JP2926100B2 - 発色性メロシアニン酵素基質 - Google Patents

発色性メロシアニン酵素基質

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Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、分析試験システムにおいて光学的指示薬と
して有効な発色性化合物に関する。特に、本発明は、新
規な発色性酵素基質化合物ならびに液体試料中の酵素の
検出のための分析試験システムにおけるその使用に関す
る。
〈従来の技術〉 酵素の測定は、生化学的研究、環境及び工業試験並び
に医療診断といったさまざまな分野において重要であ
る。血清及び血漿のような体液内の酵素レベルの測定
は、罹患状態の診断及びその治療のうえで医者に対しき
わめて有益な情報を提供する。生物学的流体において関
心の的である分析物であるのに加え、酵素は、免疫学的
検定及び核酸のバイブリダイゼーション技法といったさ
まざまな分析システムにおいて検出試薬としても役立
つ。このようなシステムにおいては、酵素は、発生する
抗原−抗体結合又は核酸ハイブリダイゼーションの程度
を監視するための標識として直接的又は間接的に役立
つ。
従って、酵素分析物を検出しさまざまな分析試験シス
テムにおいて診断用手段として酵素標識を用いたいとい
う願望から、かかる酵素の活性の検出及び測定に用いる
ための光学的指示薬化合物の開発がなされてきた。通
常、このような既知の光学的指示薬化合物には、問題の
酵素に特異的な酵素によって開裂可能な基質の基によっ
て誘導体化されたフルオロゲン（蛍光原体）又はクロモ
ゲン（色原体）のような検出可能な化学基が含まれてい
る。このような光学的指示薬化合物は、開裂された未変
性形態のフルオロゲン又はクロモゲンにより提供される
光学的信号とは異なる光学的信号を示す。原則として、
酵素は、指示薬化合物を開裂させて、それ自体液体試料
内に存在する分析物の量に相関関係づけできる存在する
酵素の量に正比例する蛍光又は色の変化を提供すべく識
別可能な形で蛍光を発する又は着色された生成物の形で
フルオロゲン又はクロモゲンを遊離させる。
特に、エステル、グリコシド結合、ペプチド結合、そ
の他の炭素−窒素結合及び無水酸の加水分解反応に触媒
として作用する酵素である加水分解酵素（ヒドロラー
ゼ）の検出及び／又は測定［Lehninger著、「Biochemis
try（生化学）」（Worth Publishers Inc.,ニューヨー
ク、NY、1970年）p148参照］は、例えばすい臓不全の診
断におけるアミラーゼ及びリパーゼの測定［Kaplan and
Pesce著、「臨床化学−その理論、分析及び相関関係」
（C.V.Mosby Co.,セントルイス、MO、1984年、第56章参
照］、腎疾患の指示薬としてのＮ−アセチルグルコサミ
ニダーゼ（NAG）の測定［Price著、Curr.Probl.Clin.Bi
ochem.9、150（1979年）参照］及び白血球の指示薬とし
てのエステラーゼの検出［Skjold著、Clin.Chem.,31、9
93（1985年）参照］といったさまざまな疾患の診断及び
監視に際し、関心の的となっている。
酵素は又、診断ならびにバイオテクノロジーの分野で
も重要性を帯びてきている。例えば、アルカリホスファ
ターゼ及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼは、酵素免疫測定
法のための指示薬酵素としてますます利用されるように
なった［Annals of Clinical Biochemistry16、221−40
（1979年）参照］。したがって、分析試験システムにお
ける指示薬酵素標識としてのグリコシダーゼ、特にβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼといった酵素の使用のため、β−
Ｄ−ガクトシダーゼによって加水分解されて、それぞ
れ、紫外領域で測光法により測定されるフェノール又は
短波長可視領域で測定されるニトロフェノールを遊離す
るようなフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、ｏ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及びｐ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド［Biochem.Z.,第33巻、p.209
（1960年）参照］の開発が行なわれることになった。そ
の他のいくつかの例を挙げると、欧州特許出願明細書第
156,347号の発色性レゾルフィン誘導体、ならびに欧州
特許出願明細書第270,946号の発色性アクリジノン誘導
体がある。
β−Ｄ−ガラクトシドの使用は又、Histochemie（組
織化学）、第35巻、p199及び第37巻、p89（1973年）に
記されているナフチル−β−Ｄ−ガラクトシド及びJ.Bi
ol,Chem.（生化学ジャーナル）、第195巻、p239（1952
年）に記されている、その６−ブロモ−α−ナフチル誘
導体といったように、組織化学的研究との関係において
も記述されてきた。このような試験システムによると、
酵素とガラクトシドが相互作用して遊離されるナフトー
ルは、さまざまなジアゾニウム塩と反応させられて、そ
れぞれのアゾ染料を生成し、この染料をこのとき視覚化
（可視化）することができる。
吸光係率、最大吸光度、水溶性、色の移行及び転換速
度といった発色性基質の諸特性の望ましい組合せを有す
る新しい化合物に対する必要性はひきつづき存在してい
る。
メモシアニン色素はこれまで分析試薬として用いられ
てきたが、発色性酵素基質としては用いられていない。
欧州特許出願明細書第47470号は、免疫化学測定法にお
ける抗体又は抗原のための標識としてのシアニン及びメ
ロシアニン色素の使用を記述している。標識づけされた
抗原又は抗体は免疫反応に付され、ハロゲン化銀と接触
させられ、次にこのハロゲン化銀が露光され現像され
る。その結果生じる光学濃度が測定される。PCT（特許
協力条約）公報第86-06374号は、診断用検定において役
に立つ生物活性ある部分と蛍光性の高いメロシアニン色
素の複合体を記述している。この出願明細書では、試料
中の分析物を測定するのに色素で標識づけされた抗体が
用いられている。Kiciak［Roczniki Chemii37225（1963
年）］は、メロシアニンアセテートエステルの調製につ
いて記述したが、それが呈色性酵素基質として機能しう
るという示唆は全く行っていない。
＜課題を解決するための手段＞ 本発明は、以下の一般式（Ａ）を有する新規な発色性
メロシアニン酵素基質化合物を提供する： ［式中、Ｙは分析せんとする該当する酵素に対する特異
性を与えるべく選択された酵素的に開裂可能な基を表わ
している。さらに、Ａは５−もしくは６−員の炭素環も
しくは複素環或いは５−及び／もしくは６−員の複素環
又は炭素環から成る縮合環系を完成する非金属原子団又
は残基を表し;Bは５−もしくは６−員の含窒素複素環又
は５−及び／もしくは６−員の複素環もしくは炭素環か
ら成る縮合環系を完成する非金属原子団又は残基を表
し;R1はアルキル又はアーリルを表し；同一であっても
異なっていてもよいＲ2及びＲ3は水素又は低級アルキル
であり；同一であっても異なっていてもよいm,n及びｐ
は、ｍ＋ｎ＋ｐが少なくとも２であることを条件として
０から３までの整数であり；そして、Ｘは対イオン（陰
イオン）である。］ 上記式中の基（原子団）Ａと共に形成される環系は本
書では酸性核と呼び、基（原子団）Ｂと共に形成される
環系は塩基性核と呼ぶ。
好ましい実施態様 メロシアニンは、1930年代初めにケンドール（Kenda1
1）（英国特許第426,718;428,222;428,359;428,360;43
2,628;549,201−4;555−549;555,550;624,027;624,951;
及び634,952号）及びブルッカー（Brooker）（米国特許
第2,078,233:2,089,729;2,153,169;2,161,331;2,165,21
9;2,165,338;2,170,803−7;2,177,401−3;2,185,182;2,
185,343;2,186,624;2,211,762;及び2,332,433）によ
り、独立して発見された一群の増感色素である。これら
の化合物に関する文献は、いくつかの総説の本題となっ
てきた。［Quarterly Reviews4,327（1950年）;The Che
mistry of Synthetic Ｄyes（合成染料の化学）第II
巻、K.Venkataraman著、Academic Press,ニューヨーク
（1952年）、第38章;Cyanine Ｄyes and Related Compo
unds（シアニン色素とその関連化合物）、F.Hamer著、I
nterscience Publishers,ニューヨーク（1964年）、第1
0章、11章及び14章;The Chemistry of Synthetic Ｄyes
（合成染料の化学）第IV巻、K.Venkataraman監修、Acad
emic Press,ニューヨーク（1971年）、第５章；及びThe
Chemistry of Heterocyclic Compounds（複素環式化合
物の化学）、第30巻、E.Taylor及びA.Weissberger監
修、Wiley−Interscience,ニューヨーク（1977年）］。
メロシアニン類は、以下の一般式（Ｂ）により示され
る酸性核と塩基性核で構成されている。
この分子内の発色団は次式（Ｃ）で表されている双極
子アミド系である。
単純なメロシアニンは、核が直接結合されている、す
なわち、式（Ｂ）においてｍ＝０であるものとして定義
づけされ、ジメチンメロシアニンはｍ＝１であるものと
して定義づけされる（上記「シアニン色素及びその関連
化合物」参照）。ジメチンメロシアニンはメロカルボシ
アニンとも呼ばれている（Kirk−Othmer Encyclopedia
of Chemical Technology第７巻、第３版、Wiley−Inter
science,ニューヨーク（1979年）、p335〜358）。ｍ＝
２及び３の同族体も知られている。このクラスの化合物
の調製のための合成方法が近年総説として出た（上記
「複素環式化合物の化学」参照）。
メロシアニン色素の中でも、スチルバゾリウムベタイ
ンタイプ［式（Ｄ）］のものは、その溶媒和発色特性の
ため、ひきつづき関心の対象となってきた。
すでに1920年にこのタイプの化合物は、酸の存在下で
「レモンイエロー（レモン様黄色）」を呈しアルカリの
存在下で「ブラッドレッド（血赤色）」となるpH指示薬
として機能することが報告された。［L.F.Werner,J.Am.
