JP5534346B2 - セレンテラミド類縁体 - Google Patents

Description

本発明は、セレンテラミド類縁体、及びそのセレンテラミド類縁体を含む蛍光蛋白質等に関する。

セレンテラミド（CTMD）は、セレンテラジンの酸化生成物である。腔腸動物由来のカルシウム結合型発光蛋白質の発光過程や、ウミシイタケ（Renilla）やガウシア（Gaussia）などのセレンテラジン（CTZ）系ルシフェラーゼによる発光過程において生成する。

カルシウム結合型発光蛋白質は、Ca²⁺と特異的に結合し瞬間的に発光する発光蛋白質であり、セレンテラジンのペルオキシドとアポ蛋白質の複合体から構成されている(非特許文献１. Head, J. F. et al. (2000) Nature 405: 372−376)。このようなカルシウム結合型発光蛋白質の中で、代表的な発光蛋白質は発光オワンクラゲ由来のイクオリンである。イクオリンの他に、オベリン、マイトロコミン、クライティン−I、及びクライティン−II等が知られている。その発光機構は、基本的に同じと考えられている。Ca²⁺添加により発光反応したイクオリン溶液は、青色の蛍光を発することから、CTZの酸化生成物であるCTMDとアポイクオリン−Ca²⁺との複合体が形成される推定され、その複合体は、BFP（Blue Fluorescent Protein）と呼ばれていた。近年、BFPは、組換えイクオリンより定量的に調製する方法が確立された（非特許文献2及び3：Inouye, S. (2004) FEBS Lett. 577:105−110, Inouye, S. and Sasaki, S (2006) FEBS Lett. 580: 1977−1982）。BFPは、熱安定性を有する蛍光蛋白質であり、しかも、CTZを基質としてルシフェラーゼ活性を有することも証明された。一方、キレート剤を添加し、アポイクオリン−Ca²⁺からCa²⁺を取り除くことにより、緑色様蛍光蛋白質(gFP)が生成することも示された。さらに、このgFPにCTZを添加することによる、発光能をもつイクオリンへの再生法も確立された。蛍光能をもち且つルシフェラーゼ活性を有する蛋白質は、BFPのみであり、イクオリンへ再生できることから、細胞生物学の領域でレポーター蛋白質として用いられる可能性があり、注目されている。

ここで、非特許文献4−21には、下記の蛍光性セレンテラミド関連化合物が開示されている。

また、非特許文献4−21には、前記したセレンテラミド関連化合物の構造とそれらの蛍光特性が開示されている。

国際公開第WO2005/014633号パンフレット

Head, J.F. et al. Nature 405, 372−376 (2000) Inouye, S. FEBS Lett. 577, 105−110 (2004) Inouye, S. and Sasaki, S. FEBS Lett. 580, 1977−1982 (2006) O. Shimomura, F. H. Johnson, Tetrahedron Lett., 31, 2963 (1973). K. Hori, J. E. Wampler, J. C. Matthews, M. J. Cormier, Biochemistry, 12, 4463 (1973). F. McCapra, M. J. Manning, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 467 (1973). K. Hori, J. E. Wampler, M. J. Cormier, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 492 (1973). K. Teranishi, T. Goto, Bull. Chem. Soc. Jpn., 63, 3132 (1990). T. Hirano, , Y. Gomi, T. Takahashi, K. Kitahara, C. F. Qi, I. Mizogushi, S. Kyushin, M. Ohashi, Tetrahedron Lett., 33, 5771 (1992). K. Teranishi, K. Ueda, H. Nakao, M. Hisamatsu, T. Yamada, Tetrahedron Lett., 35, 8181 (1994). F. Q. Chen, J. L. Zheng, T. Hirano, H. Niwa, Y. Ohmiya, M. Ohashi, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2129 (1995). R. Saito, T. Hirano, H. Niwa, M. Ohashi, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1711 (1997). K. Teranishi, M. Hisamatsu, T. Yamada, Tetrahedron Lett., 38, 2689 (1997). T. Hirano, Y. Ohmiya, S. Maki, H. Niwa, M. Ohashi, Tetrahedron Lett., 39, 5541 (1998). F. Q. Chen, J. L. Zheng, T. Hirano, Y. Ohmiya, S. Maki, H. Niwa, M. Ohashi, Bull. Chem. Soc. Jpn., 73, 465 (2000). O. Shimomura, K. Teranishi, Luminescence, 15, 51 (2000). K. Teranishi, Luminescence, 16, 367 (2001). Y. Imai, T. Shibata, S. Maki, H. Niwa, M. Ohashi, T. Hirano, J. Photochem. Photobiol., A, 146, 95 (2001). M. Kuse, N. Kondo, Y. Ohyabu, M. Isobe, Tetrahedron, 60, 835 (2004). N. Kondo, M. Kuse, T. Mutarapat, N. Thasana, M. Isobe, Heterocycles, 65, 843 (2005). K. Mori, S. Maki, H. Niwa, H. Ikeda, T. Hirano, Tetrahedron, 62, 6272 (2006).

上記状況において、従来のものと異なる蛍光特性を示すセレンテラミド類縁体、及びそのようなセレンテラミド類縁体を含有する蛍光蛋白質等が求められていた。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定のチオアミド系セレンテラミド類縁体、及び特定のスルホンアミド系セレンテラミド類縁体が、従来のものと異なる蛍光特性を示すことなどを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示す、セレンテラミド類縁体、及び蛍光蛋白質などを提供する。

（１）下記一般式（１）

で表わされる化合物
（式中、
Ｒ^１は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、脂肪族環式基、又は複素環式基であり、
Ｒ^２は、水素、又は−（ＳＯ_２）Ｒ^４であり、
Ｒ^３は、水素、水酸基、メトキシ、又はアセトキシであり、
Ｒ^４は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであり、
Ｘ¹は、−Ｃ（＝Ｓ）−、又は−ＳＯ_２−である。）。
（２）一般式（１）において、
Ｒ^１は、フェニル、ｐ−メチルフェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、４−メチルベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−メトキシベンジル、４−アセトキシベンジル、４−ニトロベンジル、フェニルエチル、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、又はチオフェン−２−イルであること、
を特徴とする、上記（１）に記載の化合物。
（３）一般式（１）において、
Ｒ^２は、水素、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、４−ヒドロキシフェニルスルホニル、４−メトキシフェニルスルホニル、４−アセトキシフェニルスルホニル、４−ニトロフェニルスルホニル、ベンジルスルホニル、α−ヒドロキシベンジルスルホニル、４−メチルベンジルスルホニル、４−ヒドロキシベンジルスルホニル、４−メトキシベンジルスルホニル、４−アセトキシベンジルスルホニル、４−ニトロベンジルスルホニル、フェニルエチルスルホニル、メタンスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、２−メチルプロピルスルホニル、２−メチルプロパニルスルホニル、シクロヘキシルメチルスルホニル、シクロヘキシルエチルスルホニル、アダマンチルメチルスルホニル、又はシクロペンチルメチルスルホニルであること、
を特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の化合物。
（４）下記化合物

からなる群から選択される、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物。
（５）下記化合物

からなる群から選択される、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物。
（５ａ）下記化合物

からなる群から選択される、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の化合物。
（６）上記（１）〜（５ａ）のいずれか１項に記載の化合物、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む、青色蛍光蛋白質。
（７）カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、上記（１）〜（５ａ）のいずれか１項に記載の化合物と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを反応させることを含む、青色蛍光蛋白質の製造方法。
（８）前記反応を、還元剤の存在下において行う、上記（７）に記載の方法。
（９）上記（１）〜（５ａ）のいずれか１項に記載の化合物、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む、緑色蛍光蛋白質。
（１０）上記（６）に記載の青色蛍光蛋白質を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することを含む、緑色蛍光蛋白質の製造方法。
（１１）上記（９）に記載の緑色蛍光蛋白質に、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることを含む、カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
（１２）蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、還元剤の存在下において行う、上記（１１）に記載の方法。

本発明のいくつかの態様のセレンテラミド類縁体は、従来のものと異なる蛍光特性を示す。本発明の好ましい態様のセレンテラミド類縁体は、水溶媒中で比較的高い蛍光能を示す。

セレンテラミドからBFP、gFP及びイクオリンなどを製造するためのスキームを示す図である。 最終濃度30 μMセレンテラミド類縁体のメタノール中での蛍光スペクトルを示す図である（実施例２）。 最終濃度30 μMセレンテラミド類縁体のリン酸緩衝液中での蛍光スペクトルを示す図である（実施例２）。 最終濃度18 μM のc−38化合物（CTSD）の10 mM CaCl₂ を含む50 mM Tris−HCl (pH7.6)中での蛍光スペクトルを示す図である（実施例３）。

以下、本発明について詳細に説明する。
１．セレンテラミド類縁体
本発明は、下記一般式（１）で表わされる化合物（本発明のセレンテラミド類縁体）を提供する。

（式中、
Ｒ^１は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、脂肪族環式基、又は複素環式基であり、
Ｒ^２は、水素、又は−（ＳＯ_２）Ｒ^４であり、
Ｒ^３は、水素、水酸基、メトキシ、又はアセトキシであり、
Ｒ^４は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであり、
Ｘ¹は、−Ｃ（＝Ｓ）−、又は−ＳＯ_２−である。）。

Ｒ^１の「置換若しくは非置換のアリール」は、例えば１〜５個の置換基を有するアリール、又は非置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数１〜６個のアルコキシル、アミノ、及び炭素数１〜６個のジアルキルアミノなどからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は水酸基である。「置換若しくは非置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｐ−アミノフェニル、又はｐ−ジメチルアミノフェニルなどであり、好ましくは、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、又はｐ−ニトロフェニルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリール」は、置換のアリールであり、例えば、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、又はｐ−ニトロフェニルなどである。

Ｒ^１の「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば１〜５個の置換基を有するアリールアルキル、又は非置換のアリールアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数１〜６個のアルコキシル、アミノ、又は炭素数１〜６個のジアルキルアミノなどが挙げられる。「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、４−メチルベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−メトキシベンジル、４−アセトキシベンジル、４−ニトロベンジル、フェニルエチル４−ヒドロキシベンジル、又は４−ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、４−メチルベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−メトキシベンジル、４−アセトキシベンジル、４−ニトロベンジル、又はフェニルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、水酸基で置換されたアリールアルキルであり、例えば、α−ヒドロキシベンジル、又は４−ヒドロキシベンジルなどである。本発明の別の態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、非置換のアリールアルキルであり、例えば、ベンジル、又はフェニルエチルなどである。

Ｒ^１の「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、非置換の直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、又は例えば１〜１０個の脂肪族環式基によって置換された直鎖若しくは分枝鎖のアルキルである。脂肪族環式基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、又はアダマンチルなどである。「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロブチルメチル、又はシクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、又はシクロペンチルメチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、又はシクロヘキシルエチルなどである。

Ｒ^１の「脂肪族環式基」は、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシルなどである。

Ｒ^１の「複素環式基」は、環を構成する原子として炭素以外にＮ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される１〜３個の原子を含む例えば５〜７員環であって炭素を介して結合する基、又は２つ以上のそのような環が縮環したものであって炭素を介して結合する基、若しくは、そのような環とベンゼン環が縮環したものであって炭素を介して結合する基である。「複素環式基」は、例えば、チオフェン−２−イル、２−フラニル、又は４−ピリジルなどである。本発明のいくつかの態様では、「複素環式基」は、硫黄を含む複素環式基であり、例えば、チオフェン−２−イルである。

本発明の好ましい態様によれば、Ｒ^１は、フェニル、ｐ−メチルフェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、４−メチルベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−メトキシベンジル、４−アセトキシベンジル、４−ニトロベンジル、フェニルエチル、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、又はチオフェン−２−イルなどである。本発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ^１は、ｐ−メチルフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、又はメチルなどである。

Ｒ^２の「−（ＳＯ_２）Ｒ^４」において、Ｒ^４の「置換若しくは非置換のアリール」は、例えば１〜５個の置換基を有するアリール、又は非置換のアリールである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数１〜６個のアルコキシル、アミノ、及び炭素数１〜６個のジアルキルアミノなどからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明のいくつかの態様では、置換基は水酸基である。「置換若しくは非置換のアリール」は、具体的には、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ｐ−ヒドロキシベンジル、又はｐ−ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、又はｐ−ニトロフェニルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリール」は、置換のアリールであり、例えば、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、又はｐ−ニトロフェニルなどである。

