amine (7e)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.00 g, 2.63 mmol) をトルエン (30 mL) およびエタノール (1.2 mL) に溶解した。これに2−naphthaleneboronic acid (6e) (543 mg, 3.16 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (110 mg, 157 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (2.70 mL, 2.70 mmol) を順次加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル= 3/1) で精製し、化合物7e (1.04 g, 2.43 mmol, 92.2%) を黄色固体として得た。Rf = 0.33 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.17 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 6.32 (s, 2H), 6.85−6.92 (AA’BB’, 2H), 7.49−7.57 (m, 2H), 7.84−7.91 (m, 3H, includes AA’BB’), 7.91−7.96 (m, 1H), 7.97−8.03 (m, 2H), 8.31 (s, 1H), 8.47 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 419, 438, 530, 648, 669, 698, 743, 779, 814, 841, 918, 939, 1009, 1103, 1126, 1165, 1192, 1219, 1252, 1341, 1362, 1389, 1420, 1431, 1462, 1508, 1530, 1566, 1605, 1636, 2859, 2895, 2930, 2955, 3038, 3057, 3159, 3296, 3416；HRMS (ESI+) m/z428.2155 ([M+H]+, C26H30N3OSi+requires 428.2153)。
2−(4−Hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)−8−(naphthalen−2−yl)imidazo[1,2−a]pyrazin−3(7H)−one (3e, TMD−277)
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(naphthalen−2−yl)pyrazin−2−amine (7e) (308 mg, 720 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (381 mg, 1.08 mmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (600 μL) を加え、14時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3e (TMD−277) (89.9 mg, 196 μmol, 27.2%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.59 (酢酸エチル/メタノール = 20/1)；HPLC retention time 13.6 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.17 (s, 2H), 6.70−6.77 (AA’BB’, 2H), 6.91−6.98 (AA’BB’, 2H), 7.11−7.17 (AA’BB’, 2H), 7.56−7.68 (m, 2H), 7.88−7.94 (AA’BB’, 2H), 7.95−8.00 (m, 1H), 8.01−8.06 (m, 1H), 8.08−8.11 (m, 2H), 8.37 (s, 1H), 8.55 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 480, 552, 656, 752, 822, 903, 1111, 1173, 1242, 1269, 1356, 1447, 1513, 1558, 1611, 1653, 2814, 2897, 3165；HRMS (ESI+) m/z 460.1666 ([M+H]+, C29H22N3O3 +requires 460.1656)。
１−５）TMD−278 (3f)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thiophen−2−yl)pyrazin−2−amine (7f)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.20 g, 3.15 mmol) を1,4−ジオキサン (30 mL) に溶解した。これに2−(tributylstannyl)thiophene (6f) (1.10 mL, 3.46 mmol) およびdichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (111 mg, 158 μmol)を順次加え、14時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに飽和KF水溶液を加え、室温にて30分間攪拌した。濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を飽和KF水溶液 (300 mL)、水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7f (1.03 g, 2.68 mmol, 84.9%) を黄色固体として得た。Rf = 0.33 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.19 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 6.42 (s, 2H), 6.87−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.17 (dd, 1H, J = 3.8, 5.2 Hz), 7.65 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.74 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.83−7.91 (AA’BB’, 2H), 8.46 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.1 (2C), 125.6, 126.4 (2C), 128.2, 128.3, 129.9, 131.8, 136.9, 139.5, 142.6, 149.8, 155.2；IR (KBr, cm−1) 471, 509, 536, 581, 623, 646, 669, 716, 741, 779, 804, 822, 839, 912, 1011, 1057, 1082, 1111, 1172, 1202, 1263, 1279, 1360, 1379, 1435, 1454, 1477, 1512, 1564, 1607, 2857, 2895, 2930, 2953, 3335, 3439；HRMS (ESI+) m/z384.1551 ([M+H]+, C20H26N3OSSi+requires 384.1560)。
2−(4−Hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)−8−(thiophen−2−yl)imidazo[1,2−a]pyrazin−3(7H)−one (3f, TMD−278)
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thiophen−2−yl)pyrazin−2−amine (7f) (276 mg, 720 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (381 mg, 1.08 mmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (780 μL) を加え、16時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3f (TMD−278) (68.2 mg, 164 μmol, 22.8%) を褐色固体として得た。Rf = 0.67 (酢酸エチル/メタノール = 20/1)；HPLC retention time 9.5 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.22 (s, 2H), 6.72−6.78 (AA’BB’, 2H), 6.90−6.97 (AA’BB’, 2H), 7.11−7.18 (AA’BB’, 2H), 7.32 (dd, 1H, J= 3.8, 5.2 Hz), 7.87 (dd, 1H, J = 1.1, 5.2 Hz), 7.91−7.97 (AA’BB’, 2H), 8.12 (dd, 1H, J= 1.1, 3.8 Hz), 8.48 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 521, 581, 629, 721, 777, 841, 881, 966, 1109, 1172, 1261, 1341, 1429, 1508, 1533, 1609, 1653, 2822, 3107；HRMS (ESI+) m/z416.1075 ([M+H]+, C23H18N3O3S+requires 416.1063)。
１−６）TMD−336 (3g)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thiophen−3−yl)pyrazin−2−amine (7g)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.50 g, 3.94 mmol) をトルエン (45 mL) およびエタノール (1.8 mL) に溶解した。これに3−thienylboronic acid (6g) (605 mg, 4.73 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (165 mg, 235 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (4.00 mL, 4.00 mmol) を順次加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 150 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7g (1.19 g, 3.11 mmol, 78.9%) を赤色固体として得た。Rf = 0.50 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.21 (s, 6H), 0.96 (s, 9H), 6.29 (s, 2H), 6.88−6.96 (AA’BB’, 2H), 7.66−7.73 (m, 2H), 7.88−7.93 (AA’BB’, 2H), 8.06−8.09 (m, 1H), 8.47 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.5 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.1 (2C), 124.7, 126.1, 126.4 (2C), 128.2, 130.4, 133.5, 136.7, 138.7, 139.6, 151.2, 155.0；IR (KBr, cm−1) 511, 534, 551, 635, 662, 694, 719, 737, 754, 779, 808, 843, 916, 1009, 1034, 1086, 1103, 1167, 1182, 1196, 1215, 1260, 1331, 1366, 1389, 1408, 1454, 1510, 1566, 1605, 2857, 2886, 2928, 2953, 3038, 3115, 3175, 3289, 3412；HRMS (ESI+) m/z 384.1560 ([M+H]+, C20H26N3OSSi+requires 384.1560)。
2−(4−Hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)−8−(thiophen−3−yl)imidazo[1,2−a]pyrazin−3(7H)−one (3g, TMD−336)
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thiophen−3−yl)pyrazin−2−amine (7g) (311 mg, 811 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (396 mg, 1.22 mmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (780 μL) を加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3g (TMD−336) (179 mg, 431 μmol, 53.2%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.70 (酢酸エチル)；HPLC retention time 7.9 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.18 (s, 2H), 6.70−6.76 (AA’BB’, 2H), 6.91−6.99 (AA’BB’, 2H), 7.11−7.19 (AA’BB’, 2H), 7.70 (dd, 1H, J= 2.8, 5.2 Hz), 7.81−7.88 (AA’BB’, 2H), 7.95 (dd, 1H, J= 1.2, 5.2 Hz), 8.29 (s, 1H), 8.50 (dd, 1H, J= 1.2, 2.8 Hz)；IR (KBr, cm−1) 519, 652, 804, 841, 926, 1173, 1233, 1271, 1341, 1437, 1508, 1609, 1647, 3107；HRMS (ESI+) m/z 416.1065 ([M+H]+, C23H18N3O3S+requires 416.1063)。
１−７）TMD−281 (3h)
3−(Benzo[b]thiophen−2−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (7h)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (971 mg, 2.55 mmol) をトルエン (27 mL) およびエタノール (1.3 mL) に溶解した。これにbenzo[b] thiophene−2−boronic acid (6h) (500 mg, 2.81 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (108 mg, 153 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (2.60 mL, 2.60 mmol) を順次加え、17時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7h (746 mg, 1.72 mmol, 67.3%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.67 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.20 (s, 6H), 0.95 (s, 9H), 6.68 (s, 2H), 6.91−6.98 (AA’BB’, 2H), 7.33−7.41 (m, 2H), 7.81−7.88 (m, 1H), 7.91−7.99 (m, 3H, includes AA’BB’), 8.11 (s, 1H), 8.55 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ −4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.2 (2C), 122.0, 122.3, 124.37, 124.42, 125.1, 126.5 (2C), 129.8, 131.0, 137.8, 139.4, 139.6, 140.9, 143.1, 150.4, 155.3；IR (KBr, cm−1) 527, 552, 584, 642, 675, 708, 723, 741, 779, 808, 835, 918, 974, 1009, 1072, 1101, 1128, 1165, 1221, 1252, 1371, 1418, 1462, 1510, 1533, 1566, 1605, 1636, 1728, 2857, 2895, 2928, 2955, 3161, 3294, 3416；HRMS (ESI+) m/z 434.1713 ([M+H]+, C24H28N3OSSi+requires 434.1717)。
8−(Benzo[b]thiophen−2−yl)−2−(4−hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)imidazo[1,2−a] pyrazin−3(7H)−one (3h, TMD−281)
アルゴン雰囲気下、3−(benzo[b]thiophen−2−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl] pyrazin−2−amine (7h) (153 mg, 352 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (190 mg, 539 μmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (400 μL) を加え、14時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3h (TMD−281) (31.0 mg, 66.6 μmol, 18.9%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.67 (酢酸エチル/メタノール = 20/1)；HPLC retention time 19.9 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.12 (s, 2H), 6.75−6.84 (AA’BB’, 2H), 6.84−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.16−7.24 (AA’BB’, 2H), 7.32−7.45 (m, 2H), 7.77−7.84 (m, 2H), 7.85−7.92 (AA’BB’, 2H), 8.30 (s, 1H), 8.35 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 430, 523, 573, 621, 637, 658, 725, 746, 839, 885, 962, 1107, 1173, 1204, 1233, 1342, 1441, 1519, 1560, 1611, 1655, 3057。
１−８）TMD−337 (3i)
3−(Benzo[b]thiophen−3−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (7i)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.50 g, 3.94 mmol) をトルエン (45 mL) およびエタノール (1.8 mL) に溶解した。これにthianaphthene−3−boronic acid (6i) (842 mg, 4.73 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (165 mg, 235 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (4.00 mL, 4.00 mmol) を順次加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 150 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7i (1.19 g, 3.11 mmol, 78.9%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.30 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.21 (s, 6H), 0.96 (s, 9H), 6.29 (s, 2H), 6.89−6.95 (AA’BB’, 2H), 7.41−7.92 (m, 2H), 7.85−7.92 (AA’BB’, 2H), 7.95−8.02 (m, 1H), 8.07−8.13 (m, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.55 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 120.1 (2C), 122.8, 123.6, 124.4, 124.6, 126.3 (2C), 127.7, 130.4, 132.2, 133.7, 137.3, 138.0, 139.3, 139.7, 152.5, 155.0；IR (KBr, cm−1) 471, 631, 664, 683, 712, 733, 758, 781, 808, 839, 912, 968, 1011, 1059, 1080, 1103, 1128, 1169, 1188, 1263, 1346, 1362, 1389, 1447, 1508, 1605, 2857, 2886, 2928, 2953, 3065, 3177, 3298, 3368, 3472；HRMS (ESI+) m/z 434.1725 ([M+H]+, C24H28N3OSSi+requires 434.1769)。
8−(Benzo[b]thiophen−3−yl)−2−(4−hydroxybenzyl)−6−(4−hydroxyphenyl)imidazo[1,2−a] pyrazin−3(7H)−one (3i, TMD−337)
アルゴン雰囲気下、3−(benzo[b]thiophen−3−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl] pyrazin−2−amine (7i) (336 mg, 775 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (378 mg, 1.16 mmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (780 μL) を加え、18時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3i (TMD−337) (136 mg, 292 μmol, 37.6%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.37 (酢酸エチル)；HPLC retention time 11.5 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.16 (s, 2H), 6.68−6.77 (AA’BB’, 2H), 6.90−6.96 (AA’BB’, 2H), 7.07−7.15 (AA’BB’, 2H), 7.43−7.54 (m, 2H), 7.90−7.97 (AA’BB’, 2H), 8.00−8.07 (m, 1H), 8.22−8.30 (m, 1H), 8.36 (s, 1H), 8.52 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 517, 571, 637, 735, 764, 839, 959, 1049, 1107, 1171, 1231, 1354, 1362, 1437, 1508, 1608, 3101；HRMS (ESI+) m/z 466.1233 ([M+H]+, C27H20N3O3S+requires 466.1220)。
１−９）TMD−280 (3j)
3,5−Bis[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (7j) (既知化合物、参考文献：P. Jeanjot, et al., Synthesis, 513−522 (2003))