Chem.Soc.,42、2309（1920年）］。また、長年にわた
り、その他のpH指示薬がこのクラスの色素に入るものと
して認められてきた［Helv.23,247（1940年）;Ukran.Kh
in.Zhur.18,347（1952）;Farmacia（ブカレスト）22,34
5（1974年）］。酸性核の酸素官能性が誘導体化される
と、誘導体化されない色素からの色の移行（シフト）が
見られた［J.Org.Chem.14302（1949年;Roczniki Chemii
37,225（1963年）］。
本発明の目的は、酸性核の酸素官能性が酵素開裂可能
基で誘導体化されているようなメロシアニン染料を調製
し、かかる化合物が発色性酵素基質として有効であるか
否かを決定することにある。その結果、式（Ａ）の化合
物が、有利な発色性酵素基質であることがわかった。
本書で用いられている「アルキル」という語には、線
状及び枝分れした形の置換されていない一般式ＣnＨ
2n+1の炭化水素残基、好ましくは、メチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピルなどのｎが６以下の「低級ア
ルキル」脂肪族タイプの残基、ならびにその置換された
形のものが含まれる。
さらに「アリール」という語には、−の水素原子を除
去した芳香族炭化水素環又は環系から誘導された有機残
基が含まれ、さらに、フェニル及びナフトールといった
置換されていない炭化水素環残基及びその置換された形
のものが含まれるものとする。本発明においては、アリ
ール残基には、本発明に基づく発色性酵素基質化合物を
提供するべく当業者により選択されうる単数又は複数
の、同一の又は異なる官能基又は置換基をもつものが含
まれている。
さらに限定的に言うと、「アリール」及び「アルキ
ル」が置換される場合、かかる置換には、当該化合物の
有効な特徴を著しく損なわない官能基でモノ（単一）置
換又はポリ（多重）置換されたときのこのような基又は
置換基が含まれるものとする。かかる官能基は、合成的
に導入でき、結果として本発明に基づく安定した有効な
発色性酵素基質指示薬化合物を生じることのできるよう
な化学的基（原子団）を含む。かかる官能基の例には
（ただし、これらに制限されるわけではない）、ハロ
（例えばフルオロ、クロロ、ブロモ）、ジアルキルアミ
ノのような置換アミノ基、ニトロ基、アルコキシ基、ア
リールオキシ基、アルキル基、アリール基、シアノ基、
スルホ基、カルボキシ基及びアルコキシカルボニル基が
ある。
酵素的に開裂可能な基（原子団） 本発明によれば、酵素的に開裂可能な基Ｙは、臨床化
学において見られる多種多様な酵素、特に、加水分解酵
素に対し特異性を与える新規な発色性酵素基質化合物を
提供するように酵素特異性部分を含む化合物Ｙ−OHの基
である。この化合物Ｙ−OHには、糖及びその誘導体、脂
肪族及び芳香族のカルボン酸、アミノ酸及びペプチドを
含むアシル基及びリン酸基や硫酸基のような無機酸が含
まれているものとする（ただし必ずしもこれらに制限さ
れるわけではない）。
当業者にとっては、酵素開裂可能基Ｙの選択は、当
然、問題となっている特定の酵素により左右されるとい
うことは明らかであると考えるべきである。
例えば、問題の酵素がグリコシダーゼである場合、酵
素開裂可能基Ｙが特定のグリコシダーゼに対する天然の
基質に相当するグリコシド基であるようなグリコシドを
調製することができる。適当なグリコシド基には、特定
のグリコシダーゼ酵素に特異的なグリコシド基質に取り
込まれこの酵素によって開裂されうる、β−Ｄ−ガラク
トピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−
グルコピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース及びα−
Ｄ−マンノピラノースのような単糖及びオリゴ糖基なら
びにＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルノイラミ
ン酸などのアミノ糖及びそれに類似する基が含まれる
が、これらに制限されるわけではない。その他の適当な
グリコシド基としては、それ自体たとえばマルトペント
ース、マルトヘキソース及びマルトヘプトースの基のよ
うなある相応するグリコシダーゼにより開裂されうる単
糖又はオリゴ糖にサッカリド鎖分解酵素により分解され
うるような、α−１→４グリコシド結合によって連結さ
れた約２から20、好ましくは、２から７の単糖単位から
成るオリゴ糖鎖がある。
なお、グリコシド基が上述のようなオリゴ糖鎖である
ような或る種の場合においては、このような鎖は、まず
最初に、酵素的に開裂可能な基が二次的酵素によりメロ
シアニン指示薬基から開裂されるような二次的基質化合
物を生成するため測定中の酵素により、より短かいオリ
ゴ糖又は単糖に変性又は分解される。この場合この二次
的化合物は、次に、二次的酵素と接触させられて、上述
のような吸光度の測定可能な変化を生み出す。例えば、
測定にかかる酵素がα−アミラーゼである場合、オリゴ
糖鎖は、結果として得られるそのグリコシド基がそれぞ
れα−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼなどの二
次的酵素によりメロシアニン指示薬基から開裂されうる
ような、α−グルコシド又はβ−グルコシドといった二
次的グリコシド基質化合物を生成するべく開裂される。
非特異的エステラーゼ酵素の場合、酵素開裂可能基Ｙ
は、以下の次式を有するアシル基である： 式中、Ｖは低級アルキル又はアーリルであり、かかる
化合物はコリンエステラーゼ、アシラーゼ、リパーゼな
どの非特異的エステラーゼ酵素の検出のために用いるこ
とができる。
本発明の発色性酵素基質化合物はまた、白血球内に一
般に見られるタンパク質分解酵素の検出のためにも用い
ることができる。かかる化合物は、Ｙが化合物Ｙ−OHの
基でありＹ−OHがＮ保護されたアミノ酸又は短かいペプ
チド、例えば、約２から５個のアミノ酸単位で構成され
ているものであるような、一般式のエステルである。例
えば、ＹはＮ保護されたアミノ酸であるＮ−トシル−Ｌ
−アラニン基であってもよい。なお、本発明は、以下に
より詳細に記されているように、等価物として、その他
のカルボン酸残基、アミノ酸残基及びＮ保護基も意図し
ていることに留意されたい。
同様に、液体試料からのアルカリホスファターゼの検
出のための酵素開裂可能基Ｙは、Ｙ−OHがリン酸グルー
プである化合物Ｙ−OHの基である。
塩基性核及び酸性核 本発明のメロシアニン色素成分を形成するためには、
きわめて広範なさまざまな異った置換もしくは非置換の
塩基性核及び酸性核を使用することができる。文献中に
報告されているメロシアニンは表Ａに列挙されている、
第１図によって示される、塩基性及び酸性の核の組合せ
によって例示される。これらは、本発明の化合物を形成
するために用いることができるが、ここで−OYが酸性核
上の−OHと置換されることになる。メロシアニン色素の
その他の例は、本書中に引用されているさまざまな総
説、特許その他の文献中に見られる。
塩基性核 染料合成技術の熟練者であれば、既知のほぼどんな塩
基性核でも本発明化合物にとり込まれうるということを
認めることだろう。塩基性核は、基本的には、５−もし
くは６−員の含窒素複素環又は５−及び／もしくは６−
員の複素環もしくは炭素環から成る縮合環系である。し
たがって、式（Ａ）において、Ｂはかかる塩基性核を完
成するための適当な残基を表している。適当な非金属原
子団の代表的なものは、Ｃ、Ｓ、Ｏ、Ｎ、及びSeであ
る。５−もしくは６−員の複素環は、単結合及び／又は
２重結合により連結されたＮ、Ｏ、Ｓ又はSeの中から選
ばれた単数又は複数の複素原子（ヘテロアトム）及び炭
素原子で構成された環であり、その代表的なものは、表
Ｂに示されている核である。表Ｂに示されている核は、
塩基性核として有用な環及び環系の数例にすぎない。そ
の他のものならびに記述されている核のさまざまな誘導
体及び置換された形のものもこの目的のために用いるこ
とができるということは明白である。
特に好ましい塩基性核は、次式（Ｅ）を有する： 式中、Ｚは、例えば、ジ（低級アルキル）メチレンの
ようなジ置換メチレン；ビニレン；低級アルキルもしく
はフェニルで置換Ｎ、Ｏ、Ｓ又はSeのようなアルキル−
もしくはアリール置換のＮ、Ｏ、Ｓ又はSeであり、Ｒ1
は本書に記されているとおりであり、式中のフェニル基
は置換されていても置換されていなくてもよい。塩基性
核は置換されていなくてもよいし或いは又、最終の発色
性基質の望ましい特性を実質的に防げないようなタイプ
及び数の置換基を一定の与えられた核上にもっていても
よい。かかる置換基には、アルキル、特に、低級アルキ
ル、アリール、特に、フェニル及び置換されたフェニ
ル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロ、ニトロ及びア
ミノ又はジアルキルアミノのような置換されたアミノ、
シアノ、スルホ、カルボキシル、カルボキシアルキル、
カルボキサミド並びにカルボキサミドアルキルが含まれ
ることが削るであろう。
塩基性核の代表例としては、チアゾール、４−メチル
チアゾール、４−フェニルチアゾール、4,5−ジメチル
チアゾール、4,5−ジフェニルチアゾール、ベンゾチア
ゾール、４−クロロベンゾチアゾール、５−クロロベン
ゾチアゾール、６−クロロベンゾチアゾール、７−クロ
ロベンゾチアゾール、５−ニトロベンゾチアゾール、６
−ニトロベンゾチアゾール、４−メチルベンゾチアゾー
ル、５−メチルベンゾチアゾール、６−メチルベンゾチ
アゾール、５−ブロモベンゾチアゾール、６−ブロモベ
ンゾチアゾール、５−ヨードベンゾチアゾール、５−フ
ェニルベンゾチアゾール、５−メトキシベンゾチアゾー
ル、６−メトキシベンゾチアゾール、５−エトキシベン
ゾチアゾール、５−エトキシカルボニルベンゾチアゾー
ル、５−フェネチルベンゾチアゾール、５−フルオロベ
ンゾチアゾール、５−クロロ−６−ニトロベンゾチアゾ
ール、５−トリフルオロメチルベンゾチアゾール、5,6
−ジメチルベンゾチアゾール、テトラヒドロベンゾチア
ゾール、４−フェニルベンゾチアゾール、５−フェニル
ベンゾチアゾール、ナフト（2,1−ｄ）チアゾール、ナ
フト（1,2−ｄ）チアゾール、ナフト（3,4−ｄ）チアゾ
ール、５−単一メトキシナフト（1,2−ｄ）チアゾー
ル、７−エトキシナフト（2,1−ｄ）チアゾール、８−
メトキシナフト（2,1−ｄ）チアゾール、５−メトキシ
ナフト（3,4−ｄ）チアゾール、オキサゾール、４−メ
チルオキサゾール、４−ニトロオキサゾール、５−メチ
ルオキサゾール、４−フェニルオキサゾール、4,5−ジ
フェニルオキサゾール、４−エチルオキサゾール、ベン
ゾキサゾール、５−クロロベンゾキサゾール、５−メチ
ルベンゾキサゾール、５−ブロモヘンゾキサゾール、５
−フルオロベンゾキサゾール、５−フェニルベンゾキサ
ゾール、５−メトキシベンゾキサゾール、５−トリフル
オロメチルベンゾキサゾール、５−ニトロベンゾキサゾ
ール、５−メチルベンゾキサゾール、６−クロロベンゾ
キサゾール、６−ニトロベンゾキサゾール、６−メトキ
シベンゾキサゾール、６−ヒドロキシベンゾキサゾー
ル、5,6−ジメチルベンゾキサゾール、4,6−ジメチルベ
ンゾキサゾール、５−エトキシベンゾキサゾール、ナフ
ト（2,1−ｄ）オキサゾール、ナフト（1,2−ｄ）オキサ
ゾール、ナフト（3,4−ｄ）オキサゾール、５−ニトロ
ナフト（3,2−ｄ）オキサゾール、４−メチルセレナゾ
ール、４−ニトロセレナゾール、４−フェニルセレナゾ
ール、ベンゾセレナゾール、５−クロロベンゾセレナゾ
ール、５−ニトロベンゾセレナゾール、５−メトキシベ
ンゾセレナゾール、５−ヒドロキシベンゾセレナゾー
ル、６−ニトロベンゾセレナゾール、５−クロロ−６−
ニトロベンゾセレナゾール、ナフト（2,1−ｄ）セレナ
ゾール、ナフト（3,4−ｄ）セレナゾール、3,3−ジアル
キルインドレニン及び環置換された3,3−ジアルキルイ
ンドレニン類、１−アルキルイミダゾール、１−アルキ
ル−４−フェニルイミダゾール、１−アルキルベンズイ
ミダゾール、１−アルキル−５−メトキシベンズイミダ
ゾール、１−アルキル−５−シアノベンズイミダゾー
ル、１−アルキル−５−フルオロベンズイミダゾール、
１−アルキル−５−トリフルオロメチルベンズイミダゾ
ール、１−アルキルナフト（1,2−ｄ）イミダゾール、
１−アリール−5,6−ジクロロベンズイミダゾール、１
−アリール−５−クロロベンズイミダゾール、１−アリ
ールイミダゾール、１−アリールベンズイミダゾール、
１−アリール−５−クロロベンズイミダゾール、１−ア
リール−5,6−ジクロロベンズイミダゾール、１−アリ
ール−５−メトキシベンズイミダゾール、１−アリール
−５−シアノベンズイミダゾール、１−アリールナフト
（1,2−ｄ−）イミダゾール（なおここでアルキル基は
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、２
−ヒドロキシアルキル、３−ヒドロキシプロピルなどで
あり、アリール基はフェニル、置換フェニル、メチル置
換フェニル又はメトキシ置換フェニルである）がある。
塩基性核の例としては、さらに、２−ピリジン、４−ピ
リジン、５−メチル−２−ピリジン、３−メチル−４−
ピリジン及びキノリン核（例えば、２−キノリン、３−
メチル−２−キノリン、５−エチル−２−キノリン、６
−メチル−２−キノリン、６−メトキシ−２−キノリ
ン、８−クロロ−２−キノリン、４−キノリン、６−エ
トキシ−４−キノリン、６−ニトロ−４−キノリン、８
−クロロ−４−キノリン、８−フルオロ−４−キノリ
ン、８−メチル−４−キノリン及び８−メトキシ−４−
キノリン）がある。
特に好ましい塩基性核は、置換もしくは非置換の形
の、インドレニン、ナフトチアゾール、ベンゾキサゾー
ル、ベンゾチアゾール、キノリン、チアゾール、ローダ
ニン、ベンゾセレナゾール及びベンズイミダゾールであ
り、特に、４−メチルチアゾール、４−フェニルチアゾ
ール、ベンゾチアゾール、５−クロロベンゾチアゾー
ル、５−メチルベンゾチアゾール、６−メトキシベンゾ
チアゾール、ナフト（2,1−ｄ）チアゾール、ナフト
（1,2−ｄ）チアゾール、ベンゾキサゾール、５−メチ
ルベンゾキサゾール、ベンゾセレナゾール、3,3−ジメ
チルインドレニン、４−キノリン、２−キノリン、６−
メトキシ−２−キノリン及び４−ピリジンを含む。