Ｒ^４の「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば１〜６個の置換基を有するアリールアルキル、又は非置換のアリールアルキルである。置換基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素など）、水酸基、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数１〜６個のアルコキシル、アミノ、及び炭素数１〜６個のジアルキルアミノなどが挙げられる。「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、例えば、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、４−メチルベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−メトキシベンジル、４−アセトキシベンジル、４−ニトロベンジル、フェニルエチル、４−ヒドロキシベンジル、又は４−ジメチルアミノベンジルなどであり、好ましくは、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、４−メチルベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−メトキシベンジル、４−アセトキシベンジル、４−ニトロベンジル、又はフェニルエチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、水酸基で置換されたアリールアルキルであり、例えば、α−ヒドロキシベンジル、又は４−ヒドロキシベンジルなどである。本発明の別の態様では、「置換若しくは非置換のアリールアルキル」は、非置換のアリールアルキルであり、例えば、ベンジル、又はフェニルエチルなどである。

Ｒ^４の「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、非置換の直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、又は例えば１〜１０個の脂肪族環式基によって置換された直鎖若しくは分枝鎖のアルキルである。脂肪族環式基としては、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、アダマンチル、シクロブチル、又はシクロプロピルなどが挙げられる。好ましくは、脂肪族環式基は、シクロヘキシル、シクロペンチル、又はアダマンチルなどである。「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロブチルメチル、又はシクロプロピルメチルなどであり、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、又はシクロペンチルメチルなどである。本発明のいくつかの態様では、「脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル」は、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、又はシクロヘキシルエチルなどである。

本発明の好ましい態様によれば、Ｒ^２は、水素、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、４−ヒドロキシフェニルスルホニル、４−メトキシフェニルスルホニル、４−アセトキシフェニルスルホニル、４−ニトロフェニルスルホニル、ベンジルスルホニル、α−ヒドロキシベンジルスルホニル、４−メチルベンジルスルホニル、４−ヒドロキシベンジルスルホニル、４−メトキシベンジルスルホニル、４−アセトキシベンジルスルホニル、４−ニトロベンジルスルホニル、フェニルエチルスルホニル、メタンスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、２−メチルプロピルスルホニル、２−メチルプロパニルスルホニル、シクロヘキシルメチルスルホニル、シクロヘキシルエチルスルホニル、アダマンチルメチルスルホニル、又はシクロペンチルメチルスルホニルなどである。本発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ^２は、水素、ベンジルスルホニル、メタンスルホニル、又はニトロベンゼンスルホニルなどである。

本発明のいくつかの態様によれば、一般式（１）で表わされる化合物は、下記一般式（２）で表わされる化合物（本発明のスルホンアミド系セレンテラミド）である。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、前記の通りである。）

好ましくは、一般式（２）で表わされる化合物は、下記化合物からなる群から選択される化合物である。

より好ましくは、一般式（２）で表わされる化合物は、下記化合物からなる群から選択される化合物である。

さらに好ましくは、一般式（２）で表わされる化合物は、下記化合物からなる群から選択される化合物である。

本発明の別の態様によれば、一般式（１）で表わされる化合物は、下記一般式（３）で表わされる化合物（本発明のチオアミド系セレンテラミド）である。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、前記の通りである。）

好ましくは、一般式（３）で表わされる化合物は、下記式で表わされる化合物からなる群から選択される化合物である。

さらに好ましくは、一般式（３）で表わされる化合物は、下記式で表わされる化合物からなる群から選択される化合物である。

２．セレンテラミド類縁体の製造方法
２．１．スルホンアミド系セレンテラミド類縁体の製造方法
本発明のセレンテラミド類縁体のうち、下記一般式（２）で表わされるスルホンアミド系セレンテラミドの製造方法について説明する。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、前記の通りである。）

一般式（２）で表わされるスルホンアミド系セレンテラミドは、例えば、
一般式（４）

で表わされる化合物（式中、Ｒ^３は、前記の通りである。）と、
一般式（５）

で表わされる化合物（式中、Ｒ^１は、前記の通りである。）を反応させることにより、製造することができる。

一般式（４）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。例えば、一般式（４）で表わされる化合物は、Kishi, Y. et al., Tetrahedron Lett., 13, 2747−2748 (1972)、又はAdamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001) に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。より具体的には、次のようにして、一般式（４）で表わされる化合物を製造することができる。すなわち、まず、４塩化チタンなどのルイス酸触媒を用いて置換フェニルグリオキサールアルドキシムとグリシノニトリル誘導体との環化反応を行い、ピラジンオキシドを形成した後、Raney Ni等を触媒として用いた接触水素還元により製造するか、又は２−アミノ−５−ブロモピラジン誘導体と置換フェニルホウ酸或は置換フェニルホウ酸ピナコールエステルとの鈴木−宮浦カップリング反応を行うことで製造できる。

一般式（５）で表わされる化合物も、公知の製造方法で製造することができ、或いは、市販のものを入手することができる。具体的には、例えば、１）対応する置換ベンジルスルホン酸又はその塩に対して過剰の塩化チオニルを作用させて加熱還流した後、減圧濃縮するか、又は、２）対応する置換ベンジルスルホン酸又はその塩に対してジクロロメタンなどの溶媒中、触媒量のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）存在下、対応するカルボン酸に対して二塩化オキサリルをさせた後、減圧濃縮することにより、或いは３）置換ベンジルGrignard試薬に対し塩化スルフリルを反応させるか、のいずれかの方法又はそれらに準ずる方法で製造することができる。また、ベンジルスルホニルクロリドは東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、関東化学株式会社、などから購入することができる。

ここで、一般式（２）で表わされる化合物の製造方法において使用される溶媒は、水系、又はアルコール類以外であればであれば特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、ピリジン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、トルエン、ジオキサン又はエーテル等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。

また、一般式（２）で表わされる化合物の製造方法において、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、−２０℃〜２００℃で、０．２５時間〜７２時間、好ましくは、−２０℃〜１００℃で、０．５時間〜３６時間、より好ましくは、０℃〜５０℃で、１時間〜２４時間である。

さらに、一般式（２）で表わされる化合物のうちR^２＝Hである一部の化合物については、R^２＝SO₂R¹である化合物、すなわちジスルホン酸アミド化合物のアルカリ加水分解を行い、一方のスルホン酸アミド結合のみを選択的に切断するか、又はそれに準ずる方法で製造することができる。

２．２．チオアミド系セレンテラミド類縁体
本発明のセレンテラミド類縁体のうち、下記一般式（３）で表わされるスルホンアミド系セレンテラミドの製造方法について説明する。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、前記の通りである。）

一般式（３）で表わされるチオアミド系セレンテラミドは、例えば、
一般式（６）

で表わされる化合物（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、前記の通りである。）に、ローソン試薬、又は五硫化二リン（十硫化四リン）を反応させることにより、製造することができる。

一般式（６）で表わされる化合物は、公知の製造方法で製造することができる。具体的には、例えば、一般式（４）で表わされる化合物、及び一般式（７）で表わされる酸ハライド又はその類縁体とを有機溶媒中、塩基の存在下、又は塩基性有機溶媒中で反応させる方法か、又はそれらに準ずる方法で製造することができる。

（式中、Ｒ^１は前記の通りであり、Ｘはハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素）、又はＲ^１Ｃ（＝Ｏ）−である。）

ここで、一般式（３）で表わされる化合物の製造方法において使用される溶媒は、水系、又はアルコール類、ケトン類、エステル類以外であれば特に限定されず、種々のものを使用できる。例えば、トルエン、ベンゼン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、又はピリジン等であり、これらは単独で又は混合して使用することができる。

また、一般式（３）で表わされる化合物の製造方法において、反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、０℃〜２００℃で、０．５時間〜７２時間、好ましくは、室温〜２００℃で、１時間〜４８時間、より好ましくは、６０℃〜１５０℃で、２時間〜２４時間である。

３．蛍光蛋白質
図１に示すように、青色蛍光蛋白質（BFP）は、セレンテラミド又はその類縁体に、アポイクオリン等のアポ蛋白質を反応させることにより製造することができる。一方、緑色蛍光蛋白質(gFP)は、BFPを、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することにより製造することができる。

３．１．青色蛍光蛋白質（BFP）
３．１．１．青色蛍光蛋白質（BFP）の製造方法
本発明の青色蛍光蛋白質（BFP）は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、本発明のセレンテラミド類縁体が配位した複合体である。すなわち、本発明のBFPは、本発明のセレンテラミド類縁体、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む。BFPは、光の励起を受けて蛍光を発生することができるとともに、BFPとセレンテラジン又はその類縁体と接触させることで、発光を生じさせることもできる。

本発明では、BFPを、本発明のセレンテラミド類縁体から次のように製造する。すなわち、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、本発明のセレンテラミド類縁体（例えば、一般式（１）で表わされる化合物）、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に反応させることで、BFPを製造する。

本発明においてBFPを製造するのに用いる本発明のセレンテラミド類縁体は、前記で説明した通りである。本発明のセレンテラミド類縁体として、例えば、前記製造方法により製造した化合物を挙げることができる。

本発明においてBFPを製造するのに用いるカルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンとは、カルシウムイオンに代えてカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こす２価又は３価のイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウムイオンと同等の作用をするものである。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンは、例えば、カルシウムイオン（Ｃａ^２+）、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ^２＋）、バリウムイオン（Ｂａ^２＋）、鉛イオン（Ｐｂ^２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ^２＋）、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）、カドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）、イットリウムイオン（Ｙ^３＋）、ランタンイオン（Ｌａ^３＋）、サマリウムイオン（Ｓｍ^３＋）、ユウロピウムイオン（Ｅｕ^３＋）、ジスプロシウムイオン（Ｄｙ^３＋）、ツリウムイオン（Ｔｍ^３＋）、又はイットリビウムイオン（Ｙｂ^３＋）等を挙げることができる。これらのうち、２価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の２価の金属イオン、例えばＣａ^２＋、Ｓｒ^２＋、又はＰｂ^２＋等である。

本発明においてBFPを製造するのに用いるカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポベルボイン等である。本発明のいくつかの態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、又はアポマイトロコミン等であり、例えば、アポイクオリンである。アポ蛋白質は、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであってよい。さらに、アポ蛋白質は、BFPを形成できるものであれば、そのアミノ酸配列を天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。

天然から採取した発光蛋白質のアポ蛋白質（天然型アポ蛋白質）の塩基配列及びアミノ酸配列は、次の通りである。すなわち、天然型アポイクオリンの塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。天然型アポクライティン−Ｉの塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。天然型アポクライティン−ＩＩの塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。天然型アポマイトロコミンの塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す。天然型アポオベリンの塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に示す。天然型アポベルボインの塩基配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。

組換え技術によって変異させたアポ蛋白質は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される蛋白質である。
（ａ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、
（ｂ）天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質、及び
（ｃ）天然型アポ蛋白質の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性若しくは機能を有する蛋白質。

上記「天然型アポ蛋白質」は、例えば、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシン、又はアポベルボイン等である。本発明のある態様では、アポ蛋白質は、アポイクオリン、アポクライティン−Ｉ、アポクライティン−ＩＩ、又はアポマイトロコミン等であり、好ましくは、アポイクオリンである。これらの天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列又は塩基配列は、前記の通りである。

上記「カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質活性又は機能」とは、例えば、蛋白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する活性又は機能を意味する。「蛋白質がセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合してカルシウム結合型発光蛋白質を形成する」とは、具体的には、（１）蛋白質が、セレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドと結合して発光蛋白質を形成すること、だけではなく（２）蛋白質が、酸素存在下に、セレンテラジン若しくはその誘導体と接触することにより、蛋白質とセレンテラジンのペルオキシド若しくはセレンテラジン類縁体のペルオキシドとを含有する発光蛋白質（複合体）を形成すること、をも意味する。ここで、「接触」とは、蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器に蛋白質を添加すること、蛋白質を収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又は蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。また、「セレンテラジン類縁体」は、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。セレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｌ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｈ−セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、ｅｆ−セレンテラジン、ｅｃｈ−セレンテラジン、又はｈｃｐ−セレンテラジン等である。これらのセレンテラジン又はその類縁体の入手方法は、後に記載する。

上記「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入若しくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、“Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”、 “Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)”、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、又は“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。

また、上記「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。

また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、天然型アポ蛋白質の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は天然型アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。具体的には、コロニー或いはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline−sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)、又はGlover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。

ここで言う「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。

これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、アポ蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。