アルゴン雰囲気下、3,5−dibromopyrazin−2−amine (42) (1.00 g, 3.95 mmol) をトルエン (60 mL) およびエタノール (4.0 mL) に溶解した。これに(4−bromophenoxy)(tert−butyl)dimethylsilane (6j) (2.49 g, 9.89 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (167 mg, 237 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (8.00 mL, 8.00 mmol) を順次加え、17時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1) で精製し、化合物7j (1.75 g, 3.45 mmol, 87.4%) を黄色固体として得た。Rf = 0.26 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.18 (s, 6H), 0.22 (s, 6H), 0.93 (s, 9H), 0.96 (s, 9H), 6.11 (s, 2H), 6.85−6.91 (AA’BB’, 2H), 6.91−6.97 (AA’BB’, 2H), 7.65−7.71 (AA’BB’, 2H), 7.81−7.87 (AA’BB’, 2H), 8.40 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ −4.5 (4C), 18.0 (2C), 25.6 (6C), 119.9 (2C), 120.1 (2C), 126.4 (2C), 129.6 (2C), 130.6, 130.8, 136.6, 137.7, 139.8, 151.5, 154.9, 155.5；IR (KBr, cm−1) 438, 513, 573, 633, 665, 675, 696, 739, 781, 806, 824, 841, 912, 1009, 1086, 1103, 1167, 1202, 1263, 1362, 1379, 1408, 1422, 1452, 1512, 1566, 1605, 2857, 2885, 2928, 2955, 3061, 3183, 3304, 3377, 3478；HRMS (ESI+) m/z 508.2820 ([M+H]+, C28H42N3O2Si2 +requires 508.2810)。
2−(4−Hydroxybenzyl)−6,8−bis(4−hydroxyphenyl)imidazo[1,2−a]pyrazin−3(7H)−one (3j, TMD−280)
アルゴン雰囲気下、3,5−bis[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (7j) (366 mg, 721 μmol) および3−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−1,1−diethoxypropan−2−one (8) (380 mg, 1.08 mmol) を1,4−ジオキサン (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、4 M塩酸 (900 μL) を加え、16時間加熱還流した。室温まで放冷し、減圧濃縮後、アルゴン気流下でカラムクロマトグラフィー(酸性シリカゲル 20 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 → 酢酸エチル → 酢酸エチル/メタノール = 20/1) で精製した。減圧濃縮中に得られた懸濁液をn−ヘキサンに加え、沈殿物をろ過、乾燥することで化合物3j (TMD−280) (96.4 mg, 227 μmol, 31.4%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.22 (酢酸エチル)；HPLC retention time 5.2 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ4.12 (s, 2H), 6.65−6.71 (AA’BB’, 2H), 6.88−6.94 (AA’BB’, 2H), 6.94−7.02 (AA’BB’, 2H), 7.06−7.12 (AA’BB’, 2H), 7.74−7.84 (AA’BB’, 2H), 7.91−7.98 (AA’BB’, 2H), 8.24 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 554, 841, 891, 1132, 1242, 1273, 1341, 1437, 1458, 1508, 1543, 1558, 1609, 1653, 2812, 2895, 3096；HRMS (ESI+) m/z426.1458 ([M+H]+, C25H20N3O4 +requires 426.1448)。
[合成例２] C−3位を改変したセレンテラミド（CTMD）類縁体
２−１）TMD−344 (4a)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−{5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−phenylpyrazin−2−yl}acetamide (11a)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.07 g, 4.02 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops) を加えた。これに0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (680 μL, 8.04 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−phenylpyrazin−2−amine (7a) (504 mg, 1.33 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (16.3 mg, 133 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl] acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で18時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1) で精製し、化合物11a (630 mg, 1.01 mmol, 75.4%) を黄色泡状固体として得た。Rf = 0.33 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.18 (s, 6H), 0.23 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 0.96 (s, 9H), 3.47 (s, 2H), 6.72−6.79 (AA’BB’, 2H), 6.96−7.02 (AA’BB’, 2H), 7.03−7.09 (AA’BB’, 2H), 7.29−7.39 (m, 3H), 7.66−7.74 (m, 2H), 8.05−8.12 (AA’BB’, 2H), 8.98 (s, 1H), 10.54 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (4C), 17.9, 18.0, 25.50 (3C), 25.54 (3C), 41.7, 119.5 (2C), 120.3 (2C), 127.8 (2C), 127.9, 128.0 (2C), 128.2 (2C), 128.5, 128.9, 130.3 (2C), 130.5, 137.6, 142.8, 147.6, 148.0, 153.8, 156.7, 169.3；IR (KBr, cm−1) 523, 694, 781, 804, 839, 914, 1020, 1070, 1086, 1105, 1169, 1263, 1371, 1416, 1510, 1605, 1672, 2857, 2886, 2930, 2955, 3040, 3059, 3233；HRMS (ESI+) m/z 648.3043 ([M+Na]+, C36H47N3NaO3Si2 +requires 648.3048)。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−phenylpyrazin−2−yl]acetamide (4a, TMD−344)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−phenylpyrazin−2−yl]acetamide (11a) (500 mg, 799 μmol) をTHF (7 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (4.00 mL, 4.00 mmol) を加え、室温に昇温しながら40分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を飽和NH4Cl水溶液 (200 mL)、水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4a (TMD−344) (206 mg, 517 μmol, 64.7%) を無色固体として得た。Rf = 0.41 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 6.5 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ3.51 (s, 2H), 6.69−6.76 (AA’BB’, 2H), 6.87−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.02−7.08 (AA’BB’, 2H), 7.30−7.43 (m, 3H), 7.58−7.65 (m, 2H), 7.96−8.02 (AA’BB’, 2H), 8.80 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 41.8, 115.2 (2C), 116.0 (2C), 125.3, 126.5, 128.0 (2C), 128.2 (2C), 128.3 (2C), 128.7, 130.4 (2C), 137.4, 137.7, 142.5, 147.8, 148.7, 156.2, 159.3, 169.9；IR (KBr, cm−1) 527, 607, 675, 700, 799, 841, 968, 1020, 1165, 1225, 1265, 1323, 1368, 1410, 1443, 1458, 1493, 1518, 1537, 1593, 1609, 1676, 3021, 3256, 3368；HRMS (ESI+) m/z 420.1321 ([M+Na]+, C24H19N3NaO3 +requires 420.1319)。
２−２）TMD−343 (4b)
(E)−2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−styrylpyrazin−2−yl]acetamide (11b)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.65 g, 6.19 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これに0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.05 mL, 12.4 mmol) を加え、室温に昇温しながら40分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、(E)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−styrylpyrazin−2−amine (7b) (500 mg, 1.24 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.3 mg, 125 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy) phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で15時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11b (563 mg, 864 μmol, 69.7%) を黄色固体として得た。Rf = 0.29 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.17 (s, 6H), 0.24 (s, 6H), 0.96 (s, 9H), 0.97 (s, 9H), 3.66 (s, 2H), 6.81−6.91 (m, 3H, includes AA’BB’), 6.99−7.04 (AA’BB’, 2H), 7.28−7.40 (m, 7H, includes AA’BB’), 7.82 (d, 1H, J = 16 Hz), 8.11−8.19 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 10.66 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.5 (2C), −4.6 (2C), 17.8, 17.9, 25.5 (6C), 42.0, 119.7 (2C), 120.3 (2C), 122.5, 127.1 (2C), 128.2 (2C), 128.5, 128.7 (2C), 128.9, 129.0, 130.3 (2C), 133.8, 136.0, 137.8, 142.8, 143.9, 148.0, 154.0, 156.7, 170.6；IR (KBr, cm−1) 471, 521, 638, 691, 746, 781, 806, 839, 914, 968, 1007, 1080, 1103, 1169, 1263, 1325, 1371, 1391, 1414, 1439, 1472, 1510, 1566, 1605, 1659, 2857, 2886, 2930, 2055, 3028, 3057, 3217；HRMS (ESI+) m/z 674.3203 ([M+Na]+, C38H49N3NaO3Si2 +requires 674.3205)。
(E)−2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−styrylpyrazin−2−yl]acetamide (4b, TMD−343)
(E)−2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−styrylpyrazin−2−yl]acetamide (11b) (500 mg, 767 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (3.90 mL, 3.90 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4b (TMD−343) (251 mg, 592 μmol, 77.3%) を黄色固体として得た。Rf = 0.50 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 10.6 min；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ3.67 (s, 2H), 6.79−6.90 (m, 3H, includes AA’BB’), 6.90−6.96 (AA’BB’, 2H), 7.25−7.32 (m, 3H, includes AA’BB’), 7.33−7.39 (m, 4H), 7.88 (d, 1H, J= 16 Hz), 8.00−8.07 (AA’BB’, 2H), 8.72 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 42.2, 115.5 (2C), 116.0 (2C), 122.5, 126.2, 126.6, 127.3 (2C), 128.4 (2C), 128.8, 128.9 (2C), 130.2 (2C), 133.9, 136.1, 137.7, 142.5, 144.1, 148.7, 156.5, 159.3, 171.1；IR (KBr, cm−1) 527, 617, 691, 756, 804, 845, 970, 1134, 1175, 1246, 1269, 1327, 1375, 1449, 1497, 1512, 1593, 1609, 1638, 3024, 3159, 3566；HRMS (ESI+) m/z 446.1475 ([M+Na]+, C26H21N3NaO3 +requires 446.1475)。
２−３）TMD−347 (4c)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(1−phenylvinyl)pyrazin−2−amine (7c)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.00 g, 2.63 mmol) をトルエン (30 mL) およびエタノール (1.2 mL) に溶解した。これに1−phenylvinylboronic acid (6c) (467 mg, 3.16 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (110 mg, 157 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (2.70 mL, 2.70 mmol) を順次加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7c (830 mg, 2.06 mmol, 78.2%) を褐色油状物質として得た。Rf = 0.33 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.15 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 5.50 (s, 1H), 5.93 (s, 2H), 5.97 (s, 1H), 6.80−6.87 (AA’BB’, 2H), 7.26−7.36 (m, 5H), 7.71−7.77 (AA’BB’, 2H), 8.45 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ −4.6 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 117.9, 120.0 (2C), 126.3 (2C), 126.5 (2C), 128.0, 128.4 (2C), 130.5, 137.7, 138.2, 139.0, 139.2, 144.4, 151.8, 154.9；IR (KBr, cm−1) 517, 552, 608, 629, 677, 692, 708, 779, 806, 843, 910, 1009, 1026, 1063, 1105, 1148, 1169, 1202, 1263, 1323, 1362, 1389, 1423, 1449, 1510, 1605, 2857, 2886, 2928, 2953, 3034, 3055, 3175, 3298, 3387, 3481。
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−{5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(1−phenylvinyl)pyrazin−2−yl}acetamide (11c)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.80 g, 6.76 mmol) をCH2Cl2 (15 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (4 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.20 mL, 14.2 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(1−phenylvinyl)pyrazin−2−amine (7c) (543 mg, 1.35 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 123 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で16時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11c (292 mg, 448 μmol, 33.3%) を黄色泡状固体として得た。Rf = 0.26 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.13 (s, 6H), 0.18 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 3.22 (s, 2H), 5.51 (s, 1H), 5.65 (s, 1H), 6.67−6.74 (AA’BB’, 2H), 6.90−6.97 (AA’BB’, 2H), 6.97− 7.03 (AA’BB’, 2H), 7.19−7.26 (m, 2H), 7.26−7.31 (m, 3H), 7.91−7.98 (AA’BB’, 2H), 8.95 (s, 1H), 10.19 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, acetone−d6) δ−4.3 (4C), 18.6, 18.7, 26.0 (6C), 42.5, 118.8, 120.5 (2C), 121.1 (2C), 127.9 (2C), 128.4, 128.6, 128.78 (2C), 128.84 (2C), 130.1, 131.3 (2C), 138.4, 140.0, 144.2, 146.9, 148.7, 148.9, 155.1, 157.9, 169.7；IR (KBr, cm−1) 546, 696, 781, 806, 839, 914, 1007, 1082, 1169, 1261, 1362, 1420, 1435, 1472, 1508, 1605, 1670, 2857, 2886, 2930, 2955, 3030, 3055, 3231；HRMS (ESI+) m/z 652.3390 ([M+H]+, C38H50N3O3Si2 +requires 652.3385)。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(1−phenylvinyl)pyrazin−2−yl]acetamide (4c, TMD−347)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(1−phenylvinyl)pyrazin−2−yl]acetamide (11c) (240 mg, 368 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.90 mL, 1.90 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4c (TMD−347) (83.9 mg, 198 μmol, 53.8%) を褐色固体として得た。Rf = 0.37 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 8.0 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.15 (s, 2H), 5.52 (s, 1H), 5.66 (s, 1H), 6.58−6.64 (AA’BB’, 2H), 6.80−6.86 (AA’BB’, 2H), 6.86−6.93 (AA’BB’, 2H), 7.19−7.25 (m, 2H), 7.25−7.31 (m, 3H), 7.84−7.91 (AA’BB’, 2H), 8.89 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 10.54 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 41.1, 115.0 (2C), 115.9 (2C), 118.1, 125.4, 126.5, 127.1 (2C), 127.7, 128.15 (2C), 128.20 (2C), 130.3 (2C), 137.8, 139.0, 143.1, 145.5, 148.1, 148.7, 156.1, 159.2, 169.6；IR (KBr, cm−1) 519, 546, 606, 698, 779, 837, 916, 1107, 1171, 1231, 1321, 1431, 1481, 1514, 1609, 1670, 3026, 3265；HRMS (ESI+) m/z 446.1483 ([M+Na]+, C26H21N3NaO3 +requires 446.1475)。