式（Ａ）に示されている塩基性核上の置換基Ｒ1は一
般に上述のようなアルキル又はアリールであってよく、
好ましくは、置換もしくは非置換の低級アルキル又はフ
ェニルである。制限されるわけではないが、例として
は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、フ
ェニル、β−フェネチル、１−ヒドロキシエチル、２−
メトキシエチル、２−（２−メトキシエトキシ）−エチ
ル、カルボキシメチル、２−カルボキシエチル、３−カ
ルボキシプロピル、４−カルボキシブチル、２−スルホ
エチル、３−スルホプロピル、３−スルホブチル、４−
スルホブチル、２−（ピロリジン−２−オン−１−イ
ル）エチル、テトラヒドロフルフリル、２−アセトキシ
エチル、カルボメトキジメチル、及び２−メタンスルホ
ニルアミノエチルがある。
式（Ａ）に示されているように、また、第１図におけ
るように陽イオンの塩基性核を表す際に暗に意味されて
いるように、メロシアニン化合物は、相応する対イオン
（陰イオン）Ｘを有している。この対イオンの性質は、
式（Ａ）の化合物がイオン化された形であるかイオン化
されていない形のものであるかにかかわらず、本発明に
とって制限はないと思われる。もっとも、溶解性は対イ
オンの性質の影響を受けるかもしれない（The Chemistr
y of Synthetic Dyes、第４巻、前述、p294参照）。し
たがって、かかる対イオンは、広範なさまざまな形態を
とることができる。一般に見られる対イオンを少数だけ
挙げてみると（なお、これらは、それが中で合成されて
いる反応混合物又はそれが溶解されている溶液からメロ
シアニンと複合体を作る）、それは塩化物、臭化物、ヨ
ウ化物、四フッ化ホウ酸塩、三フッ化酢酸塩、酢酸塩、
硫酸塩、トシル化物、リン酸塩及び過塩素酸塩のイオン
である。
酸性核 塩基性核の場合と同様に、酸性核は当該技術分野で知
られているように非常に広範にわたり変化しうる（第１
図、表Ａ及び引用した参考文献、前述）。酸性核は基本
的に５−もしくは６−員の炭素環又は複素環又は５−及
び／もしくは６−員の炭素環又は複素環から成る縮合環
系である。したがって、式（Ａ）において、Ａはこのよ
うな酸性核を完成するための適切な残基を表している。
適切な非金属原子団の代表的なものは、Ｃ、Ｓ、Ｏ、Ｎ
及びSeである。５−又は６−員の炭素環としては、単結
合及び／又は二重結合により連結された５つ又は６つの
炭素原子から成る環を指す。５−又は６−員の複素環と
しては、単結合及び／又は二重結合により連結された
Ｎ、Ｏ、Ｓ又はSeから選ばれた単数又は複数の複素原子
及び炭素原子から成る環を指す。表Ｃは、酸性核として
用いることのできる、いくつかの代表的な炭素環及び複
素環ならびに縮合環系を示している。示されている構造
は特定の酸性核の数例にすぎない。その他のものならび
に示されている核の種々の誘導体及び置換された形のも
のもまた、この目的に使用できることは明白である。
特に好ましい酸性核は、置換もしくは非置換の、1,2
−ナフチレン、1,4−フェニレン、1,4−ナフチレンそし
て2,6−ナフチレンである。
酸性核の代表例は、３−アルキル−12−ダニン、３−
アリール12−ダニン、１−アルキル−２−ピラゾリン−
５−オン、３−アリール−５−オキサゾロン、1,3−ジ
アルキル−２−チオヒダントイン（1,3−シアルキル−
２−チオ−2,4−イミダゾリジンジン、1,3−ジアリール
−２−チオヒダントイン（1,3−ジアリール−２−チオ
2,4−イミダゾリジンジオン核）、1,3−ジアルキル−２
−チオバルビツール酸、３−アルキル−４−チアゾリジ
ノン、３−アリール−４−チアゾリジノン、インダン−
1,3−シオン、チオインドキシル、1,3−ジアルキルヒダ
ントイン（1,3−ジアルキル−2,4−イミダゾリジンジオ
ン核）、1,3−ジアリールヒダントイン（1,3−ジアリー
ル−2,4−イミダゾリジンジオン核）、４−ヒドロキシ
フェニル、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル、４
−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル、２−ヒドロキシフ
ェニル、２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル、２−
ヒドロキシ−３−ニトロフェニル、２−ヒドロキシ−４
−ニトロフェニル、２−ヒドロキシ−５−エトキシフェ
ニル、２−ヒドロキシ−５−ジメチルアミノフェニル、
４−ヒドロキシ−１−ナフチル、２−ヒドロキシ−１−
ナフチル、９−ヒドロキシ−10−アントリル、４−ヒド
ロキシ−１−アントリル、６−ヒドロキシ−２−ナブチ
ル及び５−ヒドロキシ−１−ナフチルである。好ましい
酸性核には、４−ヒドロキシ−１−フェニル、４−ヒド
ロキシ−３−ニトロフェニル、２−ヒドロキシフェニ
ル、４−ヒドロキシ−１−ナフチル、２−ヒドロキシ−
１−ナフチル、６−ヒドロキシ−２−ナフチル、５−ヒ
ドロキシ−１−ナフチル及び４−ヒドロキシ−１−アン
トリルが含まれる。
塩基性核及び酸性核は、式（Ａ）に示されるように、
単結合（ｍ＝０）又は共役ビニレン基（ｍ＝１−３）に
より連結される。
ｍ＝１であるジメチンメロシアニンが最も一般的で好
ましい。この２重結合についての幾何学的配置は通常ト
ランスであるがシス配向も同様に考えられる。ｍ＝１で
ある場合、橋状炭素は置換されていてもいなくてもよ
い。例えば、Ｒ2及びＲ3は、同一であっても異なってい
てもよく、水素、低級アルキル又はシアノであってもよ
い。
本発明の特に好ましいクラスのメロシアニン系酵素基
質化合物は、式（Ｆ）により表わされる： 式中、Ｙは糖及びその誘導体、脂肪族及び芳香族の、
カルボン酸、アミノ酸、ペプチド、リン酸及び硫酸から
選ばれる化合物Ｙ−OHの基である、酵素的に開裂可能な
基であり;Bは、５−もしくは６−員の含Ｎ複素環、又
は、３個以下の、５−及び／もしくは６−員の複素環も
しくは炭素環から成る縮合環系を完成する非金属原子団
又は残基を表し:R1は置換もしくは非置換の低級アルキ
ル又はアリール、例えば、フェニルであり;Arは、置換
もしくは非置換のフェニレン、ナフチレン又はアントリ
レンであり;nは、１から３までの整数であり;Xは対イオ
ン（陰イオン）である。最も一般的には、Ｙ−OHはα−
Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ−ガラクトース、α−グルコ
ース、β−グルコース、α−マンノース、Ｎ−アセチル
グルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、又は、マル
トペントース、マルトヘキソース及びマルトヘプトース
などの約２から20個の単糖単位から成るオリゴ糖鎖であ
る。式（Ｆ）の化合物において、Arは、好ましくは、置
換されているか、或いは、より一般的には非置換の、1,
2−ナフチレン、1,4−フェニレン、1,4−ナフチレン、
又は2,6−ナフチレンであり、Ｂは置換もしくは非置換
のインドレニウム、β−ナフトチアゾリウム、ベンゾキ
サゾリウム、ベンゾチアゾリウム、キノリウム、チアゾ
リウム又はローダニンウムの残基を完成するが、より好
ましくは、式（Ｅ）のものである。
特に有用な化合物は次式（Ｇ）のものである： 式中、Ｙは、糖及びその誘導体の中から選ばれた化合
物Ｙ−OH、特に、β−Ｄ−ガラクトースの基であり;Ar
は1,4−フェニレン、1,4−ナフチレン又は2,6−ナフチ
レンであり;R1は置換もしくは非置換の低級アルキル、
特に、エチル又はメチルであり;Zは、ジ（低級アルキ
ル）メチレン、ビニレン、Ｏ、Ｓ、又はSeであり、式中
のフェニル環は置換もしくは非置換のものであり;Xは対
イオン（陰イオン）である。
合成 一般に色素（染料）合成は、文献において、適当な条
件下で、２つの中間体がある単純分子の脱離を伴って反
応するという縮合タイプのものとして特徴づけられてき
た。求核性及び求電子性試薬の組合せのこの一般的な記
述は、ほとんどの非酸化的色素合成法を網羅している。
通常、求核性試薬は、活性メチル第四級塩から誘導され
たメチレン塩基であり、求電子性試薬は、オルトエステ
ル又はアルデヒドである。活性メチル第四級塩（塩基性
核）と芳香族アルデヒド（酸性核）の塩基性条件下での
カップリングは、メロシアニン系色素の調製に用いられ
る一般的方法である。その他の方法も知られており、本
書中に引用されている文献に記述されている。
原則として、後に変性して酵素的に開裂可能な基を形
成するための酸性核上での利用可能なヒドロキシル基を
有するメロシアニン系色素をまず調製することができ
る。しかし、実際には、縮合されたメロシアニン系色素
が酵素的に開裂可能な基を形成するべく反応することは
ほとんどないため、これは一般に成功しないことがわか
っている。これは恐らく、酵素的に開裂可能な基の前駆
物質の縮合に必要な塩基性条件の下でメロシアニンが無
電荷の又は中性の互変異性体の形［式（Ｂ）参照］をし
ているためであると思われる。
従って、酵素的に開裂可能な基を含むようすでに変性
された酸性核に塩基性核を縮合させる収束合成が考案さ
れた。この合成の第１段階として、適当な酵素的に開裂
可能な基を組み込むために、適当な条件の下で、ヒドロ
キシル官能化されたアリールアルデヒドを反応させるこ
とにより、群のアリールアルデヒド中間体が形成され
る。結果として得られる化合物は、次式（Ｈ）を有す
る。
式中、Ａ、Ｙ、及びｐは、本書において前述したとお
りであり、Ｒ4は水素又は低級アルキルである。特に新
規なのは、次式（Ｊ）の中間体である： OHC−Ar−Ｏ−Ｙ （Ｊ） 式中、Arは置換もしくは非置換の、フェニレン、ナフ
チレン、特に、1,4−フェニレン、1,4−ナフチレン又は
2,6−ナフチレンである。
本発明の基質化合物を調製するために、かかるアリー
ルアルデヒドを、次（Ｋ）の第四級塩誘導体と、従来公
知の適当な塩基性条件下で反応せしめる： （式中、Ｂ、Ｒ1,n及びＸは前述のとおりであり、Ｒ5は
水素、低級アルキル又はシアノである。） 一般に、式（Ｊ）のアリールアルデヒドをまず、少な
くとも部分的にアリールアルデヒドを溶解することがで
きる適当な塩基性溶媒、塩基性溶媒混合物又は塩基を含
む溶媒の中に溶解又は懸濁させる。このような塩基性溶
媒には、ピリジン、キノリン、ピペリジン、ピロリジ
ン、ヘキサメチルホスホアミド並びにジ及びトリアルキ
ルアミンが含まれる。メタノール及びエタノールのよう
なアルコール類、テトラヒドロフラン及びジオキサンの
ようなエーテル類、ジメチルホルムアミド及びジメチル
アセトアミドのようなアミド類、トルエン及びベンゼン
のような芳香族、クロロホルム及びジクロロメタンのよ
うなハロアルカン類、アセトン及びメチルエチルケトン
のようなケトン類そして酢酸エチルのようなエステル類
を含む他の溶剤との、これら塩基性溶媒の混合物もまた
有用である。さらに、メタノール、エタノール及び第３
ブタノールといったアルコール溶媒中では、ナトリウム
メトキシド、ナトリウムエトキシド及びカリウム第３ブ
トキシドのようなある種のアルコキシド塩基が有用であ
る。好ましい溶媒はピリジンである。式（Ｊ）のアリー
ルアルデヒドの溶液又は懸濁液を、次に、0.5〜5.0モル
当量好ましくは1.0〜1.5モル当量の式（Ｋ）の第四級塩
を用いて、10分から５時間好ましくは0.25時間から2.25
時間、一度に又は部分量に分けて処理する。反応混合物
は、１分から36時間、好ましくは５時間から20時間、０
°Ｃ〜150°Ｃ、好ましくは50℃から100℃の温度に維持
し、次に溶媒を減圧下で除去し、式（Ｅ）の化合物をク
ロマトグラフィーなどの当該技術分野において既知の方
法を用いて精製する。
酵素的に開裂可能な基で変性されたアリールアルデヒ
ドの調製は、関与する開裂可能基のために適切に遂行さ
れる。
反応性酸性核のグリコシドは、適当な酸性核と反応さ
せられる化学式Ｙ−OHの炭水化物の既知の誘導体を用い
て、炭水化物化学の技術分野においては既知の方法に従
って調製することができる。場合によっては保護基を有
するこのような炭水化物誘導体は、市販されている（Al
drich Chemical社、ミルウォーキー、ウィスコンシン
州、USA:Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリ
州、USA）か、あるいは、当該技術分野において既知の
方法［炭水化物化学における諸方法（Academic Press,1
963年）、第２巻］に従って調製することもできる。適
当な式（Ｈ）のグリコシドを提供するよう酸性核にカッ
プリングさせるのに適したグリコシド基には、β−Ｄ−
ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β
−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、
α−Ｄ−マンノピラノース、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、β−グルクロン酸及びノイラミン酸といった糖の基
が含まれるが、これらに限られるわけではない。その他
の適当なグリコシド基には、それ自体相応するグルコシ
ダーゼにより色素核から直接分解されうる単糖又はオリ
ゴ糖のレベルまで、サッカライド鏡開裂酵素により分解
されうるオリゴ糖鎖の基が含まれる。ここでこのような
オリゴ糖鎖が、マルトペントース、マルトヘキソース又
はマルトヘプトースといった２個から20個、好ましく
は、２個から７個の単糖単位から成る鎖であることに留
意されたい。酸性核は単糖又はオリゴ糖又はその１−ハ
ロ−誘導体と反応させられ、ここで全てのヒドロキシル
基は、炭水化物化学の技術分野で既知の方法に従って保
護基と置換されて、ペル（過）−Ｏ−置換のグルコシド
を生成し、これから、当該分野において既知の方法に従
って保護基を開裂させることにより、酸性核のグリコシ
ドが得られる。
Ｙ＝Ｈである一般式（Ｈ）の化合物は、水性アセトン
又は（相転移条件下では）水／クロロホルムもしくは水
／ベンゼン混合物の中で、好ましくは水酸化アルカリ又
は炭酸アルカリのようなプロトン受容体の存在下で、過
−０−置換の１−ハロサッカライドと反応させられる。
この手順はさらに、まず酸性核を水酸化アルカリ又はア
ルコラートを用いてアルカリ塩に変えるか、又は置換さ