本発明で使用することができる組換えアポ蛋白質として、例えば、Shimomura, O. and Inouye, S.Protein Express. Purif. (1999) 16: 91−95に記載の組換えイクオリン、Inouye, S. and Sahara, Y. Protein Express. Purif. (2007) 53: 384−389に記載の組換えクライティン−I、又はInouye, S. J.Biochem. (2008)143: 711−717に記載の組換えクライティン−IIなどを挙げることができる。

本発明のいくつかの態様において、アポ蛋白質は、全てのシステイン残基をセリン残基で置換したものである。BFPは、アポ蛋白質中のシステイン残基の遊離ＳＨ基が酸化されてＳ−Ｓ結合を生成すると、化学発光活性を失う。したがって、システイン残基がセリン残基で置換されＳ−Ｓ結合を生じることができなくなったアポ蛋白質は、化学発光活性をほとんど失わず、Ｓ−Ｓ結合を生じないため活性が持続する。

BFPの製造のために用いる本発明のセレンテラミド類縁体の量は、特に制限されないが、アポ蛋白質1molに対して、例えば、1mol〜5mol、好ましくは、1mol〜2mol、さらに好ましくは、1mol〜1.2molである。

BFPの製造において、本発明のセレンテラミド類縁体とアポ蛋白質とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとの反応は、還元剤の存在下で行うのが好ましい。ここで用いる還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール(DTT)、又はメルカプトエタノール等を挙げることができる。BFPの再生に影響しなければ、BFPの製造のために用いる還元剤の量は、特に制限されないが、アポイクオリンには、３ヵ所のシステイン残基が存在することにより、S−S結合形成を防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1mMジチオトレイトールや0.1%（v/v）メルカプトエタノールである。

BFPの製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜42℃で0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で0.1時間〜2時間、又は、4℃〜15℃で0.1時間〜24時間である。

このようにして得たBFPは、さらに精製に供しても良い。BFPの精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。

３．１．２．青色蛍光蛋白質(BFP)の利用
（１）発光触媒としての利用
本発明のBFPは、発光基質に作用しそれを発光させるので、発光触媒として利用できる。そこで、本発明は、本発明のBFPに、セレンテラジン又はその類縁体を接触させることを含む、発光方法を提供する。ここで、「接触」とは、BFPとセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器にBFPを添加すること、BFPを収容した容器にセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又はBFPとセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。

本発明の発光方法に用いる発光基質は、例えばセレンテラジン又はその類縁体である。「セレンテラジンの類縁体」とは、セレンテラジンと同様に、アポ蛋白質として、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質を構成しうる化合物を指す。発光基質として用いるセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｌ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｈ−セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、ｅｆ−セレンテラジン、ｅｃｈ−セレンテラジン、又はｈｃｐ−セレンテラジン等であり、好ましくは、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、又はｅ−セレンテラジンである。これらのセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、Shimomura et al. (1988) Biochem. J. 251, 405−410、Shimomura et al. (1989) Biochem. J. 261, 913−920、又はShimomura et al. (1990) Biochem. J. 270, 309−312に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。或いは、チッソ株式会社、和光純薬社、又はプロメガ社等から各種市販されているので、これらの市販のものを、本発明の発光方法に用いても良い。

これらのセレンテラジン及びその類縁体をBFPに接触させ、接触させたBFPの触媒作用によって、セレンテラジン又はその類縁体が対応するセレンテラミド又はその類縁体に酸化される際（この時、二酸化炭素が放出される）、発光が生じる。通常発光時間は、０．５〜３時間であるが、条件の選択により、発光時間を更に長時間とすることも、又は発光時間を更に短時間とすることも可能である。

（２）レポーター蛋白質としての利用
本発明のBFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させ、本発明の蛍光蛋白質に由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。ここで、「接触」とは、宿主細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、宿主細胞の培養容器にセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、宿主細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で培養することなどが含まれる。

（３）検出マーカとしての利用
本発明のBFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明のBFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。

また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに本発明のセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを接触させること等によって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。ここで、「接触」とは、細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを同一の培養系・反応系に存在させることを意味し、例えば、細胞の培養容器にセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを添加すること、細胞とセレンテラミド類縁体とカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンとを混合すること、宿主細胞をセレンテラミド類縁体及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下で培養することなどが含まれる。

このような目的物質などの分布の測定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。

（４）アミューズメント用品の材料
本発明のBFPは、光の励起をうけて蛍光を生じる。よって、本発明のBFPは、アミューズメント用品の材料の蛍光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。

３．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）
３．２．１．緑色蛍光蛋白質（gFP）の製造
本発明の緑色蛍光蛋白質（gFP）は、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質に、本発明のセレンテラミド類縁体が配位した複合体である。すなわち、本発明のgFPは、本発明のセレンテラミド類縁体、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む。gFPは、光の励起を受けて蛍光を発生することができる。

本発明のgFPは、前述のBFPからカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを取り除くことによって、得られる。カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンは、BFPを、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することによって、BFPから取り除くことができる。

本発明においてgFPを製造するのに用いるキレート剤は、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２若しくは３価のイオンと強く結合するものであれば良く、特に制限されない。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、又はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）等を挙げることができる。ここで、カルシウムイオンと置換可能な２価又は３価のイオンは、前記の通りである。

gFPの製造のために用いるキレート剤の量は、gFP再生に影響しなければ、その濃度は特に制限されない。イオンアポイクオリン1molには、3molのカルシウムイオンが結合することが示されていることより、例えば、3mol 以上が好ましい。

gFPの製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜42℃で0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で0.1時間〜2時間、又は、4℃〜15℃で0.1時間〜24時間である。

このようにして得たgFPは、さらに精製に供しても良い。gFPの精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。

３．２．２．緑色蛍光蛋白質（gFP）の利用
（１）レポーター蛋白質としての利用
本発明のgFPは、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。アポ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、目的のプロモーター又は他の発現制御配列（例えば、エンハンサーなど）に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体を接触させてBFPを生成させた後、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤を接触させることでgFPを生成させ、本発明のgFPに由来する蛍光を検出することにより、目的のプロモーター又は他の発現制御配列の活性を測定することができる。

（２）検出マーカとしての利用
本発明のgFPは、蛍光による検出マーカとして利用することができる。本発明の検出マーカは、例えば、イムノアッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。本発明のgFPを化学修飾法など通常用いられる方法により目的物質（蛋白質或いは核酸など）と結合させて使用することができる。このような検出マーカを用いた検出方法は、通常の方法によって行うことができる。また、本発明の検出マーカは、例えば、アポ蛋白質と目的物質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、さらに、これに、本発明のセレンテラミド類縁体を接触させてBFPを生成させた後、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤を接触させることでgFPを生成させること等によって、前記目的物質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的物質などの分布の測定は、蛍光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、アポ蛋白質は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。

（３）アミューズメント用品の材料
本発明のgFPは、アミューズメント用品の材料の蛍光材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、蛍光シャボン玉、蛍光アイス、蛍光飴、蛍光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。

４．カルシウム結合型発光蛋白質
図１に示すように、イクオリン等のカルシウム結合型発光蛋白質は、EDTA等のカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下、gFPに、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることで、製造することが出来る。

４．１．カルシウム結合型発光蛋白質の製造
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、本発明のgFPから製造することができる。すなわち、本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、gFPに、発光基質であるセレンテラジン又はその類縁体を反応させることによって、得ることができる。

gFPとセレンテラジン又はその類縁体の反応は、gFPとセレンテラジン又はその類縁体を接触させることにより行う。「接触」とは、本発明のgFPとセレンテラジン又はその類縁体とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、セレンテラジン又はその類縁体を収容した容器に本発明のgFPを添加すること、本発明のgFPを収容した容器に本発明のセレンテラジン又はその類縁体を添加すること、又は本発明のgFPとセレンテラジン又はその類縁体とを混合すること、などが含まれる。

本発明のカルシウム結合型発光蛋白質の製造に用いるセレンテラジン又はその類縁体は、例えば、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｌ−セレンテラジン、ｎ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン、ｃｈ−セレンテラジン、ｈｃｈ−セレンテラジン、ｆｃｈ−セレンテラジン、ｅ−セレンテラジン、ｅｆ−セレンテラジン、ｅｃｈ−セレンテラジン、又はｈｃｐ−セレンテラジン等であり、好ましくは、セレンテラジン、ｈ−セレンテラジン、又はｅ−セレンテラジンである。これらのセレンテラジン又はその類縁体の入手方法は、前記の通りである。

カルシウム結合型発光蛋白質の製造のために用いるセレンテラジン又はその類縁体の量は、特に制限されないが、gFP1molに対して、例えば、1.2mol以上であれば良い。

カルシウム結合型発光蛋白質の製造における反応温度及び反応時間は、特に限定されないが、例えば、0℃〜42℃で0.1時間〜2時間、4℃〜37℃で0.1時間〜2時間、又は4℃〜15℃で0.1時間〜24時間である。
蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤の存在下において行うのが好ましい。本発明においてgFPを製造するのに用いるキレート剤は、前記と同様である。

本発明のさらに好ましい態様では、蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、還元剤の存在下において行う。このとき用いる還元剤は、例えば、ジチオトレイトール（DTT）、又はメルカプトエタノール等である。カルシウム結合型発光蛋白質の製造のために用いる還元剤の量は、再生に影響しなければ、特に制限されないが、アポイクオリンには、３カ所のシステイン残基が存在することより、S−S 結合形成を防ぐ濃度であるのが好ましい。例えば、最終濃度が、1 mMジチオトレイトールや0.1％（v/v）メルカプトエタノールである。

４．２．カルシウム結合型発光蛋白質の利用
（１）カルシウムイオンの検出又は定量
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムイオンの作用によって発光する発光蛋白質（ホロ蛋白質）である。よって、本発明の発光蛋白質は、カルシウムイオンの検出又は定量に使用することができる。

カルシウムイオンの検出又は定量を行う場合には、アポ蛋白質とセレンテラジン類縁体のペルオキシドとからなる発光蛋白質を使用する。発光蛋白質は、前述した方法に従って製造することができる。カルシウムイオンの検出又は定量は、検体溶液を直接発光蛋白質溶液に添加し、発生する発光を測定することにより行うことができる。或いは、検体溶液に発光蛋白質溶液を添加し、発生する発光を測定することにより、カルシウムイオンを検出又は定量することもできる。

カルシウムイオンの検出又は定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、発光蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。

（２）生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法
本発明のカルシウム結合型発光蛋白質は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。

例えば、本発明の発光蛋白質をドナー蛋白質として使用し、有機化合物又は蛍光蛋白質をアクセプターとして使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を起こすことにより蛋白質間の相互作用を検出することができる。本発明のある態様では、アクセプターとして使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo−1又はDAP1などである。本発明の別の態様では、アクセプターとして使用する蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質（GFP）、青色蛍光蛋白質（BFP）、変異GFP蛍光蛋白質又はフィコビリンなどである。本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体（特にG蛋白質共役受容体）、アポトーシス、又は遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ又はリン酸化酵素などである。

ＢＲＥＴ法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem. J. 2005, 385, 625−637、又はExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541−556などに記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、Nat Methods 2006, 3:165−174、又はBiotechnol J. 2008, 3:311−324などに記載の方法に準じて行うことができる。

なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2009−27904号（2009年2月9日出願）の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。

また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

１．概要
CTMDの基本骨格をベースとして、h−セレンテラチオアミドとh−セレンテラスルホンアミドを、下記合成スキームにより合成した。また、比較として、ｈ−セレンテラミドも合成した。

＜h−セレンテラチオアミドとh−セレンテラスルホンアミド＞

＜h−セレンテラミド＞

＜合成ルート＞

さらに、h−セレンテラチオアミド、h−セレンテラスルホンアミド、及びh−セレンテラミドをベースとして、様々なCTMD誘導体を、下記合成法により合成した。

＜CTMD誘導体＞

＜CTMD誘導体の合成法＞

さらに、水溶媒における溶解性と、水溶媒又は有機溶媒における蛍光量子収率とを決定することにより、合成化合物の蛍光能の評価を行なった。

２．合成例
［材料及び方法］
（１）化学薬品
全ての化学薬品は特に記さない限り、市販のものをそのまま使用した。
反応、抽出、及びクロマトグラフィー用の溶媒には、酢酸エチル、n−ヘキサン、ジクロロメタン、脱水ジクロロメタン、クロロホルム、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル、アセトン、トルエン、及び1,2−ジメトキシエタンの市販品（Wako）をそのまま用いた。
反応試薬は以下に挙げるものを使用した。
フェニルアセチルクロリド (Wako)、4−(ジメチルアミノ)ピリジン (Wako)、1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液 (Aldrich)、ローソン試薬 (Aldrich)、ベンジルスホニルクロリド (Wako)、無水酢酸 (Wako)、トリエチルアミン (Wako)、水酸化ナトリウム (Wako)、脱水ピリジン (Wako)、アセチルクロリド (Wako)、メタンスルホニルクロリド (Wako)、p−トルエンスルホニルクロリド (Kanto)、p−ニトロベンゼンスルホニルクロリド (Aldrich)、フェニルボロン酸 (Acros organics)、炭酸ナトリウム (Wako)、及びジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II） (Aldrich)。