２−４）TMD−338 (4d)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)pheny}−3−(naphthalen−1−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11d)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.00 mL, 11.8 mmol) を加え、室温に昇温しながら40分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(naphthalen−1−yl)pyrazin−2−amine (7d) (500 mg, 1.17 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.3 mg, 125 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で16時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11d (442 mg, 653 μmol, 55.9%) を黄色泡状固体として得た。Rf = 0.26 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.13 (s, 6H), 0.19 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 3.24 (s, 2H), 6.54−6.60 (AA’BB’, 2H), 6.65−6.72 (AA’BB’, 2H), 6.91−6.98 (AA’BB’, 2H), 7.36−7.54 (m, 4H), 7.61−7.69 (m, 1H), 7.87−8.08 (m, 4H, includes AA’BB’), 9.09 (s, 1H), 10.27 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (4C), 17.90, 17.94, 25.48 (3C), 25.55 (3C), 119.4 (2C), 120.4 (2C), 125.0, 125.4, 125.7, 126.2, 126.8, 128.0, 128.15, 128.21 (2C), 128.6, 128.9 (2C), 129.9, 130.7, 133.4, 134.8, 138.2, 144.4, 147.9, 148.3, 153.5, 156.7, 169.3 (one carbon at benzyl position was unobservable due to overlapping with septet peak of DMSO)；IR (KBr, cm−1) 492, 538, 675, 718, 779, 806, 839, 914, 1007, 1080, 1115, 1169, 1260, 1362, 1420, 1441, 1472, 1510, 1605, 1670, 2857, 2886, 2930, 2955, 3046, 3223；HRMS (ESI+) m/z698.3205 ([M+Na]+, C40H49N3NaO3Si2 +requires 698.3205)。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(naphthalen−1−yl)pyrazin−2−yl]acet amide (4d, TMD−338)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(naphthalen−1−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11d) (291 mg, 430 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (2.20 mL, 2.20 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を飽和NH4Cl水溶液 (200 mL)、水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4d (TMD−338) (181 mg, 404 μmol, 93.8%) を褐色固体として得た。Rf = 0.56 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 9.1 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.17 (s, 2H), 6.45−6.53 (AA’BB’, 2H), 6.56−6.64 (AA’BB’, 2H),6.80−6.88 (AA’BB’, 2H), 7.35−7.56 (m, 4H), 7.61−7.68 (m, 1H), 7.88−8.04 (m, 4H, includes AA’BB’), 9.03 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 9.85 (s, 1H), 10.14 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 41.2, 115.0 (2C), 115.9 (2C), 125.1, 125.3, 125.4, 125.8, 126.3, 126.5, 126.9, 128.25, 128.27 (2C), 128.7, 129.8 (2C), 130.7, 133.4, 134.9, 138.0, 144.0, 148.38, 148.44, 155.9, 159.2, 169.8；IR (KBr, cm−1) 492, 540, 623, 777, 802, 839, 982, 1078, 1171, 1231, 1317, 1364, 1447, 1477, 1516, 1609, 1670, 3055, 3246；HRMS (ESI+) m/z 470.1483 ([M+Na]+, C28H21N3NaO3 +requires 470.1475)。
２−５）TMD−339 (4e)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(naphthalen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11e)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.00 mL, 11.8 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(naphthalen−2−yl)pyrazin−2−amine (7e) (500 mg, 1.17 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 123 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で16時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11e (460 mg, 681 μmol, 58.2%) を黄色泡状固体として得た。Rf = 0.26 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.12 (s, 6H), 0.21 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.94 (s, 9H), 3.46 (s, 2H), 6.55−6.65 (AA’BB’, 2H), 6.91−6.97 (AA’BB’, 2H), 6.97−7.03 (AA’BB’, 2H), 7.47−7.58 (m, 2H), 7.75−8.00 (m, 4H), 8.08−8.14 (AA’BB’, 2H), 8.23 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 10.63 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (4C), 17.8, 17.9, 25.5 (6C), 119.4 (2C), 120.3 (2C), 125.5, 126.1, 126.6, 127.1, 127.2, 127.3, 127.5, 127.9, 128.2 (2C), 128.5, 130.2 (2C), 132.6, 132.8, 135.3, 137.6, 143.0, 147.5, 148.0, 153.7, 156.7, 169.4 (one carbon at benzyl position was unobservable due to overlapping with septet peak of DMSO)；IR (KBr, cm−1) 478, 527, 687, 718, 746, 781, 804, 839, 914, 1009, 1082, 1103, 1128, 1169, 1261, 1362, 1415, 1445, 1472, 1508, 1605, 1670, 2857, 2886, 2928, 2955, 3057, 3221；HRMS (ESI+) m/z698.3194 ([M+Na]+, C40H49N3NaO3Si2 +requires 698.3205)。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(naphthalen−2−yl)pyrazin−2−yl]acet amide (4e, TMD−339)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}]−3−(naphthalen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11e) (300 mg, 444 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (2.30 mL, 2.30 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を飽和NH4Cl水溶液 (200 mL)、水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4e (TMD−339) (131 mg, 292 μmol, 65.8%) を褐色固体として得た。Rf = 0.48 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 10.9 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.39 (s, 2H), 6.50−6.58 (AA’BB’, 2H), 6.82−6.94 (2AA’BB’, 4H), 7.46−7.58 (m, 2H), 7.79−7.91 (m, 4H), 8.02−8.08 (AA’BB’, 2H), 8.23 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 10.52 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 41.6, 115.1 (2C), 115.9 (2C), 125.3, 125.6, 126.3, 126.5, 126.8, 127.3, 127.5, 127.6, 128.3 (2C), 128.6, 130.2 (2C), 132.7, 132.9, 135.3, 137.3, 142.7, 147.5, 148.6, 156.1, 159.3, 169.8；IR (KBr, cm−1) 529, 635, 669, 752, 826, 968, 1163, 1223, 1356, 1454, 1491, 1516, 1539, 1593, 1611, 1672, 3065, 3246；HRMS (ESI+) m/z 470.1486 ([M+Na]+, C28H21N3NaO3 +requires 470.1475)。
２−６）TMD−340 (4f)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11f)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (2.12 g, 7.96 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.35 mL, 16.0 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thiophen−2−yl)pyrazin−2−amine (7f) (600 mg, 1.59 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (19.8 mg, 162 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で15時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製した。得られた固体を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) し、化合物11f (446 mg, 706 μmol, 44.4%) を無色固体として得た。Rf = 0.26 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.18 (s, 6H), 0.23 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 0.97 (s, 9H), 3.65 (s, 2H), .678−6.86 (AA’BB’, 2H), 6.97−7.06 (m, 3H, includes AA’BB’), 7.19−7.27 (AA’BB’, 2H), 7.51 (dd, 1H, J= 0.9, 3.7 Hz), 7.69 (dd, 1H, J = 0.9, 5.0 Hz), 8.06−8.14 (AA’BB’, 2H), 8.93 (s, 1H), 10.60 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (4C), 17.9, 18.0, 25.50 (3C), 25.54 (3C), 41.9, 119.6 (2C), 120.4 (2C), 127.8, 127.9, 128.0, 128.2 (2C), 128.4, 129.5, 130.5 (2C), 137.3, 140.5, 140.6, 142.5, 148.0, 153.9, 157.0, 170.3；IR (KBr, cm−1) 419, 519, 673, 704, 741, 781, 802, 839, 916, 1169, 1265, 1335, 1362, 1373, 1414, 1439, 1472, 1510, 1605, 1667, 2857, 2887, 2930, 2955, 3221；HRMS (ESI+) m/z 654.2617 ([M+Na]+, C34H45N3NaO3Si2 +requires 654.2612)。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acet amide (4f, TMD−340)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11f) (252 mg, 398 μmol) をTHF (4 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (2.00 mL, 2.00 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を飽和NH4Cl水溶液 (200 mL)、水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮することで化合物4f (TMD−340) (160 mg, 397 μmol, 99.6%) を無色固体として得た。Rf = 0.37 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 6.8 min ; 1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.59 (s, 2H), 6.70−6.76 (AA’BB’, 2H), 6.90−6.96 (AA’BB’, 2H), 6.99 (dd, 1H, J= 3.8, 5.0 Hz), 7.12−7.18 (AA’BB’, 2H), 7.48 (dd, 1H, J= 1.1, 3.8 Hz), 7.69 (dd, 1H, J = 1.1, 5.0 Hz), 8.01−8.07 (AA’BB’, 2H), 8.89 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 9.97 (s, 1H), 10.50 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ42.0, 115.2 (2C), 116.0 (2C), 125.2, 126.0, 128.1, 128.25, 128.34 (2C), 129.6, 130.5 (2C), 137.1, 140.1, 140.8, 142.7, 148.6, 156.3, 159.5, 170.8；IR (KBr, cm−1) 523, 631, 698, 725, 791, 841, 966, 984, 1074, 1113, 1167, 1227, 1263, 1317, 1375, 1406, 1431, 1450, 1495, 1518, 1535, 1593, 1609, 1674, 3021, 3244, 3372；HRMS (ESI+) m/z426.0877 ([M+Na]+, C22H17N3NaO3S+requires 426.0883)。
２−７）TMD−345 (4g)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−{5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thiophen−3−yl)pyrazin−2−yl}acetamide (11g)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.00 mL, 11.8 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thiophen−3−yl)pyrazin−2−amine (7g) (450 mg, 1.17 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.5 mg, 127 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で15時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11g (512 mg, 809 μmol, 69.0%) を黄色固体として得た。Rf = 0.22 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.16 (s, 6H), 0.20 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 0.94 (s, 9H), 3.56 (s, 2H), 6.72−6.82 (AA’BB’, 2H), 6.93−7.02 (AA’BB’, 2H), 7.12−7.22 (AA’BB’, 2H), 7.50 (dd, 1H, J= 2.9, 5.0 Hz), 7.59 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 7.81 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 8.04−8.12 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 10.50 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ −4.6 (4C), 17.90, 17.95, 25.50 (3C), 25.54 (3C), 41.9, 119.6 (2C), 120.3 (2C), 125.7, 126.0, 127.7, 127.9, 128.2 (2C), 128.8, 130.5 (2C), 137.1, 138.2, 142.0, 143.5, 148.0, 153.9, 156.8, 169.9；IR (KBr, cm−1) 517, 669, 712, 741, 781, 806, 839, 914, 1007, 1082, 1105, 1169, 1261, 1341, 1362, 1441, 1472, 1508, 1605, 1665, 2857, 2886, 2930, 2955, 3057, 3227；HRMS (ESI+) m/z 654.2618 ([M+Na]+, C34H45N3NaO3Si2 +requires 654.2612)。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(thiophen−3−yl)pyrazin−2−yl]acet amide (4g, TMD−345)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(thiophen−3−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11g) (310 mg, 491 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (2.50 mL, 2.50 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4g (TMD−345) (85.0 mg, 211 μmol, 43.0%) を黄色固体として得た。Rf = 0.50 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 6.2 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.50 (s, 2H), 6.65−6.72 (AA’BB’, 2H), 6.84−6.92 (AA’BB’, 2H), 7.03−7.11 (AA’BB’, 2H), 7.49 (dd, 1H, J = 2.9, 5.0 Hz), 7.58 (dd, 1H, J = 1.2, 5.0 Hz), 7.80 (dd, 1H, J = 1.2, 2.9 Hz), 7.98−8.06 (AA’BB’, 2H), 8.85 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 10.39 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ41.9, 115.2 (2C), 115.9 (2C), 125.2, 125.9, 126.2, 126.4, 127.8, 128.3 (2C), 130.4 (2C), 136.9, 138.3, 141.6, 143.7, 148.6, 156.3, 159.3, 170.4；IR (KBr, cm−1) 419, 517, 609, 671, 706, 783, 804, 839, 934, 1040, 1082, 1111, 1173, 1227, 1248, 1272, 1312, 1352, 1441, 1516, 1593, 1611, 1674, 2808, 3250；HRMS (ESI+) m/z426.0878 ([M+Na]+, C22H17N3NaO3S+requires 426.0883)。
２−８）TMD−342 (4h)
N−[3−(Benzo[b]thiophen−2−yl)−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetamide (11h)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (985 μL, 11.6 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、3−(benzo[b]thiophen−2−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl] pyrazin−2−amine (7h) (505 mg, 1.16 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 123 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyl dimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で15時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製した。得られた固体を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) し、化合物11h (294 mg, 431 μmol, 37.0%) を無色固体として得た。Rf = 0.19 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.19 (s, 6H), 0.25 (s, 6H), 0.96 (s, 9H), 0.97 (s, 9H), 3.71 (s, 2H), 6.82−6.89 (AA’BB’, 2H), 7.01−7.08 (AA’BB’, 2H), 7.26−7.42 (m, 4H, includes AA’BB’), 7.60−7.65 (m, 2H), 7.96 (d, 1H, J= 7.9 Hz), 8.10−8.18 (AA’BB’, 2H), 9.02 (s, 1H), 10.82 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 525, 677, 692, 710, 727, 743, 779, 797, 808, 835, 922, 972, 1011, 1074, 1171, 1256, 1327, 1362, 1391, 1416, 1445, 1503, 1603, 1657, 859, 2886, 2930, 2957, 3059, 3161, 3211；HRMS (ESI+) m/z 704.2758 ([M+Na]+, C38H47N3NaO3SSi2 +requires 704.2769)。
N−[3−(Benzo[b]thiophen−2−yl)−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−hydroxyphenyl) acetamide (4h, TMD−342)