れていてもよいアミンを用いてアンモニウム塩に変換
し、次に、これらを、アセトン、ジメチルスルホキシ
ド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン又はジメチル
ホルムアミドのような双極性非プロトン溶媒中で、過−
Ｏ−置換の１−ハロサッカライドと反応させることによ
って行なうことができる。さらに、酸性核からの過−Ｏ
−置換グリコシドと過−Ｏ−置換１−ハロサッカライド
の合成においては、塩化メチレン、クロロホルム、ベン
ゼン、トルエン、酢酸エチル、キノリン、テトラヒドロ
フラン又はジオキサンといった溶剤中で、場合により、
塩化カルシウム、分子ふるい又はDrierite（W.A.Hammon
d Drierite Co,Xenia,オハイオ州、USA）といった乾燥
剤を併用する、酸化銀、炭酸銀、Celite（Johns−Manvi
lle Corp.デンバー、コロラド州、USA）上の炭酸銀、銀
トリフレートもしくはサリチル酸銀といった単独の銀塩
又は銀塩の混合物の形、及び／又は、臭化水銀、シアン
化水銀、酢酸水銀もしくは酸化水銀などの単独の水銀塩
又は水銀塩の混合物の形、及び／又は炭酸カドミウムも
しくは酸化カドミウムといった単独のカドミウム塩又は
その混合物の形での添加剤も効果的であることが立証さ
れている。α−結合されたグリコシドの合成において
は、Ｙ＝Ｈである一般式（Ｈ）の酸性核が、塩化亜鉛の
ようなルイス酸の存在下で、そのヒドロキシ基が保護
基、好ましくは、アセチル基と置換されているサッカラ
イドで融解させられる（Chem,Ber.66、378−383［1933
年］及びMethods in Carbohydrate Chemistry,Academic
Press,1967年、第２巻、p345〜347を参照のこと）。反
応温度は、好ましくは80°Ｃから130°Ｃの間、さらに
好ましくは110°Ｃから130°Ｃの間である。
一般式（Ｈ）のグリコシドを形成するための過−Ｏ−
置換グリコシドから保護基の除去は、ナトリウムメチラ
ート、バリウムメチラート又はメタノール中アンモニア
と共に保護アシル基を用いるもののような、炭水化物化
学の技術分野においては、既知の方法に従って行なわれ
る。［Advances in Carbohydrate Chem.,12、157（1976
年）参照］。炭水化物化学において一般に用いられる保
護基として特に適切なのは、アセチル、ベンゾイル、ベ
ンジル又はトリメチルシリル基である。
Ｙがα−１−４グルコシド結合を介して連結された約
２個乃至20個の単糖単位から成るオリゴ糖の基である一
般式（Ｈ）の酸性核は、さらに、酵素（１−４）−α−
グルカン−４−グルコシルトランスフェラーゼ（シクロ
マルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとし
ても知られている;EC2.4.1.19）による予め形成された
多糖鎖へのグルコシドの転移が関与する、まずFrench他
により記述され［J.Am.Chem.Soc.,76、2387（1954
年）］後にWallenfels他により記述された［「Carbohyd
rate Research」（炭水化物研究）61、359、（1978
年）］酵素的方法によって、α−及びβ−グルコシドか
ら調製することができる。
一般式（Ａ）のメロシアニン系色素のエステルは、発
色性の、エステラーゼ基質及びプロテアーゼの基質とし
て役立つ。かかるエステルは、まず第１にカルボン酸の
既知の誘導体を適当な酸性核と反応させて、化学式
（Ｈ）の反応性求電子性酸性核誘導体を生成させること
により、有機化学の技術分野では既知の方法によって調
製されうる。なお式中、Ｙは であり、（ここでＶは、アルキル、置換されたアルキル
（特にアミノアルキル）又はアリールである。この誘導
体は、次に式（Ｋ）の活性メチル第四級塩（塩基性核）
と縮合せしめられ、発色性メロシアニン酵素基質を提供
する。
式Ｙ−OHのカルボン酸のこのような既知の誘導体に
は、アミノ酸残基好ましくは、Ｌ又はＤ−型ならびにラ
セミ体型での天然α−アミノ酸の残基が含まれるが、こ
れらに限られるわけではない。なお、グリシン、アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ
ン及びチロシンの残基が好ましく、さらに好ましいのは
それらのＬ型である。存在する可能性のあるいかなる遊
離ヒドロキシル基もアシル化好ましくはアセチル化して
もよい。Ｙ−OHのこの定義づけにおけるペプチド残基
は、例えばジー、トリー、テトラー、及びペンターペプ
チドのような約２個乃至５個のアミノ酸単位からのアミ
ノ酸又はペプチドであると理解されるべきであるが、ジ
及びトリペプチドが好ましく、そのアミノ酸構成成分は
上述のアミノ酸である。また、かかるアミノ酸又はペプ
チドのアミノ基は、例えば、アシル、オキシカルボニ
ル、チオカルボニル、スルホニル、特に、ｐ−トルエン
スルホニル（Tosyl,Ts）、スルフェニル、ビニル、シク
ロヘキセニル及びカルバモイル、特にｔ−ブチル−（BO
C）及びベンジル−（CBz）カルバモイル基を含む、ペプ
チド化学の技術分野では既知の窒素保護基により保護さ
れていてもよいと考えるべきである（T.W.Green,Protec
tine Groups in Organic Synthesis,J.Wiley and Sons,
ニューヨーク、NY州、1981年、p218〜287）。このよう
なエステルはまた同様に、Ｙ＝Ｈとする一般式（Ｈ）の
化合物をカルボン酸、アミノ酸又はペプチド（Ｙ−OHは
上述のとおり）と、又はその適当な反応性誘導体と、有
機化学の技術分野では既知の方法を用いて［J.March,Ad
vanced Organic Chemistry:反応、メカニズム及び構
造、McGraw−Hill Book Co.,ニューヨーク、NY、1968
年、p319〜323）反応させることによっても調製されう
る。使用される反応性誘導体としては、例えば、クロル
蟻酸エチルとのもののようなペプチド合成において従来
用いられている酸塩化物又は臭化物又は混合された無水
物、或いは又Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのエステル
のような活性エステルが考えられる。
同様に、無機エステルは、有機合成の技術分野におい
て既知の方法に従って調製されうる。
であるような化合物といったリン酸又は であるような硫酸といった無機酸Ｙ−OHの既知の誘導体
は、或る種のクマリンの無機エステルについてのKollar
及びWolfbeis共著「Monatsh.」116、65、（1985年）に
示されているような、有機化学の技術分野では既知の方
法を用いて、Ｙ＝Ｈとする一般式（Ｈ）の化合物と反応
させられる。
分析方法 本発明の発色性酵素基質化合物は、その中に存在する
酵素の量を測定する必要がある分析試験システム、特に
酵素標識化検定試薬を用いるような分析試験システムに
おいて有用である。このような分析試験システムには、
その特定のフラクションの酵素標識の量を測定し液体試
料から得られた測定中の分析物の量とこれを相関関係づ
けすることのできる競合力あるサンドイッチ式免疫検定
技術として当該分野では知られている酵素免疫検定法が
含まれるが、これに制限されるわけではない。
ある酵素で標識化された、抗原、ハプテン、抗体、レ
クチン、受容体、アビジン及びその他の結合たんぱく質
のような特定の結合物質及びポリヌクレオチドの使用が
近年開発され、生物学的流体内の物質の測定に適用され
てきている［例えば、Clin,Chem.,第22巻、p1232（1976
年）；米国再発行特許第31,006号及び英国特許第2,019,
308号参照のこと。］一般にこのような測定は、ある酵
素により標識化された結合物質を含む標識付けされた試
薬がかかる結合の程度を測定するのに用いられるよう
な、ある特定の分析物に対し結合するというかかる結合
物質（例えば、抗体又は抗原）の能力により左右される
ものである。標準的にいって、結合の程度は、分析物と
の結合反応に参加した又は参加しなかった標識づけされ
た試薬内に存在する酵素標識の量を測定することにより
決定され、ここにおいて、検出され測定された酵素の量
を、液体試料内に存在する分析物の量に相関関係づけす
ることができる。
本発明の発色性酵素基質化合物は、この化合物を含ま
せた担体マトリクスを含む分析試験装置が用いられる上
述のもののような分析試験システムにおいて特に有用で
ある（なおここでその酵素特異的部分の性質は当然のこ
とながら、検出されている特定の酵素により左右され
る）。
かかる担体マトリクスの材料の性質は、溶液分析のた
めの試薬片として用いられるもののような本発明の発色
性酵素基質化合物を含ませうるいかなる物質の性質であ
ってもよい。例えば、米国特許第3,846,247号は、フェ
ルト、多孔質セラミクス片及び織物の又はマット織りの
グラスファイバーを記載している。米国特許第3,552,92
8号は、紙の代用物として、木材棒、クロス、スポンジ
材料及び粘土質の物質を記載している。紙の代りに合成
樹脂フリース及びグラスファイバーフェルトを使用する
ことは、英国特許第1,369,139号において提案されてお
り、英国特許第1,349,623号は、下にある紙のマトリク
スのためのカバーとして薄いフィラメントの透光性のメ
ッシュの使用を教示している。この特許はまた、試薬系
の一部分を紙に含浸させることそしてその他の相容性が
無い可能性のある試薬をメッシュに含浸させることも教
示している。フランス特許第2170,397号は、中に50％以
上のポリアミドファイバーを有する担体マトリクスの使
用を記述している。担体マトリクスに対するもう１つの
アプローチは、適当な担体マトリクス上に試薬を印刷す
るという概念が用いられている米国特許第4,046,513号
の中で記述されている。米国特許第4,046,514号は、反
応体系内で試薬を有するフィラメントを織り合わせるこ
と又は編み上げることを記述している。このような担体
マトリクスの概念は全て、他のものと同様、本発明での
使用が可能である。好ましくは、この担体マトリクスに
はろ紙といった湿気を吸収しやすい材料が含まれてお
り、こうしてマトリクスに含浸させるよう本発明の発色
性酵素基質化合物の溶液が用いられることになる。また
これには、試料と接触した時点で破壊する重合体マイク
ロカプセルのような、検定試薬を物理的にとらえるシス
テムが含まれていてもよい。また、これには、後に硬化
又は凝固して検定試薬をとらえるような流体又は半流体
状態の担体マトリクスと検定試薬を均質に組み合わせる
システムが含まれていてもよい。
好ましい実施態様においては、担体マトリクスは、当
該技術分野において標識化試薬の結合種から標識化試薬
の遊離種を物理的に分離するものとして知られている不
溶性の検定試薬を使用する液体環境内で特定の検定が行
なわれる場合に用いられる本発明の発色性酵素基質化合
物を含ませたゾーン又は層の形をした吸湿性の材料であ
る。このような検定システムによると、自由種を含む液
体のアリコートが取り出され担体マトリクスに適用さ
れ、ここで．その中に含まれている発色性酵素基質化合
物は液体試料からの自由種の標識化試薬の酵素標識と相
互作用して、目で観察できそして／又は分光光度計のよ
うな適当な計器により測定できる検出可能な信号を提供
する。
同様に、例えば最上層又はゾーン及び最下層又はゾー
ンの形をした２つ以上の担体マトリクスを含む試験具を
用いることもできる。このような試験具の最下層は、本
発明に基づく発色性酵素基質化合物を含ませることがで
き、ここにおいて測定中の分析物を含む液体試料は試験
具の最上層に適用される。その中で拡散する分析物は、
上述のようなその中の酵素標識付けされた試薬の自由種
及び結合（又は不動化された）種を生成するのに必要な
結合反応に参加する。したがって、こうして生成された
標識化試薬の自由種は、最上層内へと自由に移行でき、
ここで自由種の酵素標識はその中に含まれている本発明
の発色性酵素基質化合物の酵素開裂可能基を開裂させ、
上述のような測定可能かつ検出可能な信号を与える。
本発明はここで、以下の例により記述されるが、これ
らの例によって制限されるものではない。
＜実施例＞ 以下の例に記載されているようなメロシアニン基質の
合成には、２つの主要な工程が関与している。添付の第
２図から第５図までを参照すると、第１段階は、酸化銀
（Ｉ）及びキノリンの存在下、４個のアセチル基で保護
されたブロモ−α−Ｄ−ガラクトース及びそれに対応す
るヒドロキシアリールアルデヒドからのβ−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシアリールアルデヒドの合成と、それ
に続く、ナトリウムメトキシドを用いるアルカリ加水分
解によるヒドロキシ基の保護除去である。第２段階は、
活性メチル第四級アミン塩と基質で変性されたアリール
アルデヒドをカップリングさせて対応するメロシアニン
基質を得ることである。
A.アリールアルデヒド中間体の調製 ４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシロキシ）−ベンザル
デヒド（４） 1M NaOH（50ml）中の４−ヒドロキシベンズアルデヒ
ド（１）［Aldrich Chemical Co.,Inc.,ミルウォーキ
ー、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国（USA）］（6.1
g:50mmol）溶液を、雰囲気温度にて、アセトン（200m
l）中のアセトブロモ−α−Ｄ−ガラクトース（Sigma C
hemical Co.,セントルイス、ミズーリ州、USA（10.28g;
25mmol）溶液で処理した。反応混合物を22時間撹絆し、
次に、減圧下でアセトンを除去し、水性残留物をCHCl3
で三回（各80ml）抽出した。一緒に合わせたCHCl3抽出
物を、1M NaOHで３回（各100ml）、Ｈ2Ｏで２回（各200
ml）、そして最後に食塩水（150ml）で洗浄した。次
に、その溶液をMgSO4上で乾燥させたのちろ過して、減
圧下で蒸発乾固すると、さらに精製することなく使用さ
れる黄色の泡状物質として、４−（テトラ−Ｏ−アセチ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ベンズアル
デヒド（9.33g;82％）が得られた。［生成物は、Ｈ−R.