（２）クロマトグラフィー
分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）には、MERCK社製、Silicagel 60 F₂₅₄（Cat. No. 1.05715.）を用いた。スポットの検出は、紫外線ランプ（254 nm又は365 nm）による方法、ヨウ素吸着、及びリンモリブデン酸の酸性水溶液に浸した後にホットプレートで焼くことで行った。分取用フラッシュカラムクロマトグラフィーには、順相シリカゲルとして関東化学社製、Silicagel 60N Cat. No. 37563−85、メッシュ40−50 μm、又は関東化学社製、Silicagel 60N Cat. No. 37565−84、メッシュ63−200 μmを使用した。なお、本実施例においてクロマトグラフィー用の混合溶媒の比率は、特に説明が無い限りv/v である。

（３）物性測定
融点（Mp.）は、YANACO社製、微量融点測定装置MP−J3を用いて測定した。
紫外吸収スペクトル（UV）及びOD値（330 nm）の測定には、日本分光社製、V−560を用いて25 ℃で測定した。各サンプルの30 μMメタノール溶液及びpH.7.4リン酸緩衝水溶液（PB）を調製し、石英セル（光路長10 mm）中で測定した。難溶性の化合物は、はじめに少量のDMSOに溶解し、それを各溶媒で希釈することでサンプル調製を行った。DMSOを用いた場合には、その含有割合を記載した。全ての測定は、バンド幅0.5 nm、レスポンスMedium、スキャン速度200 nm/minの条件で測定した。
¹H（400 MHz）核磁気共鳴スペクトル（NMRスペクトル）は、Varian社製、Unity Plus 400を用いてDMSO−d6中で測定した。¹H NMRの化学シフトの基準には、測定溶媒であるDMSO−d₆中の残存非重水素化ジメチルスルホキシドのピークをδ2.49とした。
¹³C（75.5 MHz）核磁気共鳴スペクトル（NMRスペクトル）は、Varian社製、MERCURY 300を用いてDMSO−d6中で測定した。¹³C NMRの化学シフトの基準には、測定溶媒であるDMSO−d₆のピークをδ 39.5とし、ピークが重複した化合物についてはピークを分離するために重メタノールを加え、その旨を記載した。
赤外分光計スペクトル（IR）は、DRS−8000を装着したSHIMADZU社製、IRPrestige−21 spectrophotometerを用いて、拡散反射法により測定した。
高分解能質量分析スペクトル（HRMS）は、JEOL社製JMS−700を用いて、電子衝撃イオン化（EI）法、又は高速原子衝突（FAB⁺）法、又はBrucker社製MicrOTOFを用いてエレクトロスプレーイオン化法（ESI⁺）により測定した。
元素分析は、YANACO社製CHN CORDER MT-5を用いて行った。

［合成例１］
3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c−16)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−11) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)に記載の方法によって製造) (400 mg, 1.37 mmol)をピリジン (4 mL)に溶解し、4−（ジメチルアミノ）ピリジン (17.3 mg, 142 μmol)を加えて0 ℃に冷却した。これにフェニルアセチルクロリド (540 μL, 4.08 mmol)を加えて、室温に昇温し3.5時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止し、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (20 g, ジクロロメタン/酢酸エチル= 15/1)で精製し、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c−16)を淡黄色固体として得た (540 mg, 96.2%)。R_f = 0.25 (ジクロロメタン/酢酸エチル= 15/1)。Mp. 197.5−202 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 330 (4.20), 293 (4.20), 274 (4.18)。UV (pH 7.4 PB, 1% DMSO) λ_max(log ε) 333.5 (3.73), 280.5 (3.85)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.68 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 4.03 (s, 2H), 7.01−7.08 (m, 4H), 7.11−7.24 (m, 3H), 7.24−7.30 (m, 1H), 7.32−7.38 (m, 4H), 8.01−8.06 (AA’BB’, 2H), 8.88 (s, 1H), 10.52 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆/CD₃OD = 2/1) δ 40.2, 42.9, 55.5, 114.8 (2C), 126.7, 127.2, 128.4 (2C), 128.6, 128.7 (2C), 128.8 (2C), 129.4 (2C), 129.7 (2C), 136.0, 137.5, 138.7, 143.9, 149.0, 151.2, 161.3, 170.6。IR (KBr, cm⁻¹) 706, 837, 1034, 1179, 1248, 1296, 1413, 1439, 1449, 1497, 1545, 1574, 1609, 1670, 3281, 3381。HRMS (FAB⁺) m/z410.1876 (M+H, C₂₆H₂₄N₃O₂ requires 410.1869)。

［合成例２］
3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン（h−セレンテラミド） (c−13)

アルゴン雰囲気下、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c−16) (250 mg, 611 μmol)を脱水ジクロロメタン (15 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液(2.15 mL, 2.15 mmol)を加え、15時間加熱還流した。還流後、室温まで放冷し、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過し残渣を乾燥することで粗生成物である淡黄色固体270 mgを得た。これをメタノールを用いて再結晶し、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン（h−セレンテラミド） (c−13)を無色固体として得た(107 mg, 44.1%)。R_f = 0.20 (ジクロロメタン/酢酸エチル= 4/1)。Mp. 259−261 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 332 (4.38), 294.5 (4.38), 276 (4.35)。UV (pH 7.4 PB, 1% DMSO) λ_max (log ε) 345.5 (3.52), 303 (3.57)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.67 (s, 2H), 4.01 (s, 2H), 6.84−6.89 (AA’BB’, 2H), 7.02 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.11−7.23 (m, 4H), 7.23−7.30 (m, 1H), 7.32−7.37 (m, 4H), 7.90−7.95 (AA’BB’, 2H), 8.82 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 10.48 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 39.7, 42.4, 115.8 (2C), 126.2, 126.4, 126.7, 128.1 (2C), 128.3 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 129.3 (2C), 135.6, 136.9, 138.3, 143.3, 148.6, 150.5, 159.1, 169.9。IR (KBr, cm⁻¹) 662, 702, 712, 727, 843, 1157, 1173, 1231, 1281, 1321, 1355, 1368, 1452, 1495, 1523, 1541, 1584, 1595, 1611, 1668, 3063, 3169, 3264。HRMS (FAB⁺) m/z 396.1706 (M+H, C₂₅H₂₂N₃O₂requires 396.1712)。

［合成例３］
3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル) −2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c−17)

アルゴン雰囲気下、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c−16) (539 mg, 1.32 mmol)を脱水トルエン (50 mL)に懸濁し、室温で撹拌しながらこれにLawesson試薬 (320 mg, 790 μmol)を加え、17時間加熱還流した。還流後、室温まで放冷し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (55 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1)で精製し、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c−17)を黄色アモルファスとして得た (430 mg, 76.6%)。R_f = 0.33 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 7/3)。Mp. 45−47 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 334 (4.23), 295 (4.16), 272 (4.25)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 360.5 (4.22), 283.5 (4.16)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.81 (s, 3H), 3.92 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 7.01 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.04−7.10 (AA’BB’, 2H), 7.12−7.24 (m, 3H), 7.29 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 8.05−8.10 (AA’BB’, 2H), 8.99 (s, 1H), 12.20 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 39.3, 51.6, 55.3, 114.5 (2C), 126.3, 127.0, 127.6, 128.2 (2C), 128.3 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 129.0 (2C), 136.9, 137.9, 138.0, 145.0, 149.6, 152.1, 160.9, 204.6。IR (KBr, cm⁻¹) 700, 835, 1028, 1115, 1175, 1252, 1292, 1319, 1369, 1422, 1437, 1493, 1516, 1607, 2961, 3395。HRMS (FAB⁺) m/z426.1646 (M+H, C₂₆H₂₄N₃OS requires 426.1640)。

［合成例４］
3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン（h−セレンテラチオアミド） (c−14)

アルゴン雰囲気下、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c−17) (114 mg, 267 μmol)を脱水ジクロロメタン (2 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液(1.35 mL, 1.35 mmol)を加えた後、反応溶液を室温に昇温し、3.5時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過し残渣を乾燥し、粗生成物である赤色固体105 mgを得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (8.2 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)で精製し、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン（h−セレンテラチオアミド） (c−14)を橙色固体として得た(88.9 mg, 80.9%)。R_f = 0.21 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 195−198 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 336.5 (4.24), 297 (4.18), 273.5 (4.26)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 336.5 (4.12), 270 (4.20)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.90 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 6.84−6.90 (AA’BB’, 2H), 6.99 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.10−7.24 (m, 3H), 7.26 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.93−7.99 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 12.17 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 39.4, 51.6, 115.9 (2C), 126.1, 126.3, 127.0, 128.3 (2C), 128.36 (2C), 126.44 (2C), 128.9 (2C), 129.0 (2C), 136.9, 137.6, 138.1, 144.6, 150.0, 152.0, 159.5, 204.5。IR (KBr, cm⁻¹) 702, 839, 1140, 1169, 1207, 1234, 1283, 1319, 1360, 1435, 1450, 1472, 1491, 1522, 1607, 3069, 3478。HRMS (FAB⁺) m/z412.1490 (M+H, C₂₅H₂₂N₃OS requires 412.1484)。

［合成例５］
3−ベンジル−2−ベンジルスルホニルアミノ−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−18)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−11) (Adamczyk M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)に記載の方法によって製造) (99.5 mg, 342 μmol)をピリジン(1 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、ベンジルスルホニルクロリド (84.7 mg, 444 μmol)を加えて室温に昇温後、1時間撹拌した。これにベンジルスルホニルクロリド (13.8 mg, 72.3 μmol)を加え、2.5時間撹拌した。さらにこれにベンジルスルホニルクロリド (13.9 mg, 72.9 μmol)を加え、15時間撹拌した。さらにこれにベンジルスルホニルクロリド (13.1 mg, 68.7 μmol)を加え、5.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、有機層をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (7 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 7/3 → 酢酸エチル)で精製した。得られた固体を酢酸エチルで再結晶し、3−ベンジル−2−ベンジルスルホニルアミノ−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン(c−18)を無色固体として得た (56.0 mg, 36.8%)。R_f = 0.32 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 7/3)。Mp. 213−215 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 334.5 (4.04), 290 (4.21), 276.5 (4.23)。UV (pH 7.4 PB, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 348.5 (3.90), 293 (3.95)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.80 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 7.02−7.07 (AA’BB’, 2H), 7.14−7.21 (m, 1H), 7.24−7.27 (m, 4H), 7.36 (s, 5H), 7.99 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 8.88 (s, 1H), 10.46 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 38.0, 55.3, 59.6, 114.4 (2C), 126.3, 127.6 (2C), 128.1, 128.3 (2C), 128.4, 128.5 (2C), 129.0 (2C), 129.9, 130.9 (2C), 136.2, 138.1, 144.6, 145.8, 146.0, 160.3。IR (KBr, cm⁻¹) 459, 538, 586, 698, 748, 785, 831, 893, 912, 926, 1032, 1121, 1132, 1177, 1215, 1256, 1287, 1319, 1395, 1452, 1495, 1516, 1609, 3231。HRMS (FAB⁺) m/z 446.1548 (M+H, C₂₅H₂₄N₃O₃S requires 446.1548)。

［合成例６］
5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン (c−19)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン （セレンテラミン） (c−5) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)に記載の方法によって製造) (303 mg, 1.09 mmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、無水酢酸 (133 μL, 1.40 mmol)を加え、室温に昇温後1時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を水で3回、飽和食塩水で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)で精製し、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン(c−19)を淡黄色固体として得た (337 mg, 96.7%)。R_f = 0.31 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 183.5−185.5 ℃。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ2.27 (s, 3H), 4.07 (s, 2H), 6.42 (s, 2H), 7.12−7.17 (AA’BB’, 2H), 7.19 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.90−7.95 (AA’BB’, 2H), 8.41 (s, 1H)。IR (KBr, cm⁻¹) 513, 596, 640, 654, 710, 746, 851, 910, 1016, 1136, 1167, 1198, 1217, 1373, 1423, 1452, 1466, 1493, 1508, 1535, 1630, 1746, 3148, 3289。