N−[3−(Benzo[b]thiophen−2−yl)−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetamide (11h) (186 mg, 273 μmol) をTHF (2 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.40 mL, 1.40 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を飽和NH4Cl水溶液 (200 mL)、水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮することで化合物4h (TMD−342) (123 mg, 271 μmol, 99.3%) を無色固体として得た。Rf = 0.41 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 13.1 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 3.62 (s, 2H), 6.70−6.78 (AA’BB’, 2H), 6.89−6.95 (AA’BB’, 2H), 7.17−7.22 (AA’BB’, 2H), 7.30−7.39 (m, 2H), 7.51−7.59 (m, 2H), 7.90−7.95 (m, 1H), 8.01−8.09 (AA’BB’, 2H), 8.94 (s, 1H), 9.38 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 10.70 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ42.3, 115.4 (2C), 116.1 (2C), 122.3, 124.3, 124.60, 124.63, 125.1, 125.6, 125.8, 128.4 (2C), 130.5 (2C), 137.8, 139.9, 140.3, 141.0, 141.5, 142.0, 148.5, 156.5, 159.6, 170.6；IR (KBr, cm−1) 525, 554, 579, 623, 654, 681, 727, 804, 827, 847, 972, 1013, 1070, 1128, 1175, 1242, 1314, 1377, 1439, 1497, 1514, 1593, 1676, 3302；HRMS (ESI+) m/z 476.1052 ([M+Na]+, C26H19N3NaO3S+requires 476.1039)。
２−９）TMD−346 (4i)
N−[3−(Benzo[b]thiophen−3−yl)−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetamide (11i)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.00 mL, 11.8 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、3−(benzo[b]thiophen−3−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl] pyrazin−2−amine (7i) (505 mg, 1.16 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 123 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyl dimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で15時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11i (505 mg, 740 μmol, 63.5%) を黄色固体として得た。Rf = 0.19 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.15 (s, 6H), 0.20 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.93 (s, 9H), 3.41 (s, 2H), 6.65−6.71 (AA’BB’, 2H), 6.93−7.00 (2AA’BB’, 4H), 7.35−7.42 (m, 2H), 7.80 (s, 1H), 7.95−8.07 (m, 4H, includes AA’BB’), 9.01 (s, 1H), 10.49 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.5 (4C), 17.89, 17.93, 25.47 (3C), 25.54 (3C), 41.6, 119.5 (2C), 120.4 (2C), 122.6, 123.5, 124.4 (2C), 127.3, 127.9, 128.1 (2C), 128.9, 130.3 (2C), 132.3, 137.5, 137.5, 139.4, 143.7, 143.8, 147.6, 153.8, 156.7, 169.4；IR (KBr, cm−1) 683, 700, 735, 758, 781, 804, 839, 914, 1169, 1261, 1331, 1362, 1435, 1472, 1508, 1605, 1670, 2857, 2886, 2930, 2955；HRMS (ESI+) m/z704.2781 ([M+Na]+, C38H47N3NaO3SSi2 +requires 704.2769)。
N−[3−(Benzo[b]thiophen−3−yl)−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−hydroxyphenyl) acetamide (4i, TMD−346)
N−[3−(Benzo[b]thiophen−3−yl)−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetamide (11i) (300 mg, 440 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (2.20 mL, 2.20 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4i (TMD−346) (191 mg, 422 μmol, 95.8%) を褐色固体として得た。Rf = 0.50 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 9.6 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.36 (s, 2H), 6.57−6.63 (AA’BB’, 2H), 6.84−6.92 (2AA’BB’, 4H), 7.36−7.43 (m, 2H), 7.79 (s, 1H), 7.95−8.04 (m, 4H, includes AA’BB’), 8.95 (s, 1H), 9.22 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 10.37 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 41.7, 115.1 (2C), 116.0 (2C), 122.8, 123.6, 124.5 (2C), 125.2, 126.5, 127.5, 128.2 (2C), 130.2 (2C), 132.4, 137.2, 137.6, 139.5, 143.3, 144.0, 148.2, 156.1, 159.3, 169.9；IR (KBr, cm−1) 419, 473, 525, 611, 735, 760, 837, 970, 1171, 1233, 1329, 1435, 1479, 1514, 1609, 1668, 2957, 3260；HRMS (ESI+) m/z 476.1052 ([M+Na]+, C26H19N3-O3S+requires 476.1039)。
２−１０）TMD−341 (4j)
N−[3,5−Bis{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetamide (11j)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (985 μL, 11.6 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、3,5−bis[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (7j) (591 mg, 1.16 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.7 mg, 129 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で15時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1) で精製し、化合物11j (714 mg, 945 μmol, 81.1%) を黄色泡状固体として得た。Rf =0.37 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 2/3)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.14 (s, 6H), 0.19 (s, 6H), 0.20 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 0.95 (s, 18H), 3.47 (s, 2H), 6.71−6.78 (2AA’BB’, 4H), 6.94−7.02 (AA’BB’, 2H), 7.03−7.13 (AA’BB’, 2H), 7.57−7.63 (AA’BB’, 2H), 8.03−8.10 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 10.49 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ −4.5 (6C), 17.9 (3C), 25.5 (9C), 41.7, 119.3 (2C), 119.5 (2C), 120.3 (2C), 127.9, 128.1 (2C), 128.9, 129.3 (2C), 130.4 (2C), 130.7, 136.9, 142.4, 147.2, 147.8, 153.8, 155.7, 156.7, 169.3；IR (KBr, cm−1) 523, 637, 677, 710, 781, 804, 839, 914, 1009, 1078, 1105, 1169, 1258, 1362, 1402, 1416, 1441, 1472, 1510, 1605, 1667, 2857, 2886, 2928, 2955, 3036, 3221；HRMS (ESI+) m/z 778.3853 ([M+Na]+, C42H61N3NaO4Si3 +requires 778.3862)。
N−[3,5−Bis(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−hydroxyphenyl)acetamide (4j, TMD−341)
N−[3,5−Bis{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetamide (11j) (500 mg, 661 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (5.00 mL, 5.00 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4j (TMD−341) (263 mg, 637 μmol, 96.3%) を褐色固体として得た。Rf = 0.43 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 4.3 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.40 (s, 2H), 6.60−6.68 (AA’BB’, 2H), 6.68−6.74 (AA’BB’, 2H), 6.82−6.90 (AA’BB’, 2H), 6.94−7.03 (AA’BB’, 2H), 7.54−7.62 (AA’BB’, 2H), 7.94−8.02 (AA’BB’, 2H), 8.80 (s, 1H), 9.24 (s, 1H), 9.70 (s, 1H), 9.85 (s, 1H), 10.29 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 41.7, 115.1 (4C), 115.9 (2C), 125.4, 126.6, 128.1, 128.2 (2C), 129.6 (2C), 130.3 (2C), 136.3, 141.9, 147.8, 148.4, 156.1, 158.3, 159.2, 170.0；IR (KBr, cm−1) 530, 571, 839, 966, 1011, 1080, 1171, 1234, 1321, 1369, 1420, 1481, 1516, 1609, 1670, 3246；HRMS (ESI+) m/z436.1269 ([M+Na]+, C24H19N3NaO4 +requires 436.1268)。
２−１１）TMD−373 (4k)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thieno[3,2−b]thiophen−2−yl)pyrazin−2−amine (7k)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (500 mg, 1.31 mmol) をトルエン (15 mL) およびエタノール (600 μL) に溶解した。これにthieno[3,2−b]thiophen−2−boronic acid (6k) (290 mg, 1.58 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (56.0 mg, 79.8 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (1.40 mL, 1.40 mmol) を順次加え、21時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7k (278 mg, 632 μmol, 48.0%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.19 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 6.55 (s, 2H), 6.89−6.96 (AA’BB’, 2H), 7.44 (d, 1H , J = 5.3 Hz), 7.71 (d, 1H, J = 5.3 Hz), 7.86−7.94 (AA’BB’, 2H), 8.08 (s, 1H), 8.49 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 509, 637, 702, 781, 839, 916, 986, 1103, 1165, 1261, 1344, 1418, 1464, 1510, 1605, 1638, 2857, 2930, 2953, 3156, 3296, 3416。
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(thieno[3,2−b]thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11k)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (757 mg, 2.84 mmol) をCH2Cl2 (8 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (2 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (490 μL, 5.79 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thieno[3,2−b]thiophen−2−yl)pyrazin−2−amine (7k) (250 mg, 569 μmol) および4−(dimethylamino)pyridine (12.3 mg, 101 μmol) を脱水ピリジン(15 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で13時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 30 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11k (228 mg, 331 μmol, 58.2%) を黄色固体として得た。Rf =0.26 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.17 (s, 6H), 0.22 (s, 6H), 0.93 (s, 9H), 0.95 (s, 9H), 3.67 (s, 2H), 6.78−6.86 (AA’BB’, 2H), 6.96−7.04 (AA’BB’, 2H), 7.20−7.30 (AA’BB’, 2H), 7.41 (d, 1H, J= 5.2 Hz), 7.57 (s, 1H), 7.73 (d, 1H, J= 5.2 Hz), 8.04−8.13 (AA’BB’, 2H), 8.92 (s, 1H), 10.69 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 527, 635, 702, 779, 837, 918, 1007, 1074, 1169, 1256, 1362, 1445, 1508, 1603, 1655, 2857, 2886, 2928, 2955, 3211。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(thieno[3,2−b]thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (4k, TMD−373)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(thieno[3,2−b]thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11k) (172 mg, 250 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.30 mL, 1.30 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) することで、化合物4k (TMD−373) (88.4 mg, 192 μmol, 77.1%) を黄色固体として得た。Rf = 0.37 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 10.6 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.59 (s, 2H), 6.71−6.78 (AA’BB’, 2H), 6.85−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.15−7.23 (AA’BB’, 2H), 7.37−7.42 (m, 2H), 7.72 (d, 1H, J= 5.2 Hz), 7.99−8.05 (AA’BB’, 2H), 8.87 (s, 1H), 9.38 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 10.61 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ42.3, 115.4 (2C), 115.9 (2C), 120.1, 120.5, 125.0, 125.8, 128.3 (2C), 130.4 (2C), 130.5, 137.1, 139.7, 140.0, 141.0, 142.4, 142.9, 148.4, 156.5, 159.5, 170.5；IR (KBr, cm−1) 530, 635, 704, 725, 804, 986, 1173, 1242, 1325, 1371, 1439, 1491, 1514, 1609, 1676, 3304。
２−１２）TMD−374 (4l)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(dithieno[3,2−b:2’,3’−d]thiophen−2−yl)pyrazin−2−amine (7l)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (700 mg, 1.84 mmol) をトルエン (21 mL) およびエタノール (840 μL) に溶解した。これにdithieno [3,2−b:2’,3’−d]thiophen−2−boronic acid (6l) (540 mg, 2.25 mmol)、dichlorobis(triphenylphos phine)palladium(II) (78.2 mg, 111 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (1.90 mL, 1.90 mmol) を順次加え、18時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7l (477 mg, 963 μmol, 52.3%) を黄色固体として得た。Rf = 0.26 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.20 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 6.59 (s, 2H), 6.89−6.97 (AA’BB’, 2H), 7.53 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.74 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.88−7.97 (AA’BB’, 2H), 8.16 (s, 1H), 8.51 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 530, 625, 644, 698, 781, 839, 908, 1072, 1109, 1179, 1225, 1267, 1360, 1393, 1462, 1512, 1605, 2857, 2928, 2957, 3173, 3285, 3424。
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(dithieno[3,2−b:2’,3’−d]thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11l)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.00 g, 3.76 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (640 μL, 7.56 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(thieno[3,2−b:2’,3’−d] thiophen−2−yl)pyrazin−2−amine (7l) (370 mg, 746 μmol) および4−(dimethylamino)pyridine (14.8 mg, 121 μmol) を脱水ピリジン(15 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル(100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製した。得られた固体を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) し、化合物11l (116 mg, 156 μmol, 20.9%) を褐色固体として得た。Rf =0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.16 (s, 6H), 0.21 (s, 6H), 0.93 (s, 9H), 0.94 (s, 9H), 3.68 (s, 2H), 6.78−6.88 (AA’BB’, 2H), 6.94−7.06 (AA’BB’, 2H), 7.20−7.30 (AA’BB’, 2H), 7.47 (d, 1H, J= 5.2 Hz), 7.65 (s, 1H), 7.75 (d, 1H, J= 5.2 Hz), 8.06−8.14 (AA’BB’, 2H), 8.93 (s, 1H), 10.72 (s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 530, 602, 644, 700, 779, 837, 922, 1072, 1171, 1265, 1361, 1447, 1504, 1603, 1657, 2857, 2928, 2955, 3208。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(thieno[3,2−b:2’,3’−d]thiophen−2−yl) pyrazin−2−yl]acetamide (4l, TMD−374)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(dithieno[3,2−b:2’,3’−d]thiophen−2−yl)pyrazin−2−yl]acetamide (11l) (82.3 mg, 111 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (600 μL, 600 μmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) することで、化合物4l (TMD−374) (50.7 mg, 192 μmol, 88.8%) を黄色固体として得た。Rf = 0.37 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 17.7 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.61 (s, 2H), 6.70−6.80 (AA’BB’, 2H), 6.87−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.15−7.25 (AA’BB’, 2H), 7.44 (s, 1H), 7.52 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.75 (d, 1H, J= 5.2 Hz), 8.01−8.09 (AA’BB’, 2H), 8.89 (s, 1H), 9.34 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 10.66 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ42.3, 115.4 (2C), 115.9 (2C), 121.4, 121.9, 125.0, 125.7, 128.3 (2C), 128.9, 130.3, 130.4 (2C), 132.3, 137.2, 140.0, 141.8, 142.00, 142.02, 142.8, 148.4, 156.5, 159.5, 170.5；IR (KBr, cm−1) 534, 598, 644, 706, 793, 835, 893, 972, 1109, 1173, 1190, 1242, 1319, 1389, 1439, 1491, 1611, 1665, 3231。