Rackwitz,Carbohydrate Research,88:223−32（1981
年）により調製されたものと同一であった］。
IR（KBr）cm-1:1740,1685,1595,1362,1218,10631 H NMR（CDCl3）δ:2.03（s,3H）,2.04（s,3H）,2.10
（s,3H）,2.20（s,3H）,4.21（br.s,3H）,5.03−5.63
（m,4H）,7.06−7.95（AB,4H）,9.93（s,1H） 無水メタノール（250ml）中の４−（テトラ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ベンズ
アルデヒド（9.33g;20.6mmol）溶液をナトリウムメトキ
シド（90mg）で処理し、雰囲気温度にて２時間撹粋し
た。次に、反応混合物を、氷酢酸（約0.2ml）を添加す
ることにより中和し、減圧下で蒸発乾固した。温EtOH
（250ml）から粗生成物を晶析せしめると、mp（融点）
＝189.92℃の微な細かい黄色針状晶として（４）（4.45
g;75.9％）が得られた［mp＝155−７℃,Z.Csuros他、Ac
ta.Chim.Acad.Sci.Hung.,42（３）、263−７（1964年;m
p＝177°C,F.Konishi他、Agric.Biol.Chem.,47（７）、
1419（1983年〕］。母液を処理すると第２の生成物（0.
46g;7.8％）が得られた。
IR（KBr）cm-1:3350,1685,1600,1515,1250,10901 H NMR（DMSO-d6）δ:3.40-3.85（m,6H）,4.65（極めて
幅広いs,4H）,5.01（d,J＝7Hz,1H）,7.10−7.95（AB,4
H）,9.89（s,1H）；13 C NMR（DMSO-d6）ppm:191.44,162.38,131.68,130.64,
116.60,100.60,75.82,73.42,70.42,68.34,60.60. ４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−１−ナ
フトアルデヒド（５） 1.0MのNaOH水溶液（25ml）中の４−ヒドロキシナフト
アルデヒド（２）（Trans World Chemical Co.,ロック
ヴィル、メリーランド州、USA）（4.304g,25mmol）溶液
をアセトン（100ml）中のアセトブロモ−α−Ｄ−ガラ
クトース（5.14g,12.5mmol）溶液で処理した。反応混合
物を、21.5時間、雰囲気温度で撹絆し、次に、アセトン
を減圧下で除去した。その結果得られた暗色混合物を、
CHCl3で４回（各40ml）抽出し、次に一緒にしたCHCl3の
層を、1.0M NaOH水溶液で３回（各50ml）、Ｈ2Ｏで２回
（各50ml）、そして食塩水で１回（50ml）洗浄した。次
に、CHCl3溶液をMgSO4上で乾燥させたのちろ過し、減圧
下で蒸発乾固すると、ベージュ色の泡状物質として粗生
成物（4.02g）が得られた。EtOAc/ヘキサンからの１回
の結晶化させると、mp（融点）＝177.8℃の分析学的に
純粋な白色棒状晶として、４−（テトラ−Ｏ−アセチル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−１−ナフトア
ルデヒド（2.79gm,44.4％）が得られた。
分析:C25Ｈ26Ｏ11としての 計算値:C,59.76;H,5.22 実測値:C,59.39:H,5.25 IR（KBr）cm-1:1740,1682,1600,1572,1510,1368,1220,1
060,7701 H NMR（DMSO-d6）δ:2.00（s,3H）;2.03（s,3H）,2.05
（s,3H）;2.18（s,3H）;4.20（d,J＝6Hz,2H）;4.65（t,
J＝6Hz,1H）;5.48（幅広いs,3H）;5.90（幅広いs,d,J＝
6Hz,1H）;7.37（d,J＝8Hz,2H）;7.55-7.90（m,2H）;8.0
0-8.35（m,2H）;9.12-9.35（m,1H）;10.28（s,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:192.68,169.92,169.79,169.46,
156.72,138.64,131.23,129.60,126.94,126.02,124.66,1
24.27,121.47,107.56,97.61,70.94,69.90,68.34,67.24,
61.32,20.29, （４つの同時バンド） HPLC級のメタノール（40ml）中の４−（テトラ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−１−ナ
フトアルデヒド（1.67g;3.32mmol）溶液を60°Ｃの浴中
で加熱し、ナトリウムメトキシド（15mg）で処理した。
３分以内に、厚い白色固体が分離した。30分後、反応混
合物を、水中にて冷却して、固体をろ過し、氷冷された
メタノールで２回洗浄し、真空乾燥させると、255°Ｃ
未満の、mp（融点）が無い分析学的に純粋な綿毛状の白
色固体として（５）（1.08g;97％）が得られた。
分析:C17Ｈ18Ｏ7としての 計算値:C,61.07;H,5.43 実測値:C,61.10;H,5.50 IR（KBr）cm-1:3400,1665,1574,1513,1254,1223,1100,7
681 H NMR（DMSO-d6）δ:3.44-3.64（m,3H）;3.68-3.88
（m,3H）;4.60（d,J＝4.6Hz,1H）;4.69（t,J＝5.5Hz,1
H）;4.96（d,J＝5.7Hz,1H）;5.19（d,J＝7.7Hz,1H）;5.
41（d,J＝5.4Hz,1H）;7.35（d,J＝8.2Hz,1H）;7.61-7.6
7（m,1H）;7.72-7.78（m,1H）;8.14（d,J＝8.2Hz,1H）;
8.44（d,J＝7.8Hz,1H）;9.20（d,J＝8.1Hz,1H）;10.21
（s,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:192.59,158.09,139.14,131.17,
129.30,126.25,125.08,125.03,123.95,122.68,107.61,1
01.00,75.89,73.16,70.32,68.17,60.42. ６−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−−２−ナ
フトアルデヒド（６） アルゴン下で、６−ヒドロキシ−２−ナフトアルデヒ
ド（３）［R.Grandhi著,J.Chem.Soc.,2530（1955年）］
（4.4g,25.6mmole）を100mlのキノリンに溶解させ、淡
黄色の溶液を得た。次に、アセトブロモ−α−Ｄ−ガラ
クトース（21.05g;51.2mmole）と酸化銀（Ｉ）（12.8g;
55mmole）を加え、得られた反応混合物を、暗所にて室
温で22時間撹絆した。反応混合物をろ過し、ろ過ケーキ
（ろ塊）をEtOAcで徹底的に洗浄した。次に、暗赤褐色
のろ液を、洗液が強い酸性になるまで1.25NのHClで洗浄
した。酸性水溶液を、次にEtOAcで抽出した。EtOAc溶液
を一緒に合わせて５％のNaHCO3と飽和NaCl溶液で洗浄
し、無水MgSO4上で乾燥させたのちろ過し、濃縮する
と、褐色の粘稠物質が得られるが、これをCHCl3に溶解
させ、フラッシュクロマトグラフィーにより、500mlの
シリカゲルを用いて、CH2Cl2/CH3OH（10/0.1v/v）で溶
出すると、オフホワイト色の固体として、６−（テトラ
−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）
−２−ナフトアルデヒド約13gが得られた。
アルゴン下で、上で得た６−（テトラ−Ｏ−アセチル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ナフトア
ルデヒド（12.8g,25.5mmole）を100mlのメタノール中に
溶解し、ナトリウムメトキシド（1g,18.5mmole）を添加
した。得られた反応混合物を半時間60°Ｃの油浴中で加
熱した。反応混合物を、濃縮しながら60mlのシリカゲル
上に吸着させ、次に、フラッシュクロマトグラフィーに
より800mlのシリカゲルを用いてCH2Cl2/CH3CH）［体積
比（v/v）、8.5/1.5］で溶出すると、オフホワイト色の
固体が得られた。
無水エタノールからの再晶析により、6.7g（78.8％）
の白色固体（６）［mp（融点）＝193°Ｃ（分解）］が
得られた。
元素分析:C17Ｈ18Ｏ7、1/10H2Ｏとしての 計算値:C,60.75;H,5.46 実測値:C,60.60;H,5.63 IR（KBr）cm-1:3403,1681,1624,1477,1267,1182,1071,7
811 H NMR（DMSO-d6）δ:3.42-3.59（m,3H）;3.61-3.78
（m,3H）;4.55（d,J＝5,1H）;4.68（t,J＝5,1H）;4.90
（d,J＝5,1H）;7.38（dd,J＝9,J＝2,1H）;7.57（d,J＝
2,1H）;7.85（d,J＝8.6,1H）;7.92（d,J＝8.6,1H）;8.1
1（d,J＝9,1H）:8.51（s,1H）;10.09（s,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:60.39,68.16,70.31,73.37,75.6
9,100.91,110.61,119.90,122.92,127.91,128.03,131.2
0,132.34,134.18,137,41,157.84,192.45. B.収束合成による基質化合物の調製 ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシスチリル）−3,3−ジメチルインドレ
ニウム（16） ４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ベンズ
アルデヒド（４）（1g,3.5mmole）、2,3,3−トリメチル
インドレニン・エチオジド（７）［Ｈ・Richter ＆ R.
L.Dresser著、J.Chem.Eng.Data,9（３）、406〜７（196
4年）］（1.1g,3.5mmole）及び20mlの無水ピリジンの混
合物を65°Ｃの油浴中で加熱し、暗いオレンジ色の溶液
を得た。４時間の反応の後、黄色固体が析出した。ピリ
ジンを減圧下で蒸発させた。得られた固体を高温メタノ
ール中に溶解し、溶液を濃縮しながら10mlのシリカゲル
上に吸着させ、次に、フラッシュクロマトグラフィーに
より300mlのシリカゲルを用いてCH2Cl2/CH3OH（体積比
8.5/1.5）で溶出すると、800mg（40％）の基質（16）
［mp139°Ｃ（分解）］が得られた。
IR（KBr）cm-1:3372,1588,1525,1480,1246,1174,1071,7
681 H NMR（DMSO-d6）δ:1.45（t,J＝5,3H）;1.8（s,6H）;
3.38-3.60（m,3H）;3.65-3.74（m,3H）;4.56（d,J＝4.
6,1H）;4.67（m,3H）;4.92（d,J＝5.7,1H）;7.21（d,J
＝9,2H）;7.60（m,3H）;7.89（m,2H）;8.24（d,J＝9,2
H）;8.44（d,J＝16,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:13.69,25.78,52.11,60.39,68.1
4,70.20,73.29,75.77,100.29,110.27,114.90,116.79,12
3.10,128.19,129.14,133.05,140,42,143.53,143.78,15
3.86,161.85,181.28 MS（FAB、グリセロール／メタノール）、m/z（相対強
度）:454（Ｍ+、21.9％）:292（Ｍ+−162,100％） ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−１−ビニレン−3,3−ジメ
チルインドレニウム（17） 無水ピリジン（105ml）中の、分子ふるい４Å（15g）
と４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−１−ナ
フトアルデヒド（５）（5.95g:17.8mmol）の撹絆された
混合物を、不活性ガス雰囲気下で65〜８°Ｃに保った。
これを2.25時間に亘って、45分毎に、2,3,3−トリメチ
ルインドレニウム・エチオジド（７）（H.Richter ＆
R.L.Dresser,前述）（計6.72g;21.3mmol）のうちの1.68
gづつで処理し、２時間撹絆した。反応混合物を冷却し
たのち、ろ過し、減圧下で蒸発乾固させた。残渣を、ジ
クロロメタン／メタノール（体積比85:15）の溶剤で展
開させられるシリカゲル（475g）上でクロマトグラフィ
ーに付し、（18）を含む留分を集めて、減圧下で蒸発乾
固した。粗生成物を、雰囲気温度でメタノール（100m
l）に溶解させ、酢酸エチル（700ml）で稀釈し、一夜、
０°Ｃに冷却した。分離した固体をろ過により集め、酢
酸エチルで洗浄し、真空乾燥させて、（17）を得た（3.