［合成例７］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノピラジン (c−20)

アルゴン雰囲気下、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン (c−19) (367 mg, 1.15 mmol)を脱水ジクロロメタン (9 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (480 μL, 3.44 mmol)を加え、0 ℃に冷却した。これに、ベンジルスルホニルクロリド (658 mg, 3.45 mmol)を加え、室温に昇温後4.5時間撹拌した。さらにこれにベンジルスルホニルクロリド (658 mg, 3.45 mmol)を加え、1.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(23 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1 → 7/3)で精製し、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノピラジン (c−20)を黄色アモルファスとして得た (487 mg, 67.4%)。R_f = 0.53 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 84−86.5 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 307 (4.26), 293.5 (4.21), 259.5 (4.19)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 320 (4.30), 298.5 (4.25), 265 (4.29)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.29 (s, 3H), 3.90 (s, 2H), 5.00 (s, 1H), 5.03 (s, 1H),5.18 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 7.13−7.17 (m, 2H), 7.18−7.23 (m, 1H), 7.25−7.33 (m, 4H), 7.39−7.45 (m, 10H), 8.09−8.14 (AA’BB’, 2H), 9.21 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 20.9, 37.4, 61.0 (1C×2), 122.7 (2C), 126.4, 126.8 (1C×2), 128.2 (2C), 128.5 (2C), 128.8 (2C×2), 129.3, 129.6 (2C), 131.6 (2C×2), 132.1, 137.5, 139.2, 141.0, 151.3, 152.5, 155.6, 169.0。IR (KBr, cm⁻¹) 509, 534, 611, 696, 777, 876, 912, 1144, 1163, 1198, 1354, 1375, 1416, 1433, 1757。HRMS (FAB⁺) m/z 628.1582 (M+H, C₃₃H₃₀N₃O₆S₂requires 628.1576)。

［合成例８］
3−ベンジル−2−ベンジルスルホニルアミノ−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン （h−セレンテラスルホンアミド） (c−15)

5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノピラジン(c−20) (435 mg, 694 μmol)をメタノール (8 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.9 mL)を加え、65 ℃で9.5時間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (35 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1 → 2/1)で精製し、3−ベンジル−2−ベンジルスルホニルアミノ−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン（h−セレンテラスルホンアミド） (c−15)を淡黄色固体として得た(286 mg, 95.6%)。R_f = 0.27 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 144−147 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λ_max (log ε) 336 (4.06), 290 (4.23), 277.5 (4.25)。UV (pH 7.4 PB) λ_max(log ε) 351.5 (4.09), 283 (4.34)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 4.22 (s, 2H), 4.91 (s, 2H), 6.83−6.88 (AA’BB’, 2H), 7.14−7.20 (m, 1H), 7.22−7.29 (m, 4H), 7.36 (s, 5H), 7.86−7.93 (AA’BB’, 2H), 8.83 (s, 1H), 9.81 (s, 1H), 10.40 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 38.0, 59.6, 115.8 (2C), 126.2, 126.5, 127.7, 128.28 (2C), 128.33 (2C), 128.5 (2C), 128.9 (2C), 129.9, 130.9 (2C), 136.0, 138.2, 144.2, 145.8, 146.5, 158.8。IR (KBr, cm⁻¹) 527, 542, 604, 698, 835, 893, 912, 926, 935, 1117, 1130, 1188, 1213, 1244, 1267, 1321, 1402, 1452, 1495, 1516, 1595, 1609, 3055, 3221, 3522。HRMS (FAB⁺) m/z 432.1385 (M+H, C₂₄H₂₂N₃O₃S requires 432.1382)。

［合成例９］
3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノ−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−21)

2−アミノ−3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−11) (Adamczyk M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)に記載の方法によって製造) (200 mg, 687 μmol)を脱水ジクロロメタン (2 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (145 μL, 1.04 mmol)を加え、0 ℃に冷却した。これにベンジルスルホニルクロリド (196 mg, 1.03 mmol)を加え、室温に昇温し1時間撹拌した。さらにこれにトリエチルアミン (145 μL, 1.04 mmol)、脱水ジクロロメタン (1.0 mL)、ベンジルスルホニルクロリド (131 mg, 687 μmol)を順次加え、1時間撹拌した。さらにこれにトリエチルアミン (145 μL, 1.04 mmol)、脱水ジクロロメタン (1.0 mL)、ベンジルスルホニルクロリド (131 mg, 687 μmol)を順次加え、2時間撹拌した。これに2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離し飽和食塩水で1回、飽和硫酸ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (23 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)で精製し、3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノ−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−21)を黄色アモルファスとして得た (320 mg, 77.6%)。R_f = 0.63 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 78−80 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 332.5 (4.31), 299.5 (4.20), 277.5 (4.06)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 342.5 (4.29), 303 (4.18), 280.5 (4.15)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.87 (s, 3H), 3.97 (s, 2H), 4.78 (s, 1H), 4.82 (s, 1H), 4.94 (s, 1H), 4.97 (s, 1H), 6.96−7.02 (AA’BB’, 2H), 7.17 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.19−7.33 (m, 3H), 7.34−7.44 (m, 10H), 7.92−7.98 (AA’BB’, 2H), 8.80 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 37.4, 55.4, 61.0 (1C×2), 114.7 (2C), 126.4, 126.8 (1C×2), 128.1 (2C), 128.78 (2C), 128.84 (2C×2), 129.0, 129.3, 129.6 (2C), 131.6 (2C×2), 137.6, 138.5, 140.1, 151.9, 155.4, 161.5。IR (KBr, cm⁻¹) 501, 611, 696, 773, 876, 922, 1028, 1144, 1163, 1250, 1354, 1373, 1422, 1431, 1454, 1495, 1514, 1607。HRMS (FAB⁺) m/z 600.1639 (M+H, C₃₂H₃₀N₃O₅S₂requires 600.1627)。

［合成例１０］
5−(4−アセトキシフェニル)−2−(4−アセトキシフェニル)アセチルアミノ−3−ベンジルピラジン (c−29)

アルゴン雰囲気下、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−[(4−ヒドロキシフェニル)アセチルアミノ]ピラジン（セレンテラミド）(c−4) (Inouye, S. & Hosoya, T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 386, 617−622 (2009) に記載の方法によって製造) (410 mg, 997 μmol)をピリジン(11 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、無水酢酸 (475 μL, 5.02 mmol)を加え、室温に昇温後22時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄した。有機層に残った沈殿物をろ過した後、真空乾燥行い、5−(4−アセトキシフェニル)−2−(4−アセトキシフェニル)アセチルアミノ−3−ベンジルピラジン (c−29)を無色固体として得た(300 mg, 60.7%)。R_f = 0.28 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 225−227 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 318 (4.14), 290 (4.12), 259 (4.19)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.26 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 3.71 (s, 2H), 4.11 (s, 2H), 7.08 (t, J = 8.6 Hz, 4H), 7.15 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 7.21 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.24−7.29 (AA’BB’, 2H), 7.34−7.40 (AA’BB’, 2H), 8.08−8.14 (AA’BB’, 2H), 8.95 (s, 1H), 10.67 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 20.89, 20.92, 41.6, 121.8 (2C), 122.5 (2C), 126.3, 127.8 (2C), 128.3 (2C), 128.9 (2C), 130.3 (2C), 132.9, 133.2, 137.9, 138.1, 144.4, 147.5, 149.3, 150.6, 151.7, 169.1, 169.3, 169.9 (one carbon at benzyl position was unobservable due to overlapping with septet peak of DMSO)。IR (KBr, cm⁻¹) 515, 590, 654, 704, 854, 918, 1016, 1157, 1190, 1211, 1238, 1346, 1371, 1418, 1449, 1493, 1543, 1672, 1751, 3287。HRMS （FAB+） m/z 496.1863 (M+H, C₂₉H₂₆N₃O₅requires 496.1872)。

［合成例１１］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン (c−30)

アルゴン雰囲気下、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン (c−19) (194 mg, 607 μmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、4−(ジメチルアミノ)ピリジン (7.8 mg, 64 μmol)を加えて0 ℃に冷却した。これにフェニルアセチルクロリド (160 μL, 1.21 mmol)を加えて、室温に昇温し2時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止し、桐山ロートを用いて沈殿物をろ過した後、残渣を真空乾燥し5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−(フェニルアセチルアミノ)ピラジン(c−30)を無色固体として得た (53.9 mg, 20.3%)。R_f = 0.24 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 228−231 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 318 (4.19), 290 (4.17), 259 (4.24)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.29 (s, 3H), 3.68 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 7.01−7.08 (AA’BB’, 2H), 7.11−7.22 (m, 3H), 7.23−7.29 (m, 3H), 7.31−7.38 (m, 4H), 8.07−8.14 (AA’BB’, 2H), 8.93 (s, 1H), 10.57 (s, 1H)。IR (KBr, cm⁻¹) 706, 851, 918, 1157, 1206, 1223, 1346, 1366, 1410, 1449, 1495, 1543, 1576, 1670, 1755, 3248。HRMS (FAB⁺) m/z438.1806 (M+H, C₂₇H₂₄N₃O₃ requires 438.1818)。

［合成例１２］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン (c−31)

アルゴン雰囲気下、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン（h−セレンテラチオアミド） (c−14) (183 mg, 444 μmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これに、無水酢酸 (55 μL, 0.58 mmol)を加え、室温に昇温後2時間撹拌した。さらにこれに、無水酢酸 (25 μL, 0.26 mmol)を加え、室温で2.5時間撹拌した。これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で3回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (22 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)で精製した後、得られた固体をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー (7 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)で精製し、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−(フェニルチオアセチルアミノ)ピラジン(c−31)を淡黄色固体として得た (96.3 mg, 47.8%)。R_f = 0.36 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)。Mp. 143−145 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 320 (4.30), 258 (4.41)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 346 (4.36), 274 (4.35)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.29 (s, 3H), 3.95 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 7.00 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.12−7.24 (m, 3H), 7.26−7.32 (AA’BB’, 3H), 7.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.12−8.18 (AA’BB’, 2H), 9.04 (s, 1H), 12.23 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 20.9, 39.4, 51.6, 122.6 (2C), 126.4, 127.0, 128.0 (2C), 128.3 (2C), 128.4 (2C), 128.9 (2C), 129.0 (2C), 132.8, 136.8, 137.9, 138.6, 145.9, 149.0, 151.9, 152.4, 169.1, 204.7。IR (KBr, cm⁻¹) 700, 1128, 1165, 1179, 1200, 1238, 1368, 1389, 1416, 1441, 1493, 1508, 1730, 3265。HRMS (FAB⁺) m/z454.1583 (M+H, C₂₇H₂₄N₃O₂S requires 454.1589)。

［合成例１３］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−(ベンジルスルホニルアミノ)ピラジン (c−32)

アルゴン雰囲気下、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン (c−19) (303 mg, 949 μmol)をピリジン (3 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これにベンジルスルホニルクロリド (362 mg, 1.90 mmol)を加えて、そのまま30分間撹拌した。さらにこれに、ベンジルスルホニルクロリド (89.7 mg, 470 μmol)を加え、そのまま30分間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を水で1回、2 M 塩酸で1回、飽和硫酸ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣を桐山ロートを用いてろ過した後、残渣を酢酸エチル/メタノール (1/1)で再結晶し、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−(ベンジルスルホニルアミノ)ピラジン (c−32)を無色固体として得た (124 mg, 27.6%)。R_f = 0.56 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 240−241 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 324 (4.06), 286.5 (4.13), 264 (4.19)。UV (pH PB, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 338.5 (4.01), 290 (4.01), 273.5 (4.02)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.29 (s, 3H), 4.25 (s, 2H), 4.92 (s, 2H), 7.14−7.21 (m, 1H), 7.23−7.28 (m, 6H), 7.35 (s, 5H), 8.03−8.12 (AA’BB’, 2H), 8.93 (s, 1H), 10.55 (s, 1H)。IR (KBr, cm⁻¹) 530, 700, 889, 920, 1157, 1179, 1204, 1223, 1325, 1420, 1454, 1748, 3267。HRMS (FAB⁺) m/z 474.1486 (M+H, C₂₆H₂₄N₃O₄S requires 474.1488)。