２−１３）TMD−375 (4m)
3−(2,2'−Bithiophen−5−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (7m)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (500 mg, 1.31 mmol) をトルエン (15 mL) およびエタノール (600 μL) に溶解した。これに5−(4,4,5,5−tetramethyl−1,3,2−dioxaborolan−2−yl)−2,2'−bithiophene (6m) (460 mg, 1.57 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (56.3 mg, 80.2 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (1.40 mL, 1.40 mmol) を順次加え、15時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7m (574 mg, 1.23 mmol, 93.7%) を黄色固体として得た。Rf = 0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.19 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 6.49 (s, 2H), 6.88−6.97 (AA’BB’, 2H), 7.10 (dd, 1H, J= 3.7, 3.7 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.41 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.53 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.84−7.92 (AA’BB’, 2H), 8.47 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ−4.5 (2C), 18.0, 25.5 (3C), 120.2 (2C), 124.5, 124.9, 125.9, 126.5 (2C), 126.6, 128.5, 129.8, 131.2, 136.4, 137.1, 138.1, 139.5, 141.6, 149.8, 155.3；IR (KBr, cm−1) 505, 544, 694, 781, 806, 839, 914, 980, 1011, 1084, 1169, 1209, 1258, 1375, 1418, 1454, 1512, 1605, 2857, 2928, 2953, 3177, 3296, 3453。
N−[3−(2,2'−Bithiophen−5−yl)−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetamide (11m)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.00 g, 3.76 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (640 μL, 7.56 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、3−(2,2'−bithiophen−5−yl)−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl] pyrazin−2−amine (7m) (350 mg, 752 μmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 123 μmol) を脱水ピリジン(15 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyl dimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11m (298 mg, crude) を褐色油状物質として得た。Rf =0.26 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.16 (s, 6H), 0.22 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 0.94 (s, 9H), 3.64 (s, 2H), 6.76−6.85 (AA’BB’, 2H), 6.98−7.05 (AA’BB’, 2H), 7.06−7.13 (m, 2H), 7.19−7.27 (AA’BB’, 2H), 7.33 (d, 1H, J= 3.6 Hz), 7.36 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.54−7.59 (m, 1H), 8.05−8.11 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 10.65 (s, 1H)。
N−[3−(2,2'−Bithiophen−5−yl)−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−hydroxyphenyl) acetamide (4m, TMD−375)
N−[3−(2,2'−Bithiophen−5−yl)−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetamide (11m) (168 mg, crude) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.20 mL, 1.20 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) することで、化合物4m (TMD−375) (102 mg, 210 μmol, 49.5% (2 steps)) を黄色固体として得た。Rf = 0.44 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 15.3 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.57 (s, 2H), 6.66−6.75 (AA’BB’, 2H), 6.85−6.95 (AA’BB’, 2H), 7.06−7.17 (m, 4H, includes AA’BB’), 7.34−7.40 (m, 2H), 7.53−7.58 (m, 1H), 7.98−8.05 (AA’BB’, 2H), 8.85 (s, 1H), 9.30 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 10.53 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ42.0, 115.2 (2C), 115.9 (2C), 124.6, 124.9, 125.1, 125.8, 126.3, 128.3 (2C), 128.6, 129.0, 130.4 (2C), 136.1, 137.1, 139.4, 139.5, 140.1, 142.1, 148.5, 156.3, 159.5, 170.7；IR (KBr, cm−1) 532, 602, 692, 837, 966, 1105, 1165, 1223, 1265, 1369, 1450, 1491, 1516, 1609, 1676, 3246, 3385。
２−１４）TMD−376 (4n)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−[4−(dimethylamino)phenyl]pyrazin−2−amine (7n)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (500 mg, 1.31 mmol) をトルエン (15 mL) およびエタノール (600 μL) に溶解した。これに4−(dimethylamino)phenylboronic acid (6n) (260 mg, 1.58 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine) palladium(II) (56.1 mg, 79.9 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (1.40 mL, 1.40 mmol) を順次加え、24時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1) で精製し、化合物7n (488 mg, 1.16 mmol, 88.3%) を黄色固体として得た。Rf = 0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.17 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 2.94 (s, 6H), 6.02 (s, 2H), 6.75−6.83 (AA’BB’, 2H), 6.83−6.92 (AA’BB’, 2H), 7.60−7.70 (AA’BB’, 2H), 7.77−7.88 (AA’BB’, 2H), 8.32 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ −4.5 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 39.9 (2C), 111.9 (2C), 120.0 (2C), 125.0, 126.3 (2C), 128.9 (2C), 130.7, 135.5, 138.5, 139.7, 150.4, 151.3, 154.8；IR (KBr, cm−1) 432, 511, 633, 698, 808, 824, 912, 1009, 1063, 1103, 1167, 1254, 1360, 1422, 1454, 1510, 1607, 2803, 2857, 2886, 2928, 2953, 3179, 3300, 3476。
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−{4−(dimethylamino)phenyl}pyrazin−2−yl]acetamide (11n)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.00 g, 3.76 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (640 μL, 7.56 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−[4−(dimethylamino)phenyl] pyrazin−2−amine (7n) (315 mg, 749 μmol) および4−(dimethylamino)pyridine (14.8 mg, 121 μmol) を脱水ピリジン(15 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyl dimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1) で精製し、化合物11n (200 mg, 300 μmol, 40.0%) を黄色固体として得た。Rf =0.26 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.17 (s, 6H), 0.23 (s, 6H), 0.95 (s, 9H), 0.97 (s, 9H), 2.95 (s, 6H), 3.50 (s, 2H), 6.52−6.65 (AA’BB’, 2H), 6.75−6.85 (AA’BB’, 2H), 6.95−7.05 (AA’BB’, 2H), 7.10−7.20 (AA’BB’, 2H), 7.56−7.66 (AA’BB’, 2H), 8.04−8.10 (AA’BB’, 2H), 8.82 (s, 1H), 10.41 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ −4.5 (2C), −4.6 (2C), 17.9 , 18.0, 25.5 (6C), 39.8 (2C), 41.8, 111.3 (2C), 119.5 (2C), 120.3 (2C), 124.4, 128.05, 128.07 (2C), 128.9 (2C), 129.2, 130.4 (2C), 135.8, 142.0, 147.78, 147.84, 150.5, 153.8, 156.6, 169.3；IR (KBr, cm−1) 527, 685, 781, 839, 914, 1080, 1167, 1256, 1371, 1441, 1508, 1607, 1668, 2857, 2928, 2955, 3233。
N−[3−{4−(Dimethylamino)phenyl}−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−hydroxy phenyl)acetamide (4n, TMD−376)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−{4−(dimethylamino)phenyl}pyrazin−2−yl]acetamide (11n) (148 mg, 220 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.10 mL, 1.10 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) することで、化合物4n (TMD−376) (85.3 mg, 194 μmol, 87.8%) を黄色固体として得た。Rf = 0.37 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 4.5 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ2.91 (s, 6H), 3.41 (s, 2H), 6.51−6.59 (AA’BB’, 2H), 6.62−6.70 (AA’BB’, 2H), 6.82−6.90 (AA’BB’, 2H), 6.98−7.08 (AA’BB’, 2H), 7.53−7.62 (AA’BB’, 2H), 7.94−8.01 (AA’BB’, 2H), 8.74 (s, 1H), 9.25 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 10.28 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ39.8 (2C), 41.9, 111.4 (2C), 115.0 (2C), 115.8 (2C), 124.4, 125.3, 126.7, 128.1 (2C), 128.9 (2C), 130.3 (2C), 135.5, 141.6, 147.8, 148.3, 150.6, 156.2, 159.1, 169.8；IR (KBr, cm−1) 538, 691, 816, 949, 1101, 1169, 1250, 1321, 1375, 1437, 1514, 1533, 1609, 1647, 2810, 3005, 3167, 3348。
２−１５）TMD−377 (4o)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(4−nitrophenyl)pyrazin−2−amine (7o)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (500 mg, 1.31 mmol) をトルエン (15 mL) およびエタノール (600 μL) に溶解した。これにp−nitrophenylboronic acid (6o) (263 mg, 1.58 mmol)、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (56.1 mg, 79.9 μmol) および1 M Na2CO3水溶液 (1.40 mL, 1.40 mmol) を順次加え、22時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7o (451 mg, 1.07 mmol, 81.2%) を黄色固体として得た。Rf = 0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.17 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 6.48 (s, 2H), 6.85−6.92 (AA’BB’, 2H), 7.82−7.92 (AA’BB’, 2H), 8.02−8.10 (AA’BB’, 2H), 8.26−8.36 (AA’BB’, 2H), 8.55 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ −4.5 (2C), 18.0, 25.6 (3C), 120.1 (2C), 123.8 (2C), 126.5 (2C), 129.5 (2C), 130.0, 134.8, 138.8, 140.1, 144.3, 146.9, 151.8, 155.2；IR (KBr, cm−1) 476, 511, 635, 700, 727, 806, 839, 913, 1026, 1084, 1169, 1213, 1279, 1348, 1402, 1464, 1516, 1603, 1643, 2859, 2951, 3142, 3300, 3372。
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(4−nitrophenyl)pyrazin−2−yl]acetamide (11o)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.00 g, 3.76 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (640 μL, 7.56 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(4−nitrophenyl)pyrazin−2−amine (7o) (317 mg, 751 μmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.3 mg, 125 μmol) を脱水ピリジン(15 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyl oxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1) で精製し、化合物11o (242 mg, 361 μmol, 48.1%) を黄色固体として得た。Rf =0.30 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.15 (s, 6H), 0.20 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 0.93 (s, 9H), 3.44 (s, 2H), 6.67−6.74 (AA’BB’, 2H), 6.94−7.07 (2AA’BB’, 4H), 7.80−7.86 (AA’BB’, 2H), 8.01−8.12 (2AA’BB’, 4H), 9.05 (s, 1H), 10.85 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ−4.5 (2C), −4.6 (2C), 17.9, 18.0, 25.50 (3C), 25.51 (3C), 41.6, 119.4 (2C), 120.4 (2C), 123.2 (2C), 127.4, 128.2, 128.52 (2C), 128.54 (2C), 130.4 (2C), 138.7, 143.0, 144.5, 145.0, 146.9, 147.9, 153.9, 156.9, 168.9；IR (KBr, cm−1) 700, 741, 781, 839, 914, 1169, 1265, 1348, 1443, 1508, 1603, 1670, 2857, 2930, 2955。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(4−nitrophenyl)pyrazin−2−yl]acetamide (4o, TMD−377)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(4−nitrophenyl)pyrazin−2−yl]acetamide (11o) (179 mg, 267 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.40 mL, 1.40 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) することで、化合物4o (TMD−377) (98.0 mg, 222 μmol, 83.0%) をオレンジ色固体として得た。Rf = 0.48 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 7.4 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.40 (s, 2H), 6.60−6.69 (AA’BB’, 2H), 6.86−6.93 (AA’BB’, 2H), 6.93−7.03 (AA’BB’, 2H), 7.81−7.89 (AA’BB’, 2H), 8.00−8.10 (2AA’BB’, 4H), 9.02 (s, 1H), 9.30 (s, 1H), 9.93 (s, 1H), 10.77 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ41.7, 115.0 (2C), 115.9 (2C), 123.2 (2C), 124.7, 126.1, 128.2 (2C), 128.6 (2C), 130.2 (2C), 138.4, 142.7, 144.5, 145.0, 146.9, 148.4, 156.3, 159.3, 169.2；IR (KBr, cm−1) 534, 640, 696, 756, 799, 843, 1013, 1080, 1107, 1171, 1236, 1346, 1437, 1516, 1609, 1670, 3250。
２−１６）TMD−378 (4p)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(phenylethynyl)pyrazin−2−amine (7p)
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (1.50 g, 3.94 mmol) をジエチルアミン (20 mL) に溶解した。これにcopper(I) iodide (450 mg, 2.36 mmol)、phenylacetylene (6p) (900 μL, 8.19 mmol) およびdichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II) (139 mg, 198 μmol) を順次加え、室温にて4時間攪拌した。これに水を加え、濾過により金属触媒を除去し、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (300 mL) および飽和食塩水 (300 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7p (1.56 g, 3.89 mmol, 98.6%) を褐色固体として得た。Rf = 0.52 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.17 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 6.75 (s, 2H), 6.85−6.92 (AA’BB’, 2H), 7.38−7.46 (m, 3H), 7.69−7.76 (m, 2H), 7.76−7.83 (AA’BB’, 2H), 8.50 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ −4.5 (2C), 17.9, 25.5 (3C), 85.4, 94.2, 120.1 (2C), 121.6, 121.8, 126.5 (2C), 128.6 (2C), 129.3, 129.9, 131.9 (2C), 138.8, 140.0, 154.8, 155.2；IR (KBr, cm−1) 529, 638, 689, 754, 781, 806, 824, 912, 1009, 1049, 1070, 1144, 1169, 1258, 1323, 1362, 1420, 1454, 1510, 1562, 1605, 2212, 2857, 2928, 2955, 3057, 3173, 3296, 3474。