15g）。メタノール（75ml）及び酢酸エチル（600ml）か
らの上述のような１回の再結晶により、mp（融点＝165
°Ｃ（分解）の赤色固体として分析学的に純粋な（17）
（2.65g:24％）が得られた。
IR（KBr）cm-1:3320,1562,1509,1268,1225,1078,7621 H NMR（DMF−ｄ7）δ:1.62（t,J＝7,3H）;2.00（s,6
H）;3.47（v br.s,4H）;3.56-3.84（m,3H）:3.87-4.12
（m,3H）;4.98（q,J＝7,2H）;5.37（d,J＝7.7,1H）;7.5
2（d,J＝8.5,1H）;7.71（m,3H）;7.84（t,J＝7Hz,1H）;
7.95−‐8.12（m,3H）;8.56（t,J＝7,2H）;8.75（d,J-
8.5,1H）;9.21（d,J＝16.1H）13 C NMR（DMF-d7）ppm:13.99,26.73,43.18,53.14,61.5
9,69.23,71.67,74.54,77.03,102.17,109.80,112.76,11
5.64,123.45,123.76,123.96,125.07,126.81,129.47,12
9.86,129.91,131.26,133.62,141.48,144.66,150.10,15
9.37,181.8 MS（FAB、グリセロール／メタノール）、m/z（相対強
度）:504（Ｍ+、4.5％）342（Ｍ-162、100％）127
（Ｉ+、95％）。
元素分析:C30Ｈ34INO6・Ｈ2Ｏとしての 計算値:C,55.47;H,5.59;N,2.16 実測値:C,55.31;H,5.55;N,2.02 ヨウ化・１−エチル−２−（６′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−２′−ビニレン）−3,3−
ジメチルインドレニウム（18） アルゴン下で、６−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオ
キシ）−２−ナフトアルデヒド、（６）12.23g,6.7mmol
e）、2,3,3−トリメチルインドレニン・エチオジド
（７）（H.Richter ＆ R−L.Dresser,前述）（2.1g,6.7
mmole）及び40mlの無水ピリジンの混合物を21時間70°
Ｃの油浴中で加熱した。次にピリジンを減圧下で蒸発さ
せ、粘稠な暗赤褐色残渣を得、これをCH2Cl2、/CH3OH
（体積比9/1）に溶解させ、450mlのシリカゲル上でフラ
ッシュクロマトグラフィーに付しCH2Cl2/CH3OH（体積比
9:1）で溶出して赤色固体［mp（融点）177°Ｃ（分
解）］として2g（48％）の基質（18）を得た。
IR（KBr）cm-1:3400,1587,1470,1310,1189,1072,7601 H NMR（DMSO-d6）δ:1.48（t,J＝5,3H）;1.85（s,6
H）;3.43-3.59（m,3H）;3.61-3.77（m,3H）;4.57（d,J
＝4.5,1H）;4.69（t,J＝5.5,1H）:4.76（q,J＝7.2H）;
4.92（d,J＝5.7,1H）;5.08（d,J＝7.7.1H）;5.26（d,J
＝5.1,1H）;7.38（dd,J＝9,J＝2.4,1H）;7.58（d,J＝2.
2,1H）;7.64（m,2H）;7.76（d,J＝16,1H）,7,89-8.03
（m,4H）,8.37（dd,J＝9,J＝1.4,1H）;8.61（d,J＝16,1
H）:8.73（s,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:13.35,25.49,42.00,52.09,60.3
0,68.02,70.24,73.27,75.57,100.93,110.84,111.29,114
・77,119.85,122,76,124.68,127.71,128.37,128.86,12
9.12,130.12,130.79,134.04,136.57,140.15,143.64,15
4.04,157.85,181.33 MS（FAB、グリセリン、m/z（相対強度）:504（Ｍ+、1
0％）:342（Ｍ-162,45％） MS（EI）m/z:127（Ｉ+、90％） 塩化・３−エチル−
２−（４′−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシスチリ
ル）ベンゾチアゾリウム（19） 無水ピリジン（5ml）中の（４）（0.284g;1mmol）と
２−メチルベンゾチアゾール・エチドジド（８）（H.Ri
chter ＆ R.L.Dresser,前述）（0.336g;1.1mmol）の溶
液を75°Ｃの浴内で約20時間加熱し、次に雰囲気温度に
冷却し、減圧下で蒸発乾固させた。暗紫色の残渣を最少
量のメタノールで希釈し、予め平衡化された直径1 1/
2″長さ11″の低圧Ｃ−18逆相カラム（Bondapak Prep C
−18パッキング、Millipore社、Waters部門、ミルフォ
ード、マサチューセッツ州、USA）上にのせて、0.75M N
aOH/MeOH（7:3,v/v）で展開した。黄色生成物を含む画
分を、pH8のリン酸塩緩衝液中でβ−ガラクトシダーゼ
の一定量と共にインキュベートすることにより固定し
た。これらを集め、減圧下で蒸発乾固させ、繰返しメタ
ノール抽出することにより脱塩すると、黄色固体（0.47
g）が残った。これを、メタノールで、1 1/8″×33″の
Sephadex LH-20充填カラム（Pharmacia LKB Biotechnol
ogy InC.,ピスカットウェイ、ニュージャージー州、US
A）に２度通して展開することによって、さらに精製し
た。前述のようにして、目的生成物を含む画分を、pH8
のリン酸塩緩衝液中でβ−ガラクトシダーゼの一定量と
共にインキュベートすることにより固定し、次に、これ
を集めて２日間雰囲気温度で減圧下、蒸発乾固させる
と、オレンジ色の固体として（19）（0.14g;29％）が得
られた。単一のWaters μ−bondapak C−18カラム（Mil
lipore Corp.Waters部門、ミルフォード、マサチューセ
ッツ州、USA）を用いて1.0ml/分でCH3CN/0.01MNaH2PO4
（1:4,v/v）を流しながら、254nmか410nmで検出を行うH
PLC分析によれば、ｔR＝9.9分に、唯一のバンドを示し
た。
IR（KBr）cm-1:3360,1595,1510,1227,1180,1070;1 H NMR（DMSO-d6）δ:1.45（幅広いバンドt,J＝8Hz,3
H）,3.10-3.85（m,7H）,4.55-5.30（m,6H）,7.18（d,J
＝8Hz,2H）,7.65-8.55（m,8H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:171.61,168.16,160.88,145.11,
140.79,132.01,129.41,128.11,127.65,124.40,116.66,1
16.42,111.20,100.40,75.69.73.41,70.29,67.85,60.21,
44.14,14.11. ヨウ化・３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−ベンゾ
チアゾリウム（20） およそ同量の４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシロキ
シ）−１−ナフトアルデヒド（５）及び２−メチルベン
ゾチアゾール・エチオジド（８）（H.Richter ＆ R.L.D
resser,前述）を、少量のピペリジンを含むエタノール
中で約１分間還流下加熱した。当初無色であった混合物
は、この間に赤−オレンジ色になった。反応混合物中の
（20）の存在は、反応混合物の一部を同量のジメチルホ
ルムアミドと混合し、これを0.1Mのリン酸塩緩衝液（pH
＝7.0）で希釈し、得られた溶液をβ−ガラクトシダー
ゼで処理することにより確認した。酵素を添加すると、
溶液は黄色から紫色に変化した。
ヨウ化・３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−６−メ
トキシベンゾチアゾリウム（21） アルゴン下で、６−メトキシ−２−メチルベンゾチア
ゾール（5g,27.9mmole,Aldrich Chemical Companly,In
c.,ミルウォーキー、ウィスコンシン州、USA）とヨウ化
エチル（5.4ml、67mmole,Aldrich Chemical Company,In
c.,ミルウォーキー、ウィスコンシン州、USA）を混合
し、60°Ｃの油浴中で約20時間加熱した。析出した固体
をろ別し、アセトンで徹底的に洗浄し、乾燥させると、
６−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾール・エチオジ
ド（９）（2g,21％）［mp（融点＝180〜182°Ｃ）］の
白色固体が得られた。
IR（KBr）cm-1:2968,1601,1481,1443,1251,1048,853,81
41 H NMR（DMSO−ｄ6）δ:1.50（t,J＝7Hz,3H）,3.25（s,
3H）,3.95（s,3H）,4.80（q,J＝7Hz,2H）,7.40-8.50
（m,3H） MS（FAB、グリセロール／メタノール）、m/z（相対強
度）:308（Ｍ+、100％） 分析:C11Ｈ14INOSについて 計算された値:C,39.42;H,4.21;N,4.18 得られた結果:C,39.62;H,4.21;N,4.34 アルゴン下で、４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオ
キシ）−ナフトアルデヒド（５）（0.5g,1.5mmole）、
６−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾール・エチオジ
ド（９）（0.75g,2.3mmole）及び10mlの無水ピリジンを
65°Ｃの油浴中で加熱する。反応混合物からオレンジ色
の固定が徐々に析出した。５時間反応後、反応混合物を
室温に冷却し、固体をピリジン、CHCl3及びCH3OHで洗浄
すると、明るいオレンジ色の固体が得られた。減圧下
で、一晩、室温で乾燥させた後、0.5g（50％）の基質
（21）［mp（融点）＝229°Ｃ（分解）］が生成した。
元素分析:C28Ｈ30INO7Ｓとしての 計算値:C,51.62;H,4.64;N,2.15 実測値:C,51.38;H,4.53;N,2.30 IR（KBr）cm-1:3380,1603,1566,1253,1227,1079,7701 H NMR（DMSO-d6）δ:1.48（t,J＝7,3H）;3.48-3.64
（m,3H）;3.71-3.87（m,3H）;3.95（s,3H）;4.62（d,J
＝5,1H）;4.70（t,J＝5,1H）;4.88-5.02（m,3H）;5.18
（d,J＝7.6,1H）;5.44（d,J＝5,1H）;7.37（d,J＝8.5,1
H）;7.46（dd,J＝7.1,J＝2.2,1H）;7.65（t,J＝7.6,1
H）;7.76（t,J＝7.0,1H）;8.02（m,2H）;8.21（d,J＝9.
3,1H）;8.47（m,3H）;8.78（d,J＝15.5,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:13.36,43.68,55.51,59.68,67.3
8.69.48,72.30,75.11,100.26,105.95,107.97,112.01,11
6.63,117.75,122.11,123.04,124.15,125.08,127.30,12
8.12,129.26,131.19,134.09,142.77,156.29,158.51,16
7.59 MS（FAB、グリセロール／メタノール/HCl）、m/z（相
対強度）:362−（M-162、12％） MS（EI）m/z（相対強度）:127（Ｉ+、100％） ヨウ化・２−（４′−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオ
キシナフチル−１′−ビニレン）−３−メチル−β−ナ
フトチアゾリウム（22） アルゴン下で、４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオ
キシ）−ナフトアルデヒド（５）（0.50g,1.5mmole）、
２−メチル−β−ナフトチアゾールメチオジド（10）
（H.Richter ＆ R.L.Dresser,前述）（0.61g,1.8mmol
e）、20mlの無水ピリジン及び10mlの無水DMFの混合物を
65°Ｃの油浴中で５時間加熱し、暗褐赤色の混合物を得
た。薄層クロマトグラフィー（TLC）は、大量のアルデ
ヒド出発物質の存在を示した。もう一つの部分の２−メ
チル−β−ナフトチアゾール・メチオジド（10）（0.61
g,1.8mmole）を反応混合物に添加した。さらに２時間反
応後、反応混合物をろ過し、減圧下で、ピリジンとDMF
を留去した。メタノール中のKI溶液（KI 1g/メタノール
8ml）約1mlを残渣に添加し、次に、減圧下でメタノール
を蒸発させながら10mlのシリカゲル上に混合物を吸着さ
せた。CH2Cl2/CH3OH（体積比8.5/1.5）で溶出を行う、
シリカゲル200mlでのフラッシュクロマトグラフィー
と、それに続くCH3OH/Et2Ｏからの再晶析により、mp
（融点）＝160°Ｃの赤色固体として、27mg（３％）の
基質（22）が生成した。
IR（KBr）cm-1:3440,1620,1564,1230,1076,7751 H NMR（DMSO−ｄ6）δ:3.40-3.68（m,3H）;3.72-3.90
（m,3H）;4.63（d,J＝5,1H）;4.72（t,J＝5,1H）;4.82
（s,3H）;4.98（d,J＝5,1H）;5.19（d,J＝7.7,1H）;5.4
4（d,J＝5,1H）;7.38（d,J＝8.6,1H）;7.64（m,1H）;7.