［合成例１４］
5−(4−アセトキシフェニル)−2−アセチルアミノ−3−ベンジルピラジン (c−33)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラミン）(c−5) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)に記載の方法によって製造) (471 mg, 1.70 mmol)をピリジン (3.6 mL)、クロロホルム(9 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これにアセチルクロリド (910 μL, 12.8 mmol)を加えて、室温に昇温後、1時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (45 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1 → 1/3)で精製し、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アセチルアミノ−3−ベンジルピラジン (c−33)を淡黄色固体として得た(355 mg, 57.8%)。R_f = 0.17 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 215.5−217 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λ_max (log ε) 317 (4.09), 290 (4.08), 259 (4.15)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 315 (4.07), 292 (3.98), 253.5 (4.08)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.05 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 4.18 (s, 2H), 7.15−7.22 (m, 3H), 7.23−7.29 (m, 4H), 8.09−8.14 (AA’BB’, 2H), 8.94 (s, 1H), 10.31 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 20.9, 23.0, 39.9, 122.5 (2C), 126.3, 127.7 (2C), 128.3 (2C), 129.0 (2C), 133.2, 137.8, 138.2, 144.7, 147.3, 150.5, 151.6, 169.1, 169.2。IR (KBr, cm⁻¹) 706, 916, 1016, 1159, 1223, 1260, 1369, 1450, 1497, 1545, 1578, 1670, 1751, 3279。HRMS (FAB⁺) m/z 362.1509 (M+H, C₂₁H₂₀N₃O₃requires 362.1505)。

［合成例１５］
2−アセチルアミノ−3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラアセトアミド） (c−25)

5−(4−アセトキシフェニル)−2−アセチルアミノ−3−ベンジルピラジン(c−33) (355 mg, 982 μmol)をメタノール (8 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.8 mL)を加え、1時間撹拌した。これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (37 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)で精製した後、得られた固体をメタノールを用いて再結晶し、2−アセチルアミノ−3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン (セレンテラアセトアミド) (c−25)を無色固体として得た (109 mg, 34.8%)。R_f = 0.23 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/2)。UV (MeOH) λ_max (log ε) 332 (4.14), 294 (4.15), 275.5 (4.12)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 328 (4.14), 289.5 (4.03), 270 (4.08)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.03 (s, 3H), 4.13 (s, 2H), 6.84−6.89 (AA’BB’, 2H), 7.14−7.21 (m, 3H), 7.23−7.29 (m, 2H), 7.89−7.94 (AA’BB’, 2H), 8.80 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 10.21 (s, 1H)。IR (KBr, cm⁻¹) 592, 631, 702, 746, 837, 1128, 1157, 1173, 1211, 1231, 1279, 1314, 1368, 1435, 1497, 1518, 1543, 1582, 1591, 1611, 1672, 3026, 3073, 3254。HRMS (FAB⁺) m/z 320.1399 (M+H, C₁₉H₁₈N₃O₂requires 320.1399)。

［合成例１６］
2−アセチルアミノ−3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−24)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン (c−11) (Adamczyk, M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)に記載の方法によって製造) (199 mg, 681 μmol)を脱水ピリジン (1.4 mL)、およびクロロホルム(4 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。これにアセチルクロリド (365 μL, 5.13 mmol)を加えて、室温に昇温後、1時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をメタノールを用いて再結晶し、2−アセチルアミノ−3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)ピラジン(c−24)を無色固体として得た (74.6 mg, 32.9%)。R_f = 0.14 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。UV (MeOH) λ_max (log ε) 329.5 (4.18), 293 (4.18), 274 (4.16)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 328 (4.11), 289.5 (4.01), 270.5 (4.05)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.04 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 4.15 (s, 2H), 7.02−7.08 (AA’BB’, 2H), 7.15−7.22 (m, 3H), 7.23−7.29 (m, 2H), 8.00−8.05 (AA’BB’, 2H), 8.87 (s, 1H), 10.25 (s, 1H)。IR (KBr, cm−¹) 698, 744, 833, 1032, 1157, 1175, 1213, 1256, 1285, 1327, 1368, 1416, 1450, 1499, 1543, 1587, 1609, 1670, 3258。HRMS (FAB⁺) m/z 334.1557 (M+H, C₂₀H₂₀N₃O₂requires 334.1556)。

［合成例１７］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(メタンスルホニル)アミノピラジン (c−39)

アルゴン雰囲気下、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン (c−19) (337 mg, 1.05 mmol)を脱水ジクロロメタン (9 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (220 μL, 1.58 mmol)を加え、室温で撹拌した。これに、メタンスルホニルクロリド (245 μL, 3.16 mmol)を加え、そのまま1.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(28 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/1 → 3/2)で精製し、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(メタンスルホニル)アミノピラジン (c−39)を黄色アモルファスとして得た (241 mg, 48.3%)。R_f = 0.32 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 165.5−167 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 306 (4.29),293 (4.25), 259 (4.21)。UV (pH PB) λ_max (log ε) 336.5 (4.19), 264 (4.09)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.29 (s, 3H), 3.59 (s, 6H), 4.36 (s, 2H), 7.20−7.26 (m, 1H), 7.26−7.35 (m, 6H), 8.11−8.17 (AA’BB’, 2H), 9.14 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 20.9, 38.5, 43.1 (1C×2), 122.7 (2C), 126.6, 128.3 (2C), 128.6 (2C), 129.5 (2C), 132.1, 137.6, 139.2, 141.5, 151.4, 152.5, 155.6, 169.0。IR (KBr, cm⁻¹) 509, 523, 706, 756, 766, 912, 974, 1015, 1163, 1200, 1321, 1368, 1418, 1435, 1528, 1603, 1755, 3032。HRMS (FAB⁺) m/z 476.0936 (M+H, C₂₁H₂₂N₃O₆S₂requires 476.0950)。

［合成例１８］
3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)2−(メタンスルホニルアミノ)ピラジン（セレンテラメシルアミド） (c−34)

5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(メタンスルホニル)アミノピラジン (c−39) (239 mg, 503 μmol)をメタノール (5 mL)に懸濁させ、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.2 mL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (23 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)で精製し、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)2−(メタンスルホニルアミノ)ピラジン（セレンテラメシルアミド） (c−34)を淡黄色固体として得た(166 mg, 92.6%)。R_f = 0.30 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 208−209 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λ_max (log ε) 335 (4.12), 290 (4.25), 276 (4.27)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 349 (4.14), 281 (4.38)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.36 (s, 3H), 4.25 (s, 2H), 6.82−6.87 (AA’BB’, 2H), 7.15−7.23 (m, 1H), 7.29 (d, J = 5.0 Hz, 4H), 7.83−7.88 (AA’BB’, 2H), 8.73 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 10.41 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 38.2, 42.7, 115.8 (2C), 126.4, 126.6, 127.7 (2C), 128.4 (2C), 129.0 (2C), 135.9, 138.1, 144.3, 146.0, 146.4, 158.8。IR (KBr, cm⁻¹) 521, 538, 588, 606, 700, 750, 827, 841, 889, 916, 939, 970, 1118, 1138, 1153, 1175, 1213, 1273, 1314, 1400, 1456, 1495, 1609, 3206。HRMS (FAB⁺) m/z356.1060 (M+H, C₁₈H₁₈N₃O₃S requires 356.1069)。

［合成例１９］
3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−[(4−メチルフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ−p−トシルアミド） (c−35)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラミン） (c−5) (Adamczyk M. et al., Org. Prep. Proced. Int., 33, 477−485 (2001)に記載の方法によって製造) (199 mg, 718 μmol)をピリジン (1.5 mL)に溶解し、これに4−(ジメチルアミノ)ピリジン (9.0 mg, 74 μmol)を加え、0 ℃に冷却した。これに、p−トルエンスルホニルクロリド (410 mg, 2.15 mmol)を加え、室温まで昇温後2時間撹拌した。これに、2 M 塩酸とジクロロメタンを加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、ジクロロメタンで3回抽出した。飽和硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をメタノール (5 mL)に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.2 mL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M 塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (23 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)で精製し、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−[(4−メチルフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ−p−トシルアミド） (c−35)を黄色固体として得た (155 mg, 37.1% (2 steps))。R_f = 0.25 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 181−182.5 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 336.5 (4.10), 291.5 (4.26), 277 (4.27)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 351 (4.14), 282.5 (4.37)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.36 (s, 3H), 4.27 (s, 2H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.17−7.24 (m, 1H), 7.25−7.32 (m, 4H), 7.36 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.79 (t, J = 8.7 Hz, 4H), 8.53 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 10.74 (s, 1H)。IR (KBr, cm⁻¹) 474, 525, 546, 567, 610, 667, 698, 743, 816, 839, 876, 941, 1088, 1148, 1165, 1215, 1269, 1321, 1364, 1404, 1447, 1495, 1516, 1593, 1609, 3283。HRMS (FAB⁺) m/z432.1382 (M+H, C₂₄H₂₂N₃O₃S requires 432.1382)。

［合成例２０］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(4−ニトロフェニルスルホニル)アミノピラジン(c−40)

アルゴン雰囲気下、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン (c−19) (140 mg, 438 μmol)をピリジン (2 mL)に溶解し、これに4−(ジメチルアミノ)ピリジン (6.0 mg, 49 μmol)を加えた。これに室温で撹拌しながら、p−ニトロベンゼンスルホニルクロリド (293 mg, 1.32 mmol)を加えて、そのまま1.5時間撹拌した。さらにこれに、p−ニトロベンゼンスルホニルクロリド (195 mg, 880 μmol)を加え、17時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、ジクロロメタンで2回抽出した。有機層を水で1回、飽和硫酸ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (24 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1 → 3/1 → 7/3 → 酢酸エチルのみ)で精製し、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(4−ニトロフェニルスルホニル)アミノピラジン(c−40)を暗褐色固体として得た (157 mg, 52.1%)。R_f = 0.62 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 227−229.5 ℃ (dec.)。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 309 (3.99), 258 (4.21)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.30 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 7.19−7.27 (m, 1H), 7.29−7.35 (m, 6H), 8.05−8.10 (AA’BB’, 4H), 8.14−8.19 (AA’BB’, 2H), 8.39−8.44 (AA’BB’, 4H), 9.13 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆) δ 20.9, 38.0, 122.8 (2C), 124.8 (2C×2), 126.6, 128.3 (2C), 128.7 (2C), 129.6 (2C), 130.7 (2C×2), 131.9, 137.3, 139.8, 140.3, 142.1 (1C×2), 151.1 (1C×2), 151.9, 152.7, 156.2, 169.0。I,R (KBr, cm⁻¹) 548, 598, 617, 687, 737, 775, 810, 854, 880, 897, 916, 935, 1013, 1165, 1180, 1206, 1315, 1348, 1368, 1385, 1404, 1418, 1435, 1530, 1603, 1755, 3107。HRMS (FAB⁺) m/z690.0975 (M+H, C₃₁H₂₄N₅O₁₀S₂requires 690.0965)。

［合成例２１］
3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−[(4−ニトロフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ−p−ノシルアミド） (c−36)

5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(4−ニトロフェニルスルホニル)アミノピラジン(c−40) (151 mg, 219 μmol)をメタノール (3 mL)に懸濁させ、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (600 μL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。これにさらにメタノール (1 mL)、10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (400 μL)を順次加え、1時間撹拌した。室温まで放冷後、2 M 塩酸を加え反応を停止し、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (8 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)で精製し、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−[(4−ニトロフェニル)スルホニルアミノ]ピラジン（セレンテラ−p−ノシルアミド） (c−36)を橙色固体として得た (88.8 mg, 87.7%)。R_f = 0.13 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 176−177.5 ℃ (dec.)。UV (MeOH) λ_max (log ε) 338 (4.11), 276.5 (4.42)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 347 (4.15), 278.5 (4.49)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 4.28 (s, 2H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.17−7.25 (m, 1H), 7.29 (s, 4H), 7.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.15 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 8.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.52 (s, 1H), 9.81 (s, 1H), 11.25 (s, 1H)。IR (KBr, cm⁻¹) 633, 698, 748, 773, 827, 853, 970, 1084, 1121, 1231, 1263, 1277, 1350, 1395, 1501, 1514, 1528, 1611, 3227。HRMS (FAB⁺) m/z463.1086 (M+H, C₂₃H₁₉N₄O₅S requires 463.1076)。