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(phenylethynyl)pyrazin−2−yl]acetamide (11p)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.00 g, 3.76 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (640 μL, 7.56 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(phenylethynyl)pyrazin−2−amine (7p) (300 mg, 747 μmol) および4−(dimethylamino)pyridine (13.8 mg, 113 μmol) を脱水ピリジン(15 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyl oxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11p (291 mg, 448 μmol, 60.0%) を褐色固体として得た。Rf =0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.10 (s, 6H), 0.20 (s, 6H), 0.90 (s, 9H), 0.93 (s, 9H), 3.65 (s, 2H), 6.63−6.73 (AA’BB’, 2H), 6.92−7.02 (AA’BB’, 2H), 7.17−7.27 (AA’BB’, 2H), 7.33−7.48 (m, 5H), 7.96−8.05 (AA’BB’, 2H), 8.99 (s, 1H), 10.69 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ−4.60 (2C), −4.61 (2C), 17.8, 17.9, 25.5 (6C), 41.7, 85.8, 94.5, 119.5 (2C), 120.4 (2C), 121.2, 128.2, 128.28 (2C), 128.34, 128.6 (2C), 129.5, 130.3 (2C), 131.8 (2C), 133.1, 138.5, 146.6, 148.0, 153.8, 156.9, 169.4；IR (KBr, cm−1) 530, 689, 756, 781, 839, 914, 1007, 1125, 1169, 1258, 1379, 1433, 1510, 1605, 1672, 2214, 2857, 2930, 2955, 3235。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−(phenylethynyl)pyrazin−2−yl]acetamide (4p, TMD−378)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−(phenylethynyl)pyrazin−2−yl]acetamide (11p) (198 mg, 305 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.60 mL, 1.60 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) することで、化合物4p (TMD−378) (93.8 mg, 223 μmol, 73.1%) を黄色固体として得た。Rf = 0.48 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 10.0 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.58 (s, 2H), 6.60−6.70 (AA’BB’, 2H), 6.83−6.93 (AA’BB’, 2H), 7.10−7.19 (AA’BB’, 2H), 7.24−7.33 (m, 3H), 7.33−7.49 (m, 2H), 7.91−7.98 (AA’BB’, 2H), 8.94 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 10.60 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ41.8, 86.0, 94.4, 115.2 (2C), 115.9 (2C), 121.2, 125.6, 125.9, 128.3 (2C), 128.7 (2C), 129.7, 130.3 (2C), 131.9 (2C), 133.2, 138.3, 146.3, 148.6, 156.2, 1159.4, 169.7；IR (KBr, cm−1) 530, 615, 687, 758, 793, 839, 962, 1125, 1157, 1177, 1219, 1267, 1327, 1389, 1456, 1489, 1582, 1684, 2212, 3231, 3391。
２−１７）化合物4q
(Z)−5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−styrylpyrazin−2−amine (7q)
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(phenylethynyl)pyrazin−2−amine (7p) (100 mg, 249 μmol) を酢酸エチル (5 mL) に溶解した。これにLindlar’s catalyst (10% Pd) (40.0 mg) を加え、反応系中を水素に置換し、室温にて30時間攪拌した。反応系中をアルゴンに再度置換した後、ジクロロメタン (15 mL) を加え、室温にて1時間攪拌した。濾過後、有機層を水 (100 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 10 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物7q、7p、7rの混合物 (98.2 mg) を褐色油状物質として得た。
(Z)−2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−{5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−styrylpyrazin−2−yl}acetamide (11q)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (170 mg, 638 μmol) をCH2Cl2 (5 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (1 drop)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (110 μL, 1.30 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、7q、7p、7rの混合物 (50.3 mg) および4-(dimethylamino)pyridine (3.0 mg, 25 μmol) を脱水ピリジン(5 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (30 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (50 mL) および飽和食塩水 (100 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 10 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、11q、11p、11rの混合物 (60.0 mg) を黄色油状物質として得た。Rf = 0.20 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)。
化合物4qは、他のCTMD類縁体の合成実施例に記載の方法に準じて、上記化合物11qのTBDMS基を脱保護することにより製造することができる。
２−１８）TMD−379 (4r)
5−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−phenethylpyrazin−2−amine (7r)
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−(phenylethynyl)pyrazin−2−amine (7p) (400 mg, 996 μmol) を酢酸エチル (20 mL) に溶解した。これにpalladium/charcoal activated (10% Pd) (80.0 mg) を加え、反応系中を水素に置換し、室温にて3時間攪拌した。反応系中をアルゴンに再度置換した後、ジクロロメタン (15 mL) を加え、室温にて1時間攪拌した。濾過により触媒を除去し、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 40 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1) で精製し、化合物7r (403 mg, 994 μmol, 99.8%) を褐色油状物質として得た。Rf = 0.48 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.18 (s, 6H), 0.93 (s, 9H), 2.92 (t, 3H, J = 8.0 Hz), 3.05 (t, 3H, J= 8.0 Hz), 6.25 (s, 2H), 6.81−6.90 (AA’BB’, 2H), 7.10−7.18 (m, 1H), 7.18−7.35 (m, 4H), 7.75−7.85 (AA’BB’, 2H), 8.27 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ−4.5 (2C), 18.0, 25.6 (3C), 31.7, 34.0, 120.0 (2C), 125.7, 126.1 (2C), 128.2 (2C), 128.5 (2C), 130.9, 135.6, 138.5, 140.1, 141.9, 152.3, 154.6；IR (KBr, cm−1) 507, 635, 677, 698, 750, 781, 841, 914, 1009, 1103, 1146, 1167, 1213, 1254, 1389, 1420, 1454, 1512, 1605, 2857, 2928, 2955, 3061, 3318。
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−phenethylpyrazin−2−yl]acetamide (11r)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.40 g, 5.26 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (890 μL, 10.5 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]−3−phenethylpyrazin−2−amine (7r) (403 mg, 994 μmol) および4−(dimethylamino)pyridine (19.6 mg, 160 μmol) を脱水ピリジン(15 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy) phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1) で精製し、化合物11r (298 mg, 455 μmol, 45.8%) を黄色油状物質として得た。Rf =0.44 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.12 (s, 6H), 0.20 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.93 (s, 9H), 2.83 (t, 1H, J= 8.4 Hz), 2.94 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 3.59 (s, 2H), 6.72−6.79 (AA’BB’, 2H), 6.92−7.00 (AA’BB’, 2H), 7.01−7.07 (AA’BB’, 2H), 7.07−7.15 (m, 1H), 7.16−7.24 (m, 4H), 7.97−8.05 (AA’BB’, 2H), 8.81 (s, 1H), 10.44 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ −4.5 (2C), −4.6 (2C), 17.9, 18.0, 25.5 (6C), 32.8, 34.7, 41.7, 119.6 (2C), 120.3 (2C), 125.7, 128.1 (2C), 128.2 (4C), 128.5, 129.1, 130.2 (2C), 130.3, 136.6, 141.4, 143.8, 147.9, 150.6, 153.8, 156.6, 170.3；IR (KBr, cm−1) 525, 698, 781, 839, 914, 1007, 1169, 1258, 1362, 1416, 1443, 1510, 1605, 1661, 2857, 2930, 2955, 3225。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)−3−phenethylpyrazin−2−yl]acetamide (4r, TMD−379)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}−3−phenethylpyrazin−2−yl]acetamide (11r) (197 mg, 301 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (1.50 mL, 1.50 mmol) を加え、室温に昇温しながら30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/酢酸エチル) することで、化合物4r (TMD−379) (100 mg, 236 μmol, 78.3%) を黄色固体として得た。Rf = 0.44 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 9.5 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ2.81 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 2.92 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 3.52 (s, 2H), 6.62−6.72 (AA’BB’, 2H), 6.80−6.90 (AA’BB’, 2H), 6.98−7.05 (AA’BB’, 2H), 7.07−7.16 (m, 3H), 7.16−7.24 (m, 2H), 7.90−7.98 (AA’BB’, 2H), 8.76 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 10.35 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ33.0, 34.8, 41.7, 115.2 (2C), 115.8 (2C), 125.8, 126.6, 128.1 (2C), 128.26 (2C), 128.29 (2C), 128.6, 130.1 (2C), 136.4, 141.5, 143.4, 148.5, 150.7, 156.2, 159.0, 170.6；IR (KBr, cm−1) 519, 606, 692, 839, 966, 1157, 1223, 1265, 1373, 1452, 1516, 1595, 1674, 3273。
２−１９）TMD−348 (4s)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl} pyrazin−2−yl]acetamide (11s)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.00 mL, 11.8 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (7s) (350 mg, 1.16 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 123 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で20時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 7/1) で精製し、化合物11s (478 mg, 869 μmol, 74.8%) を黄色泡状固体として得た。Rf =0.19 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 6/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ 0.14 (s, 6H), 0.19 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.94 (s, 9H), 3.66 (s, 2H), 6.75−6.82 (AA’BB’, 2H), 6.91−6.97 (AA’BB’, 2H), 7.17−7.24 (AA’BB’, 2H), 7.93−8.00 (AA’BB’, 2H), 8.90 (d, 1H, J= 1.4 Hz), 9.28 (d, 1H, J = 1.4 Hz), 10.99 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ −4.6 (4C), 17.8, 17.9, 25.46 (3C), 25.47 (3C), 41.8, 119.6 (2C), 120.2 (2C), 127.5 (2C), 128.2, 129.2, 130.4 (2C), 134.9, 138.7, 146.3, 147.0, 153.8, 156.2, 170.3；IR (KBr, cm−1) 417, 517, 575, 638, 681, 708, 781, 806, 839, 914, 1009, 1051, 1103, 1167, 1260, 1354, 1416, 1468, 1508, 1545, 1605, 1670, 2857, 2886, 2930, 2955, 3034, 3063；HRMS (ESI+) m/z 550.2930 ([M+H]+, C30H44N3O3Si2 +requires 550.2916)。
2−(4−Hydroxyphenyl)−N−[5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]acetamide (4s, TMD−348)
2−[4−(tert−Butyldimethylsilyloxy)phenyl]−N−[5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl} pyrazin−2−yl]acetamide (11s) (300 mg, 546 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (2.80 mL, 2.80 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4s (TMD−348) (191 mg, 422 μmol, 95.8%) を褐色固体として得た。Rf = 0.51 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 4.9 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.57 (s, 1H), 6.62−6.70 (AA’BB’, 2H), 6.79−6.84 (AA’BB’, 2H), 7.06−7.12 (AA’BB’, 2H), 7.83−7.92 (AA’BB’, 2H), 8.82 (d, 1H, J= 1.4 Hz), 9.22 (d, 1H, J = 1.4 Hz), 9.23 (s, 1H), 9.75 (s, 1H), 10.86 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ 41.9, 115.2 (2C), 115.8 (2C), 125.7, 126.8, 127.7 (2C), 130.3 (2C), 134.9, 138.4, 146.7, 146.9, 156.3, 158.7, 170.7；IR (KBr, cm−1) 419, 519, 613, 681, 804, 837, 910, 1020, 1051, 1107, 1171, 1252, 1356, 1443, 1508, 1541, 1611, 1676, 3026, 3354；HRMS (FAB+/grycerol) m/z 322.1187 ([M+H]+, C18H16N3O3 +requires 322.1192)。
２−２０）TMD−349 (4t)
N−[3−Bromo−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldi methylsilyloxy)phenyl]acetamide (11t)
アルゴン雰囲気下、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetic acid (9) (1.55 g, 5.82 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解した。これにパスツールピペットを用いてDMF (3 drops)を加えた。これを0 ℃に冷却後、oxalyl dichloride (1.00 mL, 11.8 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これを減圧濃縮することで、2−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) を無色油状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、3−bromo−5−[4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl]pyrazin−2−amine (5) (443 mg, 1.16 mmol) および4−(dimethylamino)pyridine (15.2 mg, 124 μmol) を脱水ピリジン(20 mL) に溶解した。この溶液を0 ℃に冷却後、上記で調製した2−[4−(tert−butyldimethyl silyloxy)phenyl]acetyl chloride (10) に加え、50 ℃で19時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物を酢酸エチル (200 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1) で精製し、化合物11t (431 mg, 685 μmol, 58.9%) を黄色泡状固体として得た。Rf = 0.22 (n−ヘキサン/ジエチルエーテル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ0.15 (s, 6H), 0.21 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.94 (s, 9H), 3.61 (s, 2H), 6.74−6.82 (AA’BB’, 2H), 6.94−7.01 (AA’BB’, 2H), 7.16−7.23 (AA’BB’, 2H), 7.94−8.01 (AA’BB’, 2H), 9.03 (s, 1H), 10.54 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ−4.6 (4C), 17.89, 17.93, 25.46 (3C), 25.52 (3C), 41.5, 119.6 (2C), 120.5 (2C), 127.3, 128.1, 128.4 (2C), 130.4 (2C), 136.3, 138.0, 144.6, 149.1, 153.8, 157.2, 169.8；IR (KBr, cm−1) 467, 521, 623, 685, 716, 781, 802, 839, 914, 1007, 1047, 1078, 1107, 1169, 1256, 1333, 1362, 1412, 1441, 1474, 1508, 1566, 1605, 1672, 2857, 2886, 2930, 2955, 3032, 3057, 3231；HRMS (ESI+) m/z 650.1839 ([M+Na]+, C30H42BrN3NaO3Si2 +requires 650.1840)。
N−[3−Bromo−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−hydroxyphenyl)acetamide (4t, TMD−349)