76（m,1H）;7.89（m,2H）;8.15（m,1H）;8.33（d,J＝9,
2H）;8.43（m,2H）;8.52（d,J＝8.6,2H）;8.83（d,J＝1
5,1H）;9.00（d,J＝7.7,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:42.0,60.36,68.18,70.37,73.1
6,75.87,100.91,107.57,108.85,113.79,119.63,122.75,
122.93,124.04,124.95,125.91,127.85,128.09,128.52,1
28.73,129.92,131.13,132.08,133.58,137.85,139.28,14
3.15,145.41,156.53,170.15. ヨウ化・３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシロキシナフチル−１′−ビニレン）−５−メチ
ルベンゾチアゾリウム（23） アルゴン下で、2,5−ジメチルベンゾチアゾール（10
g,61mmole,Aldrich Chemical Company,Inc.,ミルウォー
キー、ウィスコンシン州）及びヨウ化エチル（9.8ml,12
3ml,123mmole,Aldrich Chemical Company,Inc.,ミルウ
ォーキー、ウィスコンシン州）を混合し、65°Ｃの油浴
中で約23時間加熱した。析出した固体をろ別し、アセト
ンで徹底的に洗浄し、無水エタノールから再結晶したの
ち、乾燥すると、2,5−ジメチルベンゾチアゾール・エ
チオジド（11）（3g,15.4％）［mp（融点）＝202〜203
°Ｃ］の固体が得られた。
元素分析:C11Ｈ14INSとしての 計算値:C,41.39;H,4.42;N,4.39 実測値:C,41.71;H,4.44:N,4,50 ４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ナフト
アルデヒド（５）（0.33g、1mmole）、2.5−ジメチルベ
ンゾチアゾール・エチオジド（11）（0.38g,1.2mmol
e）、3mlのピリジン及び分子ふるいの混合物を密閉した
フラスコ中、120°Ｃの油浴上で７分間加熱した。次
に、反応混合物を冷却させ、30mlのアセトンを加えた。
析出した赤色固体をろ別し、アセトンで洗浄した。次
に、固体をピリジンに溶解し、シリカゲルカラムを用い
てCH2Cl2/CH3OH（3/7,v/v）で、溶出して精製すると、m
p（融点）160°Ｃ（分解）の赤色固体として、0.2gの基
質（23）が得られた。
MS（FAB、ジエチオスレイトール／ジエチオエリスリ
トール／メタノール） m/z:508（Ｍ+、2.3％）346（Ｍ−162,30.1％）。
ヨウ化・３−エチル−２−（６′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−２′−ビニレン）−ベンゾ
セレナゾリウム（24） ６−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ナフ
トアルデヒド（６）（34mg,0.1mmole）、２−メチルベ
ンゾセレナゾール・エチオジド（12）（H.Richter ＆
R.L.Dresser,前述）（35mg,0.1mmole）と0.5mlの無水ピ
リジンの混合物を、70°Ｃの油浴中で20時間加熱した。
溶媒としてCH2Cl2/CH3OH（8.5/1.5、v/v）を用いるTLC
分析は、黄色生成物のスポットの存在を示し、これを0.
3M Bicene緩衝液（pH7.9）で抽出した。β−ガラクトシ
ダーゼ及び1NのNaOH1滴を加えると、溶液は直ちに紫色
に変化した。
臭化・３−（２″−カルボキジエチル）−２−（４′
−β−Ｄ−ガラクトピラノシロキシナフチルー１′−ビ
ニレン）−５−メチルベンゾキサゾリウム（25） アルゴン下で、４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオ
キシ）−ナフトアルデヒド（５）（0.5g,1.5mmole）、
臭化・３−（２′−カルボキシエチル）−2,5−ジメチ
ルベンゾキサゾリウム（13）（Aldrich Chemical Compa
ny,Inc.）（1.35g,4.5mmole）と10mlの無水ピリジンの
混合物を、65°Ｃの油浴中で3.5時間加熱した。次に、
反応混合物を室温に冷却し、続いて、CH2Cl2/CH3OH（8.
5/1.5、v/v）で溶出された80mlのシリカゲルでフラッシ
ュクロマトグラフィーに付し、mp150°Ｃ（分解）の赤
色固体として、240mg（30％）の基質（25）が得られ
た。
IR（KBr）cm-1:3219,1730,1606,1567,1512,1270,1224,1
077,77013 C NMR（DMSO-d6）ppm:20.0,32.5,44.07,60.41,68.16,
70.41,73.26,75.73,101.49,108.87,116.50,122.80,124.
02,125.27,125.49,127.24,127.73,128.14,129.77,131.5
8,136.79,137.21,139.38,142.06,145.21,151.07,154.2
0,165.20,172.04 MS（FAB、グリセロール／メタノール/HCL）m/z（相対
強度）:536（Ｍ+、４％）、374（Ｍ−162、20％）。
ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）キノリニ
ウム（26） ４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ナフト
アルデヒド（５）（0.33g、1mmole）、キナルジン・エ
チオジド（14）（H.Richter ＆ R.L.Dresser,前述）
（0.30g,1mmole）、分子ふるい（4A、８−12メッシュ）
及び5mlの無水ピリジンの混合物を、栓付き丸底フラス
コに入れ、120°Ｃの油浴中で15分間加熱した。薄層ク
ロマトグラフィーは、大量のアルデヒド出発物質の存在
を示した。さらに一部分のキナルジン・エチオジド（0.
1g,0.3mmole）を加え、得られた反応混合物を、さらに1
0分間加熱すると、暗色の粘稠混合物が得られた。次
に、反応混合物を冷却し、アセトンを加え、得られたス
ラリーをろ別し、大量のアセトンで洗浄し、明るいオレ
ンジ色の固体を得た。オレンジ色の粗生成物を温DMSOに
溶解し、次に、CH2Cl2/CH3CH（体積比9/1）で溶出され
た90mlのシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーに
付した。生成物を含む画分からオレンジ色の固体が析出
するが、これをろ別し、一晩、室温減圧下で乾燥させる
と、明るいオレンジ色の固体として、基質（26）26mgが
得られた［mp＝236〜237°Ｃ（分解）］。
IR（KBr）cm-1:3367,1603,1568,1339,1219,1076,7601 H NMR（DMSO−ｄ6）δ:1.60（t,J＝7,3H）;3.46-3.67
（m,3H）;3.70-3.90（m,3H）;4.62（d,J＝4.5,1H）;4.7
1（t,J＝5.1,1H）;4.97（d,J＝5.6,1H）;5.17（m,3H）;
5.43（d,J＝5.2,1H）;7.37（d,J＝8.5,1H）;7.63（t,J
＝7.5,1H）;7.73（t,J＝7.5,1H）;7.86（d,J＝15.5,1
H）:7.94（t,J＝7.3,1H）;8.19（t,J＝7.8,1H）;8.33-
8.51（m,3H）;8.57（d,J＝9.0,1H）;8.63（d,J＝8.6,1
H）;8.90（d,J＝9.0,1H）;9.00（d,J＝15.2,1H）;9.06
（d,J＝9,1H）13 C NMR（DMSO-d6）ppm:12.51,47.15,61.91,70.12,72.3
7,75.36,78.32,105.22,113.35,123.40,124.04,127.10,1
28.30,128.86,130.49,130.63,131.52,133.60,133.79,13
3.87,134.68,136.26,138.33,141.25,144.45,150.34,15
0.70,162.70,163.71 MS（FAB、ジチオスリエトール／ジチオエリスリトー
ル／メタノール）m/z（相対強度）:488（Ｍ+、7.7％）;
326（Ｍ-162、100％） MS（EI）m/z（相対強度）:127（Ｉ+、30％）。
ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−６−メ
トキシキノリニウム（27） アルゴン下で、６−メトキシキナルジン（10g、58mmo
le,Aldrich Chemical Company,Inc.,ミルウォーキー、
ウィスコンシン州、USA）とヨウ化エチル（9.3ml、116m
mole）を混合し、65°Ｃの油浴中で約20時間加熱した。
反応混合物にアセトンを添加した。固体をろ別し、アセ
トンで徹底的に洗浄し、無水エタノールから再晶し、乾
燥させると、６−メトキシキナルジン・エチオジド（1
5）の明るい黄色固体（4.2g,22％）が得られた。
４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ナフト
アルデヒド（５）（0.3g,0.9mmole）、６メトキシキナ
ルジン・エチオジド（15）（0.36g,1.1mmole）、分子ふ
るい（３Å、８〜12メッシュ）及び2mlの無水ピラジン
の混合物を、120°Ｃの油浴中で10分間加熱した。DMFを
加え、得られた反応混合物を、次に、CH2Cl2/CH3OH（体
積比8/2）で溶出された90mlのシリカゲルでフラッシュ
クロマトグラフィーに付し、26mgの基質（27）の赤色固
体（６％）が得られた。
MS（FAB、ジチオスレイトール／ジチオエリスリトー
ル／メタノール） m/z:518（Ｍ+、7.1％）;356（Ｍ±162、48.9％）。
ヨウ化・１−エチル−４−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−キノリ
ウム（29） ４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ナフト
アルデヒド（５）（34mg、0.1mmole）、レピジン・エチ
オジド（28）（H.Richter ＆ R.L.Dresser,前述）（30m
g、0.1mmole）及び0.5mlの無水ピリジンの混合物を、70
°Ｃの油浴内で３時間加熱した。次に、さらに、60mgの
レピジン・エチオジド（28）を加え、反応混合物を70°
Ｃの油浴中で計20時間反応させた。CH2Cl2/CH3OH（体積
比8/2）溶媒を用いるTLC分析は、黄色生成物のスポット
の存在を示したが、これを50mMのリン酸塩緩衝液（pH7.
4）で抽出した。β−ガラクトシダーゼを添加すると、
黄色溶液は、５秒以内に、青色に変化した。
C.発色性基質の特性研究 化合物のいくつかの特性を研究し、表Ｄに報告した。
D.試験片 0.3MのBicene緩衝液（pH7.9）中の、示された濃度の
基質と4mMのMgCl2をWhatman54紙（Whatman Inc.,クリフ
トン、ニュージャージ州、USA）に含浸させ、次に、室
温で１時間空気乾燥した。0.5×1.0cmの紙のパッドを、
次に、Double Stick）両面接着テープ（3M Company,
セントポール、ミネソタ州、USA）の2mmの細片を用いて
予め積層化された0.5×8.125cmのポリスチレンの細片
（Tricite,Dow Chemical Co.,ミッドランド、ミシガ
ン州、USA）の端部にとりつけた。その後、リン酸塩緩
衝液（pH7.4）中の示されたレベルのβ−ガラクトシダ
ーゼを30マイクロリットル、基質パッドに加え、反射率
を、５秒間隔で、SERALYZER反射率計（Miles Inc.,エ
ルクハート、インジアナ州、USA）を用いてこの発色団
に対し規定された、最大吸光度を示す波長で記録した。
反射率の値を、数学関数によって線形化し、Ｌ（Ｒ）単
位として識別される単位に変換した。
その結果を、第６図から第８図までに示した。
本発明は、以上、具体的に記述され例示された。当然
のことながら、その他の数多くの本発明の変更、及び修
正を、この発明の精神及び範囲から逸脱することなく加
えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、メロシアニンを形成することのできるいくつ
かの代表的な塩基性核及び酸性核を示す。 第２図から第５図までは、例中に記されているような基
質化合物の好ましい収束合成における主な段階の流れ図
である。 第６図から第８図までは、本発明のいくつかの基質化合
物の、酵素β−ガラクトシダーゼに対する用量−応答グ
ラフである。 ＜主な構成要素＞１ :4−ヒドロキシベンズアルデヒド２ :4−ヒドロキシナフトアルデヒド３ :6−ヒドロキシ−２−ナフトアルデヒド４ :4−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−ベンズ
アルデヒド５ :4−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−１−ナ
フトアルデヒド６ :6−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ナ
フトアルデヒド７ :2,3,3−トリメチルインドレニン・エチオジド８ :2−メチルベンゾチアゾール・エチオジド９ :6−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾール・エチオ
ジド10 :2−メチル−β−ナフトチアゾール・メチオジド11 :2,5−ジメチルベンゾチアゾール・エチオジド12 :2−メチルベンゾセレナゾール・エチオジド13 ：臭化・３−（２′−カルボキシエチル）−2,5−ジ
メチルベンゾオキサゾリウム14 ：キナルジン・エチオジド15 :6−メトキシキナルジン・エチオジド16 ：ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシスチリル）−3,3−ジメチルインド
レニウム17 ：ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−１−ビニレン−3,3−ジ
メチルインドレニウム18 ：ヨウ化・１−エチル−２−（６′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−２′−ビニレン）−3,3
−ジメチルインドレニウム19 ：塩化・３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシルオキシスチリル）ベンゾチアゾリウム20 ：ヨウ化・３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−ベン
ゾチアゾリウム21 ：ヨウ化・３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−６−
メトキシベンゾチアゾリウム22 :2−（４′−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシナフ
チル−１′−ビニレン）−３−メチル−β−ナフトチア
ゾリウム23 ：ヨウ化・３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−５−
メチルベンゾチアゾリウム24 ：ヨウ化・３−エチル−２−（６′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−２′−ビニレン）−ベン
ゾセレナゾリウム25 ：臭化・３−（２″−カルボキシエチル）−２−
（４′−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシナフチル−
１′−ビニレン）−５−メチルベンゾオキサゾリウム26 ：ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）キノリ
ウム27 ：ヨウ化・１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−６−
メトキシキノリニウム28 ：レピジン・エチオジド29 ：ヨウ化・１−エチル−４−（４′−β−Ｄ−ガラク
トピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−キノ
リウム
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｑ 1/44 (56)参考文献 特開 昭57−47493（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−500123（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C09B 23/00 C12Q 1/40 C12Q 1/42 C12Q 1/44 C07H 15/26 C07D 263/56 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (60)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式： ［式中、Ｙは糖、その誘導体、アミノ酸及びペプチドか
    ら選ばれる酵素的に開裂可能な基であり;Aは、 と共に、ナフチレン基を形成する残基を表し;Bは、 と共に、５−もしくは６−員の含窒素複素環、又は５−
    及び／もしくは６−員の複素環もしくは炭素環からなる
    縮合環系を形成する残基を表し;R1は、アルキル又はア
    リールであり;R2とＲ3は、同一でも異なっていてもよ
    く、水素又は低級アルキルであり;m,n及びｐは、同一で
    も異なっていてもよく、ｍ＋ｎ＋ｐが少なくとも２であ
    ることを条件として、０から３までの整数であり;Xは対
    イオン（陰イオン）である。］ で示される発色性メロシアニン酵素基質化合物。
  2. 【請求項２】前記の酵素的に開裂可能な基が、糖及びそ
    の誘導体からなる群から選択される化合物Ｙ−OHの基で
    ある、請求項１記載の化合物。
  3. 【請求項３】Ｙ−OHが、α−Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ
    −ガラクトース、α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−グルコ
    ース、α−Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン
    及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選ばれる
    糖又はその誘導体である、請求項２記載の化合物。
  4. 【請求項４】Ｙ−OHが、約２から約20の単糖単位からな
    る１つのオリゴ糖鎖である、請求項２記載の化合物。
  5. 【請求項５】Ｙ−OHが、β−Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ
    −グルコース又はα−Ｄ−グルコースである、請求項２
    記載の化合物。
  6. 【請求項６】Ａが、1,2−ナフチレン、1,4−ナフチレン
    又は2,6−ナフチレンを形成する残基を表す、請求項１
    記載の化合物。
  7. 【請求項７】Ｂが、５−もしくは６−員の含窒素複素環
    又は３つ以下の５−及び／もしくは６−員の複素環もし
    くは炭素環からなる縮合環系を形成する残基を表す、請
    求項１記載の化合物。
  8. 【請求項８】Ｂが、インドレニニウム、β−ナフトチア
    ゾリウム、ベンズオキサゾリウム、ベンゾチアゾリウ
    ム、キノリウム、チアゾリウム、ベンゾセレナゾリウム
    又はベンズイミダゾリウムの置換形又は非置換形から選
    ばれる環系又は縮合環系を形成する残基を表す、請求項
    ７記載の化合物。
  9. 【請求項９】Ｂが、次式： （式中、Ｚはジ置換メチレン、ビニレン、アルキル−も
    しくはアリール−置換されたＮ、Ｏ、Ｓ又はSeであり、
    式中のフェニル環は置換されているか非置換である） で示される縮合環系を形成する残基を表す、請求項７記
    載の化合物。
  10. 【請求項１０】Ｒ1が低級アルキル又はフェニルであ
    る、請求項１記載の化合物。
  11. 【請求項１１】Ｒ2及びＲ3が、共に水素である、請求項
    １記載の化合物。
  12. 【請求項１２】ｍ＋ｎ＋ｐが、３、４又は５である、請
    求項１記載の化合物。
  13. 【請求項１３】次式： ［式中、Ｙは、糖及びその誘導体、アミノ酸及びペプチ
    ドの中から選ばれる化合物Ｙ−OHの基であって酵素的に
    開裂可能な基であり;Bは、５−もしくは６−員の含窒素
    複素環又は３つ以下の５−及び／もしくは６−員の複素
    環もしくは炭素環からなる縮合環を形成する残基を表
    し;R1は、低級アルキル又はフェニルであり;Arは、ナフ
    チレンであり;nは０から３までの整数であり、Ｘは対イ
    オン（陰イオン）である］ で示される発色性メロシアニン酵素基質化合物。
  14. 【請求項１４】Ｙ−OHが、α−Ｄ−ガラクトース、β−
    Ｄ−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、
    α−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−ア
    セチルノイラミン酸である、請求項13記載の化合物。
  15. 【請求項１５】Ｙ−OHが、約２から20の単糖単位からな
    るオリゴ糖鎖である、請求項13記載の化合物。
  16. 【請求項１６】Ｙ−OHが、β−Ｄ−ガラクトースであ
    る、請求項13記載の化合物。
  17. 【請求項１７】Ｙ−OHが、β−Ｄ−グルコースである、
    請求項13記載の化合物。
  18. 【請求項１８】Ｙ−OHが、α−Ｄ−グルコースである、
    請求項13記載の化合物。
  19. 【請求項１９】Arが、1,2−ナフチレン、1,4−ナフチレ
    ン又は2,6−ナフチレンである、請求項13記載の化合
    物。
  20. 【請求項２０】Ｂが、インドレニニウム、β−ナフトチ
    アゾリウム、ベンゾキサゾリウム、ベンゾチアゾリウ
    ム、キノリニウム、チアゾリウム、ベンゾセレナゾリウ
    ム又はベンゾイミダゾリウムの置換形又は非置換形から
    選ばれる環系又は縮合環系を形成する残基を表す、請求
    項13記載の化合物。
  21. 【請求項２１】Ｂが、次式： （式中、Ｚはジ置換メチレン、ビニレン、アルキル−も
    しくはアリール−置換されたＮ、Ｏ、ＳもしくはSeであ
    り、Ｒ1は低級アルキル又はフェニルであり、そして、
    式中のフェニル環は置換もしくは非置換である） で示される縮合環を形成する残基である、請求項13記載
    の化合物。
  22. 【請求項２２】次式： ［式中、Ｙは糖及びその誘導体から選ばれる化合物Ｙ−
    OHの基であり;Arは1,4−ナフチレン又は2,6−ナフチレ
    ンであり;R1は低級アルキルであり;Zはジ（低級アルキ
    ル）メチレン、ビニレン、Ｏ、Ｓ又はSeであり、フェニ
    ル環は置換又は非置換であり;Xは対イオン（陰イオン）
    である］ で示される色原体メロシアニングリコシダーゼ基質。
  23. 【請求項２３】Ｙ−OHがβ−Ｄ−ガラクトースである、
    請求項22記載の化合物。
  24. 【請求項２４】１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシスチリル）−3,3−ジメチルイン
    ドレニニウムである、請求項23記載の化合物。
  25. 【請求項２５】１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシスチリル）−ベンゾチアゾリウム
    である、請求項23記載の化合物。
  26. 【請求項２６】Arが1,4−ナフチレンである、請求項23
    記載の化合物。
  27. 【請求項２７】１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−3,
    3−ジメチルインドレニニウムである、請求項26記載の
    化合物。
  28. 【請求項２８】３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−ベ
    ンゾチアゾリウムである、請求項26記載の化合物。
  29. 【請求項２９】３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−１−ビニレン）−６−
    メトキシベンゾチアゾリウムである、請求項26記載の化
    合物。
  30. 【請求項３０】２−（４′−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
    ルオキシナフチル−１′−ビニレン）−３−メチル−β
    −ナフトチアゾリウムである、請求項26記載の化合物。
  31. 【請求項３１】３−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−５
    −メチルベンゾチアゾリウムである、請求項26記載の化
    合物。
  32. 【請求項３２】３−（２″−カルボキシエチル）−２−
    （４′−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシナフチル−
    １′−ビニレン）−５−メチルベンゾキサゾリウムであ
    る、請求項26記載の化合物。
  33. 【請求項３３】１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−キ
    ノリニウムである、請求項26記載の化合物。
  34. 【請求項３４】１−エチル−２−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−６
    −メトキシキノリニウムである、請求項26記載の化合
    物。
  35. 【請求項３５】１−エチル−４−（４′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−１′−ビニレン）−キ
    ノリニウムである、請求項26記載の化合物。
  36. 【請求項３６】Arが2,6−ナフチレンである、請求項23
    記載の化合物。
  37. 【請求項３７】１−エチル−２−（６′−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシルオキシナフチル−２′−ビニレン）−3,
    3−ジメチルインドレニニウムである、請求項36記載の
    化合物。
  38. 【請求項３８】３−エチル−２（６′−β−Ｄ−ガラク
    トピラノシルオキシナフチル−２′−ビニレン）−ベン
    ゾセレナゾリウムである、請求項36記載の化合物。
  39. 【請求項３９】液体試料中の特定の酵素の測定方法であ
    って、 （ａ）試料を、次式： ［式中、Ｙは酵素的に開裂可能な基であって、（ｉ）該
    酵素によりかかる化合物から開裂されるか、又は、（i
    i）該酵素により変性されて二次的基質化合物を生成
    し、該二次的基質化合物における変性された酵素的に開
    裂可能な基が、二次的酵素によって二次的基質化合物か
    ら開裂可能である（この場合、二次的基質化合物はこの
    二次的酵素と接触させられる）基であり;Aは、 と共に、ナフチレン環を形成する残基を表し;Bは、 と共に、５−もしくは６−員の含窒素複素環、又は５−
    及び／もしくは６−員の複素環もしくは炭素環からなる
    縮合環系を形成する残基を表し;R1はアルキル又はアリ
    ールであり;R2及びＲ3は、同一であっても異なっていて
    もよく、水素又は低級アルキルであり;m、ｎ及びｐは、
    同一であっても異なっていてもよく、ｍ＋ｎ＋ｐが少な
    くとも２であることを条件として、０から３までの整数
    であり;Xは対イオン（陰イオン）である］ で示される化合物と接触させ、 （ｂ）開裂されたメロシアニン指示基により生成された
    結果として得られる色を測定する工程からなることを特
    徴とする方法。
  40. 【請求項４０】前記酵素的に開裂可能な基が、糖及びそ
    の誘導体からなる群から選ばれる化合物Ｙ−OHの基であ
    る請求項39記載の方法。
  41. 【請求項４１】Ｙ−OHが、α−Ｄ−ガラクトース、β−
    Ｄ−ガラクトース、α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−グル
    コース、α−Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミ
    ン及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群から選ばれ
    る糖又はその誘導体である、請求項40記載の方法。
  42. 【請求項４２】Ｙ−OHが、約２から20の単糖単位からな
    るオリゴ糖鎖である、請求項40記載の方法。
  43. 【請求項４３】Ｙ−OHが、β−Ｄ−ガラクトース、β−
    Ｄ−グルコース又はα−Ｄ−グルコースである、請求項
    40記載の方法。
  44. 【請求項４４】前記酵素的に開裂可能な基が、アミノ酸
    及びペプチドからなる群から選ばれる化合物Ｙ−OHの基
    である、請求項39記載の方法。
  45. 【請求項４５】前記酵素的に開裂可能な基が、リン酸エ
    ステルである、請求項39記載の方法。
  46. 【請求項４６】Ａが、1,2−ナフチレン、1,4−ナフチレ
    ン又は2,6−ナフチレンを形成する残基を表す、請求項3
    9記載の方法。
  47. 【請求項４７】Ｂが、５−もしくは６−員の含窒素複素
    環、又は、３つ以下の５−及び／もしくは６−員の複素
    環もしくは炭素環からなる縮合環系を形成する残基を表
    す、請求項39記載の方法。
  48. 【請求項４８】Ｂが、インドレニニウム、β−ナフトチ
    アゾリウム、ベンゾオキサゾリウム、ベンゾチアゾリウ
    ム、キノリニウム、チアゾリウム、ベンゾセレナゾリウ
    ム又はベンズイミダゾリウムから選ばれる環系又は縮合
    環系を形成する残基を表す、請求項47記載の方法。
  49. 【請求項４９】Ｂが、次式： （式中、Ｚはジ置換メチレン、ビニレン、アルキル−も
    しくはアリール−置換されたＮ、Ｏ、Ｓ又はSeであり、
    そして、式中のフェニル環は置換もしくは非置換であ
    る） で示される縮合環を形成する残基である、請求項47記載
    の方法。
  50. 【請求項５０】Ｒ1が低級アルキル又はフェニルであ
    る、請求項39記載の方法。
  51. 【請求項５１】Ｒ2及びＲ3が、共に水素である、請求項
    39記載の方法。
  52. 【請求項５２】ｍ＋ｎ＋ｐが、３、４又は５である、請
    求項39記載の方法。
  53. 【請求項５３】次式： OHC−Ar−Ｏ−Ｙ （式中、Ｙは、糖及びその誘導体、脂肪族及び芳香族の
    カルボン酸、アミノ酸、ペプチド、リン酸及び硫酸の中
    から選ばれる化合物Ｙ−OHの基から選ばれる酵素的に開
    裂可能な基であり;Arは、ナフチレンである） で示される化合物。
  54. 【請求項５４】Ｙ−OHが、α−Ｄ−ガラクトース、β−
    Ｄ−ガラクトース、α−グルコース、β−グルコース、
    α−マンノース、Ｎ−アセチルグリコサミン又はＮ−ア
    セチルノイラミン酸である、請求項53記載の化合物。
  55. 【請求項５５】Ｙ−OHが、約２から20の単糖単位からな
    るオリゴ糖鎖である、請求項53記載の化合物。
  56. 【請求項５６】Ｙ−OHが、β−Ｄ−ガラクトースであ
    る、請求項53記載の化合物。
  57. 【請求項５７】Ｙ−OHが、β−Ｄ−グルコースである、
    請求項53記載の化合物。
  58. 【請求項５８】Ｙ−OHが、α−Ｄ−グルコースである、
    請求項53記載の化合物。
  59. 【請求項５９】Arが、非置換の1,4−ナフチレンであ
    る、請求項53記載の化合物。
  60. 【請求項６０】Arが、非置換の2,6−ナフチレンであ
    る、請求項53記載の化合物。
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