［合成例２２］
2−アミノ−3−ベンジル−5−フェニルピラジン (c−41)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−ブロモピラジン (c−10) (1.66 g, 6.27 mmol)を1,2−ジメトキシエタン(17 mL)、エタノール (13 mL)に溶解し、これに室温で撹拌しながら2 M 炭酸ナトリウム水溶液 (31.4 mL, 62.8 mmol)、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II） (221 mg, 315 μmol)、フェニルボロン酸 (996 mg, 8.16 mmol)を順次加え、90 ℃で2.5時間撹拌した。室温まで放冷後、飽和食塩水と酢酸エチルを加え反応を停止し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2 → 1/1)で精製した後、得られた固体を酢酸エチルを用いて2回再結晶し、2−アミノ−3−ベンジル−5−フェニルピラジン (c−41)を黄色固体として得た(982 mg, 59.9%)。R_f = 0.30 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 4.07 (s, 2H), 6.41 (s, 2H), 7.18 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.24−7.31 (m, 3H), 7.34 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 8.41 (s, 1H)。IR (KBr, cm⁻¹) 596, 664, 694, 716, 733, 754, 773, 908, 937, 1070, 1152, 1217, 1233, 1396, 1427, 1450, 1462, 1493, 1543, 1636, 3024, 3125, 3291, 3487。HRMS (EI⁺) m/z 261.1269 (M, C₁₇H₁₅N₃requires 261.1266)。

［合成例２３］
3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノ−5−フェニルピラジン (c−42)

アルゴン雰囲気下、2−アミノ−3−ベンジル−5−フェニルピラジン (c−41) (852 mg, 3.26 mmol)を脱水ジクロロメタン (25 mL)に溶解し、これにトリエチルアミン (1.38 mL, 9.87 mmol)を加え、0 ℃に冷却した。これに、ベンジルスルホニルクロリド (1.87 g, 9.80 mmol)を加え、室温に昇温後23.5時間撹拌した。これに、2 M 塩酸を加え反応を停止し、水層と有機層を分離した後、有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(56 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)で精製し、3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノ−5−フェニルピラジン (c−42)を赤橙色アモルファスとして得た (1.27 g, 68.2%)。R_f = 0.70 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 71.5−74.5 ℃。UV (MeOH) λ_max (log ε) 304 (4.20), 257 (4.15)。UV (pH 7.4 PB) λ_max (log ε) 331 (4.13), 269 (4.12)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 3.89 (s, 2H), 5.00 (s, 1H), 5.04 (s, 1H), 5.19 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 7.15 (d, J= 7.0 Hz, 2H), 7.18−7.24 (m, 1H), 7.25−7.32 (m, 2H), 7.38−7.46 (m, 10H), 7.50−7.55 (m, 3H), 8.04−8.10 (m, 2H), 9.21 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆/CD₃OD = 2/1) δ 38.3, 61.7 (1C×2), 127.0, 127.5, 127.8 (1C×2), 128.8 (2C), 129.4 (2C×2), 129.7 (2C), 129.9 (2C), 130.2 (2C), 131.3, 132.2 (2C), 135.3, 138.3, 139.6, 142.0, 153.0, 156.5。IR (KBr, cm⁻¹) 507, 538, 557, 611, 629, 694, 723, 748, 766, 779, 876, 920, 1144, 1163, 1252, 1354, 1375, 1427, 1454, 1495, 1530, 3032。HRMS (FAB⁺) m/z 570.1526 (M+H, C₃₁H₂₈N₃O₄S₂requires 570.1521)。

［合成例２４］
3−ベンジル−2−ベンジルスルホニルアミノ−5−フェニルピラジン（ジデオキシセレンテラスルホンアミド） (c−37)

3−ベンジル−2−ビス(ベンジルスルホニル)アミノ−5−フェニルピラジン (c−42) (1.15 g, 2.02 mmol)をメタノール (24 mL)に懸濁させ、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (5.7 mL)を加え、65 ℃で30分間撹拌した。室温まで放冷後、2 M 塩酸を加え反応を停止し、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルを用いて再結晶し、3−ベンジル−2−ベンジルスルホニルアミノ−5−フェニルピラジン（ジデオキシセレンテラスルホンアミド） (c−37)を無色固体として得た(662 mg, 78.9%)。R_f = 0.62 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)。Mp. 207−208.5 ℃。UV (MeOH, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 322.5 (4.01), 285.5 (4.08), 261 (4.14)。UV (pH 7.4 PB, 0.3% DMSO) λ_max (log ε) 343 (4.01), 280.5 (4.07)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 4.26 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 7.15−7.21 (m, 1H), 7.23−7.30 (m, 4H), 7.36 (s, 5H), 7.40−7.53 (m, 3H), 8.04 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 8.95 (s, 1H), 10.55 (s, 1H)。¹³C NMR (75.5 MHz, DMSO−d₆/CD₃OD = 2/1) δ 38.5, 60.1, 126.7 (2C), 126.8, 128.8 (2C), 128.9, 129.0 (2C), 129.4 (2C), 129.5 (2C), 129.7, 130.4, 131.4 (2C), 136.3, 137.3, 138.5, 145.8, 146.3, 146.6。IR (KBr, cm⁻¹) 447, 515, 532, 546, 615, 664, 692, 748, 783, 889, 1117, 1157, 1179, 1323, 1400, 1425, 1450, 1495, 3034, 3267。HRMS (FAB⁺) m/z 416.1429 (M+H, C₂₄H₂₂N₃O₂S requires 416.1433)。

［合成例２５］
3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−[(4−メトキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン (c−44)

アルゴン雰囲気下、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−[(4−メトキシフェニル)アセチルアミノ]ピラジン (c−43) (Inouye, S. & Hosoya, T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 386, 617−622 (2009) に記載の方法によって製造) (1.00 g, 2.28 mmol) を脱水トルエン (30 mL) に懸濁し、室温で撹拌しながらこれにLawesson試薬 (552 mg, 1.37 mmol) を加え、17時間加熱還流した。還流後、室温まで放冷し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (100 g, ジクロロメタン/酢酸エチル = 49/1) で精製し、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−[(4−メトキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン (c−44) を黄色油状物質として得た (823 mg, 79.4%)。R_f = 0.43 (ジクロロメタン/酢酸エチル= 19/1)。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ 2.84 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.92 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 6.90−6.96 (AA’BB’, 2H), 6.98−7.04 (AA’BB’, 2H), 7.05−7.11 (AA’BB’, 2H), 7.13−7.26 (m, 3H), 7.38−7.50 (m, 2H), 8.06−8.11 (AA’BB’, 2H), 8.99 (s, 1H), 12.12 (s, 1H)。¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO−d₆) δ39.3, 50.8, 55.0, 55.3, 113.8 (2C), 114.5 (2C), 126.3, 127.6, 128.18 (2C), 128.21 (2C), 128.8, 128.9 (2C), 130.0 (2C), 137.8, 138.0, 145.0, 149.6, 152.1, 158.4, 160.8, 205.1。IR (KBr, cm⁻¹) 704, 835, 1030, 1113, 1175, 1250, 1292, 1304, 1319, 1371, 1422, 1439, 1493, 1510, 1607, 2835, 2932, 2957, 3150。HRMS (ESI⁺) m/z 456.1747 ((M+H)⁺, C₂₇H₂₆N₃O₂S⁺requires 456.1740)。

［合成例２６］
3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−[(4−ヒドロキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン（セレンテラチオアミド） (c−45)

アルゴン雰囲気下、3−ベンジル−5−(4−メトキシフェニル)−2−[(4−メトキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン (c−44) (823 mg, 1.81 mmol) を脱水ジクロロメタン (30 mL) に溶解し、これに室温にて1.0 M 三臭化ホウ素/ジクロロメタン溶液(6.80 mL, 6.80 mmol) を加えた後、反応溶液を21時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、ジクロロメタンを除去した。懸濁液をろ過し残渣を乾燥し、粗生成物である赤色固体591 mgを得た。これを酢酸エチルに溶解し、n−ヘキサンを加え生成物を析出させた。ろ過により析出した固体を回収し、減圧下で乾燥することにより、3−ベンジル−5−(4−ヒドロキシフェニル)−2−[(4−ヒドロキシフェニル)チオアセチルアミノ]ピラジン（セレンテラチオアミド） (c−45) を橙色固体として得た(514 mg, 66.6%)。R_f = 0.23 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 101−103 ℃。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ3.90 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 6.71−6.77 (AABB’, 2H), 6.85−6.91 (AA’BB’, 2H), 6.97−7.03 (AA’BB’, 2H), 7.12−7.25 (m, 3H), 7.27−7.34 (m, 2H), 7.94−8.00 (AA’BB’, 2H), 8.91 (s, 1H), 9.34 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 12.05 (s, 1H)。¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO−d₆) δ50.9, 115.1 (2C), 115.8 (2C), 126.0, 126.2, 127.0, 128.18 (2C), 128.24 (2C), 128.9 (2C), 129.9 (2C), 137.4, 138.0, 144.6, 149.9, 152.0, 156.4, 159.3, 205.3 (one carbon at benzyl position was unobservable due to over lapping with septet peak of DMSO)。IR (KBr, cm⁻¹) 515, 561, 706, 731, 837, 908, 935, 1063, 1130, 1171, 1238, 1315, 1371, 1443, 1514, 1609, 2808, 3026, 3159。HRMS (ESI⁺) m/z 428.1434 ((M+H)⁺, C₂₅H₂₂N₃O₂S⁺requires 428.1427)。

［合成例２７］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(4−ヨードベンジルスルホニル)アミノピラジン (c−46)

アルゴン雰囲気下、5−(4−アセトキシフェニル)−2−アミノ−3−ベンジルピラジン (c−19) (681 mg, 2.13 mmol) を脱水ジクロロメタン (40 mL) に溶解し、これにトリエチルアミン (1.20 mL, 8.53 mmol) を加え、0 ℃に冷却した。これに、4−ヨードベンジルスルホニルクロリド (Liu, S. et al., Org. Lett., 3, 1571−1574 (2001)に記載の方法によって製造) (2.70 g, 8.53 mmol)を加え、室温に昇温後、26時間加熱還流した。室温まで放冷後、これに、2 M 塩酸およびジクロロメタンを加え、水層と有機層を分離した後、有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過により除去した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (100 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1) で精製し、得られた生成物にジクロロメタンを加え、ろ過することにより不溶物を除去した。この操作を5回繰り返した後、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルを用いて再結晶し、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(4−ヨードベンジルスルホニル)アミノピラジン(c−46) を無色固体として得た (597 mg, 31.8%)。R_f = 0.21 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 4/1)。Mp. 166−167 ℃。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ2.30 (s, 3H), 3.89 (s, 2H), 5.00 (d, 2H, J = 13.6 Hz), 5.19 (d, 2H, J = 13.6 Hz), 7.11−7.17 (AA’BB’, 2H), 7.19−7.34 (m, 9H), 7.78−7.83 (AA’BB’, 4H), 8.07−8.15 (AA’BB’, 2H), 9.19 (s, 1H)。¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO−d₆) δ20.9, 37.5, 60.5 (2C), 96.3, 126.4, 126.5 (2C), 128.1 (2C), 128.5 (2C), 129.5 (2C), 132.0, 133.6 (4C), 137.4, 137.7 (4C), 139.2, 140.9, 151.2, 152.5, 155.5, 168.9。IR (KBr, cm⁻¹) 519, 575, 627, 704, 775, 835, 912, 1013, 1057, 1159, 1200, 1254, 1356, 1377, 1483, 1601, 1757。Anal. Calcd. For C₃₃H₂₇I₂N₃O₆S₂: C, 45.06; H, 3.09; N, 4.78. Found: C, 45.18; H, 3.24; N, 4.78。

［合成例２８］
5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−[(4−ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ]ピラジン (c−48)