N−[3−Bromo−5−{4−(tert−butyldimethylsilyloxy)phenyl}pyrazin−2−yl]−2−[4−(tert−butyldi methylsilyloxy)phenyl]acetamide (11t) (290 mg, 461 μmol) をTHF (5 mL) に溶解した。これを0 ℃に冷却後、tetrabutylammonium fluoride (1.0 M THF溶液) (2.30 mL, 2.30 mmol) を加え、室温に昇温しながら1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液 (50 mL) を加え、生成物を酢酸エチル (100 mL×3) を用いて抽出した。有機層を水 (200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣を再結晶 (n−ヘキサン/エタノール) することで、化合物4t (TMD−349) (147 mg, 367 μmol, 79.5%) を褐色固体として得た。Rf = 0.50 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；HPLC retention time 5.5 min；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.54 (s, 2H), 6.65−6.71 (AA’BB’, 2H), 6.83−6.89 (AA’BB’, 2H), 7.08−7.14 (AA’BB’, 2H), 7.87−7.95 (AA’BB’, 2H), 8.97 (s, 1H), 9.25 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 10.45 (s, 1H)；13C NMR (75.5 MHz, DMSO−d6) δ41.5, 115.2 (2C), 116.0 (2C), 124.8, 125.4, 128.5 (2C), 130.3 (2C), 136.6, 137.7, 144.2, 149.8, 156.2, 159.8, 170.2；IR (KBr, cm−1) 519, 623, 795, 839, 1047, 1080, 1173, 1229, 1271, 1339, 1449, 1483, 1516, 1609, 1676, 3275；HRMS (ESI+) m/z422.0119 ([M+Na]+, C18H14BrN3NaO3 +requires 422.0111)。
[合成例３] C−2位を改変したセレンテラミド（CTMD）類縁体
３−１）TMD−331 (4u)
1−[3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−(4−methoxyphenyl)urea (11u)
アルゴン雰囲気下、3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−amine (12) (M. Adamczyk, et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001) の方法にて合成) (306 mg, 1.05 mmol) を脱水1,2−ジクロロエタン (10 mL) に溶解し、これに室温にて4−methoxyphenyl isocyanate (13) (191μL, 1.00 mmol) を加え、80 ℃で19時間攪拌した。室温まで放冷後、析出した固体をろ過により集め、真空乾燥を行うことで粗生成物(293 mg, <664μmol, <63.2%) を無色固体として得た。この一部 (93.0 mg, <211μmol) をメタノールを用いて再結晶し、化合物11u (54.9 mg, 125μmol, 59.2%) を無色固体として得た。Rf = 0.50 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.73 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 4.36 (s, 2H), 6.98−6.93 (AA’BB’, 2H), 7.02−7.08 (AA’BB’, 2H), 7.17−7.25 (m, 1H), 7.28−7.32 (m, 4H), 7.43−7.48 (AA’BB’, 2H), 7.95−8.01 (AA’BB’, 2H), 8.79 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 10.58 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ 38.5, 55.18, 55.24, 114.0 (2C), 114.4 (2C), 121.1 (2C), 126.3, 127.2 (2C), 128.2, 128.3 (2C), 129.0 (2C), 131.7, 134.5, 137.9, 144.4, 145.0, 145.4, 152.2, 155.1, 160.1；IR (KBr, cm−1) 704, 746, 824, 1038, 1173, 1242, 1329, 1369, 1416, 1481, 1510, 1570, 1607, 1668, 2833, 3030, 3261；Anal. Calcd. For C26H24N4O3: C, 70.89; H, 5.49; N, 12.72. Found: C, 70.66; H, 5.49; N, 12.61。
1−[3−Benzyl−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−(4−hydroxyphenyl)urea (4u, TMD−331)
アルゴン雰囲気下、1−[3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−(4−methoxy phenyl)urea (11u) (200 mg, 454μmol) を脱水ジクロロメタン (10 mL) に溶解し、これに室温にて三臭化ホウ素 (1.0 Mジクロロメタン溶液, 2.27 mL, 2.27 mmol) を加えた後、24時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過することで固体を集めた後、これを乾燥し、粗生成物 (180 mg) を無色固体として得た。これを、酢酸エチル/メタノールを用いて再結晶し、化合物4u (TMD−331) (98.2 mg, 238 μmol, 52.4%) を無色固体として得た。Rf = 0.66 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ4.35 (s, 2H), 6.69−6.74 (AA’BB’, 2H), 6.84−6.88 (AA’BB’, 2H), 7.17−7.24 (m, 1H), 7.27−7.33 (m, 5H), 7.84−7.89 (AA’BB’, 2H), 8.72 (s. 1H), 8.95 (s, 1H), 9.19 (s, 1H), 9.79 (s, 1H), 10.49 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ 38.5, 115.3 (2C), 115.7 (2C), 121.5 (2C), 126.3, 126.7, 127.4 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 130.1, 134.2, 138.0, 144.8, 145.2, 152.3, 153.3, 158.5；IR (KBr, cm−1) 519, 637, 702, 750, 835, 1105, 1171, 1223, 1246, 1369, 1445, 1481, 1508, 1578, 1609, 1681, 3035, 3256；Anal. Calcd. For C24H20N4O3: C, 69.89; H, 4.89; N, 13.58. Found: C, 69.58; H, 5.05; N, 13.37。
３−２）TMD−332 (4v)
1−[3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−(4−methoxyphenyl)thiourea (11v)
アルゴン雰囲気下、3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−amine (12) (M. Adamczyk, et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001) の方法にて合成) (291 mg, 1.00 mmol) を脱水DMF (5 mL) に溶解し、これに室温にて水素化ナトリウム(43.6 mg, 1.00 mmol) を加えた。これに0 ℃にて4−methoxyphenyl isothiocyanate (14) (182 mg, 1.10 mmol) の脱水DMF溶液 (2 mL) を加え、室温に昇温後、5.5時間攪拌した。これに2 M HCl水溶液を加え、生じた固体をろ過により集めた。これをカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 30 g, n−ヘキサン/酢酸エチル/ジクロロメタン = 57/3/40) にて精製し、不純物を含む生成物 (327 mg, <716μmol) を黄色固体として得た。これを、酢酸エチルを用いて再結晶し、化合物11v (255 mg, 559μmol, 55.9%) を黄色固体として得た。Rf = 0.24 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.75 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 4.42 (s, 2H), 6.90−6.96 (AA’BB’, 2H), 7.03−7.09 (AA’BB’, 2H), 7.20−7.26 (m, 1H), 7.30−7.36 (m, 4H), 7.38−7.45 (AA’BB’, 2H), 7.99−8.05 (AA’BB’, 2H), 8.83 (s, 1H), 9.65 (s, 1H), 11.76 (br s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ 38.9, 55.2 (2C), 113.7 (2C), 114.4 (2C), 126.2 (2C), 126.5, 127.5 (2C), 128.0, 128.5 (2C), 129.0 (3C), 131.6, 134.7, 137.5, 144.9, 145.7, 157.1, 160.4, 179.0；IR (KBr, cm−1) 581, 700, 741, 799, 833, 897, 1022, 1070, 1146, 1248, 1283, 1333, 2037, 2351, 2835, 2988, 3395；Anal. Calcd. For C26H24N4O2S: C, 68.40; H, 5.30; N, 12.27. Found: C, 68.47; H, 5.20; N, 12.26。
1−[3−Benzyl−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−(4−hydroxyphenyl)thiourea (4v, TMD−332)
アルゴン雰囲気下、1−[3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−(4−methoxy phenyl)thiourea (11v) (136 mg, 299μmol) を脱水ジクロロメタン (7 mL) に溶解し、これに室温にて三臭化ホウ素 (1.0 Mジクロロメタン溶液, 1.50 mL, 1.50 mmol) を加えた後、18時間加熱還流した。室温まで放冷後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過することで固体を集め、これを乾燥し、粗生成物 (126 mg) を橙色固体として得た。これを、酢酸エチルを用いて再結晶し、化合物4v (TMD−332) (80.6 mg, 188μmol, 62.9%) を橙色固体として得た。Rf = 0.48 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ4.40 (s, 2H), 6.70−6.76 (AA’BB’, 2H), 6.84−6.90 (AA’BB’, 2H), 7.20−7.35 (m, 7H), 7.88−7.94 (AA’BB’, 2H), 8.76 (s, 1H), 9.47 (s, 1H), 9.53 (s, 1H), 9.85 (s, 1H), 11.71 (br s, 1H)；IR (KBr, cm−1) 542, 584, 700, 741, 837, 1157, 1215, 1263, 1342, 1395, 1449, 1510, 1578, 1609, 2941, 3032, 3273, 3406；HRMS (ESI+) m/z 429.1382 ([M+H]+, C24H21N4O2S+requires 429.1380)。
３−３）TMD−330 (4w)
N−[3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−methoxyphenyl)propanamide (11w)
アルゴン雰囲気下、2−(4−methoxyphenyl)propanoic acid (I. Shiina, et al., Eur. J. Org. Chem., 5887-5890 (2008) の方法にて合成) (1.20 g, 6.66 mmol) を塩化チオニル (6.00 mL, 82.6 mmol) に溶解し、27時間加熱還流した。室温まで放冷後、これを減圧濃縮することで、2−(4−methoxyphenyl)propanoyl chloride (16) の粗生成物を無色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−amine (12) (M. Adamczyk, et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001) の方法にて合成) (500 mg, 1.72 mmol) をピリジン (8 mL) に溶解し、これに室温にて4−(ジメチルアミノ)ピリジン (21.0 mg, 172 μmol) を加えた。この溶液を室温にて、上記で調製した2−(4−methoxyphenyl)propanoyl chloride (16) に加え、55 ℃で14時間加熱攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物をジクロロメタンを用いて抽出した(×3)。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過、減圧濃縮し、残渣に残ったピリジンを、トルエンを用いて共沸除去した(×3)。残渣を二度のカラムクロマトグラフィー (シリカゲル50 g, ジクロロメタン/酢酸エチル = 9/1、及びシリカゲル50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 9/1 → 6/1) にて精製し、不純物を含む粗生成物である化合物11w (942 mg, <quant.) を白色アモルファスとして得た。

N−[3−Benzyl−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−hydroxyphenyl)propanamide (4w, TMD−330)
アルゴン雰囲気下、N−[3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−2−(4−methoxy phenyl)propanamide (11w) (500 mg, <1.10 mmol) の粗生成物を脱水ジクロロメタン (20 mL) に溶解し、これに室温にて三臭化ホウ素 (1.0 Mジクロロメタン溶液, 5.50 mL, 5.50 mmol) を加えた後、21時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過することで固体を集めた後、これを乾燥し、粗生成(330 mg) を褐色固体として得た。これを、メタノールを用いて再結晶し、化合物4w (TMD−330) (112 mg, 263μmol, <23.9% (2 steps)) を無色固体として得た。Rf = 0.26 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ1.37 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 3.81 (q, 1H, J = 7.0 Hz), 3.84−4.00 (m, 2H), 6.72−6.79 (AA’BB’, 2H), 6.85−6.96 (m, 4H), 7.09−7.19 (m, 3H), 7.21−7.27 (AA’BB’, 2H), 7.90−7.98 (AA’BB’, 2H), 8.79 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 10.30 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ 18.3, 44.3, 115.2 (2C), 115.7 (2C), 126.1, 126.5, 128.0 (2C), 128.1 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 131.6, 136.8, 138.3, 143.3, 148.6, 150.6, 156.3, 159.1, 173.4 (ベンジル位の一つの炭素のピークがDMSOの7重線と重なったため測定値が不明)；IR (KBr, cm−1) 530, 596, 700, 725, 837, 924, 1171, 1225, 1267, 1319, 1375, 1450, 1487, 1545, 1611, 1670, 2976, 3310；HRMS (ESI+) m/z448.1644 ([M+Na]+, C26H23N3NaO3 +requires 448.1632)。
３−４）TMD−365 (4x)
N−[3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−4−methoxybenzamide (11x)
3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−amine (12) (M. Adamczyk, et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001) の方法にて合成) (500 mg, 1.72 mmol) をピリジン (5 mL) に溶解し、これに室温にて4−(ジメチルアミノ)ピリジン (21.0 mg, 172μmol) 及び4−methoxybenzoyl chloride (17) (587 mg, 3.44 mmol) を順次加えた後、50 ℃で17時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物をジクロロメタンで抽出し(×3)、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過、減圧濃縮し、残渣に残ったピリジンを、トルエンを用いて共沸除去した(×3)。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル50g, ジクロロメタン/酢酸エチル = 9/1) にて精製し、さらに、酢酸エチルを用いて再結晶し、化合物11x (592 mg, 1.39 mmol, 80.8%) を無色固体として得た。Rf = 0.63 (ジクロロメタン/酢酸エチル = 9/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.83 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 4.17 (s, 2H), 7.04−7.11 (m, 4H), 7.14−7.26 (m, 5H), 7.93−7.98 (AA’BB’, 2H), 8.05−8.11 (AA’BB’, 2H), 8.96 (s, 1H), 10.63 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO + CDCl3) δ 40.3, 54.7, 54.8, 112.9 (2C), 113.7 (2C), 125.4, 125.7, 127.4 (2C), 127.7 (2C), 128.0, 128.5 (2C), 129.4 (2C), 136.2, 137.6, 143.6, 148.2, 150.4, 160.1, 162.0, 165.5；IR (KBr, cm−1) 700, 743, 843, 1030, 1159, 1177, 1258, 1290, 1452, 1485, 1514, 1535, 1580, 1609, 1643, 3242；Anal. Calcd. For C26H23N3O3: C, 73.39; H, 5.45; N, 9.88. Found: C, 73.48; H, 5.40; N, 9.94。
N−[3−Benzyl−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−4−hydroxybenzamide (4x, TMD−365)
アルゴン雰囲気下、N−[3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−4−methoxybenzamide (11x) (300 mg, 705μmol) を脱水ジクロロメタン (15 mL) に溶解し、これに室温にて三臭化ホウ素 (1.0 Mジクロロメタン溶液, 3.53 mL, 3.53 mmol) を加えた後、17時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過することで固体を集めた後、これを乾燥し、粗生成物 (288 mg) を褐色固体として得た。これをカラムクロマトグラフィー (シリカゲル30 g, n−ヘキサン/酢酸エチル= 2/3) にて精製し、さらに、酢酸エチルを用いて再結晶し、化合物4x (TMD−365) (119 mg, 300μmol, 42.6%) を黄色固体として得た。Rf = 0.46 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ4.14 (s, 2H), 6.83−6.92 (m, 4H), 7.12−7.27 (m, 5H), 7.81−7.88 (AA’BB’, 2H), 7.93−7.99 (AA’BB’, 2H), 8.88 (s, 1H), 9.89 (br s, 1H), 10.19 (br s, 1H), 10.49 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ 40.0, 115.0 (2C), 115.8 (2C), 124.1, 126.2, 126.5, 128.1 (2C), 128.2 (2C), 129.0 (2C), 130.1 (2C), 136.9, 138.4, 144.1, 148.6, 151.3, 159.1, 161.0, 165.9；IR (KBr, cm−1) 621, 708, 754, 835, 1172, 1215, 1248, 1284, 1368, 1394, 1439, 1485, 1601, 1655, 3030, 3298。
３−５）TMD−366 (4y)
N−[3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−methoxybenzamide (11y)
3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−amine (12) (M. Adamczyk, et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001) の方法にて合成) (800 mg, 2.75 mmol) をピリジン (10 mL) に溶解し、これに室温にて4−(ジメチルアミノ)ピリジン (33.6 mg, 275μmol) 及びm−anisoyl chloride (18) (773μL, 5.50 mmol) を順次加えた後、50 ℃で22時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物ジクロロメタンを用いて抽出し(×3)、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過、減圧濃縮し、残渣に残ったピリジンを、トルエンを用いて共沸除去した(×3)。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル100 g, ジクロロメタン/酢酸エチル = 9/1) にて精製した。これを、酢酸エチルを用いて再結晶し、化合物11y (967 mg, 2.27 mmol, 82.5%) を無色固体として得た。Rf = 0.63 (ジクロロメタン/酢酸エチル = 9/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.83 (s, 6H), 4.19 (s, 2H), 7.05−7.12 (AA’BB’, 2H), 7.14−7.28 (m, 6H), 7.42−7.49 (m, 2H), 7.53 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 8.06−8.12 (AA’BB’, 2H), 8.98 (s, 1H), 10.77 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, CDCl3) δ41.5, 55.3, 55.4, 112.5, 114.3 (2C), 118.6, 119.3, 126.7 (2C), 128.1, 128.55, 128.61 (2C), 128.5 (2C), 129.6, 135.0, 136.8, 137.7, 143.3, 149.2, 149.9, 159.8, 160.9, 165.7；IR (KBr, cm−1) 700, 746, 833, 1022, 1040, 1117, 1179, 1254, 1300, 1325, 1373, 1416, 1441, 1501, 1607, 1655, 2936, 3265；Anal. Calcd. For C26H23N3O3: C, 73.39; H, 5.45; N, 9.88. Found: C, 73.55; H, 5.36; N, 9.86。
N−[3−benzyl−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−3−hydroxybenzamide (4y, TMD−366)
アルゴン雰囲気下、N−(3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl)−3−methoxybenzamide (11y) (300 mg, 705μmol) を脱水ジクロロメタン (15 mL) に溶解し、これに室温にて三臭化ホウ素 (1.0 Mジクロロメタン溶液, 3.53 mL, 3.53 mmol) を加えた後、19時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過することで固体を集めた後、これを乾燥し、粗生成物 (343 mg) を橙色固体として得た。これをカラムクロマトグラフィー (シリカゲル50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル= 2/3) にて精製した。これを酢酸エチルにより再結晶を行い、化合物4y (TMD−366) (193 mg, 486μmol, 68.9%) を淡黄色固体として得た。Rf = 0.32 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ4.16 (s, 2H), 6.86−6.92 (AA’BB’, 2H), 6.98−7.03 (m, 1H), 7.14−7.27 (m, 5H), 7.29−7.40 (m, 3H), 7.94−8.00 (AA’BB’, 2H), 8.90 (s, 1H), 9.78 (br s, 1H), 9.90 (br s, 1H), 10.65 (s, 1H)；13C NMR (67.8 MHz, DMSO−d6) δ 114.8, 115.8 (2C), 118.4, 119.0, 126.2, 126.4, 128.1 (2C), 128.3 (2C), 129.0 (2C), 129.5, 135.0, 137.0, 138.3, 143.8, 148.9, 151.3, 157.4, 159.1, 166.3 (ベンジル位の一つの炭素のピークがDMSOの7重線と重なったため測定値が不明)；IR (KBr, cm−1) 596, 683, 708, 748, 843, 1165, 1209, 1250, 1269, 1304, 1371, 1443, 1503, 1520, 1595, 1649, 3254。
３−６）TMD−368 (4z)
N−[3−Benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−6−methoxy−N−(6−methoxy−1−naphthoyl)−1−naphthamide (11z)
アルゴン雰囲気下、6−methoxy−1−naphthoic acid (J. D. Moseley and J. P. Gilday, Tetrahedron, 62, 4690-4697 (2006) の方法にて合成) (1.20 g, 5.93 mmol) を塩化チオニル(5.00 mL, 68.8 mmol) に溶解し、3時間加熱還流した。室温まで放冷後、これを減圧濃縮することで、6−methoxy−1−naphthoyl chloride (22) の粗生成物を無色油状として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−amine (12) (M. Adamczyk, et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477-485 (2001) の方法にて合成) (500 mg, 1.72 mmol) をピリジン (5 mL) に溶解し、これに室温にて4−(ジメチルアミノ)ピリジン (21.0 mg, 172μmol) を加えた。この溶液を上記で調製した6−methoxy−1−naphthoyl chloride (22) に加え、50 ℃で18時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、生成物をジクロロメタンを用いて抽出し(×3)、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。濾過、減圧濃縮後、残渣に残ったピリジンを、トルエンを用いて共沸除去(×3) した。残査を二度のカラムクロマトグラフィー (シリカゲル50 g, ジクロロメタン/酢酸エチル = 9/1、及びシリカゲル50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1) で順次精製し、不純物を含む化合物11z (775 mg, 1.17 mmol, <68.3%) を茶色アモルファスとして得た。Rf = 0.21 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ3.82 (s, 3H), 3.83 (s, 6H), 4.39 (s, 2H), 7.04−7.09 (AA’BB’, 2H), 7.15−7.23 (m, 6H), 7.26−7.31 (m, 1H), 7.34−7.41 (m, 4H), 7.63−7.69 (m, 2H), 7.75−7.80 (AA’BB’, 2H), 8.02−8.08 (m, 4H), 9.07 (s, 1H)。
N−[3−Benzyl−5−(4−hydroxyphenyl)pyrazin−2−yl]−6−hydroxy−1−naphthamide (4z, TMD−368)
アルゴン雰囲気下、N−[3−benzyl−5−(4−methoxyphenyl)pyrazin−2−yl]−6−methoxy−N−(6−methoxy−1−naphthoyl)−1−naphthamide (11z) (500 mg, <758 μmol) の粗生成物を脱水ジクロロメタン (15 mL) に溶解した。これに三臭化ホウ素 (1.0 Mジクロロメタン溶液, 3.15 mL, 3.15 mmol) を加え、18時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、減圧濃縮中に得られた懸濁液中の固体を濾過により集め、これを乾燥することで、粗生成物(294 mg, 657μmol, <86.7%)を褐色固体として得た。これを酢酸エチルを用いて二度再結晶し、化合物4z (TMD−368) (10.0 mg, 22.3 μmol, 2.9%) を淡黄色固体として得た。Rf = 0.46 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)；1H NMR (400 MHz, DMSO−d6) δ4.32 (s, 2H), 6.85−6.94 (AA’BB’, 2H), 7.10−7.16 (m,1H), 7.17−7.33 (m, 6H), 7.34−7.40 (m, 1H), 7.41−7.47 (m, 1H), 7.82−7.88 (m, 1H), 7.94−8.02 (AA’BB’, 2H), 8.04−8.09 (m, 1H), 8.92 (s, 1H), 9.91 (s, 2H), 10.83 (s, 1H)。
以下では、上記合成例の化合物3a、3b、3d〜3jを、単に「セレンテラジン類縁体」とよび、また、化合物4a〜4zを、単に「セレンテラミド類縁体」とよぶ場合がある。
［実施例１］
基質特異性解析用の半合成イクオリンの作製及び発光活性の測定
以下の半合成イクオリンの作製には、チッソ社製の組換えアポイクオリンを使用した。この組換えアポイクオリンは、Inouye, S. and Hosoya. T. Biochem. Biophys. Res. Commun (2009) 386: 612−622に記載の方法に従って発現し、精製したものである。
（１）半合成イクオリンの作製
10 mM EDTAを含む30 mM Tris−HCl（pH7.6）1 ml に 2−メルカプトエタノール 1μl、組換えアポイクオリン溶液（チッソ社製）1.31μgを加えて混合した。次いでエタノールに溶解したセレンテラジン又はその類縁体 1μl を加えて4 ℃で18時間放置し、半合成イクオリンへと変換した。
(２)発光活性の測定法
上記発光活性の測定は、具体的には、次のように行った。各再生過程の半合成イクオリン溶液2μlに、50 mM 塩化カルシウム溶液を含む50 mM Tris−HCl（pH7.6）100μlを加えることにより発光反応を開始した。発光活性は、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200（アトー社製）にて10秒間測定し、最大発光強度値（Imax）で示した。また、10秒間の発光積算を行ない発光能力とした。
その結果を下記表1にまとめた。セレンテラジン類縁体を含む半合成イクオリンは、発光の最大活性は低いものの、発光活性を十分検出可能な発光強度であった。
［実施例２］
半合成イクオリンの発光パターンと半減時間の測定法
再生した半合成イクオリン溶液を、0.1% BSA（シグマ社製）及び0.01 mM EDTA、150 mM NaCl を含む20 mM Tris−HCl （pH7.6）にて10倍希釈し、96 穴マイクロプレート（Nunc #236108）に5μl／ウェルで分注した。発光プレートリーダーCentro LB960 （ベルトールド社製）を用いて、50 mM 塩化カルシウム溶液を含む50 mM Tris−HCl（pH7.6）を100μl／ウェルで注入することにより発光反応を開始した。60秒間の発光パターンを測定し、発光の半減衰時間（最大発光強度値の半分になるまでの時間）を求めた。
その結果を下記表1にまとめた。セレンテラジンより調製した天然型イクオリンの半減期（0.81秒）と比較して、セレンテラジン類縁体より調製した半合成イクオリンの半減期は長く、特に、3a, 3e, 3f, 3jのセレンテラジン類縁体より調製した半合成イクオリンの半減期は、著しく長くなることが明らかとなった。
［実施例３］
半合成イクオリンの発光スペクトル測定法
光路長10 mmの石英セルに、1 mM EDTAを含む50 mM Tris−HCl（pH7.6）1 ml、再生した半合成イクオリン溶液100μl（100μg蛋白質）を加えて混合し、次いで0.1 mlの10 mM 塩化カルシウム溶液を含む50 mM Tris−HCl（pH7.6）100μlを加えて発光反応を開始させ、蛍光測定装置（日本分光社製、FP−6500）の励起光源をオフにして測定した。測定条件は、バンド幅：20 nm、レスポンス：0.5秒、走査速度：2000 nm／分、22〜25℃である。測定発光スペクトルは、スペクトル補正を行なった。
その結果を下記表1にまとめた。セレンテラジンより調製した天然型イクオリンの最大発光波長472,5 nm と比較すると、3a, 3e, 3f, 3hのセレンテラジン類縁体より調製した半合成イクオリンは、最大発光波長が、約20 nmから 60 nm長波長へ波長移動することが明らかとなった。一方、3b, 3jのセレンテラジン類縁体より調製した半合成イクオリンは、最大発光波長が、約15 nm から25.5 nm短波長へ波長移動することが明らかとなった。
また、図１に示すように、セレンテラジン類縁体により調製した半合成イクオリンは幅広いスペクトルもつことが明らかとなった。
［実施例４］
半合成イクオリンより生成した新規蛍光蛋白質の蛍光スペクトル測定
実施例３で半合成イクオリンを発光させることにより生成した新規蛍光蛋白質の蛍光スペクトルを、JascoのFP−6500蛍光分光光度計（励起波長330 nm: 発光／励起帯域幅: 3 nm、レスポンス：0.5 sec、スキャン速度：1000nm/分）により、石英セル（光路長10mm）を用いて25℃で測定した。測定蛍光スペクトルは、スペクトル補正を行なった。
その結果を下記表２にまとめた。測定した全てのサンプルにおいて、蛍光能があることが明らかとなった。また、その蛍光スペクトルを図２にまとめた。3a, 3b, 3e, 3f, 3h, 3jのセレンテラジン類縁体由来の蛍光蛋白質の蛍光スペクトルは、半合成イクオリンの発光スペクトルと比較すると、異なるものであった。特に、3b, 3e, 3jのセレンテラジン類縁体については、半合成イクオリンの発光スペクトルとカルシウム添加により生成した蛍光蛋白質の蛍光スペクトルが著しく異なるものであった。これは、同じセレンテラジン類縁体由来の半合成イクオリンと蛍光蛋白質であるにもかかわらず、発光スペクトルと蛍光スペクトルが異なることを示した最初の例である。
［実施例５］
カルシウム標準液の調製
1 g／L の炭酸カルシウム標準液（和光純薬社製）1 mlを50 mM Tris−HCl（pH7.6）9 mlに溶解し、10−3 M 炭酸カルシウム溶液を調製した。得られた10−3 M 炭酸カルシウム溶液を1 ml 取り、50 mM Tris−HCl（pH7.6）9 mlに加えて、10−4M 炭酸カルシウム溶液を調製した。更に、得られた10−4M 炭酸カルシウム溶液を3 ml取り、50 mM Tris−HCl（pH7.6）6 mlに加えて、3×10−4M 炭酸カルシウム溶液を調製した。得られた10−4M 炭酸カルシウム溶液を1 ml取り、50 mM Tris−HCl（pH7.6）9 mlに加えて、10−5 M 炭酸カルシウム溶液を調製した。更に得られた10−5 M 炭酸カルシウム溶液を3 ml取り、50 mM Tris−HCl（pH7.6）6 mlに加えて、3×10−5 M 炭酸カルシウム溶液を調製した。上記の方法により順次希釈系列を作製し、10−3 M〜10−8 Mのカルシウム標準液を調製した。
［実施例６］
カルシウム濃度検出用の半合成イクオリンの作製
組換えアポイクオリン（チッソ社製）5 mgを、10 mM DTT及び30 mM EDTAを含む50 mM Tris−HCl（pH7.6）5 mlに溶解し、これにエタノールに溶解した1.2 倍等量のセレンテラジン類縁体 100μgを加えて4 ℃で一昼夜放置し、半合成イクオリンへと変換した。得られた半合成イクオリンを、アミコンウルトラ−４（ミリポア社製、分子量10,000カット）で濃縮後、0.05 mM EDTAを含む30 mM Tris−HCl （pH7.6）3 mlで3 回洗浄し、余剰のセレンテラジン類縁体を除き、EDTA濃度を0.05 mMとした。この半合成イクオリン溶液（2.5 mg／ml）を0.1 % BSA（シグマ社製）及び0.01 mM EDTA、150 mM NaCl を含む20 mM Tris−HCl（pH7.6）にて希釈した。
［実施例７］
カルシウム標準曲線の作成
上記の様に作製したカルシウム標準液を96 穴マイクロプレート（Nunc #236108）に50μl／ウェル分注し、発光プレートリーダーCentro LB960 （ベルトールド社製）にて、希釈した半合成イクオリン溶液を10μl／ウェル注入して発光強度を60秒間測定し、最大発光強度値（Imax）で示した。それぞれの半合成イクオリンにて同様に測定を行い、得られた各最大発光強度値（Imax）から、各半合成イクオリンの内、実用に使用可能な半合成イクオリンについて、カルシウム標準曲線を作成した。
その結果を図３に示す。図３に示されるように、本発明のセレンテラジン類縁体（3a,3b,3d,3e,3f,3h,3j）から製造した半合成イクオリンを用いて、カルシウム標準曲線を作成することができることから、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出又は定量等に使用することができることが分かる。
［実施例８］
エビルシフェラーゼの19 kDa蛋白の基質特異性解析及び発光活性の測定法
エビ(Oplophorus)ルシフェラーゼの19 kDa蛋白を、Inouye, S. and Sasaki, S. Protein Express. Purif. (2007) 56: 261−268に記載の方法で精製し、使用した。
10 mM EDTA を含む30 mM Tris−HCl (pH7.6) 100μlに、1 mM DTTを含むエビルシフェラーゼの19 kDa蛋白（2.3 mg／ml）1μlを溶解し、エタノールに溶解したセレンテラジン又はその類縁体（1μg／μl）1μlを混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200（アトー社製）で60秒間発光活性を測定した。発光活性は、前記した発光活性の測定を3回行い、発光活性の最大発光強度値（Imax）で示した。
その結果を表３に示した。セレンテラジン類縁体は、エビルシフェラーゼの良い基質にはならなかった。
［実施例９］
ガウシアルシフェラーゼの基質特異性解析及び発光活性の測定法
ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼを、特開2008−099669号公報記載の方法で精製し、使用した。0.01% Tween20（シグマ社製）、10 mM EDTA を含むリン酸緩衝生理食塩水（シグマ社製）100μlに、ガウシアルシフェラーゼ（0.024 mg／ml）1μl を溶解し、エタノールに溶解したセレンテラジン又はその類縁体（1μg／μl）1μlを混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200（アトー社製）で10秒間発光活性を測定した。発光活性は、前記した発光活性の測定を3回行い、発光活性の最大発光強度値（Imax）で示した。
その結果を表４に示した。セレンテラジン類縁体は、ガウシアルシフェラーゼの良い基質にはならなかった。
［実施例１０］
レニラルシフェラーゼの基質特異性解析及び発光活性の測定法
レニラ（Renilla）ルシフェラーゼを、Inouye, S. ＆ Shimomura, O. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1997) 233: 349−353に記載の方法で精製し、使用した。
10 mM EDTA を含む30 mM Tris−HCl (pH7.6) 100μlに、レニラルシフェラーゼ（0.45 mg／ml）1μlを溶解し、エタノールに溶解したセレンテラジン又はその類縁体（1μg／μl）1μlを混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200（アトー社製）で10秒間発光活性を測定した。発光活性は、前記した発光活性の測定を3回行い、発光活性の最大発光強度値（Imax）で示した。
その結果を表５に示した。セレンテラジン類縁体は、レニラルシフェラーゼの良い基質にはならなかった。
[実施例１１]
セレンテラミド類縁体及びアポイクオリンからの半合成gFPの調製
組換えアポイクオリン及びセレンテラミド類縁体からの半合成gFPの調製は、10mM EDTA及び 1mM DTTを含む1mlの50mM Tris−HCl(pH 7.6)中、アポイクオリン（0.2mg）及び8μlのセレンテラミド類縁体（無水メタノール中1μg/μl）を混合し、この混合物を4℃で16時間静置することにより、半合成gFP様蛋白質（以下、単に「半合成gFP」という場合がある。）を調製した。
[実施例１２]
セレンテラミド類縁体及びアポイクオリンからの半合成BFPの調製
組換えアポイクオリン及びセレンテラミド類縁体からの半合成BFPの調製は、10mM CaCl2及び1mM DTTを含む1mlの50mM Tris−HCl(pH 7.6)中、アポイクオリン（0.2mg）及び8μlのセレンテラミド類縁体（無水メタノール中1 μg/μl）を混合し、この混合物を4℃で16時間静置することにより、半合成BFP様蛋白質（以下、単に「半合成BFP」という場合がある。）を調製した。
[実施例１３]
セレンテラミド類縁体と半合成BFP 及び半合成gFPの蛍光スペクトルの測定
蛍光スペクトル測定は、セレンテラミド類縁体単体については、アポイクオリン非存在下で、10mM EDTA及び 1mM DTTを含む1mlの50mM Tris−HCl(pH 7.6) 又は10mM CaCl2及び 1mM DTTを含む1mlの50mM Tris−HCl(pH 7.6)を使用し、セレンテラミド類縁体の最終濃度を8μg/ml として、実施例１１及び１２で調製した半合成gFP及び半合成BFPについて以下の条件で蛍光測定した。すなわち、JascoのFP−6500蛍光分光光度計（励起波長337 nm: 発光／励起帯域幅: 3 nm、レスポンス：0.5 sec、スキャン速度：1000nm/分）により、石英セル（光路長10mm）を用いて25℃で蛍光スペクトルを測定した。
その結果を表６及び表７に示した。またその蛍光スペクトルのチャートを図４〜７に示した。
セレンテラミド類縁体とアポイクオリンより調製した半合成BFP及び半合成gFPの多くは、蛍光強度が、セレンテラミド類縁体単体より明らかに強く、また、半合成BFP及び半合成gFPの多くは、セレンテラミド類縁体のみの蛍光スペルトルと異なる種々の蛍光スペクトルを持っていた。
[実施例１４]
半合成BFP類のルシフェラーゼ活性の測定
カルシウムイオン存在下、セレンテラミド類縁体とアポイクオリンから調製した新規蛍光蛋白質である半合成BFPに、ルシフェラーゼ活性があることを確認するために、セレンテラジンを発光基質として、発光反応を行なった。100μlの10mM CaCl2を含む50mM Tris−HCl(pH7.6)に、実施例１２で調製した半合成BFP溶液5μl (1 μg相当の蛋白質)を加えた後、エタノールに溶解したセレンテラジン(1μg/μl)1μlを混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200（アトー社製）で10秒間発光活性を測定した。発光活性は、前記した発光活性の測定を2回行い、発光活性の最大発光強度値（Imax）で示した。その結果を表８に示した。
半合成BFPには、十分なルシフェラーゼ活性があることが明らかとなった。すなわち、蛍光活性とルシフェラーゼ活性を有する種々の蛍光蛋白質を調製できた。
［配列表フリーテキスト］
〔配列番号：１〕天然型アポイクオリンの塩基配列である。
〔配列番号：２〕天然型アポイクオリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：３〕天然型アポクライティン−Ｉの塩基配列である。
〔配列番号：４〕天然型アポクライティン−Ｉのアミノ酸配列である。
〔配列番号：５〕天然型アポクライティン−ＩＩの塩基配列である。
〔配列番号：６〕天然型アポクライティン−ＩＩのアミノ酸配列である。
〔配列番号：７〕天然型アポマイトロコミンの塩基配列である。
〔配列番号：８〕天然型アポマイトロコミンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：９〕天然型アポオベリンの塩基配列である。
〔配列番号：１０〕天然型アポオベリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：１１〕天然型アポベルボインの塩基配列である。
〔配列番号：１２〕天然型アポベルボインのアミノ酸配列である。

Claims (16)

  1. 下記から選択される、化合物。
  2. 下記から選択される、化合物。
  3. 下記から選択される、化合物。
  4. 請求項１記載の化合物及び分子状酸素より生成する前記化合物のペルオキシドと、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とが非共有的な結合を形成した複合体である、カルシウム結合型発光蛋白質。
  5. 請求項１記載の化合物と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを酸素存在下において接触させて、請求項４記載のカルシウム結合型発光蛋白質を得ることを含む、請求項４記載のカルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
  6. 請求項４記載のカルシウム結合型発光蛋白質を用いることを含む、カルシウムイオンを検出又は定量する方法。
  7. 請求項４記載のカルシウム結合型発光蛋白質をドナー蛋白質として用いて、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、生理機能又は酵素活性の解析方法。
  8. 請求項２又は３記載の化合物が、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に配位した複合体であって、前記アポ蛋白質にカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンが結合したものである、蛍光蛋白質。
  9. 請求項４記載のカルシウム結合型発光蛋白質に、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させて、請求項８記載の蛍光蛋白質を得ることを含む、請求項８記載の蛍光蛋白質の製造方法。
  10. 請求項２又は３記載の化合物を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下において、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に接触させて、請求項８記載の蛍光蛋白質を得ることを含む、請求項８記載の蛍光蛋白質の製造方法。
  11. 前記接触を、還元剤の存在下で行う、請求項９又は１０記載の方法。
  12. 請求項２又は３記載の化合物が、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に配位した複合体である、蛍光蛋白質。
  13. 請求項２又は３記載の化合物を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に接触させて、請求項１２記載の蛍光蛋白質を得ることを含む、請求項１２記載の蛍光蛋白質の製造方法。
  14. 請求項８記載の蛍光蛋白質を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することを含む、請求項１２記載の蛍光蛋白質の製造方法。
  15. 前記接触を、還元剤の存在下で行う、請求項１３又は１４記載の方法。
  16. 請求項８又は１２記載の蛍光蛋白質をアクセプター又はドナーとして用いて蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法を行うことを特徴とする、生理機能又は酵素活性の解析方法。
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