アルゴン雰囲気下、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−ビス(4−ヨードベンジルスルホニル)アミノピラジン(c−46) (402 mg, 457 μmol) をジメチルスルホキシド（DMSO）(4 mL)に溶解し、これに室温にてbis(pinacolato)diboron (284 mg, 1.12 mmol)、酢酸カリウム (236 mg, 2.41 mmol)、[1,1’−bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)ジクロロメタン錯体 (1:1)(32.7 mg, 40.1 μmol)を順次加えた後、80 ℃で18時間攪拌した。室温まで放冷後、これに水を加え、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を水で3回、飽和食塩水で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50 g, n-ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)にて精製し、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−[4−{4−(4,4,5,5−テトラメチル−1,3,2−ジオキサボロラン−2−イル)ベンジル}スルホニルアミノ]ピラジン (c−47) と5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−[(4−ヨードベンジル)スルホニルアミノ]ピラジンの混合物を得た。
上記で得られた混合物をアセトン(10 mL)に溶解し、これに室温にてoxone (247 mg, 401 μmol)を水(3 mL)に溶解したものを加え、そのまま室温で15分間攪拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止し、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を水で1回、飽和食塩水で1回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 2/1、および50 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 3/2)にて精製し、得られたを無色固体を(68.5 mg)を酢酸エチルに溶解し、n−ヘキサンを加え化合物を析出させた。ろ過により析出した固体を回収し、減圧下で乾燥することにより、5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−[(4−ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ]ピラジン (c−48) を無色固体として得た (44.8 mg, 20.0%, 2 steps)。R_f = 0.45 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ2.30 (s, 3H), 4.26 (s, 2H), 4.81 (s, 2H), 6.68−6.79 (AA’BB’, 2H), 7.08−7.32 (m, 9H), 8.02−8.14 (AA’BB’, 2H), 8.94 (s, 1H), 9.55 (s, 1H), 10.45 (s, 1H)。¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ20.9, 37.9, 59.1, 115.3 (2C), 119.8, 122.4 (2C), 126.3, 127.2 (2C), 128.3 (2C), 128.9 (2C), 132.0 (2C), 133.3, 136.8, 137.9, 145.0, 145.4, 145.5, 151.3, 157.7, 169.1。IR (KBr, cm⁻¹) 536, 598, 702, 841, 891, 920, 1015, 1153, 1204, 1233, 1327, 1373, 1422, 1454, 1514, 1599, 1746, 3269。

［合成例２９］
3−ベンジル−2−(4−ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン （セレンテラスルホンアミド） (c−38)

5−(4−アセトキシフェニル)−3−ベンジル−2−[(4−ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ]ピラジン (c−48) (105 mg, 214 μmol)をメタノール (2 mL) に溶解し、室温で撹拌しながらこれに10% （w/v）水酸化ナトリウム水溶液 (1.0 mL) を加え、60 ℃で2時間撹拌した。室温まで放冷後、これに2 M塩酸を加え反応を停止した後、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ過することで除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー (10 g, n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)およびで精製し、n−ヘキサン/酢酸エチルを用いて再結晶することで、3−ベンジル−2−(4−ヒドロキシベンジル)スルホニルアミノ−5−(4−ヒドロキシフェニル)ピラジン（セレンテラスルホンアミド） (c−38) を黄色固体として得た(43.4 mg, 45.2%)。R_f = 0.29 (n−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)。Mp. 194.5−196.5 ℃。¹H NMR (400 MHz, DMSO−d₆) δ4.22 (s, 2H), 4.78 (s, 2H), 6.70−6.77 (AA’BB’, 2H), 6.83−6.90 (AA’BB’, 2H), 7.10−7.21 (m, 3H), 7.23−7.31 (m, 4H), 7.85−7.95 (AA’BB’, 2H), 8.81 (s, 1H), 9.54 (s, 1H), 9.81 (s, 1H), 10.30 (s, 1H)。¹³C NMR (67.8 MHz, DMSO-d₆) δ38.0, 59.1, 115.4 (2C), 115.8 (2C), 119.9, 126.3, 126.6, 127.7 (2C), 128.3 (2C), 129.0 (2C), 132.0 (2C), 135.9, 138.2, 144.4, 145.7, 146.4, 157.7, 158.8。IR (KBr, cm⁻¹) 536, 602, 700, 835, 889, 1119, 1155, 1177, 1258, 1275, 1327, 1402, 1456, 1514, 1611, 3529, 3412, 3487。Anal. Calcd. For C₂₄H₂₁N₃O₄S: C, 64.41; H, 4.73; N, 9.39. Found: C, 64.28; H, 4.74; N, 9.28。

３．蛍光特性の決定
［実施例１］
合成した各CTMD類縁体の蛍光量子収率決定を以下の手順で行った。蛍光スペクトルは、Jasco（日本分光株式会社、東京）のFP−6500蛍光分光光度計を用いて25℃で測定した。具体的には、石英セル（光路長10mm）を用い、最終濃度が750 nMになるようにCTMD類縁体をメタノール (MeOH)又は６７mMリン酸緩衝液(PB)（pH 7.4）に溶解し、励起波長：330 nm、 発光／励起帯域幅: 3 nm、レスポンス：0.5 秒、スキャン速度：100 nm/分で３回測定を行い、その平均スペクトルを、化合物蛍光スペクトルとした。蛍光量子収率決定には、スペクトル補正を行った後に使用した。

蛍光量子収率の標準対照溶液として、硫酸キニーネを用いた。硫酸キニーネ（和光純薬）を0.1 N硫酸水溶液に溶解したのち、励起光を366 nmで、上記の蛍光測定条件で測定を行った。硫酸キニーネの量子収率を、0.55として、化合物の相対的な蛍光量子収率（蛍光強度）を算出した。

上記表１から、本発明のセレンテラミド類縁体（c−14、c−17、c−31、c−15、c−18、c−32、c−21、c−20、c−39、c−34、c−35、c−42、c−37、c−40、又はc−36）が、公知のCTMD（c−4)やh−CTMD（c−13)などと異なる蛍光特性を有することが分かった。

また、本発明のセレンテラミド類縁体のうち、c−15、c−18、c−32、c−21、c−20、c−39、c−34、c−35、c−42、又はc−37は、有機溶媒又は水溶媒中での蛍光量子収率が0.090以上であり、強い蛍光能を有することが分かった。特に、c−15、c−18、c−32、c−21、c−20、c−35、c−42、又はc−37は、有機溶媒又は水溶媒中での蛍光量子収率が0.100以上であり、特に強い蛍光能を有することが分かった。

また、多くの蛍光性化合物は、有機溶媒中で強い蛍光能があっても水溶液中では蛍光能が著しく減弱することが知られているが、特に、c−18、c−32、又はc−37については、有機溶媒中でも、水溶媒中でも、蛍光量子収率が0.100以上であり、特に強い蛍光能を保持することが分かった。

［実施例２］
実施例１で求めた蛍光量子収率は、セレンテラミド類縁体の最終濃度を750 nMとして、蛍光スペクトルを測定し算出した数値であるが、実施例１のように最終濃度を750 nMとした場合、本発明のセレンテラミド類縁体のうち、c−14、c−31、及びc−36については、メタノール中およびリン酸緩衝液中とも蛍光スペクトルを検出できず、c−25は、リン酸緩衝液中で蛍光スペクトルを検出できなかった（n.d.：検出不可）。そこで、蛍光スペクトルを検出できなかったc−14、c−31、c−25 及びc−36について、これらのセレンテラミド類縁体の最終濃度を30 μMとしたことを除いて実施例１と同じ条件で蛍光スペクトルを測定した。また、同様に、c−4についても、最終濃度を30 μMとして蛍光スペクトルを測定した。さらに、c−45についても、最終濃度を 18μMとしたことを除いて実施例１と同じ条件で10 mM CaCl₂を含む50 mM Tris−HCl (pH 7.6)中で蛍光スペクトルを測定した。
c−14 (ｈCTTD)、c−31 (O−Ac−h−CTTD) 及び c−36 (CT−p−NsD) のメタノール中での蛍光スペクトルを図２示し、また、リン酸緩衝液中での、c−14 (ｈCTTD)、c−31 (O−Ac−h−CTTD)、 C−25 (CTAD) 及び c−36 (CT−p−NsD)の蛍光スペクトルを図３に示す。また、10 mM CaCl₂を含む50 mM Tris−HCl (pH 7.6)中での、c−45 (CTTD)の蛍光スペクトも図３に示す。
また、c−4、c−14、c−31、c−25 及び c−36の蛍光スペクトルデータを表２にまとめた。

この結果、c−14、c−31、及びc−36を含む本発明のセレンテラミド類縁体は、有機溶媒および水溶液中で、蛍光能を有することが明らかとなった。また、c−45については、少なくとも水溶液中で蛍光能を有することが確認できた。
尚、c−44（CTTD）については、c−17（hCTTD）に蛍光能があることから、c−17と同様、蛍光能を有すると考えられる。

以上の実施例で示したように、本発明の好ましい態様のセレンテラミド類縁体は、有機溶媒中および水溶液中の両方で蛍光能を有することから、バイオアッセイや生体内分子イメージングなど幅広い用途に応用可能である。

［実施例３］
c−38について、蛍光スペクトルを、Jasco（日本分光株式会社、東京）のFP−6500蛍光分光光度計を用いて25℃で測定した。具体的には、石英セル（光路長10mm）を用い、最終濃度が18μMになるようにc−38を10 mM CaCl₂を含む50 mM Tris−HCl (pH 7.6)に溶解し、励起波長：330 nm、 発光／励起帯域幅: 3 nm、レスポンス：0.5 秒、スキャン速度：100 nm/分で３回測定を行い、その平均スペクトルを、蛍光スペクトルとした。
c−38(CTSD)の10 mM CaCl₂を含む50 mM Tris−HCl (pH 7.6)での蛍光スペクトルを図４に示す。
図４から、c−38は蛍光能を有することが分かった。

［配列表フリーテキスト］
〔配列番号：１〕天然型アポイクオリンの塩基配列である。
〔配列番号：２〕天然型アポイクオリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：３〕天然型アポクライティン−Ｉの塩基配列である。
〔配列番号：４〕天然型アポクライティン−Ｉのアミノ酸配列である。
〔配列番号：５〕天然型アポクライティン−ＩＩの塩基配列である。
〔配列番号：６〕天然型アポクライティン−ＩＩのアミノ酸配列である。
〔配列番号：７〕天然型アポマイトロコミンの塩基配列である。
〔配列番号：８〕天然型アポマイトロコミンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：９〕天然型アポオベリンの塩基配列である。
〔配列番号：１０〕天然型アポオベリンのアミノ酸配列である。
〔配列番号：１１〕天然型アポベルボインの塩基配列である。
〔配列番号：１２〕天然型アポベルボインのアミノ酸配列である。

Claims (12)

1. 下記一般式（１）
   
   で表わされる化合物
   （式中、
   Ｒ^１は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、脂肪族環式基、又は複素環式基であり、
   Ｒ^２は、水素、又は−（ＳＯ_２）Ｒ^４であり、
   Ｒ^３は、水素、水酸基、メトキシ、又はアセトキシであり、
   Ｒ^４は、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、又は脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであり、
   Ｘ¹は、−Ｃ（＝Ｓ）−、又は−ＳＯ_２−である。）。
2. 一般式（１）において、
   Ｒ^１は、フェニル、ｐ−メチルフェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−アセトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、α−ヒドロキシベンジル、４−メチルベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−メトキシベンジル、４−アセトキシベンジル、４−ニトロベンジル、フェニルエチル、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピル、２−メチルプロパニル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、アダマンチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシル、又はチオフェン−２−イルであること、
   を特徴とする、請求項１に記載の化合物。
3. 一般式（１）において、
   Ｒ^２は、水素、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、４−ヒドロキシフェニルスルホニル、４−メトキシフェニルスルホニル、４−アセトキシフェニルスルホニル、４−ニトロフェニルスルホニル、ベンジルスルホニル、α−ヒドロキシベンジルスルホニル、４−メチルベンジルスルホニル、４−ヒドロキシベンジルスルホニル、４−メトキシベンジルスルホニル、４−アセトキシベンジルスルホニル、４−ニトロベンジルスルホニル、フェニルエチルスルホニル、メタンスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、２−メチルプロピルスルホニル、２−メチルプロパニルスルホニル、シクロヘキシルメチルスルホニル、シクロヘキシルエチルスルホニル、アダマンチルメチルスルホニル、又はシクロペンチルメチルスルホニルであること、
   を特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
4. 下記化合物
   
   からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
5. 下記化合物
   
   からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、及びカルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを含む、青色蛍光蛋白質。
7. カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンの存在下、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物と、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とを反応させることを含む、青色蛍光蛋白質の製造方法。
8. 前記反応を、還元剤の存在下において行う、請求項７に記載の方法。
9. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、及びカルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質を含む、緑色蛍光蛋白質。
10. 請求項６に記載の青色蛍光蛋白質を、カルシウムイオン又はカルシウムイオンと置換可能な２価若しくは３価のイオンを除去するためのキレート剤で処理することを含む、緑色蛍光蛋白質の製造方法。
11. 請求項９に記載の緑色蛍光蛋白質に、セレンテラジン又はその類縁体を反応させることを含む、カルシウム結合型発光蛋白質の製造方法。
12. 蛍光蛋白質とセレンテラジン又はその類縁体との反応を、還元剤の存在下において行う、請求項１１に記載の方法。